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Londrina 2014
CENTRO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS MESTRADO EM SAÚDE E PRODUÇÃO DE RUMINANTES
CAMILA BIZARRO DA SILVA
EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DO HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE (FSH) NO SISTEMA DE CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS DE
FÊMEAS Bos indicus
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CAMILA BIZARRO DA SILVA
EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DO HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE (FSH) NO SISTEMA DE CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS DE
FÊMEAS Bos indicus
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Produção de Ruminantes (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito à obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda Co-orientadora: Dra. Lívia Aires Lisboa
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CAMILA BIZARRO DA SILVA
EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DO HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE (FSH) NO SISTEMA DE CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS DE FÊMEAS Bos indicus
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Produção em Ruminantes (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina [UEL] e Universidade Norte do Paraná [UNOPAR]), como requisito à obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Prof. Dr. Orientador Marcelo Marcondes
Seneda Universidade Estadual de Londrina
____________________________________ Prof. Dr. Flavio Guiselli Lopes Universidade Norte do Paraná
____________________________________ Prof. Dra. Wanessa Blaschi
Universidade Estadual Norte do Paraná
Londrina, 28 de Novembro de 2014.
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Dedico
Aos meus pais, Luzia Bizarro e Saul Sudário da Silva Sobrinho, pelo amor, dedicação e apoio que me oferecem;
e irmã, Jéssica Bizarro da Silva.
Ao meu avôs, Antonio Bizarro e José Roque da Silva, que torceram por minhas realizações e não estão mais presente.
(in memoriam)
v
AGRADECIMENTO
Agradeço primeiramente a DEUS pela vida, saúde e por estar
presente em todos os momentos de minha vida, sendo felizes ou tristes, fáceis ou
difíceis.
Agradeço a minha mãe, Luzia Bizarro, pelo carinho, amor
incondicional, apoio, fé e dedicação. Por estar ao meu lado e fazer o impossível para
me ver feliz! Gostaria de dizer que me orgulho por ser sua filha e te considero um
exemplo de vida e determinação durante toda a minha caminhada. Agradeço a
minha irmã, Jessica Bizarro, por todas as conversas e risadas que tivemos durante
este dois anos distante, claro que sempre com briguinhas, mas são coisas de irmãs
né! Amo muito vocês!
Agradeço eternamente meus avôs maternos e paternos, Antonio
Bizarro (in memoriam) e Joana M. Bizarro, e, José Roque da Silva (in memoriam) e
Aparecida Castanho da Silva, por sempre acreditarem em mim e me permitiram que
meus sonhos de menina se tornassem realidade. Agradeço em especial meu primo
Jobson Ramos Bizarro (in memoriam) por ser uma pessoa impressendível em minha
vida, responsável por me ensinar a amar os animais, e decidir na escolha da
Medicina Veterinária como profissão. Agradeço ao meu pai, Saul S. S. da Silva,
meus tios e tias, especialmente minha tia Maria Bizarro dos Santos por rezar e pedir
por mim todas as vezes em que estava desanimada, meus primos e primas e todos
meus outros familiares pelo apoio, incentivo e amizade; e a duas pessoas que são
como se fossem da minha família Júlia e a Eva que sempre torceram por mim!!!
Agradeço ao meu orientador Marcelo Marcondes Seneda, pela
confiança e orientação durante este trabalho. Além de orientador-professor foi um
grande amigo, pelo qual irei cultivar por muito e muito tempo. Sempre pelos
conselhos e lições de vida, principalmente nos momentos mais difíceis. Meu muito
obrigado de coração!
A Dra. Lívia Aires Lisboa pela coorientação, pelas oportunidades,
pela amizade e por acreditar no meu trabalho.
Ao Coordenador Profº Dr. Werner Okano, pelo apoio e atenção
durante o programa de pós-graduação. E a todo o corpo docente do programa
vi
associado de pós-graduação em Saúde e Produção de Ruminantes UNOPAR e
UEL. Obrigada!
Aos meus professores da Faculdade Evangélica do Paraná, que me
ensinaram com tanto amor o papel do Médico Veterinário, principalmente o Profº Drº
Eros Souza e a Profª Dra. Rebeca Bachi. E todos os mestres que contrubuíram na
minha formação profissional.
As minhas amigas inseparáveis que mesmo estando longe me
acompanham sempre e sempre durante todo este tempo, Kika, Cris Luxo, Pammy,
Belyza, Beti, Ale, Marcela, Ana Paula, Cinthia e a Louise. A TURMA do meu
coração, Guilherme, Jorge, Kassio, Paulo Maluco (GV), Eron, Elmar, Leandro,
Matheus e Gerson, que nunca me deixaram entristecer por estar longe de Curitiba.
Amo muito todos meus amigos de Curitiba!!!
Aos colegas do laboratório REPROA, Andressa, Camila Rosa,
Cristiane (Kit), Fabiana, Fábio, Fernanda, Gustavo, Isabela, João Vitor, Katia,
Luciana, Maíra, Marilu, Paula, Polyana, Rebeca, Reginaldo, Roberta, Suellen, que
possibilitaram dois anos de muitas risadas e alegrias, e me apoiaram em todos os
momentos; as funcionárias Alethia e Eleni pelo tempo disponibilizado. E aos colegas
de mestrado, Tobias, Geisi, Laís Belan, Tássio, Taíssa e Denis.
Agradeço aos membros da banca de Qualificação (Professor Dr.
Werner Okano e a Dra. Katia Cristina Silva Santos) pelas importantes contribuições
para este trabalho. E aos membros da banca de Defesa (Professora Dra. Wanessa
Blaschi e ao Dr. Flávio G. Lopes), pelo tempo dedicado e por poder contribuir com
este trabalho.
Gostaria de agradecer também algumas pessoas que contribuíram
direta ou indiretamente para elaboração deste trabalho.
Meu muito obrigada!
vii
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades,
lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.”
Charles Chaplin
“Decidi não esperar as oportunidades e sim, buscá-las.
Decidi ver cada dia como uma nova oportunidade de ser feliz.”
Walt Disney
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SILVA, Camila Bizarro da. Efeito de diferentes concentrações do hormônio folículo estimulante (FSH) no sistema de cultivo in vitro de folículos pré-antrais de fêmeas Bos indicus. 2014. p 64. Dissertação de Mestrado Acadêmico Saúde e Produção de Ruminantes (Mestrado Acadêmico em Saúde e Produção de Ruminantes ) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.
RESUMO
O desenvolvimento de um sistema de cultivo de folículos ovarianos in vitro eficiente capaz de permitir a investigação dos fatores relacionados à atresia folicular ainda se faz necessário. Uma vez otimizado, o sistema permitiria a obtenção da ovulação in vitro, além da produção de embriões a partir destes oócitos ovulados. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da adição do hormônio folículo estimulante (FSH) no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais de fêmeas Bos indicus. Foram utilizados ovários de abatedouro (n=5) de vacas cíclicas. Os ovários foram lavados em etanol 70% e solução tampão (PBS). Após a obtenção foram processados e transportados para o laboratório, a 20ºC. Cada par de ovários de um único animal foi processado junto, divididos em fragmentos de aproximadamente 3X3X1 mm. Para cada animal, um fragmento foi selecionado aleatoriamente e imediatamente fixado em Bouin (tratamento controle não-cultivado, D0). Os outros fragmentos foram cultivados em meio de cultivo controle constituído por meio essencial mínimo (MEM, Gibco BRL, Rockville, MD, USA; osmolaridade 300 mOsm/l, pH 7,2) suplementado (MEM+) com ITS (insulina 6,25 µg/mL, transferina 6,25 mg/mL e selênio 6,25 ng/mL), 0,23 mM de piruvato, 2 mM glutamina, 2 mM hipoxantina, 1,25 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA Gibco BRL, Rockville, MD, USA), 20 UI/mL de penicilina e 200 mg/mL de estreptomicina. Para os tratamentos, o meio MEM+ foi suplementado com diferentes concentrações do FSH (Folltropin®, 50, 100 e 200 ng/mL). Dez fragmentos do córtex ovariano de cada animal foram cultivados nos meios testados por 2 (D2) ou 6 (D6) dias. A cada intervalo de dois dias, o meio de cultivo foi substituído por meio fresco. Para a análise da morfologia ovariana e dos folículos ovarianos, os fragmentos foram processados e avaliados pela técnica de histologia clássica. Os folículos pré-antrais foram classificados de acordo com o estágio de desenvolvimento (primordial, primário, secundário) e quanto à morfologia (normal ou degenerado). Os dados analisados foram submetidos à ANOVA, teste de Tukey e Teste T-Student (p≤0,05). Dos folículos avaliados, total 2250 folículos pré-antrais, dos quais 772 folículos primordiais e 1478 folículos em desenvolvimento, entre normais e degenerados. Após dois dias de cultivo, a proporção de folículos primordiais foi reduzida em todos os tratamentos testados, em consequência, ocorreu um aumento na proporção de folículos em desenvolvimento (p≤0,05). Comparando-se as diferentes concentrações de FSH com o MEM, observou-se uma maior sobrevivência proporção de folículos viáveis em meio contendo 100 ng/mL de FSH aos dois dias de cultivo, no entanto, aos seis dias de cultivo a concentração de 100 ng/mL e 200 ng/mL de FSH possibilitaram uma maior proporção de folículos pré-antrais viáveis. Desta maneira é possível concluir que o meio MEM+ suplementado com 100 ng/ml FSH por 2 ou 6 dias e a concentração de 200 ng/mL aos 6 dias de cultivo in vitro permitiu desenvolvimento adequado dos folículos. Palavras-chave: Cultivo in vitro. Folículos pré-antrais. FSH. Bovino.
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SILVA, Camila Bizarro da. Effect of different concentrations of follicle stimulating hormone (FSH) in the in vitro culture system of preantral follicles of females bos indicus. 2014. 64p. Dissertação em Saúde e Produção de Ruminantes Mestrado Acadêmico Saúde e Produção de Ruminantes – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.
ABSTRACT
The development of culture system for ovarian follicles in vitro efficiently able to allow the investigation of factors related to follicular atresia is still necessary. An optimum time, the system also would allow the development of ovulation in vitro, besides the production of embryos from these oocytes ovulated. The aim of this study was to evaluate the effect of the addition of follicle stimulating hormone (FSH) in the culture medium in vitro pre-antral follicles from Bos indicus. Slaughterhouse ovaries (n=5) of cyclic cows were used. The ovaries were washed in 70% ethanol and buffer solution (PBS) after recovery were processed and transported to the laboratory at 20. Each pair of ovaries from a single animal has been processed together, and divided into fragments of about 3x3x1 mm. For each animal, a fragment was randomly selected and immediately fixed in Bouin (control non-cultivated, D0). The other fragments were cultured in control culture medium composed of minimum essential medium (MEM, Gibco BRL, Rockville, MD, USA; osmolarity 300 mOsm/L, pH 7.2) supplemented (MEM) with ITS (insulin 6.25 µg/ml, transferrin 6.25 mg/mL and selenium 6.25 ng/mL), 0.23 mM pyruvate, 2 mM glutamine, 2 mM hypoxanthine, 1.25 mg/mL bovine serum albumin (BSA GibcoBRL, Rockville, MD, USA), 20 IU/ml penicillin and 200 mg/ml streptomycin. For treatments, the MEM medium was supplemented with different concentrations of FSH (Folltropin®, 50, 100 and 200 ng/ml). Ten fragments of ovarian cortex of each animal were cultured in media tested 2 (D2) or 6 (D6) days. After every two days, the medium was replaced with fresh medium. For the analysis of ovarian morphology and ovarian follicles, the fragments were processed and evaluated by classical histology. The pre-antral follicles were classified according to the stage of development (primordial, primary, secondary) and the morphology (normal or degenerate). Data were analyzed by ANOVA, Tukey and Student t-test (p≤0.05). Of the evaluated follicles, 2250 Total pre-antral follicles, of which 772 primordial follicles and 1478 developing follicles, between normal and degenerated. After two days of culture, the proportion of primordial follicles was reduced in all treatments, consequently, an increase in the proportion of developing follicles (p≤0.05). Comparing the different concentrations of FSH with MEM, there was a higher proportion of viable follicle survival in medium containing 100 ng / ml FSH at two days of cultivation, however, the six days of culture the concentration of 100 ng / ml and 200 ng / ml FSH enabled a higher proportion of viable preantral follicles. Thus it can be concluded that the MEM + supplemented with 100 ng / ml FSH for 2 to 6 days and the concentration of 200 ng / mL at 6 days of in vitro culture has allowed proper development of follicles. Key words: In vitro. Preantral Follicles. FSH. Bovine.
x
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Esquema representativo do ovário mamífero e suas estruturas
fundamentais ............................................................................................................ 17
Figura 2 – Representação esquemática da formação das células germinativas
primordiais (CGP), oogênese e foliculogênese ........................................................ 19
Figura 3 – Esquema ilustrativo da origem dos folículos primordiais a partir das
células germinativas presentes nos ovários ............................................................. 21
Figura 4 – Representação do desenvolvimento dos folículos ovarianos ................. 22
Figura 5 – Alterações celulares em folículos ovarianos que ocorrem durante o
desenvolvimento folicular ......................................................................................... 24
Figura 6 – Fases de transição das células da granulosa durante o crescimento
folicular ..................................................................................................................... 28
Figura 7 – Protocolo experimental para o cultivo in vitro de folículos pré-antrais
bovinos in situ com diferentes concentrações do Hormônio Folículo Estimulante
(FSH) ........................................................................................................................ 42
Figura 8 – Fotomicrografia de cortes histológicos de ovário de bovino cultivados in
vitro, corado com PAS e Hematoxilina, 400x. A – Folículo Primordial (seta); B –
Folículo Primário (seta); C –Folículo Primário degenerado (seta); D – Folículos
Primários; E – Folículo Secundário; F – Folículo Primordial degenerado (seta)....... .45
Figura 9 – Comparação entre cada tratamento aos dois e seis dias de cultivo in vitro
em MEM ou MEM+ suplementado com diferentes concentrações de FSH de folículos
ovarianos (primordial, primário e secundário) viáveis de fêmeas Bos indicus........ .. .47
Figura 10 – Porcentagem média de folículos em desenvolvimento (primário +
secundário) viáveis de fêmeas Bos indicus, após cultivo in vitro de dois ou seis dias
em MEM ou MEM+ suplementado com diferentes concentrações de FSH....... ....... .48
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Porcentagem média de folículos viáveis de fêmeas Bos indicus em
estágio inicial de desenvolvimento (primordial, primário + secundário), em tecido
ovariano não-cultivado (controle, dia 0) e após cultivo in vitro de dois ou seis dias em
MEM ou MEM+ suplementado com diferentes concentrações de FSH. ................... 46
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg - Micrograma
ATP - Adenosina Trifosfato
BMPs 15 - Proteínas morfogenéticas ósseas 15
BMPs 4 - Proteínas morfogenéticas ósseas 4
BMPs 7 - Proteínas morfogenéticas ósseas 7
EGF - Fator de crescimento epidérmico
FGF - Fator de crescimento fibroblástico
FGF 2 - Fator de crescimento de fibroblastos
FOPA - Folículos ovarianos pré-antrias
FSH - Hormônio folículo estimulante
GDF 9 - Fator de diferenciação de crescimento- 9
IGF 1 - Fator de crescimento semelhante à insulina 1
IGF 2 - Fator de crescimento semelhante à insulina 2
ITS - Insulina transferina e selênio
K - Potássio
KGF - Fator de crescimento de queratinócitos
KL - Kit ligand
MEM - Meio Essencial Mínimo
mg - Miligrama
mL - Mililitros
Mm - Milimol
MOIFOPA - Manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais
NA - Sódio
ng - Nanogramas
ºC - Graus Celsius
PAS - Ácido periódico de Schiff
PBS - Solução Tampão
PIV - Produção de embriões in vitro
TSH - Hôrmonio estimulante da tireóide
VEGF - Fator de crescimento endotélio vascular
VIP - Peptídeo intestinal vasoativo
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 16
2.1 OVÁRIO MAMÍFERO ................................................................................................ 16
2.2 OOGÊNESE... ........................................................................................................ 17
2.3 FOLICULOGÊNESE... ............................................................................................... 20
2.4 CLASSIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DOS FOLÍCULOS OVARIANOS... ....... 21
2.4.1 Folículos Pré-antrais......................................................................................... 23
2.4.1.1 Folículos Primordiais ..................................................................................... 24
2.4.1.2 Folículos Primários ........................................................................................ 25
2.4.1.3 Folículos Secundários ................................................................................... 25
2.4.2 Folículos Antrais ............................................................................................... 26
2.5 POPULAÇÃO FOLICULAR.......................................................................................... 26
2.6 CRESCIMENTO E ATIVAÇÃO FOLICULAR... ................................................................. 27
2.7 ATRESIA FOLICULAR... ............................................................................................ 29
2.8 BIOTECNOLOGIAS UTILIZADAS NO AUXÍLIO DA COMPREENSÃO E ESTUDO DA
FOLICULOGÊNESE... ..................................................................................................... 31
2.9 CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS... ...................................................... 33
3.0 IMPORTÂNCIA DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTIVO SOBRE O DESENVOLVIMENTO
FOLICULAR IN VITRO... .................................................................................................. 37
3.1 IMPORTÂNCIA DO FSH NO DESENVOLVIMENTO FOLICULAR... ..................................... 38
3 HIPÓTESE..... ........................................................................................................ 40
4 OBJETIVOS.. ......................................................................................................... 40
4.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................... 40
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 40
5 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 41
5.1 COLETA E TRANSPORTE DOS OVÁRIOS ..................................................................... 41
5.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ................................................................................... 41
13
5.3 HISTOLOGIA CLÁSSICA ........................................................................................... 42
5.4 CLASSIFICAÇÃO FOLICULAR .................................................................................... 43
5.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................ 44
6 RESULTADOS ....................................................................................................... 45
7 DISCUSSÃO.. ........................................................................................................ 50
CONCLUSÃO ........................................................................................................... 54
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 55
14
1 INTRODUÇÃO
O Brasil detém o maior rebanho comercial bovino do mundo,
composto por aproximadamente 209 milhões de animais (53), com expressiva
participação deste seguimento no mercado mundial. E apresenta o segundo maior
rebanho bovino, em população (27), com 80 a 85% do seu plantel composto por
raças zebuínas e seus cruzamentos. Os índices produtivos são inferiores ao
esperado em decorrência da baixa eficiência reprodutiva dos rebanhos (70). Isto
possivelmente é explicado pela fisiologia ovariana, já que, estima-se uma parcela
mínima dos folículos ovarianos presentes no pool de reserva atinja a ovulação,
enquanto o restante, cerca de 99,9% dos folículos, sofram um processo
degenerativo ou apoptótico conhecido por atresia (69; 9).
Nos últimos anos, as biotecnologias associadas à reprodução
apresentaram um extraordinário crescimento, tanto no contexto molecular quanto
nos aspectos diretamente aplicados. Em virtude desta expansão e do crescente
estudo destas técnicas, o Brasil se destaca como segundo maior produtor de
embriões bovinos in vivo e líder mundial na produção de embriões in vitro (PIV – 103).
Especialmente, ao que se refere aos avanços dos últimos anos, algumas das
biotécnias utilizadas na reprodução animal obtiveram um desenvolvimento
expressivo, como a clonagem, a transgenia animal e a manipulação de oócitos
inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA), este ultimo apresenta como
princípio o desenvolvimento ou preservação de folículos ovarianos na fase pré-antral
da foliculogênese. A MOIFOPA consiste no isolamento, na conservação e no cultivo
in vitro de folículos ovarianos pré-antrais (FOPA) de mamíferos (34).
15
Apesar destas conquistas e de inúmeras pesquisas referentes às
biotecnologias, a fisiologia ovariana ainda não é totalmente esclarecida (62), e por
isso tornou-se um assunto intensamente estudado pela sua importância na pesquisa
fundamental, no incremento da produção zootécnica com fins comerciais e como
modelo para diversas áreas da medicina humana. Neste contexto, a utilização da
MOIFOPA, possibilitaria desvendar alguns paradigmas que envolvem o inicio da
foliculogênese, os quais abrangem os folículos ovarianos localizados na fase de
repouso, ativação e crescimento inicial e a liberação de oócitos (29; 34; 3).
Para maximização do potencial reprodutivo e diminuição da atresia
folicular in vivo, o cultivo in vitro de folículos pré-antrais poderia ser utilizado para
desvendar as diferentes substâncias envolvidas no desenvolvimento folicular. Do
mesmo modo, o estudo da influência do hormônio folículo estimulante (FSH) em
folículos pré-antrais cultivados in vitro poderia ser a chave para a melhor
compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do início da foliculogênese
e no controle do desenvolvimento dos folículos ovarianos. Existem hipóteses que
indicam a atuação do FSH na diferenciação e proliferação das células da granulosa
in vitro, e ainda, inibem a apoptose no cultivo in vitro de folículos pré-antrais (5).
Diante do exposto, torna-se essencial o desenvolvimento de um
sistema eficiente de cultivo in vitro de folículos ovarianos, capaz de permitir o
desenvolvimento e a maturação completa dos oócitos inclusos em folículos pré-
antrais. Após um breve revisão de literatura, apresentaremos neste trabalho o efeito
da adição do hormônio folículo estimulante (FSH) no meio de cultivo in vitro de
folículos pré-antrais de fêmeas Bos indicus.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Ovário mamífero
O ovário dos mamíferos (Figura 1) exerce funções essenciais para o
sistema reprodutivo de uma fêmea, sendo responsável por duas etapas 1) pela
produção e secreção de hormônios, os quais são responsáveis pelo
desenvolvimento folicular, manutenção do trato reprodutivo, ciclo estral e outras
funções hormonais (48; 4) e 2) pela produção, diferenciação e liberação de um oócito
maduro para fecundação (74). O formato do ovário varia de acordo com a espécie
animal e o estágio a qual se encontra do ciclo estral (45). Nos ruminantes,
especificamente nos bovinos, os ovários apresentam formato de amêndoa com peso
entre 10 a 20 g na idade adulta. O comprimento pode variar de 3,0 a 4,5 cm, e a
largura de 1,5 a 2,0 cm (45).
Nos mamíferos, os ovários são constituídos por duas regiões,
classificadas em córtex e medula ovariana, circunscrita por epitélio germinativo ou
superficial que “repousa” sob uma membrana basal (100). Os diferentes tipos
celulares encontrados no córtex ovariano diferenciam- se em diferentes subtipos
celulares. Nestes casos, podemos citar as células da granulosa que se caracterizam
em células do cúmulus ou luteais, enquanto, as células da teca se diferenciam em
camada interna e externa (25). Além disso, o córtex ovariano localizado na porção
mais externa representa a região funcional do ovário (100). A região cortical é
composta por folículos ovarianos e corpos lúteos (corpos albicans e hemorrágicos)
em vários estágios de desenvolvimento ou atresia, assim como, por tecidos
conectivos (colágeno – do tipo I e III, fibras reticulares e fibroblasto) (45; 100).
17
A região medular, na maioria das espécies, está localizada mais
internamente e apresenta um arranjo irregular de tecido nervoso, vascular
(sanguíneo e linfático), tecido fibroblástico e conjuntivo, o qual se comunica com
ovário através do hilo (100). Sua função consiste na sustentação e nutrição do ovário
(45). Durante a vida reprodutiva de uma fêmea a funcionabilidade do ovário é
influenciada pela interação exata entre os fatores endócrinos, autócrinos e
parácrinos, que juntos, atuam no processo de desenvolvimento folicular e oocitário,
conhecido como foliculogênese e oogênese, respectivamente.
Figura 1 - Esquema representativo do ovário mamífero e suas estruturas fundamentais. Fonte: http://quizlet.com/3675959/anatomy-respiratory-urinary-digestive-reproductive-flash-cards/
2.2 Oogênese
Nos ruminantes, a oogênese consiste na formação e modificação
das células germinativas primordiais até alcançar o estágio de formação do oócito
18
haplóide fecundado (Figura 2, 91). Este processo ocorre ainda durante a vida fetal
juntamente com a foliculogênese e, apenas alguns dos oócitos presentes no pool de
reserva conseguirão atingir o processo de desenvolvimento até a fecundação (115; 9).
Sabe-se que as fêmeas nascem com um estoque de oócitos pré-estabelecido (96; 34).
Na vida uterina, durante a fase de embrião, as células germinativas
primordiais, localizadas no saco vitelínico, deslocam para as gônadas em
desenvolvimento para se transformarem em oogônias, com remanejamento das
organelas citoplasmáticas, proliferação celular excessiva e a perda das
características de motilidade (92; 9).
Após as múltiplas divisões mitóticas das células germinativas
primordiais, originam-se dois tipos diferentes de células. A primeira linhagem de
células germinativas tem por início imediato de sucessivas divisões mitóticas
ocasionando a origem de uma linha de células oogônias, Enquanto que a segunda,
permanece em intérfase para divisões periódicas que darão origem às novas células
germinativas que posteriormente se diferenciarão em oócitos (48).
Como continuação do processo de oogênese, as células que
encontram-se em estágio da primeira divisão meiótica acontece à interrupção da
divisão meiótica e a constituição de oócitos primários, que persistem neste estágio
até a puberdade (48). Ao atingir a puberdade, ocorrem estímulos que determinam o
momento da ovulação, isso é possível pelo pico do hormônio luteinizante (LH) e
declínio das concentrações do hormônio folículo estimulante (FSH), neste momento,
os oócitos retomam a meiose do estágio de profase I (41). Posteriormente, acontece
o rompimento da vesícula germinativa, na qual sucedem as seguintes etapas,
metáfase I, anáfase I e telófase I, com a extrusão do corpúsculo polar e o
desenvolvimento do oócito secundário (10).
19
Subsequentemente inicia-se a segunda divisão meiótica, na qual o
núcleo do oócito se desenvolve até atingir o estágio de metáfase II. Este é o
momento da segunda interrupção da meiose (41). O oócito continua neste estágio até
a chegada do espermatozoide para a fecundação. Caso haja a fecundação, o oócito
prossegue a meiose (10) e finaliza a oogênese com a extrusão do segundo
corpúsculo polar, culminando com o oócito haploide fecundado (41; 76).
Figura 2 - Representação esquemática da formação das células germinativas primordiais (CGP), oogênese e foliculogênese. Fonte: Adaptado de Sánchez, Smitz (
89).
20
2.3 Foliculogênese
Mesmo com os inúmeros estudos e o desenvolvimento de diversas
técnicas reprodutivas, as informações existentes sobre o processo de
foliculogênese, os mecanismos de maturação e a atresia folicular ainda são pouco
compreendidos. Assim, como as informações relacionadas com os folículos
ovarianos pré-antrais (FOPA) são consideradas escassas (34).
Segundo Lima-Verde et al. (65), o inicio da foliculogênese na maioria
das espécies ocorre no decorrer da vida fetal, com a formação da reserva de
folículos primordiais, os quais são fisiologicamente estimulados a um crescimento
sequencial. Este processo de crescimento é ajustado através da presença de
hormônios esteroides sintetizados pelos ovários, por fatores de crescimento e a
atividade das gonadotrofinas.
O processo da foliculogênese é definido como a formação, o
desenvolvimento e a maturação folicular. Inicia-se com a formação do folículo
primordial e culmina no último grau de ovulação, com o folículo no ápice da
maturação, também denominado como folículo de Graff, dominante ou pré-ovulatório
(34; 86; 87). A formação dos folículos primordiais ocorre no momento em que os
oócitos são individualizados pela separação dos cordões das células germinativas
(Figura 3; 12; 9).
21
Figura 3 - Esquema ilustrativo da origem dos folículos primordiais a partir das células germinativas presentes nos ovários. Fonte: Adaptado de Juengel et al. (
60).
2.4 Classificação e caracterização estrutural dos folículos ovarianos
O folículo é a unidade morfológica e funcional responsável por
proporcionar um ambiente apropriado para manutenção e viabilidade, além do
crescimento e maturação do oócito para o processo de ovulação (34; 64; 87).
A população de folículos presente nos ovários é muito heterogênea
(95). De acordo com alguns autores os folículos podem ser classificados em relação
aos aspectos morfológicos e grau de evolução em: 1) folículos pré-antrais ou não
cavitários e 2) folículos antrais ou cavitários (29). Os folículos ovarianos pré-antrais
são classificados de primordiais, primários e secundários; e os folículos antrais
compreendem aos folículos terciários e pré-ovulatórios ou de Graaf (Figura 4, 51; 34;
65).
Ainda é possível classificar os folículos pré-antrais de acordo com o
grau de viabilidade, em folículos saudáveis ou normais com a lâmina basal, vesícula
germinativa e nucléolos intactos, e oócito com menos de três vacúolos
citoplasmáticos; e em folículos atrésicos, com o oócito com mais de três vacúolos
22
citoplasmáticos e começo da descondensação da cromatina, ou em estágios mais
avançados, com oócito com o nucléolo e o citoplasma em fragmentação e
condensação da cromatina elevada, ou ainda com o oócito completamente
fragmentado ou ausente (14; 114).
A composição do folículo ovariano consiste num oócito circundado
por células somáticas (granulosa e tecais). Durante a foliculogênese, a morfologia
folicular é alterada, visto que o oócito cresce e as células da granulosa circundantes
se multiplicam e se diferenciam (12; 65).
Durante a fase fetal, alguns folículos primordiais são ativados,
crescem e se diferenciam em folículos primários, secundários ou terciários, enquanto
que apenas alguns folículos atingirão o estágio de folículo pré-ovulatório na vida
pós-natal sob o efeito de hormônios (39).
A diferenciação das células da granulosa pode ocorrer na presença
de estradiol, momento em que se encontram receptores de FSH (39; 65).
Adicionalmente, outros pesquisadores observaram que a associação de estradiol e
FSH estabelece um crescimento folicular em fêmeas bovinas (65).
Figura 4 - Representação do desenvolvimento dos folículos ovarianos Fonte: Adaptado de Araújo et al. (
4)
23
2.4.1 Folículos Pré-antrais
O desenvolvimento folicular pré-antral esta relacionado ao aumento
do volume e mudanças no formato das células da granulosa, enquanto que no
estágio secundário ocorre o aumento do diâmetro oocitário, bem como, a
proliferação das células da granulosa (33). Os folículos pré-antrais são classificados
de acordo com o formato, tamanho e o número de camadas das células da
granulosa que envolve o oócito imaturo, em primordiais, primários e secundários (9).
Os folículos primordiais apresentam como característica o
surgimento de uma zona pelúcida, formada por glicoproteínas que circundam o
oócito (84), enquanto os folículos secundários apresentam pelo menos duas
camadas de células da granulosa e células da teca ao redor da membrana basal (6).
Neste estágio, as células da granulosa dos folículos apresentam uma extensiva rede
de junções do tipo gap, os quais são canais membranários que possibilitam a
passagem de íons inorgânicos, nutrientes, pequenos metabólicos e os mensageiros
entre as células (61).
Posteriormente no processo de foliculogênese, os folículos são
denominados de terciários ou antrais, caracterizados pela organização das células
da granulosa em diversas camadas com a formação de uma cavidade repleta de
fluido folicular, denominado de antro (Figura 5). O líquido folicular que completa esta
cavidade é composto de água, proteínas séricas, eletrólitos e altas concentrações de
hormônios esteroides secretados pelas células da granulosa (6).
24
Figura 5 - Alterações celulares em folículos ovarianos que ocorrem durante o desenvolvimento folicular
Fonte: Adaptado de Silva-Buttkus et al. (102
).
2.4.1.1 Folículos Primordiais
Os folículos ovarianos primordiais consistem no estágio inicial do
desenvolvimento folicular localizados no pool de reserva. Durante esta fase alguns
folículos serão ativados e iniciarão o processo de crescimento e diferenciação (107).
Cada folículo é composto por um oócito rodeado por uma camada de quatro a oito
células da granulosa achatada (51; 26). Em bovinos, o diâmetro folicular no estágio
primordial pode variar de 30 a 40 µm, com um oócito entre 20 a 25 µm (8).
Nos folículos primordiais, o núcleo do oócito permanece numa
posição central evidenciando o nucléolo. No entanto, as organelas estão distribuídas
uniformemente pelo citoplasma ou aproximadas ao núcleo. Contudo, a organela
mais evidente e predominantemente redonda é a mitocôndria, enquanto, o complexo
de Golgi e o retículo endoplasmático liso são estruturas pouco desenvolvidas e
distribuídas desuniformemente pelo citoplasma (68).
25
2.4.1.2 Folículos Primários
A atividade proliferativa das células da granulosa culmina na
formação de uma camada de células cuboides ao redor do oócito.
Desse modo os folículos primários apresentam um oócito rodeado
por uma camada de 11 a 12 células da granulosa em formato cuboide. Os folículos
primordiais e primários não podem ser diferenciados através das medidas de
diâmetro, mas apenas pelas alterações morfológicas (51).
2.4.1.3 Folículos Secundários
Por sua vez, quando os folículos atingem o estágio de duas ou mais
camadas das células da granulosa cuboidais, são então denominados de folículos
secundários. Em bovinos, os folículos secundários apresentam diâmetro de 60 a 200
µm (8). No decorrer do crescimento do folículo secundário as fibras de tecido
conectivo se posicionam paralelamente à membrana basal para formar a camada
tecal.
Nos folículos secundários o núcleo do oócito está disposto em uma
posição excêntrica, diferente dos folículos primordiais posicionados na região
central. Assim, o núcleo do oócito estará situado entre a zona pelúcida e o centro do
oócito, as organelas também se deslocam para a periferia do folículo (52). A zona
pelúcida é composta por pequenos microvilos e esta localizada entre o oócito e as
células da granulosa. Com o desenvolvimento folicular o espessamento da zona
pelúcida tornando-se visível (68; 86).
26
2.4.2 Folículos Antrais
Dentro da categoria dos folículos antrais estão presentes os folículos
terciários e de Graaf ou também denominados como maduros ou pré ovulatórios. A
principal característica dos folículos antrais consiste no surgimento do antro folicular.
Com a atividade proliferativa intensa das células da granulosa, ocorre o surgimento
de uma área preenchida por líquido folicular, conhecido como antro folicular (34; 9).
Os folículos terciários são constituídos de um oócito circundado pela
zona pelúcida, uma pequena cavidade antral e várias camadas de células tecais (41).
São caracterizados pela presença de muitas microvilosidades dentro da zona
pelúcida, bem como grande quantidade de mitocôndrias arredondadas e alongadas
e partículas lipídicas (26), enquanto, os folículos de Graaf representam o estágio final
do desenvolvimento folicular. Neste caso, há o predomínio de mitocôndrias
arredondadas, além disso, é possível visualizar mitocôndrias encapuzadas,
caracterizado como o crescimento completo do oócito em bovinos (52).
2.5 População folicular
Estima-se que a população folicular seja variável entre as espécies.
Na espécie bovina, a população folicular ao nascimento está em torno de 235.000
de folículos por ovário (10), enquanto que nos caprinos e ovinos este número pode
estar entre 37.646 (67) e 160.000 (21) folículos, respectivamente.
Tendo em vista essa variação quanto à população folicular, existem
diferentes fatores que podem influenciar diretamente o número de folículos presente
27
no ovário, como variação individual, raça (15), idade (91), genética (24), níveis
hormonais (82), estado nutricional (97; 104) e reprodutivo.
A população folicular dos ovários é composta por mais de 90% de
folículos pré-antrais, e está localizada no córtex ovariano (105). A população de
folículos primordiais, presentes no pool, representa aqueles em quiescência, os
quais estão diretamente relacionados com a renovação contínua dos folículos
antrais no ovário (43). Ao deixarem a fase de quiescência, os folículos sofrem um
processo sequencial de crescimento regulado pela presença de hormônios e fatores
de crescimento. Assim, ao iniciar a foliculogênese, o objetivo é a liberação de um
oócito maduro, pronto para a fecundação (86).
Uma reserva representativa dos folículos existente nos ovários,
conhecido como pool de folículos pré-antrais, pode significar um material genético
destinado para a manipulação, preservação das espécies e até para o tratamento de
infertilidade (83). A população de folículos antrais é altamente variável entre os
indivíduos, todavia, mantém-se a alta repetibilidade individual (13; 56). A variação
entre a população antral entre indivíduos adultos é altamente expressiva, e está
relacionada positivamente com os índices de fertilidade e a função ovariana. (55).
2.6 Crescimento e ativação folicular
O crescimento folicular tem como início o desenvolvimento e a
diferenciação folicular. Assim, a ativação dos folículos primordiais consiste na
passagem dos folículos encontrados no pool de reserva ou folículos quiescentes,
para o pool de crescimento (91). No momento em que o folículo deixa a reserva,
crescerá até ovular ou sofrerá atresia ou degeneração folicular (73; 65).
28
O primeiro sinal de ativação folicular é marcado pela proliferação das
células da granulosa (Figura 6). As células da granulosa dos folículos primordiais em
crescimento gradualmente adquirem o formato cuboide, tornando-se folículos em
estágio de transição, caracterizados pela presença de ambos os formatos das
células da granulosa, achatadas e cuboides, e, subsequentemente, formando os
folículos primários, com a presença de uma camada de células da granulosa
cuboides em torno do oócito (42; 102).
As alterações que ocorrem durante o crescimento dos folículos
consistem na mudança do formato das células da granulosa, também, ocorre o
aumento considerável do volume citoplasmático e nuclear do oócito (48, 102). Os
mecanismos e fatores responsáveis pela ativação dos folículos no estágio primordial,
bem como aqueles envolvidos na variação do período durante o início do
crescimento folicular ainda são desconhecidos (36).
Figura 6 – Fases de transição das células da granulosa durante o crescimento folicular. Fonte: Adaptado de Silva-Buttkus et al. (
102)
29
2.7 Atresia folicular
Os folículos ovarianos que chegam ao estágio ovulatório são muito
poucos, isto é consequência do processo de atresia. Estima-se que
aproximadamente 99,9% dos folículos ovarianos sofrem degeneração ou apoptose
denominado atresia folicular, fazendo com que o ovário seja considerado um órgão
de baixa produtividade (58).
A atresia folicular pode ser influenciada por diferentes fatores, tais
como, a idade, o ciclo reprodutivo, a lactação, a gestação, os hormônios, a nutrição
e a isquemia (54). Observações da atresia in vitro indicam que o processo é súbito,
com a morte em conjunto de todas as células da granulosa. No início do processo de
degeneração, pode ser possível a ausência de sinais de degeneração dos oócitos e
a viabilidade de algumas células da granulosa em folículos atrésicos, o qual
possibilita a recuperação dos folículos e sugerem a retomada da ovulação (48).
Este procedimento faz com que os folículos ovarianos não
apresentem uma prevalência homogênea em todos os estágios de desenvolvimento
folicular (37), sendo a predominância em folículos em estágio antral (41). Embora seja
um fenômeno natural, independente da fase que ocorra, o processo de atresia
encurta de maneira significativa o número de oócitos viáveis durante a vida
reprodutiva do animal.
A atresia ocorre por duas vias, a via degenerativa (70; 85) e/ou pela
via apoptótica (31; 70). Uma das principais causas da morte celular por degeneração é
a isquemia (28). Isto ocorre pela diminuição da síntese de ATP que afeta o
funcionando da bomba Na+/K+ localizada na membrana basal. Com a evolução do
30
processo degenerativo, a morte celular é identificada histologicamente como necrose
(7).
Durante a década de 80, a atresia foi postulada por um processo de
morte celular programada caracterizada por apoptose (110). Após alguns estudos,
evidencias demonstraram que a apoptose celular consiste no principal mecanismo
bioquímico responsável pela atresia (69). Os tecidos que sofrem alterações no
desenvolvimento ou respostas aos estímulos fisiológicos ocorrem por um processo
ativo encontrado em todos os organismos multicelulares, decorrentes da morte
celular. A principal modificação ressaltada na atresia é a condensação da cromatina
do núcleo (102).
Durante o processo de atresia, muitas características morfológicas
decorrente da apoptose são observadas em oócitos e células da granulosa. Nos
folículos pré-antrais, as primeiras alterações que indicam atresia acontecem no
oócito, assim como a retração da cromatina nuclear e a fragmentação oocitária (77).
As alterações das células da granulosa presentes nestes folículos são encontradas
raramente. Ao se desenvolver, o oócito do folículo se encontra altamente resistente,
no qual alterações indicativas de atresia são primeiramente observadas nas células
da granulosa (102).
O desenvolvimento da apoptose folicular é dependente de uma
regulação conjunta de diferentes fatores autócrinos, endócrinos e parácrinos. Ainda,
pelo balanço entre os fatores que possibilitam a sobrevivência ou aqueles que
induzem a apoptose o folículo ovariano será direcionado a um destes destinos,
continuar o desenvolvimento ou sofrer atresia (49).
As ferramentas importantes na identificação da qualidade folicular
consistem as técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de
31
transmissão. Na análise da histologia clássica, as alterações que indicam atresia dos
folículos pré-antrais sobrevêm primeiramente no oócito, pela picnose nuclear como
primeiro sinal de degeneração (117). Nas características ultra estruturais, os oócitos
inclusos em folículos primordiais degenerados têm um aumento progressivo de
vacúolos citoplasmáticos e retração oocitária, eventos que antecedem as alterações
nas células da granulosa. Além disso, as células da granulosa tornam-se túrgidas e
diminuem o número de organelas do citoplasma (105), enquanto que nos folículos
antrais, as alterações são a picnose nuclear e a vacuolização citoplasmática
acontecem primeiramente nas células da granulosa (47). Posteriormente, ocorre o
surgimento de degeneração nas células tecais (80) e, por fim, no oócito (47).
2.8 Biotecnologias utilizadas no auxílio da compreensão e estudo da foliculogênese
A ampliação e utilização das biotécnicas aplicadas à reprodução
animal são condições imprescindíveis para o aumento da eficiência reprodutiva e
produtiva, sendo uma ferramenta de grande impacto na indústria pecuária (113; 3).
Atualmente, o crescimento produtivo da pecuária tem requerido novos
conhecimentos técnicos e científicos para desenvolvimento de novas tecnologias.
Avanços tecnológicos dirigidos aos diversos segmentos repercutem no aumento da
produção animal, sendo que as biotecnologias reprodutivas têm uma atuação
específica na obtenção de animais de qualidade elevada em um maior número de
descendentes (64).
As biotecnologias da reprodução surgiram em razão aos
conhecimentos dos mecanismos envolvidos no controle da fisiologia reprodutiva,
desde os níveis molecular, celular e endócrino (78). O progresso da biotecnologia
32
iniciou quando Watson e Crick estudaram o modelo de dupla hélice do DNA em
1953 (113). A utilização de biotécnicas aplicadas com sucesso na reprodução animal
consiste de tecnologias como, inseminação artificial, fecundação in vitro e a
transferência de embriões (93). Outras tecnologias reprodutivas também são
passíveis de serem aplicadas em grande escala como a clonagem e a manipulação
de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA, 64).
Como já mencionado anteriormente, a atresia folicular pode ocorrer
por duas vias, a degenerativa e/ou apoptótica (72). Ao considerar que uma mínima
parcela dos folículos se desenvolve até o processo de ovulação, criou-se uma
biotécnica de manipulação oocitária, conhecida de MOIFOPA, a qual recupera os
oócitos inclusos nos folículos e os cultiva in vitro até sua maturação completa. (23; 64).
A MOIFOPA consiste na biotécnica de isolamento ou resgate de
folículos pré-antrais a partir de ovários; na conservação para estocagem por curto
(resfriamento) ou por longo período (congelação); e no cultivo folicular com a
finalidade de desenvolver o crescimento, maturação e fecundação in vitro dos
oócitos previamente inclusos em FOPA (29; 64).
O principal intuito dessa biotecnologia é a recuperação de um maior
número de oócitos inclusos nos folículos, para assim cultivá-los in vitro ate seu
desenvolvimento completo, evitando a atresia folicular (72). Portanto, a aplicação da
MOIFOPA para a produção in vitro proporcionaria a utilização de oócitos maduros de
animais com alto valor agregado, e ainda, aqueles em processo de extinção, em
grandes escala. Ainda, contribuiria para a padronização das biotecnologias como
fertilização in vitro, transgenia e a clonagem através da utilização de oócitos
originados pela técnica MOIFOPA (34; 64).
33
2.9 Cultivo in vitro de folículos pré-antrais
Vários sistemas de cultivo foram desenvolvidos nas últimas duas
décadas, e os resultados variam de acordo com o tipo de meio, sistema de cultivo
utilizado e principalmente da espécie estudada (40). Entretanto, o sistema de cultivo
eficiente, o qual promova o desenvolvimento completo dos folículos pré-antrais em
animais de produção, não está estabelecido (29; 34). Os sistemas de cultivo
rotineiramente adotados são o cultivo de folículos pré-antrais inclusos no próprio
tecido ovariano (cultivo in vitro in situ) ou na forma isolada (cultivo in vitro isolado; 46).
Além disso, esses dois tipos de cultivo podem ser combinados, realizando
primeiramente os procedimentos do cultivo in situ, para obtenção de um maior
número de folículos pré-antrais em desenvolvimento, e posteriormente, os folículos
seriam isolados e cultivados (107).
O objetivo do sistema de cultivo in situ consiste no estudo da
ativação folicular, assim como, no crescimento dos folículos primários (101). Além de
ser um método fácil para cultivar os folículos o cultivo de fragmentos do córtex
ovariano tem a vantagem de manter o contato celular e a integridade tridimensional
dos folículos (1). Enquanto que o sistema de cultivo isolado necessita de métodos
para isolar os folículos presentes no córtex ovariano. Os métodos desenvolvidos
para o isolamento dos folículos ovarianos são o isolamento mecânico e/ou
enzimático. Os folículos isolados podem ser cultivados em um sistema bidimensional
ou tridimensional, no primeiro os folículos são colocados diretamente sob a placa de
cultivo ou uma matriz extracelular, enquanto que o segundo consiste no sistema em
que os folículos são totalmente inclusos em uma matriz, capaz de manter a
arquitetura original do folículo ovariano (34).
34
No âmbito da pesquisa aplicada, o emprego de folículos ovarianos
pré-antrais para cultivo in vitro e criopreservação utiliza métodos enzimáticos ou
mecânicos. De acordo com registros o primeiro estudo de FOPA isolados ocorreu
em 1964 em animais de laboratório (camundongo), enquanto Figueiredo et al. (34)
utilizaram a técnica em bovinos. Os estudos empregaram metodologias enzimáticas
e mecânicas na década de 60 e 90, respectivamente (34). Existem diversos estudos
realizados com finalidade de originar in vitro o crescimento de folículos pré-antrais
em diferentes espécies (camundongos: 23; ratas: 16; suínos: 118; bovinos: 44; ovinos:
17; caprinos: 50; felinos: 57 e humanos: 89).
O desenvolvimento de condições in vitro para promover o
desempenho folicular e o estudo da foliculogênese sob as circunstâncias in vitro
pode ser essencial para diminuir a atresia folicular geralmente ocorrida in vivo (2; 4).
Os meios de cultivo, geralmente, tendem a impedir a atresia folicular, através da
inclusão de diversas substâncias, como: uma fonte de proteína, antibióticos,
antimicóticos, transferência de selênio, piruvato, glutamina e ocasionalmente um ou
mais fatores de crescimento como fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-
1), fator de crescimento epidérmico (EGF), activina-A, factor de diferenciação de
crescimento- 9 (GDF-9), e fator de crescimento de fibroblastos (FGF-2), hormônios,
como: insulina, hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio de crescimento
hormônio estimulante da tiroide (TSH) e tiroxina) e/ou esteroides (tal como o
estradiol, testosterona ou androstenediona (85; 3; 62).
Vários componentes endócrinos e produzidos localmente podem
estimular a inervação ou a neovascularização dos pequenos folículos, o que
possibilita a chegada de nutrientes, citocinas, hormônios e outras substâncias in vivo
(38). Ao que tudo indica, a presença destas sustâncias são necessárias para o
35
crescimento e sobrevivência folicular. Os fatores que atuam no desenvolvimento de
FOPA em ruminantes ainda são incompreendidos em sua totalidade. Segundo
Williams (116), os estudos realizados in vitro demonstram que diversos fatores
interferem no crescimento dos folículos com a atuação independente destes fatores
que estão envolvidos no desenvolvimento folicular (29; 4).
Buscando identificar os fatores que controlam a foliculogênese,
assim como, promover o crescimento e a maturação oocitária junto à multiplicação e
diferenciação das células da granulosa tem se desenvolvido diferentes técnicas de
cultivo. Em animais de laboratório, a pequena dimensão dos ovários permite o
cultivo do órgão na íntegra, o que serviu para o estudo inicial da foliculogênese em
pequenos mamíferos (40; 29).
O sucesso da ativação de folículos primordiais in vitro possibilitou a
utilização deste modelo por diversos grupos de pesquisadores. Entretanto, em
animais de médios e de grande porte, não é possível a utilização desta técnica em
consequência ao dimensionamento dos ovários, deste modo é necessário utilizar
fragmentos do tecido ovariano (29; 62). Assim, a técnica de cultivo se realiza através
de pequenos fragmentos do córtex ovariano, ricos em folículos primordiais, tem sido
ferramenta para o estudo do crescimento e ativação dos folículos primários em
bovinos (11; 29).
Wandji et al. (114), evidenciaram altas taxas (94%) de sobrevivência e
início do crescimento in vitro de folículos primordiais bovinos em meio de cultivo sem
soro, com a utilização de fragmentos do córtex ovariano superficial de fetos. No
cultivo in vitro o tipo de meio usado exerce grande influência na taxa de
sobrevivência e no crescimento de folículos em mamíferos (3). Neste modelo de
cultivo in vitro foi possível observar um grande número de folículos pré-antrais
36
evoluídos para o estágio de folículo primário, mantendo-se viável por 20 dias de
cultivo, entretanto, poucos progridem para folículo secundário (34).
O cultivo individual e isolado pode ser realizado em folículos
primários e secundários, este, por sua vez, é um método mecânico que foi
desenvolvido para isolar um maior número de folículos intactos de ovários, como
realizado por Figueiredo et al. (32) em bovinos (29). Após o isolamento, os folículos
podem ser cultivados, na sua forma intacta, para estudos sob a interferência in vitro
de fatores de crescimento e hormônios, sendo possível a avaliação do
desenvolvimento e da interação com as células foliculares (100; 29).
Esta é uma biotécnica de alta significância tanto para pesquisa
básica e fundamental como para a reprodução animal. A contribuição para a
pesquisa consiste na elucidação dos mecanismos presentes na fase pré-antral da
foliculogênese (64; 93). Os folículos ovarianos pré-antrais isolados do ambiente
natural, com interferências endócrinas, nutricionais e sanitárias semelhante ao
organismo, com a presença de substâncias conhecidas (matriz extracelular,
hormônios, fatores de crescimento, aminoácidos, carboidratos, etc.) poderão ser
utilizados para cultivos in vitro (34).
Assim, várias investigações no âmbito MOIFOPA contribuíram para
o cultivo in vitro mostrando que durante o controle do desenvolvimento folicular os
hormônios, fatores de crescimento e peptídeios estão envolvidos (85; 93). Entre esses
podem-se destacar: o fator de crescimento epidermal (EGF), o hormônio folículo
estimulante, o fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF- 9), o kit ligand (KL), as
proteínas morfogenéticas ósseas 4, 7 e 15 (BMPs 4, 7 e 15), o fator de crescimento
endotélio vascular (VEGF), o fator de crescimento fibroblástico (FGF), o fator de
37
crescimento de queratinócitos (KGF), a ativina e peptídeo intestinal vasoativo (VIP),
e os fatores de crescimento semelhantes à insulina 1 e 2 (IGFs 1 e 2) (29).
Devido a algumas dificuldades vinculadas ao cultivo in vitro de
folículos pré-antrais isolados ou até in situ, o congelamento de fragmentos ovarianos
possibilitaria a conservação até que os protocolos empregados para o cultivo fossem
desenvolvidos (29).
3.0 Importância da composição do meio de cultivo sobre o desenvolvimento folicular
in vitro
Um fator essencial para a obtenção de sucesso durante o cultivo in
vitro de folículos pré-antrais é a composição do meio. Segundo estudos, a
composição do meio de cultivo com a ausência de hipoxantina e outros substrados
energéticos, como glutamina e piruvato, mostraram que a sobrevivência dos folículos
pré-antrais de bovinos foi reduzida (33). Deste modo, o tipo de meio utilizado no
cultivo in vitro possui grande influência na sobrevivência e no crescimento folicular.
O Meio Essencial Mínimo (MEM) é utilizado tanto para o cultivo de
tecido ovariano bovino quanto de folículos pré-antrais isolados (99; 72; 88). No entanto,
quando os folículos ovarianos são cultivados in vitro, são expostos a grande estresse
oxidativo em consequência à exposição à luz, às elevadas concentrações de
oxigênio e às concentrações variáveis de substratos metabólicos. A adição de um
fator de crescimento ao meio de cultivo pode ser a chave para proteger os folículos
do estresse oxidativo durante a ativação e o desenvolvimento in vitro (85).
Em um estudo utilizando folículos ovarianos pré-antrais utilizou-se
um meio de cultivo base, chamado de controle (MEM), com a adição de piruvato
38
(0,23 mM), glutamina (2 mM), hipoxantina, suplementado com antibióticos, tais como
penicilina - 20 UI/mL e estreptomicina – 200 µg/mL e ITS (insulina – 6,25 µg/mL,
transferina – 6,25 ng/mL e selênio – 6,25 ng/mL), significativamente aumentou a
porcentagem de folículos morfologicamente normais de 29,4% (meio controle) para
78,0% (meio tratado) (33).
É conhecido que os folículos podem ser influenciados em potencial
pelos fatores de crescimento produzidos pelas células do estroma e por outros
folículos, ou fatores produzidos dentro dos próprios folículos, fatores de crescimento
e hormônios (40). Deste modo, diversos estudos são realizados no intuito de
investigar o efeito de vários componentes do cultivo in vitro de folículos pré-antrais,
Algumas substâncias estão sendo altamente empregadas como FSH, EGF, FGF,
ativina, insulina e outros fatores de crescimento.
3.1 Importância do FSH no desenvolvimento folicular
Os mecanismos envolvidos na regulação do início da foliculogênese
são pouco esclarecidos. No entanto, existem hipóteses que descrevem os fatores de
crescimento e o FSH atuando sobre a ativação folicular (10). Ao que tudo indica, o
FSH está envolvido na proliferação e diferenciação das células da granulosa in vitro.
Aparentemente, para o desenvolvimento de pequenos folículos são necessários
níveis basais de FSH (111).
Diferentes estudos vêm mostrando que a utilização do FSH in vitro
inibe a apoptose e proporciona o crescimento folicular inicial. Em camundongas, a
presença de FSH inibiu a apoptose de folículos pré-antrais cultivados in vitro (5).
39
Contudo, o FSH parece necessário durante o cultivo in vitro devido ao seu papel
importante na foliculogênese inicial de animais mamíferos (2).
O FSH parece apresentar um efeito indireto sob o desenvolvimento
dos folículos ovarianos, induzindo a produção de fatores de crescimentos envolvidos
no desenvolvimento folicular (59; 2). Além disso, alguns autores descrevem que o
FSH age na regulação da expressão de vários fatores de crescimento, tais como
BMP-15, KL e GDF-9, os quais apresentam um papel importante na ativação, e,
crescimento folicular (59; 108; 71; 112).
Embora isto ocorra, a utilização do FSH in vitro provou promover a
formação de antro no cultivo de folículos secundários avançados (ovelhas: 17; vacas:
44; cabras: 119), e a mantença do nível de mRNA e receptor de FSH (95). Apesar da
grande relevância relatada pelos estudos realizados com FSH in vitro, não existe
relatos a respeito dos efeitos diretos ou indiretos durante o cultivo in vitro de folículos
pré-antrais em curto prazo (2).
40
3 HIPÓTESE
O Hormônio Folículo Estimulante (FSH) contribui na ativação e
crescimento dos folículos pré-antrais (FOPA) bovinos, bem como, na manutenção da
viabilidade folicular.
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
O principal objetivo desta proposta é avaliar o efeito da adição do
hormônio gonadotrófico FSH no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais de
fêmeas Bos indicus.
4.2 Objetivos Específicos
o Estabelecer a melhor concentração de FSH no meio de cultivo (50, 100
e 200 ng/mL), tendo como parâmetros a viabilidade, ativação e
crescimento dos folículos pré-antrais bovinos;
o Avaliar o desenvolvimento folicular no cultivo in vitro com FSH através
da análise histológica com coloração de Ácido Periódico de Schiff (PAS)
e Hematoxilina.
41
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Coleta e transporte dos ovários
Os ovários (n= 10) foram coletados de abatedouro local, a partir de
cinco fêmeas adultas Bos indicus (Nelore) cíclicas, em boa condição corporal
(Escore corporal entre 2,5 e 3,5, escala de 1 a 5; 66). Após a obtenção, os ovários
foram lavados em etanol 70% e solução tampão (PBS). O par de ovários foi
processado e fragmentado ainda no frigorífico, e posteriormente transportados para
o laboratório. O transporte foi realizado com tempo máximo de 30 minutos, em meio
essencial mínimo (MEM) suplementado com 200 mg/mL de penicilina e 200 mg/mL
de estreptomicina, a temperatura de 20ºC.
5.2 Protocolo Experimental
No frigorífico, o par de ovários de cada animal foi processado junto,
após retirada do tecido circundante e dos ligamentos dos ovários. Posteriormente, o
córtex do ovário foi dividido em fragmentos de aproximadamente 3X3X1 mm. Para
cada animal, um fragmento foi selecionado aleatoriamente e imediatamente fixado
em Bouin (tratamento controle não-cultivado, D0). Os fragmentos remanescentes
(n=10) do córtex ovariano foram transportados até o laboratório e cultivados
individualmente nos diferentes tratamentos em aliquotas de 1 mL de meio de cultivo
em placas de cultivo de 24 poços em estufa a 38,5ºC, numa atmosfera de 5 % de
CO2 em ar e umidade saturada. O meio de cultivo controle constituiu de meio
essencial mínimo (MEM, Gibco BRL, Rockville, MD, USA; osmolaridade 300
42
mOsm/L, pH 7,2) suplementado (MEM+) com ITS (6,25 µg/mL insulina, 6,25 mg/mL
transferrina, e 6,25 ng/mL selênio), 0,23 mM de piruvato, 2 mM glutamina, 2 mM
hipoxantina, 1,25 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA Gibco BRL, Rockville, MD,
USA), 20 UI/mL de penicilina e 200 mg/mL de estreptomicina. Para os tratamentos, o
meio MEM+ foi suplementado com diferentes concentrações (50, 100 ou 200 ng/mL)
de FSH (Folltropin®, Bioniche Canadá Inc, Ontário, Canadá; Figura 7). Dez
fragmentos do córtex ovariano foram cultivados nos meios testado por dois (D2) ou
seis (D6) dias. A cada intervalo de dois dias, o meio de cultivo foi substituído por
meio fresco.
Figura 7. Protocolo experimental para o cultivo in vitro de folículos pré-antrais bovinos in situ com diferentes concentrações do Hormônio Folículo Estimulante (FSH).
5.3 Histologia Clássica
Para a análise da morfologia dos folículos ovarianos, os fragmentos
do córtex ovariano (controle não cultivado e cultivados durante dois ou seis dias de
cultivo in vitro) foram fixados por imersão em Bouin durante 24 horas e após este
43
período, mantidos em álcool 70%. Após a fixação, os tecidos foram desidratados
numa série graduada de soluções crescente de etanol, clarificados e diafanizados
em xilol, embebidos em parafina para posterior confecção de cortes histológicos.
Subsequentemente, cada fragmento foi seccionado a 5 µm em micrótomo rotativo
(Leica®, Wetzlar-Alemanha), com intervalo de 5 secções para montagem das
lâminas de microscopia de luz para evitar a contagem do mesmo folículo. As lâminas
foram coradas com Ácido Periódico de Schiff (PAS) e Hematoxilina. A leitura das
lâminas foi realizada por um único avaliador.
5.4 Classificação Folicular
Todas as secções foram examinadas usando microscopia de luz
(10x e 40x; Nikon®, Tokio - Japão). Os folículos foram classificados em primordial
(contendo uma camada de células somáticas, conhecidas como células da
granulosa, planas ou achatadas ao redor do oócito); ou em desenvolvimento, como
primário (uma única camada de células da granulosa cuboides em torno do oócito), e
secundário (duas ou mais camadas de células granulosas cuboides) (51). Para
avaliar a ativação e crescimento folicular foi realizada a quantificação dos folículos
nas diferentes fases do desenvolvimento (primordiais, primários e secundários) no
controle e após o cultivo in vitro nos diferentes tratamentos.
Os folículos também foram classificados de acordo com a viabilidade
segundo a morfologia em normais, o oócito com um núcleo não picnótico e cercado
por células da granulosa organizadas em camadas discretas, ou degenerado,
quando o oócito encontrava-se retraído com núcleo picnótico e cercado por células
da granulosa desorganizadas isoladas a partir da membrana basal (109). Ao avaliar
44
as taxas de crescimento e ativação folicular, apenas os folículos normais foram
considerados, e as porcentagens de folículos primordiais, primários e secundários
foram calculadas no D0 (tratamento controle), D2 e D6 nas diversas concentrações
do meio de cultivo. Para evitar a contagem do mesmo folículo duas vezes, os
folículos pré-antrais foram contados apenas no campo visual em que o núcleo do
oócito fora observado. Foram avaliados 50 folículos pré-antrais por repetição,
totalizando 250 folículos por tratamento.
5.5 Análise Estatística
Os dados foram inicialmente submetidos aos testes de normalidade
de resíduos (Shapiro-Wilk) e homogeneidade de variância (Bartlett) para se
determinar, caso necessário, a transformação Box-Cox das variáveis analisadas. O
número médio de folículos pré-antrais morfologicamente normais, de folículos
primordiais e em crescimento obtidos nas amostras controle e expostas a diferentes
tratamentos de FSH cultivadas por 2 ou 6 dias, respectivamente, após
transformação box-cox foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey (p≤0,05).
Dentro da mesma concentração, o número médio de folículos pré-antrais de
morfologia normal das amostras cultivadas por dois ou seis dias de cultivo,
respectivamente, foram analisados através do Teste T-Student. Todas as análises
foram realizadas com o software Action 2.3 (Campinas, SP, Brasil) e os valores
considerados estatisticamente significantes quando p≤0,05.
45
6 RESULTADOS
Durante o experimento, foram avaliados no total 2250 folículos pré-
antrais, dos quais 772 folículos primordiais e 1478 folículos em desenvolvimento,
entre normais e degenerados (Figura 8).
Figura 8 - Fotomicrografia de cortes histológicos de ovário de bovino Bos indicus cultivados in vitro, corado com PAS e Hematoxilina, 400x. A – Folículo Primordial (seta); B – Folículo Primário (seta); C –Folículo Primário degenerado (seta); D – Folículos Primários; E – Folículo Secundário; F – Folículo Primordial degenerado (seta).
46
O tecido ovariano cortical não cultivado (controle – D0) continha
predominantemente folículos pré-antrais nos estágios primordiais e alguns primários
e raramente folículos secundários, sendo 161 (64,4%) folículos primordiais normais e
17 (6,8%) folículos em desenvolvimento. Os percentuais de folículos primordiais e
em desenvolvimento viáveis presente no tecido cortical ovariano cultivado in vitro
aos dois e seis dias de cultivo com a presença ou ausência de FSH estão
representados na tabela 1.
Tabela 1 - Porcentagem média de folículos viáveis de fêmeas Bos indicus em estágio inicial de desenvolvimento (primordial, primário + secundário), em tecido ovariano não-cultivado (controle, dia 0) e após cultivo in vitro de dois ou seis dias em MEM+ ou MEM+ suplementado com diferentes concentrações de FSH.
Folículos Primordiais Viáveis
(%)
Folículos em Desenvolvimento
Viáveis
(%)
Tratamentos
(ng/mL)
D2 D6 D2 D6
Controle (D0) 64,4* 6,8*
MEM+ 6,8ª,B 4,4ª,C 20,4b,A 16,4b,A
50 FSH 8,8ª,AB 4,8ª,B 21,6b,A 24b,A
100 FSH 6,4ª,B 8ª,B 44,8ª,A 32,4ª,A
200 FSH 6,8ª,B 6ª,B 38,4ª,A 30,8ª,A
a,b Diferença significativa entre coluna (p≤0,05).
A,B Diferença significativa entre linhas (p≤0,05).
* Diferença significativa entre o grupo controle (p≤0,05).
Aos dois dias de cultivo, a proporção de folículos primordiais foi
reduzida em todos os tratamentos testados, em consequência, ocorreu um aumento
na proporção de folículos em desenvolvimento. Com o aumento no tempo de cultivo
(D2 e D6), ocorreu uma redução progressiva na proporção de folículos primordiais e
correspondente aumento nos folículos em desenvolvimento durante todos os
tratamentos comparado a D0 (p≤0,05; Tabela 1). O percentual de folículos primários
e secundários em D0 foram 6% e 0,8%, respectivamente.
As porcentagens médias de folículos primordiais viáveis em D2 e D6
não tiveram diferenças significativas entre os tratamentos com ou sem a presença
47
de FSH (p≤0,05). Enquanto que para os folículos em desenvolvimento em D2 as
porcentagens médias foram semelhantes estatisticamente entre MEM+ e 50 ng/ML
de FSH e entre 100 e 200ng/mL de FSH, e diferente entre os tratamentos de MEM+ e
50 ng/mL com 100 e 200 ng/mL de FSH (p≤0,05). O mesmo ocorreu com os folículos
em desenvolvimento em D6 (p≤0,05; Tabela 1).
Quando comparado com o MEM+, os folículos viáveis em meio
suplementado com 50 ng/mL, 100 ng/mL e 200 ng/mL de FSH foi possível observar
que não houve diferenças significativas entre os dias de cultivo, sugerindo uma
manutenção da viabilidade entre dois e seis dias de cultivo (p≤0,05; Figura 9).
Figura 9 – Comparação entre cada tratamento aos dois e seis dias de cultivo in vitro em MEM+ ou MEM+ suplementado com diferentes concentrações de FSH de folículos ovarianos (primordial, primário e secundário) viáveis de fêmeas Bos indicus. a,b
Diferença significativa entre os dias de cultivo(D2 e D6) (p≤0,05). A,B
Diferença significativa entre os tratamentos (p≤0,05). * Diferença significativa entre o grupo controle (p≤0,05).
Ainda comparando-se as diferentes concentrações de FSH com o
MEM+, observou-se uma maior sobrevivência de folículos viáveis em meio contendo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle MEM 50 100 200
% F
OLÍ
CU
LOS
VIÁ
VEI
S
D0 D2 D6
*
a
b
a a
a
a
a
a
A AB
ABC ABC ABC BC BC
C
48
100 ng/mL de FSH aos dois dias de cultivo apresentado aproximadamente 50% dos
folículos viáveis, no entanto, aos seis dias de cultivo a concentração de 100 ng/mL
com 40 % de folículos viáveis foi semelhantes aos demais tratamentos (p≤0,05;
Figura 9).
Para a figura 10, exceto a concentração de 100 ng/mL de FSH aos
dois dias de cultivo, manteve-se as porcentagens semelhantes entre as
concentrações de 50 e 200 ng/mL de FSH quando comparadas ao controle cultivado
(MEM) em D2 e 50, 100 e 200 ng/mL em D6 (p≤0,05).
Figura 10 – Porcentagem média de folículos em desenvolvimento (primário + secundário) viáveis de fêmeas Bos indicus, após cultivo in vitro de dois ou seis dias em MEM+ ou MEM+ suplementado com diferentes concentrações de FSH. A,B
Diferença significativa entre os tratamentos (p≤0,05).
Também avaliou-se a integridade folicular, considerando-se
características morfológicas (Figura 8). As concentrações de FSH que
proporcionaram a manutenção mais adequada da integridade dos folículos foram as
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
MEM 50 100 200
% F
olí
culo
s em
Des
en
volv
imen
to
D2
D6ABC
C
ABC AB
A
BC BC BC
49
de 100 ng/mL e 200 ng/mL quando comparado entre os tratamentos, sendo que o
número de folículos em desenvolvimento foi semelhante dentre estas concentrações
de FSH, em consequência, obtiveram uma menor taxa de degeneração (p≤0,05;
Figura 10).
50
7 DISCUSSÃO
No presente estudo, foi possível observar uma modificação na
proporção de folículos primordiais e em desenvolvimento, sugerindo a ocorrência de
ativação folicular durante o cultivo in vitro de Bos indicus. As concentrações de 100
ng/mL e 200 ng/mL de FSH foram as que apresentaram melhores condições para o
desenvolvimento folicular, a manutenção da viabilidade e integridade folicular,
considerando dois ou seis dias de cultivo.
O desenvolvimento e a transição de folículos pré-antrais in vivo
ocorre com folículos primordiais presentes na reserva ovariana. Estes folículos são
ativados e iniciam as divisões celulares originando folículos primários e
posteriormente o desenvolvimento para secundário. Este último é caracterizado pela
transformação no formato das células da granulosa de achatadas para cuboides (22;
98). Com a adição do FSH ao meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais, foi
possível observar um desenvolvimento dos folículos ovarianos dos estágios
primordiais para primordiais e secundários.
Apesar de haver sido relatado que somente folículos secundários
são sensíveis ao FSH após seis dias de cultivo em roedores (18), ou mesmo que o
acréscimo de FSH sem associação não é eficiente no cultivo in vitro de folículos
ovarianos pré-antrais isolados de catetos, caprinos e ovinos (85; 63), nossos
resultados sugerem uma ação do FSH em estágios iniciais dos folículos ovarianos
bovinos, tal como relatado por Alves et al. (2) para a espécie caprina. No entanto,
para caprinos, a concentração de FSH que promoveu ativação folicular e o
crescimento de folículos pré-antrais foi de 50ng/mL nas mesmas condições de
cultivo que o presente estudo (71), enquanto para bovinos encontramos um intervalo
51
entre 100 e 200 ng/mL de FSH. Isto pode ser justificado pelas diferenças existentes
entre as espécies e o desenvolvimento folicular, sob as mesmas condições de
cultivo in situ (87).
Outros trabalhos também mostraram a importância do FSH em
estágios iniciais do desenvolvimento folicular, associado ou não a fatores de
crescimento (37; 11; 19; 20; 112). A controvérsia entre os trabalhos quanto ao FSH sugere
importantes variações fisiológicas conforme a espécie estudada e as condições de
cultivo in vitro.
Considerando somente o período de dois dias de cultivo, a
concentração de 100 ng/mL de FSH apresentou uma melhor taxa de
desenvolvimento, enquanto, as demais concentrações de FSH (MEM, 50 ou 200
ng/mL) testadas neste trabalho apresentaram resultados estatisticamente
semelhantes. Desta forma, constatamos que a concentração inicial de 100 ng/mL até
dois dias de cultivo foi possível obter efeitos benéficos do FSH, pois em comparação
com o controle não cultivado foi o grupo em que houve uma maior proporção de
folículos primários e secundários.
Já após seis dias de cultivo, foi possível obter resultados
semelhantes entre as concentrações de 100 e 200 ng/mL de FSH, pois
apresentaram um maior número de folículos em desenvolvimento comparado às
outras concentrações de FSH. Isto reforça a possibilidade de se aumentar a
concentração de FSH necessária para proporcionar o desenvolvimento eficiente ao
decorrer os dias de cultivo. Nos demais tratamentos (MEM+ ou 50 ng/mL),
constataram-se menor eficiência para que o sistema de cultivo pudesse promover a
transição de folículos primordiais para primários e depois secundários.
52
Consideramos que as concentrações menores que 100 ng/mL foram insuficientes
para promover a estimulação do crescimento e diferenciação das células foliculares.
Corroborando tais considerações, Roy e Albee (89) mostraram que a
presença de FSH é essencial para a diferenciação de células somáticas das células
da granulosa durante o início do desenvolvimento dos folículos primordiais. Além
disso, a expressão do receptor de FSH foi relatada durante a transição de folículos
primários e posteriormente para folículo secundário (81). No mesmo contexto, foi
descrita a presença de receptores de FSH em folículos primordiais (75) e, mais
recentemente, demonstrou-se que o FSH pode influenciar na diferenciação e
proliferação das células da granulosa in vitro (112).
Adicionalmente, o FSH possivelmente desempenha um efeito
indireto sob o desenvolvimento em folículos primordiais através de fatores liberados
por folículos maiores ou as células do estroma ovariano (71). Ainda, estudos
demonstraram que após seis e 12 dias de cultivo in vitro o aumento na
suplementação de FSH (entre 100 e 1000 ng/mL) para o meio de cultivo mantém o
nível de mRNA e receptor semelhante em folículos pré-antrais caprinos (95).
O mecanismo exato pelo qual o FSH atua nas células foliculares
ainda é pouco conhecido, considerando-se viável uma estimulação do crescimento
celular pela influência indireta nos locais de interações das células mesenquimais,
presentes no epitélio do ovário (79). Neste contexto, nosso modelo de cultivo – in situ
– apresenta condições mais interessantes do que o cultivo isolado de folículos, no
qual não há esta interação entre as células foliculares e as do estroma ovariano.
Apesar dos consistentes avanços quanto aos efeitos benéficos do
FSH, é importante considerar a ação dos demais constituintes do meio de cultivo, os
quais podem exercer ação sinérgica com esta gonadotrofina. Diversos substratos
53
são utilizados na suplementação do meio de cultivo, como o piruvato, a hipoxantina,
a glutamina, insulina-transferrina-selênio (ITS), a albumina sérica bovina e outros.
Os meios utilizados para o cultivo in vitro são composto ricos em oxigênio, nutrientes
e outros elementos presentes no córtex ovariano (88) e todo este conjunto precisa
ser considerado para uma correta compreensão da fisiologia folicular.
Contudo, é essencial a utilização de meios de cultivo suplementados
com as substâncias que promovam uma ação sinérgica ao crescimento folicular,
neste caso, acrescido inicialmente de 100 ng/mL de FSH conforme este estudo.
Indicamos ainda que a partir de seis dias de cultivo possivelmente seja necessário
aumentar a concentração de FSH acrescentada ao meio de cultivo.
54
CONCLUSÃO
Pode-se concluir que houve um acréscimo na proporção de folículos
primários e secundários, em comparação aos primordiais, após dois e seis dias de
cultivo in vitro de folículos pré-antrais de fêmeas Bos indicus. A adição do FSH ao
meio de cultivo MEM manteve a sobrevivência e permitiu a viabilidade dos folículos
cultivados, sendo que a concentração de 100 ng/mL de FSH foi a que apresentou
uma melhor eficiência em proporcionar o desenvolvimento folicular, como também,
manteve a viabilidade folicular durante os dois dias de cultivo. Aos seis dias de
cultivo as concentrações de 100 e 200 ng/mL de FSH possibilitaram uma maior
proporção de folículos pré-antrais viáveis e um menor taxa de degeneração.
Contudo, as perspectivas deste trabalho foram possibilitar estudos
complementares visando à utilização desta substância sobre o desenvolvimento in
vitro de folículos pré-antrais isolados em estádios iniciais ou tardios. Além disso, são
grandes as possibilidades de se estudar a influência de tais substâncias sobre a
expressão de outras que estejam envolvidas no controle do desenvolvimento
folicular. Para assim, promover um sistema de cultura capaz de desenvolver folículos
primordiais de uma fase inicial até os estágios foliculares em que os oócitos podem
ser maturados e fecundados in vitro.
55
REFERÊNCIAS
(1) Abir R, Nitke S, Bem-Haroush A, Fisch B. In vitro maturation of human
primordial ovarian follicles: clinical significance, progress in mammals, and
methods for growth evaliation. Histol Histopathol. 2006, 26: 887-898.
(2) Alves AM, Chaves RN, Rocha RM, Lima LF, Andrade PM, Lopes CA, Souza
CE, Moura AA, Campello CC, Báo SN, Smitz J, Figueiredo JR. Dynamic
medium containing growth differentiation factor-9 and FSH maintains survival
and promotes in vitro growth of caprine prentral follicles after long-term in vitro
culture. Reprod. Fertil. Dev. 2013, 25(6): 955–965.
(3) Andrade ER, Marcondes Seneda M, Alfieri AA, Frederico Rodrigues Loureiro
Bracarense AP, Figueiredo JR. Interactions of indole acetic acid with EGF and
FSH in the culture of ovine preantral follicles. Theriogenology, 2012, 64: 1104–
1113.
(4) Araújo VR, Gastal MO, Figueiredo JR, Gastal EL. In vitro culture of bovine
preantal follicles: a review. Reproductive Biol Endoc, 2014, 12: 78.
(5) Baker SJ, Spears N. Follicle stimulating hormone inhibits apoptosis in pre- and
early-antral murine follicles in vitro. J Reprod Fertil Abst Ser, 1997, 19: 21.
(6) Barnett KR, Schilling C, Greenfeld CR, Tomic D, Flaws JA. Ovarian follicle
development and transgenic mouse models. Hum Reprod, 2006, 13: 1–19.
(7) Barros LF, Hermosilla T. Castro J. Necrotic volume increase and the early
physiology of necrosis. Comparative Biochemistry and Physiology, 2001, 130:
401–409.
(8) Beckers JF, Drion P, Figueiredo JR, Goddin L, Pirottin D, Ectors F. The
ovarian follicle in cow: in vivo growth and in vitro culture. Reprod Domestic
Anim, 1996, 31: 543–548.
(9) Bessa IR, Dode MAN. Ovogênese e modificações epigenéticas. Rev Bras
Reprod Anim, 2013, 37(3): 241–248.
(10) Betteridge KJ, Smith C, Stubbings RB, Xu KP, King WA. Potential genetic
improvement of cattle by fertilization of fetal oocytes in vitro. J Reprod Fertil,
1989, 38: 87–98.
(11) Braw-tal R, Yossefi S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle
growth in the bovine ovary. J Reprod Fertil, 1997; 109:165–171.
56
(12) Bristol-gould S, Woodruff TK. Folliculogenesis in the domestic cat (Felis
catus). Theriogenology, 2006, 66: 5–13.
(13) Burns DS, Jimenez-krassel F, Ireland JLH, Knight PG, Ireland JJ. Numbers of
antral follicles during follicular waves in cattle: evidence for high variation
among animals, very high repeatability in individuals, and an inverse
association with serum follicle-stimulating hormone concentrations. Biol
Reprod, 2005, 73: 53–62.
(14) Butler HW. Ultrastructual studies on mitocondrial swelling. J Bioch, 1970, 118:
883–886.
(15) Cahill LP, Mauléon P. Influences of season, cycle and breed on follicular
growth rates in sheep. J Reprod Fertil, 1980, 58: 321–328.
(16) Cain L, Chatterjee S, Collings TJ. In vitro folliculogenesis of rat preantral
follicles. Endoc, 1995, 136: 3369–3377.
(17) Cecconi S, Barboni B, Coccia M, Mattioli M. In vitro development of sheep
preantral follicles. Biol Reprod, 1999, 60: 594–601.
(18) Cortvrindt R, Smitz J, Van Steirteghem AC. Assessment of the need for follicle
stimulating hormone in early preantral mouse follicle culture in vitro. Hum
Reprod, 1997, 12:759–768.
(19) Cushman RA, Wahl CM, Fortune JE. Bovine ovarian cortical pieces grafted to
chick embryonic membranes: a model for studies on the activation of
primordial follicles. Hum Reprod, 2002; 174: 48–54.
(20) Derrar N, Price CA, Sirard M-A. Effects of growth factors and co-culture with
ovarian medulla on the activation of primordial in explants of bovine ovarian
cortex. Theriogenology, 2000, 54:587–598.
(21) Driancourt MA, Webb R, Fry RC. Does follicular dominance occur in ewe? J
Reprod Fertil, 1991, 93: 63–70.
(22) Eppig JJ, O’brien MJ. Development in vitro of mouse oocytes from primordial
follicles. Biol Reprod, 1996, 54: 197–207.
(23) Eppig JJ, Schroeder AC. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to
undergo embryogenesis and development to live young after growth,
maturation, and fertilization in vitro. Biol Reprod, 1989, 41: 268–276.
(24) Erickson BH. Development and Senescence of the Postnatal Bovine Ovary. J
Anim Sci, 1966, 25: 800–805.
57
(25) Erickson GF, Shimasaki S. The spatiotemporal expression pattern of the bone
morphogenetic protein family in rat ovary cell types during the estrous cycle.
Reprod Biol Endoc, 2003, 5:1–9.
(26) Fair T, Hulshof SC, Hyttel P, Greve T, Boland M. Nucleus ultraestructure and
transcriptional activity of bovine oocytes in preantral and early antral follicles.
Mol Reprod Dev, 1997, 46: 817–832.
(27) FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations. Dairy
production and products. 2014. Disponível em:
<http://www.fao.org/agriculture/dairy-gateway/milk-
production/en/#.U7CjraL0Mgc>. Acceso em: 29 fevereiro 2014.
(28) Farber JL. Membrane injury and calcium homeostasis in the pathogenesis of
coagulative necrosis. Lab Invest, 1982, 47: 114–123.
(29) Figueiredo JR, Celestino JJH, Rodrigues APR, Silva JRV. Importância da
biotécnica de MOIFOPA para o estudo da foliculogênese e produção in vitro
de embriões em larga escala. Rev Bras Reprod Anim, 2007, 31(2): 143–152.
(30) Figueiredo JR, Hulshof SC, Van Den Hurk R, Nusgens B, Bevers MM, Ectors
FJ, Beckers JF. Preservation of oocyte and granulosa cell morphology in
bovine preantral follicles cultured in vitro. Theriogenology, 1994, 41: 1333–
1346.
(31) Figueiredo JR, Hulshof SCJ, Beckers JF. Nova Biotecnologia: Isolamento,
Caracterização e Cultura de Folículos Ovarianos Pré-Antrais em Bovinos. In:
Simpósio Nacional de Biotecnologia da Reprodução de mamíferos
Domésticos, 1995, Fortaleza. Anais. Fortaleza: UECE, Curso de Mestrado em
Produção e Reprodução de Pequenos Ruminantes, 1995, 01–11.
(32) Figueiredo JR, Hulshof SCJ, Van Den Hurk R, Ectors FJ, Fontes RS, Nusgens
B, Bevers MM, Beckers JF. Development of a combined new mechanical and
enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf
and adult bovine ovaries. Theriogenology, 1993, 40: 789–799.
(33) Figueiredo JR, Hulshof SCJ, Van Den Hurk R, Nusgens B, Bevers MM, Ectors
FJ, Beckers JF. Preservation of Oocyte and Granulosa Cell Morphology in
Bovine Preantral Follicles Cultured in vitro. Theriogenology, 1994, 41: 1333–
1346.
(34) Figueiredo JR, Rodrigues APR, Amorim CA, Silva JRV. Manipulação de
oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais. In: Gonçalves PBD,
Figueiredo JR, Freitas VJF. Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. 2. ed.
São Paulo: Roca; 2008, 16: 303–327.
58
(35) Findlay JK, Drummond AE. Regulation of the FSH receptor in the ovary.
Trends Endocrin Metab, 1999, 10: 183–188.
(36) Fortune JE, Cushman RA, Wahl CM, Kito S. The Primordial to Primary Follicle
Transition. Mol Cel Endoc, 2000, 163: 53–60.
(37) Fortune JE, Kito S, Wandji SA, Srsen V. Activation of bovine and baboon
primordial follicles in vitro. Theriogenology, 1998, 49: 441–449.
(38) Fortune JE, Yang MY, Muruvi, W. In vitro and in vivo regulation of follicular
formation and activation in cattle. Reprod. Fertil, 2011, 23: 15–22.
(39) Fortune JE. Ovarian follicular growth and development in mamals. Biol
Reprod, 1994, 50: 225–232
(40) Forture JE. The early stages of follicular development: activation of primordial
follicles and growth of preantral follicles. Anim Reprod Sci, 2003, 78: 135–163.
(41) Gordon I. Prenatal development of the bovine ovary. In: Gordon, I. Laboratory
production of cattle embryos. Cambridge: Raven Press, 1994, p. 4349.
(42) Gougeon A, Busso D. Morphologic and functional determinants of primordial
and primary follicles in the monkey ovary. Mol Cel Endoc, 2000, 163: 33–41.
(43) Guibault LA, Dufourt JJ, Thatcher WW, Drost M, Haibel GK. Ovarian follicular
development during early pregnancy in cattle. J Reprod Fertil, 1986, 73: 127–
135.
(44) Gutierrez CG, Ralph JH, Telfer EE, Wilmut I, Webb R. Growth and antrum
formation of bovine antral follicles in long-term culture in vitro. Biol Reprod,
2000, 62: 1322–1328.
(45) Hafez ESE, Hafez B. Foliculogênese, maturação ovocitária e ovulação. In:
Hafez ESE, Hafez, B. Reprodução Animal. Barueri: Manole, 2004, p. 69–82.
(46) Hartshorne GM. In vitro culture of ovarian follicles. Rev Reprod. 1997, 2: 94–
104.
(47) Hay MF, Cran DG, Moor RM. Structual Changes Occurring During Atresia in
Sheep Ovarian Follicles. Cell Tissue Res, 1976, 169: 515–529.
(48) Hirshfield AN. Development of follicles in the mammalian ovary. Int Rev Cytol,
1991, 124: 43–101.
(49) Hsu SY, Hsueh AJ. Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis: An
ovarian paradigm. Physiol Rev, 2000, 80: 593–614.
59
(50) Huanmin Z, Yong Z. In vitro development of caprine ovarian preantral follicles.
Theriogenology, 2000, 54: 641–650.
(51) Hulshof SCJ, Figueiredo JR, Bekers JF, Bevers MM, Van Den Hurk, R.
Isolation and Characterization of preantral follicles from foetal bovine ovaries.
Vet Quart, 1994, 2(16): 78–80.
(52) Hyttel P, Fair T, Callesen H, Greve T. Oocyte growth, capacitation and final
maturation in catle. Theriogenology, 1997, 47: 23–32.
(53) IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Indicadores IBGE 2013.
Pesquisa Pecuária. Disponível em: < http://www.ibge.gov.br/>. Acceso em: 29
fevereiro 2014.
(54) Ingram. Atresia. In: Zuckerman S. (Ed.), The Ovary. New York: Academic
Press, 1962, 247–273.
(55) Ireland JJ, Zielak AE, Jimenez-Krassel F, Folger J, Bettegowda A, Scheetz D,
Walsh S, Mossa F, Knight PG, Smith GW, Lonergan P, Evans ACO. Variation
in the ovarian reserve is linked to alterations in intrafollicularo estradiol
production and ovarian biomarkers of follicular differentiation and oocyte
quality in cattle. Biol Reprod, 2009, 80: 954–964.
(56) Ireland JLH, Scheetz D, Jimenez-krasse, F, Themmen APN, Ward F,
Lonergan P, Smith GW, Perez GI, Evans ACO, Ireland JJ. Antral follicle count
reliably predicts number of morphologically healthy oocytes and follicles in
ovaries of young adult cattle. Biol Reprod, 2008, 79: 1219–1225.
(57) Jewgenow K, Stolte M. Isolation of preantral follicles from nondomestic cats –
viability and ultrastructural investigations. Anim Reprod Sci, 1996, 44: 183–
193.
(58) Johnson AL. Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian
follicles. Anim Reprod Sci, 2003, 78: 185–201.
(59) Joyce IM, Pendola FL, Wigglesworth K, Eppig JJ. Oocyte regulation of Kit
ligand expression in mouse ovarian follicles. Dev Biol, 1999, 214: 342–353.
(60) Juengel JL, Hudson NL, Heath DA, Smith P, Reader KL, Lawrence SB,
O’connell AR, Laitinen MP, Cranfield M, Groome NP, Ritvos O, Mcnatty KP.
Growth differentiation factor 9 and bone morphogenetic protein 15 are
essential for ovarian follicular development in sheep. Biol Reprod, 2002, 676:
1777–1789.
(61) Kidder GM, Mhawi AA. Gap junctions and ovarian folliculogenesis.
Reproduction, 2002, 123: 613.
60
(62) Leitão CCF, Costa JJN, Brito IR, Magalhães-Padilha DM, Almeida AP,
Figueiredo JR, van den Hurk R. Silva JRV. Effects of GDF-9 and FSH on
mRNA Expression for FSH-R, GDF-9 and BMPs in in vitro cultured goat
preantral follicles. Braz Arch Biol Tech, 2014, 57(2): 200–208.
(63) Lima GL, Lima LF, Rocha RMP, Rodrigues APR, Oliveira MF, Silva AR. Efeito
do FSH em meio αBase de MEM para o cultivo in vitro de folículos ovarianos
pré antrais de catetos (Pecari tajacu). Acta Vet Bra. 2014, 8(Supl. 2): 43–44.
(64) Lima GL, Santos EA. A. Aplicação das biotécnicas de MOIFOPA, transgênese
e clonagem na reprodução de caprinos. Acta Vet Bras, 2010, 4 Supl: S36–
S42.
(65) Lima-Verde IB, Rossetto R, Figueiredo JR. Influência dos hormônios
esteroides na foliculogênese. Rev Bras Reprod Anim, 2011, 35(4): 472–482.
(66) Lowman BG, Scott NA; Somerville SH. Condition scoring of cattle, Revised
edition. East Scotland College of Agriculture, 1976, 1-31.
(67) Lucci CM, Amorim CA, Rodrigues APR, Figueiredo JR, Báo SN, Silva JRV,
Gonçalves PBD. Study of preantral follicle population in situ and after
mechanical isolation from caprine ovaries at different reproductive stages.
Anim Reprod Sci, 1999, 56: 223–236.
(68) Lucci CM, Silva RV, Carvalho CA, Figueiredo R, Báo N. Light microscopical
and ultrastructural characterization of goat preantral follicles. Small Ruminant
Res, 2001, 41: 61–69.
(69) Markström E, Svensson EC, Shao R, Svanberg B, Billig H. Survival factors
regulating ovarian apoptosis: dependence on follicle differentiation.
Reproduction, 2002, 123: 23–30.
(70) Marques MO, Barreiros TRR, Max MC, Silva KCF, Gomes RG, Seneda MM.
IATF: Desafios e Solução para Maximizar a Eficiência da técnica. Acta Sci
Vet, 2008, 36: 155–157.
(71) Matos MHT, Lima-Verde IB, Luque MCA, Maia Jr JE, Silva JRV, Celestino
JJH, Martins FS, Bao SN, Lucci CM, Figueiredo JR. Essential role of follicle
stimulating hormone in the maintenance of caprine preantral follicle viability in
vitro. Zygote, 2007, 15: 173–182.
(72) Matos MHT, Silva JRV, Rodrigues APR, Figueiredo JR. Técnicas para
avaliação da qualidade de folículos ovarianos pré-antrais cultivados in vitro.
Rev Bras Reprod Anim, 2007, 31(4): 433–442.
61
(73) Mayer LP, Devine PJ, Dyer CA, Hoyer PB. The follicle-deplete mouse ovary
produces androgen. Biol Reprod, 2004, 71: 130–138.
(74) Mcgee EA, Hsueh AJ. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr
Rev, 2000, 21: 200–214.
(75) Médure G Charnaux N, Driancourt MA, Combettes L, Granet P, Vannier B,
Lossfelt H, Milgrom E. Follicle-stimulating hormone receptors in oocytes? J
Clin Endoc Met, 2002; 87: 2266–2276.
(76) Moore KL, Persaud TV. Início do desenvolvimento humano. In Moore, K.L.;
Persaud, T.V.N. (ed.), Embriologia Clínica, 480p., Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1994, 13–38.
(77) Morita Y, Tilly JL. Oocyte apoptosis: Like sand through and hourglass.
Develop Biol, 1999, 213: 1–17.
(78) Neves JP, Miranda KL, Tortorella RD. Progresso científico em reprodução na
primeira década do século XXI. Rev Bras Zoo, 2010, 39: 414–421.
(79) Nilsson EE, Skinner MK. Cellular interactions that control primordial follicle
development and folliculogenesis. J Soc Gynecol Invest, 2001, 8: 17–20.
(80) O’shea JD, Hay MF, Cran DG. Ultrastructural changes in the theca interna
during follicular atresia in sheep. J Reprod Fertil, 1978, 54: 183–187.
(81) Oktay K, Briggs D, Gosden RG. Ontogeny of follicle-stimulating hormone
receptor gene expression in isolated human ovarian follicles. J Clin Endoc
Metabol, 1997, 82: 3748–3751.
(82) Peters H. The development and maturation of the ovary. Ann Biol Anim Bioch
Biophys, 1976, 16(3): 271–278.
(83) Picton HM. Activation of follicle development: The primordial follicle.
Theriogenology, 2001, 55:1193–1210.
(84) Rankin TL, O’Brien M, Lee E, Wigglesworth K, Eppig J, Dean J. Defective
zonae pellucidae in Zp2-null mice disrupt folliculogenesis, fertility and
development. Develop, 2001, 128: 1119–1126.
(85) Rodrigues GQ, Silva CMG, Faustino LR, Bruno JB, Pinto LC, Lopes CAP,
Campello CC, Figueiredo JR. Efeito de diferentes concentrações de hormônio
folículo-estimulante recombinante sobre o desenvolvimento in vitro de
folículos pré-antrais caprinos e ovinos isolados. Acta Vet Bras, 2010, 4(3):
144–152.
62
(86) Rossetto R, Lima IMT, Saraiva MVA, Lima-Verde ETS, Figueiredo JR.
Avanços no isolamento e sistemas de cultivo de folículos pré-antrais. Acta Vet
Bras, 2011, 5(1): 15–23.
(87) Rossetto R, Santos RR, Silva GM, Duarte ABG, Silva CMG, Campello CC,
Figueiredo JR. Comparative study on the in vitro development of caprine and
bovine preantral follicles. Small Ruminant Res, 2013, 113: 167–170.
(88) Rossetto R, Saraiva MVA, Santos RR, Silva CMG, Faustino LR, Chaves RN,
Brito IR, Rodrigues GQ, Lima IMT, Donato MAM, Peixoto CA, Figueiredo JR.
Effect of medium composition on the in vitro culture of bovine preantral
follicles: morphology and viability do not guarantee functionality. Zygote, 2012,
21: 125–128
(89) Roy SK, Albee L. Requirement for follicle-stimulating hormone action in the
formation of primordial follicles during perinatal ovarian development in the
hamster. Endoc, 2000; 141: 4449–4456.
(90) Roy SK, Treacy BJ. Isolation and long term culture of human preantral
follicles. Fertil Steril, 1993, 59: 783–790.
(91) Rüsse I. Oogenesis in cattle and sheep. Bibli Anat, 1983, 24: 77–92.
(92) Sadeu JC, Cortvrindt R, Ron-el R, Kastertein E, Smitz J. Morphological and
ultrastructural evaluation of cultured froze-thawed human fetal ovarian tissue.
Fertil Steril, 2006, 85(1):1130–1141.
(93) Sánchez F, Smitz J. Molecular control of oogenesis. Bioch Bioph Acta, 2012,
1822: 1896–1912.
(94) Santos RR, Celestino JJH, Lopes CAP, Melo MAP, Rodrigues APR,
Figueiredo JR. Criopreservação de folículos ovarianos pré-antrais de animais
domésticos. Res Bras Reprod Anim, 2008, 32(1), 9–15.
(95) Saraiva MVA, Celestino JJH, Araújo VR, Chaves RN, Almeida AP, Lima-Verde
IB, Duarte ABG, Silva GM, Martins FS, Bruno JB, Matos MHT, Campello CC,
Silva JRV, Figueiredo JR. Expression of follicle-stimulating hormone receptor
(FSHR) in goat ovarian follicles and the impact of sequential culture medium
on in vitro development of caprine preantral follicles. Zygote. 2011, 19(3): 205-
14.
(96) Saumande J. La folliculogenèse chez les ruminants, Rec Méd Vét, 1991,
167(3-4): 205–218.
(97) Scaramuzzi RJ, Adams NR, Baird DT, Campbell BK, Downing JA, Findlay JK,
Henderson KM, Martin GB, Mcnatty KP, Mcneilly AS, Tsonis CG. A model for
63
follicle selection and the determination of ovulation rate in the ewe. Reprod,
Fertil Develop, 1993, 5: 459–478.
(98) Seneda MM, Silva KCF. Epigenética e neo-oogênese: novos conceitos em
foliculogênese. Rev Bras Reprod Anim. 2009, 33(3): 111-117.
(99) Silva JRV, Van Den Hurk R, Matos MHT, Santos RR, Pessoa C, Moraes MO,
Figueiredo JR. Influences of FSH and EGF on primordial follicles during in
vitro culture of caprine ovarian cortical tissue. Theriogenology, 2004a., 61:
1691–1704.
(100) Silva JRV. Growth factors in goat ovaries and the role of ativina-A in the
development of early-staged follicles. Phd Thesis. Utrecht University, Faculty
of Veterinary Medicine, 2005, 142.
(101) Silva, J.R.V., Van Den Hurk, R., Matos, M.H.T., Santos, R.R., Pessoa, C.,
Moraed, M.O. & Figueiredo, J.R. Influences of FSH and EGF on primordial
follicles during in vitro culture of caprine ovarian cortical tissue.
Theriogenology. 2004, 61: 1691–704.
(102) Silva-Buttkus P, Jayasooriya GS, Mora JM, Mobberley M, Ryder TA, Baithu M,
Stark J, Franks S, Hardy K. Effect of cell shape and packing density on
granulosa cell proliferation and formation of multiple layers during early follicle
development in the ovary. J Cell Sci, 2008, 121: 3890–3900.
(103) Stroud B. IETS 2011 Statistics and Data Retrieval Committee Report: The
year 2010 worldwide statistics of embryo transfer in domestic farm animals.
Embryo Transfer Newsletter, 2011, 29: 14–23.
(104) Szlachta M, TIschner M. Distribution, morphology and ultrastructure of
preantral follicles in the ovary of the mare. Havemeyer Foundation Monograph
Series, 2008, 5: 33–35.
(105) Tassel R, Kennedy JP. Early follicular development and atretic changes in
ovary of the Lamb-fine struture and histochemistry. Aust J Biologic Sci, 1980,
33: 675–678.
(106) Telfer EE, Binnie JP, Mccaffery FH, Campbell BK. In vitro development of
oocyte from porcine and bovine primary follicles. Mol Cell Endoc, 2000, 163:
117–123.
(107) Telfer EE, McLaughlin M, Ding C, Joo Thong K. A two-step serum-free culture
system supports development of human oocytes from primordial follicles in the
presence of activin. Hum Reprod.2008, 23(5 ): 1151–1158.
64
(108) Thomas FH, Ethier JF, Shimasaki S, Vanderhyden BC. Follicle-stimulating
hormone regulates oocyte growth by modulation of expression of oocyte and
granulosa cell factors. Endocrinology, 2005, 146: 941–949.
(109) Ting AY, Yeoman RR, Lawson MS, Zelinski MB. In vitro development of
secondary follicles from cryopreserved rhesus macaque ovarian tissue after
slow-rate freeze or vitrification. Hum Reprod, 2011, 26(9): 2461–2472.
(110) Tsafiri A, Braw RH. Experimental approaches to atresia in mammals. Oxf Rev
Reprod Biol, 1984, 6: 226–265.
(111) Van Den Hurk R, Bevers MM, Beckers JF. In-vivo and in-vitro development of
pre antral follicles. Theriogenology, 1997, 47: 73–82.
(112) Vasconcelos GL, t MVA, Costa JJN, Passos MJ, Silva AWB, Rossi RODS,
Portela AMLR, Duarte ABG, Magalhães-Padilha DM, Campelo CC, Figueiredo
JR, van den Hurk R, Silva JR. Effects of growth differentiation factor-9 and
FSH on in vitro development, viability and mRNA expression in bovine
preantral follicles. Reprod Fertil Dev, 2013, 25: 1194–1203.
(113) Vieira RJ. Biotécnicas aplicadas à Reprodução Bovina: Generalidades. Cienc
Anim, 2012, 22(1): 55–65.
(114) Wandji Sa, Eppig Jj, Fortune JE. FSH and Growth Factor Affect the Growth
and Endocrine Function in vitro of Granulosa Cells of Bovine Preantral
Follicles. Theriogenology, 1996, 45: 817–832.
(115) Wassarman PM. The mammalian ovum. In: Knobil, E.; Neill, J. The Physiology
of Reproduction, New York: Raven Press, 1988, 69–101.
(116) Williams GL. Suckling as regulador of postpartum rebreeding in catle: a
review. J Anim Sci, 1990, 68: 831–852.
(117) Wood TC, Montali RJ, Wildt DE. Follicle-oocyte atresia and temporal
taphonomy in cold-stored domestic cat ovaries, Mol Reprod Dev, 1997, 46:
190–200.
(118) Wu J, Emery BR, Carrell DT. In vitro growth, maturation, fertilization, and
embryonic development of oocytes from porcine preantral follicles. Biol
Reprod, 2001, 64: 375–381.
(119) Zhou H, Zhang Y. Regulation of in vitro growth of preantral follicles by growth
factors in goats. Domest Ani Endocr, 2005, 28: 235–242.
