Biotransformação de Compostos Orgânicos

5/22/2018 Biotransforma o de Compostos Org nicos

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Universidade Federal do ParanDepartamento de Qumica

BIOTRANSFORMAO

DE COMPOSTOS ORGNICOS

Brs H. de Oliveira

([email protected])

2012


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ii

1. Introduo ...................................................................................................................... 11.1. Aspectos gerais ...................................................................................................... 11.2. Exemplos ............................................................................................................... 11.3. Reviso Qumica Orgnica .................................................................................... 3

1.3.1. Nomenclatura................................................................................................. 31.3.2. Estereoqumica .............................................................................................. 31.3.3. Mecanismos de reaes orgnicas ................................................................. 3

1.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores .................................................... 31.4.1. Vantagens de uso de enzimas ........................................................................ 31.4.2. Desvantagens do uso de enzimas .................................................................. 4

1.5. Propriedades Enzimticas ...................................................................................... 41.5.1. Aspectos Mecansticos .................................................................................. 51.5.2. Classificao e Nomenclatura ....................................................................... 71.5.3. Coenzimas ..................................................................................................... 71.5.4. Fontes de Enzimas ......................................................................................... 7

2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatlise ............................................................ 82.1. Introduo .............................................................................................................. 82.2. Screening ............................................................................................................... 82.3. Metodologia Analtica ........................................................................................... 92.4. Exemplo ................................................................................................................. 9

3. Aplicaes Biocatalticas ............................................................................................. 113.1. Reaes de Hidrlise ........................................................................................... 11

3.1.1. Hidrlise de Amida ...................................................................................... 113.1.2. Hidrlise de steres ..................................................................................... 123.1.3. Hidrlise de Epxidos ................................................................................. 173.1.4. Hidrlise de Nitrilas .................................................................................... 20

3.2. Reaes de Reduo ............................................................................................ 213.2.1. Reduo de Aldedos e Cetonas (Enzimas Isoladas) ................................... 233.2.2. Reduo de Aldedo e Cetonas com Clulas ............................................... 253.2.3. Reduo de C=C por Clulas ...................................................................... 25

3.3. Reaes de Oxidao ........................................................................................... 263.3.1. Oxidao de lcoois .................................................................................... 263.3.2. Reaes de Oxigenao ............................................................................... 28

3.4. Formao de Ligaes C-C ................................................................................. 353.5. Adio e Eliminao ............................................................................................ 37

3.5.1. Formao de Cianidrina............................................................................... 383.5.2. Adio de gua e Amnia........................................................................... 383.5.3.

Reaes tipo acilona ................................................................................... 39

3.6. Transglicosilao ................................................................................................. 39

3.6.1. Glicosiltransferases ...................................................................................... 403.6.2. Glicosidases ................................................................................................. 40

3.7. Halogenao e Desalogenao ............................................................................ 424. Tcnicas Especiais ....................................................................................................... 45

4.1. Imobilizao ........................................................................................................ 454.2. Enzimas Modificadas e Artificiais ...................................................................... 46

5. Outras Aplicaes ........................................................................................................ 475.1. Modelos microbianos de metabolismo de mamferos ......................................... 475.2. Derivados Ativos de Drogas ................................................................................ 47


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BIOTRANSFORMAO DE COMPOSTOS ORGNICOS

1. Introduo

Este resumo se refere disciplina de Biotransformao de Compostos Orgnicos efoi preparado devido ausncia de textos em Portugus nesse assunto. Seu contedo se

baseia na bibliografia recomendada, mas contm tambm informaes de vrias outras

fontes. Ele pretende apenas ser um guia para o estudante e mais informaes sero

fornecidas nas aulas.

1.1. Aspectos gerais

conceito

importncia: alternativa/auxiliar sntese orgnica; obteno de molculas

quirais;

aplicao industrial: > 200 processos (ca. 2% do total de US$ 25 bilhes)

nmero de processos ao longo do tempo (grfico)

1.2. Exemplos

(Ref. Industrial Biotransformations)

Produto Biocatalisador Desde EmpresaVinagre Bacteria 1823 VariasL-2-metilamino-1-fenilpropan-1-ol

Levedura 1930 Knoll AG, Alemanha

L-sorbose Acetobactersuboxydans

1934 Varias

Prednisolona Arthrobacter simplex 1955 Schering AG,Alemanha

c. L-asprtico Escherichia coli 1958 Tanabe Seiyaku Co.,Japo7-ADCA Bacillus megaterium 1970 Asahi Chemical

Industry, Japoc. L-mlico Brevibacterium

ammoniagenes1974 Tanabe Seiyaku Co.,

JapoD-p-hidroxifenilglicina Pseudomonas striata 1983 Kanegafuchi

Chemical Co, JapoAcrilamida Rhodococcus sp 1985 Nitto Chemical Ltda,

Japoc D-asprtico e L-alanina

Pseudomonasdacunhae

1988 Tanabe Seiyaku Co.,Japo

L-carnitina Agrobacterium sp 1993 Lonza, Rep Checa

c 2-ceto-L-gulonico Acetobacter sp 1999 BASF, Merck,Cerestar, Alemanha


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2

a) Esterides

b) Aromas (patchouli)

c) Medicamentos (talidomida)

(R:sedativo; S: teratognico)

d) Outros

O

O

O

OH

OH

O

O

O

OHO

progesterona

cortisona

11-hidroxiprogesterona

R. arrhizus

P. rubrum

HO

CH2OH

HO HO

lcool patchouli nor-pathcoulenol

N

O

O

NH

O

O

HO2CC

NH2

C

H

H3C CH3

SH HO2CC

H

C

H2N

H3C

CH3

SH

HO2CC

HH2N

NH2

O

HO2CC

NH2H

NH2

O

R-penicilamina toxico

S-penicilamina antiartrtico

R-asparagina doce

S-asparagina amarga


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1.3. Reviso Qumica Orgnica

1.3.1. Nomenclatura

funes orgnicas

regras de nomenclatura

1.3.2. Estereoqumica

Enantimeros e molculas quirais

Importncia biolgica da quiralidade. Ex.: talidomida

Nomenclatura: sistema R-S

Atividade ptica: e.e.

Drogas quirais

1.3.3. Mecanismos de reaes orgnicas

Repr movimentao de e-

Mecanismos de hidrlise: cat cida e bsica

Mecanismos de substituio: nucleoflica

1.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores

1.4.1. Vantagens de uso de enzimas

so catalizadores eficientes

so aceitveis ecolgicamente

atuam em condies brandas so mutualmente compatveis

no esto limitadas ao papel natural

podem catalizar um grande espectro de reaes

seletividade

quimioseletividade,

regioseletividade

enantioseletividade: feitas de L-aa


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1.4.2. Desvantagens do uso de enzimas

ocorrem em apenas uma forma enantiomrica

requerem parmetros restritos (pH, temp.)

mostram maior atividade cataltica em gua

so propensas inibio

podem causar alergias

Enzimas Isoladas X Clulas Inteiras

Biocatalizador Forma Pros ContrasEnzima isolada Qualquer ap. Simples, elab.

Simples, melhorprodutividade

reciclagem de co-fator

dissolvida emgua

alta atividade enzimtica reaes colaterais, subst.lipofil. insolveis, elab.requer extrao

suspensa emsolv. Orgnico

fcil de realizar, elab.fcil, subst. lipoflicossolveis, fcil rec. daenzima

baixa atividade

Imobilizada fcil recuperao da

enzima

perda de atividade durante

a imobilizaoclulas inteiras Qualquer desnecessrio reciclar co-fatores

equip. caro, elaboraotediosa, baixa produt.(menor tolerncia concentrao), baixatolerncia a solv. org.,reaes colaterais

cultura emcrescimento

maiores atividades mais biomassa, mais sub-produtos, processo difcilde controlar

clulas em

repouso

elaborao mais fcil,

menos sub-produtos

menores atividades

clulasimobilizadas

clulas reutilisveis menores atividades

1.5. Propriedades Enzimticas

grupos hidroflicos externos (-COOH, -OH, -NH2, -SH, -CONH2)

grupos lipoflicos internos

pontes disulfeto


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5

inativao:

rearranjo da cadeia peptdica (comea a 40-50 oC); reversvel

hidrlise; irreversvel

troca de pontes disulfeto

reaes de eliminao e oxidao

enzimas termoestveis (microorganismos termoflicos)

1.5.1. Aspectos Mecansticos

a) Mecanismo Chave e Fechadura (Fisher, 1894)

Problemas: substratos de pequeno volume; substratos no-naturais

b) Mecanismo Encaixe Induzido (Koshland Jr., 1960s)


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c) Teoria Desolvatao e Solvatao-Substituio

Desolvatao (Dewar,1986)

substrato substitui gua no stio ativo

reao tipo fase gasosa

Solvatao-substituio

gua de solvatao do substrato substituida pelo stio ativo

d) Regra de Atracagem de Trs Pontos

e) Razes Cinticas para a Seletividade


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1.5.2. Classificao e Nomenclatura

IUB: 3.000 enzimas (de 25.000)

atividade cataltica: 1 U.I. = 1 mol de substrato transformado/min. enzimas disponveis comercialmente

EC A.B.C.D

A: principal tipo de reao

B: subtipo indicando tipo de substrato

C: natureza do co-substrato

D: nmero da enzima especfica

Ex.: -glucosidase (EC 3.2.1.21) de amndoa; 20-40 unidades/ mg deslido

Classe Nmero Tipo de reao Utilidade*classific. dispon.

1.oxidoredutases

650 90 oxidao-reduo +++25%

2.transferases

720 90 transferncia de grupos +5%

3.hidrolases 636 125 hidrlise/formao devrias funes +++65%4.liases

255 35 adio/eliminao depequenas molculas

++5%

5.isomerases

120 6 isomerizao 5%

6.ligases

80 5 formao/clivagem de C-O, C-S, C-N, C-C

1%

(*) +++: muito til; = pouco uso; %: percentagem de pesquisa no perodo 1987-96

1.5.3. Coenzimas

NAD/NADH; NADP/NADPH; ATP; acetil-CoA

1.5.4. Fontes de Enzimas

indstria de detergentes e alimentos: proteases e lipases

fontes animais: rins, fgado, pncreas fontes microbianas: colees de cultura; natureza


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8

2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatlise

2.1. Introduo

necessidade de novas enzimas

novas molculas quirais

substituio de processos qumicos

processos ecolgicamente corretos

2.2. Screening

fontes de enzimas

solo: 109clulas/g

gua

vegetais (endofticos): ex. GA3

isolamento no seletivo: solo seco, abs esponja, agar, incubao (temp

variadas). isolamento seletivo: pr-tratamento do solo; ad antibitico; meio seletivo.


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9

2.3. Metodologia Analtica

Importncia

Mtodos fsico-qumicos: ccd, clae, cg

Bioensaios (clulas animais, microbianas, enzimticos) HTS (high-throuput screening)

2.4. Exemplo

Biotransformao de Esteris. Brs H. de Oliveira e Deise D. Bueno,

Qumica Nova19 (3), 233-6 (1996).

Importncia de substncias esteroidais: hormnios, antiinflamatrios,

anticoncepcionais, etc.

Matrias-primas; intermedirios

O

O

Androstenodiona

HO

-Sitosterol

O

O

HO

Diosgenina

O

O

Progesterona

amostras de solo e de sementes de soja em meio lquido contendo colesterol

como nica fonte de C; 7 dias

alquota para novo frasco contendo o mesmo meio; processo executado por

um total de 15 vezes.

Crescimento microbiano em todos os frascos

Seleo: meio c/ colesterol dosagem


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TABELA 1- Degradao de Colesterol por Microorganismos Provenientes da

Amostragem 1. (S = amostra de semente; So= amostra de solo). Concentrao

inicial de colesterol = 200 mg%

Amostra ColesterolDegradado

(%)10 (S)(*) 53,02

25 (S) 50,928 (So) 48,8214 (S) 47,987 (S) 38,76. .

(*) amostra utilizada nos experimentos de degradao do -sitosterol

Transferncia p/ meio slido

Isolamento: bactria Gram +

Experimento preparativo com sitosterol

Extrao com solvente

Isolamento cromatogrfico de androst-4-eno-3,17-diona

O

O

androst-4-eno-3,17-diona


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3. Aplicaes Biocatalticas

3.1. Reaes de Hidrlise

Hidrlise qumica: mecanismo

2/3 do total da pesquisa

aspectos mecansticos: serina hidrolases

trade cataltica: importncia

C OR2

R1

ON

N

H

His

R2OHOO

-

Asp

OH

Ser

O O H

Asp

N

N

HHis

O

CO

R1

Ser

C OH

R1

O

O H

H

enzima

acilada

3.1.1. Hidrlise de Amida

Ligao amida

Importncia: qumica de aa e peptdeos Mercado de aa: > 0,5 milho toneladas/ano (US$ 2 bilhes)

Adoantes no-calricos: aspartame (Asp, Phe)

Rotas enzimticas p/ aa enantiomricamente puros:


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R CO2R1

NHR2

R CO2H

NH2

R CO2H

O

CO2H

R

hidrolase (res)

liase (ad NH3)

desidrogenase(aminao redut)

Resol por hidrolases: proteases, esterases ou lipases

3.1.2. Hidrlise de steres

Ligao ster: hidrlise

Esterases, proteases e lipases

3.1.2.1. PLE ( Pig Liver Esterase )

verstil, substrato-tolerante, barata

Ex.: prostaglandinas

CO2Me

CO2Me

OHPLE

CO2Me

CO2H

OH

e.e. 98%

O

COOMe

OH

HO

O

COOH

OH

HO

PLE


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13

3.1.2.2. Esterases microbianas

S

S

CO2

OAc

t-Bu

S

S

CO2

OH

t-Bu

S

S

CO2

OAc

t-Bu

Bacillus sp e.e. 94%

+

CO2MeR

carboxilesteraseNP

Bacillus subtilis

R= Aril-

R= Aril-O-

CO2HAr

CO2HArO

CO2MeAr

CO2MeArO

+

+

e.e. > 95%

e.e.> 87%

Ex.: analgsicos, antiinflamatrios

CO2H CO2H

MeO

Ibuprofeno Naproxeno

Otimizao da seletividade

Modificao do substrato

Variao do sistema de solvente

Variao do pH

OAc

OAc

OH

OAc

PLE

Meio e.e. (%)

H2O 55

H2O/DMSO 6:4 72H2O/DMF 8:2 84

H2O/t-BuOH 9:1 96


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3.1.2.3. Lipases

Hidrlise de triglicerdeos

Importante em: processamento de alimentos e prep de intermedirios quirais

Pode hidrolisar e formar lig ster

Diferena lipase X esterase: interao c/ substrato

Mecanismo: -hlice (tampa) aberta quando em contato c/ bifase leo-

gua

Seletividade

VOLUMOSA pequena

Molcula do Substrato

Lipase de Candida sp

Lipase deAspergillus sp Lipase de Pseudomonas spLipase deMucor sp

Lipase pancretica de porco (PPL)

A mais barata

Preparao bruta (pacreatina, esteapsina)

Outras hidrolases presentes (-quimotripsina, colesterol esterase,

fosfolipases, etc.)

Alta seletividade pode ser devida s impurezas


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15

cO HO OAc

+hidrolase

rac

Enzima V Reao Seletividade

(razo enantiomrica)

PPL bruta Boa >300

PPL pura No reage -

-quimotripsina No reage -

Colesterol esterase Rpida 17

Hidrolase nova Boa 210

Lpases de Candida sp

C. lipolytica, C. antartica (CAL), C. rugosa(CRL)

C. rugosa:aceita steres volumosos (p.ex. de lcoois sec. cclicos)

OAc

CO2Et

OH

CO2Et

OAcCO2Et

O

CO2Et

O

CO2Et

CRL

principal

e.e.= 77%

e.e. > 99% traos

Lpases de Pseudomonas sp (PSL) P. fluorescens, P. aeruginosa, P. cepaceae , P. glumae

No aceitam steres volumosos


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Ar

SS(CH2)n (CH2)n

CO2MeMeO2C

Ar

SS(CH2)n (CH2)n

CO2HMeO2C

PSL

n e.e. (%)

1 482 >983 79

Lpases de Mucor sp (MSL)

M. miehei, M. javanicus

M. miehei: operador qumico Asp-His-Ser (similar outras lpases)

O

RO

O

RO

O

O

ROH

RO

O

lipase

Lipase R Solvente e.e. (%)

CRL H tampo 12PSL H tampo 81

MSL H tampo >99

MSL Me tampo >99

PPL Me tampo 20

PPL Me tampo/hexano 85

Outras Lipases: microbianas

AcO

OMe

O

Me

OH

OMe

O

Me

AcO

OMe

O

Me

+lipase

Aspergillus sp.


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3.1.3. Hidrlise de Epxidos

Epxidos: estrutura, preparao, importncia (intermedirios p/ sntese de

compostos bioativos)

Sntese assimtrica/resoluo: no disponvel (exceto mtodo Sharpless

lcoois allicos)

Epoxidao microbiolgica: possvel mas tcnicamente difcil (eng. Processo)

Hidrlise qumica: mecanismo cat cida e bsica

Epxido Hidrolases (EH): mais teis que epoxidases; metabolismo de

alquenos e aromticos

O

procariotas

eucariotas

di-oxigenase

mono-oxigenase

dioxetano

epxido

redutase

EH

R

R

O

O

R

OH

OH

R

OH

OH

R

Epxidos como agentes alquilantes: txicos, cancergenos, teratognicos

Epxido Hidrolases Hepticas: CEH (citoslica); MEH (microsomal)

MEH

mais ativa e seletiva com epxidos no-naturais

fgado de porco, coelho, rato, camundongo, etc.

Sobrenadante 9000 g de homogenato de fgado Mecanismo de ao


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O O-

Asp

O

O O-

Asp

OH

HO

N

N

H

His

O O

OH

Asp

H O

H

Tir

OH

N

N

H

HHis

Influncia pH?

Subst Asp por Ser (mutao): que acontece?

resoluo cintica de epxidos assimtricos

OR

OH-

OH-

reteno

inverso

O

R

O

R

EH

HO

HOR

HO

HOR

+

+

substratos para MEH

cadeias lipoflicas prximas ao oxirano maior atividade

grupos polares prximas ao oxirano efeito inibidor

fatores estricos fatores eletrnicos (eletronegatividade)

O

R

O

R1

R2

O

R1

R2

O

R1

R2

R3 O

R1

R2

R3

R4> >

>


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R

MEH

tampo

R

HO

HX

X V reaoO Rpida

NH, N-CH3 LentaS No ocorre

EN O>N>S

Epxido Hidrolases Microbianas: convenincia p/ uso industrial;

escalonamento

Ex.: prep de hormnio juvenil (insetos)

OHO

O

OH

OH

OH

OH

Helmintosporiumsativum +


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Ex.: derracemizao de xido de estireno

O

O

O

O

CH2OH

OH

CH2

OH

OH

CH2OH

OH

B.s

A.n.

A.niger

B.sulfurescens

+

+

(ret.)

(inv.)

A. niger +

B. sulfurescens

98 % e.e. 83 % e.e.

89 % e.e., 92 % rend.

96 % e.e. 51 % e.e.

3.1.4. Hidrlise de Nitrilas

R-CN; H-CN

Nitrilas naturais: reserva de N; defesa

N

N N

NH2 CN

ribose

CN

O

R1

R2 glucoseN

OMe

CN

O

toiocamicina(antibiot.)

glicosdeos cianognicos(mandioca)

ricinina(mamona)

Hidrlise qumica: mecanismo

Caminhos possveis p/ hidrlise enzimtica

R C N R CO

OH+ NH3

R CO

NH2

nitrila hidratase amidase

nitrilase

RCO2H e NH3: alvos para screening

Nitrilase: mecanismo


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R C N R C

NH

S Enz

+ Enz-SH

H2O

R C

NH2

S Enz

O

H

R C

O

S Enz

H2O

R C

O

S Enz

OH

R C

O

OH

NH3

+ Enz-SH

AA contendo SH:

Exemplo:

O

NH2

NN

CN

Rhodococcus rhodochrouso-: picolinamida (977 g/l)m-: nicotinamida (1465 g/l)

p-: isonicotinamida (1099 g/(nitrila hidratase)

Importncia da nicotinamida: NAD, NADP, etc.

3.2. Reaes de Reduo


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conceito

desidrogenases

co-fatores: NAD(H); NADP(H)

reciclagem de co-fatores

enzimas isoladas X clulas inteiras

desidrogenase

cofator-H2 cofator

Substrato Substrato reduzido

sistema dereciclagem


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3.2.1. Reduo de Aldedos e Cetonas (Enzimas Isoladas)

Reduo qumica: NaBH4; LiAlH4; produtos racmicos

desidrogenase lcool de levedura (YADH)

desidrogenase lcool de fgado de cavalo (HLADH) Regra de Prelog

O

PG

OH

PG

[H-]

NAD(P)H NAD(P)

desidrogenase

YADH: muito especfica; aldedos ou metilcetonas; prep lcoois quirais

secundrios

HLADH (fgado de cavalo):

baixa especificidade

estrutura conhecida; R-X; dmero

red. De cetonas cclicas (4-9C)

Ex.:

TBADH (Thermoanaerobium brockii)

Termoestvel ( 85 oC)

Tolera solventes orgnicos Ex.:

1 R2

O

R1 R2

OH

R1 R2

OHTBADH

rec. NADPHou

O

O

H

H

136 O

O

H

H

136 + O

HO

H

H

136HLADH

recicl.NHADH


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HSDH (Hidroxiesteroid)

Substrato natural: esterides

Ex.:

O

R1

R2HO

R1

R2

OOH

O

R1

R2

+

rec. NAD(P)H

R1=R2=H

TBADH ou

HSDH

HSDH

R1,R2=Me, Cl

+

R1 R2 Enzima e.e. lcool(%)

H H HSDH < 10H H TBADH > 95H Cl HSDH > 90Cl Cl HSDH > 95Me Cl HSDH > 98Me Me HSDH > 95

Substratos preferidos pelas desidrogenases:

O

R H

O

R1 R2

R

O

O

YADH HLADH

TBADH HSDH

O

O

O


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3.2.2. Reduo de Aldedo e Cetonas com Clulas

Vantagens: co-fator

Desvantagens: baixa produtividade (transporte, rec produto, instabilidade

gentica do microorganismo)

Saccharomyces cerevisae

O mais usado; facilidade de manuseio

Primeira reviso: 1949!

Cetonas alifticas e aromticas simples: Prelog

Cadeias longas ou volumosas: no aceita

Comportamento divergente: diferentes DHs com preferncias

estereoqumicas opostas

Ex.:

Outros microorganismos redutores de cetonas

Geotrichum candidum

Sporotrichum exile

Mucor ambiguus

3.2.3. Reduo de C=C por Clulas

Hidrogenao qumica

Enoato redutases:Clostridia, Proteus, S. cerevisae, Beauveria sulfurescens

Adio trans de H

Ativao: facilitar ataque de H-

Ativadores: cidos, steres, lactonas, cetonas, aldedos ,- insaturados

R1 OR2

O O

R1 OR2

OH OS. cerevisae

R1 OR2

OH O

ou


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Ex.:

RCO2H

Cl

R

Cl

CO2Henoato redutase

S. cerevisae

Cl

CO2H

R

enoato redutase

S. cerevisaeR

CO2H

Cl

R

Cl

O

R

Cl

O

S. cerevisae

rpida

S. cerevisae

lentaR

Cl

OH

R

Cl

OH

+

major. 3.3. Reaes de Oxidao

Importncia

Problemas de mtodos qumicos: metais, inespecificidade (rgio, estreo)

3.3.1. Oxidao de lcoois

Mtodos qumicos: exemplos

Mtodos enzimticos: pouco usados

Termodinmicamente desfavorvel, recicl cofator dificultada

Inibio pelo produto (- polar)

pH timo 8-9: co-fator e produtos instveis

oxid lcool secundrio: destruio de quiralidade Oxidao regiosseletiva de poliis

Carboidratos


29/50

27

Ex.:

O O

OHOH

HO

OH

Assimetrizao de diis proquirais ou meso

OH

OHR

R

OHR

RH

O

HLADH

recicl NAD+

O

R

ROH

O

R

RO

HLADH

recicl NAD+

exp.

meso

CH2OH

C

C

C

C

CH2OH

O

HHO

OHH

HHO

Acetobacter

suboxidans

CH2OH

C

C

C

C

CH2OH

OHH

HHO

OHH

OHH

CHO

C

C

C

C

CH2OH

OHH

HHO

OHH

OHH

Sorbitol Sorbose cido L-ascrbicoGlicose

HOO

CO

C

CC

C

CH2OH

HOH

HHO


30/50

28

HLADH

recicl NAD+

HLADH

recicl NAD+

exp.

R

OH

OH

R

OH

O

H

OR

OH

OR

O

3.3.2. Reaes de Oxigenao

Oxidao qumica de HC: ativados (ex. oxid allica por SeO2) e no-ativados

(difcil, no-especfica)

Importncia

Oxigenases

Mono-oxigenases

Sub + DoadorH2 + O2 SubO + Doador + H2O

rec. co-fator

Dioxigenases

Sub + O2 SubO2

Oxidases

O2 + 2e- O2

2-H2O2

+ 2H+

2H2O2O22-O2 + 4e

- + 4H+


31/50

29

Mono-oxigenases

Maioria ligada a membrana

Ativao do O2: comum a todas

Tipos de substratos/produtos

Sub + O2 + H+ + NAD(P)H SubO + H2O + NAD(P)

+mono-oxigenase

C H C OH

R R

O

Rn-X Rn-X=O X= N, S, Se, P

H OH

R1 R2

O

R1 O

O

R2

Citocromo P-450: grupo + comum de MO; hemeproteina; detoxificao;

mesma seq 26 aa prox heme Ciclo cataltico: ~ oxid qumica com metais


32/50

30

Fe3+

S

ON

N

N

N

H H

e-

O2

Fe3+

S

N

N

N

N

OO

Sub

e-

Sub

Fe3+

S

N

N

N

N

OO

H2O 2H

+

Fe4+

S

N

N

N

N

O

Sub

Sub

Fe5+

S

N

N

N

N

O

H2O

SubO

Sub H2O Sub

Fe2+

S

N

N

N

NFe

3+

S

N

N

N

N

Sub

1. Acoplamento do substrato ao stio ativo

2. Red Fe

3+

> Fe

2+

(e

-

de NADP[H] ou outro co-fator (Fe

2+

mais reativo)3. Ligao de O2

4. Recep e-> enfraquecimento de ligao O-O

5. Sada de O na forma de gua: formao de nuclefilo forte

6. Ataque do O ao Sub; subst Sub oxidado pela H2O

MO dependente de flavina:

Co-fator: flavina

Substratos: aldedos, cetonas; produtos: steres

Ciclo cataltico de MO: ~ oxid qumica com perxidos/percidos

H

O OR

R1 OR2

O

R1 R2

OHO O

R

R1 R2

O

Bayer-Williger


33/50

31

O2

Sub

N

N NH

N O

O

NADPH NADP+

(Enz-FAD)

N

N NH

N O

O

H

H

(Enz-FADH2-Sub)

N

NNH

N O

OH OHO

(Enz-FAD-4a-OOH-Sub)

N

NNH

N O

OH OH

(Enz-FAD-4a-OH-SubO)

SubO + H2O

N

NNH

N O

OH O

O

O

N

NNH

N O

OH O

O

O

O

O

Hidroxilao de Alcanos

Funcionaliz em pos no-ativadas: poucas alternativas em Q.O.

Reativ relativa: 2o>3o>1o.

Hidroxil esterides

F. verticilloides

CH2OH

Limoneno lcool Perlico


34/50

32

Hidroxilao de Comp Aromticos Hidrox regioespecfica difcil por via qumica

Monooxigenases: hidrox em o- e p-; via epxido

Polifenoloxidases (tirosinase): fenol -> catecol -> o-quinona ->

polimerizao

R

OH

R

OH

OH

O2 H2O

polifenoloxidase

O2 H2O

polifenoloxidase

R

O

O

R.arrh izus

CO2H

O

CO2H

O

OH

O

CO 2H

OH

O

CO 2H

OHO

CO 2H

F. verticilloides

+

P. chrysogenum

CO2H

OCH2OH

CO2H

O


35/50

33

Mecanismo

Ex.: L-dopa (3,4-diidroxifenilalanina); L-epinefrina (adrenalina)

HO

HO

OH

NHCH3

adrenalina

HO

HO

COOH

NH2H

L-3,4-diidroxifenilalanina(L-DOPA)

Uso de microorganismos; Ex.

N

CO2H

O N

OHCunninghamellaechinulata

Pseudomonas sp

N

CO2H

HO

O N

OH

HO

cido 6-hidroxinicotnico

prenalterol (>85%)

(100 %)


36/50

34

Epoxidao de alquenos

Epxidos quirais: intermedirios sintticos de alto valor

Mtodos qumicos

Epxidos pequenos e no-funcionalizados: obteno difcil por via qumica

Monooxigenases: no usadas em escala preparativa; co-fator; natureza

complexa

Clulas: uso de meio bifsicos; minimizao efeito txico do produto

Ex.:

1 H

R2

R1

R2

Omicroorganismo

O2

Pseudomonas oleovorans

Corynebacterium equiMycobacterium sp

Xanthobacter spNocardia sp

Reaes de Baeyer-Villiger

Mtodo qumico: ster ou lactona

MO dependente de flavina

Uso de clulas

Acinetobacter sp, Pseudomonas sp (algumas patognicas)

Risco de hidrlise do produto: inibidores (p-nitrofenilfosfato de etila =

paraoxon); mutantes no-hidrolticas

Ex.:

O

R

O

RO

O

R

Acinetobacter sp+

Diidroxilao de aromticos

Importncia ecolgica Obteno de glicis quirais


37/50

35

Pseudomonas sp

R

O

O

R

di-oxigenase

O2

R

OH

OH

redutase

H2

R

OH

OH

diidrodioldesidrogenase

NAD(P)H NAD(P)+

3.4. Formao de Ligaes C-C

reaes do tipo aldlicas: mecanismo

sntese de imina: mecanismo

R1 R2

NH

R1 R2

O

NH3

C

OH

NH2

R2R1

aldolases

substratos: carboidratos, aa, hidroxicidos

adio 1, 2 ou 3C

2 grupos

Aldolase tipo I

Plantas superiores e animais

Co-fator: no requer

Mecanismo

CH3CHO CH3CHCH2CHO

OHOH-, H2O

5o, 4-5 haldol


38/50

36

H2O

-Enz-NH2

H

OR1

R

N

R1

X

OH

Enz

R

O

1

X

OH

RX

N

Enz

H

Enz-B

Enz-NH2

-H2O RX

NEnz

H H

X=H, OH, NH2

RX

O

baseSchiff

enamina

Aldolase tipo II

Bactrias e fungos

Dependente de Zn2+

Mecanismo

Receptor:

Doador: R

O

X

HR1

O

R

O-

X

H R1

O

NN

Enz

H

Zn+2

R1

OH

R

X

O

Obs.: remoo inicial de H+do doador por uma histidina


39/50

37

Exemplo: anlogos nitrogenados de acar (anti-HIV)

3.5. Adio e Eliminao

Liases:

adio de H2O ou NH3a alquenos;

adio de HCN a C=O

PO OH

O

+ H

O

N3

OHaldolaseFDP

PO

O

N3

OH

OH

OH

PO

O

N3

OH

OH

OH

+

1) fosfatase2) H

2/Pd

1) fosfatase2) H

2/Pd

NH

OHOH

OH

HO

NH

OH

OH

OH

HO

deoxinojirimicina deoximanojirimicina


40/50

38

3.5.1. Formao de Cianidrina

Cianidrinas: estrutura; sntese qumica: aldedo/cetona + HCN

Importantes intermedirios em qumica orgnica

R CN

OHvrios produto

sntese enzimtica: oxinitrilases

Ex.: (prioridade R > R)

R' R"

OR' R"

CNHO

R' R"

OHNC

HCN

R-oxinitrilase

S-oxinitrilase

fontes:

(R)-oxinitrilases: famlia Rosaceae (amndoa, ameixa, pssego) (S)-oxinitrilases: Sorghum bicolor(sorgo), Hevea brasiliensis(seringueira),

Ximenia americana(sndalo), Manihot esculenta(mandioca).

Problemas: uso de HCN transcianao (acetona cianidrina)

3.5.2. Adio de gua e Amnia

Fumarase: ad gua a C=C

C C

X

HOOC

COOH

HC C

X

HOOC

COOH

OH

HH

X= H (ac. fumrico), Cl X= H (ac. mlico)

fumarase

H2O

Influncia da e.n. de X. 3-metilaspartase: ad amnia a C=C


41/50

39

C C

X

HOOC

COOH

HC C

X

HOOC

COOH

NH2

HH

X= H, Cl, Me, etc.

NH3

3-metilaspartase

3.5.3. Reaes tipo acilona

Qumica: mecanismo

Biocataltica: sntese da efedrina

Ph H

O

H3C CO2H

O

Ph

OH

O+

S. cerevisae(descarboxilase

de piruvato)

CO2

aciloina

Ph

OH

NH

CH3

(-)-efedrina

MeNH2

H2/Pt

3.6. Transglicosilao

oligossacardeos e polissacardeos: migrao intracelular e excreo de

glicoproteinas; interaes clula-clula; oncognese; interao da superfcie

celular com patgenos

sntese qumica de carboidratos difcil

biocatlise atraente: glicosil transferases; glicosidases


42/50

40

3.6.1. Glicosiltransferases

requer acar ativado (UDP-acar)

3.6.2. Glicosidases

independem de co-fatores

endo e exo-glicosidases hidrlise reversa

transglicosilao

usos: celulose > glicose > etanol


43/50

41

Exemplo glicosilao de diis:

Exemplo hidrlise do esteviosdeo:OGG

CO2G

OH

CO2H

esteviosdeo esteviol

pectinase

Exemplo glicosilao do esteviosdeo (veja artigo J.Biotechnology, 2006):

+

esteviosdeo

OGG

CO2G

OGG

CO2G

G

rebaudiosdeo

glicosidases deFusarium sp maior proporo

de rebaudiosdeo


44/50

42

Mecanismo lizozima (Nature Structural Biology 8, 737 - 739 (2001)

doi:10.1038/nsb0901-737): NAG= N-acetilglicosamina.

3.7. Halogenao e Desalogenao

Introduo

Cerca de 1000 PN halogenados

Importncia: diazepam, mitotano

CH

CHCl2

Cl

Cl

mitotano

N

NO

CH3

Cl

diazepam

Derivados de Cl (terrestres) e Br (marinhos) mais comuns

Algas marinhas: lib 107ton bromoalcanos

Toxicidade de haloalcanos

Halogenao

Qumica

Haloperoxidases: nico tipo isolado


45/50

43

Cloroperoxidase de Caldariomyces fumago; bromoperoxidase de

Pseudomonas aureofaciens; iodoperoxidase de raiz forte (Armoracia

lapathifolia)

Substrato + H2O2+ X

-

+ H

+

Produtos halogenados + 2H2O

1. Halogenao de Alquenos

X+

haloperoxidase

HOX ou X2

OH

X

Y

X

OH-

Y-

O-

O

OO

Xn

I

OH

OH

I

cloroperoxidase

I-, H2O2

+

9 : 1

Halogenao de alquinos

CHCl2

O

Cl

O

Cl+

1 : 2 : 0,3

CH3 C CHcloroperoxidase

Cl-, H2O2

Cl

O

+

Halogenao de Compostos Aromticos

NH2

Cl

NH2

Cl

Brcloroperoxidase

Br-, H2O2


46/50

44

Halogenao de Grupos C-H

cloroperoxidase

Cl-

, H2O2

OO OO

Cl

Desalogenao

Importncia ambiental: biodegradao (pesticidas, solventes, etc.)

Mtodo qumico

Halohidrina Epoxidases

Fontes: bactrias (Flavobacteria, Corynebacteria, Pseudomonas),

fungos (Caldariomyces fumago), algas (Laurencia pacifica)

XHO

haloidrina epoxidase

O+ HX

2. Desalogenases: Sn X OH (indep de co-fator); influncia da

natureza de RX (1o., 2o. 3o.)

O O-

Asp

C X

R

H

H

O O-

O O

CH2R

OH

H

N

N

H

His

N

N

H

N

N

H

H

RCH2OH

Asp Asp

3. Ex.: (S)-2-cloropropinico (sntese de anti-inflamatrios e herbicidas)

CO2H

Cl

CO2H

OH

CO2H

Cldesalogenase

(P. putida)+

e.e. > 98%


47/50

45

4. Tcnicas Especiais

4.1. Imobilizao

aderncia da enzima a um suporte slido ou confinamento reutilizao da enzima

tcnicas

adsoro (van der Waals, inica, lig. H)

ligao covalente

ligao cruzada

confinamento em gis

confinamento em membranas


48/50

46

4.2. Enzimas Modificadas e Art ificiais

enzimas solveis em solventes orgnicos (mod. PEG)

bio-imprinting

enzimas semi-sintticas

anticorpos catalticos

O

O

Ph

OH

R

OH+

-O OPh

R

O

O

R

OP

O OPh

R

+ PhOH


49/50

47

5. Outras Aplicaes

5.1. Modelos microbianos de metabolismo de mamferos

Importncia

Exs.:

5.2. Derivados Ativos de Drogas

Importncia

Exs.:

N

NO

CH3

l

diazepam

N

O

O

F

O

S16924 (Servier)Antipsictico

Cunninghamella echinulataMucor plumbeus

Metablitos

O

OO

OCH3

OH

OH21

O

OO

OH

OH21

Galbanoldeo A Galbanoldeo B

Potentes antifngicos (Merck)

Streptomyces halstedii

21-OH


50/50

48

Bibliografia

K. FABER. Biotransformations in Organic Chemistry - A Textbook, 5thed.

Springer, New York, 2004. (Terceira edio disponvel na Biblioteca de

Tecnologia e na de Biolgicas,660.634 B617).

A. L iese, K. Seelbach, C. Wandrey. Industrial Biotransformation, Wiley,

Weihheim, 2000. (660.63 L721i). (Disponvel na Biblioteca de Tecnologia).

A.L. DEMAIN and J.E. DAVIES. Manual of Industrial Microbiology and

Biotechnology, 2ndEdition, American Society for Microbiology,

Washington,1999. (660.62 M294i)

P. PRAVE, U. FAUST, W. SITTING, D.A. SUKATSCH. Fundamentals of

Biotechnology, Editora VCH, Federal Republic of Germany, 1987.

Q. H.G. Davies, R.H. Green, D.R. Kelly, S.M. Roberts. Biotransformations in

Preparative Organic Chemistry, Academic Press, New York, 1989. (547.2

B615).

R. H.-J. Rehm, G. Reed and A. Puhler (Ed.). Biotechnology, 2nded. Weinheim :

VCH, 1993- Biotransformations, Vol 8a, 8b (660.6 B616).

Documents

Biotransformação de Compostos Orgânicos