Universidade Federal da Bahia

Escola de Medicina Veterinária

Mestrado Ciência Animal nos Trópicos

ATIVIDADE ANTINEMATÓIDE DO EXTRATO AQUOSO DAS

FOLHAS DE ZANTHOXYLUM RHOIFOLIUM Lam. (RUTACEAE)

TAÍSE PENELUC

Salvador – Bahia 2007

ii

TAÍSE PENELUC

ATIVIDADE ANTINEMATÓIDE DO EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE

ZANTHOXYLUM RHOIFOLIUM Lam. (RUTACEAE)

Orientadora: Profa. Dra. Maria José Moreira Batatinha Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Angela Ornelas de Almeida

Salvador – Bahia 2007

Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal.

iii

ATIVIDADE ANTINEMATÓIDE DO EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE

ZANTHOXYLUM RHOIFOLIUM Lam. (RUTACEAE)

TAÍSE PENELUC

Dissertação defendida e aprovada para a obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos

Trópicos.

Salvador, 28 de setembro de 2007.

Comissão Examinadora:

_________________________________________________________________________

Profa. Dra. Maria José Moreira Batatinha – Universidade Federal da Bahia

Orientadora

_________________________________________________________________________

Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua – Universidade Estadual do Ceará

_________________________________________________________________________

Prof. Dr. José Eugênio Guimarães – Universidade Federal da Bahia

iv

AGRADECIMENTOS

Registro aqui a minha eterna gratidão àquelas várias pessoas que contribuíram para que a

elaboração desta dissertação de Mestrado chegasse a bom termo...

• À coordenação do Curso de Pós-graduação em Ciência Animal nos Trópicos, nas pessoas

do Prof. Dr. Ricardo Castelo Branco Albinati e Prof. Dr. Roberto Franke, que permitiram e

apoiaram a realização desta dissertação;

• Aos professores e colegas da Pós-Graduação, que pelos ensinamentos, espírito

cooperativo e agradável convívio, colaboraram para a concretização de mais uma etapa da

minha vida;

• À Profa. Dra. Maria José Moreira Batatinha por compartilhar comigo sua linha de

pesquisa;

• Profa. Dra. Maria Angela Ornelas de Almeida, co-orientadora, pela confiança,

ensinamentos éticos e morais e pelo apoio fundamental na elaboração da redação final

desta dissertação. OBRIGADA!!!!

• À Profa. Dra. Silvia Lima Costa, com seu olhar e sorriso contagiantes que me fortaleceram

desde o dia da seleção do Mestrado;

• Ao Prof. Dr. Amigo Eduardo Luiz T. Moreira, não só pela participação ativa neste

trabalho, como também pelo carinho e cumplicidade desde o nosso primeiro encontro nas

aulas da Pós-Graduação; nos momentos de dificuldades enquanto me encontrava como

professora substituta da disciplina Patologia Animal I e por todos os momentos de

desabafo e de descontração que compartilhamos juntos;

• A todos os professores da graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal da

Bahia, em especial ao Prof. Dr. Joselito Nunes Costa, pelas orientações no estágio

supervisionado e pelo exemplo de profissional ético, apaixonado pela profissão; às

minhas primeiras professoras, Ana Elisa de Almeida; Márcia Maria Dantas e Maria das

Graças que me fizeram apaixonar pela Medicina Veterinária;

• À Profa. Dra. Maria Consuêlo C. Ayres, pela contribuição profissional nas análises

bioquímicas e pelos conselhos de “pé-de-ouvido”;

v

• Aos amigos do Laboratório de Diagnóstico das Parasitoses, especialmente à Rosângela

Uzêda, pelo carinho demonstrado desde que nos conhecemos e à Sheila Magaly pelo

companheirismo durante todos os momentos de angústia e alegrias durante esta jornada e

apoio na realização do trabalho experimental;

• À Profa. Dra. Tereza Calmon Bittencourt pela realização das análises estatísticas;

• À equipe técnica do Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal da Bahia,

especialmente Luciana Domingues, Mariana Botura e Gisele Nunes pelo apoio, carinho e

companheirismo;

• Aos estagiários-amigos, Ana Carla Ferreira e Thiago Sampaio pela cumplicidade e ajuda

na execução dos experimentos;

• Aos meus queridos amigos: Adriana Jucá, Rebeca Lima, Tatiana Fausta, Ana Valéria

Franco, Nívea Amoedo e Ulisses Graça Filho pela compreensão na minha ausência, em

prol da realização deste trabalho, sempre me encorajando a prosseguir na execução desta

dissertação. A presença de vocês foi indispensável para a manutenção da minha saúde

física e mental;

• Aos colegas de trabalho que se tornaram verdadeiros amigos: Stellamaris Boyda, Robson

Bahia, Marcus Ribeiro, Cátia Suse, Jorge Ribas, Ana Paula Peixoto. Meus sinceros

agradecimentos e admiração.

• Aos amigos da graduação e pós-graduação Jaciara Campos, Aline Trindade, Hermes

Neto, Ricardo Evangelhista; Ana Fernanda Ferreira, Ana Alice Gouvêa, Priscila Martinez,

pela amizade e carinho que existe há 10 anos;

• Aos amigos Sandra Dutton, Lívia Prates, Daniele Dourado, Marcelo Gomes, Alexandre

Thomé; Jociana Almeida, Marcus Welby que me proporcionaram momentos incríveis

como parceiros de sala de aula e/ou naqueles mais que descontraídos fora dela;

• Ao prof. Eliel Pinheiro Judson, Coordenador do Curso de Medicina Veterinária da

UNIME - União Metropolitana de Educação e Cultura, juntamente com o Prof. Heitor

Povoas, pelo apoio profissional que me faz ter orgulho de fazer parte da Família UNIME.

Minha eterna gratidão

• À Maria de Fátima dha Terra pela participação direta no meu equilíbrio emocional e

evolução espiritual, principalmente nos últimos dois anos, e que, com certeza, é

responsável pela continuidade deste trabalho.

vi

AGRADECIMENTO ESPECIAL

• À Maria de Lourdes Peneluc, MÃE, AMIGA, COMPANHEIRA, que me deu sólida

formação, ensinou-me a ter caráter ético desde a minha juventude e que me proporcionou

a continuidade nos estudos até a chegada deste Mestrado;

• Aos meus irmãos Taty, Lio e Tatay, que contribuíram diretamente nesta jornada e me

ensinaram a olhar para frente;

• Aos meus sobrinhos Neu, Belle, Thio, Lari e Clarinha pelos eternos momentos de alegria

e louvor à VIDA;

• A Alan Pazian, companheiro, amigo pelos momentos de compreensão e paciência durante

a realização deste trabalho. Seu apoio emocional foi meu alicerce neste último ano....

vii

ÌNDICE

página

LISTA DE TABELAS..................................................................................................... viii

LISTA DE FIGURAS...................................................................................................... ix

RESUMO.......................................................................................................................... x

SUMMARY ..................................................................................................................... xii

1 INTRODUÇÃO............................................................................................................. 1

2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 4

2.1 Parasitoses Gastrintestinais de Pequenos Ruminantes ......................................... 4

2.2 Plantas com Atividade Antiparasitária na Medicina Veterinária ....................... 6 2.3 Zanthoxylum rhoifolium ........................................................................................... 10

2.3.1 Descrição Botânica ................................................................................................. 11

2.3.2 Composição Química ............................................................................................. 12

2.3.3 Atividades Farmacológicas ................................................................................... 14

3 ARTIGO CIENTÍFICO......................................................................................... 16

4 CONSIDERAÇÕES GERAIS.................................................................................... 39

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 41

viii

LISTA DE TABELAS

página

TABELA 1 – Média, desvio padrão e percentual de redução (PR) de larvas

de terceiro estágio de nematóides gastrintestinais, em culturas de fezes de

caprinos, tratadas com extrato aquoso de Zanthoxylum rhoifolium ..................... 35

TABELA 2 - Média, desvio padrão e percentual de redução (PR) de ovos

de nematóides gastrintestinais, de ovinos mestiços de Santa Inês tratados

com o extrato aquoso de folhas de Zanthoxylum rhoifolium ................................ 36

TABELA 3 - Média, desvio padrão e percentual de redução (PR) de

nematóides gastrintestinais recuperados de ovinos mestiços de Santa Inês

tratados com o extrato aquoso de folhas de Zanthoxylum rhoifolium ................. 37

TABELA 4 – Média e desvio padrão dos parâmetros de bioquímica sérica

e das constantes fisiológicas de ovinos mestiços de mestiços de Santa Inês,

tratados com o extrato aquoso de folhas de Zanthoxylum rhoifolium em

diferentes momentos............................................................................................ 38

ix

LISTA DE FIGURAS

página

TIGURA 1 – Morfologia de Zanthoxilum rhoifolium ........................................ 12

x

PENELUC, T. Atividade antinematóide do extrato aquoso das folhas de Zanthoxylum

rhoifolium Lam. (Rutaceae). Salvador, Bahia, 2007. 52p. Dissertação (Mestrado em Ciência

animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2007.

RESUMO

O estudo objetivou avaliar a atividade anti-helmíntica do extrato aquoso das folhas de

Zanthoxylum rhoifolium e, para isto, realizaram-se dois experimentos. O experimento 1 - teste in

vitro, foi realizado com cultivos de fezes de caprinos tratados com seis diferentes concentrações

do extrato: 335,0; 279,1; 232,5; 193,7; 161,4; 134,5 mg/mL. Doramectina e água destilada foram

utilizadas como controles positivo e negativo, respectivamente. O experimento 2 foi constituído

pelo teste in vivo, pelo qual 20 ovelhas foram distribuídas em quatro grupos: G1 (seis animais) -

tratados com dose única do extrato aquoso das folhas (0,63 g/kg PV), durante quatro dias; G2

(seis animais) - tratados com a mesma dose, por oito dias; G3 (quatro animais) - controle positivo

(Ivermectina) e G4 (quatro animais)- controle negativo (água). Os resultados dos testes in vitro

mostraram uma redução de larvas dos gêneros Haemonchus, Trichostrongylus e

Oesophagostomum superior a 95% nas concentrações de 193,7 a 335,0 mg/mL. Nos testes in

vivo, com oito dias de tratamento, a redução da contagem de ovos por grama de fezes (OPG) foi

de 51%, 56% e 90%, respectivamente, nos grupos G1, G2 e G3, enquanto que para os estágios

imaturos (L4) e adultos (L5) variaram de 0 a 91% no grupo G1 e de 26 a 94% no G2. A eficácia

da ivermectina foi de 99% para L4 e L5 de H. contortus e de 100% para as demais espécies de

nematóides. Os parâmetros de avaliação clínica e bioquímica sérica permaneceram na faixa de

normalidade, não apresentando diferenças estatísticas significativas (p>0,05) entre os grupos, e as

análises histopatológicas não revelaram alterações renal ou hepática, que pudessem sugerir

toxicidade para a dose testada. Embora altamente efetivo no teste in vitro, o extrato aquoso de

folhas de Z. rhoifolium na concentração utilizada, foi pouco eficaz in vivo, na redução de

nematóides gastrintestinais.

Palavras-chaves: Zanthoxylum rhoifolium, laranjeira brava, anti-helmíntico, helmintos,

ruminantes.

xi

PENELUC, T. Antinematode activity of aqueous extract of Zanthoxylum rhoifolium Lam.

leaves (Rutaceae). Salvador, Bahia, 2007. 52p. Dissertation (Master’s Degree in Animal Science

in the Tropics). School of Veterinarian Medicine, Federal University of Bahia, 2007.

SUMMARY

The aim of this study was to evaluate the antinematode activity of aqueous extract of Z.

rhoifolium leaves. For this purpose two experiments were performed. In the experiment 1, in vitro

test, cultures of goats fecal samples were treated with different concentrations of Z. rhoifolium

leaves extract (335,0; 279,1; 232,5; 193,7; 161,4; 134,5 mg/mL). As positive and negative control

respectively were used Doramectin and distilled water treatments. The experiment 2 in vivo test

was composed of 20 sheep divided in four groups: G1 - the animals were treated with one dose

of the aqueous extract of leaves (0,63 g/Kg PV), during four days; G2 - treated with the same

dose, for eight days; G3 - positive control (Ivermectin) and G4 - negative control (water). The

results of experiment 1 showed a reduction of the larvae number of Haemonchus,

Trichostrongylus and Oesophagostomum greater than 95% in the concentrations between 335,0

and 193,7 mg/mL. In the experiment 2 was observed reduction of the eggs counting for gram of

feces (EPG) of 51%, 56% and 90% in G1, G2 and G3 groups, respectively, while for the

immature stages (L4) and adults (L5) ranged from 0 to 91% in G1 group and from 26 to 94% in

G2 group. The chemical treatment with Ivermectin showed effectiveness of 99% for L4 and L5

for H. contortus and of 100% for the others species of nematodes. Clinical and biochemical

parameters have remained in the normality, and they did not show significant statistical

differences (p>0,05) between groups. Histophatologic analyses did not show compatible

alterations with renal or hepatic insufficiencies, suggesting absence of toxicity for the tested dose.

Although the great effectiveness of Z. rhoifolium leaves extract in vitro test, it displayed poor

efficiency in vivo regarding gastrointestinal nematodes reduction.

Key-words: Zanthoxylum rhoifolium, laranjeira brava, anthelmintic, nematodes, small ruminant.

FICHA CATALOGRÁFICA

ELABORADA PELA BIBLIOTECA EMV-UFBA

Peneluc, Taíse Atividade antinematóide do extrato aquoso das folhas de Zanthoxylum rhoifolium LAMARCK (Rutaceae). Taíse Peneluc. - Salvador-Bahia,

28/09/2007. 52p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) –

Universidade Federal da Bahia. Departamento de Patologia e Clínicas, 2007.

Professor Orientador: Profa. Dra. Maria José Moreira Batatinha Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Angela Ornelas de Almeida

Palavras chaves: 1- Zanthoxylum rhoifolium 2 - laranjeira brava 3- anti-helmintos, 4- helmintos 5 - ruminantes.

1 INTRODUÇÃO

Na última década o incremento do agronegócio pela implantação de uma estrutura

agroindustrial para abate de pequenos ruminantes na região Nordeste estimulou a cadeia

produtiva da ovinocaprinocultura e, nesse contexto, o Estado da Bahia expandiu-se e

representa hoje um potencial para exportação de carne (SILVA, 2005).

A criação de caprinos e ovinos tem relevante importância social para populações de baixa

renda por fornecer carne e leite, e nas criações mais tecnificadas aparece como geradora de

empregos, permitindo a uma parcela da população ter seu sustento, garantido por vias direta

na atividade de criação, ou indireta, na elaboração de subprodutos. Estes fatos demonstram a

importância dos produtos de origem caprina e ovina na subsistência da família e a

possibilidade de sua inserção ao agronegócio.

A ovinocaprinocultura é comprometida pelo predomínio de um sistema de produção

extensivo, limitado por práticas inadequadas de manejos sanitário, reprodutivo e nutricional

que se refletem na baixa imunidade dos animais e conseqüentemente ocorrência de doenças,

especialmente as parasitoses, destacando as nematodioses gastrintestinais (MORAIS et al.,

2002), que ocasionam retardo no crescimento, perda de peso, diminuição da produção de

carne e leite e interferência na fertilidade dos animais (ALMEIDA et al., 2004), associados

aos elevados níveis de investimento com o tratamento (MOTA et al., 2003).

O controle de helmintos nos animais é realizado quase que exclusivamente com produtos

químicos, o que contribui para o desenvolvimento da resistência aos anti-helmínticos (MELO

et al., 1998). Nematóides de ovinos e caprinos resistentes aos medicamentos foram

registrados no Estado da Bahia (BARRETO; SILVA, 1999; BARRETO et al., 2006) e em

outras regiões brasileira (MATTOS et al., 2004; MELO et al., 1998, 2003; SCHIMDT et al.,

1999; VIEIRA; CAVALCANTE, 1999), sendo uma das maiores preocupações dos criadores,

em virtude da diminuição na produtividade dos rebanhos pela infecção parasitária e o

desembolso financeiro, para a aquisição de anti-helmínticos, cuja eficácia é altamente

comprometida, em função da resistência (VIEIRA, 2003).

Outros aspectos que devem ser considerados pelo uso contínuo dos fármacos sintéticos

relacionam-se ao impacto ambiental e a saúde pública. A persistência de produtos químicos,

2

como as avermectinas, nas fezes, por longos períodos, são letais e sub-letais para uma

variedade de insetos que colonizam o bolo fecal (GILL; LeJAMBRE, 1996; STRONG, 1993).

Os resíduos de medicamentos em produtos de origem animal têm sido registrados,

destacando-se a ocorrência de 17,8% (30/168) de amostras de leite bovino com presença de

ivermectina (LOBATO et al., 2006).

Além do uso de anti-helmínticos empregam-se para o controle das helmintoses, a seleção de

animais resistentes (STEAR et al., 1994), a utilização de fungos nematófagos (GRAMINHA

et al., 2005), o método FAMACHA (MOLENTO et al., 2004), o pastejo alternado ou misto

com diferentes espécies animais (AMARANTE, 2004), descanso da pastagem e rotação de

área de pastejo (FERNANDES et al., 2004). O emprego da homeopatia (CABARET, 1996;

ROCHA et al., 2006) e de plantas medicinais (BATATINHA et al., 2004; COSTA et al.,

2006; FURTADO, 2005; HÖRDEGEN et al., 2003; KRYCHAK-FURTADO, 2005; VIEIRA

et al., 1999) vem sendo avaliados no controle das parasitoses dos animais.

Os estudos com plantas visam esclarecer sobre os efeitos farmacológicos, caracterizar o seu

uso in natura ou em diferentes formas farmacêuticas e obter substâncias ativas. A diversidade

brasileira de recursos vegetais, representados por rica flora nativa, permite investigar as

famílias de plantas quanto ao seu potencial farmacêutico, e por este motivo, diversas espécies

vegetais têm sido empregadas por produtores rurais como medida alternativa no tratamento ou

prevenção das parasitoses dos animais domésticos, dentre as quais se destaca a Zanthoxylum

rhoifolium, popularmente conhecida como mamica-de-porca, mamica-de-cadela, laranjeira-

brava e espinho-cheiroso.

Z. rhoifolium, membro da família Rutaceae, tem ampla distribuição na América do Sul

(ARRUDA et al., 1992), e no Brasil é difundida em regiões de cerrado (SALGADO et al.,

1998) e de florestas Atlântica e Amazônica (PIRANI, 2005). As propriedades terapêuticas do

gênero Zanthoxylum incluem atividades antibacterianas (GONZAGA et al., 2003ab;

NGASSOUM et al., 2003; RAJBHANDARI; SCHOPKE, 1999; TATSADJIEU et al., 2003)

antifúngicas (CHAAIB et al., 2003; DIÉGUEZ-HURTADO et al., 2003; NISSANKA et al.,

2001; WEYERSTAHL et al., 1999) anti-inflamatórias (MOURA et al., 1997); leishmanicida

(FERREIRA et al., 2002) e anti-helmínticas (AKHTAR et al., 2000; NAVARRETE; HONG,

1996). Especificamente para Z. rhoifolium foram descritas atividades antibacterianas (da

SILVA et al., 2006; GONZAGA et al., 2003; MOURA et al., 1999), antiplasmodial

3

(JULLIAN et al., 2006), antifúngica (da SILVA et al., 2006) e citotóxica (SILVA et al.,

2007).

A atividade antiparasitária do gênero Zanthoxylum relaciona-se aos constituintes alcalóides,

como a nitidina e a cantina, que têm potente efeito sobre protozoários dos gêneros

Plasmodium (JULLIAN et al., 2006) e Leishmania (FERREIRA et al., 2002), além da atanina

que se mostrou ativo contra cercárias e miracídios de Shistosoma mansoni (PERRETT;

WHITFIELD, 1995).

Diferentes testes in vitro e in vivo vêm sendo usados para avaliação da atividade de plantas,

como os testes de eclosão de ovos (ASSIS et al., 2003; COSTA et al., 2002), de

desenvolvimento larval (ADEMOLA et al., 2005), a técnicas de coprocultura (ALMEIDA et

al., 2003; IQUEBAL et al, 2006) e o teste controlado empregando-se animais naturalmente

infectados (GITHIORI et al., 2002; HOUNZANGBE-ADOTE et al., 2005). O presente

experimento objetivou avaliar in vitro, pela coprocultura, e in vivo, por teste controlado, os

efeitos antiparasitários do extrato aquoso da Z. rhoifolium sobre nematóides gastrintestinais de

pequenos ruminantes, contribuindo para o conhecimento da atividade farmacológica desta

planta.

4

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Parasitoses Gastrintestinais de Pequenos Ruminantes

As helmintoses são consideradas uma das maiores causas de redução na produtividade animal

(HAMMOND et al., 1997). Na região Nordeste do Brasil, as nematodioses gastrintestinais de

pequenos ruminantes são causadas especialmente pelos gêneros Haemonchus,

Trichostrongylus, Strongyloides, Oesophagostomum e Trichuris (MELO et al., 2003;

RODRIGUES et al., 2007; VIEIRA, 1999). No Estado da Bahia, os gêneros Haemonchus,

Trichostrongylus e Oesophagostomum foram freqüentes 92%, 33,6% e 29,2%,

respectivamente, em cultivos de fezes de caprinos naturalmente infectados e criados em

sistemas intensivo e semi-intensivo (ALMEIDA et al., 1997).

Os efeitos patogênicos destes nematóides sobre o animal estão relacionados com a espécie do

parasito, o grau de infecção, a idade, os estados nutricional e imunológico do hospedeiro

(SANTA ROSA, 1996). As infecções geralmente são mistas e, caracterizam-se por uma fase

aguda, na qual os animais apresentam perda de peso, diarréia, desidratação, anemia, pêlos

arrepiados e sem brilho, e uma fase crônica, na qual se evidencia edema submandibular,

debilidade e redução da produção (AMARANTE, 2004).

H. contortus é a principal espécie de endoparasito de ovinos e caprinos no Brasil causando

lesão abomasal, que resulta em anemia, edema submandibular e, por vezes, óbitos

(ECHEVARRIA et al., 1996), e em seguida, registra-se T. axei e T. colubriformis, que

ocasionam lesões na mucosa, com exsudação de proteínas séricas para a luz intestinal e nas

infecções altas observa-se anorexia, diarréia e edema submandibular (UENO; GONÇALVES,

1998).

O uso intensivo e inadequado de anti-helmínticos para o controle de nematóides

gastrintestinais tem resultado na menor atividade destes produtos com vários registros no

Brasil. Na região Sul, a resistência anti-helmíntica foi detectada no Paraná (CUNHA; FILHO,

1999; THOMAZ-SOCCOL et al., 2004), Santa Catarina (RAMOS et al., 2004) e no Rio

Grande do Sul (ECHEVARRIA et al., 1996). Na região Sudeste, foi descrita em São Paulo

5

(FARIAS et al., 1997; VERISSÍMO et al., 2002). No Nordeste, suspeitou-se de nematóides

resistentes, inicialmente em caprinos, no Ceará por VIEIRA et al. (1989) e, em seguida,

Bevilaqua e Melo (1999); Melo et al. (1998, 2001, 2003); Vieira e Cavalcante (1999);

confirmaram esta suspeita. Posteriormente, a resistência anti-helmíntica foi relatada em

Pernambuco, Bahia e Alagoas (BARRETO; SILVA, 1999; BARRETO et al., 2002; BISPO et

al., 2002; CHARLES et al., 1989; RODRIGUES et al., 2007).

A resistência múltipla foi identificada em ovinos criados em Santa Catarina, sendo o gênero

Haemonchus resistente à ivermectina (77%), albendazole (65%) e closantel (13%),

constatando-se também resistência ao levamisole, predominando os gêneros Trichostrongylus

(44%) e Ostertagia (39%) (RAMOS et al., 2002).

No Rio Grande do Sul, Echevarria e Pinheiro (1989) comprovaram que H. contortus foi

resistente ao thiabendazole (38,7%) e tetramisole (25,8%), nas quais, 19,4% dos rebanhos

apresentavam resistência múltipla e somente 16,1% dos rebanhos apresentaram helmintos

sensíveis a estes medicamentos. No Estado do Ceará, a eficácia do oxfendazole, levamisole e

ivermectina foram de 87,5%, 75% e 37,5%, respectivamente para nematóides de caprinos,

enquanto em ovinos os índices variaram de 0-100% para oxfendazole, 18-100% para o

levamisole e 0-100% para ivermectina (MELO et al., 2003), havendo predominância do

gênero Haemonchus na população resistente aos anti-helmínticos utilizados, seguido de

Trichostrongylus e Oesophagostomum. Estudos conduzidos em caprinos da mesorregião do

Sertão Paraibano indicaram que os nematóides gastrintestinais não foram efetivamente

sensíveis à ação dos anti-helmínticos moxidectina, albendazole e ivermectina, e

moderadamente sensíveis ao cloridrato de levamisole (RODRIGUES et al., 2007).

No Estado da Bahia, verificou-se uma redução de 79,3% na contagem de ovos por grama de

fezes de caprinos (BARRETO; SILVA, 1999), e em ovinos, a eficácia foi de 37 a 100% para

o levamisole, 0 a 100% para o albendazole e de 46 a 100% para ivermectina, e após os

tratamentos foram encontrados, nas coproculturas, os gêneros Haemonchus, Trichostrongylus

e Oesophagostomum, caracterizando o fenômeno da resistência neste estado (BARRETO et

al., 2006).

6

2.2 Plantas com Atividade Antiparasitária na Medicina Veterinária

Os produtos de origem vegetal por muito tempo representaram as principais fontes para o

desenvolvimento de medicamentos, porém com a revolução industrial e o desenvolvimento da

química orgânica resultaram nos produtos sintéticos. O mercado mundial de fitofármacos gera

em torno de 15 milhões de dólares, como conseqüência de estudos químicos e farmacológicos

que comprovam a eficácia de plantas medicinais, principalmente aquelas empregadas na

medicina popular (RATES, 2001).

A validação dos fitoterápicos é uma etapa inicial obrigatória para a utilização de plantas

medicinais ou de seus compostos ativos. Os testes in vitro permitem uma avaliação da

existência de propriedades farmacológicas nos extratos vegetais, constituindo-se desta

maneira, uma etapa preliminar à caracterização de compostos ativos presentes nos vegetais,

possibilitando alternativas para o controle das parasitoses (COSTA et al., 2002).

Os estudos de plantas com atividade antiparasitária têm merecido destaque diante da

problemática da resistência de parasitos aos anti-helmínticos comercializados, da permanência

de resíduos em carne e leite e da poluição ambiental, o que acentua a necessidade da busca de

produtos anti-helmínticos alternativos com diferentes mecanismos de ação e de baixo custo

(HEINRICH, 2000).

O efeito das plantas medicinais no controle das parasitoses depende do gênero e estágios do

parasito e dos protocolos de extração dos constituintes ativos do vegetal, sendo necessários

observar seu efeito em animais naturalmente infectados, com diferentes estágios de

desenvolvimento do parasito (HOUNZANGBE et al., 2005).

Krychak-Furtado (2006) descreveu 106 espécies de plantas com atividade antiparasitária

pertencentes, principalmente, às famílias Asteraceae, Fabaceae, Lamiaceae e Meliaceae. A

maior parte dos estudos para verificar o efeito anti-helmíntico utilizou as folhas (23,6%),

seguido de frutos (10,4%) e sementes (9,4%), e 17,9% eram indicadas para tratamento de

parasitos de ruminantes.

7

Em caprinos infectados naturalmente com os gêneros Haemonchus, Trichostrongylus,

Trichuris, tratados com 30mg de pó dos frutos de Melia azedarach (Lírio), constatou-se

redução de 79%, 96% e 99% de larvas infectantes, respectivamente (AKHTAR, 1984). No

entanto, os frutos secos e moídos de M. azedarach quando administrados na dose de 1, 2 ou

3g/kg de peso vivo, via oral, em caprinos naturalmente infectados, houve redução de 43%,

59% e 54% do número de OPG respectivamente (GIRÃO et al., 1998).

O extrato etanólico das folhas e sementes de M. azedarach mostrou-se ativo na inibição do

desenvolvimento de ovos de H. contortus, apresentando 100% de eficácia, e a análise

fitoquímica desse extrato revelou a presença de triterpenóides, esteróides, alcalóides e taninos

condensados, constituintes que possivelmente são os responsáveis pela atividade anti-

helmíntica (MACIEL et al., 2006).

A ação inibitória de 50% na eclosão de ovos de H. contortus foi obtida, após o tratamento de

ovinos com extrato aquoso de Spigelia anthelmia e Mormodica charantia (BATISTA et al.,

1999). Em outros estudos, os extratos acetato de etila e metanólico destas plantas inibiram

completamente (100%) a eclosão de ovos de H. contortus (ASSIS et al., 2003; COSTA et al.,

2001). Os constituintes ativos spigantina e rianodinas de S. anthelmia podem estar

relacionados com a inibição do desenvolvimento de nematóides, por paralisia espástica da

musculatura esquelética, induzida pela abertura dos canais de cálcio no retículo

sarcoplasmático (ASSIS et al., 2003).

O extrato etanólico das sementes de Mangirefa indica, na concentração de 50 mg/mL,

mostrou-se eficaz no controle de nematóides gastrintestinais de ovinos e caprinos com

inibição de 95,66% na eclosão de ovos de H. contortus (COSTA et al., 2002).

Os óleos essenciais de Chenopodium ambrosioides (mastruz) e Ocimum gratissimum (quioiô)

inibiram em 99,8 e 100% a eclosão de ovos de H. contortus de caprinos, respectivamente

(PESSOA et al., 2001). Esses autores, em 2002, reafirmaram a atividade do óleo essencial de

O. gratissimum e de seu componente, o eugenol, em concentração superior a 0,25%, sobre

ovos de H. contortus.

Caprinos adultos infectados experimentalmente com larvas de H. contortus, tratados, em dose

única, com o suco de folhas de C. ambrosioides (0,75 g/kg PV) e de Mentha piperita (hortelã)

8

(0,5 g/kg PV) apresentaram uma redução no OPG e adultos de 33,6% e 9,6% para o mastruz e

72% e 0% para a hortelã respectivamente, (VIEIRA et al., 1999).

O extrato metanólico da raiz de Piliostigma thonningii, na concentração de 4,4 mg/mL, por

um período de 24 a 48 horas, induziu paralisia de aproximadamente 60% das larvas de

terceiro estágio de H. contortus, obtidas de amostras de fezes de ovinos infectados

naturalmente (AZUZU et al., 1996).

Ovinos infectados com nematóides gastrintestinais e tratados oralmente com 1600 mg/kg do

extrato aquoso do caule de Nauclea latifolia apresentaram um percentual de redução no OPG

de 93,8%, semelhante à eficácia de 94% do albendazole a 5mg/kg (ONYEYILLI et al., 2001).

Nas coproculturas tratadas com os extratos aquosos de Cymbopogon citratus (capim-santo),

na concentração de 224 mg/mL e Digitaria insularis (capim-açú), entre 138,75 e 355,2

mg/mL, houve uma redução superior a 95% de larvas de nematóides gastrintestinais de

caprinos (ALMEIDA et al., 2003). Resultados semelhantes foram registrados com os extratos

aquosos das folhas de Musa cavendishii (banana) na concentração de 130,6 mg/mL e das

sementes de Carica papaya (mamão) quando utilizados nas concentrações entre 290 e 464

mg/mL (BATATINHA et al., 2004).

A raiz de Khaya senegalensis apresentou efeito dose-dependente, reduzindo o grau de

parasitismo quando os ovinos foram tratados com 500 mg/kg do extrato etanólico, no qual a

redução foi de 88,82% no OPG. Registrou-se ainda o efeito letal em larvas de primeiro

estágio, nas coproculturas tratadas com a dose de 0,69 mg/mL (ADEMOLA et al., 2004).

Extratos de Zanthoxylum zanthyloides (Rutaceae), Newbouldia laevis (Bignoniaceae),

Morinda lúcida (Rubiaceae) e Carica papaya (Caricaceae) foram utilizados para tratar

cultivo de fezes de ovinos, sendo observado efeito em vários estágios do ciclo de vida do H.

contortus. Identificou-se, neste estudo, o potencial anti-helmíntico das espécies testadas,

alcançando 50% de inibição no desenvolvimento dos ovos e de larvas infectantes (3º estágio)

quando se utilizou a concentração de 300g/mL, entretanto os gêneros Newbouldia e Carica

apresentaram também efeito sobre estágio adulto do parasito (HOUNZANGBE-ADOTE et

al., 2004).

9

Folhas maduras de Fagara sp., quando ingeridas por ovelhas naturalmente infectadas com H.

contortus, diminuíram a excreção de ovos e reduziram significativamente a fertilidade das

fêmeas do parasita, ao contrário das folhas mais novas em que a excreção de ovos foi maior,

demonstrando a influência da fase de crescimento vegetal no controle do parasito

(HOUNZANGBE-ADOTE et al., 2005).

Estudos in vitro da atividade anti-helmíntica do suco de alho e do seu extrato metanólico

revelaram eficácia para as larvas do gênero Haemonchus em cultivo de fezes de caprinos

(ALMEIDA et al., 2004). Porém, quando os animais foram tratados com a dose de 1g/kg, não

se observou os mesmos efeitos dos testes in vitro, decorrente da ação dos microorganismos

ruminais sobre os constituintes químicos ativos no alho, levando a uma redução da sua

biodisponibilidade (BATATINHA et al., 2003).

Ademola et al. (2005) determinaram a atividade anti-helmíntica dos extratos etanólico e

aquoso de Spondias mombim sobre nematóides gastrintestinais de ovinos, constatando nos

testes in vitro inibição no desenvolvimento larval e in vivo, na dose de 500 mg/kg, redução de

15; 27,5; 65; 65 e 100% para os gêneros Haemonchus, Trichostrongylus, Oesophagostomum,

Strongyloides e Trichuris, respectivamente.

Costa et al. (2006) utilizaram 40 fêmeas de ovinos naturalmente infectados, para comprovar

in vivo o efeito anti-helmíntico da Azadirachta indica (neem), não verificando índices

satisfatórios no percentual de redução que justifiquem a utilização desta planta no controle de

nematóides gastrintestinais. Entretanto, Chandrawathani et al. (2006) registraram redução no

número de nematóides adultos em ovinos, após tratamento com as folhas frescas do neem,

embora não tenham sido observados resultados significativos na redução do OPG.

A redução superior a 95% do número de larvas de nematóides gastrintestinais foi encontrada

em culturas de fezes de caprinos tratadas com o extrato aquoso de capim-santo, na

concentração de 224 mg/mL e de capim-açu, em concentrações acima de 138,75 mg/mL

(ALMEIDA et al., 2007).

O efeito inibitório na eclosão de ovos de H. contortus do óleo essencial de Lippia sidoides, na

concentração de 0,62 mg/mL, foi de 94,88±0,6, semelhante ao timol, seu principal

constituinte químico quando utilizado na mesma concentração e ao tiabendazole na

10

concentração de 0,02 mg/mL, entretanto, na mesma concentração o óleo essencial do Croton

zehntneri e do seu constituinte anetol, a atividade ovicida decresceu para 58% e 26,6%,

respectivamente. Apesar da baixa eficácia do anetol, na concentração de 0,43 a 1,24 mg/mL,

sugeriu-se sua ação em fibras musculares, reduzindo a resposta ao estímulo da acetilcolina,

promovendo paralisia flácida (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2007).

O efeito de taninos condensados sobre as larvas infectantes e adultos de nematóides

gastrintestinais de ovinos foi investigado por Atanasiadou et al. (2000 a, b), observando

diminuição da fecundidade das fêmeas e melhor utilização protéica pelo hospedeiro, o que

propiciou melhor resposta imunológica. A viabilidade de larvas de terceiro estágio de H.

contortus reduziu após exposição às diferentes concentrações (0-10%) de taninos extraídos do

quebracho, possivelmente devido à capacidade dos taninos ligarem-se às proteínas da dieta,

resultando, dessa forma, em redução da disponibilidade de nutrientes e consequentemente

morte das larvas (ATANASIADOU et al., 2001). Sabe-se também que taninos condensados

podem ligar-se às larvas através de suas cutículas, ricas em glicoproteínas.

Vale ressaltar que a associação de preparações vegetais à alimentação diária dos animais

reduz a eficácia anti-helmíntica. O pó das folhas de Anannas comosus associado ao grão de

cevada quando oferecido a ovinos naturalmente infectados por NGI reduziu apenas 15,3% e

2,3% o OPG e carga parasitária, respectivamente (HÖRDEGEN et al., 2003). As folhas secas

da Azadirachta indica (Neen) administradas aos animais junto ao concentrado, por um

período de 90 dias não reduziu OPG nem carga parasitária (COSTA et al., 2006), embora,

eficácia anti-helmíntica com redução de 68% de ovos de H. contortus tenha sido descrita por

Pessoa (2001).

2.3 ZANTHOXYLUM RHOIFOLIUM

A família Rutaceae é essencialmente pantropical compreendendo cerca de 150 gêneros e 1600

espécies, dentre estas Zanthoxylum rhoifolium (PIRANI, 2005). Esta espécie é amplamente

distribuída nas regiões tropical, subtropical e temperada, com ocorrência na Austrália e África

(BARROSO et al. 1986) e América do Sul, na Argentina, Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador,

Paraguai e Venezuela (SILVA et al., 2007). No Brasil é difundida principalmente em solos

11

drenados (NUTTO; WATZLAWICK, 2002), em regiões de cerrado (SALGADO et al., 1998)

e de florestas Atlântica e Amazônica, florescendo de novembro a dezembro e frutificando em

dezembro, sendo considerada uma árvore de estrato inferior (PIRANI, 2005)

2.3.1 Descrição Botânica

O gênero Zanthoxylum compreende árvores ou arbustos, aculeados ou inermes que se

distinguem facilmente pelas folhas translúcidas, devido à presença de glândulas que secretam

óleos aromáticos. Seus frutos são variados e as folhas e seus elementos florais apresentam-se

com coloração esbranquiçada ou translúcida na maioria das espécies, porém ferrugínea em Z.

rhoifolium e Z. stelligerum (MELO; ZICKEL, 2004; PIRANI, 2005, 2006).

O Z. rhoifolium é uma das espécies de maior polimorfismo na família Rutaceae,

principalmente quanto ao número e tamanho dos folíolos, textura e densidade dos tricomas, o

que ocasionou diferentes descrições e nomes, possuindo até o momento 24 binômios em sua

sinonímia (PIRANI, 1999). A espécie é facilmente reconhecida no campo pelo porte arbóreo

geralmente com folhas, tronco e ramos aculeados. A depender da região do Brasil apresenta

diferentes nomes vulgares como laranjinha-do-mato, limãozinho, mamica-de-porca, espinho-

de-vintém, mamica-de-cadela, juva, juvevê. Na Bahia, é conhecida por laranjeira-brava e

espinho-cheiroso.

Z. rhoifolium é uma árvore de 10m de altura, com tronco aculeado, folhas pari ou

imparipinadas, aculeadas ou não, com tricomas estrelados (Figura 1). Apresenta de 13 a 14

pares de folíolos opostos a subopostos, cartáceos, subsésseis, elípticos a oblongo-elípticos,

com ápice obtuso ou agudo e margem crenada, com numerosas glândulas translúcidas e

odoríferas que apresentam entre dois e cinco centímetros de comprimento e 0,7 a dois

centímetros de largura. As inflorescências caracterizam-se por serem terminais e axilares em

tirsos piramidais, multifloros, estrelado-pilosos. As flores quatro a cinco meras apresentam

coloração creme-esverdeadas e as pétalas glabras; estames livres, reduzidos a estaminódios

deltóides nas flores pistiladas; disco anular glabro; ovário subgloboso, glabro, com estigma

subséssil discóide, unilocular, dois óvulos colaterais, reduzido a pistilódio cônico nas flores

estaminadas. Folículo subgloboso, vináceo a marrom com 5mm de comprimento, com

numerosas glândulas oleíferas salientes, uma semente negra, pendente pelo funículo na

deiscência do fruto (CORRÊA, 1974; PIRANI, 2006).

12

Figura 1. Morfologia de Zanthoxylum rhoifolium (PIRANI, 2006).

2.3.2 Composição Química

Os produtos químicos produzidos pelos vegetais podem ser divididos em dois grandes grupos.

Os primeiros essenciais a todos os seres vivos, são os metabólitos primários ou

macromoléculas. Nestes grupos estão incluídos os lipídeos, protídeos e glicídios, com funções

vitais bem definidas. O segundo grupo de compostos químicos, os metabólitos secundários ou

micro moléculas, que geralmente apresentam estrutura complexa, baixo peso molecular,

marcante atividade biológica e, diferentemente daqueles do metabolismo primário, são

encontrados em concentrações relativamente baixas e em determinado grupo de plantas, estas

substâncias são necessárias à sobrevivência e preservação da planta. Esses produtos atuam

primeiramente na defesa do vegetal, agindo como dissuasórios alimentares e como toxinas,

um dos exemplos é o tanino, freqüente nos frutos verdes. Outras classes tais como; saponinas,

cumarinas, limonóides, quassinóides, lactonas sesquiterpênicas e iridóides, devido ao sabor

amargo, podem atuar como desestimulantes de herbívoros (FERNANDES, 2004).

Folha aculeada Semente Fruto antes da deiscência

Flor estaminada sem duas pétalas um estame

Flor pistilada

13

Numerosos compostos químicos foram isolados de espécies pertencentes ao gênero

Zanthoxylum. Diéguez et al. (2004) revisaram sobre os principais constituintes químicos e

relataram que os alcalóides representam 89,5% das substancias ativas, além dos terpenos

(54,7%), ligninas (51,6%), esteróides (42,1%), cumarinas (37,9%) e flavonóides (23,2%). Na

Z. rhoifolium enontrou-se altos teores de alcalóides, como a berberina, alocriptopina,

candicina, magnoflorina, N-metilcanadina, N-metilsocoridina, N-metiltalicimidina,

tembetarina, magnoflorina, nitidina, diidronitidina, oxinitidina, esquimianina (DIÉGUEZ et

al., 2004) e rhoifoline (GONZAGA et al., 2003). Cantina-6-um e 5-metoxicantina-6-um

foram descritos como principais constituintes encontrados em Z. chiloperone (FERREIRA et

al., 2002).

No tronco de Z. rhoifolium, isolou-se nitidina (RIBEIRO et al., 1989), lupeol, hesperidina,

lupenona, β-sitosterol (ARRUDA et al., 1992), β-amirina, noreleritrina, umbeliferona,

escopoletina (REISCH et al., 1994), taninos, oxinitidina, skimianina e zantoxilina (MOURA

et al., 1997). Na casca das raízes isolou-se a gama-fagarina (GONZAGA et al., 2003) e das

folhas taninos, triterpenídeos e flavonóides, como vitexina e isovitexina (VON POSER et al.,

1989).

No óleo essencial de Z. rhoifolium, foram identificados 48 compostos ativos, dentre esses,

germacreno D, mentimol-1 e β-mirceno encontrados, respectivamente, nas proporções de

34% nas folhas, 46,2% de frutos e 65% de nas flores, caracterizando alta concentração de

sesquiterpenos nas folhas e monoterpenos nos frutos e flores (GONZAGA et al., 2003).

Germacreno D (16%) e β-cariofileno (11,5%) representam os principais constituintes

encontrados no óleo essencial de Z. ekmanii (FACUNDO et al., 2005).

O potencial de Z. rhoifolium como fonte de alimentos foi demonstrado por Caramori et al.

(2004), ao verificar na constituição percentuais de 13,97; 5,66; 6,56; 17,73 e 56,08% de

umidade, cinzas, proteínas, lipídeos e carboidratos respectivamente, o que mostra um alto

potencial para extração de constituintes e que podem ser explorados nos setores de indústrias

alimentícias.

14

2.3.3 Atividades Farmacológicas

Vários estudos vêm sendo conduzidos no sentido de identificar constituintes químicos que

apresentem atividades farmacológicas em espécies do gênero Zanthoxylum. O alcalóide

cantina-6-um, extraído da raiz de Z. chiloperone, administrado por via intralesional, na dose

de 10 mg/kg, durante quatro dias, apresentou eficácia leishmanicida para ratos infectados

experimentalmente, reduzindo em 15% a extensão da lesão e em 77,6% a carga parasitária, no

entanto, não se obteve resultados satisfatórios quando os animais foram tratados oralmente

com a mesma dose do extrato durante 14 dias, observando o aumento de 139,6% e 171,4%

nas lesões e carga parasitária, respectivamente (FERREIRA et al., 2002).

Alcalóides presentes nas raízes de Z. caudatum e Z. tetraspermum mostraram atividade

antibacteriana e antifúngica de (NISSANKA et al. (2001), como também o óleo essencial

obtido dos frutos de Z. xanthoxyloides, que foi eficaz contra Bacillus cereus, B. subtilis,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Enterococcus faecalis (NGASSOUM et al., 2003).

Extratos de diferentes partes da Z. americanum inibiram o crescimento de Candida albicans,

Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus (BAFI-YEBOA et al., 2005). Os extratos

etanólicos de Z. fagara, Z. elephantiasis e Z. martinicense indicaram atividade para diferentes

espécies de fungos como Sacharomyces cerevisae, Microsporum canis e Trichophyton

menthagrophytes, quando testados na concentração de 500 e 1000 µg/disco. Z. fagara exibiu

efeitos mais satisfatórios na concentração de 1000 µg/disco, alcançando índices comparáveis

com o antifúngico sintético Nistatina - 8 µg/disco (DIÈGUEZ-HURTADO, et al., 2003).

A redução significativa na fertilidade das fêmeas de H. contortus, com decréscimo da

oviposição foi constatado em ovinos, infectados experimentalmente com 2500 larvas

infectantes (L3), e que ingeriram folhas de Z. zanthoxyloides (Fagara) sem no entanto reduzir

a carga parasitária (HOUNZANGBE-ADOTE et al., 2005).

Os estudos sobre as atividades farmacológicas da Z. rhoifolium são descritos a seguir:

Gonzaga et al. (2003b) relataram atividade de alcalóides presentes na casca do tronco de Z.

rhoifolium contra bactérias gram negativas. O óleo essencial das folhas e frutos da Z.

15

rhoifolium foi ativo contra Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Salmonella

setubal, quando utilizada a concentração de 50 µg, enquanto o óleo essencial das flores foi

inativo para estes microrganismos (GONZAGA et al., 2003a).

No estudo in vitro, Jullian et al. (2006) demonstraram a atividade antiplasmodial do composto

alcalóide nitidina, extraído do tronco do Z. rhoifolium, por sua ação inibidora da DNA

topoisomerase I do Plasmodium falciparum. O óleo essencial das folhas de Z. rhoifolium, bem

como seus constituintes terpenos, β-cariofileno, apresentaram eficácia anti-tumoral e ação

imunomodulatória (SILVA et al., 2007).

16

3 ARTIGO CIENTÍFICO

Atividade antinematóide do extrato aquoso das folhas de Zanthoxylum rhoifolium Lam. (Rutaceae)

Antinematode activity of aqueous extract of Zanthoxylum rhoifolium Lam. leaves (Rutaceae)

Taíse Peneluc1; Luciana Ferreira Domingues1; Gisele Nunes de Almeida1; Maria Consuelo Caribé Ayres2; Eduardo Luiz Trindade Moreira3; Ana Carla Ferreira da Cruz1; Thereza Cristina Bório dos Santos Calmon de Bittencourt4; Maria Angela Ornelas de Almeida2; Maria José Moreira Batatinha1 RESUMO O estudo objetivou avaliar a atividade anti-helmíntica do extrato aquoso das folhas de Zanthoxylum rhoifolium e, para isto, realizaram-se dois experimentos. O experimento 1 - teste in vitro, foi realizado com cultivos de fezes de caprinos tratados com seis diferentes concentrações do extrato: 335,0; 279,1; 232,5; 193,7; 161,4; 134,5 mg/mL. Doramectina e água destilada foram utilizadas como controles positivo e negativo, respectivamente. O experimento 2 foi constituído pelo teste in vivo, pelo qual 20 ovelhas foram distribuídas em quatro grupos: G1 (seis animais) - tratados com dose única do extrato aquoso das folhas (0,63 g/kg PV), durante quatro dias; G2 ( seis animais) - tratados com a mesma dose, por oito dias; G3 (quatro animais) - controle positivo (Ivermectina) e G4 (quatro animais)- controle negativo (água). Os resultados dos testes in vitro mostraram uma redução de larvas dos gêneros Haemonchus, Trichostrongylus e Oesophagostomum superior a 95% nas concentrações de 193,7 a 335,0 mg/mL. Nos testes in vivo, com oito dias de tratamento, a redução da contagem de ovos por grama de fezes (OPG) foi de 51%, 56% e 90%, respectivamente, nos grupos G1, G2 e G3, enquanto que para os estágios imaturos (L4) e adultos (L5) variaram de 0 a 91% no grupo G1 e de 26 a 94% no G2. A eficácia da ivermectina foi de 99% para L4 e L5 de H. contortus e de 100% para as demais espécies de nematóides. Os parâmetros de avaliação clínica e bioquímica sérica permaneceram na faixa de normalidade, não apresentando diferenças estatísticas significativas (p>0,05) entre os grupos, e as análises histopatológicas não revelaram alterações renal ou hepática, que pudessem sugerir toxicidade para a dose testada. Embora altamente efetivo no teste in vitro, o extrato aquoso de folhas de Z. rhoifolium na concentração utilizada, foi pouco eficaz in vivo, na redução de nematóides gastrintestinais. Palavras-chave: Zanthoxylum rhoifolium, laranjeira brava, anti-helmíntico, nematóides,

pequenos ruminantes.

1. Laboratório de Toxicologia (LATOX/HOSPMEV/UFBA). 2. Laboratório de Diagnóstico das Parasitoses dos Animais (LPDA/HOSPMEV/UFBA). 3. Laboratório de Anatomia Patológica (LABAP/HOSPMEV/UFBA). 4. Departamento de Produção Animal (DPA/EMEV/UFBA). Endereço para correspondência: Profa. Dra. Maria José Moreira Batatinha. Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia. Av. Adhemar de Barros, 500, Ondina, 40170-110, Salvador, Bahia. Brasil. Tel.: 55 71 32636746 E-mail: mjmb@ufba.br

17

SUMMARY The aim of this study was to evaluate the antinematode activity of aqueous extract of Z. rhoifolium leaves. For this purpose two experiments were performed. In the experiment 1, in vitro test, cultures of goats fecal samples were treated with different concentrations of Z. rhoifolium leaves extract (335,0; 279,1; 232,5; 193,7; 161,4; 134,5 mg/mL). As positive and negative control respectively were used Doramectin and distilled water treatments. The experiment 2 in vivo test was composed of 20 sheep divided in four groups: G1 - the animals were treated with one dose of the aqueous extract of leaves (0,63 g/Kg PV), during four days; G2 - treated with the same dose, for eight days; G3 - positive control (Ivermectin) and G4 - negative control (water). The results of experiment 1 showed a reduction of the larvae number of Haemonchus, Trichostrongylus and Oesophagostomum greater than 95% in the concentrations between 335,0 and 193,7 mg/mL. In the experiment 2 was observed reduction of the eggs counting for gram of feces (EPG) of 51%, 56% and 90% in G1, G2 and G3 groups, respectively, while for the immature stages (L4) and adults (L5) ranged from 0 to 91% in G1 group and from 26 to 94% in G2 group. The chemical treatment with Ivermectin showed effectiveness of 99% for L4 and L5 for H. contortus and of 100% for the others species of nematodes. Clinical and biochemical parameters have remained in the normality, and they did not show significant statistical differences (p> 0,05) between groups. Histophatologic analyses did not show compatible alterations with renal or hepatic insufficiencies, suggesting absence of toxicity for the tested dose. Although the great effectiveness of Z. rhoifolium leaves extract in vitro test, it displayed poor efficiency in vivo regarding gastrointestinal nematodes reduction. Key-words: Zanthoxylum rhoifolium, laranjeira brava, anthelmintic, nematodes, small

ruminant.

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INTRODUÇÃO

As helmintoses em ruminantes continuam representando um significativo problema sanitário,

tendo em vista o grande número de rebanhos acometidos e as várias alterações orgânicas que

podem ocasionar, mesmo com a diversidade de anti-helmínticos sintéticos usados no seu

controle. Por outro lado, o uso contínuo tem gerado o desenvolvimento de nematóides

resistentes aos medicamentos (GILL; LACEY, 1998; MATTOS et al., 2004; MELO et al.,

2003; VON SAMSON-HIMMELSTJERNA, 2006).

Os estudos com plantas visam esclarecer sobre os efeitos farmacológicos, caracterizar o seu

uso in natura ou em diferentes formas farmacêuticas e obter substâncias ativas. A diversidade

brasileira de recursos vegetais, representados por rica flora nativa, permite investigar as

famílias de plantas quanto ao seu potencial farmacêutico, e por este motivo diversas espécies

vegetais têm sido empregadas por produtores rurais como medida alternativa no tratamento ou

prevenção das parasitoses dos animais domésticos (ATHAYDE et al., 2004).

Como fonte alternativa de princípios ativos para o controle de parasitos, as plantas medicinais,

com seus diferentes constituintes, vêm sendo estudadas in vitro e in vivo contra espécies de

nematóides gastrintestinais (NGI) de ruminantes (ALI-SHTAYEH et al., 2000; ALMEIDA et

al., 2007; BATATINHA et al., 2004; BATISTA, 1999; COSTA et al., 2006; HEINRICH,

2000; KRYCHAK-FURTADO, 2005; McGAW et al., 2000; VIEIRA et al., 1999).

As plantas da família Rutaceae são encontradas em regiões tropicais, subtropicais e

temperadas, com aproximadamente 1600 espécies, e no Brasil são representadas por 32

gêneros e 182 espécies, dentre as quais a Zanthoxylum rhoifolium (BARROSO et al., 1986;

PIRANI, 2005), distribuída principalmente em regiões de cerrado (SALGADO et al., 1998) e

florestas Atlântica e Amazônica (PIRANI, 2005). Para esta espécie foram atribuídas

propriedades antibacteriana (da SILVA et al., 2006; GONZAGA et al., 2003; MOURA et al.,

1999), antifúngica (da SILVA et al., 2006), antiplasmodial (JULLIAN et al., 2006) e

citotóxica para células de carcinomas humanos (da SILVA et al., 2007).

Outras espécies do gênero Zanthoxylum, como a Z. liebmannianum (NAVARRETE; HONG,

1996), Z. xanthoxyloides (AKHTAR et al., 2000) e Z. zanthoxyloides (HOUNZANGBE-

19

ADOTE, 2005a) apresentaram atividade anti-helmíntica e Z. chiloperone efeito

leishmanicida (FERREIRA et al., 2002). Os alcalóides nitidina e cantina têm sido descridos

como os constituintes farmacologicamente ativos do Z. rhoifolium (FERREIRA et al., 2002;

JULLIAN et al., 2006).

A seleção da Z. rhoifolium, popularmente conhecida como mamica-de-porca, mamica-de-

cadela, laranjeira-brava e espinho-cheiroso, foi baseada na argumentação de efeitos

carrapaticida e anti-helmíntico empíricos, para bovinos, contudo, nada foi cientificamente

registrado sobre estes efeitos. A atividade do extrato aquoso das folhas, desta espécie vegetal,

foi avaliada para nematóides gastrintestinais de caprinos (in vitro) e ovinos (in vivo),

contribuindo para o conhecimento da atividade farmacológica desta planta.

MATERIAL E MÉTODOS

Extrato aquoso de Zanthoxylum rhoifolium

Os exemplares de Z. rhoifolium, oriundos do município de Iguaí-Bahia, foram identificados e

armazenados no Herbário Antônio Nonato Marques - BAH, na Empresa Baiana de

Desenvolvimento Agrícola (EBDA), Salvador, Bahia, sob o número de exsicata No. 551. Os

extratos das folhas foram preparados no Laboratório de Toxicologia (LATOX) da Escola de

Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (UFBA).

As folhas foram secas a temperatura ambiente, trituradas em aparelho de mixer e submetidas a

uma extração aquosa, sob homogeneização mecânica, por um período de 24 horas. Para os

testes in vitro o filtrado foi liofilizado e acondicionado em frascos de vidro de cor âmbar e

congelados até o momento da sua utilização. Nos testes in vivo, o filtrado foi mantido a 4°C,

por um período de 24 horas, antes da sua utilização.

Teste in vitro

Para avaliar o efeito do extrato aquoso de Z. rhoifolium sobre ovos e larvas de nematóides

gastrintestinais, as amostras de fezes foram coletadas diretamente da ampola retal de caprinos

naturalmente infectados, mantidos sem tratamento anti-helmíntico. Estas amostras foram

submetidas à contagem de ovos por grama de fezes (OPG) (GORDON; WHITLOCK, 1939) e

20

aquelas que apresentaram OPG maior que 2000 foram misturadas, formando um único

homogeneizado, para a realização dos cultivos de larvas (UENO et al., 1998).

A determinação das concentrações do extrato in vitro foi baseada em resultados do ensaio

piloto, no qual a concentração de 335 mg/mL revelou-se como sendo a mais eficaz. A partir

desta, cinco outras foram obtidas, utilizando-se um intervalo numérico fixo de 1,3, resultando

nas concentrações de 335; 279,1; 232,5; 193,7; 161,4 e 134,5 mg/mL do extrato aquoso.

As diferentes concentrações do extrato foram testadas em triplicatas, nos cultivos de larvas

constituídos de 2g de fezes, 2g de serragem e 2 mL do extrato. Os controles positivo e

negativo foram tratados, respectivamente, com doramectina (1%) e água destilada. As

coproculturas foram incubadas em estufas a 34ºC durante sete dias. As larvas infectantes

foram coletadas e identificadas genericamente (UENO; GONÇALVES, 1998). O

delineamento experimental foi repetido três vezes para assegurar a validação dos resultados.

Teste in vivo

Local, Animais e Manejo

Este experimento foi realizado em uma fazenda localizada no município de Jandaíra, na

microrregião dos Tabuleiros Costeiros, Litoral Norte da Bahia, Brasil no período de janeiro a

fevereiro de 2005. A região é caracterizada por clima tropical-úmido com médias anuais de

temperatura e umidade relativa variando entre 25 a 29ºC e 75 a 85%, respectivamente. Os

solos são de elevada profundidade e o relevo é plano a suavemente ondulado. As médias

pluviométricas variam de 1.500 a 1.900mm3 anuais com concentração de chuva no período de

maio a setembro. Durante o período do estudo, a média de chuvas foi de 713,3mm3 com o

mínimo de 75,3 em janeiro. A propriedade era dividida em módulos de piquetes (1,5 a 2,0 ha)

para pastejo rotacionado com pastos formados por gramíneas das espécies Brachiaria

humidicola e B. brizantha

Foram utilizadas 20 ovelhas mestiças de Santa Inês de dois a três anos de idade, pesando entre

22 e 43 kg, que permaneceram sem tratamento anti-helmíntico por 60 dias. A infecção por

nematóides gastrintestinais foi confirmada antes do início do experimento, por contagem de

OPG (GORDON; WHITLOCK, 1939) e os animais distribuídos, aleatoriamente, em quatro

21

grupos experimentais, G1 e G2 com seis ovinos cada e G3 e G4 com quatro animais cada. O

método de alocação por grupos foi de acordo com a contagem de OPG para testes de eficácia

de anti-helmínticos em ruminantes, seguindo-se a Portaria Nº 48/1997, da Secretaria de

Defesa Agropecuária, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA).

Utilizou-se a máxima concentração obtida (59mg/mL) baseada no peso seco do extrato e

estimando-se a capacidade ruminal máxima de 500mL, alcançando a dose de 0,63 g/kg. O

grupo 1 foi tratado com dose única do extrato por quatro dias; grupo 2 tratado com a mesma

dose durante oito dias; grupo 3 tratado oralmente com dose única de ivermectina (200 µg/kg)

e no grupo 4, controle, sem tratamento.

Contagem de ovos e larvas

As fezes foram colhidas diretamente da ampola retal para contagem de OPG, cultura e

identificação de larvas de nematóides gastrintestinais como descrito anteriormente. As

amostras eram colhidas a cada quatro dias de todos os animais e examinadas individualmente

para quantificação e identificação de ovos. Posteriormente, realizava-se um homogeneizado,

único de cada grupo, para elaboração dos cultivos.

Recuperação de estágios imaturos e adultos

No último dia de cada tratamento, os animais foram necropsiados para contagem e

identificação dos helmintos gastrintestinais. Obedecendo-se um intervalo de quatro dias, e

uma semana após cada tratamento, necropsiava-se dois ovinos de cada grupo (G1 ou G2) e

um dos grupos controles.

A técnica para coleta de nematóides gastrintestinais em necropsia foi realizada conforme

Ueno; Gonçalves (1998) e a identificação específica segundo Levine (1968). Os animais

mantiveram-se em jejum por um período de 24 horas. Antes da liberação dos órgãos, foi

efetuada dupla ligadura, a fim de evitar a passagem de nematóides de um segmento do trato

digestório para outro. Uma alíquota de 10% (100 mL) dos conteúdos do abomaso e intestino

delgado, após lavagem da superfície mucosa, foi analisada e o número de nematóides por

gênero foi multiplicado por 10. O conteúdo do intestino grosso foi examinado integralmente.

Avaliações clínica, bioquímica e anátomo-histopatológica

22

Estas análises foram realizadas para registrar qualquer evento toxicológico do extrato aquoso

de Z. rhoifolium nos ovinos. O exame clínico dos animais (ROSEMBERG et al., 1993) foi

realizado uma vez ao dia, pela manhã, durante os 16 dias do período experimental, sendo

registrados temperatura corporal, freqüências respiratória e cardíaca e movimentos ruminais.

Diariamente os animais recebiam o extrato aquoso de Z. rhoifolium na dose de 0,63 g/kg. A

cada quatro dias, foi avaliado peso corporal individualmente.

Para monitorar as funções hepática e renal, as análises de creatinina, uréia, aspartato

aminotransferase (AST) e gama glutamil tranferase (GGT) foram determinadas no soro,

separado por centrifugação a 1000 xg, por 10 minutos e congelado a -20 ºC até o momento do

uso. Para as dosagens utilizaram-se kits comerciais (DOLES) e a leitura efetuada em

espectrofotômetro, com comprimentos de onda específicos para cada prova e os valores

expressos em U/L.

Os animais foram necropsiados de acordo com as técnicas recomendadas por Van Kruingen

(1954) e por Winter (1969) e baseados nos procedimentos e métodos de eutanásia em animais

(Resolução Nº 714 do Conselho/Federal de Medicina Veterinária, de 20 de junho de 2002).

No ato da necropsia, foram colhidos para exames histopatológicos, fragmentos de fígado e

rim, fixando-os em formol neutro tamponado a 10% e processados pela técnica rotineira de

inclusão em parafina, no Laboratório de Patologia Animal da União Metropolitana de

Educação e Cultura (UNIME-BA). Secções histológicas de 5µm foram coradas pela técnica

de hematoxilina-eosina (LUNA, 1968) para diagnóstico morfológico. Todas as amostras

foram analisadas no Laboratório de Anatomia Patológica (LABAP) do Hospital de Medicina

Veterinária – Professor Renato Medeiros Neto – da Universidade Federal da Bahia (UFBA).

Esta avaliação foi feita sem o conhecimento prévio dos grupos experimentais.

Análise estatística

Para determinar a eficácia das concentrações do extrato sobre ovos e larvas de nematóides

gastrintestinais de caprinos e ovinos, utilizou-se o teste de percentual de redução de

ovos/larvas por grama de fezes (OPG/LPG), utilizando-se a seguinte fórmula: PR = 100 (1-

T/C), onde PR é a redução calculada no OPG/LPG, T é a média geométrica dos OPG/LPGS

23

(OPG/LPG +10) dos testes e C a média geométrica dos OPG/LPGS (OPG/LPG+10) do

controle negativo (VIZARD; WALLACE, 1987). O número de larvas foi transformado em

logaritmo decimal para uniformização dos dados através da equação: y= log (x+25), onde x

corresponde ao valor absoluto do número de larvas e y ao logaritmo do número de larvas

acrescido de um valor constante (25) (BOX; COX, 1964).

Na avaliação dos testes in vitro, o efeito anti-helmíntico, segundo Horner; Bianchin (1989), é

assegurado quando o percentual de redução do número de larvas é superior a 95%. In vivo,

utilizaram-se os critérios estabelecidos pela Portaria Nº. 48/1997 do Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA): altamente efetivo >98%; efetivo 90-98%;

moderadamente efetivo 80-89% e insuficientemente ativo <80%. As diferenças nas

concentrações dos extratos e os resultados obtidos das mensurações séricas de AST, GGT,

Uréia e Creatinina e dos parâmetros clínicos foram avaliadas pelo Teste de Variância

Univariada, pelo programa estatístico SPSS (versão 13.0).

RESULTADOS

Nos testes in vitro, o extrato aquoso das folhas de Z. rhoifolium reduziu o número de larvas de

nematóides gastrintestinais (p<0,05) nas quatro maiores concentrações, de 335 a 193,7

mg/mL, com o percentual de redução do número de larvas superior a 95% (Tabela 1).

Nos testes in vivo, observou-se diminuição da média do número de ovos, no oitavo dia de

tratamento, para os grupos G2, G3 e G4, enquanto para o G1, verificou-se aumento do OPG.

Contudo, não houve diferença estatística significativa (p>0,05) entre os grupos (Tabela 2). Os

percentuais de redução do número de ovos foram 51% e 56% para os grupos G1 e G2,

respectivamente.

As coproculturas foram formadas por um único homogeneizado, por grupo experimental,

cujos percentuais de larvas de terceiro estágio (L3) dos gêneros Haemonchus,

Trichostrongylus, Cooperia e Oesophagostomum foram, respectivamente, para o G1 = 52; 13;

29 e 6%, G2 = 92; 5; 0 e 3%, G3 = 99; 0; 0 e 1% e para o G4 = 6; 38; 12 e 44%.

24

O percentual de redução para larvas do quarto (L4) e quinto (L5) estágios foi inferior a 95%

para os grupos de ovinos (G1 e G2) tratados com extrato aquoso de Z. rhoifolium (Tabela 3).

No entanto, quando se comparou o percentual de redução de nematóides das espécies

Trichostrongylus axei, Cooperia curticei e Oesophagostomum columbianum em relação aos

dias de tratamento, constatou-se melhor eficácia para o grupo G2. Nos animais tratados com

ivermectina a eficácia foi de 99% para os estágios L4 e L5 do Haemonchus contortus e de

100% para as demais espécies de nematóides (Tabela 3).

Na avaliação clínica dos ovinos, os parâmetros de temperatura corporal, freqüências

respiratória e cardíaca e movimentos ruminais permaneceram na faixa de normalidade, antes

(dia 0) e durante (4º e 8º dias) a administração do extrato, sendo considerados sem

significância clínica (Tabela 4). Não foram observadas reações de fotossensibilização em

nenhum dos animais tratados com o extrato. A comparação das médias em cada momento e

entre os grupos não apresentou diferenças estatísticas significativas (p>0,05). As médias de

peso no final do experimento não diferiram entre os grupos tratados e controles (p>0,05).

Os valores dos marcadores bioquímicos séricos (Tabela 4) que avaliaram as funções hepática

e renal dos animais conservaram-se na faixa de normalidade, apesar do aumento nas médias

dos valores das concentrações de AST, creatinina e uréia, no segundo momento de tratamento

(oito dias), não havendo diferença estatística significativa (p>0,05) entre os grupos

experimentais e os períodos estudados. Com relação à dosagem de GGT entre os animais

tratados com o extrato vegetal (G1 e G2) e os dos grupos controles (G3 e G4) foi observada

diferença estatística significativa (p<0,05) no 4º dia, enquanto no 8º dia a média dos valores

de GGT dos ovinos do grupo G4 foi superior aos demais grupos (p<0,05).

Macroscopicamente, não foram encontradas alterações no fígado e rins dos animais e, nas

análises histológicas, as alterações foram de natureza degenerativa e inflamatória de caráter

discreto, apresentando principalmente tumefação celular e esteatose hepática e nefrite

intersticial focal e esteatose renal discreta em todos os grupos experimentais.

25

DISCUSSÃO

Nos testes in vitro, concentrações altas do extrato aquoso das folhas de Z. rhoifolium foram

altamente eficazes contra larvas infectantes (L3) de NGI de caprinos. A atividade

antiparasitária do gênero Zanthoxylum foi registrada contra nematóides gastrintestinais em

ovinos (HOUNZANGBE-ADOTE et al., 2005) e contra os protozoários Leishmania

amazonensis (FERREIRA et al., 2002) e Plasmodium falciparum (ROSS et al., 2004;

JULLIAN et al., 2006). Na investigação in vitro, da atividade antiplasmodial de Z. rhoifolium

constatou-se que compostos alcalóides, como a nitidina, têm potente efeito sobre o

protozoário P. falciparum, por sua ação citotóxica, inibidora da DNA topoisomerase I

(JULLIAN et al., 2006). Outros constituintes alcalóides, como cantina, isolado de Z.

chiloperoneda, mostrou atividade leishmanicida (FERREIRA et al., 2002).

A atanina, isolada de espécies da família Rutaceae, foi eficaz contra cercárias e miracídios de

Schistosoma mansoni, com melhores índices de inibição da motilidade larval, in vitro, quando

comparado ao anti-helmíntico convencional (PERRETT; WHITFIELD, 1995). O α-sanshool

isolado de Zanthoxylum liebmannianum induziu redução de OPG nos ovinos naturalmente

infectados com parasitas gastrintestinais confirmando sua propriedade anti-helmíntica

(NAVARRETE; HONG, 1996).

Resultados do teste in vitro, com fezes de caprino, indicaram o potencial antinematóide de Z.

rhoifolium e por este motivo, os ovinos foram tratados com o extrato aquoso da planta,

entretanto, a eliminação dos nematóides foi baixa. A diferença dos hospedeiros não interferiu

na análise do potencial da planta, uma vez que os trichostrongilídeos são comuns para estas

espécies animais (KRYCHAK-FURTADO, 2006). Estudos in vitro sobre a atividade anti-

helmíntica do suco de alho e do extrato metanólico, revelaram elevada eficácia sobre larvas

do gênero Haemonchus (ALMEIDA et al., 2004), contudo in vivo, quando caprinos foram

tratados com o suco de alho (1g/Kg PV), registrou-se baixo percentual de redução de NGI

(BATATINHA et al., 2004).

Martin et al. (2001) justificam a ausência de similaridade entre resultados de testes anti-

helmínticos in vitro comparados com as avaliações in vivo devido à variação ambiental e à

26

duração do tratamento. Contudo, estudos que apresentaram resultados negativos frente à

atividade anti-helmíntica, demonstraram que estes fatores não influenciaram nos resultados

(NIRMAL-SANGWAN; SANGWAN, 1998; PIETROSEMOLI et al., 1999; COSTA et al.,

2006). No presente trabalho, observou-se que os animais do grupo G2 tratados com o dobro

do tratamento do G1 revelaram um potencial anti-helmíntico para três gêneros de nematóides,

exceto o Haemonchus, o que pode validar a hipótese descrita por Martin et al. (2001) apud

Costa et al., 2006.

Vale ressaltar também que a associação da preparação vegetal à alimentação diária dos

animais reduz a eficácia anti-helmíntica. O pó das folhas de Anannas comosus associado a

grão de cevada quando oferecido a ovinos naturalmente infectados por NGI reduziu apenas

15,3% e 2,3% o OPG e carga parasitária, respectivamente (HÖRDEGEN et al., 2003). As

folhas secas da Azadirachta indica (Neen) administradas aos animais junto ao concentrado,

por um período de 90 dias não reduziu OPG nem carga parasitária (COSTA et al., 2006),

embora, a redução de 68% de ovos de H. contortus em fezes de ovinos tenha sido descrita por

Pessoa (2001).

Os percentuais de redução para os vários gêneros de nematóides foram significativamente

inferiores quando comparados ao quimioterápico ivermectina. Apesar disto, quando se

administrou o extrato por mais tempo, observou-se que os animais tratados por oito dias (G2)

apresentaram menores percentuais de larvas infectantes (L3), exceto para o gênero

Haemonchus, quando comparados com os animais que receberam tratamento com o extrato

por quatro dias (G1).

Em relação aos estágios L4 e L5, o tratamento dos animais, por quatro dias, foi insuficiente

para reduzir a infecção por nematóides das espécies H. contortus, T. axei e C. curticei, porém

quando se prolongou o período de tratamento para oito dias, encontrou-se eficácia moderada

para T. axei. Este fato foi ainda observado na contagem de ovos, porém no grupo sem

tratamento (G4) houve redução do OPG no oitavo dia, de modo que não houve diferença

significativa entre os grupos, o que indica que o extrato vegetal não apresentou atividade

ovicida. Estudos com outras plantas também apresentaram resultados semelhantes, mesmo

quando eficazes para os diferentes estágios de desenvolvimento do parasito (BATATINHA et

al., 2004; KRYCHAK-FURTADO et al., 2005; COSTA et al., 2006).

27

O tratamento, em ambos os momentos, foi eficaz para o O. columbianum. Contudo, os ovinos

dos grupos tratados com o extrato (G1 e G2) e com o anti-helmíntico (G3) apresentaram uma

infecção leve (<50) por este parasito, quando comparados aos animais não tratados (G4), no

qual a infecção foi moderada (50 - 100) (UENO; GONÇALVES, 1998). Deve-se ponderar

que em animais previamente expostos, os estágios adultos deste nematóide são raros,

decorrentes da formação de nódulos pelo desenvolvimento da resposta imune

(hipersensibilidade do tipo IV) que retêm o quarto estágio larval na mucosa intestinal (DASH,

1973).

Embora estatisticamente não tenham sido observadas diferenças significativas no OPG entre

os tratamentos realizados nos animais, seja com o extrato aquoso de Z. rhoifolium ou com

ivermectina, numericamente, o grupo G1 excedeu dos demais grupos, em virtude da carga

parasitária elevada apenas em um animal. Salienta-se que a média do número de ovos, nas

amostras de fezes dos ovinos foi inferior a 2000. Esta resposta individual se explica pela

heterogeneidade na susceptibilidade do hospedeiro à infecção pelo parasito, devido à

distribuição binomial negativa, no qual a maioria dos hospedeiros alberga poucos parasitos ou

nenhum, enquanto que poucos hospedeiros albergam a maior proporção da população de

parasitos (VON ZUBEN, 1997; AMARANTE, 2004).

Este evento pode ter contribuído para dificultar a manifestação mais evidente de possíveis

diferenças entre os grupos tratados, apesar dos testes de padronização indicarem o uso de

animais com média de contagem de ovos de helmintos acima de 150 ovos (COLES et al.,

1992). Provavelmente, trabalhando-se com animais com maior carga parasitária os resultados

poderiam ser mais evidenciados (KRYCHAK-FURTADO, 2006).

A falta de associação entre estudos in vitro e in vivo pode ser conseqüente à ação de

microorganismos do rúmen ou de determinados compostos sobre os constituintes químicos

ativos, por influência na absorção ou solubilidade (BATATINHA et al., 2004; ADEMOLA et

al., 2005). Nenhuma referência foi encontrada sobre o metabolismo ruminal dos constituintes

da Z. rhoifolium.

O uso do extrato bruto pode ter interferido nos resultados obtidos, uma vez que os metabólitos

secundários, os quais apresentam a atividade biológica, são encontrados em concentrações

relativamente baixas (BRISKIN, 2000). Além disso, sabe-se que muitos fatores têm

28

influenciado negativamente em experimentos com vegetais, tais como idade e estágio de

crescimento da planta, local de colheita e preservação do vegetal a fresco ou dessecado

(GITHIORI et al., 2002).

Outro aspecto a ser abordado que possa ter interferido na avaliação da eficácia da planta foi o

emprego de animais infectados naturalmente e a seleção dos grupos pelo OPG, pela

variabilidade dos níveis de infecção. Quando se usa animais com infecções artificiais por

nematóides, é possível se estabelecer a dose de larvas infectantes e conseqüentemente

confirmar mais seguramente o potencial farmacológico de plantas (ATHANASIADOU et al.,

2001, ADEMOLA et al., 2004, HECKENDORN et al., 2007). No entanto, vale ressaltar que

o Teste Controlado empregando-se animais naturalmente infectados é recomendado pelo

MAPA, Portaria Nº. 48/1997.

Não se evidenciou nestas populações de nematóides, de ovinos, resistência à ivermectina,

evento registrado por Barreto et al. (2006) em ovinos criados na região do semi-árido baiano,

no qual em 27 rebanhos avaliados, observou-se uma variação de eficácia de 46 a 100% para

ivermectina e por Batatinha et al. (2004) que observaram um indicativo de resistência em

animais tratados com dose única de ivermectina (0,2 mg/kg) após encontrar um percentual de

redução de 89,82% para larvas.

No presente trabalho, o extrato aquoso de Z. rhoifolium quando usado em culturas de fezes

mostrou potencial antiparasitário, porém quando administrados em ovinos foi pouco efetivo,

pois não se observou inibição do desenvolvimento dos ovos e das larvas, principalmente para

o gênero Haemonchus, o nematódeo hematófago com maior prevalência, no Brasil, em ovinos

e caprinos (MELO et al., 2003), no qual o parasitismo pode resultar em anemia, anorexia,

depressão, fraqueza e eventualmente morte dos animais, dependendo da carga ou grau de

infecção (MILLER et al., 2006).

A administração oral do extrato aquoso foi bem tolerada pelos ovinos, uma vez que não

apresentaram alterações laboratoriais ou clínicas significantes. Considerando que todos os

valores de AST, GGT, uréia e creatinina encontraram-se dentro dos valores de referência para

ovinos Santa Inês (GREGORY et al., 2007 a, b) e que as diferenças significativas observadas

para GGT referem-se ao grupo controle, o qual não recebeu o extrato da planta e nem o anti-

helmíntico, assim sendo o extrato aquoso de Z. rhoifolium na concentração utilizada não

29

causou alterações que pudessem sugerir toxicidade nos animais. Na literatura, não há registro

sobre intoxicação por Z. rhoifolium, no entanto, o amido α-sanshool, constituinte isolado da

Z. liebmannianum, quando injetado, intraperitonealmente, em ratos induziu convulsões

tônico-clônicas (NAVARRETE; HONG, 1996).

Para as alterações observadas nas análises histológicas, não há justificativas que associem

estas alterações aos constituintes ativos presentes na planta, uma vez que os animais tratados

com 0,63g /kg de peso vivo do extrato e aqueles pertencentes aos grupos controles

apresentaram lesões semelhantes, em termos de natureza e caráter.

Com este estudo, pode-se concluir que o extrato aquoso de folhas de Z. rhoifolium, nas

concentrações utilizadas, foi efetivo no teste in vitro, mas pouco eficaz, in vivo, na redução de

nematóides gastrintestinais de ovinos mestiços de Santa Inês.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Drª. Marta Fagundes Neves pela preparação e registro da exsicata e

aos médicos veterinários Adriana Cavalcante, a qual nos cedeu gentilmente os animais e José

Borges Nery Junior, pelo fornecimento do material vegetal. A Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudo.

30

REFERENCIAS

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35

Tabela 1. Média, desvio padrão e percentual de redução (PR) do número de larvas de terceiro estágio de nematóides gastrintestinais, obtidos a

partir de fezes de caprinos, tratadas com extrato aquoso de Zanthoxylum rhoifolium.

Concentrações

do extrato (mg/mL)

Haemonchus spp Oesophagostomum spp Trichostrongylus spp Total

PR PR PR PR 335 0±0,00a 99 0±0,00 a 99 0±0,00 a 98 0±0,00a 99 279,1 3,88±11,66 a 99 0,55±1,66 a 99 0,55±1,66a 98 5±13,22a 99 232,5 33,88 ±48,65a 98 0±0,00 a 99 0,55±1,66a 98 34, 44 ±48,37a 99 193,7 118,88±144,71a 96 12,77±15,83 a 98 19,44 ±16,47a 96 151,11 ±173,490a 98 161,4 257,77±85,88b 85 86,11±43,64 b 93 62,77 ±57,28b 91 406,66 ±114,646b 89 134,5 386,66 ±152,90b 75 105,55±40,57 b 91 59,44±39,56b 90 551,66 ±158,843b 86 Doramectina 0±0,00a 99 0 ±0,00 a 99 0±0,00a 98 0±0,00a 99 Controle 1882,77±630,71 b 0 1740,55±1322,80 b 0 937,22±1111,22b 0 4560,54±2565,790 b 0

Letras não coincidentes na mesma coluna indicam diferenças estatísticas (p<0,05) PR.= Percentual de Redução

36

Tabela 2. Média, desvio padrão (DP) e percentual de redução (PR) do número de ovos de nematóides gastrintestinais, de ovinos mestiços de

Santa Inês tratados com o extrato aquoso de folhas de Zanthoxylum rhoifolium.

Dias G1 (0,63 g/kg / 4 dias) G2

(0,63 g/kg / 8 dias) G3 (Ivermectina)

G4 (Água)

Média ± DP PR Média ± DP PR Média ± DP PR Média ± DP 0 333,33±318,16a - 716,67±694,02 a b - 475,00±330,40 a b - 1525,00±1405,64 b 8 4750,00±6717,51 a 51 600,00±2385,503 a 56 200,00±2385,503 a 90 900,00±2385,503 a

Letras não coincidentes na mesma linha indicam diferenças estatísticas (p<0,05)

37

Tabela 3. Médias, desvios padrões (DP) e percentuais de redução (PR) do número de nematóides gastrintestinais recuperados de ovinos mestiços

de Santa Inês, após o tratamento com o extrato aquoso de folhas de Zanthoxylum rhoifolium.

Gêneros

G1 (0,63 g/kg / 4 dias) G2

(0,63 g/kg / 8 dias) G3 (Ivermectina – 200µg/kg) G4

(Água) Média ± DP PR Média ± DP PR Média ± DP PR Média ± DP PR Haemonchus spp

1012,50 ± 1475,79a

73

1607,50 ± 1265,21a

26

252,50 ± 287,21a

99

1870 ± 776,44a

0

Trichostrongylus spp

3347,50 ± 6351,62ab 12 402,50 ± 527,28ab 83 0.0 ± 0.0a 100 1678,66 ± 1371,09b 0

Cooperia spp

907,50 ± 1729,00a 0 62,50 ± 125,00a 68 0.0 ± 0.0a 100 97,5 ± 195a 0

Oesophagostomum spp 13,50 ± 12,79a 91 7,00 ± 5,94a 94 0.0 ± 0.0a 100 73,00 ± 48,92b 0

Letras diferentes na mesma linha caracterizam diferença significativa (p<0,05)

38

Tabela 4. Média e desvio padrão dos parâmetros de bioquímica sérica e constantes fisiológicas de ovinos mestiços de Santa Inês,

tratados com 0,63 g/kg do extrato aquoso de folhas de Zanthoxylum rhoifolium durante 4 ou 8 dias.

Parâmetros

G1 (Dias) (4 dias) G2 (Dias)

(8 dias) G3 (Dias) Ivermectina G4 (Dias)

Água 0 4 8 0 4 8 0 4 8 0 4 8

AST (U/L)

23.40a ±4.92

30.36a ±8.15

34.25a ±2.05 28.44a

±4.93 30.84a ±4.01

38.60a ±8.20 27.35a

±4.95 32.15a ±5.32

39.75a ±14.63 24.93a

±4.69 25.05a ±1.09

29.40a ±0.00

GGT (U/L)

28.83 ±6.07

41.07 ±8.17

40.89 ±9.37 24.10

±12.30 32.13 ±11.00

20.89 ±0.70 35.46

±10.29 55.23 ±7.21

41.19 ±14.00

63.20 ±20.29

83.92 ±5.65

80.79 ±15.11

Uréia (mg/dL)

33.5a ±7.70

48.22a ±6.69

55.30a ±12.01 40.88a

±5.40 67.15 b ±18.00

65.09a ±8.99 36.70a

±7.64 61.38a ±13.73

47.25a ±2.22 34.93a

±6.24 63.76a ±10.06

46.91a ±7.64

Creatinina (mg/dL)

2.22a ±0.23

3.09a ±0.15

3.46a ±0.10 2.06a

±0.16 2.99 a ±0.16

3.49a ±0.31 2.24 a

±0.10 3.14a ±0.10

3.82 a ±0.45 2.26 a

±0.10 3.14a ±0.07

3.76a ±0.32

FR (mov./min.)

46.80abc ±12.61

60.00b ±24.81

49.33abc ±10.06 42.00abc

±8.48

32.90a

bc ±13.97

49.60ab

c ±9.20

33.50ab

c ± 7.55

37.50a

bc ±10.24

38.67abc ±8.32

37.00a

bc ±15.36

31.00ac ±2.00

40.00abc ±8.00

FC (mov./min.)

87.60abc

±12.28

108.80a

bc ±19.05

114.67 abc ±4.61 78.80 abc

±9.75

98.40

abc ±6.84

92.20ab

cd ±16.58

76.50 ab ±5.26

92.00

abc ±8.00

129.33

abce ±10.06

91.00

ac ±4.76

101.00 ±7.57

abc

112.00

abc ±13.85

TC (ºC)

38.70 a ±0.30

39.5 a ±0.73

38.80 a ±0.11 38.74 a

±0.31 39.06 a ±0.20

38.80 a ±0.23 39.10 a

±0.31 39.10 a ±0.36

38.80 a ±0.35

38.80

a ±0.46

39.10 a ±0.14

38.80 a ±0.20

MR (mov./min.)

1.60 a ±0.54

2.00 a ±0.00

2.30 a ±0.57 1.80 a

±0.44 1.80 a ±0.44

2.00 a ±0.70 1.25 a

±0.50 1.75 a ±0.50

2.00 a ±1.00 1.25 a

±0.50 2.00 a 0.00

2.00 a ±0.00

Peso (kg) 32.80 a ±5.40

3280 a ±540

34.33 a ±7.50 36.40 a

±4.56 36.40 a ±4.56

36.40 a ±4.72 32.00 a

±5.35 32.00 a ±5.35

35.00 a ±6.55 32.25

a 33.20 a ±6.18

32.67 a ±9.07

39

±6.18 Letras não coincidentes na mesma linha indicam diferenças estatísticas (p<0,05); FR = freqüência respiratória; FC = Freqüência cardíaca; TC =Temperatura Corporal; MR = Movimentos ruminais.

40

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O aproveitamento dos recursos renováveis abundantes ou resíduos de exploração e

transformação é uma alternativa para a obtenção de produtos com alto valor agregado. O

estudo de plantas enquadra-se neste contexto, especialmente pela escassez de

fitomedicamentos para uso animal e por este motivo a fitoterapia é pouco utilizada na

medicina veterinária.

O presente estudo contribuiu para o conhecimento da atividade farmacológica da rutaceae Z.

rhoifolium contra os nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes, que se constituem

em uma das principais limitações à produção animal, e que tem o seu controle realizado quase

que exclusivamente com quimioterápicos.

Um amplo número de testes, in vitro e in vivo, voltados para avaliação das propriedades anti-

helmínticas de nematódeos gastrintestinais de pequenos ruminantes, vem sendo usado para

determinar a atividade de plantas, extratos e suas frações, sobre ovos, larvas e adultos de

nematóides. As metodologias adotadas, neste estudo, mostraram aplicabilidade para avaliar a

atividade antinematóide do Z. rhoifolium. Entretanto, o extrato aquoso de folhas foi pouco

eficaz, in vivo, na redução de nematóides gastrintestinais.

A atividade farmacológica de plantas medicinais é dependente de vários fatores, como as

infecções parasitárias mistas, presentes em ovinos e caprinos, o que permite uma variabilidade

no potencial biótico e na resistência ambiental, e conseqüentemente promover um aumento da

população de parasitos, que poderá intervir na atividade terapêutica como registrado com os

anti-helmínticos. Outros aspectos devem ser levados em consideração, como as partes

anatômicas da planta usadas para a preparação dos extratos, a época e hora da coleta e a

região, pois fatores edafoclimáticos podem alterar a concentração de substâncias ativas.

Também são relevantes, os métodos de extração, que podem influenciar na liberação dos

constituintes, em termos quantitativos e qualitativos, em função das diferenças de polaridade

dos solventes utilizados, além do tipo e o tempo de preparo do extrato, concentração do

princípio ativo, via de administração e a espécie animal.

O período de tratamento deve ser também avaliado, pois quando esse foi prolongado no

presente estudo, possibilitou a redução de nematóides dos gêneros Trichostrongylus,

41

Cooperia e Oesophagostomum, revelando a existência de potencial anti-helmíntico da planta.

Além disso, é importante salientar a segurança terapêutica, pois os parâmetros de avaliação

clínica e bioquímica sérica dos ovinos permaneceram na faixa de normalidade, e as análises

histopatológicas não revelaram alterações renal ou hepática, que pudessem sugerir toxicidade.

Estes resultados com as folhas de Z. rhoifolium indicam a necessidade de experimentos

adicionais com diferentes extratos, dosagem e freqüência de administração, bem como o

isolamento e a identificação de constituintes das várias partes desta espécie vegetal para

confirmar a bioatividade em nematóides gastrintestinais.

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REVISTA BRASILEIRA DE PARASITOLOGIA VETERINÁRIA

Brazilian Journal of Veterinary Parasitology

 POLÍTICA EDITORIAL E INSTRUÇÕES AOS AUTORES

Objetivo e política editorial

A Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária tem periodicidade trimestral e destina-se à publicação de trabalhos científicos originais sobre temas relativos a Helmintos, Protozoários e Artrópodes parasitas e assuntos correlatos.

A publicação de artigos dependerá da observância das normas editoriais, dos pareceres do Corpo Editorial e ou relator ad hoc. Apesar de serem de responsabilidade dos autores os conceitos emitidos nos trabalhos, os editores reservam-se o direito de sugerir ou solicitar modificações necessárias.

A revista tem por finalidade publicar artigos completos, notas de pesquisa e artigos de revisão, sendo estes últimos condicionados a solicitação do corpo editorial.

O (s) autor (res) deverá (ão) submeter o trabalho anexando carta devidamente assinada, declarando ser o artigo original, não publicado anteriormente, salvo sob a forma de resumo em eventos científicos, assim como, declaração de concordância de todos os autores com a submissão do trabalho.

Taxas de publicação e tramitação:

A taxa de tramitação é de R$ 20,00, por trabalho, pagos no ato da submissão. A taxa de publicação de artigos aceitos é de R$ 15,00, por página impressa, cujo valor total será informado aos autores quando da editoração. Os pagamentos deverão ser realizados através de cheque nominal a Fundação de Apoio a Pesquisa Científica e Tecnológica da UFRRJ (FAPUR).

Não serão cobradas taxas, se pelo menos um dos autores for associado ao Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária.

Apresentação de manuscritos/Instruções aos autores

Na elaboração do texto deverão ser observadas as seguintes normas:

Os trabalhos deverão ser apresentados em três cópias impressas em uma só face, com páginas numeradas, não excedendo a 15 para artigos completos e 5 para notas de pesquisa, digitados em fonte Times New Roman tamanho 12, margens superior e inferior com 2,5 cm, esquerda e direita com 3 cm e espaço entre linhas 1,5. As tabelas e as ilustrações deverão ser apresentadas em folhas separadas e anexadas ao final do trabalho. A versão final dos trabalhos, aceitos para publicação, deverá ser apresentada em disquete (3 ½ polegadas) ou em CD ROM identificados, em editor de texto compatível com o Word for Windows, sem formatação do texto, devidamente acompanhados de uma cópia impressa.

Os trabalhos podem ser redigidos em português, espanhol ou inglês, da forma mais concisa possível, com linguagem sempre que possível no passado e impessoal, com os sinais de chamadas de rodapé em números arábicos e lançados ao pé da página em que estiver o respectivo número e em ordem crescente.

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Siglas e abreviações dos nomes de instituições, ao aparecerem pela primeira vez no trabalho serão colocadas entre parênteses e precedidas do nome por extenso.

As citações no texto devem ser efetuadas pelo sistema autor-data, conforme norma NBR 10520/2002 da ABNT.

Os artigos completos devem ser organizados obedecendo a seguinte seqüência: Título, Autores, Abstract, Resumo, Introdução, Material e Métodos, Resultados, Discussão, Conclusões (ou combinação destes três últimos), Agradecimentos (facultativo) e Referências Bibliográficas.

As notas de pesquisa obedecem a seqüência acima sem a necessidade de se destacar os tópicos, sendo escrito em texto corrido.

Características dos elementos de um trabalho científico:

Título/autores: Original e traduzido e logo abaixo do título deve constar o (s) nome(s) do (s) autor (res). No rodapé, vinculação dos autores, órgão financiador e endereço completo para correspondência, incluindo e-mail, telefone e fax.

Abstract: Deve ser sempre escrito em língua inglesa, em um único parágrafo sem deslocamento, e inserido logo após os autores, constituindo-se em tradução fiel do resumo, seguido por key-words.

Resumo: deve conter no máximo 200 palavras em um só parágrafo sem deslocamento, redigido na língua de origem do trabalho. Não deve conter citações bibliográficas; siglas e abreviações dos nomes de instituições. Deve ser informativo, apresentando o objetivo do trabalho, metodologia sucinta, os resultados mais relevantes e a conclusão. Os trabalhos redigidos em língua inglesa deverão apresentar o resumo em língua portuguesa, seguido das palavras-chave.

Palavras-chave e Key-words : as palavras-chave devem expressar com precisão o conteúdo do trabalho e seu uso limitado a cinco.

Introdução: Explanação clara e objetiva do problema, da qual devem constar a relevância e objetivos do trabalho, restringindo as citações ao necessário.

Material e Métodos: Descrição concisa, sem omitir o essencial para a compreensão e reprodução do trabalho. Métodos e técnicas já estabelecidos devem ser apenas citados e referenciados. Trabalhos submetidos à avaliação em Comitê de Ética deverão incluir um parágrafo nesta seção para notificação.

Resultados: Sempre que necessário devem ser acompanhados de tabelas, figuras ou outras ilustrações, auto-explicativas. O conteúdo deve ser informativo e não interpretativo.

Discussão: Deve ser limitada aos resultados obtidos no trabalho e o conteúdo deve ser interpretativo. Poderá ser apresentada como um elemento do texto ou juntamente com os resultados, formando o tópico Resultados e Discussão.

Tabelas: Elaboradas apenas com linhas horizontais de separação no cabeçalho e ao final. A legenda (título) é precedida da palavra Tabela, seguida pelo número de ordem em algarismos arábicos, devendo ser descritivas, concisas e inseridas acima das mesmas. As tabelas devem estar limitadas a um número mínimo necessário, lembrando que tabelas muito grandes são difíceis de serem lidas. Devem ser digitadas em espaço duplo em arquivos separados. Todos os dados das tabelas devem ser digitados em minúsculo, exceto as siglas.

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Figuras: as figuras são ilustrações tais como: desenho, fotografia, prancha, gráfico, fluxograma e esquema. Devem ser de boa qualidade e numeradas consecutivamente. As legendas devem ser precedidas da palavra Figura, seguida da numeração em algarismo arábico e inseridas abaixo das mesmas. Listar as legendas numeradas com os respectivos símbolos e convenções em folha separada em espaço duplo. O número de ilustrações deve ser restrito ao mínimo necessário. Fotografias digitais deverão ser enviadas em arquivos separados, tal qual foram obtidas, nos casos de foto em papel enviar o(s) original(ais). A revista não publica figuras em cores.

Conclusões: As conclusões podem estar inseridas na discussão ou em resultados e discussão, conforme a escolha dos autores. Neste caso, este item não será necessário.

Agradecimentos: Quando necessário, limitados ao indispensável.

Referências bibliográficas: A lista de referências deverá ser apresentada em ordem alfabética pelo sobrenome do primeiro autor, sem numeração, registrando-se o nome de todos os autores, usando as normas da ABNT (NBR 6023/2002) simplificada conforme exemplos:

Livro:LEVINE, J. D. Veterinary Protozoology. Ames: ISU Press, 1985. 414 p.

Artigo completo:BUGG, R. J.; ROBERTSON, I. D.; ELLIOT, A. D.; TOMPSON, R. C. A. Gastrointestinal parasites of urban dogs in Perth, Western Australia. Veterinary Journal, v. 157, n. 3, p. 295-301, 1999.

Resumo:LIMA, N. D. Eimeriose dos ruminantes. In: II SEMINÁRIO BRASILEIRO DE PARASITOLOGIA VETERINÁRIA, 20, 1980, Fortaleza. Anais ... Brasília: C B P V, 1980. p. 79-97.

Tese, dissertação:ARAUJO, M. M. Aspectos ecológicos dos helmintos gastrintestinais de caprinos do município de Patos, Paraíba – Brasil. 2002. 40 p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2002.

Documento eletrônico:CDC. Epi Info, 2002. Disponível em: http://www.cdc.gov/epiinfo/ei2002.htm. Acesso em: 10 jan. 2003.

JESUS, V. L. T.; PEREIRA, M. J. S.; ALVES, P. A. M. Susceptibilidade de raças bovinas a tricomonose genital. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE PARASITOLOGIA VETERINÁRIA, 12, 2002, Rio de Janeiro. Anais...Rio de Janeiro: CBPV, 2002. 1 CD-ROM.

Endereço para envio de trabalhos:Revista Brasileira de Parasitologia VeterináriaUFRRJ/Instituto de Veterinária – Departamento de Parasitologia AnimalBr 465, Km 7 Seropédica – Rio de JaneiroCEP: 23 890 000e-mail: revista-cbpv@ufrrj.brTel/fax: (21) 2682-1617

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