Universidade Federal do Paraná Departamento de Química

BIOTRANSFORMAÇÃO

DE COMPOSTOS ORGÂNICOS

Brás H. de Oliveira (bho@ufpr.br)

2017

ii

1. Introdução ...................................................................................................................... 11.1. Aspectos gerais ...................................................................................................... 11.2. Exemplos industriais ............................................................................................. 11.3. Aspectos químicos e de bioatividade ..................................................................... 31.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores .................................................... 4

1.4.1. Vantagens de uso de enzimas ........................................................................ 41.4.2. Desvantagens do uso de enzimas .................................................................. 5

1.5. Propriedades Enzimáticas ...................................................................................... 51.5.1. Aspectos Mecanísticos .................................................................................. 61.5.2. Classificação e nomenclatura de enzimas ..................................................... 81.5.3. Coenzimas ..................................................................................................... 91.5.4. Fontes de Enzimas ......................................................................................... 9

2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatálise .......................................................... 102.1. Introdução ............................................................................................................ 102.2. Triagem ................................................................................................................ 102.3. Metodologia analítica .......................................................................................... 112.4. Exemplo ............................................................................................................... 11

3. Aplicações Biocatalíticas ............................................................................................. 133.1. Reações de hidrólise ............................................................................................ 13

3.1.1. Hidrólise de amida ....................................................................................... 133.1.2. Hidrólise de ésteres ...................................................................................... 143.1.3. Hidrólise de Epóxidos ................................................................................. 183.1.4. Hidrólise de Nitrilas .................................................................................... 21

3.2. Reações de Redução ............................................................................................ 233.2.1. Redução de Aldeídos e Cetonas (Enzimas Isoladas) ................................... 253.2.2. Redução de Aldeído e Cetonas com Células ............................................... 273.2.3. Redução de C=C por Células ...................................................................... 27

3.3. Reações de Oxidação ........................................................................................... 293.3.1. Oxidação de Álcoois .................................................................................... 293.3.2. Reações de Oxigenação ............................................................................... 31

3.4. Formação de Ligações C-C ................................................................................. 403.5. Adição e Eliminação ............................................................................................ 42

3.5.1. Formação de Cianidrina ............................................................................... 423.5.2. Adição de Água e Amônia ........................................................................... 433.5.3. Reações tipo aciloína ................................................................................... 43

3.6. Transglicosilação ................................................................................................. 433.6.1. Glicosiltransferases ...................................................................................... 443.6.2. Glicosidases ................................................................................................. 44

3.7. Halogenação e Desalogenação ............................................................................ 474. Técnicas Especiais ....................................................................................................... 50

4.1. Imobilização ........................................................................................................ 504.2. Enzimas modificadas e artificiais ........................................................................ 51 enzimas artificiais (Nature Chemistry | vol 8 | september 2016, DOI: 10.1038/NCHEM.2555) .................................................................................................. 52

5. Outras Aplicações ........................................................................................................ 525.1. Metabolismo de drogas ........................................................................................ 525.2. Bioativação .......................................................................................................... 525.3. Modelos microbianos de metabolismo de mamíferos ......................................... 535.4. Derivados ativos de drogas .................................................................................. 53

1

BIOTRANSFORMAÇÃO DE COMPOSTOS ORGÂNICOS

1. Introdução

Este resumo se refere à disciplina de Biotransformação de Compostos Orgânicos.

Ele foi preparado devido à ausência de textos em Português nesse assunto. Seu conteúdo se

baseia na bibliografia recomendada e em informações de várias outras fontes. Ele pretende

apenas ser um guia para o estudante e mais informações serão fornecidas durante as aulas.

1.1. Aspectos gerais

conceito

importância: alternativa/auxiliar à síntese orgânica; obtenção de moléculas

quirais;

aplicação industrial: > 200 processos (ca. 2% do total de US$ 25 bilhões)

número de processos ao longo do tempo (gráfico)

1.2. Exemplos industriais (Ref. Industrial Biotransformations)

Produto Biocatalisador Desde Empresa Vinagre Bacteria 1823 Varias L-2-metilamino-1-fenilpropan-1-ol

Levedura 1930 Knoll AG, Alemanha

L-sorbose Acetobacter suboxydans

1934 Varias

Prednisolona Arthrobacter simplex 1955 Schering AG, Alemanha

Ác. L-aspártico Escherichia coli 1958 Tanabe Seiyaku Co., Japão

Ác. 7-aminodesace

toxicefalosporanico

(7-ADCA)

Bacillus megaterium 1970 Asahi Chemical Industry, Japão

Ác. L-málico Brevibacterium ammoniagenes

1974 Tanabe Seiyaku Co., Japão

D-p-hidroxifenilglicina Pseudomonas striata 1983 Kanegafuchi Chemical Co, Japão

Acrilamida Rhodococcus sp 1985 Nitto Chemical Ltda, Japão

Ác D-aspártico e L-alanina

Pseudomonas dacunhae

1988 Tanabe Seiyaku Co., Japão

L-carnitina Agrobacterium sp 1993 Lonza, Rep Checa Ác 2-ceto-L-gulonico Acetobacter sp 1999 BASF, Merck,

Cerestar, Alemanha

2

Ácido 6-aminopenicilânico (6-APA)

N

N

S

CO2H

O

O

H

CO2H

H2N

N

S

CO2HO

+

penicilina Gácido 6-aminopenicilânico

(6-APA)

penicilinaacilase

Usos: síntese de penicilinas semissintéticas

Condições da reação:

• C: 0.24 M, 80 g/ L [334.39 g/mol]

• pH: 8.0

• T: 30-35 oC

• Meio: aquoso

• Reação: hidrólise de amida

• Catalisador: enzima imobilizada

• Enzima: penicilina amidoidrolase (penicilina acilase, penicilina amidase)

• Cepa: Escherichia coli e outras (e.g. Bacillus megaterium)

• CAS (enzima): [9014-06±6]

3

Parâmetros do processo:

• conversão: 98%

• rendimento: 86% (reação: 97%); seletividade: > 99%; pureza: 99%

• tipo de reator: repetitive batch; volume: 3.000 L

• capacidade: 300 t/ano

• tempo de residencia: 1.5 h (average over 800 cycles; initial: 1 h)

• rendimento tempo-espaço: 445 g/L/dia

• down stream processing: extração, cristalização

• atividade da enzima: 22 M U, correspondente a aprox. 100 Kg de

biocatalizador úmido (27.5 Kg de Eupergit-C seco)

• consumo da enzima: 345 U/Kg (6-APA)

• início produção: 1973

• empresa: Unifar, Turkey (e outras: Fujisawa Pharmaceutical Co., Japan,

Gist-Brocades/DSM, The Netherlands, Novo-Nordisk, Denmark, Pfizer,

USA)

1.3. Aspectos químicos e de bioatividade

a) Esteróides

b) Aromas (patchouli)

O

O

O

OH

OH

O

O

O

OHO

progesterona

cortisona

11α-hidroxiprogesterona

R. arrhizus

P. rubrumHO

CH2OH

HO HO

álcool patchouli nor-pathcoulenol

4

c) Medicamentos (talidomida)

(R :sedativo; S : teratogênico)

d) Outros

1.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores

1.4.1. Vantagens de uso de enzimas

são catalizadores eficientes

são aceitáveis ecológicamente

atuam em condições brandas

são mutualmente compatíveis

não estão limitadas ao papel natural

podem catalizar um grande espectro de reações

seletividade

quimioseletividade,

regioseletividade

enantioseletividade: feitas de L-aa

N

O

ONH

O

O

HO2CC

NH2

C

H

H3C CH3

SH HO2CC

H

C

H2N

H3C CH3

SH

HO2CC

HH2N

NH2

O

HO2CC

NH2H

NH2

O

R-penicilamina toxico

S-penicilamina antiartrítico

R-asparagina doce

S-asparagina amarga

5

1.4.2. Desvantagens do uso de enzimas

ocorrem em apenas uma forma enantiomérica

requerem parâmetros restritos (pH, temp.)

mostram maior atividade catalítica em água

são propensas à inibição

podem causar alergias

Enzimas Isoladas X Células Inteiras

Biocatalizador Forma Pros Contras

Enzima isolada Qualquer ap. Simples, elab. Simples, melhor produtividade

reciclagem de co-fator

dissolvida em água

alta atividade enzimática reações colaterais, subst. lipofil. insolúveis, elab. requer extração

suspensa em solv. Orgânico

fácil de realizar, elab. fácil, subst. lipofílicos solúveis, fácil rec. da enzima

baixa atividade

Imobilizada fácil recuperação da enzima

perda de atividade durante a imobilização

células inteiras Qualquer desnecessário reciclar co-fatores

equip. caro, elaboração tediosa, baixa produt. (menor tolerância à concentração), baixa tolerância a solv. org., reações colaterais

cultura em crescimento

maiores atividades mais biomassa, mais sub-produtos, processo difícil de controlar

células em repouso

elaboração mais fácil, menos sub-produtos

menores atividades

células imobilizadas

células reutilisáveis menores atividades

1.5. Propriedades Enzimáticas grupos hidrofílicos externos (-COOH, -OH, -NH2, -SH, -CONH2)

grupos lipofílicos internos

pontes disulfeto

6

inativação:

rearranjo da cadeia peptídica (começa a 40-50 oC); reversível

hidrólise; irreversível

troca de pontes disulfeto

reações de eliminação e oxidação

enzimas termoestáveis (microorganismos termofílicos)

1.5.1. Aspectos Mecanísticos

a) Mecanismo “Chave e Fechadura” (Fisher, 1894)

Problemas: substratos de pequeno volume; substratos não-naturais

7

b) Mecanismo do encaixe induzido (Koshland Jr., 1960’s)

c) Teoria de desolvatação e solvatação-substituição

Desolvatação (Dewar,1986)

substrato substitui água no sítio ativo

reação tipo “fase gasosa”

Solvatação-substituição

água de solvatação do substrato substituida pelo sítio ativo

d) Regra de atracagem de três pontos

8

e) Razões cinéticas da seletividade

1.5.2. Classificação e nomenclatura de enzimas

IUB: 3.000 enzimas (de 25.000)

atividade catalítica: 1 U.I. = 1 µmol de substrato transformado/min.

enzimas disponíveis comercialmente

EC A.B.C.D

A: principal tipo de reação

B: subtipo indicando tipo de substrato

C: natureza do co-substrato

D: número da enzima específica

Ex.: β-glucosidase (EC 3.2.1.21) de amêndoa; 20-40 unidades/ mg de

sólido

9

Classe Número Tipo de reação Utilidade* classific. dispon. 1. oxidoredutases 650 90 oxidação-redução +++

25% 2. transferases 720 90 transferência de grupos +

5% 3. hidrolases 636 125 hidrólise/formação de

várias funções +++ 65%

4. liases 255 35 adição/eliminação de pequenas moléculas

++ 5%

5. isomerases 120 6 isomerização ± 5%

6. ligases 80 5 formação/clivagem de C-O, C-S, C-N, C-C

± 1%

(*) +++: muito útil; ± = pouco uso; %: percentagem de pesquisa no período 1987-96

1.5.3. Coenzimas

NAD/NADH; NADP/NADPH; ATP; acetil-CoA

1.5.4. Fontes de Enzimas

indústria de detergentes e alimentos: proteases e lipases

fontes animais: rins, fígado, pâncreas

fontes microbianas: coleções de cultura; natureza

10

2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatálise

2.1. Introdução necessidade de novas enzimas

novas moléculas quirais

substituição de processos químicos

processos ecológicamente corretos

2.2. Triagem fontes de enzimas

solo: 109 células/g

água

vegetais (endofíticos): ex. GA3

isolamento não seletivo: solo seco, abs esponja, agar, incubação (temp

variadas).

isolamento seletivo: pré-tratamento do solo; ad antibiótico; meio seletivo.

11

2.3. Metodologia analítica Importância

Métodos físico-químicos: ccd, clae, cg

Bioensaios (células animais, microbianas, enzimáticos)

HTS (“high-throuput screening”)

2.4. Exemplo

Biotransformação de Esteróis. Brás H. de Oliveira e Deise D. Bueno,

Química Nova 19 (3), 233-6 (1996).

Importância de substâncias esteroidais: hormônios, antiinflamatórios,

anticoncepcionais, etc.

Matérias-primas; intermediários

O

O

AndrostenodionaHO

β-Sitosterol

O

O

HO

Diosgenina

O

O

Progesterona

amostras de solo e de sementes de soja em meio líquido contendo colesterol

como única fonte de C; 7 dias

alíquota para novo frasco contendo o mesmo meio; processo executado por

um total de 15 vezes.

Crescimento microbiano em todos os frascos

Seleção: meio c/ colesterol dosagem

12

TABELA 1- Degradação de Colesterol por Microorganismos Provenientes da

Amostragem 1. (S = amostra de semente; So= amostra de solo). Concentração

inicial de colesterol = 200 mg%

Amostra Colesterol Degradado

(%) 10 (S)(*) 53,02

25 (S) 50,92 8 (So) 48,82 14 (S) 47,98 7 (S) 38,76 ……. …….

(*) amostra utilizada nos experimentos de degradação do β-sitosterol

Transferência p/ meio sólido

Isolamento: bactéria Gram +

Experimento preparativo com sitosterol

Extração com solvente

Isolamento cromatográfico de androst-4-eno-3,17-diona

O

O

androst-4-eno-3,17-diona

13

3. Aplicações Biocatalíticas

3.1. Reações de hidrólise

Hidrólise química: mecanismo

2/3 do total

aspectos mecanísticos: serina hidrolases

tríade catalítica: importância

C OR2

R1

ON

N

H

His

R2OHO O-

Asp

OH

Ser

O OH

Asp

N

NH

His

OC

O

R1

Ser

C OHR1

O

O HH

enzimaacilada

3.1.1. Hidrólise de amida

Ligação amida

Importância: química de aa e peptídeos

Mercado de aa: > 0,5 milhão toneladas/ano (US$ 2 bilhões)

Adoçantes não-calóricos: aspartame (Asp, Phe)

Rotas enzimáticas p/ aa enantioméricamente puros:

14

R CO2R'

NH2

R CO2H

NH2

hidrolase

desidrogenaseamin. redutiva

R CO2H

O

CO2H

R

liase

Resol por hidrolases: proteases, esterases ou lipases

3.1.2. Hidrólise de ésteres

Ligação éster: hidrólise

Esterases, proteases e lipases

3.1.2.1. PLE (“Pig Liver Esterase”)

versátil, substrato-tolerante, barata

Ex.: prostaglandinas

CO2Me

CO2Me

OHPLE

CO2Me

CO2H

OH

e.e. 98%

O

COOMe

OH

HO

O

COOH

OH

HO

PLE

15

3.1.2.2. Esterases microbianas

S

S

CO2

OAc

t-Bu

S

S

CO2

OH

t-Bu

S

S

CO2

OAc

t-Bu

Bacillus sp e.e. 94%

+

CO2MeR

carboxilesteraseNP

Bacillus subtilis

R= Aril-

R= Aril-O-

CO2HAr

CO2HArO

CO2MeAr

CO2MeArO

+

+

e.e. > 95%

e.e.> 87% Ex.: analgésicos, antiinflamatórios

CO2H CO2H

MeOIbuprofeno Naproxeno

Otimização da seletividade

Modificação do substrato

Variação do sistema de solvente

Variação do pH

OAc

OAcOH

OAc

PLE

Meio e.e. (%)

H2O 55H2O/DMSO 6:4 72H2O/DMF 8:2 84H2O/t-BuOH 9:1 96

16

3.1.2.3. Lipases

Hidrólise de triglicerídeos

Importante em: processamento de alimentos e prep de intermediários quirais

Pode hidrolisar e formar lig éster

Diferença lipase X esterase: interação c/ substrato

Mecanismo: α-hélice (“tampa”) é aberta quando em contato c/ bifase óleo-

água

Lipase pancreática de porco (PPL)

A mais barata

Preparação bruta (pacreatina, esteapsina)

Outras hidrolases presentes (α-quimotripsina, colesterol esterase,

fosfolipases, etc.)

Alta seletividade pode ser devida às impurezas

AcO HO OAc

+hidrolase

rac

Enzima V Reação Seletividade

(razão enantiomérica)

PPL bruta Boa >300

PPL pura Não reage -

α-quimotripsina Não reage -

Colesterol esterase Rápida 17

Hidrolase nova Boa 210

17

Lipases de Candida sp

C. lipolytica, C. antartica (CAL), C. rugosa (CRL)

C. rugosa: aceita ésteres volumosos (p.ex. de álcoois sec. cíclicos)

OAc

CO2Et

OH

CO2Et

OAcCO2Et

O

CO2Et

O

CO2Et

CRL

principal

e.e.= 77%

e.e. > 99% traços

Lípases de Pseudomonas sp (PSL)

P. fluorescens, P. aeruginosa, P. cepaceae , P. glumae

Não aceitam ésteres volumosos

Ar

SS(CH2)n (CH2)n

CO2MeMeO2C

Ar

SS(CH2)n (CH2)n

CO2HMeO2C

PSL

n e.e. (%)

1 482 >983 79

Lípases de Mucor sp (MSL)

M. miehei, M. javanicus

M. miehei : operador químico Asp-His-Ser (similar outras lípases)

O

RO

O

RO

OO

ROH

RO

O

lipase

Lipase R Solvente e.e. (%)

CRL H tampão 12 PSL H tampão 81 MSL H tampão >99 MSL Me tampão >99 PPL Me tampão 20 PPL Me tampão/hexano 85

18

Outras Lipases: microbianas

3.1.3. Hidrólise de Epóxidos

Epóxidos: estrutura, preparação, importância (intermediários p/ síntese de

compostos bioativos)

Síntese assimétrica/resolução: não disponível (exceto método Sharpless –

álcoois alílicos)

Epoxidação microbiológica: possível mas técnicamente difícil (eng. Processo)

Hidrólise química: mecanismo cat ácida e básica

Epóxido Hidrolases (EH): mais úteis que epoxidases; metabolismo de

alquenos e aromáticos

O

procariotas

eucariotas

di-oxigenase

mono-oxigenase

dioxetano

epóxido

redutase

EH

R

R

O

O

ROH

OH

R

OH

OH

R

Epóxidos como agentes alquilantes: tóxicos, cancerígenos, teratogênicos

Epóxido Hidrolases Hepáticas: CEH (citosólica); MEH (microsomal)

MEH

mais ativa e seletiva com epóxidos não-naturais

fígado de porco, coelho, rato, camundongo, etc.

Sobrenadante 9000 g de homogenato de fígado

AcO

OMe

O

Me

OH

OMe

O

Me

AcO

OMe

O

Me

+lipase

Aspergillus sp.

19

Mecanismo da reação

Asp

O O

Asp

O O

Asp

O O

O

OH

Tir

OH

N

N

H

His

O

HH OH

HO

N

N

H

HisH

O Tir

Influência pH?

Mutação: e.g. substituição Asp por Ser; consequências.

resolução cinética de epóxidos assimétricos

O

R

OH-

HO

R

OHretenção

O

ROH-

R

H

HO

inversão

H OH

O

HOH-

R

H

HO

inversão

R OH

Rac

20

Exemplo: esteroides (influência da EN)

R

X

MEH

tampão

R

HO

HX

X V reação O Rápida

NH, N-CH3 Lenta S Não ocorre

Ex.: hormônio juvenil (insetos)

OHO

OOH

OH

OH

OH

Helmintosporiumsativum +

Ex.: derracemização de óxido de estireno

O

O

O

O

CH2OH

OH

CH2OH

OH

CH2OH

OH

B.s

A.n.

A. niger

B. sulfurescens

+

+

(ret.)

(inv.)

A. niger +

B. sulfurescens

98 % e.e. 83 % e.e.

89 % e.e., 92 % rend.

96 % e.e. 51 % e.e.

21

3.1.4. Hidrólise de Nitrilas

R-CN; H-CN

Nitrilas naturais: reserva de N; defesa

N

N N

NH2 CN

ribose

CN

O

R1

R2 glucoseN

OMe

CN

O

toiocamicina(antibiot.)

glicosídeos cianogênicos(mandioca)

ricinina(mamona)

Hidrólise química: mecanismo

Caminhos possíveis p/ hidrólise enzimática

R C N R CO

OH+ NH3

R CO

NH2

nitrila hidratase amidase

nitrilase

RCO2H e NH3: alvos para triagem

Nitrilase: mecanismo

R C N R CNH

S Enz+ Enz-SH

H2O

R C

NH2

S Enz

OH

R CO

S Enz

H2O

R C

O

S Enz

OH

R CO

OH

NH3

+ Enz-SH

AA contendo –SH:

Exemplo:

ONH2

NN

CN

Rhodococcus rhodochrouso-: picolinamida (977 g/l)m-: nicotinamida (1465 g/l)p-: isonicotinamida (1099 g/(nitrila hidratase)

22

Importância da nicotinamida: NAD, etc.

P O

O

O

O

P

O

O

OOO

NN

HO

OHHO

OH

N

N

N

H2N

NH2

O

23

3.2. Reações de Redução

Reciclagem

Substrato Substrato-H2

Desidrogenase

NAD(P)H NAD(P)H

conceito

redução química: NaBH4; LiAlH4; produtos racêmicos

desidrogenases

co-fatores: NAD(H); NADP(H)

P O

O

O

O

P

O

O

OOO

NN

HO

OHHO

OH

N

N

N

H2NH

P O

O

O

O

P

O

O

OOO

NN

HO

OHHO

OH

N

N

N

H2N

H

NADH

NAD+

NH2

O

NH2

O

H

24

RN

H

C O

R

R

H A

H

H2N O

RN

C OH

R

R

A-

H

H2N O

H

reciclagem de co-fatores: química, eletroquímica, fotoquímica, enzimática

reciclagem enzimática

mesma enzima

Substrato Substrato-H2

Substratoauxiliar-H2

Substratoauxiliar

EnzimaNAD(P)H NAD(P)H

outra enzima

Substrato Substrato-H2

Substratoauxiliar-H2

Substratoauxiliar

Enzima 2

NAD(P)H NAD(P)H

Enzima 1

exemplos

25

NAD(P)+ NAD(P)H

Desidrogenasede formato

HCO2- CO2

NAD(P)+ NAD(P)H

GlucosedesidrogenaseO

HOHO

OH

OH

OHO

HOHO

OH

OH

O

CO2H

OHHO

HO

OH

OH

ácidoglucônico

enzimas isoladas X células inteiras

3.2.1. Redução de Aldeídos e Cetonas (Enzimas Isoladas) desidrogenase álcool de levedura (YADH)

desidrogenase álcool de fígado de cavalo (HLADH)

Regra de Prelog

O

P G

OH

P G

[H-]

NAD(P)H NAD(P)

desidrogenase

YADH: muito específica; aldeídos ou metilcetonas; prep álcoois quirais

secundários

HLADH (fígado de cavalo):

baixa especificidade

estrutura conhecida; R-X; dímero

red. De cetonas cíclicas (4-9C)

Ex.:

26

TBADH (Thermoanaerobium brockii)

Termoestável ( 85 oC)

Tolera solventes orgânicos

Ex.:

R1 R2

O

R1 R2

OH

R1 R2

OHTBADH

rec. NADPHou

HSDH (Hidroxiesteroid)

Substrato natural: esteróides

Ex.:

OR1

R2 HOR1

R2

OOH

OR1

R2

+

rec. NAD(P)H

R1=R2=H

TBADH ou HSDH

HSDH

R1,R2=Me, Cl+

R1 R2 Enzima e.e. álcool (%)

H H HSDH < 10 H H TBADH > 95 H Cl HSDH > 90 Cl Cl HSDH > 95 Me Cl HSDH > 98 Me Me HSDH > 95

O

O

H

H

136 O

O

H

H

136 + O

HO

H

H

136HLADH

recicl.NHADH

27

3.2.2. Redução de Aldeído e Cetonas com Células Vantagens: co-fator

Desvantagens: baixa produtividade (transporte, rec produto, instabilidade

genética do microorganismo)

Saccharomyces cerevisae

O mais usado; facilidade de manuseio

Primeira revisão: 1949!

Cetonas alifáticas e aromáticas simples: Prelog

Cadeias longas ou volumosas: não aceita

Comportamento divergente: diferentes DHs com preferências

estereoquímicas opostas.

Ex.:

Outros microorganismos redutores de cetonas

Geotrichum candidum

Sporotrichum exile

Mucor ambiguus

3.2.3. Redução de C=C por Células

Hidrogenação química

Enoato redutases: Clostridia, Proteus, S. cerevisae, Beauveria sulfurescens

Adição trans de H

Ativação: facilitar ataque de H-

Ativadores: ácidos, ésteres, lactonas, cetonas, aldeídos α,β- insaturados

Ex.:

R1 OR2

O O

R1 OR2

OH OS. cerevisae

R1 OR2

OH Oou

28

RCO2H

Cl

R

Cl

CO2H enoato redutaseS. cerevisae

Cl

CO2H

R

enoato redutaseS. cerevisae

RCO2H

Cl

R

Cl

O

R

Cl

O

S. cerevisaerápida

S. cerevisaelenta

R

Cl

OH

R

Cl

OH

+

major.

29

3.3. Reações de Oxidação

Importância

Problemas de métodos químicos: metais, inespecificidade (régio, estéreo)

3.3.1. Oxidação de Álcoois

Métodos químicos: exemplos

Métodos enzimáticos: pouco usados

Termodinâmicamente desfavorável, recicl cofator dificultada

Inibição pelo produto (- polar)

pH ótimo 8-9: co-fator e produtos instáveis

oxid álcool secundário: destruição de quiralidade

Oxidação regiosseletiva de polióis

Carboidratos

Ex.:

O O

OHOH

HO

OH

CH2OH

C

C

C

C

CH2OH

O

HHO

OHH

HHO

Acetobactersuboxidans

CH2OH

C

C

C

C

CH2OH

OHH

HHO

OHH

OHH

CHO

C

C

C

C

CH2OH

OHH

HHO

OHH

OHH

Sorbitol Sorbose Ácido L-ascórbicoGlicose

HO O

CO

C

C

C

C

CH2OH

HO

H

HHO

30

Assimetrização de dióis proquirais ou meso

OH

OHR

R

OHR

RH

O

HLADHrecicl NAD+

O

R

ROH

O

R

RO

HLADHrecicl NAD+

exp.

meso

HLADHrecicl NAD+

HLADHrecicl NAD+

exp.

R

OH

OH

R

OH

O

H

OR

OH

OR

O

31

3.3.2. Reações de Oxigenação

Oxidação química de HC: ativados (ex. oxid alílica por SeO2) e não-ativados

(difícil, não-específica)

Importância

Oxigenases

Mono-oxigenases

Sub + DoadorH2 + O2 SubO + Doador + H2O

rec. co-fator

Dioxigenases

Sub + O2 SubO2

Oxidases

O2 + 2e- O22- H2O2

+ 2H+

2H2O2O22-O2 + 4e- + 4H+

32

Mono-oxigenases

Maioria ligada a membrana

Ativação do O2: comum a todas

Tipos de substratos/produtos

Sub + O2 + H+ + NAD(P)H SubO + H2O + NAD(P)+mono-oxigenase

C H C OH

R R

O

Rn-X Rn-X=O X= N, S, Se, P

H OH

R1 R2

O

R1 O

O

R2

Citocromo P-450: grupo + comum de MO; hemeproteina; detoxificação;

mesma seq 26 aa prox heme

Ciclo catalítico: ~ oxid química com metais

N

N

N

N

CO2H

HO2C

Fe

Citocromo P-450: mecanismo

33

Fe3+

S

ON

N

N

N

H He-

O2

Fe3+

S

N

N

N

N

OO

Sub

e-

Sub

Fe3+

S

N

N

N

N

OO

H2O 2H+

Fe4+

S

N

N

N

N

OSub

Sub

Fe5+

S

N

N

N

N

O

H2O

SubO

Sub H2O Sub

Fe2+

S

N

N

N

NFe3+

S

N

N

N

N

Sub

1. Acoplamento do substrato ao sítio ativo

2. Red Fe3+ > Fe2+ (e- de NADP[H] ou outro co-fator (Fe2+ mais reativo)

3. Ligação de O2

4. Recep e- > enfraquecimento de ligação O-O

5. Saída de O na forma de água: formação de nucleófilo forte

6. Ataque do O ao Sub; subst Sub oxidado pela H2O

34

MO dependente de flavina:

Co-fator: flavina

NNH

O

N

OH

N O

PO

OHO

PO

O

HO

O

HO OH

N

N

NN

NH2

HO

O

OH

Flavina adenina dinucleotídeo(FAD)

NNH

O

N

R

N O

NNH

O

N

R

N O

2H+, 2e-

H

H

35

Substratos: aldeídos, cetonas; produtos: ésteres

Ciclo catalítico de MO: ~ oxid química com peróxidos/perácidos

HO O

R

R1 OR2

O

R1 R2

OHO OR

R1 R2

O

Bayer-Williger

O2

Sub

N

NNH

N O

O

NADPH NADP+

(Enz-FAD)

N

NNH

N O

O

H

H

(Enz-FADH2-Sub)

N

NNH

N O

OH O

HO(Enz-FAD-4a-OOH-Sub)

N

NNH

N O

OH OH

(Enz-FAD-4a-OH-SubO)

SubO + H2O

N

NNH

N O

OH O

O

O

N

NNH

N O

OH O

O

O

O

O

36

Hidroxilação de Alcanos

Funcionaliz em pos não-ativadas: poucas alternativas em Q.O.

Reativ relativa: 2o>3o>1o.

Hidroxil esteróides

F. verticilloides

CH2OH

Limoneno Álcool Perílico

R.arrhizus

CO2H

O

CO2H

O

OH

O

CO2H

OH

O

CO2HOHO

CO2H

F. verticilloides+

P. chrysogenum

CO2H

OCH2OH

CO2H

O

37

Hidroxilação de Comp Aromáticos

Hidrox regioespecífica difícil por via química

Monooxigenases: hidrox em o- e p-; via epóxido

Polifenoloxidases (tirosinase): fenol -> catecol -> o-quinona ->

polimerização

R

OH

R

OH

OH

O2 H2O

polifenoloxidase

O2 H2O

polifenoloxidase

R

O

O

Mecanismo

38

Ex.: L-dopa (3,4-diidroxifenilalanina); L-epinefrina (adrenalina)

HO

HO

OH

NHCH3

adrenalina

HO

HO

COOH

NH2H

L-3,4-diidroxifenilalanina(L-DOPA)

CO2H

HONH2

CO2H

ONH2

O

Melaninas

TirosinaseCO2H

HONH2

HO

Tirosina DOPA Dopaquinona

HONH2

HO

Dopamina

[O]

Uso de microorganismos; Ex.

N

CO2H

O N

OH Cunninghamellaechinulata

Pseudomonas sp

N

CO2H

HO

O N

OH

HO

ácido 6-hidroxinicotínico

prenalterol (>85%)

(100 %)

Epoxidação de alcenos

Epóxidos quirais: intermediários sintéticos de alto valor

Métodos químicos

Epóxidos pequenos e não-funcionalizados: obtenção difícil por via química

Monooxigenases: não usadas em escala preparativa; co-fator; natureza

complexa

Células: uso de meio bifásicos; minimização efeito tóxico do produto

39

Ex.: R1 H

R2

R1

R2

OmicroorganismoO2

Pseudomonas oleovoransCorynebacterium equiMycobacterium spXanthobacter spNocardia sp

Reações de Baeyer-Villiger

Método químico: éster ou lactona

MO dependente de flavina

Uso de células

Acinetobacter sp, Pseudomonas sp (algumas patogênicas)

Risco de hidrólise do produto: inibidores (p-nitrofenilfosfato de etila =

paraoxon); mutantes não-hidrolíticas

Ex.:

O

R

O

RO

O

R

Acinetobacter sp+

Diidroxilação de aromáticos

Importância ecológica

Obtenção de glicóis quirais

Pseudomonas sp

R

O

O

R

di-oxigenase

O2

R

OH

OH

redutaseH2

R

OH

OH

diidrodioldesidrogenase

NAD(P)H NAD(P)+

40

3.4. Formação de Ligações C-C

reações do tipo aldólicas: mecanismo

síntese de imina: mecanismo

R1 R2

NH

R1 R2

O

NH3

C

OH

NH2

R2R1

aldolases

substratos: carboidratos, aa, hidroxiácidos

adição 1, 2 ou 3C

2 grupos

Aldolase tipo I

Plantas superiores e animais

Co-fator: não requer

Mecanismo

H2O

-Enz-NH2

H

OR1

R

N

R1

X

OHEnz

R

O

R1

X

OH

RX

NEnz

H

Enz-B

Enz-NH2

-H2O RX

NEnz

H HX=H, OH, NH2

RX

O

baseSchiff

enamina

CH3CHO CH3CHCH2CHO

OHOH-, H2O

5o, 4-5 haldol

41

Aldolase tipo II

Bactérias e fungos

Dependente de Zn2+

Mecanismo

Receptor:

Doador: R

O

X

HR1

OR

O-

X

H R1

O

NN

Enz

HZn+2

R1

OH

R

X

O

Obs.: remoção inicial de H+ do doador por uma histidina

Exemplo: análogos nitrogenados de açúcar (anti-HIV)

PO OH

O

+ H

O

N3

OHaldolaseFDP

PO

O

N3

OH

OH

OH

PO

O

N3

OH

OH

OH

+

1) fosfatase2) H2/Pd

1) fosfatase2) H2/Pd

NH

OHOH

OH

HO

NHOH

OH

OH

HO

deoxinojirimicina deoximanojirimicina

42

3.5. Adição e Eliminação

Liases:

adição de H2O ou NH3 a alquenos;

adição de HCN a C=O

3.5.1. Formação de Cianidrina

Cianidrinas: estrutura; síntese química: aldeído/cetona + HCN

Importantes intermediários em química orgânica

R CN

OHvários produtos

síntese enzimática: oxinitrilases

Ex.: (prioridade R’ > R”)

R' R"

O R' R"

CNHO

R' R"

OHNC

HCN

R-oxinitrilase

S-oxinitrilase

fontes:

(R)-oxinitrilases: família Rosaceae (amêndoa, ameixa, pêssego)

(S)-oxinitrilases: Sorghum bicolor (sorgo), Hevea brasiliensis (seringueira),

Ximenia americana (sândalo), Manihot esculenta (mandioca).

Problemas: uso de HCN → transcianação (acetona cianidrina)

43

3.5.2. Adição de Água e Amônia

Fumarase: ad água a C=C

C CX

HOOC

COOH

HC C

X

HOOC

COOH

OH

HH

X= H (ac. fumárico), Cl X= H (ac. málico)

fumaraseH2O

Influência da e.n. de X.

3-metilaspartase: ad amônia a C=C

C CX

HOOC

COOH

HC C

X

HOOC

COOH

NH2

HH

X= H, Cl, Me, etc.

NH3

3-metilaspartase

3.5.3. Reações tipo aciloína

Química: mecanismo

Biocatalítica: síntese da efedrina

Ph H

O

H3C CO2H

O

Ph

OH

O+

S. cerevisae(descarboxilase

de piruvato)

CO2

aciloina

Ph

OH

NHCH3

(-)-efedrina

MeNH2

H2/Pt

3.6. Transglicosilação oligossacarídeos e polissacarídeos: migração intracelular e excreção de

glicoproteinas; interações célula-célula; oncogênese; interação da superfície

celular com patógenos

síntese química de carboidratos difícil

44

biocatálise atraente: glicosil transferases; glicosidases

3.6.1. Glicosiltransferases

requer açúcar ativado (UDP-açúcar)

3.6.2. Glicosidases

independem de co-fatores

endo e exo-glicosidases

hidrólise reversa

transglicosilação

usos: celulose > glicose > etanol

45

Exemplo glicosilação de dióis:

Exemplo hidrólise do esteviosídeo:

OGG

CO2G

OH

CO2H

esteviosídeo esteviol

pectinase

Exemplo glicosilação do esteviosídeo (veja artigo J.Biotechnology, 2006):

+

esteviosídeo

OGG

CO2G

OGG

CO2G

G

rebaudiosídeo

glicosidases deFusarium sp maior proporção

de rebaudiosídeo

46

Mecanismo lizozima (Nature Structural Biology 8, 737 - 739 (2001)

doi:10.1038/nsb0901-737): NAG= N-acetilglicosamina.

47

3.7. Halogenação e Desalogenação

Introdução

Cerca de 1000 PN halogenados

Importância: diazepam, mitotano

CH

CHCl2Cl

Cl

mitotano

N

NO

CH3

Cl

diazepam Derivados de Cl (terrestres) e Br (marinhos) mais comuns

Algas marinhas: lib 107 ton bromoalcanos

Toxicidade de haloalcanos

Halogenação

Química

Haloperoxidases: único tipo isolado

Cloroperoxidase de Caldariomyces fumago; bromoperoxidase de

Pseudomonas aureofaciens; iodoperoxidase de raiz forte (Armoracia

lapathifolia)

Substrato + H2O2 + X- + H+ Produtos halogenados + 2H2O

1. Halogenação de Alquenos

X+

haloperoxidase

HOX ou X2

OH

X

Y

X

OH-

Y-

O-

OOO

Xn

48

I

OHOH

I

cloroperoxidase

I-, H2O2

+

9 : 1

Halogenação de alcinos

CHCl2

OCl

O

Cl+

1 : 2 : 0,3

CH3 C CHcloroperoxidase

Cl -, H2O2Cl

O+

Halogenação de Compostos Aromáticos

NH2

Cl

NH2

Cl

BrcloroperoxidaseBr -, H2O2

Halogenação de Grupos C-H

cloroperoxidaseCl -, H2O2

OO OO

Cl

Desalogenação

Importância ambiental: biodegradação (pesticidas, solventes, etc.)

Método químico

Halohidrina Epoxidases

Fontes: bactérias (Flavobacteria, Corynebacteria, Pseudomonas),

fungos (Caldariomyces fumago), algas (Laurencia pacifica)

XHO

haloidrina epoxidase

O+ HX

2. Desalogenases: Sn X → OH (indep de co-fator); influência da

natureza de RX (1o., 2o. 3o.)

49

O O-

Asp

C XR

H

H

O O-O O

CH2R

OHH

N

N

H

His

N

N

HN

N

H

H

RCH2OH

Asp Asp

3. Ex.: (S)-2-cloropropiônico (síntese de anti-inflamatórios e herbicidas)

CO2H

Cl

CO2H

OH

CO2H

Cldesalogenase

(P. putida)+

e.e. > 98%

50

4. Técnicas Especiais

4.1. Imobilização aderência da enzima a um suporte sólido ou confinamento

reutilização da enzima

técnicas

adsorção (van der Waals, iônica, lig. H)

ligação covalente

ligação cruzada

confinamento em géis

confinamento em membranas

51

4.2. Enzimas modificadas e artificiais

Enzima-PEG

solúveis em solventes orgânicos

redução de imunogenicidade e eliminação

“bio-imprinting”

anticorpos catalíticos

O

O

Ph

OHR

OH+

-O OPh

RO

O

R

OP

O OPh

R

+ PhOH

52

enzimas artificiais (Nature Chemistry | vol 8 | september 2016, DOI: 10.1038/NCHEM.2555)

Glu

O O

N

NHis

H

SH

Cys

C OR2

O

R1

R2OH

Cys

CS O

R1

OH

HN

NHis

Glu

O OH

H

5. Outras Aplicações

5.1. Metabolismo de drogas Importância

Exs.: paracetamol

N

OHO

H

N

OHO

H

AGlc

N

OHO

OH

N

OO

H

SO O

HO

N

OO

N

OHO

H

GSH GHS: glutationa; AGlc ácido glicurônico

5.2. Bioativação

Importância

53

Exs.: (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP), MPP+ e doença

Parkinson

N

CH3

N

CH3

N

CH3

MPTP MPDP MPP+

5.3. Modelos microbianos de metabolismo de mamíferos Ex.: Trimegestone (Hoechst)

O

OHCH3

O

CH3

H

H

O

OHCH3

O

CH3

H

H

HO

O

OHCH3

O

CH3

H

H

HO

O

OHCH3

O

CH3

H

H

OH

5.4. Derivados ativos de drogas

54

Ex.: antifúngicos (Merck)

O

OO

OCH3

OH

OH21

O

OO

OH

OH21

Galbanolídeo A Galbanolídeo B

Potentes antifúngicos (Merck)

Streptomyces halstedii21-OH

55

Bibliografia

K. FABER. Biotransformations in Organic Chemistry - A Textbook, 5th ed. Springer, New York, 2004. (Terceira edição disponível na Biblioteca de

Tecnologia e na de Biológicas, 660.634 B617).

A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey. Industrial Biotransformation, Wiley, Weihheim, 2000. (660.63 L721i). (Disponível na Biblioteca de Tecnologia).

A.L. DEMAIN and J.E. DAVIES. Manual of Industrial Microbiology and

Biotechnology, 2nd Edition, American Society for Microbiology,

Washington,1999. (660.62 M294i)

P. PRAVE, U. FAUST, W. SITTING, D.A. SUKATSCH. Fundamentals of

Biotechnology, Editora VCH, Federal Republic of Germany, 1987.

Q. H.G. Davies, R.H. Green, D.R. Kelly, S.M. Roberts. Biotransformations in

Preparative Organic Chemistry, Academic Press, New York, 1989. (547.2

B615).

R. H.-J. Rehm, G. Reed and A. Puhler (Ed.). Biotechnology, 2nd ed. Weinheim :

VCH, 1993- Biotransformations, Vol 8a, 8b (660.6 B616).