Capítulo4

120

Captulo 4

Espectroscopia de Fluorescncia Molecular

121

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.1 - LUMINESCNCIA MOLECULAR Fotoluminescncia

- excitao absoro de ftons - geralmente a radiao emitida tem comprimento de onda maior do que o da

radiao absorvida na excitao

Fluorescncia

- tempo mdio de vida no estado excitado 10-5 s - no h alterao no spin do eltron

Fosforescncia

- tempo mdio de vida no estado excitado >10-5 s - inverso de spin do eltron

Quimiluminescncia

- emisso de radiao por parte de espcies excitadas formadas durante uma reao qumica

- nmero de reaes qumicas que produzem quimiluminescncia pequeno tcnica aplicada a um nmero pequeno de substncias

- mtodo simples, seletivo e com alta sensibilidade - aplicao qumica analtica recente

4.1.1 - CARACTERSTICAS DAS TCNICAS LUMINESCENTES

- alta sensibilidade

- limites de deteco trs ordens de grandeza melhores do que os da absoro molecular (nvel de ppb)

- sujeitos a interferncias de espcies presentes na matriz - faixa linear de concentraes mais amplas

- menos acurados e precisos que absoro molecular no UV/VIS

- campo de aplicao menor nmero de espcies que possuem propriedades luminescentes pequeno

122


4.2 - TEORIA DA FLUORESCNCIA E DA FOSFORESCNCIA

Molcula no estado fundamental

- todos os eltrons emparelhados estado eletrnico singlet

- no h desdobramento de energia dos nveis eletrnicos em presena de campo magntico externo

Radicais livres

- presena de eltron desemparelhado estado eletrnico dublet

- desdobramento de energia duas orientaes do spin eletrnico em presena de campo magntico externo

Molculas no estado excitado

- par eletrnico excitado

Singlet no h inverso de spin eletrnico

Triplet inverso de spin eltrons excitados no emparelhados

fundamental singlet

excitado singlet

excitado triplet

Transio singlet triplet menos provvel que a singlet singlet

tempo mdio de vida no estado excitado triplet maior (>10-4 s) do que no singlet (10-5 a 10-8 s)

4.3 - PROCESSOS DE RELAXAO

relaxao no radiativa

relaxao radiativa fluorescncia ou fosforescncia

processo predominante minimizar o tempo de vida no estado excitado

123


Figura 4.1 Diagramas de energia para sistema fotoluminescente

4.3.1 - RELAXAO NO RADIATIVA

4.3.1.1 - Relaxao ou desativao vibracional

- colises entre molculas excitadas e molculas do solvente

- excesso de energia vibracional transferido para molculas do solvente numa srie de etapas pequeno aumento da temperatura do meio

- processo muito rpido tempo de vida no estado vibracional excitado < 10-12 s

Se ocorrer fluorescncia transio do nvel vibracional de menor energia do nvel eletrnico excitado para qualquer nvel vibracional do nvel eletrnico fundamental

Conseqncia banda de fluorescncia de uma dada transio eletrnica aparece

a maiores do que os da banda de absoro deslocamento de Stokes

124


4.3.1.2 - Converso interna

- relaxao do nvel vibracional de menor energia de um nvel eletrnico excitado para um outro nvel eletrnico de menor energia sem emitir radiao

- processo menos eficiente que a desativao vibracional tempo de vida no nvel eletrnico excitado 10-6 a 10-8 s, mas mais eficiente que fluorescncia

- mecanismo no completamente conhecido e compreendido - processo particularmente eficiente quando os dois nveis de energia so

suficientemente prximos sobreposio de energia dos nveis vibracionais

Conseqncia Absoro bandas centradas em 1, 2 banda de fluorescncia 3

Figura 4.2 Espectros de absoro e fluorescncia de soluo de quinina

4.3.1.3 - Converso externa

- processo tambm pouco conhecido

- interao e transferncia de energia entre a molcula excitada e molculas do solvente ou outro soluto

- evidncias do processo influncia da T, do tipo de solvente e da sua viscosidade nas caractersticas da fluorescncia

125


4.3.1.4 - Cruzamento intersistema

- processo que provoca inverso de spin no estado excitado

S1 T1 (S0 T1 transio proibida)

- processo eficiente quando h sobreposio de energia dos nveis vibracionais de S1 e T1

- favorecido pela presena de tomos pesados (iodo, bromo) na molcula

4.3.2 - RELAXAO RADIATIVA

4.3.2.1 - Fluorescncia

- retorno da molcula de um nvel eletrnico excitado do tipo singlet para o nvel fundamental com emisso de radiao eletromagntica

- como podem retornar para qualquer nvel vibracional do nvel eletrnico fundamental espectro fluorescncia molecular bandas formadas por uma srie de linhas prximas cuja resoluo difcil

Linhas de ressonncia

- radiao emitida mesma energia (mesmo ) que a radiao absorvida

Deslocamento de Stokes

- radiao emitida menor energia (maior ) que a radiao absorvida - parte da energia da absoro dissipada por processo de relaxao no

radiativa (relaxao vibracional) que ocorre a taxa elevada - se a converso interna pouco importante espectros de absoro e

fluorescncia imagens especulares aproximadas e se sobrepem pela linha de fluorescncia de ressonncia

126


Figura 4.3 Espectro de fluorescncia para soluo 1 ppm de antraceno em lcool. (a) absoro; (b) emisso.

4.3.2.2 - Fosforescncia

- retorno da molcula de um nvel eletrnico excitado do tipo triplet para o estado fundamental com emisso de radiao eletromagntica

- transio T1 S0 baixa probabilidade tempo mdio no estado excitado T1 relativamente grande (>10-4 s)

- compete, com pouco sucesso, com os processos de converso interna e externa no de espcies fosforescentes muito pequeno

- fosforescncia temperaturas baixas, meio viscoso, molculas adsorvidas em slidos caractersticas que dificultam os processos de converso interna e externa

127


4.4 - FLUORESCNCIA MOLECULAR

4.4.1 - EFICINCIA QUNTICA OU RENDIMENTO QUNTICO ()

teoricamente todas as espcies que absorvem radiao UV/VIS deveriam fluorescer

na prtica s poucas so fluorescentes

estrutura molecular favorece a relaxao por processos no radiativos que ocorrem a taxas maiores do que a fluorescncia

Eficincia ou rendimento quntico

excitadas molculas de total nfluorescem que molculas de n

=o

o

ou rf

fk+k

k=

sendo: kf = constante da taxa de relaxao por fluorescncia kr = soma das constantes das taxas de relaxao por processos no

radiativos

4.4.2 - FLUORESCNCIA E ESTRUTURA

Principais molculas fluorescentes:

- presena de anis aromticos - outras: compostos carbonlicos

compostos com duplas ligaes conjugadas

Transies pi pi* maior eficincia na fluorescncia

no de anis aromticos grau de condensao dos anis

heterocclicos simples no fluorescem

N

piridina

O

furano

S

tiofeno

N

H

pirrol

128


exibem fluorescncia

N

quinolina

N

isoquinolina

N

H

indol

presena de substituintes no anel deslocamento das bandas de fluorescncia e influncia sobre a eficincia de fluorescncia

Tabela 4.1 Efeito dos grupos substituintes na fluorescncia do anel benznico

Substncia (nm) Substncia (nm) Benzeno 270-310 10 Fenolato 310-400 10 Tolueno 270-320 17 Anisol 285-345 20 Propilbenzeno 270-320 17 Anilina 310-405 20 Fluorbenzeno 270-320 10 Anilnio - 0 Clorobenzeno 275-345 7 Ac. Benzico 310-390 3 Bromobenzeno 290-380 5 Benzonitrila 280-360 20 Iodobenzeno - 0 Nitrobenzeno - 0 Fenol 285-365 18

4.4.2.1 - Efeito da rigidez da estrutura

- Fluorescncia favorecida por molculas com estruturas rgidas

Ex 1)

= 1

= 0,2

aumento da rigidez da estrutura pela ponte metilnica entre os dois anis aromticos

reduo na taxa de relaxao no radiativa e a fluorescncia acaba ocorrendo a taxa maior

129


Ex 2) Agentes complexantes orgnicos

N

OH

no fluorescente

Zn

N

O

2

fluorescente

Ex. 3) Espcies fluorescentes adsorvidas em slidos eficincia de fluorescncia

aumentada

4.4.2.2 - Efeito da temperatura

T aumento da probabilidade de colises favorecendo aos processos de relaxao no radiativa (converso externa)

4.4.2.3 - Efeito do solvente

Viscosidade aumento da probabilidade de colises intermoleculares

Presena de tomos pesados

favorecimento ao cruzamento inter-sistema (S1 T1) favorece fosforescncia

4.4.2.4 - Presena de O2 dissolvido

- reduo na intensidade da fluorescncia

oxidao fotoquimicamente induzida da espcie fluorescente

- propriedades paramagnticas do O2 promoo do cruzamento intersistema favorece transio S1 T1 reduzindo a fluorescncia

130


4.4.2.5 - Efeito do pH na fluorescncia

- anis aromticos com substituintes com carter cido ou bsico fluorescncia afetada pelo pH do meio

posio da banda intensidade da radiao emitida diferentes nas formas ionizada e no

ionizada

Ex : anilina e on anilnio

N

N

_

N

_

N +

estruturas de ressonncia da anilina on anilnio

4.4.3 - EFEITO DA CONCENTRAO NA INTENSIDADE DA FLUORESCNCIA

F = K(P0 P) (1) (Kdepende de )

Sendo bc-0

10PP

==== (2)

Substituindo-se (2) em (1)

F = KP0 (1 10-bc) (3) Pela expanso do termo potencial em srie de Maclaurin

(((( )))) (((( )))) (((( )))) ......... -! 3bc 2,3-

-

! 2bc 2,3-

-bc 2,3- P 'KF32

0

====

Quando bc = A < 0,05

F = 2,3 K bc P0

131


Sendo P0 = constante

F = K c

Representao grfica

0 2 4 6 8 10 12 14 16 180

2

4

6

8

10

12

14

16

Inte

nsi

dade

Concentrao

- baixas concentraes dependncia linear

- concentraes elevadas A > 0,05 perda de linearidade

aumento das colises entre molculas excitadas

favorecimento dos processos de relaxao

no radiativa (converso externa ou interna)

auto supresso

prprias molculas absorvem a radiao emitida por fluorescncia

reduo na intensidade da radiao emitida

por fluorescncia

auto absoro

132


4.4.4 - INSTRUMENTOS PARA MEDIDA DE FLUORESCNCIA

Componentes

- os mesmos da espectrometria de absoro molecular no UV/VIS

Fluormetros filtros para seleo dos

Espectrofluormetros

- filtro ou monocromador limitar a radiao de excitao

- redes de difrao dispersar a radiao de fluorescncia

obteno dos espectros de fluorescncia

Figura 4.4 - Componentes de um fluormetro ou de um espectrofluormetro

Caractersticas

Feixe duplo compensar flutuaes em P0

133


Feixe de amostra

filtro ou monocromador primrio transmitir a radiao que vai excitar a amostra e limitar os correspondentes fluorescncia

radiao de fluorescncia emitida pela amostra em todas as direes medida num ngulo de 90o com o feixe incidente reduzir ou eliminar o efeito do espalhamento da radiao na soluo e nas paredes da clula

filtro ou monocromador de emisso - dispersar a radiao de fluorescncia - selecionar a banda de fluorescncia de interesse

Feixe de referncia

Atenuador reduzir a intensidade a um nvel similar ao da radiao fluorescente

Comercialmente vrios modelos

grau de sofisticao preo

Fluormetros

mais adequados para anlises quantitativas maior sensibilidade

simples e de fcil utilizao

custo baixo

Componentes

Fontes

maior intensidade que as da espectrometria de absoro no UV/VIS

Fluormetros

- Lmpada de vapor de Hg linhas de excitao 254 302 313 546 578 691 e 773 nm isoladas pelos filtros de absoro

- Compostos fluorescentes fluorescncia induzida por diferentes e pelo menos um destes ser adequado

134


Espectrofluormetros

- Lmpada de arco de Xe espectro contnuo de 300 a 1300 nm

Filtros e monocromadores

idnticos aos dos instrumentos para medida da absoro no UV/VIS

Clulas e Compartimentos para amostras

Clulas cilndricas ou retangulares vidro ou slica fundida

Compartimento de clula - design adequado de modo a reduzir a incidncia d radiao espalhada

Detetores

Sinal de luminescncia baixa intensidade detetor altamente sensvel

- Tubos fotomultiplicadores (operao sob resfriamento) - Rede de diodos

Instrumentos tpicos

Figura 4.5 Representao esquemtica de um fluormetro.

135


Figura 4.6 Reperesentao esquemtica de um espectrofluormetro.

Padronizao dos instrumentos

Fluormetros / espectrofluormetros potncia da fonte e sensibilidade do detetor podem variar de um dia para outro

padronizao dos instrumentos de modo a obter-se um nvel de sensibilidade

reprodutvel

Soluo padro de sulfato de quinina 10-5 mol/L

(excitada a 350 nm fluoresce a 450 nm)

Perkin Elmer

kit com 6 padres

136


4.4.5 - APLICAES DA FLUORESCNCIA MOLECULAR

Espcies inorgnicas

ction ou nion extrado para soluo orgnica imiscvel com agente quelante fluorescncia da soluo orgnica medida

Mtodos diretos - analito + agente quelante complexo com propriedades fluorescentes - determinao de ctions

Mtodos indiretos - reduo na emisso de fluorescncia de um dado reagente em funo da sua

reao com o analito - determinao de nions

Estruturas dos agentes quelantes mais comuns

NOH

8-hidrxi-quinolina

HO N N

OH HO

SO3Na

alizarina garnet R

O

O

OH

flavanol

C C

H

OHO

benzona

137


Tabela 4.2 Mtodos fluoromtricos selecionados para espcies inorgnicas

on Reagente (nm) S (g/mL) Interferentes Abs F

Al3+ alizarina garnet R 470 500 0,007 Be, Co, Cr, Cu, F-,

NO3-, Ni, PO43-, Th, Zr

F- auto-supresso do complexo acima 470 500 0,001

Be, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, PO43-, Th, Zr

B4O7- benzona 370 450 0,04 Be, Sb

Cd2+ 2-(o-hidrxifenil-benzoxazola) 365 azul 2 NH3 Li+ 8-hidrxiquinolina 370 580 0,2 Mg

Sn4+ flavanol 400 470 0,1 F-, PO43-, Zr

Zn2+ benzona - verde 10 B, Be, Sb e ons

corados

OBS:

ons de metal de transio

- formao de complexos que absorvem no UV/VIS relaxao no radiativa to rpida (eficiente) no fluorescem

- muitos so paramagnticos favorece os cruzamentos intersistemas para estado excitado triplet fluorescncia pouco provvel (aumenta a tendncia a fosforescncia)

ons de metais no de transio no formam complexos que absorvam radiao na regio UV/VIS, mas seus complexos com quelantes org6anicos adequados fluorescentes

FLUORESCNCIA MOLECULAR + ABSORO MOLECULAR NO UV/VIS

complementares para determinao de ctions

Substncias orgnicas/ bioqumicas

Fluorescncia campo de aplicao amplo

- seletividade e sensibilidade elevadas Ex: hidrocarbonetos aromticos policclicos, adenina, guanidina, indol, naftol, protenas, aminocidos, produtos alimentares e farmacuticos, produtos naturais.

Documents

Capítulo4