Camila Figueira Mendes - USP · 2012-08-14 · Camila Figueira Mendes EFEITO DO EXTRATO DE Mikania glomerata SPRENGEL ... Não somos o que deveríamos ser, não somos o que iremos

Camila Figueira Mendes

EFEITO DO EXTRATO DE Mikania glomerata SPRENGEL (GUACO)

SOBRE A IMPLANTAÇÃO E O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO E

PLACENTÁRIO EM CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.

São Paulo 2011

Camila Figueira Mendes

EFEITO DO EXTRATO DE Mikania glomerata SPRENGEL (GUACO) SOBRE A

IMPLANTAÇÃO E O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO E PLACENTÁRIO EM

CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Biologia Celular e Tecidual

Orientadora: Profª. Drª. Estela Bevilacqua

Versão Original.

São Paulo 2011

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)

Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

reprodução não autorizada pelo autor

Mendes, Camila Figueira. Efeito do extrato de Mikania glomerata Sprengel (guaco) sobre a implantação e o desenvolvimento embrionário e placentário em camundongos / Camila Figueira Mendes. -- São Paulo, 2012. Orientador: Estela Maris Andrade Forell Bevilacqua. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento. Área de concentração: Biologia Celular e Tecidual. Linha de pesquisa: Citofisiologia do trofoblasto: estudo in vivo e in vitro dos aspectos celulares envolvidos na fisiologia do trofoblasto. Versão do título para o inglês: Effect of Mikania glomerata Sprengel (guaco) extract on implantation and placental and embryonic development in mice. Descritores: 1. Placenta 2. Teratogênese 3. Mikania glomerata 4. Fitoterápicos 5. Defeito congênito 6. Aborto I. Bevilacqua, Estela Maris Andrade Forell II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual III. Título.

ICB/SBIB0224/2011

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

_____________________________________________________________________________________________________________

Candidato(a): Camila Figueira Mendes.

Título da Dissertação: Efeito do extrato de Mikania glomerata Sprengel (guaco) sobre a implantação e o desenvolvimento embrionário e placentário em camundongos.

Orientador(a): Estela Maris Andrade Forell Bevilacqua.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado,

em sessão pública realizada a .............../................./.................,

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome completo: ................................................................................... Instituição: ............................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome completo: ................................................................................... Instituição: ............................................................................................

Presidente: Assinatura: ............................................................................................ Nome completo: .................................................................................... Instituição: ..............................................................................................

Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor, mas lutamos para que o melhor fosse

feito. Não somos o que deveríamos ser, não somos o que iremos ser... MAS Graças a Deus,

não somos o que éramos.

Martin Luther King

Questions of science, science and progress

Don't speak as loud as my heart.

The Scientist- Coldplay

À Profa. Dra. Estela Bevilacqua…

Por ser uma excepcional orientadora e pessoa, por ser minha “mãe” e amiga, por me

receber e me ajudar a me adaptar em São Paulo, por confiar em meu trabalho, por

acreditar em meu potencial, pelos inúmeros conselhos, por me ensinar a nunca

desistir, por me dar um sorriso e sempre falar quando algo saía errado: “Acontece

gatinha, tenta de novo, vai dar tempo !!!!!”

AGRADECIMENTOS

À Deus por me proporcionar a vida que tenho;

À minha família como um todo, pois sem ela eu nada seria;

À minha mãe Julia e meu pai Dirceu que desde o momento que souberam de

minha existência, passaram a me amar, desejar e almejar um futuro brilhante

gostaria também de agradecer os ensinamentos, o carinho, o conselho, o

investimento e principalmente o amor que me foi dado, SEM VOCÊS DOIS podem

ter certeza que eu não chegaria onde estou. OBRIGADA, por nunca terem desistido

de mim!!!

Aos meus pais de aluguel Cristiane e Mauro, que inúmeras vezes tiveram a

paciência de me ouvir, de interceder por mim e também de me acalmar nos

momentos que eu precisei, além de todos os momentos descontraídos e risadas que

pudermos ter.

À minha irmã Ingrid pelas piadas que fazemos sempre que nos vemos e carinho

em mim depositado.

À minha avó Zilda, pessoa a qual me espelho e almejo ser quando ficar velhinha,

pelo amor, carinho, sorriso e olhar tênue que sempre tem ao me ver, saiba que

mesmo morando longe, sinto muita falta, afinal posso dizer que você é muito mais

do que uma avó é sim minha mãe e amiga. TE AMO!

À tia Neli, pelo carinho, esforço e principalmente paciência que têm comigo,

obrigada por ser da minha família e também por ser minha professora de inglês, com

absoluta certeza, sem a sua presença eu jamais teria chego onde estou tão rápido,

você é mais que parte desse trabalho!

À Profa. Dra Suzana Guimarães Moraes por me ensinar a dar os primeiros

passos na ciência, por ter ministrado aquela primeira aula de Histologia no segundo

ano do Curso de Ciências Biológicas a qual me fez decidir qual área da Biologia e da

Ciência eu gostaria de seguir, a ter me ensinado a ser independente e por ter se

tornado uma amiga de valor inigualável; obrigada por ser minha amiga,professora e

co-orientadora.

Ao Prof. Dr. Sérgio de Oliveira, pelo uso de seus equipamentos, laboratório e

ensinamentos;

À Profa. Dra.Telma Zorn, pelo uso contínuo de seu laboratório;

Aos Profs. Dr. Victor Chaves, Dra. Maria Inês Borella, Dra Vanessa Freitas pela

participação em minha banca de qualificação e pelas sugestões;

À Profa. Dra. Patrícia Gama, pelas inúmeras aulas de Práticas de Ensino, nas

quais pude aprender um pouco mais de como se ministrar uma boa aula, pelo uso

de seu laboratório e também pelas sugestões dadas para a melhoria de métodos

utilizados laboratorialmente;

À Fernanda pelo apoio e momentos únicos de descontração, além claro dos

inúmeros cafés que pude tomar em sua companhia;

Ao Junior por toda ajuda técnica laboratorial;

À Profa. Dra. Elfriede Bacchi pela orientação na manipulação do extrato de guaco

e também por ceder seu laboratório;

À Rose, primeira pessoa a me receber e acolher no Trofo’s Lab, com seu sorriso

gigantesco e muito amor, pessoa esta que me apoia e conforta, pelos ensinamentos

valiosos que só ela poderia me passar, Obrigada por estar sempre lá, quando eu

precisei!!!

Aos amigos do Trofo’s Lab: Adriana, Alexandre, Aline, Fernanda, Ísis, Lessandra,

Letícia, Miriam, Rodrigo, Sara, Simone e Sônia, especialmente a Carla, Karoll, Karen

e Mariane;

Às estagiárias Aline, Evelyn, Jéssica e Paola que me ajudaram no decorrer da

tese e que nos momentos finais se desdobraram para que esse trabalho fosse

realizado;

À Karoll e família (José e Neusa), pelo companheirismo, por me acolher em sua

casa, amizade, sinceridade, “puxões de orelha”, ajuda na realização deste trabalho,

sem vocês tudo seria muito mais difícil;

À Karen e Mariane, pelas inúmeras horas de risadas em nossa viagem, pela

calma e carinho com que me trataram nesses anos todos, por me ouvir sempre que

precisei;

À Carla, pela convivência agradável e sincera nesses anos todos e por ter me

recebido em sua casa inúmeras vezes em que eu ainda não morava em São Paulo;

À Daniella Oliveira, pela paciência, cuidado, carinho, dedicação e amizade, você

é muito mais que uma amiga, você é uma irmã que escolhi para ter e que irei levar

para sempre em minha vida;

À Poliana Proença, pelo carinho, simpatia, companheirismo e por ter se

demonstrado uma amiga ímpar, além claro de ser extremamente divertida e me

apoiar nos momentos complicados que passei, tendo sempre um ombro amigo para

me confortar, você é uma daquelas pessoas que desejo ter sempre ao meu lado;

À Antonella, Andréa, Bruna, Daisy, Liliane, Lucimara e Valéria pela amizade e

pelos momentos de descontração quando eu mais precisei e por me acompanharem

sempre;

Ao meu querido primo-amigo Leonardo que têm me acompanhado nessa

empreitada, pela confiança e por acreditar em meus sonhos;

Aos meus primos Fabiana, Gustavo, Hellington , Rafael por existirem em minha

vida e por sempre estarem sorrindo quando eu retornava a Sorocaba;

Aos amigos Adam, Ana Zen, Felipe, Helô, Juliane, Maraysa, Tati pela alegria e

amizade, mesmo que em poucas esbarradas no corredor ou nas festas de amigo

secreto;

A Secretária da Pós-Graduação, Celiana, por toda a ajuda;

As bibliotecárias Valéria Loro e Maria Socorro pelo apoio excepcional, ajuda na

adequação da tese e muita paciência que tiveram comigo;

Aos funcionários do departamento sempre dispostos a ajudar;

À FAPESP, pelo apoio financeiro

A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste estudo e que

por ventura não foram citados;

Aos animais, que dão suas vidas para realização dos trabalhos científicos;

MENDES, C.F. Efeito do extrato de Mikania glomerata sprengel (guaco) sobre a implantação e o desenvolvimento embrionário e placentário em camundongos. 2011. 103 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Tecidual)- Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012.

RESUMO

Nos dias atuais, a utilização de fitoterápicos tem crescido acentuadamente.

No Brasil, um país cuja flora nativa é riquíssima, tem-se investido substancialmente em pesquisas nesta área. Isto se deve, em parte, à necessidade de novos medicamentos, ao interesse na comercialização destes produtos, ao interesse na preservação da cultura popular e da reserva da flora nacional. Paralelamente a este cenário, está a crença de que medicamentos fitoterápicos são inofensivos em circunstâncias especiais tais como: gravidez, hipertensão, diabetes, etc. É como se os fitoterápicos atuassem especificamente sobre uma determinada patologia não sobre o metabolismo como um todo. A Mikania glomerata Sprengel, conhecida popularmente como guaco e originária da América do Sul, é uma planta subarbustiva, antialérgico, antiinflamatório e antiofídico, na grande maioria das vezes administrada sem supervisão de profissionais da área da saúde. Neste estudo, nosso objetivo é estudar a possível ação do extrato vegetal de Mikania glomerata Sprengel (guaco) no perfil reprodutivo e gestacional de camundongos (Mus musculus domesticus) e determinar se a administração desta droga pode comprometer o embrião/feto e placenta durante a prenhez. Este estudo mostrou que a utilização do extrato de Mikania glomerata em doses supra-terapêuticas pode atuar sobre processos morfofuncionais orgânicos, interferindo no crescimento placentário e fetal e podendo levar ao insucesso gestacional e ao aparecimento de defeitos congênitos. Além disto, a diminuição do crescimento fetal observado nas doses consideradas terapêuticas também é um alerta para o uso inadvertido do extrato de guaco sem acompanhamento médico devido, em qualquer período gestacional. que nasce nas matas e cerrados e, que se adapta muito bem ao cultivo doméstico. Ela é vastamente utilizada pela população no tratamento de doenças como a asma, bronquite, e reumatismo, além de possuir efeito antifúngico, antimicrobiano.

Palavras- Chave: Placenta. Teratogênese. Mikania glomerata.

MENDES, C.F. Effect of Mikania glomerata Sprengel (guaco) extract on implantation and placental and embryonic development in mice. . 2011. 103 p. Masters Thesis (Cell and Tissue Biology Program) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012.

ABSTRACT

Nowadays, the use of medicinal plants has grown dramatically. In Brazil, a country whose native flora is rich, has invested substantially in research in this area. This is due in part to the need for new drugs, the interest in marketing these products, the interest in the preservation of popular culture and the reserve of national flora. In parallel with this scenario is the belief that phitotherapeutics are harmless in special circumstances such as pregnancy, hypertension, diabetes, etc. It is as if the herbal acted specifically in a determinate disease not on the metabolism as a whole. The Mikania glomerata Sprengel, popularly known as guaco and originating from South America, is a plant undergrowth, which rises in the forests and savannahs, and that lends itself very well to domestic cultivation. It is widely used by local people in the treatment of diseases such as asthma, bronchitis, and rheumatism, as well as having antifungal effect, antimicrobial, antiallergic, anti-inflammatory and anti-snakebite, in most cases administered without the supervision of health professionals. In this study, our goal is to study the possible action of plant extract of Mikania glomerata Sprengel (guaco) in pregnancy and reproductive profile of mice (Mus musculus domesticus) and determine whether the administration of this drug may affect the embryo / fetus and placenta during pregnancy. This study showed that the use of extract of Mikania glomerata at supratherapeutic doses can act on morphofunctional organic processes, interfering with fetal and placental growth and could lead to pregnancy failure as well as contribute to the appearance of birth defects. Furthermore, the decrease in fetal growth observed in therapeutic doses is also considered a warning to the inadvertent use of the extract guaco without medical supervision because, at any gestational period.

Key-words: Placenta. Teratogenesis. Mikania glomerata.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BSA – albumina sérica bovina

CO2 Gás carbônico

DAB - 3,3’-diamino benzidina

Dg – Dia gestacional

EDTA – Ácido etilenodiaminio tetra-acético

HE – Hematoxilina e Eosina

PAS- Ácido Periódico de Schiff

PBS Phosphate buffered-saline

TBS Tris-phosphate buffer saline

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Relação de plantas embriotóxicas, teratogênicas e abortivas comumente utilizadas pela população brasileira..................................................................... 38 Tabela 2 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado em fêmeas prenhes sobre o ganho de peso corporal () entre o 1º e o 19º dia de gestação.............................................................................................................. 52 Tabela 3 – Efeito da administração do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 7 e 11 da gestação (n=10) sobre parâmetros gestacionais ............................................................................................................................. 52 Tabela 4 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata, administrado entre os dias 7 e 11 da gestação (n=10). Índices gestacionais................................... 52 Tabela 5 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 7 e 11 de gestação (n=10)...................................................................... 53 Tabela 6 – Frequência de malformações congênitas e anomalias nos grupos tratados com extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 7 e 11 de gestação............................................................................................... 55 Tabela 7 – Número de centros de ossificação identificados pela alizarina vermelha nos fetos controle e que receberam o extrato hidroetanólico de Mikania glomerata entre os dias 7 e 11 da gestação......................................................................... 56 Tabela 8 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata, administrado entre os dias 14 e 18 da gestação. Parâmetros gestacionais (n=10)........................... 57 Tabela 9 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 14 e 18 da gestação. Desempenho gestacional (n=10)........................... 57 Tabela 10 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (T mg/g/dia, por gavagem), administrado entre os dias 14 e 18 da gestação. Parâmetros biométricos ............................................................................................................................. 58 Tabela 11 – Frequência de malformações congênitas e anomalias nos grupos tratados com extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 14 e 18 da gestação............................................................................................. 60 Tabela 12 – Número de centros de ossificação identificados pela alizarina vermelha nos fetos que receberam ou não o extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (T mg/g/dia, por gavagem) entre os dias 14 e 18 de gestação.................................. 61

Tabela 13 – Resumo dos dados obtidos dos estudos nas dosagens 0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia de Mykania glomerata, administrados durante o 7 ao 11 e 14 ao 18 dia de gestação.................................................................................................................61

Tabela 14 – Efeito da Mykania glomerata administrada durante o período organogenético e de desenvolvimento fetal nas dosagens 0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia, na área total da placenta e na área das regiões juncional e do Labirinto........ 65

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 7 e 11 de gestação sob a anatomia fetal............................................... 54

Figura 2 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0,6 mg/g/dia, por gavage), administrado entre os dias 14 e 18 da gestação................................. 60

Figura 3 – Placentas de fêmeas-controle (A) e tratadas (B-F) com Mikania glomerata nas doses de (B) 0,03, (C) 0,3 e (D-F) 0,6 mg/g/dia, por gavagem, durante os dias 7 e 14 de gestação................................................................... 63

Figura 4 – Preparados histológicos de placentas de camundongo aos 19 dias de gestação de fêmeas tratadas e controle com o extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0,6 mg/g/dia, por gavagem) entre os dias 7 e 11 da gestação durante o período organogenético.................................................................................... 64

Figura 5 – Efeito da Mykania glomerata administrada durante o período organogenético e de desenvolvimento fetal nas dosagens 0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia, na área da região juncional e labiríntica........................................................... 65

Figura 6 – Reação de TUNEL em placentas tratadas com extrato de Mikania glomerata e controle......................................................................................... 66

Figura 7 – Imunolocalização do antígeno Ki67.................................................. 67

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 20

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................... ............ 24

2.1 Implantação embrionária em camundongos ........................... ............ 25

2.2 Desenvolvimento Placentário................................................................. 27

2.3 Teratogênese e Defeitos Congênitos ....................................... ............ 29

2.3.1Teratogênese .......................................................................................... 29

2.3.1.1 Definições e Princípios ........................................................................ 29

2.3.1.2 Genótipo materno-fetal ........................................................................ 31

2.3.1.3 Mecanismos específicos de cada agente............................................. 31

2.3.1.4 Estágio do desenvolvimento do embrião/feto...................................... 31

2.3.1.5 Relação dose e efeito........................................................................... 31

2.3.1.6 Mecanismos de teratogênese.............................................................. 31

2.3.2 Defeitos Congênitos................................................................................ 32

2.3.2.1 Causas e prevenção das malformações congênitas............................ 33

2.3.2.1.1 Classificação por causa..................................................................... 33

2.3.2.1.2 Classificação por patogênese .......................................................... 33

2.3.2.1..2.1 Malformação.................................................................................. 33

2.3.2.1.2.2 Disrupção ...................................................................................... 34

2.3.2.1.2.3 Deformação.................................................................................... 34

2.3.2.1.2.4 Displasia......................................................................................... 34

2.3.3 Prevenção dos defeitos congênitos.........................................................34

2.3.3.1 Prevenção Primária.............................................................................. 34

2.3.3.2 Prevenção Secundaria......................................................................... 34

2.3.3.3 Prevenção Terciária............................................................................. 35

2.4 Plantas medicinais, fitoterápicos e teratogênese................................. 35

2.4.1 A toxcicidade das plantas medicinais...................................................... 36

3 OBJETIVOS.................................................................................................. 39

3.1 Objetivo Geral........................................................................................... 40

3.2 Objetivos Específicos.............................................................................. 40

4 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 41

4.1 Reagentes................................................................................................. 42

4.2 Comitê de ética......................................................................................... 42

4.3 Animais...................................................................................................... 42

4.4 Acasalamento e determinação da prenhez........................................... 42

4.5 Material Vegetal e extração......................................................... ............ 43

4.6 Protocolo de dose e administração nos animais.................................. 44

4.7 Toxicidade do extrato.............................................................................. 44

4.8 Desempenho gestacional....................................................................... 44

4.9 Processamento das amostras para análise morfológica.................... 45

4.10 Imunolocalização do antígeno Ki67.................................................... 46

4.11 Reação de TUNEL............................................................... ....... ........... 47

4.12 Análise das regiões placentárias ....................................................... 47

4.13 Análise da morfologia fetal.................................................................. 48

4.14 Analise Estatística........................................................... .......... .......... 49

5 RESULTADOS........................................................................................... 50

5.1 Avaliação da toxicidade do extrato...................................................... 51

5.2 Avaliação do efeito do extrato sob o desempenho gestacional e

parâmetros biométricos.............................................................................. 51

5.2.1 Efeitos durante o período organogenético............................................. 51

5.2.1.1 Desempenho gestacional.................................................................... 51

5.2.1.2 Parâmetros biométricos...................................................................... 53

5.2.1.3 Malformações e anomalias.................................................. .... ........... 54

5.3 Avaliação do efeito do guaco administrado durante o desenvolvimento

fetal................................................................................................................. 56

5.3.1 Desempenho gestacional....................................................................... 56

5.3.2 Parâmetros biométricos.......................................................................... 58

5.3.3 Malformações e anomalias .................................................................... 58

5.4 Avaliação do efeito de Mikania glomerata (guaco) sobre a placenta. 62

5.4.1 Analise morfológica................................................................................ 62

5.4.2 Análise morfométrica............................................................................ 64

5.4.3 Avaliação da taxa de morte celular...........................................................66

5.4.4 Análise ciclo celular................................................................................. 67

6 DISCUSSÃO................................................................................................. 68

ANEXOS ........................................................................................................ 93

REFERÊNCIA ................................................................................................. 96

1 INTRODUÇÃO

21

O termo barreira placentária é empregado para designar a presença de tecidos que

se interpõem entre o sangue materno e fetal. Esta estrutura enquanto barreira física,

também é dotada de mecanismos complexos e específicos para permitir a

passagem de moléculas entre estes organismos e a proteção a agentes estranhos

presentes na interface materno-fetal ou no sangue materno (CLARK et al., 1998).

Estes mecanismos, entretanto podem não ser adequadamente eficientes em

determinadas situações. Alguns fármacos ou seus metabólitos, por exemplo,

administrados por vias diversas ao organismo materno, podem também alcançar a

interface materno-fetal e atravessar a barreira placentária e atingir a corrente

sanguínea fetal. Nestes casos, pode haver comprometimento do organismo fetal,

que por não possuir ainda capacidade de metabolização de muitas substâncias e

não ter ainda seus sistemas corporais completamente desenvolvidos, pode sofrer os

efeitos negativos da droga utilizada (LEMONICA, 1996).

Até 1960, acreditava-se que a barreira placentária era absoluta, não expondo o

feto a substâncias outras que não as nutritivas, como por exemplo: os teratógenos.

No entanto, este conceito foi fortemente abalado quando a sociedade se deparou

com os efeitos gerados pela Talidomida, que administrada entre a primeira e oitava

semana de gestação alterava ou depletava completamente o desenvolvimento dos

membros fetais. Instalou-se então uma preocupação crescente (até os dias de hoje)

relacionada à teratogenicidade a que o embrião/feto pode ser submetido durante o

desenvolvimento intra-uterino (GILLBERG, 1994; SCHULER-FACCINI et al., 2002 ;

UJHÁZY et al., 2005).

Teratógenos agem através de diferentes mecanismos durante o

desenvolvimento, como por exemplo: induzindo morte celular, alterando o

crescimento tecidual ou ainda, interferindo nos processos de diferenciação ou na

sequência de processos morfogenéticos específicos. O efeito de um teratógeno

pode ainda, atingir um tecido, um órgão, um sistema ou o conjunto de sistemas que

determina a homeostase de um indivíduo. As ações de um componente teratógeno

podem ser relacionadas como causadoras de:

a) morte do embrião/feto;

b)malformações (defeitos ou malformações congênitas geralmente consideradas

uma anomalia estrutural presente ao nascimento, mas que atualmente pode incluir

também desordens funcionais e retardo mental);

22

c) retardo do crescimento intra-uterino;

d) deficiências funcionais.

Deve-se ainda, considerar que a ação de um teratógeno depende:

a) do estágio de desenvolvimento embrionário/fetal (determinados estágios

de desenvolvimento são mais vulneráveis que outros;

b) da dose administrada;

c) da heterogeneidade genética maternal e/ou fetal (CASTILLA e ORIOLI,

2004; KALTER et al., 2003; MOORE, 2008; RAMOS et al., 1981). Em

humanos, acredita-se que 7 a 10% dos defeitos congênitos derivam da

ação perturbadora de drogas, vírus e outros fatores ambientais (MOORE,

2008).

A Mikania glomerata Sprengel conhecida popularmente como guaco, é originária

da América do Sul, sendo encontrada na Argentina, Paraguai, Uruguai e Brasil,

especialmente na região Sul e Sudeste. Esta é uma planta subarbustiva que nasce

nas matas e cerrados, adaptando-se muito bem ao cultivo doméstico (OLIVEIRA;

SAITO; GARCIA et al., 1994). É largamente utilizada pela população, sem indicação

médica, no tratamento de doenças como: asma, bronquite, reumatismo, além de

possuir efeito antifúngico, antimicrobiano, antialérgico, antiinflamatório e antiofídico

(FIERRO et al., 1999; HOLETZ et al., 2002; MAIORANO et al., 2005).

Estudos fitoquímicos têm demonstrado a presença de inúmeras substâncias na

Mykania glomerata Sprengel tais como: flavonóides, cumarinas, taninos,

estigmasterol e sistosterol, muitas das quais dão à planta características únicas de

odor (FIERRO et al., 1999; OLIVEIRA; ALVARENGA; AKISUE et al., 1984;

VENEZIANI ; OLIVEIRA 1999).

Entre estes compostos, a cumarina é a substância química majoritariamente

encontrada e estudada e, intrinsecamente relacionada com a ação farmacológica do

guaco (LEITE et al., 1993; REHDER et al., 1998; SOARES DE MOURA et al., 2002).

Estudos também têm mostrado que a cumarina apresenta atividade tóxica em

fígados de ratos (BORN et al., 2000), atividade contraceptiva em ratas (ULUBEEN et

al., 1994) e é responsável também pela Síndrome da Warfarina (HETZEL et al.,

2006). Por outro lado o uso de agentes cumarínicos tem sido relacionado a

malformações do tipo: microftalmia, retardo no crescimento ósseo, condrodisplasia

puntacta, hipoplasia de membros, retardo mental, restrição de crescimento intra

23

uterino, aborto espontâneo, natimortalidade e hemorragias (BRIGS; FREEMAN;

YAFFE et al., 1994; HALL et al., 1980; HOWE et al., 1992; PAULI et al., 2010;

O’REILLY, 1980).

Os flavonóides também são bastante estudados devido às suas ações como:

antioxidante, antiinflamatório, prevenção e retardo de determinados tipos de câncer,

etc. (CHOI et al., 2009; FENG; ZHANG; ZHU., 2009; GERAETS; HAEGENS;

BRAUERS et al., 2009).

Já os taninos são polifenóis com peso molecular entre 500 e 3000 kD utilizados

para prevenir a aterosclerose. Além de promover a queda leucocitária em

camundongos tratados com essas substâncias (MELO et al., 2008).

Estes constituintes caracterizam a Mikania glomerata como um potencial agente

teratógeno e justificam estudos mais pormenorizados do uso deste fitoterápico

durante a gestação. Além disto, deve se também destacar que mulheres grávidas

por toda a América do Sul se utilizam desta planta, como meio terapêutico de “cura”

para tosses de diferentes causas, muitas vezes sem conhecimento de seu médico,

baseadas na crença de que medicamentos fitoterápicos são inofensivos. É como se

os fitoterápicos atuassem especificamente sobre uma determinada patologia e não

sobre o metabolismo como um todo!

Neste contexto, este estudo teve como objetivo analisar diferentes parâmetros

associados à gestação após a administração oral de Mykania glomerata em

diferentes concentrações, utilizando camundongos como modelo experimental.

24

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

25

2.1 Implantação embrionária em camundongos

O sucesso da gestação depende de uma favorável interação entre tecidos

maternos e fetais. Tal interação pode ser superficial como no caso dos ruminantes,

na qual o feto permanece na cavidade uterina e a interação materno-fetal inclui

todos os tecidos endometriais e o cório; ou associada à intrusão do feto no

endométrio, na qual o cório interage diretamente com o sangue materno. Esta

condição é observada em primatas e roedores e a placenta oriunda desta interação

é classificada como hemocorial (MOSSMAN, 1937).

Ao atingir o útero, o embrião de mamíferos na fase de mórula inicia a primeira

etapa do processo de diferenciação celular. Este processo culmina com o

aparecimento do o blastocisto, formado por: massa celular interna ou embrioblasto

(dará origem ao corpo do embrião propriamente dito), a blastocele ou cavidade

blastocística e o trofoectoderma ou trofoblasto (recobre totalmente o blastocisto e dá

origem ao cório, a porção fetal da placenta).

Em roedores e mais especificamente em camundongos, as células trofoblásticas

que revestem a blastocele, o trofoblasto mural, diferenciam-se em células gigantes

primárias, poliplóides, fagocíticas e invasivas envolvidas com a intrusão e

alojamento do embrião na decidua antimesometrial (BEVILACQUA ;

ABRAHAMSOHN, 1989; ENDERS e SCHLAFKE, 1967). As células trofoblásticas

que revestem a massa celular interna são denominadas de trofoblasto polar. Estas

células darão origem a cone ectoplacentário, cujas células em contato com o

organismo materno diferenciam-se em células gigantes secundárias e invadem a

porção mesometrial do sítio de implantação (GARDNER ; PAPAIOANNOU ;

BARTON et al., 1973, RUGH., 1968). Juntamente com o ectoderma extra-

embrionário e mesoderma alantoideano, o cone ectoplacentário forma a porção fetal

da placenta ao redor do dia 10,5 de gestação (CROSS ; WERB ; FISHER et al.,

1994).

Durante o período de implantação embrionária o trofoblasto invade o epitélio

uterino, decídua e vasos endometriais, fazendo contato direto com o sangue

materno. Este processo inicia-se na região antimesometrial continuando,

26

posteriormente, na região mesometrial uterina (AIN ; CANHAM ; SOARES, 2003;

MOSSMAN, 1937; SHARKEY ; SMITH, 2003).

O processo de implantação embrionária costuma ser dividido em três principais

estágios: a fase de aposição, na qual ocorre a aproximação entre as células do

trofoblasto e as do epitélio uterino; a fase de adesão, caracterizada por uma íntima

associação entre as membranas plasmáticas das células do trofoblasto e as do

epitélio uterino e a fase de invasão, quando as células do trofoblasto penetram no

epitélio uterino e lâmina basal, alcançando o estroma endometrial subjacente.

Diferentes tipos de células trofoblásticas com funções distintas se diferenciam a

partir do trofoblasto do blastocisto de camundongos (CROSS, 2005). A primeira

onda de diferenciação ocorre através do trofoblasto mural. Por volta do 5º dia de

gestação, estas células super expressam o gene Hxt e entram em um processo de

endoreplicação e tornam-se poliplóides (células gigantes primárias) (CROSS, 2005;

POOTS, 1969). O conteúdo de DNA destas células pode aumentar até 850 vezes

com o avançar da gestação (BARLOW ; SHERMAN,1972).

Já as células do trofoblasto polar ao redor do 6º dia de gestação, proliferam e

formam uma saliência denominada de cone ectoplacentário, estrutura precursora da

placenta. Enquanto as células mais centrais desta estrutura mantém sua atividade

proliferativa, um segundo processo de diferenciação leva á diferenciação de células

gigantes secundárias na periferia do cone ectoplacentário. A morfologia das células

gigantes primárias e secundárias é bastante semelhante entre si assim como uma

fração substancial da expressão gênica associada ás funções celulares (ZYBINA,

1961). Além de mediar o processo de implantação embrionária, estas células

gigantes também estão envolvidas com a produção de hormônios, citocinas e outras

moléculas reguladoras e moduladoras (BEVILACQUA; ABRAHAMSOHN, 1989;

CROSS et al 1995; MACAULEY ; CROSS ; WERB, et al 1998; ZYBINA, 1961).

27

2.2 Desenvolvimento placentário

A placenta definitiva em roedores pode ser dividida em quatro compartimentos: a

placa coriônica, o labirinto e a zona juncional contendo o espongiotrofoblasto e a

camada de células trofoblásticas gigantes secundárias (WELSH ; ENDERS, 1991).

As células trofoblásticas gigantes secundárias, que constituem a camada mais

externa da placenta, estão interpostas entre as células deciduais e do

espongiotrofoblasto (MUNTNER ; HSU, 1977).

As células trofoblásticas gigantes desta forma se organizam ao longo de toda a

periferia embrionária, formando uma frente de interação com o organismo materno.

Dentre as estruturas com quem interagem, destacam-se os vasos endometriais que

permitem o acesso a nutrientes, gases e outros fatores vitais para o

desenvolvimento embrionário. A interação células: trofoblásticas gigantes e

endoteliais endometriais inicia-se precocemente, assim que o embrião ultrapassa os

limites do epitélio uterino e alcança o estroma endometrial. Evidências experimentais

indicam que projeções das células trofoblásticas são capazes de se inserir entre as

células endoteliais, passando a fazer parte destes segmentos vasculares e entrando

em contato com o sangue materno (BEVILACQUA ; ABRAHAMSOHN, 1989). Na

medida em que as células gigantes ao redor do embrião aumentam em número e

dimensões, assumem forma estrelada e se comunicam através de seus

prolongamentos. Desta forma, o sangue materno extravasado pelas células gigantes

percola nas malhas destas células ao redor de todo o embrião.

A implantação embrionária está desta forma associada ao desenvolvimento e

diferenciação de células trofoblásticas gigantes com potencial invasivo, capazes de

penetrar o epitélio uterino, estroma endometrial e segmentos vasculares, sendo

capazes de alojar o embrião no endométrio e ainda estabelecer uma íntima relação

de trocas altamente eficientes cuja complexidade aumenta com a maturação da

placenta (PIJNENBORG et al, 2006).

As células mais internas do cone ectoplacentário mantém sua atividade

proliferativa e diferenciam-se ao longo da gestação em células do

espongiotrofoblasto da zona juncional. De função ainda não completamente

conhecida, acredita-se que possuam um papel estrutural, regulador e hormonal,

28

secretando hormônios como, por exemplo, a proliferina e o placentário lactogênico.

(CROSS et al., 2002, 2005). Dentre os tipos celulares desta camada, destacam-se

também células que acumulam glicogênio, plenamente diferenciadas ao redor do dia

12,5 de gestação (GARDNER ; PAPAIOANNOU ; BARTON et al 1973; TESSER et

al 2010).

Um pouco mais tardiamente, ao redor do dia 8,5 da gestação inicia-se a

formação da camada labiríntica da placenta a partir da fusão do mesoderma

alantoideano e do ectoderma extra-embrionário, na base do cone ectoplacentário.

Nesta região, também denominada de placa coriônica, destacam-se em cortes

histológicos com o progredir da gestação evaginações do mesoderma alantoideano

com os primeiros capilares fetais no ectoderma extra-embrionário. A partir do dia 10

de gestação, a interação mesoderma vascularizado e células trofoblásticas

derivadas do ectoderma extra-embrionário torna-se mais complexa, de forma que

uma tripla camada de trofoblasto se organiza ao redor do mesoderma em estruturas

digitiformes que se anastomosam entre si e que em conjunto caracterizam a camada

labiríntica da placenta de roedores (ANSELL, 1974; SERMAN ; SERMAN., 2011;

VALDÉS e CORTHORN., 2011). As células trofoblásticas mais externas desta

estrutura entram em contato com o sangue materno extravasado oriundo da invasão

vascular das células gigantes.

Neste contexto, a camada labiríntica passa a caracterizar uma barreira materno-

embrionária entre o sangue materno que banha a superfície trofoblástica e o fetal

presente no interior dos vasos do mesoderma extra-embrionário, desempenhando

funções relacionadas a trocas gasosas e nutricionais (CROSS, 2000, 2002).

A camada trofoblástica labiríntica, formada por duas camadas de sinciciais e uma

com células individualizadas entre as quais algumas gigantes também

desempenham funções de proteção importantes nas infecções durante a gestação,

impedindo ou dificultando a passagens de microorganismos.

Uma segunda onda de invasão das células trofoblásticas gigantes ocorre

tardiamente durante a formação da placenta. Esta invasão denominada de peri ou

endovascular caracteriza-se pela migração de células trofoblásticas no interstício

decidual, alcançando vasos arteriais de maior calibre. A invasão das células

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vald%C3%A9s%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Corthorn%20J%22%5BAuthor%5D

29

trofoblásticas nestes segmentos vasculares causa alterações fundamentais na

estrutura vascular que tem suas células musculares e endoteliais substituídas por

células trofoblásticas (CROSS et al., 2002; DUNK et al., 2003; GEUSENS et al.,

2008). Este mecanismo diminui a resistência vascular e impede a ação de

mediadores vasoativos na interface materno-fetal, garantindo um suprimento

sanguíneo (nutrientes e gases) adequado ao desenvolvimento do concepto

(CROSS., 2005; PLAISIER., 2011; PIJINENBORG et al., 2011).

No dia 14 de gestação, após completo o processo de diferenciação das células

trofoblásticas, a placenta fetal de camundongo é considerada madura (MUNTNER ;

HSU., 1977; CROSS., 2000, 2002).

No endométrio também se observam alterações importantes nos tecidos que

comporão a porção materna da placenta. Simultaneamente à implantação

embrionária ocorre a remodelação do estroma endometrial materno, conhecida

como reação decidual ou decidualização. Estudos mostram que uma cascata de

eventos morfofuncionais caracteriza esta reação que envolve: edema, aparecimento

de fenestras no endotélio dos vasos sanguíneos, mudança na estrutura e

composição dos componentes da matriz extracelular, alterações morfológicas das

células do estroma endometrial (epitelióides, poliplóides, etc) e síntese de

mediadores específicos. Assim como a diferenciação das células gigantes a

formação da decídua inicia-se na região antimesometrial e gradativamente atinge a

mesometrial uterina. Ainda, esta é uma estrutura transitória que regride

completamente no terço final da gestação (ABRAHAMSOHN ; ZORN, 1993)

2.3 Teratogênese e Defeitos congênitos

2.3.1 Teratogênese

2.3.1.1 Definições e princípios

Defeitos congênitos têm sido descritos a milhares de anos. Acredita-se que

grande parte da mitologia grega, por exemplo, tenha se originado da observação de

anomalias do desenvolvimento, tais como: ciclopia (Polifemos), simelia (Sereias) e

janicéfalo (Janos).

30

Dentre os grandes pensadores, Aristóteles conhecia e descrevia uma ampla

variedade de malformações, as quais consideravam absolutamente contrárias à

ordem estabelecida; contudo, também mencionava que “obedeciam a uma

determinada ordem e não ocorriam ao acaso”. Plínio - “o velho” - relatou em sua

história (primeiro século d.C) povos e tribos que apresentavam malformações. Ele

introduziu o termo monstros, como aqueles seres incomuns, com malformações

grosseiras e de mau agouro (do latim, monstrum, mau agouro). Neste contexto, a

palavra grega para monstro é teras, teratos, originando assim o termo teratologia

(estudo das monstruosidades) (O’RAHILLY, 1988).

Trabalhos publicados por Paré, em 1573, foram importantes para o estudo e

delineamento de trabalhos futuros na área. Este autor acreditava na multiplicidade e

na interação de fatores causais. Dentre as causas, entretanto, ele incluía impressões

maternas.

Na década de 1820, a teratologia foi firmemente estabelecida por Etienne

Geoffroy Saint-Hilaire (considerado pai da teratologia), estudando embriões de

galináceos e cujo filho Isidore, introduziu o termo na Biologia ao escrever o Traité de

Teratologie, em 1836 (LEITE et al 2002). No entanto, segundo Warkany (1971) foi

Meckel em 1812 quem introduziu a análise sistemática das malformações

conhecidas.

Após os trabalhos de Mendel sobre os princípios da herança, o

desenvolvimento normal e o anormal foram considerados geneticamente

determinados (HOPWOOD, 1999).

Assim, a Teratologia: o estudo de malformações congênitas presentes no recém

nascido é relativamente recente como Ciência. A partir da tragédia gerada pela

talidomida nos anos 60, instalou-se uma preocupação global com relação à

teratogênese que certos compostos podem gerar no feto. Atualmente poucas drogas

são reconhecidas como teratógenos e nenhuma delas com risco de efeito

teratogênico próximo a 100% (JASPER et al., 2001; MOORE, 2008).

Definimos como agente teratogênico ou teratógeno qualquer substância,

organismo ou agente físico capaz de gerar uma alteração na estrutura, função ou no

metabolismo do embrião/feto/recém nascido (DICKE, 1989, MOORE, 2008), bem

31

como déficits comportamentais e neurológicos até mesmo a morte intra-uterina

(ADAMS, 1993; BRIGGS et al., 1998). Sendo assim, a procura das causas das

malformações nos organismos vivos, continua sendo o principal objetivo da

teratologia, cujos princípios básicos, para caracterizar agentes como teratógenos

são:

2.3.1.2 Genótipo materno - fetal – a susceptibilidade ou resistência à

manifestação de um agente teratogênico é influenciada diretamente pelo seu

metabolismo e distribuição na circulação materna, pela capacidade de atravessar a

barreira placentária e pelo metabolismo fetal, características estas únicas da

unidade “mãe-feto” em função da heterogeneidade genética.

2.3.1.3 Mecanismo específico de cada agente – os teratógenos atuam em

células, tecidos, órgãos e sistemas através de mecanismos específicos para iniciar

uma seqüência de eventos de desenvolvimento anormal.

2.3.1.4 Estágio do desenvolvimento do embrião/feto – a susceptibilidade ao

teratógeno varia de acordo com o período de desenvolvimento embrionário-fetal. Em

humanos o período organogenético compreende o intervalo entre a 3ª e a 8ª

semana após a fecundação, considerado o mais crítico em relação aos erros

morfogenéticos. Em camundongos, período equivalente ocorre entre o 7º e 14º dia

da gestação.

2.3.1.5 Relação dose e efeito – a indução de defeitos congênitos é diretamente

proporcional ao aumento da dose do agente, variando desde a ausência do efeito

até letalidade.

2.3.1.6 Mecanismos de teratogênese – os agentes teratogênicos atuam em

mecanismos diretos ou indiretos no funcionamento intra ou extracelular através de

interferências relacionadas com: proliferação, interações celulares, metabolismo

celular, crescimento tecidual, nutricional e de controle da metilação de DNA

(HOLLIDAY, 1998; RUTLEDGE et al., 1997; ROGERS et al., 2000; WELSH, 1992).

32

2.3.2 Defeitos congênitos: definição e características

Recentemente um provável efeito de fármacos e plantas medicinais sobre o

desenvolvimento do embrião/feto tem sido questionado, abrindo a necessidade de

novos estudos nesta área.

Neste sentido, embora diversos estudos tenham definido conceitos para os

defeitos congênitos (CHRISTIANSON et al., 1981; ENDL e SCHALLER, 1973;

FRASER 1959; MARDEN et al., 1969; OPTIZ, 2000; WARKANY, 1947), o mais

amplamente aceito é o estabelecido por KALTER (2003) que diz: - defeitos

congênitos ou anomalias congênitas são considerados distúrbios do

desenvolvimento presentes ao nascimento, podendo ser de ordem estrutural,

funcional ou metabólica e até mesmo genética e hereditária acarretando um

distúrbio físico, mental ou até mesmo o óbito do concepto. Ainda que uma

malformação ocorra no período neonatal, inúmeras vezes seu diagnóstico é

realizado apenas durante a adolescência ou até mesmo na idade adulta, como é o

caso das cardiopatias congênitas (OPTZ, 2000).

Atualmente para efeito de diagnóstico as malformações congênitas podem ser

divididas em dois grandes grupos: o das malformações maiores e e o das menores.

As malformações denominadas maiores possuem um efeito drástico no organismo,

sendo necessário tratamento médico cirúrgico. Possuem também um alto impacto

social podendo levar a morte perinatal ou neonatal. A incidência de malformações

maiores é de 3 a 5% nos recém nascidos, sem considerar aquelas inseridas nos

casos de aborto (GIUGLIANI, 2002). As malformações menores, presentes em

aproximadamente 15% dos recém-nascidos necessitam de acompanhamento

médico, mas não são fatais e não necessitam de intervenção cirúrgica, ou seja, não

provocam nenhuma conseqüência ao indivíduo portador (KALTER, 2003). A

incidência de três ou mais malformações menores, no entanto, pode estar

relacionada a existência de uma malformação maior (DE CASTRO, 2002; KALTER,

2003; MOORE, 2008).

33

2.3.2.1 Causas e prevenção das malformações congênitas

Existem diversas maneiras de se classificar as malformações e suas causas,

facilitando assim o melhor entendimento médico, científico e social. Estas

classificações levam em consideração fatores relevantes para a potencialidade de

um teratógeno baseados no período de desenvolvimento e carga genética do

concepto, dose e período de exposição. O período mais crítico para a ação de um

teratógeno ocorre durante os processos de divisão celular, diferenciação e

morfogênese (JORDE et al., 1999).

2.3.2.1.1 Classificação por causa

Os defeitos congênitos podem ser atribuídos a diversas etiologias, sendo elas:

ambiental, genética e multifatorial (CASTILLA et al., 1996). As estimativas de causa

de etiologia genética (monogênicas e cromossômicas) são de aproximadamente

13,5%; as de origem ambiental (agentes físicos, químicos e biológicos) são de 5,0%,

enquanto que as consideradas multifatoriais (ambiental e genética) são da ordem de

20%. Sessenta e cinco por cento dos defeitos congênitos, no entanto, ainda

possuem causas desconhecidas (KALTER, 1993; MOORE, 2008; SCHARDEIN,

2000a).

Dentre os agentes químicos podemos citar drogas lícitas e ilícitas, medicamentos

e substâncias químicas; dentre os agentes biológicos, as infecções e dentre os

agentes físicos a radiação ionizante e temperatura.

2.3.2.1.2 Classificação por patogênese

Os defeitos congênitos podem também ser classificados pela gravidade no

desenvolvimento fetal e período de ocorrência:

2.3.2.1.2 .1 Malformação.

São anormalidades morfológicas de um órgão e partes do corpo decorrente do

desenvolvimento anormal podendo ser retardado, interrompido ou alterado. Este

defeito é comumente determinado nas primeiras 8 semanas do desenvolvimento,

isto é no período organogenético, podendo ter como etiologia, agentes genéticos ou

multifatoriais (JONES, 1998).

34

2.3.2.1.2.2 Disrupação.

São anormalidades morfológicas de um órgão, parte dele ou de uma região

maior do corpo, originada através da perturbação ou interferência de uma estrutura

previamente normal. Suas principais causas são os fatores ambientais, o que gera

comprometimento através de compressão, isquemia, hemorragia ou adesão

estrutural (KALTER, 2003).

2.3.2.1.2.3 Deformação.

São distorções nas estruturas fetais previamente formadas decorrente de

choques mecânicos intrínsecos (edema fetal) ou extrínsecos (constrição uterina do

canal de parto) (KALTER, 2003).

2.3.2.1.2.4 Displasia.

Apresenta-se como desorganização celular de um tecido, gerando um aspecto

tumoral (KALTER, 2003).

Além dos fatores citados, existem outros como: paridade, consangüinidade, etnia

e nível sócio econômico que tendem a aumentar significativamente os defeitos

congênitos (CASTILLA et al., 1996; SHAW et al., 2002; WHO, 1993).

2.3.3 Prevenção dos defeitos congênitos

Segundo CASTILLA et al. (1992), levando-se em consideração todos estes

fatores, pode-se inferir que as causas das malformações são variadas, inespecíficas

e intrínsecas, contudo, poderiam ser facilmente prevenidas tomando-se medidas,

simples, efetivas e econômicas, a saber:

2.3.3.1 Prevenção Primária: realizada antes da concepção, impedindo a

ocorrência de um defeito congênito. Exemplo: a vacinação preventiva contra

infecções como a rubéola e a hepatite B e o tratamento prévio de infecções

ambientais tais como a toxoplasmose.

2.3.3.2 Prevenção Secundária: durante o período gestacional, para evitar

malformações fetais. Exemplos: hábitos maternos que atuam diretamente sobre o

desenvolvimento como etilismo, tabagismo e uso de drogas ilícitas.

35

2.3.3.3 Prevenção Terciária: baseada no tratamento dos defeitos congênitos

após o nascimento, evitando complicações futuras e melhorando a qualidade de vida

e sobrevida da criança.

Dentre as condutas de prevenção são mundialmente relevantes: (i) evitar

gestações em mulheres acima de 40 anos (diminui em 1/3 a freqüência da Síndrome

de Down; (ii) suplementação alimentar com ácido fólico (preveni o aparecimento de

defeitos congênitos do tubo neural) (LEITE et al., 2002)

2.4 Plantas medicinais, fitoterápicos e teratógenos

A manutenção da integridade física, a procura de alívio da dor e a cura de

doenças levaram á incorporação de inúmeras espécies vegetais à medicina

tradicional (STASI, 1996). Segundo DA CUNHA (2003) e TYLER (1996) e os

primeiros relatos de uso de plantas datam dos séculos II e III antes da era Cristã.

Assim, vegetais fazem parte da vida do homem desde as primeiras civilizações e

sua importância é medida pela intensidade de seu uso.

Em 78 d.C., o botânico grego Pedonios Dioscorides descreveu aproximadamente

600 plantas com caráter medicinal, no tratado “De Materia Medica”, o qual

permaneceu como referência bibliográfica e médica por aproximadamente catorze

séculos.

No século XVI, o médico Philippus AureolusTheophrastus Bombastus von

Hohenheim, conhecido como Paracelsus (1493-1541), formulou a “teoria das

Assinaturas” a qual descreve que semelhante cura semelhante. Acreditava-se que a

forma, a cor, o sabor e o odor das plantas estavam relacionados com as suas

propriedades terapêuticas, podendo dar indícios de seu uso clínico. Algumas destas

plantas passaram a fazer parte das farmacopéias alopáticas e homeopáticas a partir

do século XIX, quando suas bases terapêuticas começaram a ser estudadas.

(ELVIN-LEWIS, 2001).

No Brasil, o registro de uso de plantas medicinais data da época de seu

descobrimento, contudo sabe-se que a população indígena já detinha o

conhecimento terapêutico das plantas oriundas da flora nacional (ELIZABETSKY e

SOUZA, 2004; REAIS et al., 2004). Embora os recursos terapêuticos fossem

36

constituídos predominantemente de plantas e extratos vegetais (SCHENKEL et al.,

2004a), muitas das plantas utilizadas como medicamento, só tiveram seu princípio

ativo conhecido a partir do fim do século XVIII, quando se iniciou o isolamento e

determinação dos seus constituintes (DA CUNHA, 2003). A partir dessa data, muito

desse conhecimento empírico passou a ser comprovado cientificamente abrindo

possibilidades para o uso de produtos vegetais como matéria prima para a síntese

de substâncias bioativas, especialmente fármacos de origem vegetal na medicina

popular (BARREIRO et al., 2004; SILVIA e RITTER, 2002).

2.4.1 A toxicidade das plantas medicinais

O potencial teratogênico de diversas plantas tem sido considerado a partir de

inúmeros relatos descrevendo efeitos tóxicos e malformações na prole de mães

tratadas experimentalmente. Esta literatura é escassa quanto aos efeitos

embriotóxicos gerados por plantas, mas amplamente explorada, quando se trata de

efeitos abortivos.

Estudo realizado por KAMBOJ (1988) mostra que das 120 plantas medicinais,

pertencentes a 54 famílias utilizadas e testadas em roedores para verificação de

atividade abortiva, apenas duas não apresentaram resultados positivos, o que

significa que mais de 50% dos animais testados tiveram a gestação interrompida.

Abaixo relacionamos parte desta literatura a título de exemplificar as relações

embriotóxicas já estudadas.

A ação de plantas como a angélica (Angelica archangelica, anti-coagulante), a

sucuúba (Himathantus sucuuba, combate à amebíase, úlcera e gastrite), o alecrim

(Rosmarinus officinales, propriedades anti-oxidantes, antifúngicas e antibacterianas),

a arnica (Arnica Montana, cicatrizante), a cânfora (Cinnamomum camphora, anti-

séptico, sedativo), o eucalipto (Eucaliptus globulus, tratamento de inflamações

pulmonares e mucosidade excessiva) e a sene (Cassia angustifolia e Cassia

acutifólia, laxativas) podem induzir aborto (ADIGÜZEL et al., 2005; PORTE e

GODOY, 2001; VEIGA JÚNIOR et al., 2005).

Ainda, estudos utilizando modelo experimental com ratas Wistar, demonstraram

que a arruda (atividade anti-hemorrágica, indicada para o tratamento de reumatismo,

37

hipertensão e verminoses, GONZALES et al., 2006), o barbatimão (atividade anti-

microbiana e antioxidante, VITRAL et al., 1987), o cambará (antipiréticos,

antimicrobianos, antimutagênicos, MELLO et al., 2005), o chapéu-de-couro

(tratamento de doenças renais, reumatismo, afecções cutâneas, TOLEDO et al.,

2004b) e o falso boldo (tratamento de problemas digestivos, ALMEIDA e

LEMONICA, 2000) também apresentam efeitos que podem ser prejudiciais à

gestante e ao concepto, tais como aborto, embriotoxicidade e malformações.

NAVARRO (2000) também demonstrou que o ipê roxo (Tabebuia sp.) e a hortelã

(Mentha piperita, distúrbios gastrintestinais, vermífugo para giardíase e amebíase,

possuem efeito teratogênico, embora ensaios-clínicos tenham confirmado a

atividade antineoplásica do ipê roxo (MATOS, 2000). Quebra-pedra (Phyllanthus

amarus) por sua vez, não pode ser utilizada durante a gravidez, pois possui

princípios ativos que atravessam a barreira placentária, podendo provocar aborto

(MATOS, 2000; MENGUE et al., 2001; SCHENKEL et al., 1985; SOUZA et al.,

2004).

Amplamente comercializada para rinite e sinusite a bucha paulista ou cabacinha

(Luffa operculata) possui substâncias denominadas cucurbi tacinhas responsáveis

por efeitos embriotóxicos e abortivos devido a hemorragia grave (MATOS, 2000;

SOUZA et al., 2004). O Ginseng (Pfaffia glomerata spreng) utilizado contra úlcera e

como calmante e hipoglicemiante podem prejudicar o desenvolvimento fetal na

medida em que causa malformações viscerais e esqueléticas (TOLEDO et al.,

2004a).

Além das plantas listadas acima, a tabela (Tab. 1) abaixo exemplifica outras

plantas medicinais que utilizadas em experimentos mostraram se embriotóxicas.

38

Tabela 1 – Relação de plantas embriotóxicas, teratogênicas e abortivas comumente utilizadas

pela população brasileira

Fonte: (Mendes, 2011)

Nome Vulgar

Nome Científico

Efeito Dosagem Período a

ser evitado Referências

Alecrim Rosmarinus of

ficinales Abortivo - -

Joly, 1993; Sartorato et al.,

2004

Angélica Angelica

archangelica Abortivo - -

Veiga Junior et al. , 2005

Arnica Arnica Montana Teratogênico

Abortivo - -

Veiga Junior et al. , 2005

Artemísia Artemísia vulgaris Teratogênico Embriotóxico

6000 mg kg-1 dia-1

Organogênese Tigno et al., 2000; Nacul et al. , 2001;

Cânfora Cinnamomum

canphora Abortivo - -

Veiga Junior et al., 2005

Cipó mil homens

Aristolochia Triangularis Cham

Abortivo Mutagênico

Carncinogênico - -

Ernest et al 1996; Nortier et al 2000

Espinheira Santa

Maytenus ilicifol ia Abortivo - Pré-implantação Jorge et al., 2004;

Montanari & Bevilacqua, 2002

Gengibre Zengiber off icinalis Abortivo 1000 mg kg-1

dia-1 11a semana gestacional

Conover, 2003

Melão de São Caetano

Mormodica Chrantia L.

Abortivo - - Gupta, 1995

Vidreira Tripterygium

Wilfordii Teratogênico Embriotóxico

50 e 100 mg kg-1 dia- 1

Origanogênese Zhang, 1992;

Chan & NG, 1995

- Rhazya stricta

Embriotóxico Teratogênico

500 a 2000 mg kg-1 dia-1

Pré implantação organogênese

Rasheed et al.,1997;

39

3 OBJETIVOS

40

3.1 Objetivo Geral

Este estudo pretende investigar a possível ação dos extratos vegetais de guaco

(Mikania glomerata Sprengel) no perfil gestacional em camundongos.

3.2 Objetivos específicos

1. Determinar os possíveis efeitos do extrato de guaco (Mikania glomerata

Sprengel) sobre parâmetros gestacionais visando determinar o(s) estágio(s) mais

sensível(s) à ação da droga.

2. Determinar no embrião/feto de mães que receberam o guaco: (a) As possíveis

alterações morfológicas que o tratamento provoca na interface materno-fetal

(placenta e decídua) ao longo da gestação; (b) Os possíveis efeitos teratogênicos

(malformações embrio-fetais) como uma forma de avaliar células/tecido-alvo da ação

do fitoterápico.

41

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Reagentes, abreviaturas e procedência:

42

Bayer (Alemanha): cetamina, cloridrato de tiazina. DAKO A/S (Denmark):

anticorpo secundário anti cabra feito em coelho. Merck KGaA (Darmstadt,

Germany): ácido acético, ácido cítrico, alizarina vermelha, eosina, etanol, etanol

benzílico, formaldeído, hematoxila de Harris, Hematoxilina de Mayer, glicerina

Histosec®, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, metanol,

peróxido de hidrogênio, reativo de schiff, sulfeto de amônio, verde metila, xilol.

Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany): kit detecção de morte celular-

fosfatase alcalina-TUNEL. Santa Cruz Biotechnology Inc. (Ca, EUA): anticorpo

primário anti Ki67 feito em cabra, anticorpo primário anti proliferina feito em cabra

Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, EUA): albumina sérica bovina (BSA), 3,3’-

diamino benzidina tetracloreto (DAB), ácido etileno diamino tetraacético (EDTA),

Fast Red/ Naphthol, paraformolaldeído, poli-L-lisina, tampão fosfato salina (PBS),

tampão Tris salina (TBS).

4.2 Comitê de Ética

Todos os procedimentos experimentais deste estudo foram realizados de acordo

com os princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

e aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ANEXO A).

4.3 Animais

Foram utilizados camundongos Mus musculus domesticus da linhagem CD1

com idade aproximada de 3 meses, mantidos no Biotério do Departamento de

Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo, sob regime de água e ração granulada ad libitum.

4.4 Acasalamento e determinação da prenhez

Para o acasalamento, ao fim de cada tarde, lotes de aproximadamente 20

fêmeas eram colocados nas gaiolas dos machos na proporção 2:1. A presença de

rolha vaginal na manha seguinte indicava o dia 0,5 de gestação (dg). Todos os

animais foram sacrificados no 19º dia de gestação

43

4.5 Material vegetal e extração

Folhas secas de Mikania glomerata Sprengel, certificadas e cedidas pelo

Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA)

foram utilizadas para o preparo do extrato vegetal hidroetanólico das amostras. O

extrato fluído hidroetanólico foi produzido na Faculdade de Ciências Farmacêuticas,

Departamento de Farmácia, sob orientação da Profa. Dra. Elfriede Bacchi,

processado em um rota-evaporador a vácuo, a 40º C para retirada do etanol e

posterior liofilização para remoção da água. O produto seco foi pesado, aliquotado

em tubos de 1 mL, em doses já predefinidas e mantido a temperatura ambiente, em

dissecador, protegido da luz e à vácuo.

4.6 Protocolo de dose e administração nos animais

De acordo com o Formulário Terapêutico Nacional, a dose de utilização diária de

guaco (Mikania glomerata Sprengel) em humanos deve ser de até 1500 mg/dia

(aproximadamente 0,03 mg/g de peso corporal)(vide bulas Herbarium, 2010).

Diversos trabalhos na literatura mostram doses diversas e efeitos fisiopatológicos de

diferentes graus em doses que variam de 0,004 mg/g a 6 mg/g de peso corporal

(ALMEIDA et al., 2006; DRIEL et al., 2002; PANDA et al., 2007; PARI et al., 2009;

PAULI et al., 1987). Muito possivelmente esta variabilidade de efeitos está associada

à concentração de determinados princípios ativos componentes da planta, que

variam de acordo com a região de plantio, qualidade da espécie, tratamento utilizado

e forma de preparo do fitoterápico.

Levando todos estes resultados em consideração, neste estudo, optou-se por

calcular as doses do fitoterápico, da seguinte forma: i) utilizando os valores de

posologia recomendados a humanos como dose terapêutica: 0,03 mg/g de peso

corporal; e valores acima deste como doses supra-terapêutica: 0,3 e 0,6 mg/g de

peso corporal (10x e 20x maiores, respectivamente). Neste contexto os valores

preconizados ainda estariam dentro do range de doses ministradas em ratos com

efeitos citotóxicos e metabólicos já conhecidos.

44

Para a administração das doses diárias, o produto seco e aliquotado foi retirado

do dissecador e diluído em água destilada estéril. Os animais foram então pesados e

selecionados (foram selecionadas as fêmeas que pesavam entre 22,5 e 30,5 g) e,

em seguida, foi realizada a administração do extrato por via oral (gavage) em um

volume total de 0,3 mL, sempre no período da manhã.

O grupo experimental e o controle continham 10 fêmeas cada. No grupo tratado,

as fêmeas receberam a quantia de 0,6, 0,3 e 0,03 mg/g de peso corporal/dia de

extrato de Mikania glomerata Sprengel (guaco) entre os dias 7 e 11 (T7-11 período

organogenético) e 14 e 18 (T14-18 período de desenvolvimento fetal e placentário)

de gestação. Os grupos controles receberam o mesmo volume de água destilada

estéril, nos mesmos dias gestacionais (veículo na qual o guaco foi dissolvido para

administração C7-11; C14-18).

4.7 Toxicidade do extrato

Como forma de avaliar a toxicidade de extrato nas fêmeas, foi realizada a

pesagem dos animais durante todo o ciclo gestacional. Os animais foram pesados

antes do acasalamento, um dia após o acasalamento, após a administração da

primeira e última dose do extrato e no dia do sacrifício.

4.8 Desempenho gestacional

Para a avaliação do desempenho gestacional, os cornos uterinos dos animais do

grupo tratado e controle foram seccionados na extensão longitudinal e, após a

retirada dos fetos, das placentas, das reabsorções tardias e ovários, colocados em

sulfeto de amônio 1% água destilada, por 10 minutos, para contagem dos sítios

iniciais de implantação e de reabsorções embrionárias precoces (SALEWSKY,

1964). As reabsorções tardias, os embriões ou fetos degenerados ou mortos e os

fetos vivos também foram contados.

As placentas, fetos e ovários foram pesados permitindo a avaliação da

interferência do extrato de Mikania glomerata Sprengel sobre o desenvolvimento

destas estruturas, também foi contado sob estéreo-microscópio, o número de corpos

lúteos nos ovários para os cálculos de índices reprodutivos. Sob estéreo

45

microscópio, os fetos foram ainda analisados para a identificação de malformações

externas e ósseas.

A partir das contagens realizadas foram calculados os seguintes índices

gestacionais apresentados como média ± desvio padrão:

a) Índice de implantação (II= nº de sítios de implantação/nº de corpos lúteos x

100)

b) Índice de mortalidade (IM = nº de fetos degenerados ou mortos/nº de sítios de

implantação x 100)

c) Índice de reabsorção (IR= nº de reabsorções/nº de corpos lúteos x 100)

d) Índice de perda embrionária antes da implantação (IPeEai = nº de corpos

lúteos - nº de sítios de implantação/nº de corpos lúteos x 100)

e) Índice de perda embrionária total (IPet = IPEai + IR + IM)

f) Índice de viabilidade embrionária (IVE = 100 – IPet)

4.9 Processamento das amostras para análise morfológica

No dia 19 de gestação, as fêmeas dos grupos experimental e controle foram

anestesiadas com dose letal de cloridrato de tiazina (Rompun®, Bayer, São Paulo) e

cetamina (1:1, v/v, Ketalar, Bayer, São Paulo) e em seguida foi realizado o

deslocamento cervical.

Imediatamente após, realizou-se laparotomia dos animais para a obtenção dos

ovários e cornos uterinos. Os cornos uterinos removidos do corpo dos animais foram

colocados em PBS gelado e dissecados sob microscopia estereoscópica para

exposição dos sítios de implantação e conseqüentemente dos fetos/restos ovulares

e respectivas placentas. Os fetos foram então sacrificados em câmara de CO2 e em

seguida contados, pesados e medidos. Também sob microscópio estereoscópico, os

fetos foram analisados para a verificação de alterações macroscópicas e

malformações congênitas.

Amostras de placentas, intestino e fetos foram subdivididas em lotes para:

a) Fixação em paraformaldeído 4% tamponado 0,1M, pH 7,4 para análise histológica

e imunohistoquímica;

b) Fixação em formaldeído 10% tamponado 0,1M, pH 7,4 para análise morfológica e

óssea.

46

Para os procedimentos histológicos e imunohistoquímicos das placentas, o

material fixado foi desidratado, diafanizado e incluído em Histosec® (Merck,

Germany). Cortes de 5 m de espessura, aderidos a lâminas histológicas por meio

de poli-L-lisina, foram: desparafinizados, hidratados e submetidos aos protocolos de

Hematoxilina e Eosina (H.E) e Ácido Periódico de Schiff (PAS) (MCMANUS e

MOWRY, 1960) e em seguida observados em microscópio de luz convencional

(Nikon Optiphot-2) acoplado a um sistema de captura de imagem (COOL PIX 5000,

Nikon, Japan). Cortes adicionais foram também obtidos para os procedimentos

imunohistoquímicos, conforme detalhado a seguir.

4.10 Imunolocalização do antígeno Ki67

Para estimar se a administração de Mikania glomerata Sprengel durante a

gestação interfere no ciclo celular das células placentárias, reações

imunohistoquímicas foram realizadas para a localização do antígeno Ki67 (expresso

em células em G1, S, G2 e M, mas não em células em G0).

Os cortes histológicos obtidos em lâminas foram:

a) desparafinizados em banhos de xilol;

b) re-hidratados em uma série de concentrações decrescentes de etanol;

c) incubados em uma solução de hidróxido de amônio 10% em etanol 95%;

d) submetidos à recuperação de sítios antigênicos por aquecimento em solução de

ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), pH 6,0 por 30 minutos em banho Maria, a

95 ºC;

e) submetidos ao bloqueio da peroxidase endógena em uma solução de metanol e

peróxido de hidrogênio (H2O2) durante 30 minutos;

f) incubados com anticorpo primário (anti-Ki67, feito em cabra, Santa Cruz, CA, USA)

durante 1 hora;

g) lavados por 10 minutos, a temperatura ambiente;

h) incubados com o anticorpo secundário biotinilado, IgG de coelho anti cabra;

i) submetidos à revelação da peroxidase com 3, 3 - diaminobenzidina (DAB), por 10

minutos;

j) lavados em solução TRIS;

k) contra-corados com Hematoxilina de Mayer por 1 minuto;

l) desidratados e, finalmente;

47

m) examinados em microscopia de luz convencional (Optiphot-2, Nikon, Japão).

4.11 Reação de TUNEL

Para avaliar se o uso de Mikania glomerata Sprengel poderia alterar as taxas de

morte programada das células placentárias, optou-se por utilizar a reação de TUNEL

e identificar células apoptóticas.

Cortes histológicos desparafinizados e reidratados (4.10 itens a a f) foram

submetidos ao resgate dos sítios antigênicos em tampão citrato de sódio 10 mM, pH

6,0 a 95ºC por 1 minuto e 5 minutos a temperatura ambiente. O bloqueio enzimático

endógeno para a fosfatase alcalina foi realizado com uma solução de ácido acético

5% em água destilada. Os procedimentos subseqüentes seguiram as indicações do

fabricante do Kit (Kit Detecção de Morte Celular, ROCHE). Os cortes foram

incubados com a enzima TdT com substrato (4:10) por 1 hora, a 37º C, lavados em

solução de TBS durante 5 minutos e incubados em solução converter durante 1

hora, a temperatura ambiente. Reações controle foram realizadas omitindo-se a

incubação com a enzima TdT. A revelação foi realizada utilizando-se o Fast

Red/Naphthol durante 10 minutos. Os cortes foram contra-corados com verde metila

0,5% em tampão acetato 0,1 M e examinados em microscopia de luz convencional

(Optiphot-2, Nikon, Japan).

4.12 Análise das regiões placentárias

A estrutura das camadas placentárias foi analisada morfologicamente com HE e

PAS e com ao auxílio da imunolocalização de proliferina, um marcador das células

de glicogênio da camada de espongiotrofoblasto (YAMAGUCHI et al., 1994;

SIMMONS et al., 2007). A imunomarcação para proliferina seguiu os mesmos

passos descritos para a imunolocalização do antígeno Ki67 (Item 4.10). Como

anticorpo primário utilizou-se IgG de cabra anti-proliferina (1:200, Santa Cruz, CA,

USA) e como secundário IgG de coelho anti cabra (1.300, KPL, cat. 074-1506).

As amostras foram examinadas em microscopia de luz convencional (Optiphot-2,

Nikon, Japão) acoplado a um sistema de captura de imagem (COOL PIX 5000,

Nikon, Japan).

48

Para a análise da área da placenta e de suas regiões foram obtidas pelo menos

2 imagens de secções transversais totais, medianas de cada placenta, coradas pelo

HE, totalizando 12 imagens por grupo experimental (n=6). As imagens foram

digitalizadas, utilizando-se uma câmara digital, acoplada a um microscópio (Zeis,

Mannheim, Ge) sempre na mesma magnitude (2,5x). A análise da área total

placentária, da área da camada juncional e da área do labirinto foi realizada nos

diferentes grupos utilizando o software Image-J (NIH, Bethesda, USA) que

possibilitou o cálculo da área através da medida do perímetro que contorna cada

região. As comparações das áreas foram realizadas pelo teste estatístico ANOVA, e

sub teste de Bonferroni com significância de 5% dentro de cada período gestacional

em relação ao controle e entre os períodos analisados.

4.13 Análise morfológica fetal

Para a análise morfológica, os fetos foram medidos e pesados em balança

analítica (Libror AEG), em seguida fixados em formalina 10% tamponada para

posterior análise macroscópica fetal e verificação de malformações congênitas.

A análise óssea fetal foi realizada seguindo-se o seguinte protocolo:

a) os fetos foram eviscerados e colocados em uma solução de hidróxido de potássio

1% diluído em água destilada por um período de 96 h para diafanização da pele e

musculatura;

b) os animais foram então colocados na mistura hidróxido de potássio 1%/alizarina

aonde permaneceram por 48 horas;

c) os fetos foram imersos em uma solução clareadora contendo álcool

benzílico/glicerina/etanol absoluto (1:2:2 v/v) (DAWSON 1926;) aonde

permaneceram até a análise óssea.

4.14 Análise Estatística

49

As diferenças entre os grupos experimentais e controle foram estatisticamente

analisadas utilizando-se o teste ANOVA, seguido do sub teste de Bonferroni.

Determinou-se como estatisticamente significativo os resultados obtidos com p<0,05.

Todos os testes foram obtidos no programa Bioestat 5.0 versão para Windows.

50

5 RESULTADOS

51

5.1 Avaliação da toxicidade do extrato

A toxicidade do extrato foi avaliada pelo ganho de peso corporal. Embora o

grupo tratado com Mikania glomerata (guaco) tenha apresentado um ganho menor

de peso tanto nos experimentos em que este foi administrado entre os dias 7 e 11

(p = 0,2060) como naqueles em que foi administrado entre os dias 14 e 18 de

gestação (p = 0,2218), estes valores não diferiram significativamente do grupo

controle (Tab. 1, Anexo A).

Tabela 2 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado em fêmeas prenhes sobre o ganho de peso corporal () entre o 1º e o 19º dia de gestação

7-11 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação; 14-18 = guaco administrado entre os dias 14 e

18 de gestação; C, controle - com administração do veículo; T, tratado; 0.6, 0.3 e 0.03: dosagem

administrada em mg/g/dia.

Fonte: (MENDES, 2011)

5.2 Avaliação do efeito da Mikania glomerata (guaco) no desempenho

gestacional e parâmetros biométricos

5.2.1 Efeitos durante o período organogenético

5.2.1.1 Desempenho gestacional

As Tabelas 3 e 4 abaixo representadas mostram os principais efeitos do guaco

sobre o desempenho gestacional durante o período organogenético (dias 7 a 11 da

gestação).

Como pode ser observada, a administração de Mikania glomerata Sprengel

durante esta fase com dosagens de 0,6 mg/g/dia, aumenta significativamente os

Grupos Experimentais

Peso corporal (1º-19º dia de gestação) C 07-11 10,66 ± 1.75 C 14-18 11.09 ± 1.81

T 07-11 0,6 09.84 ± 2.54 T 14-18 0,6 10,54 ± 2.42 T 07-11 0,3 11.13 ± 1.48 T 14-18 0,3 10,00 ± 0,96 T 07-11 0,03 11.30 ± 0,83 T 14-18 0,03 11.63 ± 1.55

52

valores referentes às reabsorções precoces (p=0,031), tardias (p=0,043) e totais

(p=0,0029) em relação ao controle. Também se observou uma diminuição relevante

no número de fetos vivos (p=0,038). Consistente com estas diferenças encontradas,

os índices de reabsorção (p=0,002), de mortalidade (p=0,0031), de perdas totais

(p=0,0024) e de viabilidade (p=0,002) também se mostraram relevantemente

diferentes em relação ao controle.

Na dose de 0,3 mg/g/dia apenas observou-se diminuição no número de fetos

vivos (p=0,03), enquanto que o grupo tratado com dose terapêutica (0,03 mg/g/dia)

apresentou diferenças estatisticamente significativas apenas em relação ao número

de reabsorções tardias (p=0,005).

Tabela 3: Efeito da administração do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 7 e 11 da gestação (n=10) sobre parâmetros gestacionais

Os dados apresentados representam a média ± desvio padrão. 7-11 = guaco administrado entre os dias 7 e 11

de gestação; dosagem 0,6 mg/g/dia; 7-11 0,3 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação na

dosagem de 0,3 mg/g/dia; 7-11 0,03 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação na dosagem de

0,03 mg/g/dia. C, controle; T, tratado. a, diferenças significativas em relação ao controle (p<0,05)


Tabela 4: Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata, administrado entre os dias 7 e 11 da gestação (n=10). Índices gestacionais.

Grupos Copos lúteos

Sítios de implantação

Reabsorção precoce

Reabsorção tardia

Total reabsorção

Fetos mortos

Fetos vivos

C 7-11 11,7± 1,56 11,7± 1,56 1± 0,66 0± 0 1± 0,66 0± 0 10,7± 1,33

T 7-11 0,6

12,2± 1,39 12,2± 1,39 2,3± 1,63a 0,4± 0,69

a 2,7± 1,41

a 0,5± 0,97 9± 2,00

a

T 7-11 0,3

10,3± 1,39 10,3± 1,39 1± 1,63 0,3± 0,69 1,3± 1,41 0,3± 0,97 8,7±2,40a

T 7-11 0,03

11,9±1,17 11,9± 1,17 0,8± 0,63 0,8± 0,73 a 1,6± 0,84 0 ± 0 10,3± 0,73


IR IM IPEt IV

C 07-11 8,3± 5,4 0,0± 0,0 8,3± 5,4 91,7±5,4

T 07-11 0,6 21,8± 10,6a 4,2± 8,1

b 26,0± 15,0

a 74,0±15,0

a

T 07-11 0,3 13,6± 15,4 2,7± 6,1 16,3± 16,4 83,7±16,4

T 07-11 0,03 13,1± 5,7 0,0± 0,0 13,1± 5,7 86,9± 5,7

53

Os dados apresentados representam a média ± desvio padrão. 7-11 0,6 = guaco administrado entre os dias 7 e

11 de gestação na dosagem de 0,6 mg/g/dia; 7-11 0,3 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação

na dosagem 0,3 mg/g/dia; 7-11 0,03 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação na dosagem de

0,03 mg/g/dia; C, controle; T, tratado. Letras sobre-escritas representam diferenças significativas em relação ao

respectivo controle onde em a, p< 0,05, e b, p< 0,001. IR, índice de reabsorção; IM, Índice de mortalidade,

IPEt, Índice de perda embrionária total, IV, Índice de viabilidade.


5.2.1.2 Parâmetros biométricos

Em relação ao peso obtido para os ovários, placentas e fetos, apenas os referentes aos

pesos dos fetos (p<0,05) e placentas (p<0,001) do grupo tratado 0,6 mg/g/dia diferiram

significativamente do grupo controle. Apesar do peso menor os fetos não apresentaram

diferenças significativas quanto aos seus comprimentos (Tab. 5).

Já nos fetos de mães tratadas com doses de 0,3 e 0,03 mg/g/dia, o comprimento fetal

mostrou-se significativamente reduzido em relação ao controle, porém sem interferir com o peso

fetal (Tab. 5).

Tabela 5 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 7 e 11 de gestação (n=10).

Os dados apresentados representam a média ± desvio padrão. 77-11 0,6 = guaco administrado entre

os dias 7 e 11 de gestação na dosagem de 0,6 mg/g/dia; 7-11 0,3 = guaco administrado entre os dias

7 e 11 de gestação na dosagem de 0,3 mg/g/dia; 7-11 0,03 = guaco administrado entre os dias 7 e 11

de gestação na dosagem de 0,03 mg/g/dia; C, controle; T, tratado. Letras sobre-escritas representam

diferenças significativas em relação ao respectivo controle onde em a, p<0,05, e b, p<0,001.



Peso ovários (g)

Peso placentas (g)

Peso fetos (g)

Comprimento fetos (cm)

C 07-11 0,01 ± 0,005 0,16± 0,01 1.20±0,20 2.82± 0,39

T 07-11 0,6

0,01 ± 0,005 0,12±0,01b 0,98± 0,14

a 2.56± 0,50

T 07-11 0,3

0,01 ± 0,004 0,15± 0,04 1.23± 0,21 2.22± 0,56 a

T 07-11 0,03

0,01 ± 0,003 0,14± 0,02 1.30± 0,10 2.29± 0,12 a

54

5.2.1.3 Malformações e anomalias

Os fetos fixados em formalina foram analisados, sob microscópio estereoscópico,

para a presença de anomalias ou malformações externas ou internas. A malformação

mais freqüente no grupo tratado 0,6 mg/g/dia foi a restrição no crescimento intra-

uterino (Fig. 1A), seguida por ossificação incompleta cranial (Fig. 1E) e hemorragia

(Fig. 1C). Em apenas um dos fetos tratados ocorreu a presença de malformações

Índices gestacionais associadas (hemorragia subcutânea, exoftalmia e agenesia

bucal, Figs. 1B-D). Também chamou a atenção a alta freqüência de fetos

degenerados presentes no grupo tratado (Tab. 6).

FIGURA 1 –Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 7 e 11 de gestação sob a anatomia fetal.

Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0.6 mg/g/dia, por gavagem) administrado entre

os dias 7 e 11 de gestação. (A) Restrição crescimento intra-uterino; (B) Exoftalmia; (C) Hemorragia

subcutânea; (D) Agenesia bucal. Note ainda as diferenças entre o grau de ossificação craniana entre

um feto controle (E) e um tratado com guaco (F).Fonte: (Mendes, 2011)

55

Os grupos tratados 0,3 e 0,03 mg/g/dia, não apresentaram aumento significativo

de malformações. A ossificação incompleta cranial, principal problema encontrado

em doses mais altas do guaco estava presente em proporções semelhantes às

observadas no grupo controle, o que corrobora o uso de dosagens terapêuticas

deste fitoterápico.

Tabela 6 – Frequência de malformações congênitas e anomalias nos grupos tratados com extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 7 e 11 de gestação.

7-11 0,6 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação; dosagem 0,6 mg/g/dia; 7-11 0,3 = guaco

administrado entre os dias 7 e 11 de gestação na dosagem de 0,3 mg/g/dia; 7-11 0,03 = guaco

administrado entre os dias 7 e 11 de gestação na dosagem de 0,03 mg/g/dia. C, controle; 7-11 = guaco

administrado entre os dias 7 e 11 de gestação.


A análise fetal também incluiu a contagem dos centros fetais de ossificação. Em

relação a este parâmetro nota-se apenas que a falta de ossificação dos metacarpos

e metatarsos no grupo tratado com 0,6 mg de guaco foi discretamente mais

frequente do que no grupo controle.

C 7-11 (%) T 7-11 0,6

(%) T 7-11

0,3 (%) T 7-11

0,03 (%)

Total de fetos examinados 107 95 103 119 Normal 99 (92%) 67 (70%) 90 (87%) 109 (91%)

Ossificação incompleta cranial 8 24 13 10 Acrânia 0 2 0 0 Protrusão lingual 0 1 0 0 Imobilidade de membros 0 1 0 0 Exoftalmia 0 1 0 0 Agenesia bucal 0 1 0 0

Tabela 7 – Número de centros de ossificação identificados pela alizarina vermelha nos fetos controle e que receberam o extrato hidroetanólico de Mikania glomerata entre os dias 7 e 11 da gestação.

Metatarso Metacarpo Costelas Vértebras lombares

Vértebras Caudais

Esterno

Controle N 05 (26) 04 (28) 13 (28) 06 (28) 05 (26) 06 (28)

A

03 (02) 04 (01)

03 (01)

Tratado N 05 (29) 04 (30) 13 (31) 06(31) 05 (30) 06 (31)

0,6 mg/g/dia A 04 (02) 03 (01) 04 (01)

Tratado N 05 (27) 04 (30) 13 (30) 06(30) 05 (28) 06 (30)

0,3 mg/g/dia A 04 (03) 04 (02)

Tratado N 05 (27)

0,03 mg/g/dia A

04 (01) 04 (28) 13 (28) 06 (28) 05 (27) 04 (01)

06 (30)

Os valores representam o número de centros de ossificação; o valor entre parênteses corresponde ao

número de animais analisados. (N) valores considerados normais; (A) valores alterados em relação ao

considerado normal


5.3 Avaliação do efeito do guaco administrado durante o desenvolvimento

fetal

5.3.1 Desempenho gestacional

As tabelas 8 e 9, demonstram o efeito causado pela administração de

Mikania glomerata (0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia, por gavage) entre os dias 14 e 18 da

gestação.

O grupo tratado com 0,6 mg/g/dia de guaco apresentou um relevante

aumento no número de reabsorções precoces (p=0,04) e totais (p=0,03) e no

número de fetos nascidos mortos (p=0,005) em relação ao grupo controle.

Paralelamente, houve um aumento significativo nos índices de reabsorção

(p=0,03), de mortalidade (p=0,004), perdas embrionárias totais (p=0,004) e

diminuição na viabilidade (p=0,004) em relação aos controles.

O grupo tratado com 0,3 mg/g/dia de guaco também apresentou uma

relevante diminuição no número de corpos lúteos e sítios de implantação

(p=0,01), também houve um notável aumento no número de reabsorções

precoces (p=0,04), reabsorções tardia (p=0,01), reabsorções totais (p=0,002),

57

concomitantemente também, houve um aumento nos índices de reabsorção

(p=0,03), mortalidade (p=0,005), perdas embrionárias totais (p=0,005) e uma

diminuição no índice de viabilidade (p=0,005). O grupo em que a dose terapêutica

de guaco foi utilizada (0,03 mg/g/dia) não apresentou diferenças significativas em

nenhum dos aspectos analisados.

Tabela 8 - Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata, administrado entre os dias 14 e 18 da gestação. Parâmetros gestacionais (n=10)

Os dados apresentados representam a média ± desvio padrão. 14-18 0,6 = guaco administrado entre os

dias 14 e 18 de gestação na dosagem de 0,6 mg/g/dia; 14-18 0,3 = guaco administrado entre os dias 14 e

18 de gestação na dosagem de 0,3 mg/g/dia; 14-18 0,03 = guaco administrado entre os dias 14-18 de

gestação na dosagem de 0,03 mg/g/dia; C, controle; T, tratado. Letras sobre-escritas representam

diferenças significativas em relação ao respectivo controle onde em a, p<0,05.


Tabela 9 - Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 14 e 18 da gestação. Desempenho gestacional (n=10)


os dias 14 e 18 de gestação na dosagem de 0,6 mg/g/dia; 14-18 0,3 = guaco administrado entre os

dias 14 e 18 de gestação na dosagem de 0,3 mg/g/dia; 14-18 0,03 = guaco administrado entre os dias

14-18 de gestação na dosagem de 0,03 mg/g/dia; C, controle; T, tratado. Letras sobre-escritas

representam diferenças significativas em relação ao respectivo controle onde em a, p<0,05, e b,

p<0,01,=. IR, índice de reabsorção; IM, Índice de mortalidade, IPEt, Índice de perda embrionária total,

IV, Índice de viabilidade.



Copos lúteos


Reabsorção precoce

Reabsorção tardia

Total reabsorção

Fetos mortos

Fetos vivos

C14-18 12,1±1,52 12,1±1,52 0,80±1,03 0,00± 0,00 0,80±1,03 0,00± 0,0 11,3±1,42

T14-18 0,6 12,6± 2,17 12,6± 2,17 1,80± 1,22a 0,10± 0,31 1,90± 1,28

a 1,1± 1,1

a 9,60±3,83

T14-18 0,3 9,60± 2,55 9,60± 2,55

a 1,70± 0,95

a 0,60± 0,70

a 2,30± 0,95

a 0,2± 0,63 8,91±3,25

T14-18 0,03 12,9± 1,45 12,9± 1,45 0,90± 0,88 0,30± 0,48 1,20± 1,18 0,3± 0,67 12,6±1,90


IR IM IPEt IV

C14-18 6.2± 8.0 0,0± 0,0 6.2± 8.0 93.8± 8.0

T14-18 0,6 17.2± 14.3a 9.5± 9.3

b 26.7± 20,7

b 73.3± 20,7

b

T14-18 0,3 27.2±16.3 a 2.5± 7.9

a 29.7± 20,7

a 70,3± 15.7

a

T14-18 0,03 9.1± 7.1 2.7± 5.8 11.8± 5.5 88.2± 5.5

58

5.3.2 Parâmetros biométricos

A administração de 0,6 mg de guaco entre os dias 14 e 18 da gestação levou

a uma significativa diminuição no peso fetal (p=0,014) e placentário (p=0,034) em

relação ao grupo controle (Tab. 10).

Já o grupo tratado com 0,3 mg/g/dia apresentou apenas uma significativa

diminuição no comprimento fetal (p<0,001) enquanto que a dose de 0,03 mostrou

diminuição no peso placentário (p=0,005) e no comprimento fetal (p=0,009).

Tabela 10 – Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (T mg/g/dia, por gavagem), administrado entre os dias 14 e 18 da gestação. Parâmetros biométricos.


os dias 14 e 18 de gestação na dosagem de 0,6 mg/g/dia; 14-18 0,3 = guaco administrado entre os

dias 14 e 18 de gestação na dosagem de 0,3 mg/g/dia; 14-18 0,03 = guaco administrado entre os dias

14-18 de gestação na dosagem de 0,03 mg/g/dia; C, controle; T, tratado. Letras sobre-escritas

representam diferenças significativas em relação ao respectivo controle onde em a, p<0,05 e b,

p<0,001.


5.3.3 Malformações e anomalias

Dentre as malformações e anomalias observadas nos fetos decorrentes do

grupo 0,6 mg/g/dia (Tab. 10), as que apresentaram maior freqüência com a

administração de guaco entre os dias 14 e 18 da gestação foram: fetos

degenerados (Fig. 2A), protrusão lingual (Fig. 2C) e acrânia (Fig. 2C), além de

restrição de crescimento uterino.


Peso ovários Peso placentas Peso fetos Comprimento

fetos

C14-18 0,01± 0,005 0,17± 0,04 1.16±0,07 2.37± 0,16

T14-18 0,6 0,01± 0,004 0,13± 0,03a 1.06± 0,17

a 2.04± 0,34

a

T14-18 0,3 0,01± 0,004 0,16± 0,02 1.12± 0,09 1.99± 0,07

b

T14-18 0,03 0,01± 0,005 0,12± 0,01a 1.31± 0,07 2.14± 0,07

a

59

Com relação aos centros de ossificação, podemos notar que apenas a

freqüência de metacarpos do grupo tratado encontra-se alterada em relação ao

controle (Tab. 11).

60

FIGURA 2 - Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0,6 mg/g/dia, por gavage), administrado entre os dias 14 e 18 da gestação.

(A) Feto degenerado; (B) Protrusão lingual; (C) Acrânia (feto ao lado direito de um feto-controle).

Tabela 11 - Freqüência de malformações congênitas e anomalias nos grupos tratados com extrato hidroetanólico de Mikania glomerata administrado entre os dias 14 e 18 da gestação.

14-18 0,6 = guaco administrado entre os dias 14 e 18 de gestação na dosagem de 0,6 mg/g/dia; 14-

18 0,3 = guaco administrado entre os dias 14 e 18 de gestação na dosagem de 0,3 mg/g/dia; 14-18

0,03 = guaco administrado entre os dias 14-18 de gestação na dosagem de 0,03 mg/g/dia; C,

controle; T, tratado.


C14-18

(%) T14-18 0,6

(%) T14-18 0,3

(%) T14-18 0,03

(%)

Total de fetos examinados 111 107 96 129 Normal 92 (83%) 57 (54%) 84 (88%) 116 (89%) Ossificação incompleta cranial 19 50 11 13 Acrania 0 3 1 0 Protrusão lingual 0 3 0 0

B

A

61

Tabela 12 – Número de centros de ossificação identificados pela alizarina vermelha nos fetos que receberam ou não o extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (T mg/g/dia, por gavage) entre os dias 14 e 18 de gestação.

Metatarso Metacarpo Costelas Vértebras lombares

Vértebras Caudais

Esterno

Controle N 05 (32) 04 (28) 13 (35) 06 (35) 05 (35) 06 (35)

A

04 (03) 03 (07)

Tratado N 05 (11) 04 (21) 13 (27) 06 (27) 05 (27) 06 (27)

0,6 mg/g/dia A

04 (09) 03 (07)

03 (06)

Tratado N 05 (27) 04 (28) 13 (28) 06 (28) 05 (28) 06 (28)

0,3 mg/g/dia A 04 (01)

Tratado N 05 (27) 04 (30) 12 (30) 06 (30) 05 (30) 06 (30)

0,03 mg/g/dia A 04 (03)

Os valores representam o número de centros de ossificação; o valor entre parênteses corresponde ao

número de animais analisados. (N) valores considerados normais; (A) valores alterados em relação ao

considerado normal


Os principais dados obtidos nesta etapa deste estudo encontram-se

sumarizadas na Tabela 13 abaixo relacionada.

Tabela 13: Resumo dos dados obtidos dos estudos nas dosagens 0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia de Mykania glomerata, administrados durante o 7 ao 11 e 14 ao 18 dia de gestação.

Administração do fitoterápico

Período organogenético

Período de desenvolvimento fetal

Dias 7 a 11 de gestação Dias 14 a 18 de gestação

Dose (mg/g /dia) 0,6 0,3 0,03 0,6 0,3 0,03 Perdas fetais totais (~3>) (~4>) (~4>)

Índice de mortalidade (~3>) (~4>) (~5>) Peso placenta Peso fetal Comprimento do feto Ossificação craniana incompleta

~ 4> ~ 3>

Centros de ossificação *1

*1 número de metacarpos anômalos ; Fonte: (Mendes, 2011)

62

5.4 Avaliação do efeito da Mikania glomerata (guaco) sobre a placenta

5.4.1 Análise morfológica grupo tratado com 0,6 mg de guaco

A análise das placentas de 19º dia de gestação de fetos que receberam ou

não guaco entre os dias 7-11 e 14-18 de gestação foram analisadas sob

microscopia de luz convencional. Todas as placentas analisadas apresentaram

todas as camadas peculiares a placentas maduras, ou seja: zona juncional e

labiríntica. Independente do grupo experimental a zona juncional continha sempre

células trofoblásticas gigantes associadas entre si por meio de seus

prolongamentos e células do espongiotrofoblasto, com citoplasma basófilo ou com

acúmulo de glicogênio. Na região labiríntica, a barreira placentária separa o

sangue materno do fetal por meio de camadas de células trofoblásticas e

endotélio fetal (barreira hemotricorial).

A análise histológica também mostrou diferenças entre as placentas de mães

tratadas com 0,6 e 0,3 mg de guaco e as de fêmeas-controles ou tratadas com

doses terapêuticas. Estas placentas mostraram um aparente aumento na

quantidade de células de glicogênio e de células basófilas; este aumento pareceu

ser responsável pelo aumento da camada juncional como um todo (Figurass. 3-

4). Por outro lado, estas células também invadiam áreas relativamente extensas

da camada labiríntica (Figura. 4), que se mostrava menos exuberante do que a

observada nas placentas das fêmeas-controle. Embora esta característica tenha

sido encontrada também quando o guaco foi administrado na fase de

desenvolvimento fetal, ela foi mais evidente na análise morfológica no grupo

experimental que recebeu o guaco na fase organogenética (Figura. 3).

63

Figura 3: Placentas de fêmeas-controle (A) e tratadas (B-F) com Mikania glomerata nas doses de (B) 0,03, (C) 0,3 e (D-F) 0,6 mg/g/dia, por gavagem, durante os dias 7 e 14 de gestação.

Comparando as imagens A-D (25x), notar a maior espessura da zona juncional (zj) e o adelgaçamento do

labirinto (L) na placenta do grupo tratado com 0,6 mg de guaco. Notar também as projeções de

espongiotrofoblasto (cabeça de setas) aproximando-se da base da placenta. Em maior magnitude (E, 160x;

F, 320x), observam-se as células de glicogênio (g) entremeadas por células não glicogênicas do

espongiotrofoblasto (*), fortemente coradas pela proliferina (F, imunohistoquímica, peroxidase, coloração

marrom). (demais preparados foram corados pela HE).


64

Figura 4. Preparados histológicos de placentas de camundongo aos 19 dias de gestação de fêmeas tratadas e controle com o extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0,6 mg/g/dia, por gavagem) entre os dias 7 e 11 da gestação durante o período organogenético.

Preparados histológicos de placentas de camundongo aos 19 dias de gestação de fêmeas tratadas (B-C) ou não (A) com o extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0,6 mg/g/dia, por gavage) entre os dias 7 e 11 da gestação durante o período organogenético. A coloração PAS evidencia os depósitos de glicogênio placentário e os acúmulos de células do espongiotrofoblasto; g, células de glicogênio; b, células basófilas invadindo profundamente a camada labiríntica (L) na amostra do grupo tratado. O espaço sanguíneo indicado por asterisco em B e em maior aumento em C (ss) mostra-se completamente revestido por células do espongiotrofoblasto (G, B) PAS+. A, B, 100X; C, 200X. Fonte: (Mendes, 2011)

5.4.2 Análise morfométrica

A análise morfométrica corroborou os achados morfológicos mostrando um

significativo aumento da área da camada juncional nos grupos que receberam o

guaco nas doses de 0,3 (p<0,01) e 0,6 mg (p<0,001) tanto quando administrada

no período organogenético quanto quando administrada no período de

desenvolvimento fetal (p<0,001). A área da camada labiríntica mostrou-se

relevantemente menor nos grupos que receberam 0,6 mg de guaco/peso

corporal/dia (Tabela 14). A apresentação destes valores em porcentagem

conforme mostra a Figura 5, evidencia claramente a diferença de área das

camadas que constituem a placenta.

65

Tabela 14 - Efeito da Mykania glomerata administrada durante o período organogenético e de desenvolvimento fetal nas dosagens 0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia, na área total da placenta e na área das regiões juncional e do labirinto.

Administração do fitoterápico Período organogenético Dias 7 a 11 de gestação

Período de desenvolvimento fetal Dias 14 a 18 de gestação

Dose (mg/g /dia) 0 0,03 0,3 0,6 0 0,03 0,3 0,6

Área total placenta x 106 m

2

DP

10,2 0,65

9,94 2,76

10,54 1,34

9,82 0,66

10,4 1,03

10,31 0,75

10,96 0,63

9,77 0,62

Área espongiotrofoblasto x

106 m

2 DP

4,34 0,76

4,24 0,79

5,47 0,57

a

5,54 0,77

b

3,88 0,68

4,71 0,86

5,67 0,56

b

5,70 0,54

b

Média da Área

Labirinto

x 106 m

2 DP

5,78 0,98

6,55 0,70

5,84 0,96

4,18 0,36b

6,24 1,19

5,66 0,95

5,80 0,41

3,94 0,23

b

ap≤0,01;

bp≤0,001, DP desvio padrão


Figura 5. Efeito da Mykania glomerata administrada durante o período organogenético e de desenvolvimento fetal nas dosagens 0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia, na área da região juncional e labiríntica.

C: controle; 0.6, 0.3 e 0.03 – animais tratados mg/g/dia.


66

5.4.3 Avaliação das taxas de morte celular por apoptose

A reação de TUNEL utilizada para identificar células apoptóticas mostrou

positividade em células das duas camadas placentárias, com uma discreta

prevalência nas células do espongiotrofoblasto tanto nas placentas de fêmeas

tratadas com guaco, como nas controle que receberam apenas o veículo (Figura.

6A-D). Esta marcação, entretanto, foi mais evidente nas placentas de fêmeas

que receberam o fitoterápico nas doses supra-terapêuticas (Fig. 6E-H). Reações

controle, em que a enzima TdT foi omitida não mostraram qualquer núcleo

marcado (dado não mostrado).

Figura 6. Reação de TUNEL em placentas tratadas com extrato de Mikania glomerata e controle

Notar a presença de células reativas (setas, núcleos em vermelho) na camada juncional (A-C, zj) e

labiríntica (D, L) em preparados do grupo controle (A-D). Em amostras de animais que receberam guaco

na dose de 0,6 mg (E-H) no período organogenético (E, G-H) e de desenvolvimento fetal (F), a

reatividade nas camadas juncional (zj) e labiríntica (L) é mais intensa. (g) células de glicogênio.

Aumentos: A,E-F 25x; B, D, G 100x; C, H 200x.Fonte: (Mendes, 2011)

67

5.4.4 Análise do ciclo celular

A imunolocalização do antígeno Ki67 utilizado como indicador de células

que estão ciclando (células que não estão em G0), mostrou células reativas tanto

nas placentas de fêmeas tratadas com guaco, como nas do grupo controle. Esta

marcação pareceu, entretanto, mapear as placentas de ambos os grupos de

forma específica. Nas placentas controle a reatividade foi muito mais evidente no

labirinto do que na zona juncional (Figura. 7A). Nas placentas do grupo tratado

com as doses supra-terapêuticas (0,6 e 0,3 mg), a camada juncional mostrou-se

acentuadamente marcada, tanto nas células de glicogênio, como nas células

basófilas (Figura. 7C-D). Em ambos os grupos, na base da placenta em contato

com o âmnio, região denominada de placa coriônica, houve intensa reatividade ao

antígeno (Figura. 7A-C).

Figura 7. Imunolocalização do antígeno Ki67.

Notar que na placenta do grupo controle (A-B) a reatividade prevalece na região do labirinto (L), cujos

limites com o espongio-trofoblasto (et) estão indicados pela flecha. Em B, destaque da região da placa

coriônica. Na placenta do grupo tratado com 0,6 mg de guaco (C-D), notar que a reatividade é intensa no

espongiotrofoblasto (et) além da placa coriônica (setas). (g) células de glicogênio; (d) decídua. A, C 100x;

B, D 200x.


68

6 Discussão

69

O uso popular de Mikania glomerata Sprengel para o tratamento de

doenças respiratórias e/ou inflamatórias, em inúmeras regiões e por diferentes

culturas, não está embasado em qualquer estudo científico sobre sua possível

ação na gestação e também seus possíveis efeitos teratogênicos nos fetos. Desta

forma, numa tentativa de elucidar se este fitoterápico pode ser seguramente

administrado durante a gestação, se existe um período mais sensível a uma

possível ação deletéria ou ainda, se esta droga pode acarretar alterações

relevantes na morfologia placentária ou estrutura fetal, este estudo utilizou extrato

liofilizado de M. glomerata e administrou em fêmeas prenhes durante dois

períodos críticos gestacionais: período organogenético (do dia 7 a 11 de

gestação) e período de crescimento fetal (14 a 18 de gestação).

Os resultados obtidos foram baseados em doses terapêuticas (0,03

mg/g de peso corporal/dia) e supra-terapêuticas (0,6 e 0,3 mg/g de peso corporal/

dia). As dosagens foram calculadas tendo-se por base bulas medicamentosas e

bibliografias relacionadas ao consumo Mikania glomerata Sprengel (BRIGHETTI

et al., 2005; MAIORANO et al., 2005; SÁ et al., 2006; PANDA et al., 2007).

Apesar das doses supra-terapêuticas utilizadas neste estudo serem 10

e 20 vezes maiores do que a dose terapêutica usual, não se observou

mortalidade materna. Além disto, não foram observadas alterações

comportamentais nas atividades dos animais (tais como irritabilidade, resposta ao

toque, tônus do corpo, tremores, convulsões, pilo-ereção, etc.) de modo que os

rituais de acasalamento e manejo seguiram sem qualquer destaque. O ganho de

peso corporal das fêmeas durante o tratamento também não mostrou alterações

significativas em nenhuma das dosagens administradas que indicasse efeito

tóxico por parte do extrato sobre o organismo materno.

No entanto, a presença de guaco no organismo materno nas doses

supra-terapêuticas mostra claramente uma interferência no desempenho

gestacional; de modo geral as perdas fetais foram 3 a 5 vezes maiores nos

animais tratados. Mais do que isto, no período de desenvolvimento gestacional

houve um efeito muito mais pungente na medida em que ambas as doses supra-

terapêuticas (0,6 e 0,3 mg) causaram perdas fetais significantes. Além disto, em

comparação com a administração da droga no período organogenético quando

somente a dose mais alta do fitoterápico levou a perdas significativas fetais, fica

evidente a maior susceptibilidade à droga nas fases mais avançadas do

70

desenvolvimento, ao contrário do observado para a maioria dos teratógenos em

geral.

Ainda vale a pena ressaltar que o fator preponderante que contribui

para as altas taxas de perdas fetais é dado pelas reabsorções e não por fetos

recém mortos, no momento da análise. Este achado parece implicar em uma ação

mais imediata do fitoterápico sobre a gestação, o que culmina com a observação

de fetos mortos com sinais de morte precoce. Qualquer que seja a ação do guaco

sobre a fisiologia gestacional, entretanto, deve ser suficiente forte para provocar a

morte em cerca de 30% da prole. As causas possíveis da interferência do

guaco na progressão gestacional podem estar diretamente relacionadas à ação

de alguns de seus componentes.

O guaco é constituído principalmente por flavonóides, cumarinas e taninos

(OLIVEIRA et al., 1984; FIERRO et al., 1999; VENEZIANI e OLIVEIRA 1999),

componentes estes que podem desencadear reações adversas diretamente sobre

a sobrevida do concepto ou sobre as condições maternas que sustentam a

gestação.

O principal componente encontrado no guaco é a cumarina, a qual tem sido

atribuída funções específicas do fitoterápico (LEITE et al., 1993; REHDER et al.,

1998; SOARES DE MOURA et al., 2002). Estudos prévios mostraram que como

agente farmacológico este composto tem uma atividade tóxica sobre o tecido

hepático em ratos (BORN et al., 2000) e apresenta atividade contraceptiva em

ratas (ULUBEEN et al., 1994). Além disto, associado ao uso de guaco também foi

já relatado aumento nas taxas de aborto espontâneo, natimortalidade e

hemorragias (O’REILLY, 1980; HALL et al., 1980; HOWE et al., 1992; BRIGS et

al., 1994; PAULI et al., 1993; ABRAHAM et al., 2011). Estas atividades biológicas

da cumarina podem, sem dúvida, explicar o aumento das taxas de perdas

gestacionais encontradas neste estudo.

Braun (1999) e Salazar (2001) relataram que o uso de cumarina e derivados

cumarínicos durante a gestação pode aumentar em 26% o risco de perdas

embrio-fetais. O aumento na incidência de perdas fetais foi atribuído a problemas

de coagulação no feto, já que a cumarina e seus derivados são capazes de

atravessar a barreira placentária, alcançando o sistema circulatório fetal

(SALAZAR ; IZAGUIRRE, 2001). Na hipótese levantada pelos autores, a

71

imaturidade organogenética e a incapacidade de metabolização do composto pelo

organismo fetal contribuiriam para a ação tóxica da cumarina.

A cumarina é um produto vegetal natural amplamente utilizado como aditivo

de perfume em diversos produtos (OPDYKE, 1974; COHEN, 1979) e que

combinada com a cimetidina foi utilizada em ensaios clínicos para o tratamento de

melanoma maligno, metastático de células renais carcinoma (MARSHALL et al.

1994), e carcinoma da próstata (MOHLER et al., 1994). Também já foi utilizada

como aditivo alimentar, prática esta interrompida devido a hepatotoxicidade

(HAZLETON et al, 1956; HAGAN et al, 1967). Estudos recentes indicam que são

necessárias doses elevadas para produzir hepatotoxicidade em ratos (LAKE,

1984; LAKE et al, 1989). Ativação metabólica de cumarina parece estar envolvida

na formação da cumarina 3,4-epóxido reativa (COHEN, 1979; FENTEM ; FRY,

1993; LAKE, 1984) que pode causar necrose celular / apoptose observada em

estudos histológicos. Por outro lado, a formação de monohidroxido e dihidroxido

de cumarina leva a desintoxicação deste composto (GU et al, 1997). Neste

contexto, assim como sugerido em outros modelos é possível que a toxicidade

fetal e não materna possa estar associada a diferenças nas taxas de depuração

sistémica deste composto pelo organismo fetal e ainda imaturo em relação ao

materno, capaz de detoxicá-lo (ZHUO et al., 1999).

Além disto, é possível que a ação anticoagulante da cumarina tenha também

um papel nas perdas embrio-fetais encontradas e, neste caso certamente

dependente não só da capacidade de metabolização pelo organismo, mas

também da concentração e níveis de fatores disponíveis da via de coagulação, já

que este composto está diretamente relacionada à cascata de coagulação

(HOULT et al.; 1996). A cumarina inibe a coagulação sanguínea por inibir as

reações de carboxilação dependentes de vitamina K necessárias para a função

da trombina e fatores VII, IX e X. Antagonistas da vitamina K por outro lado são

conhecidos por atuar como teratógenos. Em um estudo observacional,

prospectivo comparou–se 666 mulheres grávidas expostas a anti-coagulantes

entre os quais derivados cumarinicos a um grupo controle não exposto (n =

1.094). Os principais resultados medidos foram embriopatia e defeitos congênitos

associada a cumarina, taxa de aborto espontâneo, peso ao nascer e

prematuridade. A taxa de defeitos congênitos após a exposição no primeiro

72

trimestre gestacional foi significativamente maior assim como as taxas de

prematuridade (16,0% vs 7,6%) e de aborto (42% vs 14%), além do menor peso

de nascimento de bebês nascidos a termo (3.166 g vs . 3.411 g, p <0,001). Os

autores concluiram que estas drogas durante a gravidez aumentam o risco de

defeitos estruturais e de adversidades durante a gravidez, embora o risco de

embriopatia associada a cumarina tenha sido baixo quando a terapia era

realizada durante o 1º trimestre (SCHAEFER et al., 2006).

Além da cumarina, não se pode deixar de lado a presença de flavonóides

e taninos como possíveis agentes desencadeadores de perdas fetais e nosso

estudo. Em geral, os flavonóides são utilizados como tratamento para ameaça de

aborto associado com sangramento devido a suas atividades como microbicida,

antiinflamatório e bloqueador de coagulação sanguínea (KANDASWAMI, 1993). No

entanto, pode se pensar também que associada a sua ação sobre a coagulação

sanguínea também age como anti proliferativo (CHOI et al., 2009; HAGEMAN et

al., 2009; ZHU et al., 2009), o que é um fator importante a ser considerado no

crescimento placentário e fetal. Segundo Schröder-van der Elst (1998), flavonas

podem cruzar a placenta e entrar em contato com os tecidos fetais; ainda, em

seus estudos o autor mostrou que a concentração destes compostos é maior no

tecido fetal do que no materno.

Em relação aos taninos, Melo e colaboradores (2008) observaram que

estes compostos são capazes de alterar o perfil de glóbulos brancos, causando

leucopenia, o que também pode ser um fator relevante a ser considerado em

relação às perdas fetais. Equinos e bovinos que consomem Tillandsia usneoides

L durante a gestação, rica em compostos como tanino, cumarina, flavonóides e

saponinas apresentam altos índices de aborto fetal (FRACARO et al., 2004).

Neste contexto ainda, é possível que a perda gestacional possa estar

relacionada ao efeito sinérgico destes componentes. Em face do observado neste

estudo, estudos mecanísticos associados a cada um dos compostos do guaco se

justificam na busca de preservar o sucesso gestacional.

Em relação aos índices biométricos analisados, peso placentário e peso e

comprimento fetal também se notou diferenças importantes. O guaco utilizado na

dose supra-terapêutica de 0,6 mg/g/dia restringiu o peso fetal e da placenta em

ambos os períodos estudados, o que significa que é capaz de interferir com o

73

desenvolvimento embrionário/fetal e placentário. Por outro lado, ao analisarmos

as relações feto/placenta observamos um aumento de 7,5 para 8,1 no período

organogenético e de 6,8 para 8.1 no de desenvolvimento fetal [controle vs.

tratado] mostrando que na presença de guaco, o crescimento placentário parece

ter sido mais vulnerável do que o crescimento fetal. O guaco administrado na fase

organogenética pareceu interferir no peso fetal mas não no comprimento total do

corpo sugerindo que os eixos corporais não foram alterados, mas sim a massa

total fetal. Já no período de desenvolvimento fetal a administração de guaco levou

a uma evidente restrição de crescimento intra-uterino, onde peso e comprimento

fetal estão comprometidos. Novamente a ação do fitoterápico foi mais

contundente nas fases mais adiantadas da gestação.

Similarmente, estudos realizados por Schaefer e colaboradores (2006)

utilizando o guaco como droga anticoagulante em gestantes também mostrou

maior índice de prematuridade e baixo peso, embora não tenha sugerido uma

explicação metabólica plausível para este achado. Por outro lado, na medida em

que a restrição de crescimento placentário pode acarretar em modificações no

transporte e acesso de nutrientes e oxigênio pela barreira materno-fetal, esta

pode ter sido a causa principal da restrição do crescimento fetal. Sem dúvida, o

mecanismo de ação do guaco e de seus componentes sobre a fisiologia da

placenta merece estudos mais pormenorizados.

Neste estudo, apenas a análise da estrutura placentária foi realizada

mostrando o aumento da camada juncional em detrimento da camada labiríntica.

Este achado claramente mostra uma diminuição da região de trocas metabólicas

entre a mãe e o feto, o que pode ser um fator adicional na restrição do peso fetal.

O aumento da camada juncional devido ao aumento de células de glicogênio do

espongiotrofoblasto, por outro lado, precisa ser minuciosamente investigado.

Duas possibilidades entretanto podem ser cogitadas com estes dados: 1.

Ação do guaco sobre o labirinto com conseqüente reação compensatória no

espongiotrofoblasto, ou seja aumento no número de células acumulando

glicogênio para aumentar as reservas energéticas e compensar a restrição

calórica fetal; 2. Ação sobre as células basófilas, conhecidamente produtoras de

hormônios de ação metabólica como a proliferina, que induz proliferação celular e

aumento da absorção de glicose pelas células de glicogênio. Esta ação poderia

inclusive explicar a intensa reatividade ao antígeno proliferativo Ki67 nesta região.

74

Ainda, dados relatados por Gicquel em 2006, afirmam que o desenvolvimento

fetal e placentário está principal e diretamente relacionado aos níveis do sistema

IGF- IGFR. O IGF-I atua no processo de diferenciação e maturação placentária e

regula a disponibilidade de glicose. Neste contexto, é possível que o distúrbio no

peso e dimensões das camadas placentárias e o acúmulo de glicogênio nas

placentas das fêmeas que receberam o guaco tenham relação com alterações no

perfil de moléculas reguladoras da glicose, como o sistema IGF-IGFR. Até onde

pudemos investigar, não existem dados na literatura relacionando estes possíveis

aspectos que merecem atenção oportunamente.

A análise do processo de morte celular na placenta mostrou ocasionais

células apoptóticas em toda a sua extensão, que aumentaram em freqüência nas

placentas de fêmeas tratadas com guaco. Ao contrário do esperado, entretanto,

não se relacionou diretamente à diminuição da camada labiríntica e ao aumento

da camada juncional. Em ambas houve um aparente aumento de reatividade. Na

camada juncional a reatividade era sempre encontrada em grupos de células do

espongiotrofoblasto. Sabendo que o balanço entre proliferação e morte celular é

fundamental em todos os tecidos, inclusive na organogênese placentária, é

possível que este atípico aumento na proliferação das células placentárias esteja

de relacionado também ao aumento da morte celular por apoptose como uma

tentativa tecidual de manter a homeostase nos limites da placenta.

Se por um lado o guaco pode interferir na gestação causando perdas fetais

independente do período de sua administração, efeitos teratogênicos foram

período-dependentes. O guaco administrado no período organogenético,

propiciou uma amplitude maior de malformações (ossificação incompleta cranial,

agenesia bucal, exoftalmia e acrânia) em relação a sua administração mais

tardiamente (ossificação incompleta cranial e acrânia), nas dosagens de 0,3 e 0,6

mg/g/dia em comparação com o controle, embora no período de desenvolvimento

fetal estas malformações tenham sido proporcionalmente mais numerosas (11%,

12% e 46% vs 8%, respectivamente).

Sob esta perspectiva, as malformações embora presentes em ambos os

períodos gestacionais após a administração de guaco nas doses supra-

terapêuticas parecem ser dose-dependentes. Assim, nossos resultados

corroboram outros achados da literatura, na medida em que o perfil teratogênico

75

do guaco tendeu a um aumento na fase organogenética, quando as principais

alterações decorrentes da ação de teratógenos são encontradas no sistema

nervoso central e no crescimento fetal (SCHARDEIN, 1980; VULSMA et al.,

1989;).

Interessantemente, as malformações observadas concentravam-se

principalmente na região da cabeça e apenas discretas alterações forma

encontradas nos processos iniciais de ossificação (centros de ossificação foram

semelhantes em grupos tratados e controle). Estas alterações prevaleceram

apenas nas doses mais altas do fitoterápico.

O uso de agentes cumarínicos em humanos provoca malformações

semelhantes às encontradas em nossos experimentos, sugerindo que os efeitos

teratogênicos provocados pelo uso do guaco independentemente do período

gestacional podem estar intimamente associados a princípios ativos contidos

neste fitoterápico (HALL et al., 1980; O’REILLY, 1980; HOWE et al., 1992; BRIGS

et al., 1994; PAULI et al., 1999; HETZEL et al., 2006; ABRAHAM et al., 2010,

MCLINTOCK, 2011).

O efeito teratogênico da cumarina parece depender da quantidade de droga

ingerida, estoque e bioatividade da vitamina K corpórea. Segundo Howe e

Webster, 1994; PRIETO, 1999, a cumarina atua de maneira antagonista a

vitamina K, inibindo sua reciclagem e impedindo que esta aja de maneira

apropriada no organismo como um todo.

Além disto, Becker e colaboradores (1975) sugeriram que as

deformidades encontradas nos fetos expostos a cumarina, provavelmente são

causadas por micro hemorragias e longo tempo de cicatrização seguida de

calcificação. Outros efeitos como a acrania e não formação dos centros de

ossificação dos metacarpos e metatarsos também foi descrito previamente em

tratamentos utilizando warfarina (derivado cumarínicos) (RAGHAV e REUTENS,

2007). Em conjunto, os dados da literatura nos permitem sugerir que os principais

achados deste estudo estão relacionados à ação da cumarina no guaco.

Em nossos achados, considerando que a alteração mais freqüente associada

ao guaco foi a ossificação cranial incompleta, poderia se pensar que este

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McLintock%20C%22%5BAuthor%5D

76

fitoterápico atua tanto nos processos histogenéticos iniciais como no crescimento

ósseo a partir de blastemas pré-formados. No entanto, a presença constante de

ossos pré-formados craniais sugere que a interferência tenha ocorrido em

momentos mais tardios relacionados ao crescimento e expansão do tecido ósseo.

Outras malformações como exoftalmia, agenesia bucal, protrusão lingual e

imobilidade de membro dianteiro apenas ocorreram nos grupos tratados 0,6

mg/g.dia, embora de baixa incidência, algumas destas inclusive associadas.

Estudos mais detalhados merecem ser no futuro delineados para averiguar se

estas alterações envolvem comprometimento ósseo, elegendo desta forma este

tecido como alvo da ação do fitoterápico. Além disto, também tem que ser

considerado que as anormalidades e malformações geradas nos fetos dos

camundongos expostos ao extrato de guaco podem ser derivadas de uma

associação de princípios ativos e não somente da cumarina.

Em suma, este estudo mostrou que a utilização do extrato de Mikania

glomerata em doses supra-terapêuticas pode atuar sobre processos

morfofuncionais orgânicos, interferindo no crescimento placentário e fetal e

podendo levar ao insucesso gestacional e ao aparecimento de defeitos

congênitos. Além disto, a diminuição do crescimento fetal observado nas doses

consideradas terapêuticas também é um alerta para o uso inadvertido do extrato

de guaco sem acompanhamento médico devido, em qualquer período

gestacional.

ANEXO A- Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia, por gavagem),

administrado em fêmeas prenhes (n=10) sobre o peso corporal (g).

77

(continua)

Animal Peso 1o d.g Peso 7

o d.g Peso 11

o d.g Peso 19

o d.g Ganho de peso

1C 7-11 28.3 29.2 33.7 39.8 11.5

2C 7-11 29.4 31,1 34.8 41.1 11.7

3C 7-11 25.5 26.4 31.2 37.1 11.6

4C 7-11 31.2 33.1 37.6 42.9 11.7

5C 7-11 28.7 30,1 34.2 37.1 8.4

6C 7-11 31.5 32.9 38.7 42.1 10,6

7C 7-11 26.9 29.2 34.8 39.7 12.8

8C 7-11 21.6 23.9 28.7 32.3 10,7

9C 7-11 24.7 26.2 28.9 31.6 6.9

10C 7-11 31.2 33.9 37.1 41.9 10,7

X ± D.P. 29.9 ± 3.24 29.6 ± 3.46 33.97 ± 3.46 38.56 ± 3.99 10,66 ± 1.75

1C 14-18 20,9 22.6 30,2 34.9 14

2C 14-18 23.9 25 31.2 36.3 12.4

3C 14-18 20,1 22.3 29.6 31.2 11.1

4C 14-18 24.3 25.6 31.2 35.1 10,8

5C 14-18 21.2 24.4 28.7 31.1 9.9

6C 14-18 22.1 23.7 29.2 33.7 11.6

7C 14-18 20,3 22.9 29.8 31.2 10,9

8C 14-18 27.1 29.2 35.3 39.2 12.1

9C 14-18 20,1 22.3 25.9 31.2 11.1

10C 14-18 23.1 24.9 29.3 30,1 7

X ± D.P. 22.31 ± 2.28 24.29 ± 2.10 30.04 ± 2.37 33.4 ± 2.94 11.09 ± 1.81

DOSAGEM 0,6 mg/g/dia

1T 7-11 27.3 28.4 34.1 37.2 9.9

2T 7-11 21.8 22.9 25.3 26.2 4.4

3T 7-11 25.8 27.4 31.2 35.8 10

4T 7-11 20,7 22.1 27.1 31.2 10,5

5T 7-11 22.7 24.1 26.2 32 9.3

6T 7-11 21.3 22.2 27.5 31.1 9.8

7T 7-11 24.6 26.1 35.2 37.1 12.5

8T 7-11 27.2 30,1 37.1 40,2 13

9T 7-11 23.1 25.6 31.2 34.9 11.8

10T 7-11 24.9 26.1 29.2 32.1 7.2

X ± D.P. 23.94 ± 2.38 25.5 ± 2.68 30.41 ± 4.04 33.78 ± 4.03 9.84 ± 2.54

1T 14-18 21.5 22.9 24.9 27.6 6.1

2T 14-18 20,1 22.3 25.2 30,2 10,1

3T 14-18 24.4 26.1 29.3 34.7 10,3

4T 14-18 22.5 24.1 28.7 31.9 9.4

5T 14-18 21.3 24.1 27.9 34.5 13.2

6T 14-18 20,9 22.1 26.8 31.3 10,4

7T 14-18 26.1 28.2 33.4 39.1 13

8T 14-18 29.3 31.7 37.9 42.1 12.8

9T 14-18 32.1 34.2 37.9 43.3 11.2

10T 14-18 23.5 25.1 28.8 30,4 6.9

X ± D.P. 24.17 ± 3.92 26.08 ± 4.09 30.08 ± 4.75 34.51 ± 5.33 10.54 ± 2.42 DOSAGEM 0,3 mg/g/dia

Animal Peso 1o d.g Peso 7

o d.g Peso 11

o d.g Peso 19

o d.g Ganho de peso

1T 7-11 23.5 25.1 28.1 35.1 11.6

78

2T 7-11 24.9 26.4 31.2 26.3 11.4

3T 7-11 27.1 28.9 33.4 38.2 11.1

4T 7-11 22.6 24.3 27.9 36.1 13.5

5T 7-11 23.6 24.1 28.4 36.8 13.2

6T 7-11 29.3 30,7 34.2 39.1 9.8

7T 7-11 20,2 22.1 25.4 21.2 11

8T 7-11 26.1 28.0 31.2 25.2 9.1

9T 7-11 22.1 23.9 26.2 33.5 11.4

10T 7-11 20,9 21.8 24.7 30,1 9.2

X ± D.P. 24.03± 2.84 25.53± 2.92 29.07± 3.29 35.16± 2.86 11.13± 1.48

1T 14-18 23.6 24.6 27.9 32.1 8.5

2T 14-18 22.1 24.2 25.7 31.5 9.4

3T 14-18 24.2 26.3 28.5 32.9 8.7

4T 14-18 22.8 25.1 29.3 34.5 11.7

5T 14-18 24.1 26.2 29.3 33.8 9.7

6T 14-18 22.9 24.2 27.3 33.1 10,2

7T 14-18 21.2 24.2 27.4 31.8 10,6

8T 14-18 25.7 27.1 29.8 36.1 10,4

9T 14-18 23.5 25.2 28.1 34.2 10,7

10T 14-18 22.4 25.3 28.7 32.5 10,1

X ± D.P. 23.25± 1.24 25.24± 1.01 28.2± 1.20 33.25± 1.41 10.00± 0.96


1T 7-11 20,2 22.6 26.8 33.2 13.0

2T 7-11 23.1 25.1 27.9 34.1 11.0

3T 7-11 22.4 24.2 29.1 32.9 10,5

4T 7-11 24.1 26.3 30,2 36.2 12.1

5T 7-11 26.3 28.1 31.4 37.1 10,9

6T 7-11 28.1 25.9 28.9 35.1 10,8

7T 7-11 25.9 24.1 27.2 34.6 12.0

8T 7-11 24.1 22.2 26.1 31.2 10,8

9T 7-11 22.2 24.5 29.2 33.1 10,4

10T 7-11 21.3 23.9 25.4 32.8 11.5

X ± D.P. 22.73± 1.84 24.69± 1.75 28.22± 1.80 34.03± 1.76 11.3± 0.83

1T 14-18 21.9 24.1 27.1 31.9 10,0

2T 14-18 24.1 26.5 28.9 35.7 11.6

3T 14-18 22.5 27.1 31.2 35.8 13.3

4T 14-18 24.3 28.2 30,2 35.2 10,9

5T 14-18 22.8 25.7 29.2 34.1 11.3

6T 14-18 20,6 22.9 26.3 35.4 14.8

7T 14-18 20,1 23.5 28.4 32.1 12.0

8T 14-18 21.6 24.2 27.3 30,9 9.3

9T 14-18 21.8 24.9 26.7 33.2 11.4

10T 14-18 23.9 26.1 29.9 35.6 11.7

X ± D.P. 22.36± 1.44 25.32± 1.68 28.52± 1.64 33.99± 1.83 11.63± 1.55 7-11 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação; 14-18 = guaco administrado entre os dias 14 e 18 de gestação; C, controle; T, tratado. X±DP, média ± desvio padrão. Fonte: (Mendes, 2011) Fonte: (Mendes, 2011)

ANEXO B: Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0,6 mg/g/dia, 0,3 mg/g/dia,0,03 mg/g/dia, por gavagem), administrado em fêmeas prenhes (n=10) entre os dias 7 e 11

de gestação sobre o desempenho gestacional (Continua)

79

Animal Corpos lúteos

Sítios implantação

Reabsorções precoces

R Reabsorções tardias

Total de reabsorções

Fetos mortos

Fetos vivos

CONTROLE

1C 7-11 15 15 2 0 2 0 13

2C 7-11 11 11 1 0 1 0 10

3C 7-11 12 12 0 0 0 0 12

4C 7-11 13 13 1 0 1 0 12

5C 7-11 11 11 1 0 1 0 10

6C 7-11 11 11 1 0 1 0 10

7C 7-11 12 12 1 0 1 0 11

8C 7-11 12 12 1 0 1 0 11

9C 7-11 9 9 0 0 0 0 9

10C 7-11 11 11 2 0 2 0 9

X

11.7 11.7 1 0 1 0

10. 7

± D.P. 1.56 1.56 0,66 0 0,66 0 1.33


1T 7-11 13 13 3 0 3 0 10

2T 7-11 13 13 6 0 6 0 7

3T 7-11 11 11 1 1 2 1 8

4T 7-11 9 9 1 0 1 0 8

5T 7-11 13 13 1 2 3 0 10

6T 7-11 12 12 4 0 4 3 5

7T 7-11 13 13 2 0 2 1 10

8T 7-11 14 14 1 1 2 0 12

9T 7-11 12 12 2 0 2 0 10

10T 7-11 12 12 2 0 2 0 10

X 12.2 12.2 2.3 0.4 2.7 0.5 9

± D.P. 1.39 1.39 1.63 0,69 1.41 0.97 2


1T 7-11 11 11 0 0 0 0 11

2T 7-11 11 11 0 1 1 0 10

3T 7-11 8 8 0 0 0 0 8

4T 7-11 8 8 3 0 3 0 5

5T 7-11 12 12 0 0 0 0 12

6T 7-11 11 11 2 0 2 2 7

7T 7-11 12 12 0 0 0 1 12

8T 7-11 11 11 1 0 1 0 10

9T 7-11 9 9 1 1 2 0 7

10T 7-11 10 10 3 1 4 0 6

X 10,3 10,3 1 0,3 1.3 0,3 8.7

± D.P. 1.39 1.39 1.63 0,68 1.41 0.97 2.40


80


Sítios implantação

Reabsorções precoces

R Reabsorções tardias

Total de reabsorções

Fetos mortos

Fetos vivos

1T 7-11 13 13 2 0 2 0 11

2T 7-11 10 10 1 0 1 0 9

3T 7-11 10 10 0 1 1 0 9

4T 7-11 12 12 1 0 1 0 11

5T 7-11 13 13 0 1 1 0 12

6T 7-11 12 12 1 1 2 0 10

7T 7-11 13 13 1 2 3 0 10

8T 7-11 11 11 1 0 1 1 10

9T 7-11 11 11 0 1 1 0 10

10T 7-11 14 14 1 2 3 0 11

X 11.9 11.9 0.8 0.8 1.6 0 10,3

± D.P. 1.17 1.17 0,63 0.78 0.84 0 0.73

7-11 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação; C, controle; T, tratado. X±DP, média ± desvio padrão.


ANEXO C: Efeito do extrato hidroetanólico de Mikania glomerata (0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia, por gavage),

administrado em fêmeas prenhes (n=10) entre os dias 7 e 11 de gestação sobre o desempenho gestacional. Índices gestacionais.

(Continua)

81

Animal II IR IM IPEai IPEt IV

CONTROLE

1C 7-11 100,0 13.3 0,0 0,0 13.3 86.7

2C 7-11 100,0 9.1 0,0 0,0 9.1 90,9

3C 7-11 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

4C 7-11 100,0 7.7 0,0 0,0 7.7 92.3

5C 7-11 100,0 9.1 0,0 0,0 9.1 90,9

6C 7-11 100,0 9.1 0,0 0,0 9.1 90,9

7C 7-11 100,0 8.3 0,0 0,0 8.3 91.7

8C 7-11 100,0 8.3 0,0 0,0 8.3 91.7

9C 7-11 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

10C 7-11 100,0 18.2 0,0 0,0 18.2 81.8

X 100.0 8.3 0.0 0.0 8.3 91.7

± D.P. 0.0 5.4 0.0 0.0 5.4 5.4


1T 7-11 100,0 23.1 0,0 0,0 23.1 76.9

2T 7-11 100,0 46.2 0,0 0,0 46.2 53.8

3T 7-11 100,0 18.2 9.1 0,0 27.3 72.7

4T 7-11 100,0 11.1 0,0 0,0 11.1 88.9

5T 7-11 100,0 23.1 0,0 0,0 23.1 76.9

6T 7-11 100,0 33.3 25.0 0,0 58.3 41.7

7T 7-11 100,0 15.4 7.7 0,0 23.1 76.9

8T 7-11 100,0 14.3 0,0 0,0 14.3 85.7

9T 7-11 100,0 16.7 0,0 0,0 16.7 83.3

10T 7-11 100,0 16.7 0,0 0,0 16.7 83.3

X 100.0 21.8 4.2 0.0 26.0 74.0

± D.P. 0.0 10,6 8.1 0.0 15.0 15.0


1T 7-11 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

2T 7-11 100,0 9.1 0,0 0,0 9.1 90,9

3T 7-11 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

4T 7-11 100,0 37.5 0,0 0,0 37.5 62.5

5T 7-11 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

6T 7-11 100,0 18.2 18.2 0,0 36.4 63.6

7T 7-11 100,0 0,0 8.3 0,0 8.3 91.7

8T 7-11 100,0 9.1 0,0 0,0 9.1 90,9

9T 7-11 100,0 22.2 0,0 0,0 22.2 77.8

10T 7-11 100,0 40,0 0,0 0,0 40,0 60,0

X 100.0 13.6 2.7 0.0 16.3 83.7

± D.P. 0.0 15.4 6.1 0.0 16.4 16.4



82

1T 7-11 100,0 15.4 0,0 0,0 15.4 84.6

2T 7-11 100,0 10,0 0,0 0,0 10,0 90,0

3T 7-11 100,0 10,0 0,0 0,0 10,0 90,0

4T 7-11 100,0 8.3 0,0 0,0 8.3 91.7

5T 7-11 100,0 7.7 0,0 0,0 7.7 92.3

6T 7-11 100,0 16.7 0,0 0,0 16.7 83.3

7T 7-11 100,0 23.1 0,0 0,0 23.1 76.9

8T 7-11 100,0 9.1 0,0 0,0 9.1 90,9

9T 7-11 100,0 9.1 0,0 0,0 9.1 90,9

10T 7-11 100,0 21.4 0,0 0,0 21.4 78.6

X 100.0 13.1 0.0 0.0 13.1 86.9

± D.P. 0.0 5.7 0.0 0.0 5.7 5.7

_____________________________________________________________________________ 7-11 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação; C, controle; T, tratado. X±DP, média ± desvio padrão. II, índice de implantação; IR, índice de reabsorção; IM, Índice de mortalidade, IPEai, Índice de perda embrionária antes da implantação; IPEt, Índice de perda embrionária total, IV, Índice de viabilidade Fonte: (Mendes, 2011)

83

ANEXO D – Efeito do extrato liofilizado de M. glomerata administrado nas dosagens 0,6, 0,3 e

0,03 mg/g/dia administrado entre os dias 7 e 11 a gestação, sobre o peso dos ovários, das placentas e dos fetos e, sobre o comprimento fetal.

(Continua)

Animal Peso médio dos

ovários (g) Peso médio das placentas (g)

Peso médio dos fetos (g)

Comprimento médio dos fetos

(cm)

CONTROLE

1C 7-11 0,02 0,15 1.55 3.19

2C 7-11 0,02 0,17 1.58 3.41

3C 7-11 0,01 0,15 1.02 2.30

4C 7-11 0,01 0,17 1.03 2.33

5C 7-11 0,02 0,13 1.04 2.26

6C 7-11 0,02 0,18 1.14 3.02

7C 7-11 0,01 0,19 1.15 3.06

8C 7-11 0,01 0,16 1.15 2.89

9C 7-11 0,02 0,15 1.17 2.89

10C 7-11 0,02 0,18 1.19 2.85

X 0.01 0.16 1.20 2.82

± D.P. 0.005 0.01 0.20 0,39


1T 7-11 0,02 0,10 1.21 3.29

2T 7-11 0,02 0,12 1.13 2.91

3T 7-11 0,01 0,12 1.07 2.86

4T 7-11 0,01 0,14 0,94 2.80

5T 7-11 0,01 0,13 0,80 2.79

6T 7-11 0,02 0,13 0,99 2.96

7T 7-11 0,02 0,16 1.12 2.19

8T 7-11 0,01 0,13 0,91 2.00

9T 7-11 0,01 0,10 0,81 1.93

10T 7-11 0,02 0,10 0,82 1.93

X 0.01 0.12 0.98 2.56

± D.P. 0.005 0.01 0.14 0.50


1T 7-11 0,02 0,14 0,83 2.50

2T 7-11 0,02 0,14 1.41 3.08

3T 7-11 0,02 0,15 0,82 1.61

4T 7-11 0,01 0,17 0,88 1.76

5T 7-11 0,01 0,16 0,83 1.74

6T 7-11 0,02 0,15 0,91 1.80

7T 7-11 0,02 0,11 1.28 3.20

8T 7-11 0,02 0,15 0,97 2.24

9T 7-11 0,01 0,14 1.15 2.18

10T 7-11 0,02 0,14 1.17 2.08

X 0.01 0.15 1.03 2.22

± D.P. 0.004 0.02 0.21 0.56

84


````````````````````````

``````

Animal Peso médio

dos ovários (g) Peso médio das placentas (g)

Peso médio dos fetos (g)

Comprimento médio dos fetos

(cm)

1T 7-11 0,01 0,14 1.06 2.16

2T 7-11 0,02 0,14 1.33 2.18

3T 7-11 0,02 0,14 1.36 2.14

4T 7-11 0,02 0,14 1.36 2.33

5T 7-11 0,02 0,14 1.31 2.18

6T 7-11 0,02 0,14 1.21 2.30

7T 7-11 0,02 0,14 1.27 2.30

8T 7-11 0,02 0,11 1.35 2.50

9T 7-11 0,02 0,14 1.42 2.41

10T 7-11 0,02 0,13 1.37 2.39

X 0.01 0.14 1.30 2.29

± D.P. 0.003 0.01 0.10 012

7-11 = guaco administrado entre os dias 7 e 11 de gestação; C, controle; T, tratado. X±DP, média ±

desvio padrão. Fonte: (Mendes, 2011)

85

ANEXO E - Efeito do extrato liofilizado de M. glomerata nas dosagens 0,6, 0,3 e 0,03 mg/g/dia

administrado entre os dias 14 e 18 da gestação, sobre parâmetros gestacionais. (Continua)



Reabsoções precoces

Reabsorções tardias

Total reabsorções

Fetos mortos

Fetos vivos

CONTROLE

1C 14-18 14 14 1 0 1 0 13

2C 14-18 13 13 2 0 2 0 11

3C 14-18 11 11 1 0 1 0 10

4C 14-18 12 12 0 0 0 0 12

5C 14-18 10 10 0 0 0 0 10

6C 14-18 13 13 1 0 1 0 12

7C 14-18 13 13 3 0 3 0 10

8C 14-18 10 10 0 0 0 0 10

9C 14-18 14 14 0 0 0 0 14

10C 14-18 11 11 0 0 0 0 11

X 12.1 12.1 0.8 0 0.8 0 11.3

± D.P. 1.52 1.52 1.03 0.00 1.03 0.00 1.42


1T 14-18 9 9 4 0 4 2 3

2T 14-18 13 13 2 0 2 2 9

3T 14-18 14 14 1 0 1 3 10

4T 14-18 13 13 3 0 3 0 10

5T 14-18 14 14 0 0 0 1 13

6T 14-18 14 14 1 0 1 0 13

7T 14-18 9 9 2 1 3 1 5

8T 14-18 15 15 1 0 1 0 14

9T 14-18 14 14 1 0 1 0 13

10T 14-18 11 11 3 0 3 2 6

X 12.6 12.6 1.8 0.1 1.9 1.1 9.6

± D.P. 2.17 2.17 1.22 0,31 1.28 1.1 3.83


1T 14-18 11 11 2 0 2 0 9

2T 14-18 8 8 2 0 2 2 4

3T 14-18 11 11 1 2 3 0 8

4T 14-18 8 8 2 1 3 0 5

5T 14-18 14 14 1 0 1 0 13

6T 14-18 12 12 0 1 1 0 11

7T 14-18 5 5 2 0 2 0 3

8T 14-18 8 8 2 1 3 0 5

9T 14-18 9 9 3 0 3 0 6

10T 14-18 10 10 2 1 3 0 7

X 9.6 9.6 1.7 0,6 2.3 0.2 8.91

± D.P. 2.55 2.55 0.82 0.70 0.82 0,63 3.18

86



Reabsoções precoces

Reabsorções tardias

Total reabsorções

Fetos mortos

Fetos vivos

1T 14-18 13 13 2 0 2 0 11

2T 14-18 13 13 1 0 1 0 12

3T 14-18 10 10 0 0 0 1 9

4T 14-18 14 14 0 0 0 0 14

5T 14-18 14 14 2 0 2 0 12

6T 14-18 15 15 2 0 2 0 13

7T 14-18 12 12 1 1 2 0 10

8T 14-18 12 12 1 1 2 0 10

9T 14-18 14 14 0 1 1 0 13

10T 14-18 12 12 0 0 0 2 10

X 12.9 12.9 0.9 0,3 1.2 0,3 11.4

± D.P. 1.45 1.45 0.88 0.48 1.28 0,67 1.65

14-18 = guaco administrado entre os dias 14 e 18 de gestação; C, controle; T, tratado. X±DP, média ±

desvio padrão. Fonte:( Mendes, 2011)

87

ANEXO F- Efeito do extrato liofilizado de M. glomerata nas dosagens (0,6,0,3 e 0,03 mg/g/dia)

administrado entre os dias 14 e 18 da gestação. Índices gestacionais. (Continua)


CONTROLE

1C 14-18 100,0 7.1 0,0 0,0 7.1 92.9

2C 14-18 100,0 15.4 0,0 0,0 15.4 84.6

3C 14-18 100,0 9.1 0,0 0,0 9.1 90,9

4C 14-18 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

5C 14-18 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

6C 14-18 100,0 7.7 0,0 0,0 7.7 92.3

7C 14-18 100,0 23.1 0,0 0,0 23.1 76.9

8C 14-18 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

9C 14-18 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

10C 14-18 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

X 100.0 6.2 0.0 0.0 6.2 93.8

± D.P. 0.0 8.0 0.0 0.0 8.0 8.0


1T 14-18 100,0 44.4 22.2 0,0 66.7 33.3

2T 14-18 100,0 15.4 15.4 0,0 30,8 69.2

3T 14-18 100,0 7.1 21.4 0,0 28.6 71.4

4T 14-18 100,0 23.1 0,0 0,0 23.1 76.9

5T 14-18 100,0 0,0 7.1 0,0 7.1 92.9

6T 14-18 100,0 7.1 0,0 0,0 7.1 92.9

7T 14-18 100,0 33.3 11.1 0,0 44.4 55.6

8T 14-18 100,0 6.7 0,0 0,0 6.7 93.3

9T 14-18 100,0 7.1 0,0 0,0 7.1 92.9

10T 14 18 100,0 27.3 18.2 0,0 45.5 54.5

X 100.0 17.2* 9.5* 0.0 26.7* 73.3*

± D.P. 0.0 14.3 9.3 0.0 20.7 20.7


1T 14-18 100,0 18.2 0,0 0,0 18.2 81.8

2T 14-18 100,0 25.0 25.0 0,0 50,0 50,0

3T 14-18 100,0 27.3 0,0 0,0 27.3 72.7

4T 14-18 100,0 37.5 0,0 0,0 37.5 62.5

5T 14-18 100,0 7.1 0,0 0,0 7.1 92.9

6T 14-18 100,0 8.3 0,0 0,0 8.3 91.7

7T 14-18 100,0 40,0 0,0 0,0 40,0 60,0

8T 14-18 100,0 37.5 0,0 0,0 37.5 62.5

9T 14-18 100,0 33.3 0,0 0,0 33.3 66.7

10T 14 18 100,0 30,0 0,0 0,0 30,0 70,0

X 100.0 26.4 2.5 0.0 28.9 71.1

± D.P. 0.0 11.8 7.9 0.0 13.9 13.9

88



1T 14-18 100,0 15.4 0,0 0,0 15.4 84.6

2T 14-18 100,0 7.7 0,0 0,0 7.7 92.3

3T 14-18 100,0 0,0 10,0 0,0 10,0 90,0

4T 14-18 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0

5T 14-18 100,0 14.3 0,0 0,0 14.3 85.7

6T 14-18 100,0 13.3 0,0 0,0 13.3 86.7

7T 14-18 100,0 16.7 0,0 0,0 16.7 83.3

8T 14-18 100,0 16.7 0,0 0,0 16.7 83.3

9T 14-18 100,0 7.1 0,0 0,0 7.1 92.9

10T 14 18 100,0 0,0 16.7 0,0 16.7 83.3

X 100.0 9.1 2.7 0.0 11.8 88.2

± D.P. 0.0 7.1 5.8 0.0 5.5 5.5 14-18 = guaco administrado entre os dias 14 e 18 de gestação; C, controle; T, tratado. X±DP, média ± desvio padrão. II, índice de implantação; IR, índice de reabsorção; IM, Índice de mortalidade, IPEai, Índice de perda embrionária antes da implantação; IPEt, Índice de perda embrionária total, IV, Índice de viabilidade. Fonte: (Mendes, 2011)

89

ANEXO G – Efeito do extrato liofilizado de M. glomerata dosagens (0,6,0,3 e 0,03 mg/g/dia)

administrado entre os dias 14 e 18 da gestação sobre o peso dos ovários, das placentas e dos fetos e do comprimento fetal.

(Continua)


ovários (g) Peso médio

das placentas (g) Peso médio

dos fetos (g) Comprimento

médio dos fetos (cm)

CONTROLE

1C 14-18 0,01 0,15 1.14 2.32

2C 14-18 0,02 0,14 1.11 2.14

3C 14-18 0,02 0,13 1.00 2.19

4C 14-18 0,02 0,14 1.26 2.36

5C 14-18 0,02 0,13 1.19 2.42

6C 14-18 0,01 0,17 1.20 2.58

7C 14-18 0,01 0,16 1.21 2.65

8C 14-18 0,01 0,21 1.14 2.48

9C 14-18 0,01 0,26 1.18 2.26

10C 14-18 0,02 0,17 1.14 2.29

X 0.01 0.17 1.16 2.37

± D.P. 0.004 0.04 0.07 0.16


1T 14-18 0,01 0,09 1.11 1.99

2T 14-18 0,02 0,10 1.16 2.10

3T 14-18 0,02 0,11 1.12 2.05

4T 14-18 0,02 0,18 1.16 2.15

5T 14-18 0,02 0,14 0,79 1.99

6T 14-18 0,02 0,17 1.03 2.00

7T 14-18 0,02 0,15 1.04 2.00

8T 14-18 0,01 0,12 1.05 2.08

9T 14-18 0,02 0,13 1.03 2.03

10T 14-18 0,01 0,10 0,80 2.06

X 0.01 0.13 1.02 2.04

± D.P. 0.005 0,03 0.17 0,34


1T 14-18 0,02 0,17 1.16 2.14

2T 14-18 0,02 0,16 1.05 1.99

3T 14-18 0,01 0,16 0,96 1.90

4T 14-18 0,01 0,15 1.24 2.03

5T 14-18 0,01 0,17 1.00 1.96

6T 14-18 0,02 0,16 1.14 2.02

7T 14-18 0,01 0,20 1.06 1.90

8T 14-18 0,02 0,14 1.16 1.95

9T 14-18 0,02 0,12 1.17 2.00

10T 14-18 0,02 0,15 1.23 1.98

X 0.01 0.16 1.12 1.99

± D.P. 0.004 0.02 0.09 0.07

90



ovários (g) Peso médio

das placentas (g) Peso médio

dos fetos (g) Comprimento

médio dos fetos (cm)

1T 14-18 0,02 0,12 1.14 2.13

2T 14-18 0,02 0,10 1.14 2.02

3T 14-18 0,02 0,12 1.10 2.30

4T 14-18 0,02 0,11 1.12 2.11

5T 14-18 0,02 0,14 1.13 2.11

6T 14-18 0,01 0,15 1.14 2.16

7T 14-18 0,01 0,12 1.16 2.13

8T 14-18 0,02 0,12 1.12 2.15

9T 14-18 0,02 0,12 1.31 2.10

10T 14-18 0,01 0,12 1.15 2.15

X 0.01 0.12 1.15 2.14

± D.P. 0.004 0.01 0.06 0.07

14-18 = guaco administrado entre os dias 14 e 18 de gestação; C, controle; T, tratado. X±DP, média ± desvio

padrão.Fonte : (Mendes, 2011)

91

ANEXO H Efeito da Mykania glomerata administrada durante o período organogenético e de

desenvolvimento fetal nas dosagens 0,6,0,3 e 0,03 mg/g/dia, na área placentária, área do espongiotrofoblasto e labirinto dos animais tratados no período organogenético

Área total placentária

Amostra Controle T 0,03 mg/g/dia T 0,3 mg/g/dia T 0,6 mg/g/dia

1 9.77 10.4 11.6 9.82

2 8.87 10.2 11.5 9.78

3 10.0 9.51 11.8 10.2

4 10.2 11.0 12.2 9.95

5 11.2 10.7 11.3 10.7

6 10,3 10.2 9.97 9.42

7 9.87 11.7 8.67 10.0

8 10,6 10.2 8.84 9.53

9 9.70 11.4 9.02 11.1

10 10.1 10.7 8.49 9.62

11 11.2 11.2 10.2 8.79

12 10,6 10.9 10,6 8.94

Média 10.2 9.94 10.54 9.82

± DP 0,65 2.76 1.34 0,66

Área Espongiotrofoblasto


1 3.11 3.3 5.54 5.23

2 5.67 3.25 5.22 5.46

3 3.20 4.03 5.64 6.09

4 4.02 3.67 6.02 5.78

5 4.70 3.98 5.04 6.23

6 4.05 4.01 5.21 5.76

7 5.04 3.87 4.79 5.97

8 4.01 5.02 5.23 5.02

9 4.04 5.79 5.29 7.05

10 4.30 3.99 4.89 4.23

11 5.10 5.23 6.01 4.89

12 4.90 4.75 6.78 4.76

Média 4.34 4.24 5.47 5.54

DP 0.76 0.79 0.57 0.77

92

Área Labirinto


1 6.12 6.86 5.68 4.02

2 3.50 5.31 5.96 5.01

3 6.02 5.83 6.24 4.23

4 6.70 7.58 6.30 4.05

5 6.21 7.00 5.90 4.11

6 6.36 7.21 4.97 3.89

7 4.70 6.89 4.08 4.27

8 6.40 5.96 4.01 3.95

9 4.90 6.98 4.47 4.03

10 6.80 7.02 4.01 4.79

11 5.90 5.95 4.20 3.79

12 6.50 6.02 4.04 4.01

Média 5.78 6.55 5.84 4.18

DP 0.98 0.70 0.96 0,36 Média , DP: Desvio Padrão. Fonte: (Mendes, 2011)

93

ANEXO I Efeito da Mykania glomerata administrada durante o período organogenético e de

desenvolvimento fetal nas dosagens 0,6,0,3 e 0,03 mg/g/dia, na área placentária, área do espongiotrofoblasto e labirinto dos animais tratados no período de desenvolvimento fetal

(Continua)

Área total placentária


1 8.99 9.91 11.1 9.98

2 9.19 9.63 10.4 8.75

3 9.25 11.9 11.7 10.2

4 12.4 10.4 12.0 9.79

5 9.96 10.5 11.3 10.1

6 10.8 10.8 10.9 10.1

7 11.4 8.97 11.6 10.5

8 10.5 9.79 10.4 9.23

9 9.96 10,3 10.2 9.02

10 10.2 10.0 10.0 9.56

11 11.3 11.1 10.7 9.23

12 11.2 10.4 11.2 10.8

Média 10.4 10,31 10.96 9.77

DP 1.03 0.75 0,63 0,62

Área Espongiotrofoblasto


1 3.16 5.21 5.38 5.02

2 3.29 3.35 4.8 4.89

3 4.53 5.26 5.08 5.43

4 2.92 2.89 6.38 5.04

5 3.43 4.65 5.27 5.97

6 3.21 4.87 5.57 6.02

7 4.27 4.25 5.89 6.22

8 5.01 5.23 5.04 5.76

9 4.02 5.02 6.01 5.29

10 3.98 5.27 5.98 5.88

11 4.76 5.96 6.23 5.61

12 4.01 4.58 6.42 6.87

Média 3.88 4.71 5.67 5.67

DP 0,68 0.86 0.56 0.58

94

Área Labirinto


1 5.6 4.8 5.87 4.02

2 5.61 5.96 5.89 3.89

3 4.59 6.44 6.48 4.04

4 8.75 7.45 5.5 4.22

5 6.13 5.14 6.2 3.98

6 7.02 5.21 5.92 4.02

7 6.96 4.93 6.08 4.12

8 5.07 5.74 5.72 3.89

9 5.2 4.21 5.59 3.27

10 5.6 5.01 6.05 4.01

11 6.97 6.07 5.04 3.85

12 7.4 6.92 5.21 4.01

Média 6.24 5.66 5.80 3.94

DP 1.19 0.95 0.41 0.23 Média, DP: desvio padrão

95

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Camila Figueira Mendes - USP · 2012-08-14 · Camila Figueira Mendes EFEITO DO EXTRATO DE Mikania glomerata SPRENGEL ... Não somos o que deveríamos ser, não somos o que iremos