Bioquímica

Experimental I

Docente: Carlos Farinha Discentes: André Nascimento, nº. 41842 Andreia Carvalho, nº. 41873 João Carréu, nº. 41843 Patrícia Patrão, nº. 41864 13 de Novembro de 2012

Caracterização de proteínas por técnicas electroforéticas (SDS-PAGE e focagem isoelectrónica)

Faculdade de Ciências da

Universidade de Lisboa

Índice Resumo .......................................................................................................................................... 3

Fluxograma do gel ......................................................................................................................... 4

Fluxograma da sandwich ............................................................................................................... 5

Materiais, reagentes e procedimento ........................................................................................... 6

Tratamento de dados .................................................................................................................... 7

SDS-PAGE................................................................................................................................... 7

a) Apresente um esquema da separação obtida na eletroforese SDS-PAGE. Represente

a curva de calibração do gel preparado e determine a massa molecular relativa das

subunidades da γ-globulina................................................................................................... 7

b) Discuta globalmente os resultados obtidos na técnica de SDS-PAGE em termos da

estrutura da γ-globulina. ..................................................................................................... 11

Focagem isoeléctrica ............................................................................................................... 13

a) Explique o número de bandas de proteína padrão que encontrou. ........................... 13

b) De acordo com os dados obtidos para os padrões, construa uma curva de calibração

do gel: pI da banda versus distância migrada em relação ao cátodo. ................................ 14

c) Determine o valor de pI das proteínas estudadas a partir da curva de calibração

anterior. ............................................................................................................................... 15

d) Discuta os resultados e compare os valores obtidos com os pI calculados para as

proteínas estudadas a partir da sua sequência de resíduos de aminoácidos (consulte uma

base de dados de proteínas (http://www.expasy.org/ )). Comente os possíveis desvios

observados. ......................................................................................................................... 16

Conclusão: ................................................................................................................................... 17

Bibliografia .................................................................................................................................. 19

Resumo

Este trabalho experimental teve como objectivo a realização de duas técnicas

eletroforéticas SDS-PAGE e focagem isoelétrica para caracterização de proteínas.

A primeira técnica foi usada para obter informação sobre a estrutura da -globulinas, no qual,

utlizou se dois tampões:

Tampão de aplicação da amostra preparado sem β-mercaptoetanol;

Tampão de aplicação da amostra preparado com β-mercaptoetanol.

Após a realização da electroforese determinamos a massa molecular relativas das

subunidades da γ- globulina e para a determinação destas traçou-se uma recta de calibração

baseada nos valores de Rf das proteínas padrão e nos seus valores de log10(Mr). Obteve-se

experimentalmente uma massa relativa de 66489,1 Da para a Albumina; 92879,1 Da para a

Xilanase U4; 51745,8 Da para a Fosfamanose isomerase e 26518 Da para a Esterase Fam 4 de

glúcidos.

A segunda técnica foi usada para determinação do ponto isoeléctrico de várias proteínas.

Determinamos estes valores por comparação da curva de caliberação e os pontos isoelétricos

conhecidos de vários marcadores e concluimos que os resultados estão praticamente todos de

acordo com o esperado.

Fluxograma do gel

Fluxograma do gel

Adicionar a solução do gel resolvente à “sandwich” com o auxílio de uma pipeta

de Pasteur, deitando-a por um dos cantos e inclinando

ligeiramente a base de polimerização, até

um pouco acima da altura do traço que foi

marcado.

Adicionar os agentes polimerizantes, TEMED e PSA, à

solução do gel resolvente e agitar (ter

preparada uma seringa com agulha

contendo água destilada).

Preparar as soluções do gel resolvente e do gel de concentração em erlenmeyers, sem

adicionar os agentes polimerizantes TEMED e PSA, de acordo com as quantidades indicadas nos

Quadros I e II. A solução de PSA deve ser preparada no próprio

dia.

Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel polimerize (45 min

a 1 h) - nessa altura notar-se-á mais distintamente a linha de interface gel-água. A solução não usada

também pode servir de auxiliar para seguir a polimerização

do gel.

Muito devagar, com o auxílio da seringa preparada anteriormente, introduzir um pouco de água

destilada sobre a superfície da solução de gel resolvente. É aconselhável introduzir a água pelos dois

cantos superiores da "sandwich" (para evitar a formação de uma superfície de

polimerização irregular, o que ocorreria caso a solução polimerizasse directamente exposta ao ar).

Guardar o monómero não usado ao

pé da “sandwich”.

Secar com cuidado a superfície

do gel com um pouco de

papel de filtro.

Após certificação de que o gel polimerizou, inverter a caixa de polimerização de modo a escorrer

totalmente toda a água da superfície do gel (não apenas a que foi adicionada com a seringa, mas

também a que resultou da reacção de polimerização da

acrilamida - água de exclusão do gel).

Quando a solução tiver polimerizado no erlenmeyer, deitá-la fora. Nessa altura, também o gel na “sandwich”

deverá ter polimerizado.

Introduzir o pente na “sandwich” e incliná-lo de modo a que os dentes façam um ângulo de cerca

de 10°. Este cuidado visa impedir que fiquem retidas

bolhas de ar nos dentes do pente quando se introduz a solução de monómeros.

Adicionar a solução do gel de concentração do lado do espaçador em que o pente está inclinado

até cobrir os seus dentes.

Adicionar os agentes

polimerizantes ao gel de

concentração num

erlenmeyer e agitar.

Deixar em repouso até polimerizar (30 - 45 min) (Notar que, neste caso, não é

necessário adicionar água para se obter uma superfície de polimerização lisa, uma vez que os

dentes do pente desempenham essa função).

Introduzir cuidadosamente o pente, evitando a retenção de bolhas de ar

nos seus dentes.

Alinhar o pente na “sandwich” e adicionar mais solução de modo a

que a “sandwich” fique completamente cheia.

Marcar a posição dos poços do pente no gel com uma caneta.

Aguardar que o monómero

polimerize no erlenmeyer antes de o

deitar fora.

Quando se tiver certificado de que o gel de concentração já polimerizou, tirar o

pente com cuidado, puxando-o para cima lentamente, para

não estragar os poços do gel.

Lavar os poços do gel com água

destilada ou com tampão de

electroforese já diluído.

Fluxograma da sandwich

Lavar muito bem as placas de vidro, os espaçadores de 0,75 mm e os

“pentes” com mistura etanol-éter etílico (2:1, v/v) e deixar secar ao ar.

Colocar os dois espaçadores sobre a placa de vidro rectangular maior, ao longo das arestas laterais, e por

cima, em "sandwich", colocar a placa de vidro de menores dimensões, de modo a ficar rigorosamente sobre a primeira, com as extremidades inferiores dos

espaçadores e das placas bem alinhadas. Nesta altura, os

espaçadores devem ficar cerca de 5 mm saídos na outra extremidade em relação à placa de vidro maior.

Desapertar os quatro parafusos das molas da peça suporte da “sandwich”

(clamp assembly) e montá-la na bancada de modo a que os parafusos não fiquem virados para a pessoa que

manuseia o material.

De um modo firme, pegar na “sandwich” preparada

anteriormente com a placa de vidro maior afastada em relação a si e introduzi-la na peça suporte da

“sandwich”.

No final, a placa de vidro maior deve ficar encostada à

placa de acrílico da peça suporte da

“sandwich”. Apertar os dois

parafusos superiores da

montagem.

Introduzir a montagem anterior na caixa de polimerização de

modo a que os parafusos fiquem

afastados em relação a si.

Despertar novamente os dois parafusos superiores de modo a que as

placas de vidro e os espaçadores

assentem na base da caixa de

polimerização.

Insirir o cartão de alinhamento entre as duas placas de

vidro de modo a posicionar correctamente os espaçadores e, com cuidado, apertar ambos os pares de

parafusos.

Retirar o cartão de alinhamento e a peça suporte da “sandwich” da caixa de

polimerização, confirmando que as placas e os espaçadores estão perfeitamente alinhados na sua base

inferior. Se tal não acontecer, repetir os passos anteriores pois, pode ocorrer um fuga do gel durante a

sua introdução entre as placas de vidro.

Usando o nível da bolha de ar,

nivelar a caixa de polimerização.

Confirmar que as borrachas de silicone cinzentas removíveis estão limpas e completamente livres de restos de

acrilamida de modo a assegurar uma boa selagem do sistema.

Colocar as borrachas de silicone na parte superior da caixa

de polimerização.

Transferir novamente a peça suporte da “sandwich” para a caixa de

polimerização mas agora para a sua posição central. Para isso, pressionar a placa de acrílico de encontro à base da

caixa de polimerização, de modo a que as placas

de vidro assentem nas borrachas

cinzentas.

Encaixar a placa de acrílico debaixo da saliência da

caixa de polimerização empurrando as molas brancas da

montagem. Não exercer pressão

contra as placas de vidro ou

espaçadores pois poderiam partir-se.

Introduza um pente na "sandwich" até que os seus dentes fiquem totalmente

inseridos entre as duas placas de vidro.

Marcar com uma caneta um traço 1,0 cm abaixo do nível inferior dos dentes do pente. Este será o

nível até ao qual se introduzirá a solução de gel resolvente ou de

separação.

Materiais, reagentes e procedimento

Tantos os materiais como os reagentes utilizados nesta experiência estão de acordo com

o protocolo experimental.

O procedimento da electroforese sofreu as seguintes modificações:

1. Á amostra P foi adicionado apenas 10μL de proteína padrão em vez de 5 μL e

95 μL de água destilada

2. As outras amostras continham 20μL de γ-globulina

3. Adicionou-se a cada amostra e à proteína padrão 20μL de tampão Tris-HCl (pH

6,8) 0,0625 M em vez dos 100μL

Tratamento de dados

SDS-PAGE

a) Apresente um esquema da separação obtida na eletroforese SDS-PAGE.

Represente a curva de calibração do gel preparado e determine a massa

molecular relativa das subunidades da γ-globulina.

No gel realizado foi aplicada proteína padrão nos poços 2 e 7, os poços 1 e 10 foram

deixados livres e sendo que nos outros foram colocadas ϒ – globulina.

Esquema do gel:

Ilustração 1 – gel de concentração de SDS-PAGE

Gel de concentração.

Altura do gel: 4 cm

Gel de resolução.

Distância migrada do

azul de bromofenol:

3,6cm

A electroforese decorreu durante 1.30 a uma voltagem de 100 V, após esse tempo,

cuidadosamente, retirou-se o gel das placas de vidro para electroforese e mediu-se a altura do

gel de concentração (4cm), assim como a distancia percorrida pelo azul de bromofenol (3,6cm).

A ilustração 1 demonstra este esquema, antes da revelação do gel.

A distância percorrida pelo azul de bromofenol (3,6cm) é utilizada para determinar os Rf

de cada risca adquirida no gel de concentração após a sua revelação (demonstrado em anexo) na

seguinte fórmula:

Para se obter a distância percorrida de cada risca da proteína padrão mede-se com uma

régua a distância de migração da banda desde o poço do gel até ao centro da mesma.

Demonstramos o cálculo utilizado para o primeiro exemplo (P3, primeira risca), pois são

realizados cálculos análogos para a determinação dos outros Rf’s:

Para traçar a recta de calibração, ainda é necessário realizar o logaritmo de cada uma das

massas moleculares relativas apresentadas na Tabela 1 que foram identificadas na amostra

padrão.

Proteína Massa Molecular

relativa (MMr) (Da)

Log10 (MMr)

(Da)

Xilanase U4 96 000 4,98

Albumina 66 000 4,82

Fosfamanose isomerase 48 000 4,68

Celulase 5 A 40 000 4,60

Celulase M9 32 000 4,51

Esterase Fam 4 de glucidos 26 100 4,41

Dominio M6 de ligação a xiloglucanos 18 500 4,27

Tabela 1 – Massa relativa dos vários componentes da proteína padrão

Assim, traçamos a curva de calibração que nos permitiu determinar, aproximadamente, as

massas moleculares relativas das bandas adquiridas nos outros poços.

Gráfico 1 – Recta de distribuição do Rf em função do log(MMr) em SDS-PAGE

Exemplificação da determinação de uma das massas moleculares relativas (exemplo

anterior):

Sendo:

Então, para

O verdadeiro valor de MMr para esta banda é

Realizando, cálculos análogos para todos os outros dados, construímos a Tabela 2

Log(MMr) (Da) MMr (Da)

P3 P4 P5 P6 P8 P9 P3 P4 P5 P6 P8 P9

4,915332 4,740629 4,740629 4,740629 4,985213 4,915332 82287,13 55033,73 55033,73 55033,73 96652,51 82287,13

4,845451 4,461104 4,461104 4,461104 - - 70056,87 28913,73 28913,73 28913,73 - -

4,740629 - - - - - 55033,73 - - - - -

4,461104 - - - - - 28913,73 - - - - -

Tabela 2 – Tabela alusiva ao Gráfico 1, cálculo das massas moleculares relativas nos diferentes poços da SDS-PAGE

Infelizmente muitos destes resultados não estam de acordo com o esperado, como é o

caso evidente da quarta risca do poço três (P3), tendo migrado exactamente o mesmo que a

Esterase Fam.4 de glúcidos, obviamente que tem de ter massa molecular relativa idêntica, ou

seja, em vez de 28913,73 deveria ser perto de 26100. Isto pode ser explicado a partir de uma

observação mais cuidada do Gráfico 1: apesar de o valor de R2

(0,9545) ser, relativamente,

próximo de 1, consiguimos inferir que a recta de distribuição escolhida não é a melhor, uma vez

que não possui nenhum dos pontos obtidos da amostra padrão, R2

possui um valor tão elevado

pois os desvios são compensados. Então, o grupo decidiu realizar um novo gráfico rejeitando

y = -0,795x + 4,0188 R² = 0,9545

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9 5 5,1

Rf vs log(MMr)

quer o primeiro, quer o último pontos, visto que estão completamente desnivelados da recta.

Assim, construímos o Gráfico 2.

Gráfico 2 – Recta de distribuição do Rf em função do log(MMr) melhorado em SDS-PAGE

Os cálculos são análogos aos realizados anteriormente, à excepção que a recta utilizada

para determinar as massas relativas foi:

Então, construímos a Tabela 3, como novas e melhoradas massas moleculares relativas.

Log(MMr) (Da) MMr (Da)

P3 P4 P5 P6 P8 P9 P3 P4 P5 P6 P8 P9

4,895334 4,713875 4,713875 4,713875 4,967918 4,895334 78584,03 51745,8 51745,8 51745,8 92879,1 78584,03

4,822751 4,42354 4,42354 4,42354 - - 66489,13 26517,97 26517,97 26517,97 - -

4,713875 - - - - - 51745,8 - - - - -

4,42354 - - - - - 26517,97 - - - - -

Tabela 3 – Tabela alusiva ao Gráfico 2, cálculo das massas moleculares relativas nos diferentes poços da SDS-PAGE

Através dos dados da Tabela 3 realizou-se a recta de calibração representada no Gráfico

2. Esta é utilizada para calcular a massa molecular relativa das subunidades da ϒ – globulina.

A partir desta recta o resultado comentado anteriormente, aproxima-se muito mais do

verdadeiro (26000), 26517,97 é apenas um pouco superior, isto deve-se ao facto de, a partir da

recta de calibração, apenas obtemos resultados aproximados. Podemos, assim, assumir esta

recta, uma vez que a maioria dos resultados assemelha-se mais à realidade esperada. No entanto

a primeira risca do terceiro poço (78584,03) possui um valor para a massa relativa mais

aproximado ao real (9600) no Gráfico 1 (82287,13) do que no Gráfico 2. Uma vez rejeitado o

primeiro, resta-nos a hipótese de considerar o dado em questão um erro, devido à anulação da

risca da amostra padrão correspondente.

y = -0,7654x + 3,858 R² = 0,9983

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9

Rf vs log(MMr) melhorado

Novamente, outro exemplo que levou a preferência deste gráfico é: a segunda risca que

tem massa relativa aproximadamente semelhante a 66000, sendo muito superior a este valor

(70056,87) no Gráfico 1; porém, comparando com o Gráfico 2 esse valor decresce para

66489,13 podendo ser assumido como verdadeiro, repetidamente este não é corresponde ao

valor exacto devido à recta de calibração, que representa uma aproximação da relação entre Rf e

log(MMr) dos nossos dados.

Assim concluímos que o Gráfico 2 apresenta uma recta de calibração mais relacionada

com os nossos resultados do que a do Gráfico 1 pelo que assumimos o primeiro.

De seguida isolamos os valores de Rf e MMr retirados da Tabela 3

Rf MMr (Da)

0,11 78 584

0,17 66 489,1

0,25 51 745,8

0,47 26 518 Tabela 4 – Dados dos Rf e MMr das bandas dos poços 3 a 6

b) Discuta globalmente os resultados obtidos na técnica de SDS-PAGE em

termos da estrutura da γ-globulina.

Analisando a Tabela 4 e o gel de concentração após a resolução (em anexo) chegamos à

conclusão que a ϒ – globulina possui duas cadeias, uma leve com, aproximadamente, 26518 Da

de massa relativa e outra pesada 66489,1 Da. Tal como esperado a cadeia pesada da proteína

migrou menos que a leve, uma vez que apresentarem maior dificuldade em passar pelos crivos

do gel por possuírem maiores dimensões.

Observando, com mais cuidado, notamos que os diversos poços que contêm ϒ –

globulina apresentam diferentes números de bandas, bem como nitidez de cada. Iniciando com

os poços 3 a 6 todos a eles foi adicionado 100 mL de β-mercaptoetanol, agente que reduz as

ligações persulforeto dos polipeptídos, destruindo as suas estruturas tridimensionais. Só com a

sua adição, garantimos que todas elas têm forma linear e igual massa.

Dos poços, anteriormente considerados o P3 foi o único que não foi aquecido (100ºC),

pelo que podemos verificar que a desnaturação da ϒ – globulina não foi total e, possivelmente,

ainda continha algumas pontes dissulfito apresentando bandas com massas moleculares relativas

superiores à cadeia pesada. Os restantes (P4 a P6) foram sujeitos a aquecimento, mas com

tempos diferentes (1, 2 e 5 minutos, respectivamente). Obviamente que o P6 possui o melhor

resultado com as cadeias leve e pesada bem definidas e sem mais bandas. Este acontecimento

esperado, deve-se ao facto de a ϒ – globulina estar definitivamente desnaturada pelo que no gel

apenas observamos duas bandas bem nítidas representativas das suas cadeias. Assim, deduzimos

que quanto maior o tempo de aquecimento maior a destruição dos níveis de estrutura da

proteína.

Já para os poços 8 e 9 não foi utilizado β-mercaptoetanol pelo que não foram destruídas

as ligações persulforeto. Assim verificamos uma migração das amostras mínima uma vez que as

cadeias leve e pesada permaneceram juntas, tendo um elevadíssimo peso molecular não

atravessam os crivos do gel de concentração e, portanto, permanecem, praticamente, no poço. O

P9, apesar de ter sido aquecido (100 ºC, 5 minutos), evidenciou o mesmo resultado que o P8, o

que nos permite inferir que o aquecimento não é suficiente para quebrar as ligações em questão,

não se dando a separação das cadeias.

Focagem isoeléctrica

Ilustração 2 – gel de resolução da Focagem isoeléctrica

a) Explique o número de bandas de proteína padrão que encontrou.

Neste gel foram colocadas amostras padrão nos poços 3 e 8 e nos poços 5 (mioglobina) e

7 (BSA) solução proteica desconhecida, tal como é possível presenciar no gel de resolução

apresentado em anexo.

Após uma observação muito cuidada do mesmo, apenas conseguimos detectar onze

bandas. De inicio este resultado poderia gerar alguma confusão, uma vez que a proteína padrão

possui doze componentes diferentes, porém é o dado esperado uma vez que a Amiloglucosidase

( pH = 3,5) possui um pH inferior ao do corante, o vermelho de metilo (pH = 3,75). Isto

significa que a suposta banda correspondente ao enzima referido não ficou retida no gel.

No reservatório superior encontrava-se uma solução alcalina (NaOH 25mM) no cátodo

(pólo negativo) e no reservatório inferior colocou-se uma solução mais ácida ( Ácido acético

20mM) o ânodo (pólo positivo). Então os componentes da proteína padrão mais ácidos

migraram mais que os alcalinos. A partir desta análise podemos induzir que a Amiloglucosidase

(pH = 3,5) percorreu todo o gel, não ficando retida nele.

b) De acordo com os dados obtidos para os padrões, construa uma curva de

calibração do gel: pI da banda versus distância migrada em relação ao cátodo.

Componentes pI

Amiloglucosidase 3,50

Vermelho de metilo (corante) 3,75

Inibidor da tripsina de soja 4,55

β –lactoglobulina 5,20

Anidrase carbónica bovina B 5,85

Anidrase carbónica humana B 6,55

Banda acídica da mioglobina do cavalo 6,85

Banda básica da mioglobina do cavalo 7,35

Banda acídica da lectina da lentilha 8,15

Banda central da lectina da lentilha 8,45

Banda básica da lectina da lentilha 8,65

Tripsinogénio 9,3

Tabela 5 – pontos isoeléctricos dos componentes do Broad p/ Calibration Kit da Amersaham BioSciences

Gráfico 3 – Relação entre a distância migrada das diferentes proteínas em função dos seus pontos isoeléctricos

Uma análise delicada do Gráfico 3 e da Tabela 5 leva-nos a deduzir que apesar do

elevado R2 conseguido a recta de calibração não retrata a realidade mas uma aproximação à

mesma. Isto porque segundo a recta os componentes da amostra padrão, cujos pontos

isoeléctricos são conhecidos, teriam valores ligeiramente diferentes dos tabelados. Contudo esta

aproximação é razoável pelo que considerámos ao longo do relatório como verdadeira.

y = -0,9124x + 9,0422 R² = 0,9805

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6 8 10

pI da banda vs Distância migrada em relação ao cátodo

c) Determine o valor de pI das proteínas estudadas a partir da curva de

calibração anterior.

Após a obtenção da recta de distribuição, calculámos os pI das diferentes bandas

utilizando a equação reduzida da recta:

Demonstração de um cálculo efectuado para o poço dois (P5) primeira banda (0,5cm):

Realizando esta equação para todas as outras bandas construímos a seguinte tabela:

Poço Amostra Distâncias migradas

em relação ao cátodo pI pI da proteína

3 BSA

0,5

2,8

3,2

3,2

3,5

3,7

4,2

9,36

6,84

6,51

6,40

6,07

5,86

5,31

5,86

4 γ-Globulina 2,7 6,95 6,95

5 Lisozima 0,3 Fora da gama* 9,58

6 Tripsina 3,0 6,62 6,62

7 Mioglobina

1,4

1,8

2,1

2,3

2,5

2,8

3,1

8,38

7,94

7,61

7,39

7,17

6,84

6,51

7,17

8 Citocromo c 0 Fora da gama* 9,90

9 Fosfatase ácida

2,5

2,8

3,0

3,3

3,5

3,7

4

5,6

7,17

6,84

6,62

6,29

6,07

5,86

5,53

3,77

6,29

Tabela 6 - Tabela alusiva ao Gráfico 3, cálculo dos pontos isoeléctricos dos dois poços na Focagem isoeléctrica

*NOTA: o citocromo c e o lisozima não apresentam pontos isoeléctricos dentro da gama de pH

do gel pelo que praticamente não migram nos mesmo mantendo-se nos poços, onde foram

colocados.

Os valores escolhidos para o pI de cada proteína teve em consideração a banda de

maiores dimensões, isto é a que estava mais conecentrada poir esse valor de pH deverá

aproximar-se mais do verdadeiro ponto isoeléctrico da proteína.

d) Discuta os resultados e compare os valores obtidos com os pI calculados para

as proteínas estudadas a partir da sua sequência de resíduos de aminoácidos

(consulte uma base de dados de proteínas (http://www.expasy.org/ )). Comente os

possíveis desvios observados.

Proteína Valores tabelados Valores experimentais

BSA 5,82 5,86

ϒ - globulina 6,85 6,95

Lisozima 9,36 9,58

Tripsina 6,08 6,62

Mioglobina 7,2 7,17

Citocromo c 9,59 9,90

Fosfatase Ácido 6,29 6,29

Tabela 7 – valores tabelados dos pontos isoeléctricos das proteínas utilizadas no gel de resolução

Tal como podemos verificar pela Tabela 7 a grande maioria dos nossos resultados não

só se assemelham aos verdadeiros como tomam exactamente o mesmo valor, pelo que

consideramos que esta experiencia foi realizada com enorme rigor e precisão levando-nos a

pouquíssimos erros. No entanto estes não podem ser desvalorizados e, portanto, tomamo-los em

consideração: principalmente os de paralaxe em medições de volumes e também no

manuseamento do material. Quanto à qualidade das amostras resta-nos apenas assumir que se

encontram puras, todavia podem ter sido responsáveis pelos pequenos desvios obtidos. É apenas

de salientar as amostras de Tripsina e Citocromo c. Estes desníveis poderão estar associados à

recta de calibração e não necessariamente a pureza das amostras.

Os elementos do grupo tiveram alguma dificuldade em observar as bandas dos poços 4

(ϒ - globulina) e 6 (Tripsina) e, em vez de reparar nas supostas riscas, ainda dentro dos poços 5

(Lisozima) e 8 (citocromo c) não avistamos nenhuma deduzindo que aí se encontravam, visto

que o nosso gel de resolução se encontrava ligeiramente danificado.

Conclusão:

Electroforese em gel é uma tecnica que tem em consideração a migração de espécies

carregadas eletricamente, quando dissolvidas ou suspensas num eletrólito, cujo é aplicado uma

corrente eléctrica. As moléculas são separadas consoante a sua relação carga/massa, quanto

menor esta for menor será a distância percorrida pela devida molécula no gel. Esta tecnica é,

geralmente, utilizada na separação de proteínas ou moléculas de DNA e RNA.

Para este tabalho laboratorial foi utilizada a eletroforese em gel de poliacrilamida na

presença de dodecilssulfato de sódio (SDS). Este método é muito utilizado para a análise de

massas moleculares de proteínas oligoméricas. A poliacrilamida é uma mistura de dois

polimeros: acrilamida (molécula linear) e bisacrilamida (molécula em forma de “T”); onde a sua

mistura dá origem a uma rede, o gel. Este é uma matriz constituída por um polímero de

acrilamida com ligações cruzadas de N, N-metil-bis-acrilamida, cuja porosidade da malha pode

ser escolhida. Quanto maior a concentração de acrilamida, menores serão os poros da malha

formada, podendo-se, então, criar diferentes gradientes de separação alterando as concentrações

usadas de cada uma das moléculas referidas.

Antes de iniciar a SDS-PAGE, as diferentes cargas, nativas de cada proteína, devem ser

eliminadas para que esta separação dependa apenas da sua massa molecular. Então, as proteínas

são misturadas com SDS. Este detergente desnaturante confere às proteínas umas estrutura

linear (a forma nativa é geralmente globular) e densidade de carga uniforme. Isto é acontece

devido a duas características muito importantes desta substância química: ser alifático, possui

uma região hidrólilica, que forma interacções fracas com a água, e outra hidrofóbica, que

interage com as cadeias polipeptídicas tornando todas as proteínas negativamente carregadas

anulando, deste modo, a razão carga/massa referida precedentemente; e ser aniónico, possui

elevada carga negativa, podendo transferi-las para as devidas cadeias.

Na preparação das amostras colocámos, em 6 (incluíndo as duas amostras padrão), com

β-mercaptoetanol, agente que reduz as ligações persulfureto da ϒ – globulina, destruindo a sua

estrutura quaternária. Só com a sua adição, garantimos que todas elas têm forma linear e igual

massa, uma vez que para as outras duas amostras este agente não foi colocado não se verificou

separação entre cadeias leve e pesada.

Após esse tratamento, as proteínas são aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida e

submetidas a uma corrente elétrica (100V), fazendo com que elas migrem através da malha em

direção ao polo positivo, o anôdo. Dependendo do seu tamanho, cada proteína se moverá

diferentemente: as proteínas menores migrarão mais rapidamente, enquanto que as maiores

terão mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se ficarão presas no mesmo.

Na Focagem isoeléctrica a diferença entre as proteínas a separar numa amostra foca-se

nos, respectivos pontos isoeléctricos. Todas as proteínas possuem uma carga nativa que pode ser

positiva, negativa ou nula dependendo do pH do meio, quando não possuem carga o respectivo

pH denomina-se ponto isoeléctrico (pI).

Quando uma proteína é colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual o

gradiente de pH é estabelecido pela mistura de soluções tampão especiais (NaOH 25mM e

CH3COOH 20mM) e sujeita a um campo eléctrico (200V) irá inicialmente mover-se em

direcção ao eléctrodo com carga oposta à da proteína, nesta experiência encaminharam-se para o

cátodo.

Durante a migração através do gradiente de pH, a proteína irá captar ou perder protões.

Enquanto a proteína migra a sua velocidade vai diminuindo até chegar ao ponto em que o valor

de pH será igual ao seu pI. Neste ponto a proteína terá carga total neutra e como consequência

deixa de migrar, ficando retida no gel. Se a proteína se difundir para uma região fora do seu pI,

irá adquirir carga e consequentemente move-se novamente para a posição onde é globalmente

neutra, é devido a este fenómeno que se encontram diversas bandas em cada zona do gel. Esta

pode ter grupos ionizados, mas globalmente é neutra.

Concluindo ambas as técnicas utilizadas são bastante eficazes para a determinação das

proteínas utilizadas, apesar de serem métodos de comparação.

Bibliografia http://www.ufrgs.br/leo/eletroforese/policrilamida.htm

http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese

http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel

http://www.expasy.org

http://kdbio.inescid.pt/~atf/bioinformatics.ath.cx/bioinformatics.ath.cx/index09c3.html?id=11

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