Capítulo I Métodos de Detecção de Enterotoxinas ... · produção de SEs (Stiles e Krakauer, 2005a). As SEs interagem com vários alvos celulares desencadeando reações biológicas

Capítulo I

Métodos de Detecção de Enterotoxinas

Estafilocócicas

1- Introdução

1.1 – Aspectos gerais sobre as enterotoxinas estafilocócicas

As enterotoxinas estafilocócicas (SEs) são proteínas monoméricas de peso

molecular variando entre 22 e 31 kDa, termoestáveis e de vida média longa, que são

secretadas e acumuladas durante a fase estacionária de crescimento in vitro e in

vivo de diferentes cepas de Staphylococcus aureus enterotoxigênicas (Balaban e

Rasooly, 2000). Essas proteínas são determinantes de intoxicações alimentares, na

ordem de microgramas (3,5 – 150 µg, dependendo da sensibilidade da espécie e do

indivíduo), após a ingestão acidental ou intencional de alimento contaminado (Ilbäck

et al., 2003; Rusnak et al., 2004; Mantis, 2005).

As intoxicações ocorrem frequentemente após ingestão de carnes processadas

e produtos derivados do leite contaminados por causa do manuseio impróprio dos

alimentos e subseqüente acondicionamento inadequado, por exemplo,

armazenamento em altas temperaturas, levando ao crescimento de S. aureus e à

produção de SEs (Stiles e Krakauer, 2005a).

As SEs interagem com vários alvos celulares desencadeando reações

biológicas e fisiológicas que conduzem às manifestações clínicas características de

intoxicação alimentar: náuseas, vômitos, vertigens e ocorrência de diarréia entre

uma a seis horas após ingestão do alimento contaminado (Mantis, 2005).

Hipotensão, deficiência nas funções renais e edema pulmonar são também

alterações freqüentes em casos de intoxicação. A recuperação ocorre no período de

vinte e quatro horas, porém, óbitos entre neonatos e idosos não são raros (Medina-

Acosta et al., 2003).

Tradicionalmente, cinco tipos de SEs antigênicas clássicas são reconhecidas

(SEA, SEB, SEC, SED e SEE (Dinges et al., 2000)). Entretanto, durante os anos 90,

novas enterotoxinas (SEG, SEH, SEI e SEJ) foram descritas e seus genes

identificados (Zhang et al., 1998). Recentemente, dados resultantes das análises

genômicas têm levado a uma expansão rápida do alfabeto de SEs e à descrição de

novos genes (sek, sel, sem, seo, seq, ser e seu) (Jarraud et al., 2001; Orwin et al.,

2001, 2002, 2003; Letertre et al., 2003; Omoe et al., 2003).

Entre as SEs, os sorotipos SEA, SED e SEE compartilham

maior homologia, variando entre 53 e 81%. Elas também apresentam uma

conformação tri-dimensional conservada, que separa dois domínios distintos de

2

ligação ao receptor de célula T (TCR) (Hurley et al., 1995). Uma outra característica

indicativa da similaridade estrutural das enterotoxinas é a reatividade cruzada e

neutralização com anticorpos (Kum e Chow, 2001).

As SEs são estruturalmente semelhantes entre si e na localização das pontes

dissulfeto. Análises cristalográficas revelaram que estas moléculas possuem forma

elipsoidal e que são pregueadas de modo a formar dois domínios contendo uma

mistura de estruturas α-hélices e folhas-β pregueadas, conforme observado na

figura 1. As enterotoxinas compartilham várias regiões conservadas e possuem o

duplo domínio separado por uma pequena cavidade. A união entre esses domínios,

que dá a conformação tridimensional, parece ser bastante conservada, mas a

seqüência de aminoácidos nestas regiões não (Balaban e Rassoly, 2000).

Além das semelhanças estruturais (Balaban e Rassoly, 2000), as SEs exibem

similaridades biológicas de superantigenicidade e enterotoxigenicidade (Jarraud et

al, 2001).

Figura 1: Modelo da estrutura tridimensional da enterotoxina B, demonstrando os

dois domínios da molécula (Georgiou et al., 1998).

1.2 – Atividades enterotoxigênica e superantigênica das enterotoxinas

Harris et al. (1993) propuseram que existe uma relação entre a atividade

superantigênica e enterotoxigênica das toxinas, e que na maioria dos casos, a perda

da atividade superantigênica resulta na perda de enterotoxigenicidade. Porém,

essas duas atividades são atribuídas a domínios distintos da molécula (Hoffman et

al., 1996). Assim sendo, o fato de a proteína ser superantigênica não significa

necessariamente que ela seja enterotoxigênica.

3

A superantigenicidade está relacionada à capacidade da proteína estimular

inespecificamente a proliferação de células T, enquanto que a enterotoxigenicidade

e o efeito emético estão relacionados com a estimulação do sistema nervoso central,

após atuação da toxina nos receptores neurais intestinais (Monday e Bonach, 1999).

O efeito emético está associado a náuseas, vômitos, dores abdominais,

prostração e diarréias. Os primeiros acontecem de duas a seis horas após a atuação

da toxina sobre os receptores neurais no intestino. Na maioria dos hospedeiros, a

diarréia ocorre devido ao aumento do peristaltismo intestinal e perda de líquido pelo

organismo (Balaban e Rasooly, 2000)

A administração via oral de SEA não resulta em danos na membrana da

mucosa gastrointestinal como edema, citólise, necrose do tecido do lúmen ou

alterações na morfologia do epitélio. Esses fatos dificultam os estudos do

mecanismo pelo qual a toxina induz a intoxicação alimentar e resulta em vômitos e

diarréia. Hu et al. (2005a), sugerem ainda que o contato direto da enterotoxina com

o epitélio intestinal afeta a função epitelial, pelo aumento da liberação de cálcio

intracelular, e seu efeito sobre a sinalização celular deste tecido, já que o cálcio é

importante regulador de muitos processos fisiológicos e respostas patológicas.

Analisando estruturalmente a SEA carboximetilada foi revelado que a histidina

na posição 61 é importante para o evento emético, mas não para a

superantigenicidade (Hoffman et al., 1996). Entretanto, foi descrita como

responsável pela êmese na SEA, a região peptídica dos resíduos 121 a 180 que não

possui a alça dissulfeto e histidinas (Hu et al., 2001). As regiões dos domínios

central e C-terminal das SEs parecem ser responsáveis por causarem tais efeitos

uma vez que a remoção de 59 resíduos da região N-terminal, testada em SEC 1,

não altera essa propriedade (Spero et al., 1976).

Tais toxinas possuem dois domínios principais responsáveis por sua ligação às

cadeias Vβ das moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade Classe II

(MHC II), estimulando inespecificamente as células apresentadoras de antígenos

(APCs) (Dinges et al., 2000) (figura 2). Para realizar tal função, as APCs requerem o

reconhecimento da cadeia β do TCR para interação deste com as proteínas do MHC

II nas APCs, sem o processamento do antígeno. Devido a essa interação, as SEs

causam ativação de até 25% dos linfócitos T (Kappler et al., 1994). Em contraste, os

antígenos clássicos ativam 0,0001-0,01% das células T (Fink et al., 1986). Como

resultado da ativação celular ocorre um excesso na produção de citocinas, tais como

4

fator de necrose tumoral (TNF) α e β, interleucinas (IL) 1 e 2 e interferon (INF) γ.

Estas citocinas são responsáveis por vários sintomas clínicos observados em

septicemias e na síndrome do choque tóxico, levando as células à apoptose e

resultando em imunossupressão (Rellahan et al., 1990).

O choque tóxico tem como manifestações clínicas febre acima de 39ºC,

exantema com descamação, hipotensão, podendo afetar os sistemas muscular

(mialgia severa), mucoso (com enantema), renal (elevação de uréia e creatinina),

hepático (elevação da transaminases e hiperbilirubinemia, levando a lesão),

hematológico (trombocitopenia e linfocitopenia) e nervoso central (desorientação,

sem sinais neurológicos focais) (Veronesi et al., 1997).

Figura 2: Esquema de ativação de linfócito T por antígenos clássicos e

superantígenos (Phillips, 2002, adaptado).

Experimentos usando mutantes do TCR sugerem que as três alças, CDR1,

CDR2 e CDR3, da cadeia Vβ contactam uma cavidade nas moléculas de SEA, SEB

e SEC, formada por resíduos de aminoácidos de pelo menos três regiões separadas

na estrutura primária da toxina, porém aproximadas durante a organização

tridimensional da molécula (Bentley, 1995). A diferença na seqüência de

aminoácidos na cavidade das SEs permite a diversidade de suas interações com as

regiões Vβ (Balaban e Rassoly, 2000), que possuem um repertório de

aproximadamente 25 famílias.

1.3 – Estado-da-arte da detecção de enterotoxinas

Além de ser um problema de ordem de saúde pública, a presença das SEs

resulta em perda econômica para o produtor de leite (Wilson et al., 1997). A infecção

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intramamária em gado leiteiro com S. aureus causam a doença típica de mastite,

que resulta em perda da produção e da qualidade do leite para consumo (Weigler et

al., 1990; Beck et al., 1992).

Ainda, as SEs estão classificadas na Categoria B de agentes de risco biológico

e são considerados de fácil disseminação (Kaempfer et al., 2002) e, se distribuídas

acidental ou intencionalmente na população, resultam em morbidade moderada e

mortalidade baixa. Por causa da situação de bioterrorismo, os Institutos de Saúde

dos EUA (NIH) e o Centro para o Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC)

colocaram essas toxinas na lista de agentes biológicos que têm o potencial de ser

utilizadas como armas biológicas (Mantis, 2005).

Os problemas associados às SEs alertam sobre a necessidade de rápida

detecção em produtos de consumo humano, para que os tratamentos sejam

providenciados antecipadamente a doença clínica.

Muitos métodos têm sido desenvolvidos para detecção de SEs. Basicamente se

resumem a ensaios biológicos e imunológicos. Os ensaios imunológicos são mais

sensíveis e específicos e são base para detecção das SEs identificadas

sorologicamente. Entretanto, qualquer SE não caracterizada pode ser detectada

apenas pela sua atividade emética em macacos. A quantidade de SE requerida para

causar doença em homens depende da susceptibilidade dos indivíduos, dessa

forma, o ensaio diagnóstico, além de específico, deve ser sensível o suficiente.

1.3.1 – Detecção baseada em ensaios biológicos

A maioria dos ensaios biológicos utiliza macacos, gatos e cobaias (Su e Wong,

1997). As enterotoxinas são detectadas pela sua atividade emética em macacos.

Classicamente, as amostras suspeitas são aplicadas intragastricamente em

macacos Rhesus jovens e os efeitos eméticos podem ocorrer em até cinco horas

após ingestão, caso a amostra contenha alguma enterotoxina. A dose efetiva média

(ED50) varia de 5 a 20 µg. Dentre as desvantagens deste método estão a variação

na sensibilidade dos animais, a inabilidade de diferenciação entre os sorotipos das

SEs, o desenvolvimento de resistência em animais a repetidas administrações de

SEs, além do alto custo dos ensaios (Surgalla et al., 1953).

Em gatos, SEC só é capaz de produzir efeitos eméticos quando utilizada cinco

vezes acima da concentração de SEA ou SEB (Bergdoll, 1972). Além das SEs,

outras substâncias tóxicas presentes no meio de cultura são capazes de causar

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vômitos nestes animais. Dessa forma, o resultado deve ser analisado

criteriosamente (Dolman et al., 1936).

A injeção cutânea de toxina após injeção intravenosa com azul de Evans (1%)

em cobaias sensibilizadas com imunoglobulina E anti-SEB resulta na produção de

uma área sensibilizada de aproximadamente 5 mm de diâmetro. Por este método é

possível detectar 10 pg de enterotoxina num período de dez a quinze minutos,

porém é impraticável o uso deste ensaio para analisar um grande número de

amostras para SEB (Scheuber et al., 1983).

1.3.2 – Técnicas baseadas em ensaio enzimático imunoabsorvente

O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) é uma ferramenta fundamental

na detecção de agentes biológicos, incluindo toxinas como as SEs. Baseado nos

princípios de interações antígeno-anticorpo, o ELISA permite uma fácil visualização

de resultados e pode ser finalizado sem a adição de materiais radioativos (Khan et

al., 2003).

Uma variedade de técnicas qualitativas para detecção dessas toxinas está

disponível no mercado (figura 3). Essas técnicas incluem os ensaios

imunoabsorventes radioativos e os kits EIA (enzyme immunosorbent assay), alguns

dos quais estão disponíveis como kits comerciais. A sensibilidade dessas técnicas

difere, e o menor limite de detecção tem sido de 0,1 ng/mL de enterotoxina B

estafilocócica (SEB) com o kit SET-EIA (Kijet et al., 2000).

Figura 3: Kit comercial de diagnóstico. Em geral, os kits são compostos de soluções

de incubação, lavagem, revelação, reagentes e recipientes previamente preparados

para a reação.

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Vernozy-Rozand et al. (2004), compararam especificidade e sensibilidade de

três kits (VIDAS SET - bioMérieux, VIDAS SET2 - bioMérieux e TRANSIA PLATE –

Diffchamb, Lon, France) disponíveis no mercado para detecção de SEs. Realizaram

ensaios em diversos tipos de alimentos, a saber: cozidos, crus (delicatessen e

produtos do mar), enlatados, líquidos, desidratados e derivados do leite. Desses

alimentos, apenas os crus apresentaram falso-positivos, com especificidade de 82%

e 78%, para os kits, VIDAS SET e TRANSIA PLATE, respectivamente.

Quanto à sensibilidade, o kit VIDAS SET2 foi o melhor e os resultados foram

comparáveis com os imunoensaios Western blot (Rasooly e Rasooly, 1998),

biosensores bidifrativos (O`Brien et al., 2000), e sensores baseados em

fluorescência (Rowe-Taitt et al., 2000). Vale ressaltar que os tempos necessários

para realizar os ensaios são de oitenta minutos para VIDAS SET e VIDAS SET2 e

cento e quarenta e cinco minutos para TRANSIA PLATE. Os dois primeiros, por

serem automatizados, podem ser incorporados no programa Hazard Critical Controle

Point (Su e Wong, 1997), e serem usados para análise de SEs em larga escala.

Também foram considerados dois outros métodos capazes de detectar toxinas

em amostras mais difíceis como leite seco (contendo 5% de umidade). Esses

métodos são o biosensor de ressonância de superfície de plasma (Homola et al.,

2002) e o citômetro imunomagnético (Miyamoto et al., 2003).

Além dos métodos qualitativos, também existem os quantitativos. Sasaki et al.

(2005), estabeleceram um imunoensaio específico e quantitativo, utilizando

anticorpos monoclonais num sistema, baseado no ELISA sanduíche, o ABS-ELISA

(avidin-biotin sandwich ELISA). O método é sensível e confiável, comparado com o

SET RPLA (DENKA SEIKEN Co., Tókio) comercial, baseado em aglutinação em

látex (quantitativo), porém foi considerado superior porque o tempo requerido para

medição é menor (três horas para o RPLA versus dezoito horas para o ABS-ELISA)

e a exatidão na determinação da concentração dos antígenos foi maior (desvio

padrão de 0,01-0,87 para o ABS-ELISA e de 0,0009-6,2 para o SET RPLA).

Um método sensível e mais rápido foi desenvolvido por Alefantis et al. (2004).

Neste método utiliza-se um sistema de dois anticorpos onde um anticorpo policlonal

anti-SEB está ligado a esferas magnéticas e o outro, um anticorpo monoclonal anti-

SEB marcado, está ligado com Alexa flúor 647 (figura 4).

8

Figura 4: Esquema representativo do funcionamento do imunoensaio para detecção

de S

numerosas aplicações dos chips de proteínas, produzidos acoplando-se tais

proteínas a uma estrutura bi ou tridimensional, incluem a detecção de marcadores

de doenças e alérgenos, estudos de interações entre proteínas em células e em

plasma e para análise de proteoma (Zhy e Snyder, 2003; Seong e Choi, 2003;

Glokler e Angenent, 2003).

Rubina et al. (2005), desenvolveram e aperfeiçoaram microchips de proteínas

baseados em imunoensaios direto, competitivo e sanduíche. Estes microchips são

capazes de detectar, em horas, algumas biotoxinas, dentre elas SEB, toxinas do

EB baseado em esferas magnéticas. Basta misturar a amostra problema aos

dois componentes, incubar trinta minutos a 37ºC, lavar e medir a presença do

anticorpo marcado em um espectrofotômetro. O tempo total deste ensaio é de

aproximadamente quarenta e cinco minutos (Alefantis et al., 2004, adaptado).

Atualmente, a pesquisa científica e tecnológica está na fase dos microchips,

que são arranjos de microelementos individuais contendo várias sondas. Ao

contrário dos métodos comuns, os microchips permitem análises paralelas de

amostras, para diversos parâmetros, utilizando baixas quantidades de material.

Entretanto, essas análises são feitas de forma sensível, segura e eficiente. As

9

tétano e da difteria e fator letal de antraz (figura 5). Os resultados dos imunoensaios

podem ser alcançados por vários métodos: intensidade de fluorescência, pela

intensidade de quimioluminescência da proteína conjugada a peroxidase e por

espectrometria de massa direta (MALDI TOF) dos elementos do microchip.

Microarranjos semelhantes foram desenvolvidos por Rucher et al. (2005), porém

estes eram específicos para a subunidade b da toxina do cólera, toxina da difteria,

fator letal e o antígeno protetor do antraz, SEB e o fragmento C da toxina do tétano.

Figura 5: Microchips de proteínas para detecção de toxinas. Os pontos brancos

intensos são indicativos de presença de toxina nas amostras testadas (Rubina et al.,

2005, modificado).

1.3.3 – Detecção por Western blot

A técnica Western blot supera alguns dos problemas associados com os

ensaios de ELISA. O Western blot é um método amplamente usado para análise de

proteínas e, assim, tem sido usado para detectar SEA e SEC (Orden et al., 1992;

Uhl, 2004). Em um imunoblot, as proteínas são separadas por tamanho usando a

eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) ou por

ponto isoelétrico usando gel de enfoque isoelétrico, transferido para uma membrana,

que é, então, incubada com anticorpos específicos (figura 6). Uma vez que o ELISA

e o Western blot se baseiam em detecção imunológica, os imunoblots apresentam

duas vantagens para o teste em alimentos. Primeiro, mesmo que o tratamento

térmico possa causar agregados protéicos, os agregados são solubilizados e

desenovelados em gel de SDS. Não existe um passo de solubilização em ELISA

porque a amostra é diretamente aplicada no anticorpo, e SDS na amostra

10

desnaturaria o anticorpo. Segundo, a reação cruzada entre antígenos pode ser

caracterizada em Western blot, enquanto no ELISA, eles apenas aumentam o

background. No blot, o peso molecular (ou o ponto isoelétrico) identifica o antígeno

e está reagindo com o anticorpo (Rasooly e Rasooly, 1998). qu

Figura 6: Esquema representativo da transferência de proteínas para membrana de

nitrocelulose e marcação de anticorpos que reconhecem as proteínas presentes em

uma amostra desconhecida.

1.3.4 – Detecção pela PCR

Como técnica moderna da Biologia Molecular, a PCR (polymerase chain

reaction) também tem sido utilizada na detecção dos genes que codificam

enterotoxinas (figura 7). Ela se faz de forma específica, porém, a amplificação das

seqüências não é evidência da toxina no material biológico (Sasaki et al., 2005).

Entretanto, apesar de ser executado em horas e até mesmo em dias, uma vantagem

deste método é o fato de possuir uma alta sensibilidade e precisão, mesmo numa

amostra com baixa concentração de microrganismos. É possível amplificar a cópia

de uma seqüência para enterotoxina em 1 pg de DNA, o que corresponde a 10

CFU/mL (Cremonesi et al., 2005).

11

Figura 7: Esquema representativo do funcionamento da técnica da PCR.

A polimerase sintetiza a molécula de DNA. Estes processos

esnaturação, anelamento e alongamento) ocorrem em vários ciclos de forma que,

ilhões de fragmentos de DNA de peso

mole

o. Esta técnica é aprovada pela Associação Oficial

de A

nas técnicas de microlâmina e ótima sensibilidade em placa (Robbins et al., 1974).

Inicialmente o DNA de interesse é desnaturado e os iniciadores presentes na

solução se ligam de forma complementar e antiparalelamente a uma das fitas. Em

seguida, a DN

(d

ao final do processo, são amplificados m

cular específico correspondente a seqüência de interesse.

1.3.5 – Detecção por Imunodifusão

Um dos métodos de referência, a imunodifusão ou técnica de Ouchterlony foi

desenvolvida por Casman et al. (1969); requer de três a dez dias para obtenção dos

resultados. Neste método, a proteína e um anticorpo específico difundem por um gel

e a reação entre ambos forma uma linha de precipitação característica de

positividade (figura 8). É um método que detecta cerca de 500 ng/mL de

enterotoxina no material suspeit

nálises Químicas (AOAC), adotada pelo FDA e é recomendada como método

padrão para avaliação de novos ensaios. Outras variações do método são utilizadas

12

Figura 8: Imunodifusão em ágar. As linhas de precipitação são indicativas de reação

1.3.6 – Detecção por aglutinação em látex

ade

e especificidade. Em comparação com outros métodos de detecção são mais

de não necessitarem de técnicos

a izá-lo, equipamentos sofistic

ais elevados (L 200 po inda ser c ado para clínicas,

equenos centro ença p o paciente

e , 2003).

, o anticorpo e fico adsorvido ou ligado covalentemente

misturado com a amostra suspeita e é monitorado se há ou não aglutinação. A

e antígeno na a ra permite reconhecimento pelo anti

o do complexo formado no látex (figura 9). Existem algumas modificações

a utiliza lá ohne l., 1992; L t al., 1

o (Lim et al., 1998).

entre as amostras T, 2 e 4 com o antisoro (AS) que difundiram no gel (reproduzido

de Uhl, 2004).

Os testes de aglutinação em látex têm sido utilizados para vários alvos e

apesar de não serem métodos padrões de detecção têm mostrado alta sensibilid

rápidos – o tempo varia de um minuto (Lu et al., 2002) a dezesseis horas (Igarashi et

al., 1986) –, econômicos e fáceis de utilizar, além

especializados p ra real

ee et al.,

s de do

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ados ou reagentes de custos

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o e realizad

m 4). O teste

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13

Figura 9: Aglutinação em látex. As amostras 2 e 4 representam anticorpos

adsorvidos ao látex, que aglutinaram na presença de amostras suspeitas

(http

tecção de fatores de virulência de

taphylococcus aureus por aglutinação em látex.

://www.rapid-diagnostics.org/images/Image5.jpg).

A tabela 1 apresenta comparativamente a especificidade e sensibilidade de

alguns testes padronizados para detecção em látex de amostras de S. aureus.

Tabela 1: Testes padronizados para de

S

Alvo de detecção

Método padrão de detecção (padrão ouro)

Tempo necessário (padrão ouro/ latex)

Especificidade (em comparação com o padrão ouro)

Sensibilidade (em comparação com o padrão ouro)

Referência

Staphylococcus aureus resistente a meticilina

PCR 1-1,5 h/3-15 min

99,2 100 Cavassini et al., 1999

Staphylococcus resistente a meticilina

PCR 1-1,5 h/12-15 min

99,1 100 Sakoulas et al., 2001

Staphylococcus aureus resitente a meticilina

PCR 1-1,5 h/20 min 100 100 Lee et al., 2004

Staphylococcus coagulase-

PCR

negatresistente a

1-1,5 h/não informado

100 100 Louie et al., 2001

ivo

oxacilina TSST-1

Ouchterlony ~24 h/16 h ND ND Igarashi et al., 1986

Em resumo, dentre os métodos disponíveis para detecção de SEs, existem

vantagens e desvantagens (tabela 2). Os métodos biológicos ainda são utilizados,

14

15

e torna impraticável, devido a

quantidade de animais e aos cuidados de manutenção e análise de resultados.

Em comparação com os métodos biológicos, os métodos imunoquímicos, como

o Western blot, imunodifusão em ágar, ELISA, aglutinação em látex, PCR,

microarranjos, são mais sensíveis, específicos práticos, rápidos e bem-vistos quando

há a necessidade de analisar um grande número de materiais, embora necessitem

de certos equipamentos, reagentes e de padronização para que os resultados

possam ser analisados com confiabilidade.

1.4 – Justificativa

As SEs são proteínas secretadas por 30-50% das cepas de S. aureus e podem

ser encontradas em alimentos contaminados cozidos e mantidos à temperatura

ambiente, ricos em carboidratos e proteínas, como as carnes processadas,

presuntos, carne de porco salgada, massas recheadas com cremes, salada de

batata, sorvete, leite e seus derivados. Essas toxinas são resistentes às altas

temperaturas (cozimento), às enzimas intestinais tripsina e pepsina e podem ser

facilmente produzidas a partir de culturas obtidas de procedimentos laboratoriais mais

simples. Além disso, pertencem à Categoria B de agentes de risco biológico,

causando morbidade e mortalidade moderadas, tendo como alvo sua utilização como

agente bioterrorista.

Por causa da exposição e dos riscos causados pelas enterotoxinas, torna-se

necessário o desenvolvimento de métodos rápidos, seguros e baratos de detecção

dessas toxinas, de modo que possam ser utilizados ao leito do paciente, como

também no controle de alimentos e bebidas nas indústrias, principalmente em

amostras de leite em rebanhos suspeitos de infecção estafilocócica, como em

procedimentos que exijam monitoramento em ampla escala. Sendo assim, neste

trabalho propomos desenvolver um teste piloto de aglutinação em látex, utilizando

anticorpo anti-SEC recombinante, para detectar proteína SEC de forma rápida e

mais barata que os métodos convencionais. Visamos também comparar a

especificidade e sensibilidade deste e de outros métodos, como os testes de ELISA,

de Imunodifusão, de Western blot, com a PCR.

entretanto, não quando se deseja determinar a classe da toxina em questão. Para

estes métodos existem casos em que é possível determinar a concentração da

toxina. De qualquer forma, quando é necessário a detecção de SEs em um grande

número de amostras, a utilização de animais s

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Tabela 2: Características apresentadas pelos métodos de detecção de enterotoxinas. Método de detecção*

Vantagem Desvantagem Sensibilidade Especificidade Custopor amostra

Tempo Necessário

Ouchterlony e variações

Aprovada pela AOAC e adotada pelo FDA

É subjetivo 100 ng/mL Tipagem Baixo 18-72 horas

ELISA kits diagnósticos

Sensibilidade Não distingue proteína A produzida pelos S. aureus

0,2 ng/mL Tipagem Moderado 1,5 - 4 horas

Radioimuno-ensaio

Sensibilidade Utiliza material radioativo

1 ng/mL Tipagem Moderado 3-4 horas

Western blot Há solubilização de agregados

Necessidade de equipamentos exclusivos

100 pg/mL Tipagem Moderado 4--6 horas

Aglutinação em látex

Rápido É subjetivo 2,5 ng/mL Tipagem Baixo 20 minutos

Microarranjo

Sistematização

Exige profissional qualificado

100 pg/mL Tipagem Alto 1,5 horas

PCR Muito sensível,altamente específico

Exige profissional qualificado, a presença do gene não é necessariamente indicativa da presença da proteína

1 pg Todos os genes Alto 4-6 horas

Biológico É possível visualizar o efeito causado pela toxina

Utiliza um animal por amostra 10 pg Inespecífico Alto 15 minutos-6horas

* Os testes necessitam de preparação da amostra.

2 – Objetivos

2.1 – Desenvolver um teste piloto para detecção de enterotoxina C por aglutinação

em látex.

2.2 – Avaliar comparativamente a sensibilidade e especificidade do teste piloto em

relação aos testes de ELISA, Western blot, Imunodifusão e PCR.

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3 – Materiais e Métodos

3.1 – Material biológico

3.1.1 – Obtenção da proteína SEC nativa

SEC foi gentilmente cedida pelo prof. Dr. Olney Vieira da Motta, Laboratório de

Sanidade Animal (LSA), Centro de Ciências e Tecnologias Agrárias (CCTA),

Universidade Estadual Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) – Campos dos

Goytacazes/Rio de Janeiro. Brevemente: a proteína foi purificada a partir da cultura

em saco de diálise da cepa bovina de S. aureus LSA 88 em coluna Sephadex G-100

(Sigma), seguida de cromatografia líquida de alta eficiência, em coluna C4 (GE

Healthcare) (Vieira-da-Motta, 2001).

3.1.2 – Obtenção da proteína SEC recombinante

A construção pEMA-30 contém a região que codifica a seqüência da proteína

SEC madura e foi utilizada como controle positivo sec+ nos ensaios. Este plasmídeo

foi utilizado para transformar Escherichia coli M15-pREP4 (Invitrogen) e os

transformantes para induzir a superexpressão de SEC recombinante, que foi

purificada em coluna de afinidade de Ni2+ agarose (Sigma, EUA), dessalinizada em

coluna de gel filtração Sepharose Dessalting HiTrap (GE Healthcare, Alemanha) e

dosada pelo método do ácido biscinconínico (Sigma, EUA; Redinbaugh e Turley,

1986) (Uhl, 2004).

3.1.3 – Soros

3.1.3.1 – Produção e purificação de IgG anti-SEC recombinante (R18)

O sangue total de um coelho foi coletado, via punção cardíaca, sete dias após a

última das quatro imunizações, realizadas em intervalos de sete dias. O animal

recebeu 60 µg de SEC recombinante, no ponto “BaiHui”, e foi observado durante 28

dias, por um veterinário. Após a coleta, o sangue foi incubado por uma hora a 37ºC

para coagulação e, em seguida, o soro, denominado R18, foi separado e

acondicionado congelado até o momento da utilização (Uhl, 2004).

IgG anti-SEC recombinante foi purificado em coluna montada com resina

Sepharose 4B ativada por brometo de cianogênio (GE Healthcare), a qual foi

18

imobilizada a proteína SEC recombinante. A resina Sepharose 4B (1 g) foi dissolvida

em 1 mL de 1 mM HCl durante quinze minutos. Em seguida, foi lavada com 200 mL

de 1 mM HCl, em alíquotas de 20 mL. Dez miligramas de SEC recombinante foram

suspensas em 5 mL de solução de 0,1 M NaHCO3 , 0,5 M NaCl, pH 8,3 e misturada

com a resina durante uma hora, a temperatura ambiente. O excesso de ligante foi

retirado após lavagem da resina com 5 volumes de solução 0,1 M NaHCO3, 0,5 M

NaCl, pH 8,3. A coluna foi bloqueada com 1 M de etanolamina, pH 8,0 durante duas

horas. A seguir, foi lavada com 3 ciclos dos tampões: 0,1 M de tampão acetato, pH

4,0 contendo 0,5 M de NaCl (5 volumes da coluna); e, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0,

contendo 0,15 M de NaCl (5 volumes da coluna). A quantidade de proteína

desacoplada nos sobrenadantes foi dosada pelo método do ácido biscinconínico. O

soro R18, previamente diluído (4 volumes), foi incubado com a resina por duas horas

a temperatura ambiente. A coluna foi lavada, com PBS 1X, com 5 volumes da coluna

e o material foi coletado. A eluição foi feita com 2 volumes de 100 mM de glicina, pH

2,5; o anticorpo foi coletado em um tubo contendo 0,1 volume de tampão fosfato 1M,

pH 8,0. A seguir, a coluna foi lavada com 10 volumes de tampão fosfato 10 mM, pH

6,8 (Harlon e Lane, 1998a). A dosagem foi realizada pelo método de Bradford

(Bradford, 1976). A presença de anticorpos foi verificada por ELISA.

IgG de soro pré-imune de coelho foi purificado em coluna de afinidade de

proteína A (Protein A Antibody Purification - Sigma) segundo as especificações do

fabricante e foi denominado IgG controle.

3.1.3.2 – Soros e proteínas padrões

Os soros anti-SEA, anti-SEB, anti-SEC, anti-SED e anti-TSST-1 e as proteínas

padrões (SEA, SEB, SEC, SED e TSST-1) utilizados nos testes de imunodifusão,

Western blot, ELISA foram desenvolvidos pelo Dr. Luis Simeão, Fundação Ezequiel

Dias – Belo Horizonte/Minas Gerais e gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Olney Vieira

da Motta, LSA, CCTA, UENF.

3.1.3.3 – Soros de pacientes

Os soros de pacientes pediátricos NN1, NN2 e NN3 internados com sintomas

de choque tóxico no Hospital Ferreira Machado foram gentilmente cedidos pela Dra.

Regina Célia de Souza Campos Fernandes, Faculdade de Medicina de Campos/RJ.

19

Os soros foram utilizados após verificação da presença de anticorpos anti-SEC por

ELISA ou por imunodifusão em ágar.

3.1.4 – Isolados de S. aureus

Amostras de Staphylococcus sp da bacterioteca do professor Dr. Olney Vieira

da Motta, LSA, CCTA, UENF foram obtidas de leite coletado de rebanhos bubalinos

e bovinos, principalmente das regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de Janeiro

(Vieira-da-Motta, 2001). As amostras de leite foram semeadas em placas contendo:

ágar sangue (Base ágar sangue, OXOID); ágar MacConkey (Ágar MacCONKEY,

Merck, Alemanha); ágar Sabouraud (Ágar Sabouraud Dextrose, OXOID), e ágar

Vogel Johnson (Ágar Vogel-Johnson, OXOID). O ágar sangue é utilizado para

crescimento de qualquer microrganismo e observação do padrão de hemólise; o

cultivo em ágar MacConkey seleciona as enterobactérias presentes no leite; ágar

Sabouraud é especifico para fungos e leveduras e o Ágar Vogel Johnson é seletivo

para Staphylococcus sp. As placas com os diferentes meios de cultura foram

incubadas a 37ºC por vinte e quatro horas. Após crescimento bacteriano foi feita a

coloração de Gram. As colônias cujas bactérias foram confirmadas como cocos

Gram-positivos, associados em forma de cachos, foram submetidas aos testes

produção de coagulase, de catalase, de Voges Proskauer e fermentação do manitol.

Trinta e três amostras, sendo uma bovina e trinta e duas bubalinas, apresentaram

colônias hemolíticas coagulase positivas, catalase positivas, produtoras de acetoína

e fermentadoras do manitol e, portanto, foram consideradas Staphylococcus aureus.

Estas cepas foram denominadas LSA88, B35, B315, B78, B47, B34, B352, B77,

B243, B260, B361, B327, B194, B112, B196, B326, B10, B193-2, B295, B102, B44,

B48, B6, B5, B117, B188, B118 B221, B193-1, B195, B316, B184 e B85. O

sobrenadante destas cepas foi denominado amostra de conveniência. A cepa FRI-

S6, também cedida pelo professor Olney, foi positiva para SEB pelo kit TECRA e por

isso foi usada como controle positivo.

3.2 – Padronização das técnicas de detecção de enterotoxinas

3.2.1 – Detecção de enterotoxinas por ELISA

Foram utilizados 50 µL de 2 µg/mL de soluções controles das proteínas SEC

recombinante ou das proteínas SEA, SEB, SEC ou SED padrões, diluídas em 50

20

mM de tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6 ou 50 µL do sobrenadante das culturas

de cepas de S. aureus (previamente fervidos ou não), para sensibilizar a placas de

96 poços (Nunc, Copanhagen, Denmark), por dezesseis horas a 4ºC. Cada amostra

foi testada em duplicata. Os poços foram lavados três vezes com solução de

lavagem. Após bloqueio por uma hora, a 37ºC, com 100 µL de 1% de leite em pó

desnatado (Molico, Nestle) (diluído em PBS 1X, Tween-20 0,05%) e três lavagens

com solução de lavagem, foram adicionados à placa 100 µL dos soros (R18 ou anti-

SEA-D padrões) diluídos 1000 vezes em 0,2% de leite/PBS/Tween-20 0,05%, que

foram incubados por duas horas, a 37ºC. As placas foram lavadas por mais três

vezes e incubadas com 100 µL de proteína A conjugada a peroxidase diluída

1:15000 (em 0,2% de leite/PBS/Tween-20 0,05%) e após dez lavagens foram

incubadas com 100 µL da solução de revelação durante vinte e cinco minutos, na

ausência de luz. A reação foi terminada com a adição de 20 µL de ácido sulfúrico,

diluído 1:20. A leitura das reações colorimétricas foi realizada em leitor de placas

Multiskan, Labsystems Uniscience, a 492 nm (Coligan et al., 1991).

3.2.2 – Detecção de enterotoxinas por Western blot

O sobrenadante de cada uma das cepas estafilocócicas foi misturado ao

tampão de amostra e fervidos por 3 minutos. O perfil de proteínas foi analisado por

eletroforese a 100 V, utilizando-se o sistema de SDS-PAGE (Bio-Rad, EUA) em gel

de separação 15% (Laemmli, 1970). Foram aplicados 18 µL da amostra. As

proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 µm, por

duas horas e trinta minutos a 10 V, em tampão fosfato, no sistema transblot (Bio-

Rad, EUA), segundo a metodologia descrita por Towbin et al. (1979). A membrana

foi então bloqueada em 0,3% de leite desnatado (diluído em TST). A presença das

proteínas SEA-D nos sobrenadantes foi validada por imunodetecção com soros anti-

SEA-D padrões e R18, diluídos 1:8000. As membranas foram incubadas por duas

horas com os respectivos anticorpos e após 3 lavagens com 50 mL de TST 1X,

foram incubadas com proteína A conjugada a peroxidase (1:15000) por duas horas e

reveladas com solução de revelação.

3.2.3 – Detecção de enterotoxinas por imunodifusão em ágar

Para a detecção de SEC em sobrenadantes das cepas estafilocócicas foram

utilizadas placas de Petri (Falcon, EUA) com 5 cm de diâmetro e contendo 3,5 mL de

21

ágar “Noble” (Difco, EUA) a 1,2% em 1,5 M NaCl adicionada de timerosal na diluição

1:1000. Foram vasados sete poços (2 poços de 6,7 mm e 5 poços 8,3mm de

diâmetro) no ágar e aspirados, conforme molde FRI (figura 10). O soro R18 (50 µL),

diluído 1:4, foi colocado no orifício central de cada placa, juntamente com a SEC

recombinante (25 µL de uma solução 4 µg/mL), que foi colocada em dois orifícios

menores. Nos outros orifícios foram colocados 50 µL de sobrenadantes de cultura de

cepas estafilocócicas a serem testadas. Passadas quarenta e oito horas de

incubação a 37°C em câmara úmida foram considerados como positivos os testes

que apresentaram a formação de uma linha de precipitação entre a anti-SE e as

amostras testadas (Robbins et al., 1974). Após três lavagens dos géis com solução

salina, durante um período de quarenta e oito horas, os géis foram corados com azul

brilhante de Coomassie R-250, e em seguida descorados com solução descorante

de ácido acético e metanol (Robbins et al., 1974).

Figura 10: Molde de placa para realização do teste de imunodifusão. Modelo FRI.

3.3 – Comparação das técnicas de detecção com a técnica padrão ouro

.3.1 – Iniciadores

Os iniciadores utilizados nas reações de PCR foram sintetizados pela Genemed

ynthesis Inc., CA, EUA, a partir das seqüências codificadoras das enterotoxinas A-

e do gene 16S de S. aureus, disponíveis no GeneBank (tabela 3).

3

S

E

22

Tabela 3: s s PCRs.

Gene

Amplicon

(pares de

base)

GeneBank

Informações obre os iniciadores utilizados na

Iniciador Sequência Código

Iniciador 5` GGTTATCAATGTGCGGTGC sea

Iniciador 3` CGGCACTTTTTTCTCTTCCG

102 L22565

Iniciador 5` GTATGGTGGTGTAACTGAGC seb

Iniciador 3` CCAAATAGTGACGAGTTAGG

164 M11118,

ENSAB6

Iniciador 5` AGATGAAGTAGTGATGTGTATGG

Iniciador 3` CACACTTTTAGAATCAACCG

451 XO5815

CAATAATAGGAGAAAATAAAAG 278 M28521,

7.1

sec

Iniciador 5` Csed

Iniciador 3` TGTTGAACTTTATCTAAAGA P20723

Iniciador 5` CAGCTCGTGTCGTGAGATGT 16s

Iniciador 3` GTCCATTGTAGCACGTGTGTA

170 BX57185

3.3.2 – Extração de DNA

Trinta e duas cepas bubalinas, uma bovina e a cepa FRI-S6 de S. aureus e o

clone pEMA-30 de Escherichia coli foram cultivados em meio BHI (Merk, Alemanha),

por dezoito horas a 37ºC. As cepas bubalinas e bovina foram previamente testadas

para presença de enterotoxinas A-D e TSST-1, através de imunodifusão. O cultivo

foi centrifugado e o DNA cromossômico foi extraído pelo método TELT (Medina-

Acosta e Cross, 1993). As culturas foram distribuídas em tubos para microcentrífuga

de 1,5 mL e centrifugadas por três minutos a 13000 x g. O sedimento celular

formado foi suspenso em 250 µL de TELT, misturado vigorosamente por alguns

segundos e incubado por cinco minutos. Foram adicionados 500 µL da solução

fenol:cloforórmio:álcool isoamílico (50:49:1), que foram misturados por inversão

durante cinco minutos. Em seguida, os tubos foram centrifugados por dez minutos a

13000 x g e a fase aquosa foi transferida para tubos novos, nos quais foram

adicionados 2 volumes de etanol absoluto refrigerado (Merck). Após misturados

dez minutos a

13000 x g. Logo foi adicionado 1 mL de etanol 70%, para lavagem, seguida de

vigorosamente por cinco segundos, os tubos foram centrifugados por

23

centr

as reações, o DNA foi amplificado em 1 ciclo inicial de

cubação a 95ºC por cinco minutos, seguido de 30 ciclos de incubação a 94ºC por

e meio e 72ºC por um minuto, seguido por uma incubação final a 72ºC por

quinze . As t testadas para cada SE estão

descritas na tabela 4.

Tabela emperatur rentes iniciadores nas reações da

PCR.

s

ifugação a 13000 x g, dez minutos. O sobrenadante foi descartado e o

precipitado foi seco na estufa a 37ºC, suspenso em 50 µL de TE-RNAse (20 µg/mL),

incubado por duas horas a 37ºC e utilizado para realização da PCR.

3.3.3 - Detecção da seqüência específica de enterotoxinas pela PCR

As seqüências específicas para SEA-D e para a região codificadora da porção

16S ribossomal (rDNA) de S. aureus foram amplificadas por PCR, a partir do DNA

extraído das diversas cepas estafilocócicas. Foram utilizados iniciadores específicos

para as SEs, conforme indicado na tabela 3. Os oligonucleotídeos para 16S rDNA

foram utilizados como controle interno para verificação de DNA bacteriano.

Para cada reação foram utilizados aproximadamente 100 ng de DNA; 50 pM de

cada iniciador; 0,2 µM de dNTPs (Invitrogen); 0,25 – 4 mM de MgCl2; Tampão

caseiro 1X e 0,1 U de Taq polimerase. As reações foram preparadas para um

volume final de 50 µL, sob as mesmas condições de temperatura, com exceção das

temperaturas de anelamento dos iniciadores, que variaram para as diferentes

seqüências. Em todas

in

um minuto, temperatura de anelamento específica para cada seqüência por um

minuto

minutos emperaturas de anelamento

4: T as testadas para os dife

Par de

Iniciadore

Temperaturas testadas (ºC)

sea 47; 50; 52; 54; 56; 58

seb

Curva 1

52; 54; 56; 58

,2; 59,4; 62,2; 64,4; 66,2

5

Curva 2

Curva 3

46; 47,2; 48,08; 50,9; 53,2; 55,7; 58,2; 60,4; 62,3; 63,8

43; 45,2; 46,8; 48,9; 51,2; 53,7; 56,1; 58,4; 60,3; 61,8

sec 47; 50; 55

sed 47; 50; 55

16s 50; 5

50; 55; 47;

56,1; 57

24

Foram utilizados dois termocicladores, de acordo com a necessidade de fazer a

uma curva de temperatura. Para amplificar a uma temperatura foi utilizado o

termiciclador PCR Sprint (Thermo, Electron Corporation, Needham Heights, MA) e

para curva de temperaturas foi utilizado o termociclador Mastercycler Gradient

(Eppendorf AC, Germany).

Os produtos amplificados foram misturadas com tampão de DNA 6X e

resolvidos em gel de agarose 1,2%, preparado em TAE 1X juntamente com 0,5

isualização foi possível por exposição do gel à

diação UV. As respectivas imagens foram registradas no fotodocumentador Image

plicons está indicado na

tabel

3.4 –

µg/mL de brometo de etídeo. Sua v

ra

Master – VDS (Pharmacia Biotech). O tamanho dos am

a 3.

Teste de aglutinação em látex

3.4.1 - Acoplamento de proteínas em látex de poliestireno

O látex, utilizado como indicador de aglutinação, foi acoplado em três

condições.

Condição 1: látex tratado conforme a literatura

Um volume de quinhentos microlitros de látex de poliestireno (latex beads

polystirene, 0,807 micron, aqueous suspension, solids content 10%, lote 11K05685 -

Sigma) foram suspensos em 8,5 mL de solução GBS. A seguir, 200 µg e 1 mg de

SEC recombinante de 2 lotes diferentes, 750 µg de IgG anti-SEC recombinante ou 1

mg de IgY anti-SEC (cedido pelo Prof. Dr. Olney), diluídas em 1 mL de 50 mM MES

(USB) foram misturados ao látex diluído e incubados, em banho-maria, a 37ºC por

duas horas (Lu et al., 2002). O material lavado com 1mL de PBS foi centrifugado por

cinco minutos, 3000 x g (3 vezes). Depois de suspenso em 1mL de 1% BSA Fração

V (Sigma), diluído em PBS, a mistura foi incubada por trinta minutos, 37ºC. O

material foi novamente lavado com PBS e centrifugado por cinco minutos, 3000 x g

(3 vezes). O látex, acoplado a proteína, foi suspenso em 1 mL de 1% BSA. A

conc foi

colet

entração final do látex foi de 5%. O material das primeiras três lavagens

ado e dosado, pelo método de Bradford, para verificação da quantidade de

proteína acoplada ao látex.

25

Condição 2: látex tratado conforme condições recomendadas pelo fabricante

O acoplamento de SEC recombinante e IgG anti-SEC recombinante ao látex

(latex beads polystirene, 0,807 micron, aqueous suspension, solids content 10%, lote

11K05685 - Sigma) foi realizado da seguinte forma: as proteínas de interesse (1 mg)

foram suspensas em 2 mL e 10 mL, respectivamente, de 50 mM de MES (USB),

misturadas com 10 e 100 µL, respectivamente, de látex e incubadas a 37ºC, por

duas horas, sob agitação de 150 rpm. Passado o período de incubação, o material

foi centrifugado por cinco minutos, 3000 x g e lavado com 1 mL de MES (3 vezes).

Então, foi suspenso em 1mL de 1% BSA (diluído em MES), e incubado por trinta

minutos, 37ºC sob agitação de 150 rpm. O material foi centrifugado por cinco

minu

te. O material das primeiras três lavagens foi coletado

e dosado, pelo método de Bradford, para verificação da quantidade de proteína

acop

tos, 3000 x g e novamente lavado com MES (3 vezes). O látex, acoplado a

proteína, foi suspenso em 1 mL de 1% BSA Fração V. A concentração final do látex

foi de 0,1 e 1%, respectivamen

lada ao látex.

Adicionalmente, em condições semelhantes à condição 2, o acoplamento de

IgG anti-SEC recombinante, foi refeito, porém em duas diferentes concentrações

finais de látex: 0,1% e 0,25%.

Condição 3: látex tratado conforme condições recomendadas pelo fabricante

O acoplamento de anticorpo anti-SEC ao látex (latex beads, deep blue dyed

0,80 micron, aqueous suspension, solids content 10%, lote 034K1174 – Sigma) foi

realizado da seguinte forma: 500 µg de IgG anti-SEC recombinante foi suspenso em

5 mL de 50 mM de MES (Sigma), misturados a 50 µL de látex e incubadas a 37ºC,

por duas horas, sob agitação de 150 rpm. Passado o período de incubação, o

material foi centrifugado por cinco minutos, 3000 x g e suspenso em 1mL de 1%

BSA (diluído em MES). Em seguida o material foi incubado por trinta minutos, 37ºC

sob agitação de 150 rpm. Após centrifugação por cinco minutos, 3000 x g, foi lavado

com 1 mL de 50 mM de MES (3 vezes). O látex, acoplado a proteína, foi suspenso

entração final do látex foi de 0,5%. O sobrenadante da

prime

em 1% BSA Fração V. A conc

ira centrifugação foi coletado e dosado, pelo método de Bradford, para

verificação da quantidade de proteína acoplada ao látex.

26

3.4.2 – Teste de aglutinação

As preparações de látex acoplado às diferentes proteínas foram testadas para

verificação do seu potencial de aglutinação em amostras controles. A visualização

da aglutinação foi feita em lâmina de vidro (Bioslide) sobre fundo escuro, nas

preparações com látex de poliestireno e em um local de fundo branco, nas

preparações com látex azul. Para o teste foram utilizados 50 µL do látex misturado a

or aproximadamente um minuto e o material foi

bservado por até trinta minutos (Kasempimolporn et al., 2000; Attar, et al., 2002; Lu

et al., 2002; Chandrakesan, 2003; 04).

Tabela 5: Misturas utiliz a verifica

iferentes cond

50 µL de amostras controle (tabela 5) ou 50 µL de amostras de conveniência (tabela

6). A mistura foi feita manualmente p

o

Lee, et al., 20

adas par ção da aglutinação em látex com amostras

controles, sob d ições.

Condição 1

Material de captura es) Amostras controles (reagent

IgG anti-SEC,

látex 5%

o/bicarbonato;

/mL) lote 1;

nhecida);

SEC recombinante 2 µg/mL em tampão

carbonat

SEC recombinante (0,6 µg/mL) lote 1;

SEC recombinante (6 mg

SEC recombinante (concentração desco

Eluídos 1 e 2 da coluna de afinidade;

PBS 1X

IgY anti-SEC,

látex 5% combinante 2 µg/mL em tampão

carbonato/bicarbonato;


SEC recombinante (6 mg/mL) lote 1;

Eluído 1 da coluna de afinidade;

PBS 1X

SEC re

27

Continuação da tabela 5 Condição 1

Material de captura Amostras controles (reagentes)

SEC recombinante (lote 1),

látex 5%

Soro R18;

IgG anti-SEC recombinante;

Soro paciente NN1;

Soro anti-SEC padrão;

PBS 1X

SEC recombinante lote 2,

látex 5%

Soro R18;


Soro paciente NN1

Soro paciente NN2;


PBS 1X

Condição 2

IgG Anti-SEC,

látex 1% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão


SEC recombinante (concentração desconhecida);


Eluídos 1 e 2 da coluna de afinidade;

SEC recombinante não acoplada ao látex

(lavados);

Sobrenadante da cultura da cepa B48;

PBS 1X;

Meio BHI

IgG Anti-SEC,

látex 0,25%

Sobrenadante da cultura da cepa B48 sem ferver,

Sobrenadante da cultura da cepa B48 fervidas 3

minutos,

Meio BHI

28


Material de captura Amostras controles (reagentes)

IgG Anti-SEC ,

látex 0,1% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão


SEC recombinante (0,6 mg/mL) lote 1,

SEC recombinante (0,06 mg/mL) lote 1;


SEC recombinante (10 µg /mL) lote 1;


SEC padrão;

PBS 1X;

Meio BHI

SEC recombinante (lote

2),

látex 0,1%

Soro R18;

Soro paciente NN1;

Soro paciente NN2;

PBS 1X

Condição 3

IgG Anti-SEC,

látex 0,5% SEC nativa (1,0; 0,5; 0,25; 0,125 e 0,06 µg/mL);

Sobrenadante da cultura da construção pEMA-30;

Sobrenadante da cultura da cepa B48 ;

SEC recombinante lote 3 (1,2 µg/mL);

PBS 1X,

Meio BHI

Tabela 6: Misturas utilizadas para verificação da aglutinação em látex com amostras

de conveniência, sob a condição 3.

Material de captura Amostras de conveniência

IgG Anti-SEC,

látex 0,5%

Sobrenadante da cultura das cepas LSA 88, B188, B48,

B195, B10, B77

29

3.5 - Dosagem de proteínas

A dosagem de proteínas foi feita segundo a metodologia descrita por

Redinbaugh e Turley (1986), utilizando BSA como padrão.

A dosagem de anticorpos foi feita segundo a metodologia descrita por Bradford

(1976), utilizando BSA como padrão.

3.6 – Cálculos utilizados para determinar sensibilidade e especificidade dos métodos

de detecção descritos

A PCR foi considerada como teste padrão ouro nesta tese. Dessa forma, os

resultados apresentados nos ensaios de ELISA, Western blot, Imunodifusão e

Aglutinação em látex foram comparados aos resultados da PCR.

Considerando a Imunodifusão como método padrão adotado pelo FDA e

AOAC, os resultados dos testes de ELISA, Western blot e Aglutinação em látex

também foram comparados a este teste.

A seguir, a fórmula utilizada para os cálculos (figura 11).

Figura 11: Fórmulas descritas por Jordan et al, 2006, para calcular a sensibilidade e

a especificidade dos testes de ELISA, Imunodifusão, Western blot e Aglutinação em

látex.

30

4 – Resultados

4.1 – Purificação de anti-SEC recombinante

Após dosagem do excesso de ligante coletado durante o acoplamento de

proteína à coluna Sepharose 4B verificamos que toda proteína, disponibilizada para

tal, foi acoplada. Foi possível purificar cerca de 10 mg de anticorpo anti-SEC na

coluna anti-SEC montada e 5 mg de anticorpo IgG controle da coluna de proteína A.

4.2 – Detecção de enterotoxinas

4.2.1 – Detecção de enterotoxinas por ELISA

Dos sobrenadantes das 33 cepas estafilocócicas (fervidas ou não) testadas,

9% reagiram com o soro anti-SEA, 81% com o soro anti-SEB, 27% com o soro anti-

SEC, 64% com o soro anti-SED e 24% com o soro R18.

Os códigos das referidas cepas estafilocócicas estão contidas nos quadros 1-

9, em anexo, que demonstram o tipo de enterotoxina secretada pelas cepas

testadas. Foram consideradas positivas as amostras que indicaram DO492nm maior ou

igual a 2 vezes o valor do controle negativo, descontando-se o valor do controle

negativo.

As toxinas padrões SEA, SEB, SEC e SED utilizadas como controles positivos

não apresentaram sinais positivos no ensaio de ELISA (valor para DO492nm igual ao

controle negativo). A SEC recombinante teve um excelente sinal (valor para DO492nm

acima de 3.6).

4.2.2 – Imunodetecção de enterotoxinas por Western blot

A título de comparação o sobrenadante das culturas das cepas estafilocócicas

também foi testado em Western blot. Destas, 3% reagiram com o soro anti-SEA, 9%

com o soro anti-SEB e 6% com soro anti-SEC, 12% com o soro anti-SED e 21% com

o soro R18. Na figura 12 e quadros 1-9, em anexo, estão indicadas as amostras

positivas para os soros específicos utilizados.

31

Figura 12: Membranas de nitrocelulose incubadas e reveladas com os anticorpos: A) anti-SEA padrão; B) anti-SEB padrão; C) anti-SEC padrão; Kaleidoskope (Bio-Rad); sobrenadantes da

D) anti-SED padrão e E) R18. Raias: M) marcador s cepas: 1) B316; 2) B85; 3) B195; 4) B77; 5) B47; 6)

) 27,1 kDa; SEB) 28,3 kDa; SEC) 27,6 kDa, SED) 26,3 kDa, SEC recombinante: 28,58 kDa.

B327; 7) B243; 8) B194; 9) B44; 10) B221; 11) B6; 12) LSA 88; 13) B118; 14) B361; 15) B117; 16) B196; 17) B193-1; 18) B260; 19) B193-2; 20) B184; 21) B10; 22) B352; 23) B35; 24) B188; 25) B78; 26) B326; 27) B295; 28) B48; 29) B102; 30) B112; 31) clone pEMA-30; 32) B315; 33) B5; 34) B34. Peso Molecular das proteínas: SEA

32

4.2.3 – Imunodifusão em ágar

ilizadas no ensaio de

uns dos resultados da imunodifusão estão exemplificados na figura 13. Em

ção

ouro de comparação foi realizada a PCR para as cepas em estudo. Foram utilizados

iniciadores desenhados a partir das seqüências de enterotoxinas obtidas em bancos

de dados para sea-sed e da subunidade ribossomal 16S, conforme indicado na

tabela 3.

Das cepas estudadas, 9% foram positivas para a seqüência sea, 39% para a

seqüência sec e 15% para a seqüência sed. Os quadros 1-4, em anexo, especificam

o resultado de todas as amplificações realizadas para as 33 cepas de S. aureus.

O DNA das cepas bubalinas B315, B6 e B118 amplificou na temperatura de

anelamento 47ºC, 1,5 minutos e 2 mM de magnésio, com os iniciadores específicos

para a seqüência sea, conforme pode ser visto na figura 14. O DNA das cepas B77

e B361 amplificou de forma inespecífica para este par de iniciadores.

A seqüência seb foi testada sob várias condições para sua amplificação.

Desde gradiente de temperaturas, gradiente de magnésio, tentativas de

amplificações utilizando temperaturas individuais. Pelo fato de não termos um

controle positivo de referência, foi necessário fazê-la com DNA das cepas positivas

Os sobrenadantes de todas as cepas estafilocócicas ut

ELISA foram utilizados para verificação de sua reação com soro R18, em ágar Noble

(figura 13 e quadros 4 e 9, em anexo). Antes de serem trabalhadas nos ensaios

desta tese, todos os sobrenadantes foram testados para as proteínas SEA-D

(quadros 1-3 e 5-8, em anexo) pela aluna de Iniciação Científica do curso de

Medicina Veterinária do CCTA, UENF, Giseli dos Santos Ferreira.

Alg

cada placa há formação de uma linha de precipitação entre o poço correspondente

ao anticorpo e os poços correspondentes à toxina padrão, assim como para as

amostras correspondentes aos sobrenadantes das cepas positivas. A visualiza

foi feita por mais de um observador.

No ensaio de imunodifusão, 30% das cepas reagiram com o soro anti-SEA,

51% reagiram com o soro anti-SEB, 45% com o soro anti-SEC, 61% com o soro anti-

SED e 33% com o soro R18.

4.3 – Detecção das seqüências codificantes das enterotoxinas

Com o propósito de comparar com os outros métodos aqui descritos (ELISA,

Imunodifusão, Western blot e Aglutinação em látex) e utilizá-la como método padrão

33

Figura 13: Imunodifusão em ágar. Painel superior - Ágar Noble 1,2%. AC) soro R18, T) Toxina SEC

el inferior - Esquema representativo das observações. A identificação às amostras no ágar. A intensidade da banda no esquema não

equivale a intensidade da banda observada no gel original.

recombinante, 1) soro de paciente NN3; sobrenadante das cepas: 2) B48; 3) B193-1; 4) B85; 5) B352; 6) B5; 7) B47; 8) B243; 9) B188; 10) B35; 11) B48; 12) clone pEMA-30; 13) B194; 14) B193-2; 15) B118; 16) B221; 17) BHI; 18) B117; 19) B102; 20) LSA 88; 21) B195; 22) B361; 23) B260; 24) B196; 25) clone pEMA-30; 26) B44; 27) B327; 28) B10; 29) B184; 30) B34; 31) B112; 32) B295; 33) B6; 34) B315; 35) B78 e 36) B326. Paindo esquema é correspondente

34

para SEB, pelo teste de imunodifusão. Neste caso, foi utilizado DNA das cepas

B316, B195 e B1931, escolhidas de forma aleatória. Para as três amostras

testadas, em todas as condições, observam-se amplificações de bandas

inespecíficas (figura 15).

Posteriormente, foi utilizado DNA de uma cepa comprovadamente positiva

entração de

gCl2

i amplificada a 55ºC e 2

reu a 47ºC com 2 mM de cloreto de magnésio.

Todas as amostras testadas para amplificar a seqüência 16S do ribossomo de

. aureus foram positivas (figuras 18 e 19). Isso demonstra que os resultados

para SEB, através do kit de diagnóstico TECRA: a cepa FRIS6. Embora o DNA

dessa amostra tenha sido positivo para o gene 16S ribossômico (figura 19); em

nenhuma das condições testadas de temperatura de anelamento e conc

M foi obtido o amplicon de aproximadamente 280 pb.

A seqüência sec presente nas cepas B48, B118, B6, B188, B77, B316, clone

pEMA-30, LSA88, B195, B184, B193-1, B47, B44 e B5 fo

mM de cloreto de magnésio, conforme pode ser verificado na figura 16.

As cepas identificadas como B6, B85, B102, B327 e LSA 88 tiveram seu DNA

amplificado durante a PCR utilizando iniciadores para a seqüência sed (figura 17). A

reação ocor

S

negativos com os iniciadores específicos para SEs devem ser tidos como reais

negativos.

Figura 14: Amplificação da seqüência sea. Gel de agarose 1,2%, corado com

brometo de cianogênio. M) marcador 1Kb (Promega); DNA das cepas: 1) B48; 2)

B315; 3) B361; 4) B6; 5) B352; 6) B77; 7) B188; 8) B47; 9) B221; 10) B44; 11) B5;

12) B117; 13) B193-2; 14) B10; 15) B78; 16) B243; 17) B194; 18) B316; 19) H2O; 20)

B295; 21) B260; 22) B102; 23) B184; 24) B327; 25) B34; 26) B112; 27) B326; 28)

B193-1; 29) LSA 88; 30) B35; 31) B85; 32) B118; 33) B195; 34) B196; 35) paciente

NN3 e 36) H2O.

35

Figura 15: Amplificação da seqüência seb. Gel de agarose 1,2%, corado com

brometo de cianogênio. Temperatura de anelamento: 47ºC, concentrações de 1, 2, 3

e 4 mM de cloreto de magnésio, respectivamente para cada amostra. M) marcador

1Kb (Promega); DNA das cepas: 1-4) B316; 5-8) B195; 9-12) B193-1 e 13-15) H2O.

Figura 16: Amplificação da seqüência sec. Gel de agarose 1,2%, corado com

brometo de cianogênio. M) marcador 1Kb (Promega); DNA das cepas: 1) B361; 2)

B315; 3) B48; 4) B196; 5) B118; 6) B85; 7) B35; 8) B326; 9) B352; 10) B6; 11) B243;

12) B78; 13) B327; 14) B102; 15) B260; 16) B295; 17) B188; 18) B77; 19) H2O; 20)

B194; 21) B316; 22) clone pEMA-30; 23) LSA 88; 24) B195; 25) B184; 26) B193-1;

27) B47; 28) B221; 29) B44; 30) B5; 31) B117; 32) 193-2; 33) B10; 34) B112; 35)

B34; 36) paciente; 37) H2O.

36

Figura 17: Amplificação da seqüência sed. Gel de agarose 1,2%, corado com

brometo de cianogênio. Temperatura de anelamento: 47ºC, concentração de 2 mM

de cloreto de magnésio.M) marcador 1Kb (Promega); DNA das cepas: 1) B6; 2)

B315; 3) B85; 4) B195; 5) B193-1; 6) B326; 7) B102; 8) B5; 9) B188; 10) B48; 11)

B193-2; 12) B10; 13) B44; 14) B196; 15) B295; 16) B47; 17) H2O; 18) B327; 19) B48;

20) B34; 21) B117; 22) LSA 88; 23) B221; 24) B112; 25) B316; 26) B118; 27) B194;

28) B243; 29) B78; 30) B35; 31) B184; 32) B352; 33) B361; 34) B77 e 35) B260.

Figura 18 e 19: Amplificação da seqüência 16S. Gel de agarose 1,2%, corado com

brometo de cianogênio.Temperatura de anelamento: 55ºC, concentração de 2 mM

de cloreto d dor a) ) B47; 2)

B194; 3) B102; 4) B44; 5) B48; 6) B6; 7) B5; 8) B117; 9) B188; 10) B221; 11) B193-

1; 12) B195; 13) B184; 14) B85; 15) LSA 2O;

19) B35; 20) B78; 21) )

B112; 28 10; 31) B 2) B295; 33) B118; 34) B117; 35)

B195; 36 9) B22 RIS-6.

e magnésio. M) marca 1Kb (Promeg ; DNA das cepas: 1

88; 16) clone pEMA-30; 17) B48; 18) H

B34; 22) B352; 23) B243; 24) B260; 25) B361; 26) B327; 27

) B196; 29) B326; 30) B 193-2; 3

) H2O; 37) B44; 38)B 47; 3 1 e 40) F

37

4.4 – Teste de aglutinação em

4.4.1 - Ac átex d stireno

O s ao i feito em condições: uma

conforme lporn et al, 2000; Lu et al, 2002; Attar et al, 2002) e

outras duas recomendadas

O material de todas as lavagens colet

acoplamento do reagente (tabela 7). Em todos os casos houve acoplamento de

Tabela 7: Quantidade de proteína acoplada

látex

oplamento de proteína em l e polie

acoplamento de proteína látex fo três

a literatura (Kasempimo

pelo fabricante.

adas foi dosado para verificar se houve

proteínas, em maior ou menor quantidade.

ao látex, sob diferentes condições.

Reagente de captura Quantidade

acoplada % de acoplamento

Condição 1 (literatura)

IgG Anti-SEC, látex µ 5% 675 g 90

IgY anti-SEC, látex 5% 960 µg 96

SEC rec lote 1, látex 5% 500 µg 50

SEC rec lote 2, látex 5% 144 µg 72

Condição 2 (fabricante)

IgG Anti-SEC, látex 1% 660 µg 66

IgG Anti-SEC, látex 0,25% 1 mg 100

IgG Anti-SEC, látex 0,1% 280 µg 28

SEC lote 2, látex 0,1% 300 µg 30

Condição 3 (azul, fabricante)

IgG Anti-SEC, látex 0,5% 320 µg 64

4.4.2 – Aglutinação em látex

Para realizar este ensaio foram colocados em uma lâmina de vidro 50 µL do

látex acoplado a IgG anti-SEC recombinante, IgY anti-SEC ou à SEC recombinante

e 50 µL de algumas amostras controles (contendo proteína SEC recombinante de

diferentes lotes e de concentrações conhecidas), incluindo dois controles negativos,

38

que no caso foram PBS 1X e BHI. O tempo de observação de aglutinação foi de até

trinta minutos, porém o resultado, ivo, foi visto entre cinco e treze

minutos.

observação de aglutinação da mistura látex/controle negativo, no mesmo intervalo

possível ver , onde o látex foi tratado conforme

condições apresentad látex não aglutinou na

presença de toxina. N ncentrações, foi tratado

com MES. Nesta cond ão do látex

para algumas amostras. Em outras concentrações, não foi observada reação. A

única condição em qu resultados esperado foi a

3, utilizando MES. Nessa condição, amostras de sobrenadantes das cepas foram

testadas e tiveram resultados coerentes com aqueles observados para os outros

testes aqui apresentados (tabela 8).

Tabela 8: Resultado do teste piloto de aglutinação em látex utilizando amostras

controles e amostras de conveniência das cepas de S. aureus (quadros 4 e 9, em

anexo). O sinal (+) indica que as amostras aglutinaram e o sinal (–) indica que as

amostras não aglutinaram.

Condição 1

quando posit

A observação de aglutinação da mistura látex/amostra associado com a não

de tempo, foi o critério de positividade analisado.

ificar que na condição 1Foi

as na literatura, utilizando glicina, que o

a condição 2, o látex, utilizado em 3 co

ição e utilizando 1% de látex, verificamos aglutinaç

e todos os controles apresentaram s

Reagente de

captura

Amostras Resultado

IgG Anti-SEC,



SEC recombinante (0,6 µg/mL) lote 1 ;


SEC recombinante (concentração desconhecida)



PBS 1X

+ - - - - - -

39


Reagente de

captura

Amostras Resultado

IgY anti-SEC,






PBS 1X

- - - - -

SEC recombinante

(lote 1),

látex 5%

Soro R18;


Soro paciente NN1;


PBS 1X

- - - - -

SEC recombinante

(lote 2),

látex 5%

Soro R18;

IgG Anti-SEC recombinante;

Soro paciente NN1

Soro paciente NN2;


PBS 1X

- - - - - -

Condição 2

IgG Anti-SEC,



SEC recombinante (concentração

desconhecida);




SEC recombinante não acoplada ao látex;

Sobrenadante da cultura B48;

PBS 1X;

Meio BHI

+

+ - + - + + - -

40

Continuação da tabela 8

Condição 2

Reagente de

captura

Amostras Resultado

IgG Anti-SEC,

látex 0,25%

Sobrenadante da cultura da cepa B48 sem

ferver;

Sobrenadante da cultura da cepa B48 fervidas

3 minutos;

Meio BHI

- - -

IgG Anti-SEC,

látex 0,1% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão





SEC recombinante (10 µg /mL) lote 1;


SEC padrão;

PBS 1X;

Meio BHI

- - - - - - - - -

SEC recombinante

lote 2,

látex 0,1%

Soro R18;

Soro paciente NN1;

soro paciente NN2;

PBS 1X

- - - -

41


Reagente de

captura

Amostras Resultado

IgG Anti-SEC,

látex 0,5% SEC nativa 1,0 µg/mL;

SEC nativa 0,5 µg/mL;





SEC recombinante lote 3 (1,2 µg/mL);

Sobrenadante da cultura do clone pEMA-30; PBS 1X;

Meio BHI

+ + + + + + + + - -

IgG Anti-SEC,

látex 0,5%



Sobrenadante da cultura da cepa LSA 88;



Sobrenadante da cultura da cepa B77

+ + + + - -

4.5 – Cálculos de sensibilidade e especificidade

Pelo fato da PCR ser considerada, neste trabalho, a técnica padrão ouro, os

resultados dos ensaios de ELISA, do Western blot, da Imunodifusão e da

Aglutinação em Látex foram comparados àqueles obtidos para o padrão ouro.

Os cálculos de sensibilidade e especificidade foram realizados pela aplicação

da quantidade de amostras real-positivas ou negativas e falso-positivas ou negativas

nas fórmulas descritas por Jordan et al., 2006.

A identificação das amostras falso-positivas e falso-negativas, considerando a

PCR como padrão está disponível nos quadros 1-4, em anexo. As amostras real-

positivas ou negativas são aquelas que apresentaram, para cada teste, o resultado

positivo ou negativo, respectivamente, idêntico à técnica padrão ouro. Amostras

falso-positivas ou negativas são aquelas que discordam, neste caso, da PCR. Por

exemplo, para a proteína SEC, a cepa B35 é considerada real-negativa, uma vez

42

que foi negativa para os testes de ELISA, Western blot e Imunodifusão e foi negativa

para a técnica da PCR. A cepa B78 é considerada falso-positiva em ELISA, já que

foi positiva em ELISA e negativa para a técnica padrão ouro (PCR). Real-positiva foi

a cepa B316 para o teste de ELISA, uma vez que positiva em ELISA, resultado que

concorda com a técnica padrão ouro, entretanto, foi falso-negativa em Western blot,

já que foi negativa para este teste, resultado que discorda da PCR (técnica padrão

ouro).

Os resultados dos cálculos de sensibilidade e especificidade para cada tipo

de ensaio de detecção de SEs e para cada toxina estão apresentados na tabela 9.

Como não foi possível amplificar seb por causa da inespecificidade dos iniciadores,

estes cálculos não foram realizados para SEB. Foi possível verificar que o teste

piloto de aglutinação em látex para detecção de enterotoxina C foi o que apresentou,

concomitantemente, melhores resultados de sensibilidade e especificidade. O teste

piloto apresentou também especificidade absoluta e maior sensibilidade,

comparando com os outros métodos (tabela 9).

A Imunodifusão é o método padrão adotado pelo FDA e AOAC para

identificação de enterotoxinas. Com a finalidade de verificar a sensibilidade e

especificidade dos métodos e se os altos percentuais de sensibilidade e

especificidade obtidos pelo teste de aglutinação em látex e os resultados obtidos

para os outros testes se reproduziam, os cálculos descritos por Jordan et al., 2006,

também foram realizados, considerando a Imunodifusão como técnica padrão ouro.

A identificação das amostras falso-positivas e falso-negativas está disponível

nos quadros 5-9, em anexo. As amostras real-positivas ou negativas são aquelas

que apresentaram, para cada teste, o resultado idêntico à técnica padrão ouro. Por

exemplo, para a SEC, a cepa B35 é considerada real-negativa, uma vez que foi

negativa para os testes de ELISA, Western blot e foi negativa para a imunodifusão.

A cepa B327 é considerada falso-positiva em ELISA, já que foi positiva em ELISA e

negativa para a técnica padrão ouro (imunodifusão). Real-positiva foi a cepa B47

para o teste de ELISA, uma vez que foi positiva em ELISA, resultado que concorda

com a técnica padrão ouro, entretanto, foi falso-negativa em Western blot, já que foi

negativa para este teste, resultado que discorda da imunodifusão (técnica padrão

ouro).

Os resultados dos cálculos de sensibilidade e especificidade para cada tipo

de ensaio de detecção de SEs e para cada toxina, considerando a Imunodifusão

43

como técnica padrão ouro, estão apresentados na tabela 10. Foi possível verificar

que o teste piloto de aglutinação em látex foi o que apresentou, concomitantemente,

melhores resultados de sensibilidade e especificidade. O teste piloto apresentou

também sensibilidade absoluta (tabela 10), que é mais significante que a

especificidade, uma vez que, mais importante do que saber qual tipo de enteroxotina

está presente no alimento, é saber que há enterotoxina e isso o método

desenvolvido realiza com segurança.

Tabela 9: Relação da quantidade de amostras real-positivas e negativas

(observadas pelos resultados da PCR) e das amostras falso-negativas e positivas

(observadas pelos resultados de ELISA, Imunodifusão, Western blot e Aglutinação

em látex). Sensibilidade e especificidade foram calculadas pelas fórmulas

RP/(RP+FN) e RN/(RN+FP), respectivamente.

REAGENTE DE CAPTURA

REAL POSITIVO

(RP)

FALSO NEGATIVO

(FN)

FALSO POSITIVO

(FP)

REAL NEGATIVO

(RN)

SENSIBILIDADE %

ESPECIFICIDADE %

ELISA anti-SEA padrão

3 3 3 30 50 91

anti-SEC padrão

13 10 6 20 50 80

anti-SED padrão

5 1 17 28 83 62

anti-SEC Recombinante

13 10 5 20 56 80

WESTERN BLOT anti-SEA padrão

3 3 1 30 50 97

Anti-SEC padrão

13 11 0 20 54 100

Anti-SED padrão

5 4 3 28 55 90


13 9 2 20 59 90

IMUNODIFUSÃO anti-SEA padrão

3 0 7 30 100 81

anti-SEC padrão

13 3 5 20 81 80

anti-SED padrão

5 1 16 28 83 64


13 11 9 20 54 69

AGLUTINAÇÃO EM LATEX anti-SEC Recombinante*

5 1 0 1 83 100

*Foram consideradas 6 amostras.

44

Tabela 10: Relação da quantidade de amostras real-positivas e negativas

(observadas pelos resultados da Imunodifusão) e das amostras falso-negativas e

positivas (observadas pelos resultados de ELISA, Western blot e Aglutinação em

látex). Sensibilidade e especificidade foram calculadas pelas fórmulas RP/(RP+FN) e

RN/(RN+FP), respectivamente.

REAGENTE DE CAPTURA

REAL POSITIVO

(RP)

FALSO NEGATIVO

(FN)

FALSO POSITIVO

(FP)

REAL NEGATIVO

(RN)

SENSIBILIDADE %

ESPECIFICIDADE %

ELISA anti-SEA padrão

10 10 3 23 50 88

anti-SEB padrão

17 4 14 16 81 53

anti-SEC padrão

15 10 4 18 60 81

anti-SED padrão

20 8 9 13 71 59


11 8 5 23 58

82

Western blot anti-SEA padrão

10 10 1 23 50 96

anti-SEB padrão

17 16 2 16 51 89

anti-SEC padrão

15 13 0 18 54 100

anti-SED padrão

20 17 0 13 54 100


11 11 6 23 50 79

AGLUTINAÇÃO EM LATEX anti-SEC Recombinante*

2 0 2 4 100 67

*Foram consideradas 6 amostras.

45

5 – Discussão

Tendo como referência a técnica da PCR, a sensibilidade e a especificidade do

teste piloto de aglutinação em látex, descrito no presente trabalho, foi de 83 e 100%,

respectivamente. Esses resultados são melhores do que aqueles obtidos para outros

testes, incluindo o de Imunodifusão, um dos métodos padrões de detecção (Casman et

al, 1969; Su e Wong, 1997). Os resultados de sensibilidade e especificidade,

respectivamente, dos testes de detecção para SEC com soro anti-SEC recombinante

(soro R18) através de Imunodifusão foram de 54 e 69%, através de Western blot, 59 e

88% e, através de ELISA foram de 56 e 80%. Além do mais, o tempo de detecção para

o teste em questão foi de aproximadamente oito minutos, tempo extremamente

reduzido em comparação com os outros métodos.

A técnica da PCR foi considerada como método padrão ouro porque, além de

ser um método sensível, podendo detectar até 1 pg de DNA numa amostra (Cremonesi

et al., 2005), é altamente específico (Schmitz et al., 1998), pelo fato de se utilizar

iniciadores exclusivos para cada gene de interesse.

Alguns iniciadores podem se ligar a regiões polimórficas do DNA em questão.

Isso acarreta na amplificação de regiões não específicas para o qual o iniciador foi

desenhado, dessa forma, resultando em amplicons de tamanhos inesperados (Bania et

al., 2005). Esse caso ocorreu para os iniciadores utilizados para amplificar a seqüência

seb. Por este fato, foi utilizada a cepa FRIS6, comprovadamente positiva para SEB

através do kit TECRA, para realizar os ensaios. Entretanto, a PCR não foi positiva em

nenhuma das condições testadas. Dessa forma, nenhum dos ensaios imunoquímicos

realizados foi comparado com os resultados da PCR para a SEB.

Todas as preparações apresentaram DNA de S. aureus, conforme averiguação

com os iniciadores para a região ribossômica 16S de S. aureus. Estes resultados

confirmam que as amostras negativas nas reações da PCR, foram negativas pela

ausência da seqüência das respectivas SEs, salvo para seb, caso em que o par de

iniciadores foi inadequado.

Para amplificação das seqüências de SEs foram selecionadas amostras que

foram positivas por Imunodifusão. Essas amostras foram utilizadas como controles

positivos nos ensaios da PCR, nos quais a temperatura foi a variável. Cada amostra

positiva para a reação na temperatura determinada foi, então, analisada em diferentes

concentrações de magnésio. Após determinação da temperatura e concentração ideais

de amplificação, todas as amostras foram analisadas nessas condições.

46

Dentre os métodos utilizados na comparação com a PCR, de modo geral, o que

apresentou menor sensibilidade foi o Western blot. O cálculo de sensibilidade descrito

por Jordan et al. (2006), relaciona real-positivos com falso-negativos. Isso significa que

a quantidade de falso-negativos por Western blot foi maior em relação aos outros

testes. Embora se admita que os falso-negativos possam ser causados pela falta de

sensibilidade do método, também o podem ser pela ausência da expressão da toxina.

Como se sabe, o fato de a cepa apresentar a seqüência para a toxina não significa que

ela secrete, o que depende das condições em que o microrganismo se encontra

(Sasaki et al., 2005). Mesmo assim, para padronizar o ensaio, todas as cepas foram

cultivadas sob a mesma condição, assim como as alíquotas utilizadas nas

eletroforeses, as concentrações e o tempo de incubação com os anticorpos. Além

disso, o ensaio de imunodetecção é capaz de detectar 100 pg/mL (Rasooly e Rasooly,

1998), sensibilidade suficiente para evitar a ingestão de alimento contaminado pela

enterotoxina, se detectável a tempo. Entretanto, o ensaio dura entre quatro e seis

horas, além de necessitar do kit para preparação do gel, do kit de transferência e de

alguém especializado para sua realização.

Apesar de apresentar menor sensibilidade, o Western blot foi o teste que

apresentou maior especificidade, seguida da aglutinação em látex. Isso se deve ao fato

de que as proteínas são separadas por tamanho (ou ponto isoelétrico) e, após a

revelação, é possível conhecer seu peso molecular para, então, caracterizá-la. Além do

mais, através deste método, é possível desnaturar a proteína, ou desfazer agregados,

possibilitando a melhor interação com o anticorpo, e reduzindo as reações cruzadas

que podem ocorrer pelas conformações ou pelas seqüências das proteínas (Rasooly e

Rasoly, 1998). Essa preparação prévia das amostras não ocorre nos ensaios de ELISA

e Imunodifusão, o que pode acarretar em reações cruzadas não detectadas, resultando

em aumento do background.

Quanto a sensibilidade, a imunodifusão foi um dos testes que apresentou melhor

resultado. A sensibilidade ocorreu não em relação a quantidade de material captado,

mas pela facilidade de interação e captação de moléculas por anticorpos específicos e

não específicos. Neste ensaio, a interação da toxina com o anticorpo pode ser facilitada

pela conformação, que nas SEs é conservada (Hurley et al., 1995) e acaba por resultar

em mais falso-positivos que negativos, dessa forma, diminuindo sua especificidade.

Além disso, existe o fato de a linha de precipitação formada não ser padronizada. O

que é positivo no teste para alguns manipuladores, pode não ser para outros, o que se

47

traduz em menor confiabilidade do teste. Dessa forma, os resultados da imunodifusão

disponibilizados foram visualizados por mais de um observador. Um outro problema

deste teste é a longa duração do procedimento, variando entre dezoito e setenta e

duas horas (Su e Wong, 1997).

Um dos métodos mais utilizados para rápida e sensível detecção de SEs é o

teste de ELISA (Freed et al., 1982), principalmente na forma de kits comerciais. Estes

testes são capazes de detectar toxinas dos tipos A-E. Um deles, o TECRA, é

usualmente utilizado nas indústrias de alimentos com aprovação do AOAC e do FDA

(Boerema et al., 2006). Estes testes são relativamente rápidos e detectam tão pouco

como 0,1 e 1 ng/mL de SEs (Su e Wong, 1997), com duração de aproximadamente

duas horas e apesar de ser um dos métodos clássicos de detecção, podem produzir

resultados falso-positivos por causa das reações cruzadas entre as toxinas (Schmitz et

al.,1998; Bavari et al., 1999).

Apesar de o ideal ser a utilização de kits comerciais, só foi possível comparar

com o ELISA convencional. Obviamente, o kit oferece maior segurança, pois todos os

elementos que o compõem estão devidamente padronizados. Para minimizar as

diferenças entre os ensaios foram utilizados os mesmos soros padrões utilizados nos

ensaios de Western blot, sempre na diluição de 1:1000. Os sobrenadantes utilizados

foram obtidos das culturas cultivadas durante aproximadamente dezesseis horas em

meio BHI. Apesar das precauções, os títulos encontrados foram baixos para o

sobrenadante das cepas, embora, nos casos positivos, maiores que o controle

negativo, e negativo para as proteínas padrões. Não é sabido se as proteínas padrões

utilizadas nas imunizações dos coelhos, utilizados para produção de anticorpos foram

purificadas, nem por qual método, ou se elas foram desnaturadas. Desta forma, se

esses anticorpos produzidos reconheciam a proteína, devido a sua conformação, é

provável que a realização de um ELISA sanduíche implicasse num resultado diferente

e até mais seguro. Entretanto, se os anticorpos foram produzidos contra a proteína

desnaturada, os resultados do Western blot podem ser considerados mais confiáveis,

levando-se em consideração as reações cruzadas. Estes fatos podem justificar o

resultado negativo das proteínas padrões, que não apresentaram resultado esperado

em testes de ELISA. É provável que, no Western blot, essas proteínas apresentem

sinal positivo, utilizando-se seus respectivos soros.

Nesta tese não foram realizados testes de ELISA sanduíche pelo fato de

possuirmos apenas um anticorpo (soro) padrão para cada toxina. Para realizar tal

48

ensaio são necessários dois anticorpos e ainda, é recomendável que, pelo menos um

seja monoclonal (Harlow e Lane, 1998b).

Para sensibilização das placas de ELISA foram utilizadas amostras fervidas e

não fervidas. A intenção da utilização das amostras fervidas era mimetizar uma

desnaturação sem adição de componentes que pudessem vir a interferir no resultado,

possibilitando melhor acesso dos anticorpos presentes nos soros padrões às SEs

presentes nas amostras de conveniência. Porém, o efeito pode ter sido exatamente o

contrário, já que poucas amostras fervidas apresentaram reatividade com os

anticorpos. Anderson et al. (1986), observaram que SEA presente em alimentos

processados por calor não reagiu bem com anticorpos usados em ELISA.

As reações cruzadas ocorrem por causa da homologia tanto na seqüência de

aminoácidos (tabela 11) quanto na sua estrutura tridimensional (Balaban e Rasooly,

2000). A discrepância nos resultados encontrados, tanto com relação ao percentual de

amostras positivas para cada anticorpo quanto com relação a própria comparação

entre os testes realizados sugere que essas seriam as causas da ocorrência de

reações cruzadas. Como exemplo, a existência de 68% de homologia entre SEB e SEC

e, ainda, a semelhança na estrutura tridimensional entre as SEs, podem justificar a

reação cruzada com o anticorpo anti-SEB padrão ocorrida para a cepa 188 no ensaio

de imunodifusão já que esta cepa é apenas sec+.

Tabela 11: Homologia (em porcentagem) das seqüências de aminoácidos das SEs

(Jarraud et al., 2001, modificada).

SEB SEC SED

SEA 33 30 50

SEB 68 35

SEC 31

O fato de, por exemplo, a cepa B77 ser sec+ e não ter se apresentado positiva

para SEC para nenhum dos outros ensaios pode ser explicado pela informação de que

49

a presença da seqüência sec não é indicativa, necessariamente, de expressão protéica

desta seqüência.

Ainda, algumas cepas apresentaram-se negativas pela PCR para as seqüências

sea, sec ou sed, mas testaram positivas nos outros ensaios para alguma dessas SEs.

Neste caso podem ter ocorrido duas coisas: 1) a cepa pode possuir a seqüência seb,

que não foi detectada pela PCR nas condições e com os iniciadores testados ou; 2) a

cepa não possuir nenhuma das 4 seqüências testadas mas possuir outras. Ainda, o

fato de serem positivas para os anticorpos testados se explica pelas reações cruzadas

entre as proteínas expressas e os soros padrões utilizados. Como exemplo, cita-se as

cepas B194 e B295. Assim sendo, devido às reações cruzadas era de se esperar que

nenhuma cepa fosse negativa em todos os ensaios imunoquímicos testados.

Tendo como método de referência a imunodifusão, foi observada sensibilidade

de 100% para o teste de aglutinação em látex. Para que o teste resulte em

sensibilidade absoluta é necessário que não haja amostras falso-negativas, ou seja,

todas as amostras real-positivas também foram positivas no ensaio de aglutinação em

látex. Tal fato demonstra que, além do teste ser conveniente, o anticorpo imobilizado

em látex é um bom reagente de captura, reconhecendo bem as moléculas de SEC.

A proteína SEC recombinante foi purificada na presença de 8 M de uréia.

Nessas condições, espera-se que a proteína esteja na sua forma desnaturada.

Associada a resistência enzimática e térmica das SEs, está o fato de que nem toda a

estrutura de uma proteína desnaturada é perdida (Shortle e Acherman, 2001). O soro

R18 pode ter sido produzido a partir da SE não completamente desenovelada na sua

conformação, mas provavelmente com alguns sítios mais expostos, talvez os mais

antigênicos. Tais fatos justificam a imunogenicidade da proteína e a boa reatividade do

soro R18, produzido a partir da toxina recombinante, com as proteínas nativas

presentes nas amostras de conveniência testadas.

Os testes de ELISA e Western blot apresentaram 58 e 69 de sensibilidade,

comparando com o teste de imunodifusão. Este resultado demonstra que o mesmo

anticorpo, que reconhece bem as moléculas de SEC no teste de aglutinação, não as

reconhece tão bem no ELISA e no Western blot, sugerindo que a forma com que a

proteína é disponibilizada no teste influencia na sua detecção. Por exemplo, em ELISA

as proteínas e seus contaminantes estão imobilizados num recipiente, o que pode

dificultar o acesso à proteína de interesse e aumentar a quantidade de amostras falso-

negativas, diminuindo a sensibilidade. O próprio teste padrão, a imunodifusão neste

50

caso, pode fazer com que sejam apresentadas amostras falso-negativas no Western

blot. Por não possuir alta confiabilidade, uma amostra que seja apenas SEC positiva

pode se apresentar real-SEB-SEC-positiva, pelo teste de imunodifusão, devido a uma

reação cruzada com anticorpo anti-SEB. Isso resulta em negatividade de SEB (falso-

negativo) no Western blot, diminuindo a sensibilidade do teste.

Ainda considerando o teste de imunodifusão como método de referência, temos

especificidade de 67, 81 e 79% para os testes de aglutinação em látex, o ELISA e o

Western blot, respectivamente. Segundo Jordan et al. (2006), a especificidade está

relacionada com a quantidade de amostras falso-positivas. Comparando os testes,

ELISA e Western blot apresentaram melhores resultados que o teste de aglutinação em

látex. Em primeiro lugar, a facilidade de reação do anticorpo anti-SEC com a própria

SEC e com outras SEs resulta em mais amostras falso-positivas. Essa interação

antígeno-anticorpo é facilitada nas moléculas em solução, conforme ocorre no teste de

aglutinação e o torna menos específico. Em segundo lugar, o teste de Western blot é o

que melhor diferencia os resultados positivos por reações cruzadas, o que se traduz

em menos amostras falso-positivas e maior especificidade. Em terceiro lugar, o

material em teste imobilizado no recipiente das placas para ELISA pode possuir

moléculas, que não a toxina, que reajam com o anticorpo. Estes resultados positivos

não podem ser confirmados em ELISA, conforme é possível em Western blot. De

qualquer forma, mesmo que não sejam reais essas amostras positivas são

consideradas na contagem e aumentam a especificidade do teste. Em testes de ELISA

também podem ocorrer reações cruzadas que, aumentam a quantidade de amostras

falso-positivas e também de amostras real-positivas.

Quaisquer fatos justificados pelas reações cruzadas e pela questão dos

contaminantes se aplicam a todos os testes. Entretanto, neste trabalho, estão sendo

ressaltadas as condições que favorecem os resultados observados.

Na prática, os anticorpos específicos não reconhecem as respectivas proteínas

nas mesmas condições físico-químicas porque, além da disponibilização das proteínas

nos diferentes testes e apesar da homologia entre as seqüências, nem todas as SECs,

por exemplo, são sintetizadas a partir da mesma seqüência de nucleotídeos em todas

as cepas. As cepas não são clones e por isso normalmente podem possuir variações

em um ou mais nucleotídeos e tal acontecimento pode acarretar em variações em

nenhum, um ou mais aminoácidos. Tais variações permitirão maior ou menor interação

51

entre os anticorpos (produzidos contra uma seqüência protéica específica) e as

moléculas, presentes na amostra problema, com as quais estes anticorpos interagem.

Em relação ao acoplamento de proteínas ao látex, observa-se que as

concentrações de IgG anti-SEC e SEC adsorvidas variam de acordo com as condições.

A presença de glicina durante o acoplamento permite que maiores quantidades de IgG

anti-SEC e de SEC recombinante se liguem ao látex. Entretanto, a presença de MES

parece melhorar a ligação da proteína ao látex/anticorpo e a conseqüente aglutinação.

E ainda, na presença de MES, e de 0,5 a 1% de látex, é possível visualizar aglutinação.

Quanto a enterotoxina acoplada, nenhuma das condições testadas foi eficiente para

que houvesse detecção de anticorpo em amostras de soros.

Conforme foi atentado para a imunodifusão, os testes de aglutinação também

são subjetivos (Lim et al., 1998). Por isso, além dos resultados serem relatados por

mais de um observador, os testes foram realizados num prazo determinado. Num

período maior que trinta minutos, nas lâminas contendo o material em teste, este

apresentava-se seco. E, aproximadamente 15 minutos após mistura das soluções de

látex com a proteína, o controle negativo apresentava-se decantado, o que pode ser

confundido com aglutinação. Desta forma, os materiais analisados após este período

foram descartados. Por este motivo, e também pela subjetividade e praticidade, os

resultados não foram apresentados na forma de uma, duas ou três cruzes (Attar et al.,

2001), indicando menor ou maior reatividade. As amostras foram consideradas

positivas quando se observou aglutinação da mistura látex/proteína (sobrenadante ou

solução controle) e não se observava aglutinação da mistura látex/controle negativo

(meio BHI ou PBS ou água) no período de aproximadamente 8 minutos.

Apesar de os testes imunológicos de comparação utilizados não serem

absolutamente sensíveis e específicos, a PCR, por sua vez, apresenta alto índice de

confiabilidade, e isso valida os resultados de sensibilidade e especificidade

encontrados para os testes pilotos de aglutinação em látex. Ainda, a forma com que os

dados dos testes foram analisados aumenta a confiabilidade das comparações. Talvez

o teste baseado na aglutinação pudesse apresentar um percentual de sensibilidade

ainda maior, quando se considera para o fato de que a presença do gene não é

necessariamente evidência da presença da respectiva toxina (Sasaki et al., 2005), o

que se traduz em falsos negativos. Contudo, tal vantagem diagnóstica do teste piloto

não deve ser considerada definitiva, pois apenas 18% das amostras foram analisadas.

Além disso, não foi realizado o teste duplo-cego, onde se analisam as amostras sem

52

conhecer qualquer informação prévia pelo operador. Esses testes não foram realizados

por limitação do cronograma e pelo fato de ser um teste piloto, não necessitando ser

feito para todas as amostras. Entretanto, antes da realização dos testes de aglutinação,

foram testadas várias amostras controles, em diferentes concentrações para, então, as

amostras de conveniência serem testadas e consideradas. Embora uma amostra

comprovadamente positiva (a cepa B48) e outra comprovadamente negativa (a cepa

B10) tenham sido escolhidas como controles internos do teste piloto de aglutinação, os

operadores não tinham conhecimento prévio da classe secretada pelas outras

amostras.

Embora o teste piloto de aglutinação em látex tenha sido produzido apenas para

a SEC, verifica-se que é possível desenvolver este método de detecção rápido, seguro,

prático e fácil de usar, e estender as outras SEs. Além disso, comparando com os kits

disponíveis no mercado, a metodologia desenvolvida teria um custo muito reduzido:

enquanto um teste pelo kit comercial sairia por aproximadamente R$35,00 o teste de

aglutinação em látex teria um custo menor que R$10,00. Fica claro que o teste ainda

necessita ser avaliado para vários tipos de amostras alimentares, propositalmente

contaminadas com as SEs e aquelas disponíveis em estabelecimentos comerciais,

principalmente em alimentos mais suscetíveis a contaminação por S. aureus, uma vez

que as intoxicações mais prevalentes que causam diarréias infantis e gastroenterites

são as causadas pelas SEs estafilocócicas (Dinges et al., 2000). Além disso, o mundo

ainda vive o cenário de bioterrorismo (Mantis, 2005), no qual as SEs estão incluídas

como agentes categoria B de risco biológico, e um teste como esse, que seja rápido e

utilizável em larga escala, seria de grande valor.

53

6 – Conclusões

O teste piloto de aglutinação em látex mostrou-se um método sensível e

específico de detecção para SEC presente em amostras controles e de cepas de

Staphylococcus aureus enterotoxigênicas de conveniência.

Comparado com os testes de ELISA, imunodifusão e Western blot, o teste piloto

apresentou o melhor resultado de sensibilidade (83/100%) e especificidade (100/67%),

considerando como método de referência a PCR ou a imunodifusão.

Devido ao desempenho do teste piloto desenvolvido para detecção de SEC, ao

tempo reduzido para o ensaio e às altas sensibilidade e especificidade, é possível

propor a utilização do teste de aglutinação em látex como método de detecção de SEs

em amostras de alimentos e em fluidos biológicos.

O teste de aglutinação em látex é rápido, simples, fácil de usar e possui bom

desempenho, todavia, cabe ressaltar que é um método subjetivo, pelo fato de o

resultado ser dependente da observação visual.

A discrepância observada na sensibilidade, especificidade e na quantidade de

amostras positivas para a mesma proteína entre os diferentes métodos testados pode

ser justificado pelas possíveis reações cruzadas entre as toxinas, uma vez que as

enterotoxinas possuem altas homologias conformacionais e seqüenciais. A desconexão

também pode ser justificada pelas limitações dos métodos analisados.

54

Capítulo II

Terapia e Profilaxia Para Enterotoxinas Estafilocócicas

55

1 - Introdução

1.1 – Alvos terapêuticos ou profiláticos de neutralização

Para neutralizar os efeitos das toxinas existem pelo menos três importantes alvos:

1) a interação TCR-toxina-MHC classe II; 2) as moléculas de adesão, acessórias ou co-

estimulatórias envolvidas nas funções de ativação e efetoras das células T; e 3) as

citocinas secretadas pela ativação de células T e macrófagos. A inibição de todos ou um

dos três alvos tem sido descrito tanto in vitro como in vivo como meio viável de controlar

os efeitos biológicos dessas toxinas bacterianas (Stiles e Krakauer, 2005b).

Outras opções de controle alternativas aos antibióticos, à intervenção dos

mecanismos que regulam geneticamente a expressão dos fatores de virulência das

cepas de Staphylococcus aureus patogênicas (Medina-Acosta et al., 2003) e as que

envolvem as interações célula-célula (Stiles e Krakauer, 2005b) no hospedeiro são

aquelas que se utilizam de anticorpos que inibem a ação das toxinas (Kum e Chow,

2001) e aquelas que se utilizam das proteínas recombinantes, proteínas mutadas

(Mantis, 2005) e da seqüência de transcitose (Shupp et al., 2002) como antígenos

vacinais.

1.2 – Possíveis vacinas contra enterotoxinas

Vários grupos vêem desenvolvendo vacinas para SEs e TSST-1 (Stiles e Krakauer,

2005b). O potencial superantigênico das toxinas tem levado a investigação de seus

sítios antigênicos e sua utilização no desenvolvimento de profiláticos (Lowell et al.,

1996). A compreensão das interações moleculares entre SEB e TCR-MHCII tem

permitido o desenvolvimento de vacinas atenuadas com pequenas mutações em alguns

resíduos para inibição do seu potencial mitogênico. Tais vacinas têm sido testadas em

modelos animais (Tseng et al., 1995; Ulrich et al., 1998; Stiles et al., 2001; Gampfer et

al., 2002).

A proteção atribuída depende, além da própria formulação vacinal, da via de

inoculação, do adjuvante utilizado e ainda da espécie animal em questão. Lowell et al.

(1996), mostraram que camundongos imunizados, pela via intramuscular, com SEB

formalinizada na forma de proteossomas utilizando hidróxido de alumínio como

adjuvante, protegeu 60% dos animais desafiados com uma dose letal pela via

respiratória. Além disso, 80% dos animais imunizados inicialmente pela via

56

intramuscular seguida de administração intranasal (reforço) sobreviveram ao desafio

contra uma dose letal intramuscular, contendo galactosamina (Lowell et al., 1996).

Em mamíferos não primatas, três doses de SEB recombinante (produzida com três

mutações pontuais específicas para ligação ao MHC II e TCR), inoculadas pela via

intramuscular, e na presença de hidróxido de alumínio, protegeram 100% dos animais

contra um desafio utilizando dose letal de proteína veiculada em aerossol. Essa

proteína, quando utilizada como imunógeno, não induziu a elevação de temperatura,

clássica variável indicadora da síndrome do choque tóxico; porém, em animais não

protegidos, a temperatura variou de 1 a 2ºC (Boles et al., 2003a).

A imunização cruzada tem sido observada, o que significa que proteção em amplo

espectro seja possível. A vacinação de animais com uma toxina protege animais contra

várias outras SEs (ou TSST-1) ou a imunização de camundongos BALB/c com uma

mistura de SEs protege parcialmente os animais contra desafios utilizando uma ou

várias toxinas. Além disso, títulos maiores de anticorpos foram encontrados contra cada

SE quando os animais foram vacinados com a inoculação multivalente (Bavari et al.,

1999). A imunização de camundongos com SEC mutante, protegeu 62,5% dos animais

desafiados com S. aureus, em comparação com 0% do grupo controle (Hu et al.,

2005b).

O desenvolvimento de protocolos de imunização pelas formas ativas ou passivas

abre horizontes no sentido de proteger o público em amplas proporções, enquanto se

providencia uma planilha complementar de tratamento e proteção efetivos contra as

doenças causadas por essas toxinas (Hassani et al., 2004).

1.3 – Terapias contra enterotoxinas

1.3.1 – Baseadas em citocinas ou moléculas envolvidas na ativação de células T

Uma série de estratégias que inibe os superantígenos in vitro e in vivo está

descrita na literatura. A produção de óxido nítrico mediada por SEA e SEB está

intimamente ligada a síntese de citocinas pirogênicas IL-1, IL-2, IL-6, TNF, e INF-γ e a

inibição da enzima óxido nítrico sintetase, pela dexametasona ou anizomicina, reduziu a

produção dessas moléculas atenuando a resposta pirética (Won et al., 2000). A

produção de TNF-α no soro de animais administrados com SEB e lipopolissacarídeos

(LPS) foi reduzida em até 80% com a utilização do antiinflamatório pirfenidona,

57

demonstrando seu potencial terapêutico contra choque séptico e os efeitos biológicos

de SEB (Hale et al., 2002).

A proteína CD28 é um co-estimulador da união do receptor de reconhecimento

antigênico da superfície do linfócito T com o complexo antígeno-MHCII nas APCs.

Camundongos CD28-/- são resistentes ao choque tóxico, enquanto que camundongos

CD28+/- ou +/+ são suscetíveis. Esses resultados sugerem que inibição do co-

estimulador reduz efetivamente a proliferação de células T, pela inibição da produção de

TNF-α induzida por TSST-1 in vitro e previne a síndrome do choque tóxico in vivo (Saha

et al., 1996).

A tolerância em camundongos foi induzida pela aplicação nasal de SEA. O

fenômeno resultou na sobrevivência de 50-100% dos animais testados após o desafio

com SEA e 0% de sobrevivência dos animais desfiados com TSST-1. Neste caso, a

tolerância foi relacionada com o aumento dos níveis de IL-10 no soro, mas não com

depleção da reatividade de célula T induzida por SEA (Collins et al., 2002).

1.3.2 – Baseadas em interações com o antígeno/epítopo

A imunoprofilaxia passiva usando tanto anticorpos policlonais (Capparelli et al.,

2005) ou anticorpos monoclonais promove proteção imediata (embora por um curto

período) uma importante abordagem para pacientes que ou não querem esperar o efeito

da vacina ocorrer ou cujo sistema imune está muito comprometido para desenvolver

uma resposta imune contra a vacina (Projan et al., 2006). Os dados disponíveis na

literatura destacam a vantajosa utilização dessa terapia que pode ser aplicada para

reduzir ou eliminar a síndrome do choque tóxico, os efeitos de intoxicação, letalidade e

outras possíveis desordens associadas mediadas por superantígenos e SEs.

A transferência passiva em camundongos de IgY anti-SEB suprimiu a resposta de

citocinas e foi protetora (LeClaire et al., 2002). Macacos tratados com IgY anti-SEB

antes ou quatro horas após a exposição a uma dose letal de SEB, na forma de aerossol,

sobreviveram ao desafio (LeClaire et al., 2002). Também foi observado que este

anticorpo inibiu a atividade proliferativa da SE sobre células T obtidas de voluntários

humanos (LeClaire e Bavari, 2001).

O soro de camundongos imunizados com os mutantes de SEB, N23K e F44S,

protegeu de 80 a 87% de camundongos contra o desafio com 30 vezes a LD50 de SEB

nativa. Essa proteção ocorreu durante a administração do soro uma, duas ou quatro

58

horas após o desafio. Este soro também foi eficiente em bloquear a proliferação in vitro

de células T induzidas por SEB (Woody et al., 1997).

Como mencionado, a imunização com uma classe de enterotoxina resulta na

produção de anticorpos capazes de neutralizar outras. Ulrich et al. (1998), imunizaram

macacos com SEB e verificaram que os anticorpos policlonais produzidos protegeram

esses animais contra doses letais de SEA, SEB, SEC1 ou TSST-1, com um percentual

de sobrevivência de 100% para animais desafiados com SEB e SEC1.

Há também a possibilidade do anticorpo produzido contra uma das toxinas

estafilocócicas proteger contra a infecção por S. aureus. A utilização de dez miligramas

de anticorpo específico para TSST-1 reduziu a mortalidade de camundongos de 100%

para 80%, por 15 dias, após um desafio com 5 x 107 CFU de S. aureus 834 (Hu et al.,

2002).

Os anticorpos monoclonais também são interessantes imunoterápicos. Conforme

verificado por Bonventre et al. (1993), o anticorpo monoclonal Mab 8-5-7, específico

para TSST-1 nativa, protegeu coelhos não só contra os efeitos sistêmicos causados

pela TSST-1 nativa, mas também contra várias TSST-1 mutadas.

Em um outro tipo de experimento, onde foram analisados sítios funcionais da SEB,

foi observado que dois anticorpos monoclonais específicos para epítopos de SEB foram

capazes de bloquear, na toxina, um sítio de ligação ao MHCII ou um sítio de ligação

envolvido com o reconhecimento da cadeia Vβ do TCR (Hamad et al., 1994).

Inicialmente os anticorpos foram incubados com SEB. A neutralização de SEB pela

formação de complexo foi determinada investigando-se a produção de IL-2. A inibição

da produção de IL-2 indicou que as células T não responderam à ligação do complexo

SEB-MHCII porque os anticorpos monoclonais neutralizaram as moléculas de SEB. Em

seguida, SEB apresentada por APCs foi incubada com anticorpo monoclonal e um

reagente secundário fluorescente. A maior intensidade de fluorescência detectada foi

indicativa de que a região onde o anticorpo monoclonal se ligou seria responsável pela

ligação do complexo SEB-MHCII às células T.

1.3.3 – Baseadas em peptídeos

Os peptídeos têm atraído considerável atenção dos pesquisadores nos últimos

anos (Lomonossoff e Hamilton, 1999). Estes podem ser usados para identificar uma

seqüência específica responsável por algum efeito danoso na célula (Hamad et al.,

1994; Hu et al., 2001), para produção de vacinas, como sugerido por Shupp et al.

59

(2002), se estas seqüências forem conservadas nas moléculas, ou ainda como

antagonistas de moléculas alvo (Arad et al., 2000; Llewelyn e Cohen, 2001; Kaempfer

et al., 2002; Rajagopalan et al., 2004).

Hu et al. (2001), sintetizaram peptídeos de 10 aminoácidos não sobrepostos,

correspondentes a seqüência inteira de SEA. Anticorpos contra todos estes peptídeos

foram produzidos em coelhos. Ratos sadios, adultos, foram inoculados com misturas

de 6, 3, 2 ou 1 dos anticorpos produzidos contra cada peptídeo, junto com SEA (ED50).

Quanto menor fosse a quantidade de animais que apresentasse êmese, maior a

possibilidade do anticorpo produzido contra uma seqüência específica ser encontrado

nessa mistura. Consequentemente, este anticorpo, que pode ser utilizado como

terapêutico, teria sido produzido por uma seqüência responsável pela

enterotoxigenicidade da molécula analisada (Hu et al., 2001).

A região responsável pela passagem transepitelial das SEs (figura 20), o peptídeo

SEB152-161 KKKVTAQELD de transcitose, é um alvo interessante a ser explorado. Após a

conjugação do peptídeo ao carreador KLH, foram produzidos anticorpos anti-peptídeo

em camundongos. Soros destes animais foram utilizados num ensaio in vitro, em

células T-84, de inibição da transcitose de SEA, SEB, SEE e TSST-1, e o resultado foi

uma redução significante da transcitose das 4 toxinas (Shupp et al., 2002).

Figura 20: Esquema representativo da transcitose de SEs. A toxina próxima ao epitélio

intestinal é transcitada até os vasos sanguíneos utilizando o peptídeo de transcitose.

Essa transcitose é mediada, em parte, por um peptídeo específico e conservado nas

SEs, o peptídeo de transcitose (http://www.biodeliverysciences.com/

BDSI-images/transcytosis_small.jpg).

60

Pelo fato dos peptídeos serem fracos imunógenos, além da alternativa de ligá-los a

moléculas carreadoras (Abbas et al., 2000), uma estratégia encontrada para utilizar

peptídeos como vacina visa aumentar seu número de cópias na superfície de proteínas

carreadoras ou macromoléculas, como por exemplo, os vírus quiméricos, dentre eles,

os vírus de plantas (Lomonossoff e Johnson, 1995 e 1996).

O peptídeo de transcitose tem sido expresso na superfície de partículas virais

quiméricas de plantas com o objetivo de verificar tanto sua imunogenicidade para

anticorpos anti-peptídeo como para utilizá-lo como antagonista (Moura, 2004; Medina-

Acos

quatro horas sobreviveram a dose letal de

SEB

I das APCs, duas ou

uma

ibir in vitro a transcitose de

/peptídeo

foram

ta, dados não publicados).

Os peptídeos usados como antagonistas podem surtir efeitos antes e após a

exposição/desafio das SEs. Kaempfer et al. (2002), comprovaram que 30% dos

camundongos expostos num período de vinte e quatro horas e 20% dos camundongos

expostos num período superior a vinte e

quando o peptídeo de SEB148-161 VQTNKKVTAKELD foi administrado antes da

exposição. Além disso, 70, 60 e 50 % dos animais desafiados sobreviveram à

exposição letal de SEB, após administração do peptídeo V148QTNKKVTAKELD161, três,

cinco ou sete horas, respectivamente, após desafio.

Em outro trabalho foi comprovado que a administração de um peptídeo,

possivelmente inibidor competitivo pelo sítio de ligação ao MHC I

hora antes da administração individual de dose letal de diversas SEs protegeu

entre 83 a 100% de camundongos previamente sensibilizados com LPS e

galactosamina (Visvanathan et al., 2001)

O peptídeo de transcitose também foi utilizado para in

SEA, SEB, SEE e TSST-1 (Shupp et al., 2002). Diferentes proporções toxina

incubadas com 1µg/mL da toxina na presença de células T-84. A quantidade de

toxina capaz de atravessar as células epiteliais foi detectada por ELISA. Os resultados

indicaram que o peptídeo SEB152-161 foi capaz de inibir a transcitose de 73% de SEA,

aproximadamente 60% de SEB, 68% de SEE e 59% de TSST-1.

Com resultados tão promissores, não diferente da produção de anticorpos

específicos, a produção de peptídeos antagonistas das SEs e da TSST-1 permitiria

avaliar as vantagens terapêuticas desta estratégia na exposição sistêmica aos

superantígenos ingeridos ou inalados (Shupp et al., 2002).

1.4 – Vírus vegetais quiméricos como sistemas de apresentação de epítopos

61

Para resolver alguns dos problemas associados com os métodos tradicionais de

produção de vacina, como a perda da estrutura das proteínas pela sua desativação, a

reversão do fenótipo patogênico de microrganismos atenuados ou, o alto custo dos

processos de obtenção de proteínas recombinantes, tem sido considerado interessante

ção de epítopos (Lomonossoff e Johnson,

1996)

s

quime

ala, na ordem 1-2g/Kg (Porta e Lomonossoff,

1996;

tais como ausência do risco de contaminação

com p

as são suscetíveis a mobilidade genética durante a

o desenvolvimento de sistemas de apresenta

nos quais seqüências peptídicas definidas correspondentes a sítios antigênicos

específicos de patógenos são engenheiradas em vírus não patogênicos (Porta e

Lomonossoff, 1996). Nesse sistema, a seqüência de interesse é incorporada ao genoma

do vírus, que será replicado e, consequentemente, levado a síntese protéica. Esta

ras são atraentes como novos potenciais vacinais, porque as partículas

modificadas podem ser facilmente purificadas e a apresentação de múltiplas cópias do

peptídeo na superfície da macromolécula pode aumentar significativamente sua

imunogenicidade (Usha et al., 1993; Lomonossoff e Johnson, 1995 e 1996).

1.4.1 – Características dos vírus de plantas

Alguns vírus, Vírus do Mosaico do Feijão-de-Corda (CPMV – cowpea mosaic

virus), Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), Vírus do Tomate (TBSV), Pox Vírus (PPV), o

Vírus X da Batata (PVX) e o Vírus do Mosaico da Alfafa (AlMV), têm sido estudados e

utilizados como sistemas de expressão de proteínas em plantas (Lomonossoff, 2001).

Os vírus se multiplicam extremamente bem em seus hospedeiros e as partículas

são facilmente purificadas em grande esc

Scholthof et al., 1996; Lomonossoff, 2001; Mechtchriakova et al., 2005; Cañizares

et al., 2005). Dentre as vantagens que tornam os vírus atrativos para tal propósito

temos: 1) o vírus é termoestável, com o ponto termal de inativação maior que 60ºC; 2) o

genoma viral é pequeno e, portanto, fácil de manipulação; 3) a infecção das plantas é

facilmente realizada e; 4) a seqüência inserida no vetor viral é amplificada durante a

replicação viral (Liu et al., 2005; Cañizares et al., 2005). Os sistemas de expressão em

plantas ainda apresentam as vantagens

atógenos animais, baixos custos de produção, e a possibilidade de produção em

larga escala. Também oferecem a opção da produção de vacinas comestíveis

(Cañizares et al., 2005; Rae et al., 2005).

Algumas desvantagens de se utilizar vírus incluem 1) restrições físicas

associadas ao tamanho da seqüência a ser inserida, para que o vírus mantenha sua

viabilidade; 2) as seqüências inserid

62

replica

Para produção de vacinas comestíveis se faz necessário avaliar in vivo a

a condições gastrointestinais e é distribuído sistemicamente em

camun

er utilizadas como plataformas para moléculas de interesse diagnóstico, como

aquela

1.4.2

vírus de planta, o CPMV, oferece uma ferramenta potencialmente

segura para a apresentação de epítopos/proteínas de patógenos para o

desenvolvimento de vacinas de baixo-custo (Chatterji et al., 2002).

O CPMV pertence ao grupo comovirus e infecta um grande número de

leguminosas. Sua estrutura é icosaédrica, composta por 60 cópias da proteína maior

(proteína L), de aproximadamente 37,4 kDa, e 60 cópias da proteína menor (proteína

S), de 21,3 kDa (figura 21); o genoma viral é RNA bipartido e simples fita. O RNA 1

(5889 nucleotídeos) codifica a maquinaria de replicação, independente das células

vegetais, e o RNA 2 (3481 nucleotídeos) codifica as proteínas de movimentação e as

ção viral e; 3) tais seqüências não são mantidas estáveis após múltiplas

passagens (Liu et al., 2005; Cañizares et al., 2005). Apesar das desvantagens, o uso de

vírus de plantas para produção de vacinas vem crescendo como uma alternativa atrativa

aos tradicionais sistemas de produção.

administração oral de partículas virais. Rae et al. (2005), verificaram que o CPMV é

resistente

dongos, via corrente sanguínea, tanto para se ligar ao endotélio ou entrar no

parênquima tecidual numa variedade de tecidos após inoculação oral (e intravenosa) ou

alimentação com folhas infectadas.

Além de poderem ser usadas como vacinas, as partículas quiméricas podem

ainda s

s usadas em imunoensaios (Spasford et al., 2006) ou aquelas utilizadas para

técnicas de capturas de imagens (Lewis et al., 2006).

– Vírus do mosaico do feijão-de-corda como sistema de apresentação de

peptídeos

CPMV foi o primeiro vírus de planta a ser desenvolvido como sistema de

apresentação de epítopos. Por isso, os conhecimentos envolvendo a estrutura e o

genoma do CPMV são bem definidos, o que contribui para a sua ampla utilização como

sistema apresentador de epítopos e de expressão de polipeptídeos (Lomonossoff,

2001).

Sendo um

proteínas estruturais (Porta et al., 1994).

63

Figura 21: Modelo tridimensional do vírus quimérico do mosaico do feijão-de-corda que

expõe

que foi

comprovado com experimentos contendo uma variedade de quimeras. As

características físicas e biológicas das partículas modificadas são similares àquelas

obtidas para o CPMV selvagem (Porta et al., 1994).

A proteína S do capsídeo tem se mostrado extensivamente útil na inserção de

peptídeos exógenos, porém outros locais também têm sido utilizados com sucesso

como a alça βE-αB da proteína L e o sítio βC’-βC’’ da proteína S (Chatterji et al., 2002;

Porta et al., 2003; Liu et al., 2005).

Alguns exemplos de partículas quiméricas geneticamente estáveis produzidas a

partir de CPMV e diferentes seqüências heterólogas são apresentados na tabela 12,

evidenciando a capacidade de CPMV como sistema apresentador de epítopos.

peptídeos heterólogos. Em verde a proteína L; em azul a proteína S e em

amarelo a seqüência heteróloga (esquema gentilmente cedido por George Lomonossoff,

John Innes Centre, Inglaterra).

Uma análise detalhada da estrutura tridimensional do CPMV revelou que a alça

mais exposta da superfície do vírus, o βB-βC, região entre a alanina 22 e a prolina 23,

na proteína S, tolera a inserção de aproximadamente 40 aminoácidos, o

64

Tabela 12: Exemplos de epítopos expressos como peptídeos de fusão da proteína S de

CPMV.

Epítopo Origem da Seqüência Referência

VP1 Vírus da febre aftosa Usha et al., 1993

VP1 Rinovirus humano - 14 Porta et al., 1994

Gp41 Virus da imunodeficiência

humana -1

Kennedy et al., 1986

VP2 Parvovirose canina Dalsgaard et al.,1997;

Langeveld et al., 2001;

Nicholas et al., 2003

D2 da FnBP Staphylococcus aureus Brennan et al., 1999a

Proteína F Pseudomonas aeruginosa Brennan et al., 1999b

GP63, LACK,

LDP23

Leshmania chagasi Mittmann, 2004

Peptídeo de

transcitose

Enterotoxina B de

Staphylococcus aureus

Moura, 2004

1.4.3 - Propriedades Imunogênicas

Em termos tecnológicos, a produção de partículas virais quiméricas (PVQs)

oferece uma alternativa competitiva às metodologias clássicas de produção de

imunoprofiláticos. PVQs podem ser administradas em animais experimentais para

avaliar a eficiência desta tecnologia em conferir proteção contra doenças clínicas

desenvolvida tanto em animais como em humanos. A imunogenicidade dessas

partículas tem sido demonstrada em animais de experimentação pela injeção de

partículas que conferem proteção contra doenças (Porta et al., 1994).

Uma variedade de partículas virais contendo insertos na alça βB-βC da proteína

S tem sido propagadas e as partículas purificadas têm sido analisadas

imunologicamente. Os epítopos candidatos são derivados de rinovirus humano (HRV),

virus da imunodeficiencia humana (HIV), vírus da febre aftosa (FMDV), parvovirus

65

canina, virus measles, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Plasmodium

falciparum e outros agentes não patogênicos como hormônios, antígenos de células

tumorais, proteínas estruturais e peptídeos (Lomonossoff e Hamilton, 1999).

A eficácia das partículas quiméricas como vacina experimental tem sido

comprovada para diferentes modelos de doenças (tabela 13).

Em alguns casos, a imunização de uma partícula específica acarreta na proteção de

uma partícula de outro grupo, como no caso de camundongos imunizados com CPMVs.

Os anticorpos anti-CPMV produzidos foram transferidos passivamente para outra

linhagem de camundongos e protegeram esses animais contra dose intracraniana letal

do vírus da rubéola (Oleszewska e Steward, 2003).

Confirmada sua eficácia, as PVQs mostram-se bastante úteis para o

desenvolvimento de vacinas (Figura 22).

Figura 22: Esquema representativo da produção de vacinas pela tecnologia de

partículas virais quiméricas (modificado de esquema gentilmente cedido por George

Lomonossoff, John Innes Centre, Inglaterra).

66

Tabela 13: Peptídeos imunogênicos expressos utilizando o sistema viral de

apresentação de epítopos de plantas (Cañizares et al., 2005, modificado).

Peptídeo Propriedades Imunológicas Referência Gp-41 de HIV-1 Camundongos imunizados pela via

intraperitoneal ou nasal produziram altos

níveis de IgG e IgA contra HIV-1

Marusic et al., 2001

MHV Camundongos imunizados via parenteral

ou intranasal foram protegidos contra MHV

Koo et al., 1999

VP2* Injeção parenteral protegeu martas contra

desafio com Vírus da Enterite Martas;

A forma inativada da quimera inoculada

protegeu cães contra o desafio com

parvovirus canino.

Dalsgaard et

al.,1997; Langeveld

et al., 2001

D2 da FnBP* Aplicação parenteral protegeu ratos contra

endocardites.

Rennermalm et al.,

2001

Proteína F * Injeção parenteral protegeu camundongos

contra desafio com Pseudomonas

aeruginosa

Brennan, 1999b

Peptídeos da

proteína G e F do

vírus da raiva

Camundongos imunizados e desafiados

com a partícula NF1-g24 cederam a

infecção em 10-20 dias.

Voluntários imunizados com a partícula

Av/A4-g14 apresentaram aumento

significante nos níveis de anticorpos contra

o vírus da raiva.

Yusibov et al., 2002

Gp63 Camungondos imunizados pela via oral e

nasal foram parcialmente protegidos contra

desafio com Leishmania major

Mittmann, 2004

67

*Produzidos em partículas CPMV. Nos últimos anos houve um significante progresso no uso de vetores virais de

plantas para produção de imunógenos. Particularmente encorajador é o fato de que

peptídeos apresentados neste modelo podem conferir imunidade protetora contra várias

doenças. Na maioria dos casos, a imunidade é estimulada pela vacinação parenteral,

mas há casos em que a imunização via mucosa é possível. Isso aumenta a perspectiva

de que é possível conferir imunidade protetora pela simples alimentação com planta

infectada com a construção viral apropriada (Cañizares et al., 2005).

Assim como no caso dos peptídeos sintéticos, os peptídeos expostos na superfície

de partículas virais podem ser utilizados como antagonistas de moléculas alvo, com as

vantagens de sua produção ser mais barata e descomplicada que a produção de

peptídeos sintéticos e, ainda, poder competir pelo mesmo receptor que os fatores de

virulência.

Considerando as características tóxicas e superantigênicas das SEs como alvos

de possível eliminação, a seqüência K152KKVTAQELD161 de transcitose de SEB

(Shupp et al., 2002) foi expressa na superfície do vírus do mosaico do feijão-de-corda

por Moura, 2004, e o seu potencial terapêutico foi avaliado no presente trabalho.

1.5 – Justificativa

Não existe nenhuma vacina ou tratamento disponibilizados para o combate aos

sintomas causados por intoxicação ou superantigenicidade dessas toxinas. Desta

forma, também há a necessidade de desenvolver estratégias capazes de bloquear tais

efeitos que podem levar a morte. Com a finalidade de inibir efeitos visíveis causados

pela SEC recombinante ou pela SEC nativa, visamos avaliar duas estratégias: uma

baseada na interação antígeno-anticorpo (terapia passiva) e outra baseada na utilização

de partículas virais quiméricas expressando o peptídeo K152KKVTAQELD161 de

transcitose, presente nas SEs.

Em princípio, a terapia passiva poderia tratar indivíduos já expostos a aerossóis ou

intoxicados pela ingestão de alimentos contaminados. Esse tipo de proteção é imediata

e evita a necessidade de submeter o paciente, que já apresenta o sintoma ou que

apresenta imunossupressão, à imunização com a toxina e à espera da reação do

sistema imunológico.

O conhecimento e a utilização do peptídeo de transcitose representam um passo

importante quando se pensa em estratégias profiláticas/terapêuticas para as doenças

68

causadas pelas SEs e TSST-1. Esta seqüência de 10 aminoácidos é altamente

conservada nas SEs e na TSST-1. O desenvolvimento de uma vacina ou a produção de

anticorpos específicos através deste peptídeo evitaria o contato com regiões específicas

das proteínas responsáveis por causarem intoxicação e superantigenicidade. E ainda

permitiria inibir os efeitos tóxicos de várias SEs. Neste trabalho também propomos a

produção de anticorpo policlonal contra o peptídeo de transcitose e a avaliação destes

produtos na inibição dos efeitos tóxicos causados pelas SEs.

Acoplada a utilização de peptídeos está a implementação de partículas virais de

plantas como eficientes plataformas de apresentação de antígenos. Dentre as

vantagens apresentadas por esse sistema estão: 1) a facilidade de propagação das

partículas virais no hospedeiro e 2) as altas concentrações de partículas obtidas, 3) a

facilidade de purificação das partículas, 4) a dispensa da refrigeração, como ocorre nas

vacinas tradicionais, 5) os baixos custos e 6) facilidade de manutenção da planta para

propagação do vírus e, 7) o fato da técnica não requerer condições estéreis de cultura.

Ainda há a característica imunogênica/protetora dessas partículas.

Além das vantagens apresentadas pela utilização de partículas virais, é bem

possível que a produção dessas partículas quiméricas expressando 60 vezes o

peptídeo K152KKVTAQELD161 de transcitose permita sua utilização com uma função

diferenciada, a de antagonistas das SEs.

69

2 – Objetivos

2.1 – Avaliar in vivo o potencial terapêutico de anticorpos anti-SEC recombinante e anti-

peptídeo de transcitose K152KKVTAQELD161 em enterotoxinas.

2.2 – Avaliar in vivo o potencial terapêutico de partículas virais quiméricas do vírus do

mosaico do feijão-de-corda expressando o peptídeo de transcitose

K152KKVTAQELD161.

70

3 – Materiais e métodos

3.1 – Materiais biológicos

3.1.1 – Animais

Uma ninhada de três gatos machos sadios de 30 dias (~500 g/animal) foi obtida

através de um criador local.

Coelhos machos albinos sadios de 1-3 kg foram comprados de criador/fornecedor

local.

Os animais foram mantidos em ambiente de temperatura e iluminação

controladas, alimentados com ração e água ad libitum. Os coelhos foram agrupados

dois a dois e os gatos em três, em gaiolas 20 x 20 x 90 cm higienizadas diariamente.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os cuidados

exigidos pelo Comitê de Ética do LSA, CCTA, UENF, observando-se os Princípios

Éticos na Experimentação Animal, estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA) e a Lei número 3900 (2002), que institui o Código

Estadual de Proteção aos Animais.

3.1.2 – Partículas virais

As construções pCP1 (contendo o cDNA do RNA 1 do CPMV) e pCP2/PT14

(contendo o cDNA do RNA 2 do CPMV acrescentado do inserto para o peptídeo

K152KKVTAQELD161 de transcitose, responsável pela transcitose) foram utilizados para

infectar folhas primárias de Vigna unguiculata de 10 dias de idade. Dez microgramas

da construção pCP1 foram linearizados com a enzima Mlu I e dez microgramas da

construção pCP2 foram linearizados com Eco RI e, então, utilizadas para infecção, por

meio de abrasão manual com pó de carborundum. Após manutenção das plantas

infectadas a 25ºC, 65% de umidade, durante aproximadamente 20 dias, as primeiras

lesões cloróticas, indicativas de infecção/produção de partículas virais quiméricas,

apareceram. Depois de confirmada a produção de partículas por RT-PCR, PCR, SDS-

PAGE e Western blot, tais partículas, denominadas CPMV-PT14, foram purificadas,

dosadas, por espectrofotometria e utilizadas nos experimentos de neutralização de

SEC. As partículas CPMV selvagem foram produzidas de forma semelhante, porém,

utilizando o plasmídio pCP2, que não possui a seqüência codificadora do peptídeo de

transcitose (Moura, 2004). Ambas as partículas CPMV-PT14 ou CPMV selvagem foram

71

gentilmente doadas pela Bióloga colaboradora Renata Moura (Hospital Geral de

Guarus, Campos dos Goytacazes - RJ).

3.1.3 – Soros

3.1.3.1 – Produção de soro anti-CPMV (R20)

Antes da realização do ensaio foi coletado 1 mL de sangue (soro pré-imune).

Esquema de imunização: nos dias 0, 15º e 30º o coelho recebeu 200 µg de CPMV

selvagem, pela via subcutânea, emulsionada em adjuvante completo de Freund

(relação 1:1) na primeira imunização e emulsionada em adjuvante incompleto (relação

1:1) a partir da segunda imunização. No 45º dia foi feita coleta de sangue via punção

cardíaca. O sangue obtido foi incubado por uma hora a 37ºC para coagulação e, em

seguida, o soro foi separado e acondicionado congelado até realização do teste de

ELISA.

3.1.3.2 – Produção de soro anti-peptídeo de transcitose

3.1.3.2.1 – Obtenção de peptídeos sintéticos correspondentes à seqüência de

transcitose

Foram utilizados 2 peptídeos para produção de anticorpos anti-peptídeo de

transcitose (tabela 14), sintetizados por encomenda pela companhia Genemed

Synthesis Inc, São Francisco, EUA, a partir da seqüência de transcitose de SEB

descrita por Shupp et al., 2002.

72

Tabela 14: Informações sobre as seqüências dos peptídeos de transcitose utilizados

para a produção de anticorpos.

Peptídeo Diferencial Referência

MAP-KKKVTAQELD Possui oito seqüências do

peptídeo de transcitose

K152KKVTAQELD161 acoplados

num suporte de lisina carreador de

MAP (multiple antigen peptide).

Shupp et al., 2002;

Tam e Zavala,

1989; Tam e

Spetzler, 1997

C-KKKVTAQELD O resíduo de cisteína adicionado

tem o propósito de acoplamento

apenas.

Shupp et al., 2002;

Genemed

Synthesis Inc, São

Francisco, EUA

3.1.3.2.2 – Imunização de coelhos com os peptídeos MAP-KKKVTAQELD e C-

KKKVTAQELD

Peptídeo MAP-KKKVTAQELD

Protocolo 1

Antes de iniciar o experimento, 1 mL de soro do coelho foi coletado (soro pré-

imune). Esquema de imunização: nos dias 0, 15º e 30º o coelho recebeu 1 mg do

peptídeo MAP-KKKVTAQELD, pela via subcutânea, emulsionado em adjuvante

completo de Freund (relação 1:1) na primeira imunização e emulsionado em adjuvante

incompleto (relação 1:1) a partir da segunda imunização. No 45º dia foi feita coleta de

sangue via punção cardíaca. O sangue obtido foi incubado por uma hora a 37ºC para

coagulação e, em seguida, o soro foi separado e acondicionado congelado até

realização do teste de ELISA.

Protocolo 2

Antes de iniciar o experimento, 10 mL de soro de cada animal foi coletado (soro

pré-imune). Neste caso, dois coelhos foram imunizados conforme o protocolo descrito a

seguir. Estas imunizações foram realizadas pelo colaborador veterinário Ricardo José

Bottecchia e os animais foram mantidos e tratados segundo as normas da EMBRAPA,

local onde foram mantidos os animais. Esquema de imunização: nos dias 0, 7º, 15º e

73

21º um coelho recebeu 500 µg do peptídeo MAP-KKKVTAQELD, no ponto BaiHui

(Lignon e Bottecchia, 2000), num volume de 1 mL de solução salina. O outro animal

recebeu 500 µg do peptídeo MAP-KKKVTAQELD, pela via intraperitoneal, emulsionado

em adjuvante completo de Freund (relação 1:1) na primeira inoculação e emulsionado

em adjuvante incompleto (relação 1:1) a partir da segunda inoculação. No 28º dia o

sangue de cada animal foi coletado via punção cardíaca. O sangue obtido foi incubado

por uma hora a 37ºC para coagulação e, em seguida, o soro foi separado e

acondicionado congelado até realização do teste de ELISA.

O mesmo protocolo de imunização foi realizado para dois coelhos, porém

utilizando 1 mg de peptídeo.

Peptídeo C-KKKVTAQELD

A imunização com esse peptídeo foi realizada por encomenda pela Genemed

Synthesis Inc., São Francisco, EUA. Além da imunização ter sido em 2 coelhos, não há

mais informações sobre o protocolo utilizado.

3.1.3.3 - Ensaio de ELISA

O ELISA dos soros dos animais imunizados no item 3.1.3 foi realizado contra

CPMV, para animais imunizados com CPMV selvagem, ou contra os peptídeos MAP-

KKKVTAQELD ou C-KKKVTAQELD, contra a SEC recombinante e contra a partícula

viral CPMV-PT14, para os animais imunizados com os peptídeos (tabela 15). O

protocolo ELISA foi realizado conforme o item 3.2.1, capítulo I.

Foram utilizados 2 µg/mL de SEC recombinante e 5 µg/mL de cada peptídeo ou

de CPMV selvagem ou CPMV-PT14 para sensibilização das placas. O soro controle foi

o R18 (anti-SEC recombinante, 1:15000). O soro de coelhos imunizados no item

3.1.3.1 e 3.1.3.2, capítulo II, foram testados a partir da diluição 1:100 até 1:25600.

74

Tabela 15: Ensaio de ELISA com as combinações dos diferentes peptídeos, SEC

recombinante e partícula viral CPMV-PT14 com os soros dos animais imunizados.

Reagente contra o qual os soros foram testados Soro do animal

inoculado com o

peptídeo MAP-

KKKVTAQELD

C-

KKKVTAQELD

SEC

recombinante

Partícula CPMV-

PT14

MAP-KKKVTAQELD X

C-KKKVTAQELD X X X

3.1.3.4 – Avaliação do anticorpo anti-peptídeo de transcitose por imunoprecipitação de

partículas virais

A um tubo de ensaio foram adicionados 50 µL de solução contendo 5 µg de

partículas virais e 50 µL de soro (contra a partícula ou pré-imune ou contra o peptídeo

C-KKKVTAQELD). Essa mistura foi incubada por duas horas a 37ºC, sob agitação.

Então, foram acrescentados 50 µL de uma suspensão 50% (v/v) de proteína G

sepharose (Sigma-Aldrich). O tubo foi novamente incubado a 37ºC por uma hora, sob

agitação. Após o período de incubação, o material foi transferido para tubos de

microcentrífuga e centrifugado a 3000 x g por cinco minutos. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado foi lavado 3 vezes com PBS 1X (Harlow e Lane, 1998c). O

material foi suspenso em 50 µL de tampão de amostra completo.

Uma alíquota de 20 µL de cada amostra foi fracionada em SDS-PAGE, gel de

separação 15% e então transferida para membrana de nitrocelulose, conforme

explicitado no item 3.2.2, capítulo I. Após bloqueio, a membrana foi incubada com o

soro R20 (1:5000) por duas duas horas e após lavagem foi incubada por mais duas

horas com proteína A peroxidase (1:5000).

3.2 – Ensaio de neutralização do efeito pirético da SEC nativa com IgG anti-SEC

recombinante em gatos

Antes da realização do ensaio, foram coletados de cada gato, 500 µL de sangue,

que foram incubados por uma hora a 37ºC para coagulação. Em seguida, o soro foi

separado e testado para verificação da presença de anticorpos contra SEC. Tendo sido

75

negativos por ELISA (item 3.2.1, capítulo I) para anticorpos IgG anti-SEC, os animais

foram utilizados no experimento.

Protocolo terapêutico: 2 mg de IgG anti-SEC recombinante (item 3.1.3.1, capítulo

I) foram incubados com 100 µg de SEC nativa purificada (item 3.1.1, capítulo I) por

uma hora, 37º. O volume final foi de 1 mL, em PBS. A mistura foi inoculada pela via

intraperitoneal. A temperatura retal foi medida antes da inoculação; a cada hora por

três horas consecutivas, após inoculação. Foram observadas variação de temperatura

e a ocorrência de vômito, diarréia, letargia e sonolência (Martin e Marcus, 1964; Clark e

Page, 1968; Boles et al., 2003b; Ilbäck et al., 2003).

Protocolo não terapêutico: 2 mg de IgG pré-imune (item 3.1.3.1, capítulo I) foram

incubados com 100 µg de SEC nativa purificada por uma hora, 37º. O volume final de 1

mL, em PBS, foi administrado vinte e quatro horas após aplicação do protocolo

terapêutico, pela via intraperitoneal. A temperatura retal foi medida antes da inoculação

e a cada hora por três horas, após inoculação. Também foram observadas variação de

temperatura e a ocorrência de vômito, diarréia, letargia e sonolência.

O monitoramento da temperatura retal se fez com o uso do termômetro durante

três minutos. Foi considerada resposta pirética aquela em que a temperatura variou em

1,2ºC ou mais, em relação ao tempo 0 (Marcus e Martin, 1964).

3.3 – Ensaio de neutralização do efeito diarréico da SEC recombinante com IgG anti-

SEC recombinante em coelhos

Antes da realização do ensaio, foram coletados de cada coelho, 500 µL de

sangue, que foram incubados por uma hora a 37ºC para coagulação. Em seguida, o

soro foi separado e testado para verificação da presença de anticorpos contra SEC.

Tendo sido negativos por ELISA (item 3.2.1, capítulo I) para anticorpos IgG anti-SEC,

os animais foram utilizados no experimento.

Protocolo terapêutico: 2 mg de IgG anti-SEC recombinante foram incubados com

60 µg de SEC recombinante (item 3.1.2, capítulo I) por uma hora, 37º. O volume final

foi de 1 mL, em PBS. A mistura foi inoculada subsequentemente no ponto BaiHui. A

temperatura retal foi medida antes da inoculação e 2 vezes durante vinte e quatro

horas após inoculação. Foram observadas variação de temperatura e a ocorrência de

taquipinéia, constipação, fezes mucosas, diarréia, letargia e sonolência (Shlievert et al.,

2000; Lignon e Bottecchia, 2000; Hu et al., 2003).

76

Protocolo não terapêutico: 2 mg de IgG pré-imune foram incubados com 60 µg de

SEC recombinante por uma hora, 37º. O volume final foi de 1 mL, em PBS. A mistura

foi inoculada vinte e quatro horas após aplicação do protocolo terapêutico, no ponto

BaiHui. A temperatura retal foi medida antes da inoculação e 2 vezes durante vinte e

quatro horas após inoculação. Também foram observados efeitos como variação de

temperatura e ocorrência de taquipinéia, constipação, fezes mucosas, diarréia, letargia

e sonolência.

O monitoramento da temperatura retal se fez com o uso do termômetro durante

três minutos. Foi considerada resposta pirética aquela em que a temperatura variou em

1ºC ou mais, em relação ao tempo 0 (Boles et al., 2003a).

3.4 – Ensaio de neutralização do efeito diarréico de SEC recombinante com a partícula

viral quimérica CPMV-PT14



soro foi separado e testado para verificação da presença de anticorpos anti-SEC e anti-

CPMV. Tendo sido negativos por ELISA (item 3.2.1, capítulo I) para anticorpos IgG

anti-SEC e IgG anti-CPMV, os animais foram utilizados no experimento.

Protocolo terapêutico: 30 µg de SEC recombinante e 200 µg do vírus CPMV-PT14

(que equivalem a uma relação molecular proteína/peptídeo de aproximadamente 1:1)

foram misturados (volume final de 500 µL, em PBS) e administrados, pela via oral. Os

animais foram observados diariamente, durante sete dias, para verificação da

ocorrência de fezes com muco, pastosa ou diarréica (Arad et al., 2000; Shupp et al.,

2002; Kaempfer et al., 2002). Dois dias após inoculação, amostras de fezes foram

coletadas para detecção de partícula viral.

Protocolo não terapêutico: Sete dias após administração do protocolo terapêutico,

30 µg de SEC recombinante e 200 µg de CPMV selvagem misturados (num volume de

500 µL em PBS) foram administrados pela via oral. Os animais foram novamente

observados, durante sete dias, para verificação da ocorrência de fezes com muco,

pastosa ou diarréica.

3.4.1 – Detecção de partícula viral das fezes de coelhos

77

Amostras de fezes dos coelhos (três gibalas por 2 animais) foram coletadas dois

dias após administração do protocolo terapêutico e maceradas em 1-2 mL de tampão

fostafo (van Kammen, 1967). Após centrifugação, 12000 x g por dez minutos, o

sobrenadante foi utilizado para sensibilização das placas de poliestireno de 96 poços

para testes de ELISA.

3.4.2 – Detecção de partículas virais em soro de coelhos

Vinte e quatro horas antes do experimento foram coletados aproximadamente 500

µL de sangue de 4 coelhos, de aproximadamente 1 Kg. Dois coelhos foram

administrados com 200 µg de partícula selvagem em 500 µL de PBS, pela via oral.

Outros dois coelhos foram administrados com 200 µg de CPMV-PT14 em 500 µL de

PBS, pela via oral. Após administração das partículas, 300 a 1000 µL de sangue dos

coelhos foram coletados (da orelha com agulha 27G) a cada duas horas durante oito

horas. O sangue foi incubado por uma hora a 37ºC e posteriormente centrifugado para

obtenção do soro. Amostras diluídas dos soros foram analisadas por

espectrofotometria de varredura (Specord M500, Zeiss Germany), comprimentos de

onda variando entre 220 nm e 400 nm. Picos (denominados pico-identidade, daqui em

diante) nos comprimentos de onda 260 e 290 nm indicam a presença de partículas

virais (van Kammen, 1967). O soro coletado quatro horas após inoculação com CPMV-

PT14 foi também utilizado para infectar plantas de feijão-de-corda (Vigna unguiculata)

por abrasão manual e para imunodetecção.

3.4.3 – Verificação do potencial diarréico da SEC recombinante pela via oral

Dois coelhos foram administrados pela via oral com 30 µg de SEC recombinante

(com um lote comprovado causador de diarréia após administração pela via

subcutânea). Os animais foram observados durante três dias para verificação de

diarréia.

3.5 – Verificação do potencial diarréico da SEC nativa obtida do sobrenadante da cepa

B48

A cepa bubalina B48 de S. aureus, produtora de enterotoxina C e TSST-1, testada

por imunodifusão e Western blot, foi cultivada por dezoito horas a 37ºC, em meio BHI.

A dosagem aproximada de SEC no sobrenadante foi realizada por meio de SDS-PAGE

78

e imunodetecção, comparando visualmente as intensidades das bandas de uma curva

de diluição de SEC recombinante e da banda de igual peso molecular na raia

correspondente ao sobrenadante da cepa B48.

Três coelhos de aproximadamente 1Kg receberam, pela via subcutânea, 150 µL

de sobrenadante da cepa B48 contendo aproximadamente 8 µg de SEC nativa. Os

animais foram observados durante três dias para verificação de diarréia.

3.5.1 – Ensaio de neutralização do efeito diarréico de SEC nativa com a partícula viral

quimérica CPMV-PT14



soro foi separado e testado para verificação da presença de anticorpos contra SEC e

anti-CPMV. Tendo sido negativos por ELISA (item 3.2.1, capítulo I) para anticorpos IgG

anti-SEC e IgG anti-CPMV, os animais foram utilizados no experimento.

Protocolo terapêutico: 3 coelhos receberam, pela via subcutânea, 150 µL de

sobrenadante da cepa B48 cultivada em meio BHI misturado com 200 µg de CPMV-

PT14 (volume final de 500 µL). Os animais foram observados diariamente, durante sete

dias, para verificação de fezes com muco, pastosas ou líquidas.

Protocolo não terapêutico: 3 coelhos foram administrados, pela via subcutânea,

com uma mistura contendo 150 µL do mesmo lote de sobrenadante da cepa B48 e 200

µg de CPMV selvagem. Os animais foram observados diariamente, durante sete dias,

para verificação de fezes com muco, pastosas e diarréicas.

79

4 - Resultados

4.1 – Avaliação da resposta humoral de animais

4.1.1 – Após imunização com CPMV selvagem

Os soros pré-imune e imune (R20) foram testados contra CPMV. Houve

resposta humoral após administração da partícula no coelho e apenas o soro imune

apresentou sinal, com endpoint 1:12800 contra a partícula viral.

4.1.2 – Após imunização com peptídeos

Peptídeo MAP-KKKVTAQELD

O soro obtido na coleta do dia 45 (protocolo 1 de imunização) e seu pré-imune

foram testados por ELISA contra o peptídeo MAP-KKKVTAQELD. Não houve resposta

humoral para o coelho imunizado pela via subcutânea com 1 mg do peptídeo. O valor

da DO492nm para o título na menor diluição utilizada (1:100) foi igual ao valor obtido para

o controle negativo.

Os soros obtidos na coleta do dia 28 (protocolo 2 de imunização) e seus pré-

imunes foram testados por ELISA. Não houve resposta humoral contra o peptídeo

MAP-KKKVTAQELD para os coelhos imunizados no ponto BaiHui ou fora do ponto,

com 500 µg ou 1 mg de peptídeo. O valor da DO492nm para o título na menor diluição

utilizada (1:100) foi igual ao valor obtido para o controle negativo.

Peptídeo C-KKKVTAQELD

Os soros pré-imunes ou imunes, obtidos pela companhia Genemed Synthesis

Inc, São Francisco, EUA, foram testados contra o peptídeo C-KKKVTAQELD, SEC

recombinante e CPMV-PT14. Apenas o soro imune apresentou sinal, com endpoint

maior que 1:100000 contra o peptídeo C-KKKVTAQELD, 1:3200 contra SEC

recombinante e 1:50 contra CPMV-PT14.

O título dos soros anti-peptídeo de transcitose MAP-KKKVTAQELD negativo

para SEC recombinante e do soro anti-peptídeo C-KKKVTAQELD de 1:3200 para SEC

recombinante, foi considerado insuficiente para execução do, então planejado, desenho

experimental in vivo de neutralização dos efeitos diarréico e pirético de SEC

recombinante com soro anti-peptídeo de transcitose.

80

4.1.3 - Imunoprecipitação de partículas virais

Os baixos títulos do anticorpo anti-peptídeo de transcitose contra SEC e a

negatividade do mesmo anticorpo contra a partícula CPMV-PT14 sugerem que os

anticorpos presentes nestes soros reconhecem peptídeos na sua estrutura

tridimensional. Para avaliar essa possibilidade foi realizado o ensaio de

imunoprecipitação. Este teste visa a precipitação do complexo

partícula/anticorpo/proteína A Sepharose formado. Quando este complexo é submetido

a separação em SDS PAGE, as ligações formadas entre essas moléculas são desfeitas

e então é possível detectar as proteínas do capsídeo viral que ligarem ao anticorpo

anti-peptídeo.

Somente o anticorpo anti-CPMV se ligou a partícula CPMV-PT14, assim como a

CPMV selvagem (figura 23). Sendo assim, é possível concluir que o anticorpo anti-

peptídeo K152KKVTAQELD161de transcitose (Genemed Synthesis Inc, São Francisco,

EUA) não reconhece a partícula CPMV-PT14.

Figura 23: Membrana de nitrocelulose revelada com R20. Raias: M) marcador

Kaleidoskope (Bio-Rad); 1) CPMV selvagem (lote 1) + soro R20; 2) CPMV selvagem

(lote 1) + soro R18 (anti-SEC recombinante); 3) CPMV selvagem (lote 2) + R20; 4)

CPMV selvagem (lote 2) + R18; 5) CPMV-PT14 + R20; 6) CPMV-PT14 + pré-imune do

coelho imunizado com o peptídeo C-KKKVTAQELD (Genemed Synthesis); 7) CPMV-

PT14 + soro do coelho imunizado com o peptídeo C-KKKVTAQELD (Genemed

Synthesis).

81

4.2 – Neutralização do efeito pirético de SEC recombinante com IgG anti-SEC em

gatos

Após administração tanto do protocolo terapêutico quanto do protocolo não

terapêutico não foram observados eventos de vômitos ou diarréia nos gatos. Letargia e

sonolência também não foram visíveis.

Com relação à temperatura, ambos os protocolos testados induziram resposta

pirética. Para os gatos 1 e 2, no T3 com o protocolo terapêutico e, para o gato 3, no T3

com os protocolos terapêutico e não terapêutico (figura 24, A e B).

Figura 24: Variação de temperatura nos gatos submetidos aos protocolos A)

terapêutico e B) não terapêutico. T0 = temperatura antes da inoculação; T1-T3 =

de SEC recombinante por IgG anti-SEC em

ra a SEC recombinante para neutralizar este efeito

diarréico.

temperatura após 1, 2 e 3 horas, respectivamente.

4.3 – Neutralização do efeito diarréico

coelhos

Em experimentos preliminares verificou-se que 30 µg de SEC recombinante,

quando inoculados no ponto BaiHui, foram suficientes para causar diarréia em coelhos.

Foi utilizado um anticorpo cont

82

Vinte e quatro horas após administração do protocolo terapêutico, os coelhos

não foram acometidos com diarréia ou mesmo fezes contendo muco. Em contrapartida,

vinte horas após administração do protocolo não terapêutico, fezes contendo muco até

iarréia severa foram observadas, após um período de constipação.

Sonolência e taquipinéia não foram observadas em nenhuma das duas

condições testadas, porém letargia foi observada no caso dos animais submetidos ao

protocolo não terapêutico.

Os animais submetidos ao protocolo não terapêutico apresentaram falta de

apetite nas dezoito horas após inoculação, enquanto que após a administração do

protocolo terapêutico a alimentação foi habitual. O critério de avaliação foi a diferença

na quantidade de alimento consumido por cada grupo de dois animais no mesmo

período, nos dois tratamentos.

A temperatura dos coelhos também foi verificada (figura 25, A e B). Somente no

caso do protocolo não terapêutico ocorreu resposta pirética. O aumento da temperatura

ocorreu para os coelhos 2, 3 e 4 (protocolo não terapêutico) no tempo de 2 horas.

d

Figura 25: Variação de temperatura nos coelhos submetidos aos protocolos A)

terapêutico e B) não terapêutico. Apenas o protocolo não terapêutico induziu resposta

irética. p

83

84

para o protocolo não terapêutico foi

ou anticorpos anti-

sagem da SEC e consequentemente seus

foi verificado se a partícula viral administrada oralmente seria

detectada no soro ou ficaria retida nesse sítio.

4.4.2 – Investigação de partícula viral em soro de coelhos

Amostras de CPMV selvagem e CPMV-PT14, utilizadas como controles nesta

etapa, apresentaram um pico-identidade no comprimento de onda de 260 nm (Figura

26A). A análise do espectro de varredura dos soros dos animais administrados com

CPMV-PT14 também apresentou um pico-identidade no comprimento de onda de 260

nm, no tempo de coleta de quatro horas (Figura 26D e 3E). Entretanto, para os animais

administrados com CPMV selvagem não foi observado, em nenhum espectro, o pico-

identidade correspondentes à partícula viral (Figura 26B e 3C).

4.4 – Neutralização do efeito diarréico de SEC recombinante com partícula CPMV-

PT14, via oral

Nem para o protocolo terapêutico ou

observada ocorrência de diarréia, ao contrário, os animais apresentaram bem-estar e

fezes habituais.

Com o intuito de investigar a suspeita ocorrência de anticorpos anti-CPMV e

anti-SEC nos animais submetidos aos protocolos terapêutico e não terapêutico, isto é,

a exposição prévia à partícula viral, os respectivos soros pré-imunes foram testados por

ELISA. Nenhum dos soros foi positivo para anticorpos anti-CPMV

SEC.

4.4.1 – Investigação de partícula viral em fezes de coelhos

Não foi detectada partícula viral nas fezes, conforme monitorado por ELISA com

anticorpo anti-CPMV, o que sugeria que a partícula estivesse sendo absorvida pelo

epitélio intestinal do animal.

Além disso, não foi observado o quadro de intoxicação esperado após

administração de SEC recombinante em coelhos (no protocolo não terapêutico), o que

sugere que as partículas CPMV selvagem poderiam ser capazes de competir/bloquear

o sítio de transcitose, impedindo a pas

efeitos. Sendo assim,

Figura 26: Espectro de varredura. Partículas virais CPMV e CPMV-PT14 purificadas apresentando um pico-identidade em 260 nm

(A); soros de coelhos inoculados com CPMV selvagem (B e C), que não apresentaram o pico-identidade; e soros de coelhos

inoculados com CPMV-PT14 (D e E), onde é possível verificar um pico em 260 nm.

85

86

Figura 26: continuação.

Quando testados por imunodetecção, os soros dos coelhos administrados com

partículas virais não apresentaram reação positiva para as proteínas L e S do vírus

com o anticorpo anti-CPMV (figura 27).

Figura 27: Membrana de nitrocelulose incubada e revelada com o anti-CPMV. Raias: 1

e 2) controles positivos: ~ 6 µg de CPMV selvagem e CPMV-PT14 purificados,

respectivamente; 3) mistura do soro pré-imune dos coelhos 1 e 3; soro do coelho 1

após administração de partículas CPMV selvagem nos tempos: 4) 2 horas; 5) 4 horas;

6) 6 horas; soro do coelho 3 após administração de partículas CPMV-PT14 nos

tempos: 7) 2 horas; 8) 4 horas e 9) 6 horas.

As plantas de feijão-de-corda inoculadas com soro do coelho 3 (administrado

com CPMV-PT14) apresentaram leves sintomas de infecção. Para verificar a infecção

por CPMV, extratos foliares dessas plantas foram utilizados para inoculação em novas

plantas. Essas plantas apresentaram lesões cloróticas ou e formação de mosaico foliar

(figura 28), indicativa de infecção viral. Esses resultados corroboram os dados

observados por espectrofotometria.

87

Figura 28: Imagens de folhas de feijão-de-corda: A e B) não inoculadas e C e D)

infectadas com partículas presentes no extrato bruto das plantas diretamente

inoculadas com o soro de coelho 3, coletado 4 horas após administração de CPMV-

PT14.

Resumindo, embora CPMV selvagem ou CPMV-PT14 não tenham sido

, CPMV-PT14 foi

dete

sido detectada partícula viral no soro de um

coelho por espectrofotometria e ainda, o soro do animal administrado com CPMV-PT14

detectadas por imunodetecção em membrana de nitrocelulose

ctada no soro, por espectrofotometria. Além disso, partículas presentes nas plantas

inoculadas com o soro do coelho 3 foram capazes de infectar novas plantas. Esses

resultados sugerem que a partícula é eficientemente transcitada através do epitélio

intestinal quando administrada pela via oral.

4.4.3 – Verificação do potencial diarréico da SEC recombinante após administração

oral

Visto que a administração de SEC na presença de CPMV selvagem, via oral, não

resultou em quadro diarréico, além de ter

88

ter infectado feijão-de-corda, suspeitou-se de que a SEC recombinante utilizada no

ensaio não estivesse sendo tóxica. Sendo assim, foi necessário verificar a toxicidade

da concentração de SEC recombinante utilizada no ensaio. Foi observado que 30 µg

de SEC inoculados pela via oral não foram suficientes para causar diarréia nos

coelhos.

4.5 – Neutralização de SEC nativa com partícula viral CPMV-PT14

Este experimento teve como objetivo verificar se a partícula viral inoculada pela

binante e do sobrenadante da cepa B48, em membrana de nitrocelulose revelada

om soro anti-SEC recombinante, diluído 1:8000. Por comparação visual, foi

cons

via subcutânea juntamente com as SEs nativas presentes no sobrenadante da cultura

B48 é capaz de neutralizar/diminuir o efeito tóxico causado pela SEC. Para isso, foi

necessário quantificar, previamente, SEC presente no sobrenadante.

A figura 29 mostra o perfil eletroforético de diferentes concentrações de SEC

recom

c

iderado que o volume aplicado no gel do sobrenadante em questão possuía

aproximadamente 400 ng de SEC nativa.

Figura 29: Dosagem de SEC nativa secretada in vivo por S. aureus cepa B48.

Membrana de nitrocelulose incubada e revelada com soro anti-SEC recombinante.

Raias: M) marcador Kaleidoskope (Bio-Rad); 1-5) 4,5; 2,25; 0,9; 0,45; 0,09 �g de SEC

recombinante, respectivamente, 6) sobrenadante da cepa estafilocócica B48, 7) meio

BHI.

Previamente à execução dos protocolos terapêutico e não terapêutico foi

observado que 150 µL de sobrenadante da cepa B48 (contendo 8 µg de SEC nativa)

89

foram suficientes para causar diarréia nos animais vinte e quatro horas após

oculação. A normalização das fezes ocorreu em três dias.

O

in

s animais submetidos ao protocolo terapêutico não foram acometidos pelo

quadro de diarréia, durante os sete dias de observação. Ao contrário, episódios de

diarréia foram observados nos animais administração com protocolo não terapêutico, a

partir do segundo dia, durante 4 dias. Nos dois grupos, foi visto de uma a três fezes

amolecidas, mas não diarréica.

90

5 – Discussão

Além de causarem intoxicações alimentares, as SEs são proteínas classificadas

como superantígenos e por isso induzem a ativação do sistema imunológico de forma

não específica (Dinges et al., 2000; Phillips, 2002), levando indivíduos acometidos ao

al., 2000), gatos (Martin e Marcus, 1964),

ntínua de um

quadro de choque tóxico. O quadro clínico de choque tóxico se caracteriza por febre

acima de 38,9ºC, descamação da pele, hipotensão, e alterações dos sistemas

gastrointestinal, muscular, mucoso, renal, hepático, hematológico e nervoso central

(Monday e Bohach, 1999).

A ativação do sistema imune por SEs envolve a ligação não específica do

superantígeno às moléculas de MHC II nas APCs e os TCRs das células T. As

interações entre essas moléculas resultam na ativação de até 25% dos linfócitos T

(Kappler et al., 1994) e conseqüente excesso na produção de citocinas

proinflamatórias. Algumas dessas citocinas são responsáveis pela elevação da

temperatura não apenas em humanos, mas também em animais, fato que leva os

pesquisadores a utilizá-los como modelos de estudo (Martin e Marcus, 1964, Scheuber

et al., 1983, Huang et al., 1997, Wright et al., 2000, Kum e Chow, 2001, Boles et al.,

2003b).

Vários modelos animais têm sido utilizados nos ensaios biológicos que envolvem

SEs: camundongos (Kum e Chow, 2001), cobaias (Scheuber et al., 1983), coelhos

(Huang et al., 1997), furão (Wright et

macacos (Boles et al., 2003b). No presente trabalho foram utilizados dois modelos de

experimentação, gatos e coelhos. Vale ressaltar que os animais foram devidamente

cuidados conforme os princípios éticos estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA) e a Lei número 390 (2002), que institui o Código

Estadual de Proteção aos Animais e sob o conhecimento e supervisão co

veterinário. Ainda, o desenho experimental permitiu utilizar um número reduzido de

animais, devido às dificuldades em se trabalhar com animais maiores, que necessitam

de uma estrutura mais elaborada. Isso tornou o experimento menos dispendioso. O

desenho dos protocolos de experimentação também considerou gatos e coelhos como

animais de estimação e assim sensibilizam o experimentador.

Os gatos foram utilizados para verificação da resposta pirética após

administração intraperitoneal de SEC nativa, na presença ou ausência de anti-SEC

recombinante. Nestes animais, febre é melhor indicativo de intoxicação do que a

91

êmese (Clark e Page, 1968) e um aumento de 1,2ºC na temperatura já é definida como

resposta pirética (Martin e Marcus, 1964). Embora os gatos sejam mais sensíveis em

relação a temperatura, não são em relação a enterotoxina do tipo C. Para causar

êmese nesses animais é necessário que a concentração de SEC seja 50 vezes maior

to de realizar o protocolo terapêutico. Dessas análises, não é possível concluir

). Entretanto, contrária a situação em humanos, gatos e cães, a

diarréi

hrt, 2004). A diarréia em coelhos é definida como o aumento

que a de SEA ou SEB (Su e Wong, 1997).

Em ambos os protocolos de experimentação utilizados neste trabalho, com o

objetivo de verificar o potencial antipirético de anti-SEC recombinante, houve resposta

pirética. Analisando-se a variação de T3 a T0, verifica-se que diferença de temperatura

foi mais significativa após administração do protocolo terapêutico. Também é possível

verificar que, ao realizar o protocolo não terapêutico, a temperatura inicial dos animais

se encontrava maior do que aquela observada no momento de realizar o protocolo

terapêutico. Isso sugere que, ao realizar protocolo não terapêutico, os animais ainda

estavam sob o efeito pirético do teste terapêutico. Sendo assim, se o intervalo utilizado

para realização dos dois ensaios tivesse sido maior, provavelmente a temperatura

inicial no momento de realizar o protocolo não terapêutico teria sido menor e talvez

essa variação de temperatura tivesse um resultado maior ou igual àquela observada no

momen

sobre o potencial antipirético do anticorpo anti-SEC recombinante, em gatos. Edwin et

al. (1986), realizaram um experimento semelhante utilizando SEA, no mesmo intervalo

de tempo, entretanto, a atividade biológica analisada foi êmese, aproximadamente

trinta minutos após inoculação da toxina.

O quadro febril observado após administração do protocolo terapêutico pode ser

justificado pelo fato de o anticorpo utilizado, produzido contra a SEC recombinante, não

estar interagindo com a SEC na forma nativa. Dessa forma, o anticorpo não neutralizou

o efeito da toxina. A falha do protocolo terapêutico ocorreu mesmo confirmada a

reatividade do anticorpo conta SEC nativa em imunodeteção (Uhl, 2004).

Os coelhos foram utilizados para verificação do efeito diarréico e pirético, após

administração dos protocolos terapêutico e não terapêutico. Estes animais são

extremamente sensíveis à família das SEs e os efeitos cardiovasculares e

imunológicos são similares àqueles observados em choque séptico em humanos

(Ilbäck et al., 2003

a em coelhos é causada pelo decréscimo da motilidade intestinal, o que resulta

em constipação (Brown, 2001), e pode ser causada por vários fatores, incluindo

ingestão de toxinas (Steino

92

da quantidade de água nos gibalas fecais com ou sem o aumento na freqüência ou

volume dos movimentos do intestino e é sinal de uma condição muito séria e

frequentemente fatal (Brown, 2001), porém, não deve ser confundida com as fezes

noturnas (cecotropos), produzidas e ingeridas por esses animais (Steinohrt, 2004).

Em coelhos, após administração do protocolo terapêutico, não foram observados

nenhum dos sintomas sugestivos de intoxicação. Em contraste, menos de vinte e

quatro horas após a administração do protocolo não terapêutico, utilizando anticorpo

pré-imune, foram observados os quadros de falta de apetite, letargia, desconforto

contra doenças (Casadevall,

2002).

Page, 1968; Huang et al. 1997; Boles et al., 2003a; Ilbäck et al., 2003;). No presente

trabalho, medições retais da forma mais simples foram realizadas por vários motivos: 1)

a primeira intenção dos experimentos foi verificar se os protocolos terapêutico e não

terapêutico causariam ou não diarréia, a variação de temperatura seria uma informação

adicional; 2) evitar maior sofrimento dos animais e; 3) impossibilidade de realização das

cirurgias no centro de pesquisa. Assim, além da variação intrínseca para cada

indivíduo, variações importantes poderiam ter ocorrido, as quais as medições não

contínuas e com menor rigor não tenham detectado, o que resultaria numa diferença

mais significativa.

A forma de monitoramento de temperatura deve ser reavaliada, principalmente

em gatos, e realizada em menores intervalos de tempo, o que garante análises mais

acuradas dos resultados.

abdominal e mudança na consistência das fezes (fezes mucosas ou diarréia severa).

Ainda, duas horas após aplicação do protocolo não terapêutico, houve resposta

pirética. Estes resultados sugerem que, em coelhos, a terapia utilizando anti-SEC

recombinante é eficaz. Os resultados sugerem que o anticorpo anti-SEC recombinante

oferece proteção como agente profilático ou terápico contra doses diarréicas de SEC,

em coelhos. Essas análises podem ser expandidas para outros modelos, como

primatas, para validação, uma vez que a administração passiva de anticorpos

apresenta como uma das vantagens a imunidade imediata

A maioria dos ensaios em que se monitora a variação de temperatura como

resposta pirética, as medições de temperatura são realizadas pela implantação

cirúrgica de um termômetro no espaço retro-peritoneal do animal. O aparelho

permanece nos animais por um período de seis horas até três semanas e os dados são

transferidos para um banco de dados para análise (Martin e Marcus, 1964; Clark e

93

Outras vantagens da aplicação de anticorpos como defesa incluem a

possibilidade de administração oral para alguns agentes gastrintestinais, sua

administração requerer apenas uma inoculação, sua preparação ser gerada de forma

mais rápida do que novos agentes biológicos possam ser desenvolvidos, sua produção

oder incluir técnicas avançadas de expressão (hibridomas, sistemas bacterianos,

fagos), seu desenvolvimento reduzir a atratividade da produção de armas biológicas e

os anti oderem ser h tilizados em conjunto a outros terápicos

(Casadevall, 2002).

Contudo, algumas desvantagens dessa abordagem são o alto custo, a

necessidade do diagnóstico específico antes do uso e a possibilidade de se tornar

obsolet sa da variaç s agentes bio asadevall, 2002).

Foi pensando neste problema que o peptídeo de transcitose, região altamente

conserv esponsável pela epitelial das S p et al., 2002), foi

testado imunógeno. O p scitose é altamente conservado, inclusive

nas diferentes SEs e na TSST-1 (tabela 16). Assim, os anticorpos produzidos contra

essa se poderiam ser tes in vivo.

Nenhum dos animais imunizados com o peptídeo MAP-KKKVTAQELD produziu

IgG anti-peptídeo. Nem a via, nem a concentração, nem o carreador utilizados fizeram

com qu sta fosse ob a que nem as s do peptídeo ou

da imu oram eficientes para estabelecer uma

spos imunogênica. Este resultado, embora, em princípo, desanimador, torna a

seqüê

p

corpos p umanizados e u

o por cau ão antigênica do lógicos (C

ada r passagem trans Es (Shup

como eptídeo de tran

qüência utilizados em tes

e a respo tida. Isso signific condiçõe

nização ou a própria seqüência peptídica f

re ta

ncia de transcitose alvo terapêutico importante, devido a baixa imunogenicidade.

94

Tabela 16: Homologia entre as seqüências responsáveis pela transcitose de

enterotoxinas estafilocócicas, toxina da síndrome do choque tóxico e enterotoxinas

estreptocócicas. Os aminoácidos destacados em vermelho são aqueles diferentes dos

apresentados para a seqüência de transcitose de SEB.

Toxina Seqüência GenBank #

SEB KKKVTAQELD P01552

SEA KKNVTVQELD P13163

SEC-1 KKSVTAQELD P01553



SED KKNVTVQELD P20723

SEE KKEVTVQELD P12993

SEG KNMVTIQELD O85382

TSST-1 KKQLAISTLD P06886

SPE* A KKMVTAQELD P08095

SPE* C KDIVTFQEID P13380

SPE* H KPKVTAQEVD Q9X5C8

SPE* G KKQFTLQEFD Q9X5C7

*SPE: streptococcal pyrogenic enterotoxin

O carreador MAP utilizado não é imunogênico (Tam, 1988), mesmo quando

expondo oito vezes o peptídeo K152KKVTAQELD161. Tal carreador apenas funciona

como adjuvante, para peptídeos que já sejam antigênicos (Chai et al., 1992), caso

contrário da seqüência de transcitose. Desta forma, a antigenicidade do peptídeo em

questão não é obtida quando acoplado a MAP, quando coelhos são imunizados por via

subcut

de SEA utilizando anticorpo anti-peptídeo,

que po

ânea ou intraperitoneal com 0,5 ou 1 mg de peptídeo.

O soro de coelhos imunizados com o peptídeo C-KKKVTAQELD, produzido pela

Genemed Synthesis Inc, São Francisco, EUA, foi o que apresentou bom título

(1:100000). Este foi testado contra SEC recombinante, porém, a resposta obtida com

título de 1:3200, não compensava realização dos ensaios in vivo. Hu et al. (2001),

realizaram experimentos de neutralização

ssuía título acima de 1:20000 para a proteína. Devido aos baixos títulos de anti-

95

peptídeo de transcitose contra SEC recombinante não foi possível avaliar seu potencial

terapêutico em ensaios in vivo.

Em nenhum dos dois protocolos testados utilizando SEC recombinante e CPMV-

PT14, foi observado o quadro clínico de diarréia esperado. Inicialmente, acreditava-se

que o CPMV-PT14 ficaria retido no sítio de transcitose, impedindo a transferência da

toxina para a corrente sanguínea. Entretanto, após o monitoramento da detecção de

partícu

élio animal para a

corren

animal.

las virais no soro foi possível verificar que a partícula é transcitada para a

corrente sanguínea quatro horas após sua administração oral. Pelo fato de CPMV

selvagem não ter sido detectada no soro até oito horas após administração oral,

inferindo-se que a passagem de CPMV-PT14 foi favorecida pela presença do peptídeo

de transcitose apresentado na sua superfície da partícula viral. A detecção de partícula

CPMV-PT14 no soro através de espectrofotometria e a infecção de plantas por extrato

de folhas de feijão-de-corda inoculadas com o soro de animal administrado com CPMV-

PT14 são resultados que indicam que o vírus foi transcitado do epit

te sanguínea.

Este resultado possibilita a utilização de CPMV-PT14, ou outra partícula

expressando um peptídeo de sinalização específico, associado a fármacos com o

objetivo de dirigir tais moléculas a sítios específicos no organismo

Os soros que testaram positivos para CPMV-PT14 por espectrofotometria

também testaram positivo no bioensaio de infecção de feijão-de-corda. Após

inoculação do soro do animal administrado com CPMV-PT14, as folhas apresentaram

um leve sintoma de infecção, que foi intensificado após inoculação de extrato foliar

desta planta em novas folhas. O leve sintoma observado pode ser justificado pela baixa

concentração de partícula no soro e está associado ao resultado obtido para a

imunodetecção. A baixa concentração de partícula viral ou a falta de sensibilidade do

método inviabilizaram a detecção por Western blot.

O não aparecimento de CPMV selvagem no soro dos animais não significa que

estas moléculas não estejam sendo transferidas para outros tecidos. Neste trabalho só

foi analisado o sangue, porém, Rae et al., (2005), detectaram RNA de CPMV selvagem

distribuído no baço, nos rins, no fígado, nos pulmões, no cérebro, na medula óssea, no

estômago, no duodeno, no jejuno e no íleo, por meio de RT-PCR, num período de três

dias após inoculação oral ou intravenosa.

A quantidade de SEC recombinante necessária para causar diarréia em coelhos

pela via subcutânea é insuficiente para causar diarréia pela via oral. Schlievert et al.,

96

(2000), observaram que diferentes concentrações de superantígenos, que foram letais

para os animais quando inoculados pela via intravenosa, não mataram os animais

quando inoculados pela via oral. Dessa forma, verifica-se que a via oral e a

concentração de SEC utilizadas na administração do protocolo terapêutico utilizando

partícula viral não foram satisfatórias para concluir sobre o potencial terapêutico do

CPMV-PT14.

Depois de confirmar que a rota e a quantidade de enterotoxina inoculadas não

foram suficientes para causar os sintomas de intoxicação e, ainda, que CPMV-PT14

não fica retida no sítio de transcitose, foi possível realizar o experimento de

neutralização pela administração de SEC nativa por outra via. A SEC nativa, presente

no sobrenadante da cepa estafilocócica B48, causou diarréia quando administrada pela

via su

te) e impedindo a passagem de SEC, o

que su

ia à temperatura, e suporta as

de ter sido devido a uma clivagem proteolítica que

ocorre entre os dois últimos resíduos da seqüência inserida. Não é sempre que ocorre,

mas esta clivagem pode ter resultado na liberação do epítopo de transcitose da

superfície do vírus (MClain et al., 1995; Lin et al., 1996), impedindo a detecção deste

bcutânea. O tratamento com CPMV-PT14 preveniu o quadro diarréico induzido

por SEC nativa, indicando que a partícula funcionou como terapêutico pela inibição da

toxicidade, provavelmente antes do contato com o epitélio intestinal.

A inferência é que as partículas tenham competido com as SEs pelo mesmo sítio

de transcitose e, ainda, que elas tenham alcançado esse sítio de forma mais rápida que

as SEs, ocupando-o (porém, temporariamen

gere que a partícula possa estar agindo como antagonista.

O fato das SEs serem resistentes a inativação pelas enzimas gastrintestinais e

ao calor indica que a vida média das SEs seja longa (Balaban e Rasooly, 2000). O

período de permanência no lúmen intestinal pode ser igual ou maior do que a da

partícula viral, que também apresenta resistênc

condições gastrintestinais (Cañizares et al., 2005; Rae et al., 2005). Por estes motivos,

associados à não ocorrência de diarréia, após administração de CPMV-PT14, sugere-

se que as partículas possuam alta afinidade pelo receptor ou ainda que a reposição do

receptor não seja rápida o suficiente para permitir a transcitose do superantígeno.

Tendo visto que o anticorpo anti-peptídeo de transcitose não reagiu com CPMV-

PT14, pelos testes de ELISA, e acreditando que essa reação poderia ocorrer pela

conformação tridimensional, testamos a interação dessas moléculas por

imunoprecipitação. Mesmo por este método, não ocorreu reconhecimento de CPMV-

PT14 pelo anticorpo. O ocorrido po

97

pelo anticorpo anti-peptídeo de transcitose. Isso significa que, o anticorpo analisado

ode não ter interagido com o peptídeo pelo fato deste ter se perdido da partícula após

a apenas pela

região

cção de plantas com o imunocomplexo

itelial da seqüência em questão. Se houvesse dificuldade de

o no bloqueio da

partícu

SEC n

001; Kaempfer et al.,

realizado também de forma rápida.

p

adição do tampão desnaturante e não pelo fato deste não interagir com a molécula.

Desta forma, mesmo que tenha havido interação, as interações iriam se desfazer,

dificultando ou mesmo impedindo a detecção da partícula (posteriormente através de

Western blot), que estaria formando complexo através de uma ligação não-covalente

com uma sequência curta de aminoácidos, provavelmente ancorad

amino-terminal, que na presença de desnaturante, se desestrutura liberando tal

fragmento. Com tais problemas, suponho que outros métodos de detecção poderiam

ter sido utilizados como o ELISA sanduíche, infe

ou ainda microscopia eletrônica.

Embora a seqüência de transcitose esteja expressa na superfície da partícula

viral, o acesso do anticorpo ao peptídeo pode ter sido dificultado pela estrutura

complexa da partícula. Entretanto, essa possibilidade pode ser descartada, quando se

pensa no receptor ep

acesso do anticorpo à partícula, provavelmente também haveria dificuldade no

reconhecimento da seqüência pelo receptor.

O desejo e a insistência em verificar o reconhecimento da partícula pelo

anticorpo anti-peptídeo de transcitose está no fato de que sua utilizaçã

la CPMV-PT14 concomitante à repetição do experimento de neutralização de

ativa por CPMV-PT14 validaria a possibilidade de utilização de partícula viral

como terapêutico para doenças causadas por SEs.

Vários trabalhos demonstram a atividade antagônica de peptídeos contra

superantígenos (Arad et al., 2000 e 2001; Visvanathan et al., 2

2002), entretanto, não é de conhecimento deste grupo que partículas virais

expressando peptídeos tenham sido testadas e tenham funcionado com essa função.

Aliada a eficácia dos peptídeos como antagonistas está a facilidade de obtenção e

baixo custo de produção de partículas expressando peptídeos. Esses fatores permitem

sua preciosa avaliação no tratamento rápido e em larga escala de doenças causadas

por superantígenos, assim como, para outras doenças, desde que o diagnóstico seja

98

6 – Conclusões

O protocolo terapêutico contra SEC recombinante baseado em IgG anti-SEC foi

ficaz em coelhos, prevenindo a diarréia e o efeito pirético, resultados que foram

bservados nos animais submetidos ao protocolo não terapêutico. Este fato possibilita

a utilização do anticorpo na vacinação passiva contra doenças causadas por

enterotoxinas, após expansão do protocolo a outros modelos animais.

Os resultados obtidos após a administração do mesmo protocolo terapêutico não

foi conclusivo em gatos, uma vez que o efe o pirético foi observado na presença de

IgG pré-imune e na presença de IgG anti-SEC.

O peptídeo K152KKVTAQELD161 foi imunogênico em coelhos quando alterado

com o resíduo de cisteína na região amino-te minal. Esses anticorpos reconheceram a

SEC recombinante, porém com baixos títulos, e não reconhecem as partículas virais

quiméricas. Tais fatos impossibilitaram a avaliação de IgG anti-peptídeo de transcitose

como imunoterápico.

Partículas virais qu ptídeo de transcitose

foram transcitadas para a corrente sanguínea, quando administradas pela via oral em

coelhos. Soros desses animais apresentaram pico-identidade a 260 nm,

correspondente a partícula viral, duas horas após sua administração.

As partículas virais detectadas em soro foram infecciosas em plantas repórteres.

Vírus presentes no soro de animal administrado com partícula viral quimérica

foram capazes de infectar plantas de feijão-de-corda e foram detectados na corrente

sanguínea. Esses resultados abrem a possibilidade de utilização de CPMV-PT14

acoplado a fármacos para direcionamento a tecidos específicos.

CPMV-PT14 funcionou como terapêutico no tratamento de diarréia causada pela

SEC nativa. A administração intraperitoneal concomitante da partícula com a toxina

inibiu a diarréia em coelhos, indicando que a partícula funciona como antagonista. Os

dados sugerem a possibilidade de utilização de CPMV acoplado a peptídeos

específicos contra doenças como antagonistas que, em superfície de partículas virais,

possuem baixo custo de produção, não são tóxicas e ainda são eficazes.

e

o

it

r

iméricas expressando na superfície o pe

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ZHY, H.; SNYDER, M. Protein chip technology. Curr. Opin. Chem. Biol.: 7, 55–63,

2003.

o

115

116

Anexos

Quadro 1: Resultados da detecção de SEA pelos testes de ELISA, Western blot (WB) e Imunodifusão (ID) nos sobrenadantes, fervidos ou não

durante três minutos, de cepas estafil cam que as amostras são positivas e

ne i te. FP amostras ti ela téc e ELIS ISA écn LISA,

FP tras f iva de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB, FP-ID: amostras falso-positivas pela

D, FN-ID: am stras falso-n tivas pela té nica de ID.

ecção da seqüência sea u de SEA utilizando soro anti-

ocócicas, comparados à técnica padrão ouro (PCR). Os sinais + e - indi

gativas, respect

-WB: amos

vamen -ELISA: falso-posi vas p nica d A, FN-EL : amostras falso-negativas pela t ica de E

also-posit s pela técnica

técnica de I o ega c

Det o SEA padrão

Sobrenadante das cepas (Padrão

ELI(fervidos/não

FP-ELISA FN-ELISA WB FN-WB ID FP-ID FN-ID PCR

ouro)

SA

fervido)

FP-WB

B35 - - - - - - - + + - -/

B315 + - - + - - + - - -/ +

B78 - - - - - - + + - -/ -

B47 - - - - - - - - - -/ -

B34 - - - - - - - - - - -/

B352 - - - - - - - - - - -/

B77 - - - - - - - - - - -/

B243 - - - - - - - - - -/ -

B260 - - - - - - - - - - -/

B361 - - - - - - - - - - -/

B327 - - - - - - - + + - -/

B194 - - + - - - - - - - +/

B112 - - - - - - - - - - -/

B196 - - - - - - - - - - -/

117

Continuação do quadro 1 Detecção da seqüência sea ou de SEA utilizando soro anti-SEA padrão

Sobrenadante das cepas

PCR (Padrão ouro)

ELISA (fervidos/não fervido)

FP-ELISA FN-ELISA

WB FP-WB FN-WB ID FP-ID FN-ID

B326 - -/- - - - - - - - -

B10 - -/- - - - - - - - -

B193-2 - -/- - - - - - - - -

B295 + - - - - - - - - +/-

B102 - -/- - - - - - - - -

B44 - -/- - - - - - - - -

B48 - /- + - + + - - - - +

B6 -/- - + - - + + - - +

B5 - -/- - - - - - + + -

B117 - -/- - - - - - - - -

B188 -/- - - - - - - - - -

B118 + -/- - + - - + + - -

B221 - -/- - - - - - - - -

B193-1 - -/- - - - - - - - -

B195 - /- - - - - - - - - -

B316 - -/- - - - - - + + -

B184 - -/- - - - - - + + -

B85 - -/- - - - - - + + -

LSA88 - -/- - - - - - - - -

118

Quadro 2: Resultados da detecção de SEC pelos testes de ELISA, Western blot (WB) e Imunodifusão (ID) nos sobrenadantes, fervidos ou não

durante três minutos, de cepas est dicam que as amostras são positivas e

ecti te. F : amo o a de E -EL stras falso-ne ELISA,

ostras f i ica de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB, FP-ID: amostras falso-positivas pela

a de ID, FN-ID: a ostras falso-negativas pela técnica

tecção da seqüência se ou de SEC utilizando soro anti-

afilocócicas, comparados à técnica padrão ouro (PCR). Os sinais + e - in

negativas, resp vamen P-ELISA stras falso-p sitivas pela técnic LISA, FN ISA: amo gativas pela técnica de

FP-WB: am also-posit vas pela técn

técnic m de ID.

De c SEC padrão


PCR (Padrão ouro)

ELIS(fervidos/

FP-ELISA FN-ELISA WB ID FN-ID A

não fervido)

FP-WB FN-WB FP-ID

B35 - -/- - - - - - - - -

B315 - -/- - - - - - - - -

B78 - -/+ + - - - - - - -

B47 + +/- - - - - + + - -

B34 - -/- - - - - - - - -

B352 - -/- - - - - - - - -

B77 + -/- - + - - + - - +

B243 - -/- - - - - - - - -

B260 - -/- - - - - - - - -

B361 - -/- - - - - - - - -

B327 - +/- + - - - - - - -

B194 - -/- - - - - - + + -

B112 - -/- - - - - - - - -

B196 - -/- - - - - - - - -

119

Continuação do quadro 2 Detecção da seqüência sec ou de SEC utilizando soro anti-SEC padrão


PCR (Padrão ouro)

ELISA (fervidos/ não fervido)

FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB ID FP-ID FN-ID

B326 - -/- - - - - - - - -

B10 - -/- - - - - - - - -

B193-2 - - - - - - - -/+ + -

B295 - -/- - - - - - - - -

B102 - -/+ + - - - - + + -

B44 + -/- - + - - + + - -

B48 + -/- - + + - - + - -

B6 + -/- - + - - + + - -

B5 + -/+ - - - - + + - -

B117 - -/- - - - - - + + -

B188 + -/- - + + - - + - -

B118 + -/- - + - - + - - +

B221 - +/- + - - - - + + -

B193-1 + -/- - + - - + + - -

B195 + -/- - + - - + + - -

B316 + +/- - - - - + - - +

B184 + -/- - + - - + + - -

B85 - +/+ + - - - - + + -

LSA88 + -/- - + - - + + - -

120

Quadro 3: Resultados da detecção de SED pelos testes de ELISA, Western blot (WB) e Imunodifusão (ID) nos sobrenadantes, fervidos ou não

durante três minutos, de cepas est ndicam que as amostras são positivas e

ecti te. F : amo p a ca de E -EL ostras falso-ne ELISA,

ostras f i ni de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB, FP-ID: amostras falso-positivas pela

a de ID, FN-ID: a ostras falso-negativas pela técnica

ecção da seqüência ou de SED utilizando soro anti-

afilocócicas, comparados à técnica padrão ouro (PCR). Os sinais + e - i

negativas, resp vamen P-ELISA stras falso- ositivas pel técni LISA, FN ISA: am gativas pela técnica de

FP-WB: am also-posit vas pela téc ca

técnic m de ID.

Det sed SED padrão


PC(Padrão ouro)

ELIS(fervidos/

FN- ISA WB ID FN-ID R A

não fervido)

FP-ELISA EL FP-WB FN-WB FP-ID

B35 - -/- - - - - - - - -

B315 - +/- + - - - - - - -

B78 - -/- - - - - - - - -

B47 - -/- - - - - - - - -

B34 - +/- + - - - - + + -

B352 - +/- + - - - - + + -

B77 - -/- - - + + - + + -

B243 - +/- + - + + - + + -

B260 - -/- - - - - - + + -

B361 - +/- + - - - - + + -

B327 + +/+ - - - - + - - +

B194 - +/- + - - - - - - -

B112 - -/- - - - - - + + -

B196 - -/- - - - - - + + -

121

Continuação do quadro 3 Detecção da seqüência sed ou de SED utilizando soro anti-SED padrão


PCR (Padrão ouro)


FP-ELISA

FN-ELISA WB FP-WB FN-WB ID FP-ID FN-ID

B326 - -/- - - - - - + + -

B10 - +/- + - - - - + + -

B193-2 - -/- - - - - - + + -

B295 - +/- + - - - - + + -

B102 + --/ - + - - + + - -

B44 - - - - - - -/ - - - -

B48 - - + - - - - - - +/ -

B6 + - + - +/ - - - - + -

B5 - - + - - - - - - +/ -

B117 - - + - - - - - - +/ -

B188 - - + - - - - - - +/ -

B118 - - + - - - - - - +/ -

B221 - + + - - +/ - - + + -

B193-1 - - + - - +/ - - + + -

B195 - - - + + - + + -/- -

B316 - + - - +/- - - + + -

B184 - - + - - - - - - +/ -

B85 + - - +/ - - - - - + -

LSA88 + +/- - - + - + + - -

122

Quadro 4: Resultados da detecção de SEC pelos testes de ELISA, Western blot (WB), Imunodifusão (ID) e Aglutinação em Látex (AL) nos

sobrenadantes, fervidos ou não d CR). Os sinais + e - indicam

s ositiv gativas pectiv nte. F SA: f tivas pela técnica de ELISA, FN-ELISA: a fa

ela té E : sitivas pela técnica de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB, FP-

ostras falso-po ivas pela t ica de ID N-ID: amostras falso-negativas pela técnica de I

tecção da eqüênci sec ou d SE o soro R18 (anti-SEC rec binante

urante três minutos, de cepas estafilocócicas, comparados à técnica padrão ouro (P

que as amostra são p as e ne

LISA, FP-

, res

amos

ame

tras falso-po

P-ELI amostras also-posi mostras lso-

negativas p cnica de WB

ID: am sit écn , F D. De s a e C utilizand om )


PC(Padrão ouro)

ELIS(fervidos/

FP-ELISA

FN-ELISA

WB FP-WB FN-WB FP-ID FN-ID R A

não fervido)

ID AL FP-AL FN-AL

B35 - -/- - - - - - - - - NT NT NT

B315 - -/- - - + + - - - - NT NT NT

B78 NT - -/- - - - - - + + - NT NT

B47 + -/+ - - - - + - - + NT NT NT

B34 - -/- - - + + - - - - NT NT NT

B352 - -/- - - - - - + + - NT NT NT

B77 + -/- - + - - + - - + - - +

B243 - -/+ + - - - - - - - NT NT NT

B260 - -/- - - - - - - - - NT NT NT

B361 - -/- - - - - - - - - NT NT NT

B327 NT - -/+ + - - - - + + - NT NT

B194 - +/+ + - - - - + + - NT NT NT

B112 - -/- - - - - - + + - NT NT NT

B196 - -/- - - - - - - - - NT NT NT

123

Continuação do quadro 4 Detecção da seqüência sec ou de SEC utilizando soro R18 (anti-SEC recombinante)


PCR (Padrão ouro)


FP-ELISA

FN-ELISA

WB FP-WB FN-WB ID FP-ID FN-ID AL FP-AL FN-AL

B326 - -/- - - - - - + + - NT NT NT

B10 - -/- - - - - - - - - - - -

B193-2 - -/- - - - NT NT - - - - - NT

B295 - -/- - - - - + - NT NT NT - +

B102 -/- - - - - - - - NT NT NT - -

B44 -/- + - - + - - + NT NT NT + -

B48 -/- - + + - - + - - + - + -

B6 -/- + - - + - - + NT NT NT + -

B5 +/- - + - - - - + NT NT NT + -

B117 +/- - - - - + - NT NT NT - + +

B188 -/- + + - - - + + - - + - -

B118 -/- + - - + - - + NT NT NT + -

B221 -/- - - - - - + - NT NT NT - +

B193-1 -/- + - - + - - + NT NT NT + -

B195 -/- + - - + - - + + - - + -

B316 +/- - - - + - - + NT NT NT + -

B184 -/- + + - - - - + NT NT NT + -

B85 - +/- + - + + - - - - NT NT NT

LSA88 + -/- - + - - + + - - + - -

124

Quadro 5: : Resultados da detecção de SEA pel nadantes, fervidos ou não durante três minutos,

lo cas, comparad dr unodif Os si + e - indicam que as amostras são positivas e

respectivamente. FP-EL tras falso-positivas pela técnica de ELISA, FN-ELISA: amostras falso-negativas pela técnica de

FP-WB: amostras f so-positivas pela cnica de WB amostras falso-negativas pela técnica de WB.

Detecção da SEA utilizando soro anti-SEA padrão

os testes de ELISA e Western blot (WB) nos sobre

de cepas estafi cóci os à técnica pa ão ouro (Im usão – ID). nais

negativas, ISA: amos

ELISA, al té , FN-WB:

Sobrdas c

enadante epas

ID ELISA vido/ não-fervido)

FP-ELISA FN-ELISA WB (fer FP-WB FN-WB

B35 + -/- - + - - +B315 + -/- - + - - +B78 + -/- - + - - +B47 - -/- - - - - -B34 - -/- - - - - -B352 - -/- - - - - -B77 - -/- - - - - -B243 - -/- - - - - -B260 - -/- - - - - -B361 - -/- - - - - -B327 + -/- - + - - +B194 - +/- + - - - -B112 - -/- - - - - -B196 - -/- - - - - - B326 - -/- - - - - - B10 - -/- - - - - -

125

Continuação do quadro 5 Detecção da SEA utilizando soro anti-SEA padrão

Sobrenadante ID ELISA (fervido/ FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB das cepas não-fervido) B193-2 - -/- - - - - - B295 - +/- + - - - - B102 - -/- - - - - - B44 - -/- - - - - - B48 - - + + - +/- + B6 + - + - -/- - + B5 + -/- - + - - +B117 - -/- - - - - -B188 - -/- - - - - -B118 + -/- - + - - +B221 - -/- - - - - -B193-1 - -/- - - - - -B195 - -/- - - - - -B316 + -/- - + - - +B184 + -/- - + - - +B85 + -/- - + - - +LSA88 - -/- - - - - -

126

ResuQuadro 6: lta da detecção B) nos sobrenadantes, fervidos ou não durant os, de

stafilocócicas, co rados à técnic drão ouro (Imunodifusão – ID). O nais + e - indica que as amostra ão positi

tivamente. FP-ELI : amostras fals sitivas pela técn a de s egativas pela técnica de ELISA, FP-WB:

ras falso-positivas pela técnica B: amostras falso-negativas pel écnica de WB.

Detecção da SEB utilizando soro anti-SEB padrão

dos de SEB pelos testes de ELISA e Western blot (W e três minut

cepas e mpa a pa s si m s s vas e negativas,

respec SA o-po ic ELISA, FN-ELISA: amo tras falso-n

amost de WB, FN-W a t

Sobrenadante cepas

ID ELISA do/ não-fervido)

FP-ELISA FN-ELISA WB das

(fervi FP-WB FN-WB

B35 - +/- + - - - -B315 - +/- + - - - -B78 - +/- + - - - -B47 - +/- + - - - -B34 - +/- + - - - -B352 - +/+ + - - - -B77 - +/- + - - - -B243 - +/- + - + + -B260 - -/- - - - - -B361 - +/- + - - - -B327 + +/- - - - - +B194 + +/- - - - - + B112 + -/- - + - - + B196 + -/- - + - - + B326 + -/+ - - - - + B10 + +/- - - + - -

127

Continuação do quadro 6 Detecção da SEB utilizando soro anti-SEB padrão


ID ELISA (fervido/ não-fervido)

FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB

B193-2 + -/- - + - - + B295 + +/- - - + - - B102 - - - - +/+ + - B44 - - -/- - - - - B48 - +/+ + - - - -B6 - +/- + - - - -B5 - +/- + - - - -B117 + -/- - + - - +B188 + +/- - - - - +B118 + +/- - - - - + B221 + +/- - - - - + B193-1 + +/- - - - - +B195 + +/- - - - - +B316 + +/- - - - - +B184 + +/- - - - - +B85 + +/- - - - - +LSA88 - +/- + - + + -

128

Quadro 7: Resultados da detecção de SEC pelos testes de ELISA e Western blot (WB) nos sobrenadantes, fervidos ou não durante três minutos, de

cepas estafilocócicas, comparados à técnica pa am que as amostras são positivas e negativas,

e. ELISA: amostr p a de tras falso-n WB:

lso-positivas pela técnica B: amostras falso-negativas pel écnica de WB.

Detecção da S utilizando soro ti-SEC padrão

drão ouro (Imunodifusão – ID). Os sinais + e - indic

respectivament FP- as falso-positivas ela técnic ELISA, FN-ELISA: amos egativas pela técnica de ELISA, FP-

amostras fa de WB, FN-W a t

EC anSobredas cepas

nadante ID ELISA vido/ não-fervido)


B35 - -/- - - - - -

B315 - -/- - - - - -

B78 - -/+ + - - - -

B47 + +/- - - - - +

B34 - -/- - - - - -

B352 - -/- - - - - -

B77 - -/- - - - - -

B243 - -/- - - - - -

B260 - -/- - - - - -

B361 - -/- - - - - -

B327 - +/- + - - - -

B194 + -/- - + - - +

B112 - -/- - - - - -

B196 - -/- - - - - -

B326 - -/- - - - - -

B10 - -/- - - - - -

129

Continuação do quadro 7 Detecção da SEC utilizando soro anti-SEC padrão




B193-2 - -/+ + - - - -

B295 - -/- - - - - -

B102 + - + -/+ - - -

B44 + -/- - + - - +

B48 + -/- - + + - -

B6 + -/- - + - - +

B5 + -/+ - - - - +

B117 + -/- - + - - +

B188 + -/- - + + - -

B118 - -/- - - - - -

B221 + +/- - - - - +

B193-1 + -/- - + - - +

B195 + -/- - + - - +

B316 - +/- + - - - -

B184 + -/- - + - - +

B85 + +/+ - - - - +

LSA88 + -/- - + - - +

130

Quadro 8: Resultados da detecção de SED pelos testes de ELISA e Western blot (WB) nos sobrenadantes, fervidos ou não durante três minutos, de

cepas estafilocócicas, comparados à técnica pa am que as amostras são positivas e negativas,

e. ELISA: amostr p a de tras falso-n WB:

lso-positivas pela técnica B: amostras falso-negativas pel écnica de WB.

Detecção da S utilizando soro ti-SED padrão

drão ouro (Imunodifusão – ID). Os sinais + e - indic

respectivament FP- as falso-positivas ela técnic ELISA, FN-ELISA: amos egativas pela técnica de ELISA, FP-

amostras fa de WB, FN-W a t

ED anSobredas cepas

nadante ID ELISA vido/ não-fervido)


B35 - -/- - - - - -

B315 - +/- + - - - -

B78 - -/- - - - - -

B47 - -/- - - - - -

B34 + +/- - - - - +

B352 + +/- - - - - +

B77 + -/- - + + - -

B243 + +/- - - + - -

B260 + -/- - + - - +

B361 + +/- - - - - +

B327 - +/+ + - - - +

B194 - +/- + - - - -

B112 + -/- - + - - +

B196 + -/- - + - - +

B326 + -/- - + - - +

B10 + +/- + - - - +

131

Continuação do quadro 8 Detecção da SED utilizando soro anti-SED padrão




B193-2 + -/- - + - - +

B295 + + - + /- + - -

B102 + -/- - + - - +

B44 - -/- - - - - -

B48 +/- + - - - - -

B6 +/- + + - - - -

B5 +/- + - - - - -

B117 +/- + - - - - -

B188 +/- + - - - - -

B118 +/- + - - - - -

B221 +/+ + + - - - -

B193-1 +/- + + - - - -

B195 + -/- + - - - +

B316 +/- + + - - - -

B184 +/- + - - - - -

B85 +/- - - + - - +

LSA88 +/- + + - - - -

132

133

detecção de SEC pelos testes de ELISA, Western blot (WB) e Aglutinação em látex (AL) nos sobrenadantes, fervidos ou

não durante três minutos, de cepas estafilocó ID). Os sinais + e - indicam que as amostras

ativas, vamente A: al sitivas de

LISA, FP-WB: amostras falso-positivas pela técnica de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB.

Detecção de SEC utilizando soro anti-SEC recombinante

cicas, comparados à técnica padrão ouro (Imunodifusão –

são positivas e neg respecti . FP-ELIS amostras f so-po pela técnica ELISA, FN-ELISA: amostras falso-negativas pela

técnica de E

Sobrenadante pas

ID ELISA (fervid

FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB ALdas ce o/

não-fervido)

FP-AL FN-AL

B35 - - -/- - - - - NT NT NT

B315 + - N NT - -/- - - + T NT

B78 + + -/- - + - - NT NT NT

B47 - - -/+ + - - - NT NT NT

B34 + - -/- - - + + NT NT NT

B352 - N NT + -/- - + - - T NT

B77 - - -/- - - - - - - -

B243 - - -/+ + - - - NT NT NT

B260 - - -/- - - - - NT NT NT

B361 - N NT - -/- - - - - T NT

B327 - + -/+ - - - - NT NT NT

B194 +/+ - + - - - - NT NT NT

B112 - + -/- - + - - NT NT NT

B196 - N NT - -/- - - - - T NT

Quadro 9: Resultados da

B326 + -/- - + - - - NT NT NT

B10 - -/- - - - - - - - -

134

o do quadro 9 de liz EC iDetecção SEC uti ando soro anti-S recomb nante

Sobrenadante das cepas o/

rvi

F A P- FN FN-AL ID ELISA(fervidnão-fe

do)

FP-ELISA N-ELIS WB F WB -WB AL FP-AL

B193-2 - -/- NT - - - - - NT NT

B295 + -/- - NT - + - - NT NT

B102 - -/- - NT - - - - NT NT

B44 -/- - NT - - - - - NT NT

B48 -/- - - + - + + - + -

B6 /- - NT - - - - - - NT NT

B5 /- - NT - + + - + + NT NT

B117 + /- + NT + - - - - NT NT

B188 - /- + - - - - - + + +

B118 - /- - - NT - - - - NT NT

B221 + /- + - + NT - - - NT NT

B193-1 - /- - - - - - - NT NT NT

B195 - /- - - - - - - - + +

B316 - /- - - NT + + - - NT NT

B184 - /- + - NT - - - + NT NT

B85 - /- + NT + + - + - NT NT

LSA88 + /- + - + - - - +--

Continuaçã

Princípios éticos na experimentação animal

A evolução contínua das áreas de conhecimento humano, com especial

qual se preconizam posturas éticas

:

roporciona.

ar das manobras experimentais e da dor que

possam causar.

rtigo IV - É relevante considerar a importância dos estudos realizados através de

experimentação animal quanto a sua contribuição para a saúde humana em animal,

o desenvolvimento do conhecimento e o bem da sociedade.

Artigo V - Utilizar apenas animais em bom estado de saúde.

Artigo VI - Considerar a possibilidade de desenvolvimento de métodos alternativos,

como modelos matemáticos, simulações computadorizadas, sistemas biológicos in

vitro, utilizando-se o menor número possível de espécimes animais, se caracterizada

como única alternativa plausível.

ênfase àquelas de biologia, medicinas humana e veterinária, e a obtenção de

recursos de origem animal para atender necessidades humanas básicas, como

nutrição, trabalho e vestuário, repercutem no desenvolvimento de ações de

experimentação animal, razão pela

concernentes aos diferentes momentos de desenvolvimento de estudos com animais

de experimentação.

Postula-se

Artigo I - É primordial manter posturas de respeito ao animal, como ser vivo e pela

contribuição científica que ele p

Artigo II - Ter consciência de que a sensibilidade do animal é similar à humana no

que se refere a dor, memória, angústia, instinto de sobrevivência, apenas lhe sendo

impostas limitações para se salvaguard

Artigo III - É de responsabilidade moral do experimentador a escolha de métodos e

ações de experimentação animal.

A

135

Artigo VII - Utilizar anima m desconforto, angústia

e dor, considerando que determinariam os mesmos quadros em seres humanos,

Artigo VIII - Desenvolver procediment animais, assegurando-lhes sedação,

analgesia ou anestesia quando se confignar o desencadeamento de dor ou angústia,

rejeitando, sob qualquer argumento ou tiva, o uso de agentes químicos e/ou

físicos paralizantes e não anes

rtigo X - Dispor de alojamentos que propiciem condições adequadas de saúde e

as necessidades das espécies animais mantidas para

sistência de profissional qualificado para orientar e

ades de transportes, acomodação, alimentação e atendimento de

volvidos nos procedimentos com animais de experimentação,

is através de métodos que previna

salvo se demonstrados, cientificamente, resultados contrários.

os com

justifica

tésicos.

Artigo IX - Se os procedimentos experimentais determinarem dor ou angústia nos

animais, após o uso da pesquisa desenvolvida, aplicar método indolor para sacrifício

imediato.

A

conforto, conforme

experimentação ou docência.

Artigo XI - Oferecer as

desenvolver ativid

animais destinados a fins biomédicos.

Artigo XII - Desenvolver trabalhos de capacitação específica de pesquisadores e

funcionários en

salientando aspectos de trato e uso humanitário com animais de laboratório.

136

Lei nº 3900, 19 de julho de 2002.

Institui o Código Estadual de Proteção aos Animais, no Âmbito do Estado do Rio de

Janeiro.

Título I

Capítulo I

Seção I

Das disposições gerais

ão aos Animais”, estabelecendo normas

ara a proteção dos animais no Estado do Rio de Janeiro, visando a compatibilizar o

rt. 2º - É vedado:

imais, sujeitando-os a qualquer tipo de

experiência capaz de causar sofrimento ou dano, bem como as que criem condições

inaceitáveis de existência;

II – V E T A D O.

orbitantes ou que ultrapassem sua força;

e de animais para menores desacompanhados por

enenos ou outros métodos não preconizados pela

Organização Mundial da Saúde – OMS, nos programas de profilaxia da raiva.

Art. 3º - Consideram-se espé stado do Rio de Janeiro as

que são originárias deste Estado e que viva

estão em migração, incluindo-se as espéc e animais marinhos da costa

uminense.

desenvolvimento, bem como os seus ninhos, ovos e abrigos são considerados bens

Art. 1º - Institui o “Código Estadual de Proteç

p

desenvolvimento sócio-econômico com a preservação ambiental.

A

I – ofender ou agredir fisicamente os an

III – obrigar animais a trabalhos ex

IV – não dar morte rápida e indolor a todo animal cujo extermínio seja necessário

para consumo;

V – exercer a venda ambulant

responsável legal;

VI – enclausurar animais com outros que o molestem ou aterrorizem;

VII – sacrificar animais com v

cies da fauna nativa do E

m de forma selvagem, inclusive as que

ies de peixes

fl

Art. 4º - Os animais silvestres de qualquer espécie, em qualquer fase de seu

137

d

respeitando os limite

e interesse comum do Estado do Rio de Janeiro, exercendo-se este direito

s que a legislação estabelece.

Fauna exótica

rt. 6º - Nenhuma espécie poderá ser introduzida no Estado do Rio de Janeiro sem

prévia autorização do órgão competen

rt. 7º - Todo vendedor de animais pertencentes à fauna exótica deverá possuir

arágrafo único – V E T A D O.

Da pesca

Art. 9º - Toda alteração no regime dos cursos de água, devido a obras, implicará

medidas de pro tidade estadual

ompetente.

Seção II

Art. 5º - V E T A D O.

A

te.

A

certificado de origem e licença de importação fornecida pela autoridade responsável.

P

Seção III

Art. 8º - São de domínio público todos os animais e vegetação que se encontram nas

águas dominiais.

teção que serão orientadas e fiscalizadas por en

c

Capítulo II

Dos animais domésticos

Seção I

Dos animais de carga

tos agrícolas e

industriais, somente pelas espécies bovinas, eqüinas ou muares.

Art. 10 – Será permitida a tração animal de veículos ou instrumen

138

Art. 11 – É vedado:

I – atrelar animais de diferentes espécies no mesmo veículo;

l trabalhar por mais de 6 (seis) horas seguidas sem lhe dar água e

Seção II

Do transporte de animais

Art. 12 – Todo veículo de transporte de animais deverá estar em condições de

ferecer proteção e conforto adequado.

– transportar sem a documentação exigida por lei;

al fraco, doente, ferido ou em adiantado estado de gestação,

II – utilizar animal cego, enfermo, extenuado ou desferrado em serviço, bem como

castigá-lo;

III – fazer viajar animal a pé por mais de 10 (dez) quilômetros sem lhe dar descanso;

IV – fazer o anima

alimento.

o


I – transportar em via terrestre por mais de 12 (doze) horas seguidas sem o devido

descanso;

II

III – transportar anim

exceto para atendimento de urgência.

Capítulo III

Dos sistemas intensivos de economia agropecuária

Art. 14 – Consideram-se sistemas inte economia agropecuária os métodos

cuja característica seja a criação de confinamento, usando para tal fim

um alto grau de tecnologia que permita economia de espaço e trabalho e o rápido

ganho de peso.

rt. 15 – Será passível de punição toda a empresa que utilizar o sistema intensivo

nsivos de

animais em

A

de economia agropecuária que não cumprir os seguintes requisitos:

139

I – os animais deverão receber água e alimento, atendendo-se, também, suas

necessidades psicológicas, de acordo com a evolução da ciência, observadas as

xigências peculiares de cada espécie;

irculação de

r e temperatura.

Capítulo IV

e

II – os animais devem ter liberdade de movimento de acordo com as suas

características morfológicas e biológicas;

III – as instalações devem atender a condições ambientais de higiene, c

a

Parágrafo único – Não será permitida em nenhuma hipótese a engorda de aves,

suínos e outros animais por processos mecânicos, químicos e outros métodos que

sejam considerados cruéis.

Do abate de Animais

Art. 16 – Todo frigorífico, matadouro e abatedouro no Estado do Rio de Janeiro tem

a obrigatoriedade do uso de métodos científicos e modernos de insensibilização,

aplicados antes da sangria, por instrumentos de percussão mecânica,

processamento químico, elétrico ou decorrentes do desenvolvimento tecnológico.


I – emprego de marreta, picada no bulbo (choupa), facada no coração, bem como

mutilação ou qualquer método considerado cruel para o abate;

II – abater fêmeas em período de gestação e de nascituros até a idade de três

meses de vida, exceto em caso de doença, a fim de evitar o sofrimento do animal.

Título II

Capítulo I

Dos Animais de Laboratório

Da vivissecção

Art. 18 – Considera-se vivissecção os experimentos realizados com animais vivos

em centro de pesquisas.

140

Art. 19 – Os centros de pesquisas deverão ser devidamente registrados no órgão

competente e supervisionados por profissionais de nível superior, nas áreas afins.

Art. 20 – O diretor do centro de pesquisa, antes de proceder qualquer experimento

com animal vivo, deverá relatar ao órgão competente a natureza do experimento, a

quantidade, a espécie de animal e o nível de dor que o mesmo sofrerá.

Art. 21 – É proibida a prática de vivissecção sem uso de anestésico, bem como a

sua realização em estabelecimentos escolares de ensino fundamental e médico.

§ 1º - Os relaxantes musculares parciais ou totais não serão considerados

anestésicos.

§ 2º - V E T A D O.

Art. 22 – Com relação ao experimento de vivissecção é proibido:

I – realizar experiências cujos resultados já são conhecidos anteriormente ou

aqueles destinados à demonstração didática que já tenham sido filmadas ou

ilustradas;

II – V E T A D O.

III – realizar experiências com fins comerciais, de propaganda armamentista e outros

que não sejam de cunho científico humanitário;

IV – utilizar animal já submetido a outro experimento ou realizar experiência

prolongada com o mesmo animal.

Art. 23 – V E T A D O.

Art. 24 – Nos locais onde está autorizada a vivissecção, deverá constituir-se uma

comissão de ética, composta por, no mínimo, 03 (três) membros, sendo:

I – um (01) representante da entidade autorizada;

II – um (01) veterinário ou responsável;

III – um (01) representante da sociedade protetora de animais.

Art. 25 – Compete à comissão de ética fiscalizar:

I – a habilitação e a capacidade do pessoal encarregado de prestar assistência aos

animais;

141

II – verificar se estão sendo adotados os procedimentos para prevenir dor e o

sofrimento do animal, tais como aplicação de anestésico ou analgésico;

III – denunciar ao órgão competente qualquer desobediência a esta Lei.

Art. 26 – Todos os centros de pesquisas deverão possuir os recursos humanos e

materiais necessários a fim de zelar pela saúde e bem estar dos animais.

Art. 27 – Somente os animais criados nos centros de pesquisas poderão ser

empregados em experimentos.

Art. 28 – As penalidades e multas referentes às infrações definidas nesta lei serão

estabelecidas pelo Poder Executivo, em espécie.

Art. 29 – V E T A D O.

Art. 30 – Esta Lei entra em vigor na data de sua publicação, revogadas as

disposições em contrário.

142

Lista de Soluções

Soluções utilizadas para Extração/Visualização de DNA

TELT: 50 mM Tris pH 8,0/62,5mM EDTA pH 9,0/2,5M LiCl /4% (v/v) Triton X-100

Tampão TE RNAse: 10 mM Tris-HCl pH 8.0/1 mM EDTA/20 µg RNAse /mL

Tampão de PCR 10X: 500mM KCl/100mM Tris

Tampão de amostra 6X para DNA: 0,25% azul de bromofenol/0,25% xileno

cianol/30% glicerol

Gel agarose: 1,2g agarose/100 mL de TAE 1X

TAE 1X: Tris 4,84 g/Acido acético glacial 1,142 g/EDTA 0,93 g

Soluções utilizadas para SDS-PAGE e Transferência

Tampão de amostra 2X para proteína: Tris base pH 6.8/2,3% SDS/0,1% azul de

bromofenol/10% glicerol/Para cada 1 mL, adicionar 50 µL de β-mercaptoetanol.

Gel separador de acrilamida 15% (15 mL): 3,5 mL H2O/4 mL Tampão Lower

7,5 mL Acrilamida 30%/0,03 mL APS 20%/0,02 mL TEMED

Gel concentrador de acrilamida 6% (15 mL): 7 mL H2O/4 mL Tampão Upper

4 mL Acrilamida 30%/0,03 mL APS 20%/0,02 mL TEMED

Tampão Lower: 1,5 M Tris-HCl, pH 8.8/0,4% SDS

Tampão Upper: 0,5 M Tris-HCl, pH 8.8/0,4% SDS

Acrilamida 30%: 29,2 g Acrilamida/0,8 g Bisacrilamida/100 mL H2O

Corante Azul de Coomassie: 0,4% (w/v) Azul brilhante de Coomassie R-250/15%

(v/v) metanol/7,5% (v/v) ácido acético

Solução Descorante de ácido acético: Metanol 450 mL/Ácido acético glacial 90 mL

Tampão fosfato 0,5 M pH 7,4: 200 mL de 1 M NaHPO4/59,2 mL de 1M

Na2HPO4/volume final de 400 mL

Tampão TST-20 10X: 100 mM Tris/15 mM NaCl/0,5% Tween 20/pH 7,4

Solução de revelação (Western blot): 40 mM Tris-HCl, pH 7.4/10 mM imidazol/30 v

H2O2/1 mg/mL DAB

143

Soluções utilizadas em ELISA

Tampão carbonato/bicarbonato: 0,032 g de CaCO3/0,058 g de NaHCO3/20mL de

H2O/pH 9,6

Solução de lavagem: PBS 1X/Tween-20 0,05%

Solução de revelação: 6,5 mL de 0,1M de ácido cítrico/7,0 mL de 0,2M de

Na2HPO4/ 5 µL de H2O2 3 V/ 10 mg de OPD/11,5 mL de H2O.

Soluções utilizadas em imunodifusão

Agar Noble 1,2%: 1,2 g Agar Noble/100 mL NaCl 1,5M/0,1 µL mertiolate

Solução salina: 150 mM NaCl/50 mM CaCl2/50 mM MgCl2

Corante Azul de Coomassie: 0,4% (m/v) Azul brilhante de Coomassie R-250/15%

(v/v) metanol/7,5% (v/v) ácido acético

Solução Descorante de ácido acético: Metanol 450 mL/Ácido acético glacial 90 mL

Outras soluções

GBS: 50 mM glicina, 0,1 M NaCl, pH8,0

PBS: 0,2 g KCl/8 g NaCl/1,44 g Na2HPO4/0,24 g KH2PO4/pH 7,4

144

145

Glossário

Amostras falso-negativas: amostras que foram negativas nos testes avaliados e

discordam do resultado positivo do teste padrão.

Amostras falso-positivas: amostras que foram positivas nos testes avaliados e

discordam do resultado negativo do teste padrão.

Amostras real-negativas: amostras que foram consideradas negativas nos testes

avaliados e concordam com os resultados negativos do teste padrão de detecção.

Amostras real-positivas: amostras que foram consideradas positivas nos testes

avaliados e concordam com os resultados positivos do teste padrão de detecção.

Bubalino: de búfalos

Dor abdominal: situação evidenciada pelo comportamento de coices (em coelhos).

Êmese: vômito

Enantema: erupção na superfície das cavidades

Endpoint: a maior diluição do anticorpo cujo valor da DO B492nm B é imediatamente

maior que duas vezes o valor do controle negativo

Exantema: erupções cutâneas

Letargia: prostração.

Ponto BaiHui: ponto subcutâneo localizado entre a última vértebra lombar e a

primeira vértebra sacral.

Sonolência: inércia.

Taquipinéia: respiração acelerada.

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Capítulo I Métodos de Detecção de Enterotoxinas ... · produção de SEs (Stiles e Krakauer, 2005a). As SEs interagem com vários alvos celulares desencadeando reações biológicas