CaioHenriqueYsokoyamaMazucanti Mestrado P

CAIOHENRIQUEYOKOYAMAMAZUCANTI

SINALIZAOINTRACELULARDESENCADEADAPORCONCENTRAESSUBTXICASDEESTREPTOZOTOCINAEMCLULASNEURO2A:

MODELOINVITRODENEURODEGENERAOASSOCIADADOENADEALZHEIMER

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Farmacologia do Instituto de CinciasBiomdicas da Universidade de So Paulo, para aobtenodoTtulodeMestreemCincias.readeconcentrao:FarmacologiaOrientador:Prof.Dr.CristforoScavoneVersooriginal

SoPaulo2013

RESUMO

MAZUCANTI,C.H.Y.Sinalizao intracelulardesencadeadaporconcentraessubtxicasdeestreptozotocinaemclulasNeuro2A:modeloinvitrodeneurodegeneraoassociadadoenadeAlzheimer.2013.75f.Dissertao(MestradoemFarmacologia) InstitutodeCinciasBiomdicas,UniversidadedeSoPaulo,SoPaulo,2013.A Doena de Alzheimer (DA) a causa mais comum de demncia e caracterizadaclinicamente por comprometimentos cognitivos. Histologicamente compese pelaformao de placas senis e emaranhados neurofibrilares intracelulares resultantes dealteraes dometabolismo do peptdeo betaamiloide e da hiperfosforilao da protenaTau, respectivamente. Essas alteraes parecem, em parte, ser uma decorrncia de umaresistncia enceflica insulina e consequente diminuio da sinalizao neuronal dessehormnio, sugerindoqueaDAespordica tenhauma relao comoDiabetesmellitus.Aestreptozotocina (STZ) tem sido utilizada comomodelo de induo do Diabetes, emaisrecentemente, sua injeo intracerebroventricular (icv) tem sido utilizada comomodeloanimaldeDA.Nossoobjetivoneste trabalhoodeavaliarosefeitoscausadospordosessubtxicas de STZ em uma linhagem de neuroblastoma sobre a cascata intracelularassociadasinalizaode insulina.Paratanto,oestadodefosforilaodasprotenasAkteGSK3 foi avaliado em perodos agudos de tratamento com a droga, bem como aresponsividade dessas clulas insulina aps 48 horas de tratamento. Para avaliao deefeitos morfolgicos foi provocada neuritognese por tratamento com NGF e oaparecimento e comprimento de neuritos comparados entre grupo controle, gruporesistente insulina e grupo prtratado com STZ. Foi feita averiguao da doaoespontneadexidontrico(NO)pordetecoeletroqumicaeavaliaodaparticipaodoNO nas aes da STZ atravs do tratamento simultneo com STZ e CarboxiPTIO(sequestrante deNO).Por fim, a avaliao daproduo de espcies reativas deoxignio(EROs)decorrentedotratamentocomSTZfoiavaliadautilizandoseumasondafluorescentesensvel a superxido, adihidroetidina (DHE),por fluorimetriaem citometriade fluxo.OsresultadosconfirmamadoaoespontneadeNOpelaSTZesugeremqueadrogacapazdemodular a cascata intracelular associada ao receptor de insulina em perodos agudosatravs da nitrosilao e consequente inativao da Akt, o que acaba regulandopositivamenteaatividadedaGSK3.AcapacidadedaSTZde induzirresistncia insulnicatambmafetadapelosequestrodoNO, indicandoqueoradical livredesempenhapapelfundamentalna induodo fenmenonas condiesexperimentaisutilizadas.OperfildeproduodeEROs induzidoporSTZpodeseracausadasuaneurotoxicidade.Por fim, foivistoqueotratamentocomSTZ,bemcomoa induoderesistncia insulina,capazdeimpedir a formao de neuritos pelo tratamento com NGF. Dessa forma, este trabalhocontribuiparaaelucidaodosmecanismospelosquaisa injeo icvdeSTZpode causaralgumascaractersticasdetoxicidadeneuronalsemelhantesDA.Palavraschave: Doena de Alzheimer. Estreptozotocina. Diabetes mellitus. Resistnciainsulnica.xidontrico.Espciesreativasdeoxignio.

ABSTRACTMAZUCANTI, C. H. Y. Intracellular signaling triggered by streptozotocin subtoxicconcentrationsinNeuro2Acells:invitroAlzheimersdiseaseassociatedneurodegenerationmodel. 2013. 75 p. Masters thesis (Pharmacology) Instituto de Cincias Biomdicas,UniversidadedeSoPaulo,SoPaulo,2013.Alzheimersdisease(AD) isthemostcommoncauseofdementia inelderlyand isclinicallycharacterized as cognitive impairments. It ishistologically characterizedby senileplaquesformation,aswellasbyintracellularneurofibrillarytanglesduetoamyloidbetametabolismalterations and hyperphosphorylation of the microtubule associated protein Tau,respectively.Thesealterationsseemstobe,at least inpart,causedbyaencephalic insulinresistanceandconsequentimpairmentinitsneuronalsignaling,suggestingthatthesporadicformofDAmightbycorrelatedtoDiabetes.Streptozotocin(STZ)hasbeenusedasananimalmodel forDiabetesand,more recently, its intracerebroventricular (icv) injectionasanADanimalmodel.Ourobjectivewiththisprojectinvolvestheassessmentoftheeffectscausedby subtoxic doses of STZ in a neuroblastoma cell line upon insulin signaling associatedintracellular cascade. For thispurpose,we accompanied thephosphorylation stateofAktandGSK3inacuteperiodsoftimefollowingSTZtreatment,aswellastheresponsivenessofsuchcellsagainstinsulinaftera48hourstreatment.Formorphologicaleffectsevaluation,neuritogenesiswasinducedbyaNGFtreatmentandneuriteoutgrowthcomparedbetweendifferent experimental groups. Nitric oxide (NO) spontaneous donationwas assessed byelectrochemical detection and its participation in STZ actions through simultaneoustreatmentofSTZandCarboxyPTIO (aNOscavenger). Inaddition, reactiveoxygenspecies(ROS) production due to STZ treatment was assessed using a superoxide sensitivefluorescent probe, dihydroethidium (DHE) by flow cytometry fluorimetry. Results confirmSTZ spontaneous NO donation and suggest that the drug is capable ofmodulating theintracellular cascade associated to insulin receptor in acute periods of time through Aktnitrosylationand itssubsequent inactivation,whichcouldup regulateGSK3activity.STZabilitytocauseinsulinresistanceisalsoaffectedbyNOproduction,whichindicatesthatthefree radical plays an essential role in the phenomenon induction in this experimentalapproach.Therefore,EROsproductionmayplayanimportantroleinthemechanismlinkedtoSTZ inducedneurotoxicity.Ultimately, ithasbeenshownthatSTZtreatment,aswellasinsulinresistancealone,iscapableofimpairneuriteoutgrowthbyNGFtreatment.Thisworkcontributes for the elucidation of themechanisms bywhich STZ icv injectionmay causefeaturessimilartoDA.Keywords: Alzheimers disease. Streptozotocin. Diabetes. Insulin resistance. Nitric oxide.Reactiveoxygenspecies.

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1INTRODUO1.1DoenadeAlzheimer

ADoenadeAlzheimer(DA)seapresentaatualmentecomosendoaprincipalcausadedemncianomundoocidental,sendooenvelhecimentooprincipalfatorderiscoe,emcertamaneira,umanecessidadeparaodesenvolvimentodapatologia(HEBERTetal.,2003).Omesmoocorreemdiversasoutrasdoenasneurodegenerativas,comoParkinsoneoutrasdemncias causadas por corpos de Lewis, sendo a ocorrncia de todas essas sndromesmuitoraraempessoasjovensoumesmoadultosdemeiaidade.

ADAacausaprincipaldedemnciaentreos idosos,eestassociadaaumdanoprogressivo em funes enceflicas, incluindo memria, linguagem, orientao espacial,comportamentoepersonalidade.Estimasequeexistematualmente36milhesdepessoasemtodoomundovivendocomDA,eesperasequeessenmerocresadrasticamentenasprximasdcadas.ADAumadoenamultifatorialecercade90%doscasossodeumaocorrnciaespordica(revisadoemQUERFURTH;LAFERLA,2010),sendoaidadeoprincipalfatorderisco.Outrosfatoresderiscoimportantesrelacionamseacondiesmetablicasevasculares, compondo o cenrio da sndrome metablica, como dislipidemia ehipertenso,bemcomoahiperglicemia.Defato,adiabetestipoIIestassociadaaummaiorrisco de desenvolvimento de DA e demncia vascular (revisado em BIESSELS; KAPPELLE,2005).

Os principais fatores de risco parecem ser a idade, contribuies genticas eambientais,sendobemntidaadivisoentredoistiposdiferentesdaDA,deacordocomomomento da instalao da doena. Nesse sentido, a DA Espordica acontece de formatardia, aparecendo a partir dos 60 anos de idade, enquanto a DA Familiar temacontecimentomaisprecoce,aoredordos40anos(KARetal.,2004;SPIRES;HYMAN,2005).

A DA uma sndrome relativamente comum, cujo diagnstico se d poraparecimento de caractersticas envolvendo comprometimentos cognitivos ecomportamentais progressivos associados com a idade, tais como perda de memria,desorientao geogrfica, deteriorao da linguagem (FABERLANGENDOEN et al., 1988),mudanasdecomportamentoepersonalidade(RUBINetal.,1987;SWEARERetal.,1988)ecomplicaesmotorasemestgiosavanadosdadoena(MORRISetal.,1989).Noentanto,

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quandosinaisdecomprometimentoscognitivosdevidoDAsomanifestados,jexisteumprocessopatolgicoenceflicoirreversvel(IKONOMOVIC;MUFSON;WUU,2003).

Atualmente o diagnstico somente possvel aps aparecimento decomprometimentos cognitivosmoderados, identificados atravs de diferentes testes queavaliamdiversascompetnciascognitivas.EstestestesauxiliamodiagnsticodaDA,pormesto longedeapresentaremsensibilidadeeespecificidadeconfiveis (FRANK;MALCOLM;DEAN, 2009; KOIBAS et al., 2000). Outra ferramenta utilizada para o diagnostico so osexames de imagem, capazes de detectar estgiosmais iniciais da doena ao identificarpequenasdegeneraesdereasespecficasassociadasDA,cujaatrofiainiciasenocrtexentorrinalehipocampoeevoluiparaoneocrtex.Tcnicasmaismodernaspodem aindarevelardiferentespadresdehipoperfuso(porTomografiaComputadorizadaporEmissode Fton nico SPECT) (OBRIEN, 2007) ou hipometabolismo, alm de conseguiremidentificaralteraesbioqumicasespecficasdaDAatravsdemarcadores(porTomografiaporEmissodePsitronsPET)(EDWARD;SUSAN;MARTIN,2004).

Clinicamente, a DA caracterizada por perda de memria e declnio cognitivoprogressivos, culminando namorte prematura do paciente, emmdia aps dez anos dodiagnstico (QUERFURTH;LAFERLA,2010).Almdisso,aDAacompanhadaporsintomasneuropsiquitricosnocognitivos,que incluemansiedade,agressividade,delrio,excitaoou apatia, desinibio ou depresso (revisado em PINTON et al., 2011) . Padresneuropatolgicos especficos da DA incluem perda neuronal, acumulao abundante deemaranhados neurofibrilares anormais (correspondentes a depsitos intracelulares daprotena Tau hiperfosforilada) e aumento na expresso e processamento anormal daprotenaprecursoradobetaamiloide(APP),levandodeposiodopeptdeobetaamiloide(A)e,dessa forma, formaodeplacassenis.OutracaractersticadaDAaangiopatiaamiloide. possvelque adisfuno cerebrovascularpossaprecederodeclnio cognitivo.Hipoperfuso enceflica e diminuio da depurao de A atravs da barreira hematoenceflicapodemcontribuirparaainstalaoeprogressodaDA.Aindaexistemevidnciasindicando o envolvimento damicroglia desempenhando um papel importante atravs detodoesseprocessopatolgico(revisadoemBELL;ZLOKOVIC,2009).

As caractersticas bioqumicas especficas da DA envolvem o desenvolvimento deemaranhados neurofibrilares intracelulares (NFT) e de posio de placas senis, formados

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pelo acmulo de segmentos proteicos resultantes demetabolismo anormal da protenaprecursoradopeptdeoamiloideeconsequenteagregaodopeptdeobetaamiloide,comdiminuiodesuadegradaoporproteases (KANGetal.,1987).OsNFTsso formadosapartirdocolapsodocitoesqueletodoneurnio,decorrentedahiperfosforilaodaprotenaassociadaamicrotbuloTau(ALEJANDRAetal.,2010),econsequenteperdaneuronalcomdiminuiodamassaenceflica.

1.2SinalizaoAssociadaNeurodegeneraonaDA

AlgunsautoresacreditamqueaDAiniciadapordeficinciadeenzimasdociclodo

cidotricarboxlico,atividadereduzidadacitocromooxidaseoudanoemDNAmitocondrial.Enquanto muitos anos foram dedicados para a hiptese amiloide, diversas outraspropostas continuam sendo causaspossveispara a instalaoeprogressodaDA, comoestresse oxidativo, hiperfosforilao da tau, pron e causas ambientais (revisado emSWERDLOWetal.,2010).Aproduodeespciesreativasdeoxignio(EROs),porexemplo,pareceestarenvolvidanocomeoemanutenodociclodegenerativodaDA,agravandoodano de DNA mitocondrial e alterando outros complexos da cadeia de transporte deeltrons,oquelevaaumaumentonaproduodeEROs(revisadoporPATTENetal.,2010).

ComprometimentodeaprendizagemememriapodeestarassociadoaalteraesdasinalizaodeCa2+.OsoligmerosdebetaamiloideaumentamaentradadeCa2+nasclulasemaisCa2+bombeadoparadentrodo retculoendoplasmtico. Issocontribuiparaumaumentonasensibilidadedosreceptoresderianodina(RyR)que,porsuavez,liberammaisCa2+ dos reservatrios intracelulares. Existem evidncias indicando que vriasmutaesrelacionadas com a DA podem induzir alteraes na sinalizao de Ca2+. No entanto, aquesto do que ocorre primeiro, a ativao da via amiloidognica ou as alteraes nasinalizaodeCa2+,aindapermaneceemaberto(revisadoemBERRIDGE,2010).

Aprotenaassociada a microtbulo Tau se acumula no estadoanormalmentehiperfosforilado formando depsitos filamentosos intracelulares em diversas doenasneurodegenerativas que causam demncia. Essas doenas so coletivamente conhecidascomoTaupatias. Essa famliadedemncias incluiaDA,adultos comSndromedeDown,demncia frontotemporal com Parkisonismo associada ao cromossomo 17, esclerose

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amiotrfica lateral, degenerao cortical basal, demncia pugilstica e a Doena de Pick(IQBALetal.,2010).

Embora apresentemmanifestaes fenotpicas diversas, disfuno e degeneraoenceflica, essas Taupatias esto associadas acumulao progressiva de inclusesfilamentosasdetauhiperfosforilada,eessasincluses,juntamentecomaausnciadeoutrasanormalidades neuropatolgicas especficas doena exceto deposio de A na DA eSndromedeDown,provmevidnciaqueindicapapeldaTaunoincioe/ouprogressodadoena(IQBALetal.,1998).

A Tau a principal protena associada amicrotbulo. In vitro, a Tau promove aconexoda tubulinanosmicrotbuloseestabilizaaestruturadomicrotbulo (DEVREDetal.,2010).Agrandemaioriadasprotenasaxonaissintetizadanocorpocelulardoneurnioe transportada atravs do axnio pelos caminhos demicrotbulos. O transporte axonalocorreportodavidadeumneurnioeessencialparaseucrescimentoesobrevivncia.Osmicrotbulos repousam ao longo do eixo do axnio se constituindo na principal via docitoesqueleto para transporte. Nos neurnios de pacientes com DA, acreditase que osistemademicrotbulos seencontre rompido,eo transporteaxonalesteja interrompido,impedindo que vesculas alcancem as sinapses e, de forma vagarosa e persistente, assinapsesdegeneram,processoesseassociadocomdegeneraoretrgrada(ALEJANDRAetal.,2010;IQBALetal.,2010).

O nvel de fosforilao proteica controlado pelas aes opostas de protenasquinasese fosfatases. Vrios trabalhos indicamalteraonaexpressoe/ouatividadedeprotenas quinases e fosfatases no encfalo de pacientes comDA (Quadro 1). Protenasquinasescomoaglicogniosintasequinase3(GSK3),P25/Quinasedependentedeciclina(Cdk5) eProtenasquinases ativadaspormitgeno (MAPKs) apresentam expresso e/ouatividade aumentadas, enquanto atividade reduzida foi encontrada para protenasfosfatases (PPs) como PP1,PP2AePP5emencfalosacometidospelaDA.A fosforilaoanormaldeprotenaspode contribuirparaaprogressodaDAatravsdamodificaodesubstratos em diversas funes como atividade enzimtica, localizao subcelular,acoplamento de ligantes, interao comoutrasprotenas,almdeoutraspropriedades(CHUNG,2009).

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Quadro 1 Resumo das alteraes de expresso e/ou atividade de protenas quinases e

protenasfosfatasesnaDAProtena Expressoe/ouatividadenaDA RefernciasProtenasQuinases GSK3 Aumentada Hyeetal.(2009),Leroy,YilmazeBrion

(2007),Peiatal.(1997),Swattonetal.(2004)

P25/Cdk5 Aumentada Swattonetal.(2007),Patricketal.(1999),Tandonetal.(2003)

Dyrk1A Aumentada Dowjatetal.(2007),Kimuraetal.(2007),Ryooetal.(2008)

ERK Aumentada Swattonetal.(2004),Zhuetal.(2002),Peiatal.(2002)

JNK Aumentada Swattonetal.(2004),Zhuetal.(2003),Otthetal.(2003)

p38 Aumentada Swattonetal.(2004),JohnsoneBailey(2003)

CKI Aumentada Yasojimaetal.(2000)Akt/PKB Aumentada Peiatal.(2003),Rickleetal.(2004),

Griffinetal.(2005)PKA Diminuda Liangetal.(2007),Kimetal.(2001)PKC Diminuda Wangetal.(2008),Buxbaumetal(1990)ProtenaFosfatases PP1 Diminuda Gongetal.(1993)PP2A Diminuda Gongetal.(1993),Liuetal.(2005a),

VogelsbergRagagliaetal.(2001)PP5 Diminuda Liuetal.(2005a),Liuetal.(2005b)PP2B(calcineurina) Aumentada Liuetal.(2005b),Liuetal.(2005c)Cdc25A Aumentada Dingetal.(2000)Cdc25B Aumentada Vincentetal.(2001)PTEN Diminuda Griffinetal(2005),Rickleetal.(2006)Fonte:AdaptadodeChung,2009

Atualmente, temsedadomaioratenoaopapeldaGSK3comosendoaprovvelprotena responsvel pela hiperfosforilao da protena Tau, principalmente devido tendnciaemseacreditarqueaDAespordicaestejarelacionadacomaDiabetesmellitus(DM),propondosequeaneurodegenerao sejaefeitoda resistncianeuronal insulina(DE LAMONTE;WANDS, 2005; GASPARINI et al., 2002; HOYER et al., 2004; SALKOVICPETRISICetal.,2006).Defato,a insulinaaumentaaatividadedaprotenaquinaseAkt/PKBquepor suavez inibeaGSK3, regulandonegativamentea fosforilaode seus substratos(dentreosquaisaprotenaTau)(RATAN;SAMANTHA;JESUS,2004).Assimsendo,ocentroda cascatadeneurodegenerao seriadesencadeadapela resistncianeuronal insulina,provocando a morte do neurnio pela falta de responsividade ao fator neurotrfico

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(insulina), deficincia nometabolismo de energia e possivelmente inibio de expressognicaresponsivainsulina(DELAMONTE,2009).

Embora a DA seja multifatorial e, mesmo na presena de diversas hipteses, aprincipaletiologiaaindasejadesconhecida,esse trabalho focanopapelemquea insulinapode desempenhar como uma possvel causa da DA. Evidnciasmoleculares permitirampressuposiesqueindicamqueoprocessamentodaAPPpodesofrerinflunciadainsulinaeasinalizaodeseureceptortirosinaquinase(GASPARINIetal.,2011;RIVERAetal.,2005)equeainsulinapoderegularafosforilaodaprotenaTauatravsdocontroledaatividadedaGSK3 (HONGetal.,1997;MANDELKOWetal.,1992).Almdisso,estudos funcionaismostraramdiminuiestantonamobilizaodeglicosequantonometabolismoenergticoprecedendoouacompanhandoosestgiosiniciaisdoscomprometimentoscognitivosnaDA(HOYER, 1998). Consequentemente, dficits nometabolismo de glicose e da sinalizaointracelulardeinsulinaforampropostoscomoumaprovveletiologiadaDA.

Resumidamente,a insulinabemconhecidaporseuenvolvimentonaregulaodometabolismo de glicose somente nos tecidos perifricos. No entanto, esse hormniotambm pode alterar diversas funes enceflicas incluindo cognio, memria eplasticidade sinptica atravs de vias de sinalizao associadas ao complexoinsulina/receptor tirosina quinase. A insulina ligase subunidade extracelular de seureceptor(IR),oqueresultanaativaodasubunidade intracelularesuadecorrenteautofosforilao.Umavezativado,oIRfosforiladiversossubstratosintracelulares,incluindoumafamliadeprotenasconhecidacomosubstratopara IR (IRS).Ento,a fosforilaodealvosintracelulareslevaaorecrutamentoeativaodediversasprotenaseainiciaodemuitascascatasdesinalizao,dentreasquaisasmais importantessoaviada fosfoinositdeo3quinase (PI3K)eacascatadaprotenaquinaseativadapormitgeno (MAPK) (JOHNSTON;PIROLA;VANOBBERGHEN,2003).AativaodaviadaPI3K,porsuavez,induzaativaodaserina treonina quinase Akt (tambm conhecida como PKB), promovendo sobrevivncianeuronalaoinativardiretamenteamaquinariaprapopttica(VANDERHEIDE;RAMAKERS;SMIDT,2006).

Almdisso,PI3K /Aktativado fosforilae inibeasduas formas citoslicasdaGSK3(CROSSetal.,1995).SabesequeaGSK3 controlaa formaodepeptdeosde A,dessa

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forma,ainsulinaconsegueregularodesenvolvimentodepeptdeossolveisdeAPPatravsdesinalizaodependentedePI3K(SOLANOetal.,2000).

1.3MetabolismoEncefliconaDAeoModelodaSTZ

Diversosestudosconfirmaramadiminuiodometabolismoenceflicoprecedentedeteriorao das funes cognitivas, sugerindo que a deficincia energtica uma dascaractersticasreversveismaisprecocesdaDA(revisadoemHOYER,1998).Anormalidadespredominantes no metabolismo enceflico de glicose e seu controle pela sinalizaoneuronal de insulina foram encontrados na DA espordica (DAE) (FROLICH et al., 1998;HOYERetal.,1991;HOYER,2002,2004), levandohiptesequeaDAE funcionariacomoumaDiabetesMellitustipoIIenceflica(HOYER,1998).Umaincompatibilidadeentreaaoda insulina e a funo do prprio IR, incluindo vias intracelulares, foi proposta noenvolvimentodadisfunodo sistemade insulinaenceflicanaDAE (SALKOVICPETRISIC;LACKOVIC,2006).

Considerandoapresenade insulinae IRnoencfalo,ummodeloexperimentalemratos foidesenvolvidousandoestreptozotocina (STZ)para induzirdisfunodosistemadeinsulina enceflico. A STZ (uma glicosaina derivada de nitrosuria) uma drogaseletivamentetxicasclulasBpancreticas,induzindoassimDiabetesTipoI,mastambm utilizada para induzir Diabetes InsulinoIndependente (tipo II) em animais, apsadministrao intravenosa ou intraperitoneal em ratos (SZKUDELSKI, 2001). A injeointracerebroventricular (icv) de STZ em baixas doses no altera, no entanto, os nveisplasmticos de glicose e no induz DM,mas altera ometabolismo de glicose enceflico(SALKOVICPETRISIC et al., 2006). Considerando os papeis importantes da insulina noencfalo,equeadeficincianasinalizaodeinsulinaestrelacionadatantoDAquantoDM, a injeo icv de STZ considerada pormuitos autores como um modelo da DAE(BIESSELS;KAPPELLE,2005;HENNEBERG;HOYER,1995;HOYER,2003;HOYERetal.,2004;SALKOVICPETRISICetal.,2006).

ASTZumadrogacujatoxicidadesedbasicamentepordoismecanismosprimrios(Figura 1).O primeiro deles a doao de radical xido ntrico (NO), podendo provocaralteraesnoestadonitrooxidativodaclula.Outromecanismodetoxicidadeametilao

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direta de bases nitrogenadas do DNA, podendo provocar um distrbio no equilbrioenergticodaclulaporconsumodeATPegeraodeespciesreativasdeoxignio(EROs)(LENZEN,2008;SZKUDELSKI,2001).Noh,noentanto,nenhummecanismodescritoqueexpliqueaaodaSTZemdosessubtxicasparapromooderesistnciainsulnica.

Perifericamente,a toxicidadedaSTZse iniciaquandoadroga internalizadapelasclulasBpancreticasporintermdiodotransportadordeglicosedotipo2(GLUT2)einduzmortecelularporalquilaodeDNAeativaodapoliADPribosilao.ComoaSTZumdoadordexidontrico(NO),aparticipaodoNOnoefeitocitotxicodaSTZtambmfoiobservada,bemcomoageraodeespciesreativasdeoxignio,quetambmcontribuemparaafragmentaodoDNAeevocamoutrasaesdeletriasnasclulas.AaodaSTZnamitocndria resultana formaode superxido, inibiodo ciclodocido tricarboxlicoediminuio substancialdo consumodeoxigniopelamitocndria, limitando fortementeaproduo de ATPmitocondrial (SZKUDELSKI, 2001). Omecanismo de ao da droga nosistemanervosocentral,noentanto,aindanofoielucidado.

Figura1 Mecanismopropostodedanooxidativoedesbalanoenergticoprovocadopela

STZ

Adoao espontneadoNOprovoca inibioda aconitase e consequentediminuiodoATPmitocondrial(MITATP),elevandoasconcentraesdeAMP.OAMPsubstratoparaaxantinaoxidase(XOD),quepassaateratividadeaumentadae,porconsequncia,aumentaaproduoderadicaissuperxido.

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AchadosmolecularesecomportamentaisqueseguemaperturbaodometabolismodeglicoseesinalizaodeinsulinaparecemmimetizaraDA,aomenosemalgunsaspectos.A administrao icv de STZ vem sendo associada, em animais, amudanasmorfolgicas,moleculares e comportamentais comparveis DA. Essas alteraes ocorrem algumassemanas aps a injeo e perduram por perodos indeterminados. Muitos autoresdescrevemaumentodaexpressodeGFAPprincipalmenteem regiesperiventriculareseparaventriculares, sugerindo que a funo hipocampal alterada pode resultar de umainervaocomprometidaedanodiretonessaregio (SANTOSetal.,2012;SHOHAMetal.,2006).

Comomencionadoanteriormente,asprincipaiscaractersticasdaDAsoaformaodeplacas senisdevidoacumulaode Aea formaodeemaranhadosneurofibrilaresdevidohiperfosforilaodaprotenaTau(KARetal.,2004).FoiobservadoqueessemodeloaumentaafosforilaodaprotenaTauemdiversasregiesdoencfalodorato(CORREIAetal., 2011;GASPARINI et al., 2002; SANTOS et al., 2012), aumenta a imunoreatividade amarcadores de emaranhados neurofibrilares (DE LA MONTE et al., 2005), e aumenta aexpressodopeptdeo A (DE LAMONTE et al., 2005; SALKOVICPETRISIC;HOYER, 2007;SANTOSetal.,2012),emboraessesestudosno tenhamobservadoa formaodeplacassenis.

Dados recentes tm sido bastante consistentes emmostrar os dficits cognitivos,aprendizagemememriadecurtoe longoprazocomprometidasno labirintoaquticodeMorris,apsaadministrao icvdeSTZ(GRNBLATTetal.,2006;LANNERT;HOYER,1998;2006;SANTOSetal.,2012;SHOHAMetal.,2006),quepareceserindependentedonmerodeinjeesoudadosedeSTZadministrada(revisadoemSALKOVICPETRISIC;HOYER,2007).Existem, no entanto, alguns estudos que demonstram que dosesmenores resultam emdficitcognitivomenor(GRNBLATTetal.,2006;PRICKAERTSETetal.,2000).A injeo icvde STZ tambm alterou o padro de comportamento em outras tarefas de memria,incluindoaesquivapassivaeo labirintoemcruzelevado(ISHRATetal.,2009;VEERENDRAKUMAR;GUPTA,2003).

Especificamente relacionado insulina e aometabolismo de glicose,Duelli (1994)mostrou que aps a administrao icv de STZ, houve alterao severa na utilizao deglicose, e diminuio dometabolismo energtico em 17 regies enceflicas. Plaschke e

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Hoyer (1993)mostraramqueaatividadedasprincipaisenzimasdaviaglicolticadiminuiudrasticamenteapsaadministraoicvdeSTZ.Tantoodficitenergticoquantoareduonaatividadedacolinaacetiltransferase(ChAT)(BLOKLAND;JOLLES,1993;HELLWEGETetal.1992)podemserabasebiolgicaparaareduzidahabilidadedeaprendizagemememria(LANNERT;HOYER,1998).

AadministraocentraldeSTZpodeterseusefeitosrestritosaneurnioseneurogliaque expressamGLUT 2.No entanto, a STZ pode alcanar omeio intracelular atravs deoutros transportadores, induzindo efeitos txicos generalizados. De fato, a utilizao deinibidoresdeGLUT2associadaadministraoicvdeSTZnofoicapazdesuprimirodficitdememriacausadopeladrogaemratos(GRUNBLATTetal.,2007),oquesugerequeaSTZtemaesindependentesdoGLUT2.

Propese que a sinalizao intracelular de insulina pode ser regulada por EROs.AcreditasequeaaodasEROspossaserdicotmica(Figura2).AsviasmaisinfluentesnomecanismodeestresseoxidativosoasrelacionadasaoNFkB,JNK/SAPK,p38MAPKePKC(LOPES; SILVA; FORTUNATO, 2008). Porm, sabese que agentes oxidantes podem tantopossuirefeitosquemimetizamaaodainsulina,aofacilitarafosforilaodasubunidadedoreceptordeinsulinae,portanto,suaativao,quantotambmseremcapazesdeinduziraoinsulnicadefeituosa(NAVAetal.,2009).Umadasinteraesviveisparaaconversaentreasinalizaoredoxeasinalizaode insulinapoderiamserumafamliadeprotenasfosfatases,asPTPs (protena tirosina fosfatases),que somoduladasnegativaporEROsoque,consequentemente,facilitarespostasintracelularesdependentesdefosforilaoemtirosina,comoocasodasinalizaodeinsulina(PAPACONSTANTINOU,2009).

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Figura 2 Possveis interferncias na cascata de sinalizao de insulina provocadas porespciesreativasdeoxignioenitrognio

Em A, o papel facilitador explicado pela inibio de protenas fosfatases que normalmente modulamnegativamenteavia(notarqueessasfosfatasestambmseapresentamcomatividadediminudanaDA).EmB,aativaodacascatadaMAPKinaseprovocainibiodoreceptordeinsulinaeseussubstratosintracelulares(IRS)pela fosforilaoem resduosde serinae treonina.Almdisso,espcies reativasdenitrognio (ERNs)danificamosIRS,encaminhandoosdegradao.

Outrosmodelos tm sidousadosna tentativade induzirDAE, como injeo icvde

colchicina (KUMARetal.,2007)e aplicao subcutneade longoprazode corticosterona(HOYER; LANNERT, 2008). Esses autores tambm observaram alteraes histopatolgicas,molecularesecomportamentaissimilaresaoqueobservadonaDA,noentantoaindahproblemas relacionados utilizao desses modelos e estudos mais aprofundados sonecessriosparainvestigarseusefeitos.

ComoapontadoporSalkovicPetrisicetal.(2011),carregarogenemutadocomouminevitvel ponto de partida desde o incio faz com que os modelos genticos decamundongossejam inapropriadospara investigaracausa, instalaoedecursodaDAemcondiesnoassociadascomamutaodogenedaAPP.

EstudosmaisprofundossonecessriosparaacompreensototaldosefeitosdaSTZnasclulasdosistemanervosocentral.Defato,omecanismodeaodedosessubtxicasdeSTZemneurniosaindanodevidamenteelucidado.Emborasuaaotxicasejabem

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conhecida,suautilizaocomomodeloparaaDAEporinduodedisfunoinsulnicaaindacarecedemaioresexplicaes.

A hiptese de que os efeitos subtxicos provocados pela STZ, dentro os quais asalteraesnasinalizaoeresponsividadeinsulina,bemcomomodificaodemarcadoresbiomoleculares relacionadosDA (hiperfosforilaodeTaue amilide), sejamcausadosporEROsencontra respaldonos trabalhosque indicamaproduodestasespcies comoumadasprimeirasformasdetoxicidadedadroga.

Alm dos trabalhos que estudam o mecanismo de ao da STZ, vrios outrosapontam a possibilidade do distrbio da sinalizao intracelular de insulina por agentesoxidantes.Nessesentido,oestudodosmecanismosintracelularesdesencadeadosporumaconcentrao subtxicadeSTZpode contribuirnaelucidaodenovosalvos teraputicosparaaDA.

1.4Objetivos

O objetivo deste trabalho determinar as alteraes induzidas por concentraessubtxicasde STZemneurniosda linhagemNeuro2Anaproduo intracelulardeEROs,procurandorelacionaroestadoredoxdaclulacomaatividadedacascataassociadaaoreceptor de insulina (PI3KAkt) atravs da verificao o estado de fosforilao dossubstratosdavia.

Almdaproduo intracelulardeEROsecapacidadededoaoespontneadeNOpeladroga,esteestudopretendeaveriguaracapacidadedeinduoderesistnciainsulnicapela STZ nas clulas utilizadas, bem como a influncia desse fenmeno na induo deneuritogneseportratamentocomNGF.

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5CONLUSES

Este trabalhoconseguealcanarconcluses importantesepioneirasa respeitodosefeitosdaSTZsobalinhagemcelularNeuro2A.

Foipossvelidentificarointervalodedosenotxicosclulasemperodosagudos,bemcomoascondiesideaisparaotratamentode48horascomadroga,bemcomoumabrevedescriodopadrodedoaoespontneadeNOpelaSTZ.

O acompanhamento da ativao da via PI3K / Akt em perodos agudos aps aadministraodadrogafoiumresultadoparticularmenteinteressante.Nessesexperimentosfoipossvela identificaodopapel fundamentaldoNOdoadopeladroga,queprovocaanitrosilao e inativao da protenaAkt, o que resulta numamaior atividade daGSK3nessesperodoscurtos.

AdescriodoperfildegeraodeespciesreativasdeoxignioapsadministraodaSTZtambmfoiumexperimentoqueobteveumresultadobastanteinteressante,emboramaisexperimentos seriamnecessriospara identificaodaorigeme contribuiodessasespciesreativasnainduodosfenmenosobservados.

Porfim,foipossvelcomprovarqueaestreptozotocinacapazdeinduzirumestadoderesistnciainsulnicanalinhagemneuronalutilizadaequeessefenmenodependentedeNO.Almdisso,apartirdos resultadosobtidosneste trabalhopossvel inferirqueadrogacapazdeprejudicaraneuritogneseinduzidaporNGF.Talefeitopodeseratribudo ao diabetognica da droga, uma vez que neurnios resistentes insulina tambmfalharamnamesmatarefa.

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FOLHA DE ROSTOCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao Final Completa.pdf1-13DissertaoIntegralCaioHenriqueYMazucanti.pdfCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado).pdfFicha_36_2013Folha_36_20130233_001CAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado)

Sumrio CorretoCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-Sumario.pdf1 INTRODUO1.1 Doena de Alzheimer1.2 Sinalizao Associada Neurodegenerao na DA1.3 Metabolismo Enceflico na DA e o Modelo da STZ1.4 Objetivos

2 MATERIAIS E MTODOS2.1 Cultivo de Clulas2.2 Viabilidade Celular2.2.1 Ensaio de viabilidade celular: reduo de formazan colorido (MTT)2.2.2 Ensaio de viabilidade celular: liberao de lactato desidrogenase (LDH)

2.3 Medio de xido Ntrico por Quimioluminescncia2.4 Ensaios de Western Blotting2.4.1 Avaliao da cintica de sinalizao do receptor de insulina2.4.2 Acompanhamento do estado de fosforilao da Akt e GSK3-2.4.3 Desafio de insulina2.4.4 Induo de resistncia insulnica

2.5 Medio de EROs por Fluorimetria em Citometria de Fluxo2.6 Ensaio de Imunofluorescncia2.6.1 Tratamento com NGF

3 RESULTADOS3.1 Viabilidade Celular (MTT)3.2 Citotoxicidade (LDH)3.3 Doao Espontnea de NO3.4 Western Blotting3.4.1 Estado de fosforilao da Akt e GSK3-3.4.2 Cintica da sinalizao do receptor de insulina3.4.3 Desafio de insulina3.4.4 Induo de resistncia insulnica

3.5 Avaliao de EROs por DHE e Citometria de Fluxo3.6 Induo de Neuritognese e Imunofluorescncia

4 DISCUSSO5 CONLUSESREFERNCIAS0FCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-Sumario.pdf1 INTRODUO1.1 Doena de Alzheimer1.2 Sinalizao Associada Neurodegenerao na DA1.3 Metabolismo Enceflico na DA e o Modelo da STZ1.4 Objetivos






4 DISCUSSO5 CONLUSESREFERNCIAS0F

11-76.pdfDissertaoIntegralCaioHenriqueYMazucanti.pdfCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado).pdfFicha_36_2013Folha_36_20130233_001CAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado)

RESUMOSCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao Final Completa.pdf1-13DissertaoIntegralCaioHenriqueYMazucanti.pdfCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado).pdfFicha_36_2013Folha_36_20130233_001CAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado)















CAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao Final Completa.pdf1-13DissertaoIntegralCaioHenriqueYMazucanti.pdfCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado).pdfFicha_36_2013Folha_36_20130233_001CAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado)















INTRODUOCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao Final Completa.pdf1-13DissertaoIntegralCaioHenriqueYMazucanti.pdfCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado).pdfFicha_36_2013Folha_36_20130233_001CAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado)















CONCLUSAO REFERENCIAS.pdfCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao Final Completa.pdf1-13DissertaoIntegralCaioHenriqueYMazucanti.pdfCAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado).pdfFicha_36_2013Folha_36_20130233_001CAIO HENRIQUE YOKOYAMA MAZUCANTI - Dissertao-1 (1) (2) (Reparado)















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