CARACTERIZAÇÃO DAS NUCLEOTIDASES PRESENTES NO … · caracterizaÇÃo das nucleotidases presentes no veneno da serpente bothrops jararaca – Ênfase para as atividades atpase e

CARACTERIZAÇÃO DAS NUCLEOTIDASES PRESENTES NO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararaca – ÊNFASE PARA AS

ATIVIDADES ATPase E ADPase.

ANDRÉ TEIXEIRA DA SILVA FERREIRA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ

JULHO - 2006




"Tese de Doutorado apresentado ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense como parte das exigências para obtenção de título de Doutor em Biociências e Biotecnologia".

Orientador: Prof. Elias Walter Alves

CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ JULHO - 2006




"Tese de Doutorado apresentado ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense como parte das exigências para obtenção de título de Doutor em Biociências e Biotecnologia".

Aprovada em 31 de julho de 2006 Comissão Examinadora: _______________________________________________

Prof. André Lopes Fuly (Doutor em Ciências) - UFF

_______________________________________________

Prof. Marilvia Dansa de Alencar Petretski (Doutora em Ciências) - UENF

_______________________________________________

Prof. Milton Masahiko Kanashiro (Doutor em Ciências) - UENF

_______________________________________________ Prof. Jorge Hudson Petretski (Doutor em Ciências) - UENF

Revisor _______________________________________________

Prof. Elias Walter Alves (Doutor em Ciências) - UENF

Orientador

"Toda a história científica do mundo tem sido realizada através das lutas e das paixões que separam e devoram os homens"

Arthur Neiva

Dedico esta tese a Marcinha, o grande amor da minha vida e um presente de Deus para mim, e também aos frutos dessa união feliz: Juliana, Bruno e Gabriel.

Amo todos vocês, e obrigado por existirem.

AGRADECIMENTOS - Ao Prof. Elias Walter Alves pela orientação, amizade e principalmente por não ter desistido de mim quando eu mesmo já não me acreditava mais. - A Prof. Olga Lima Tavares Machado por tudo que me ensinou nesses anos, pelo convívio maravilhoso no laboratório e principalmente pelo carinho que sempre dedicou a mim e a minha família. - Ao Prof. José Xavier Filho meu "Mestre" que sempre acreditou em mim, meu muito obrigado. - Aos membros da Banca examinadora, por aceitarem participar desta defesa de Tese. - Ao Prof. Jorge Petretski por ter revisado minha tese, mas principalmente pela amizade de sempre, pelos "Papos Cabeça" e é claro pelos puxões de orelha que sempre me deu. - Aos amigos de toda hora que se tornaram minha família em Campos, Leonardo (Cogu) e Elenir, Beto e Michele, Marco Antônio e Gilliana e Thiago Venâncio (Cabeção), pela força, respeito, amor e carinho que sempre me dedicaram dentro e fora do laboratório. - Aos irmãos de coração que vieram comigo do Rio para essa incrível aventura que tem sido a UENF, Francisco Gomes Neto (Chico) e André Lopes Fuly, amo vocês. - Ao Cristóvão (Cris) e Dona Laci, pela colaboração e principalmente pela paciência de aturar meu temperamento tempestivo. - Aos amigos Adriana (Coisa Ruim), Marcinho, Luciana, Alexandra, Viviane, Fabinho pelos bons momentos que tivemos no dia a dia de trabalho. - A todos os amigos da UENF que não foram aqui citados por não haver espaço para listá-los, muito obrigado. - Aos amigos da UFRJ, Fred, Mário, Júlio, Cameron, Georgia, Ana Cláudia, Antônio Pereira, Celso Caruso, Adilson (negão) e muitos outros, muito obrigado. Sinto falta de vocês... - A todos os Professores que contribuíram para minha formação profissional como aprendiz de "Feiticeiro" na UERJ e na UFRJ, Prof. Ubatuba, José Roberto, Mauro Velho, Fatinha, Vera, Jaime, Adalberto Ramon Vieyra, Martha Sorenson, Hector Barrabin, Masuda, Orlando, Horácio meu "Gurú", Pedro, Sônia Ubatuba, Célia Carlini, Jorge Guimarães, Jerson Lima, Sérgio Ferreira, Tatiana Coelho, Leopoldo

de Meis e tantos outros que no momento me falha a memória, muito obrigado mesmo. - A todos os Professores da UENF por tudo que me ensinaram e fizeram por mim. - Ao amigo Luiz Machado e seus filhos, Tales, Tiago, Taís e Vinícius pela amizade e carinho (a Olga eu já agradeci). - Aos amigos Jorge e Lea que acolheram a mim e minha família desde que cheguei a Campos. Vocês são especiais. - Aos meus Pais José e Leila, que fizeram de mim o que sou, que me ensinaram o que considero mais importante de tudo, a amar a Deus e ao próximo. Amo vocês e sei que nunca terei como retribuir o presente de tê-los como pais, que Deus os abençoe. - Aos meus irmãos naturais Zezinho, Claudinho e Marcinha, e aos que ganhei pelo casamento Welington e Mauro, pelo amor e amizade de toda hora, não sei o que fiz para merecer vocês. - Aos meus sogros, Francisco e Lourdes que me adotaram como filho, meu muito obrigado por tudo, amo vocês de verdade. - A todos, muito obrigado de coração.

Lista de Abreviaturas e Siglas

- µM - micromolar - Abs - absorvância - ADO - adenosina - ADP - adenosina 5'-difosfato - AMP - adenosina 5'-monofosfato - ATP - adenosina 5'-trifosfato - AxP – Adenosina mono, di ou trifosfatada - B. - Bothrops - C - graus Celsius - Cis - cisteína - D.O. - Densidade ótica - D0,5 - tempo necessário para inibir 50% da atividade a uma temperatura

constante de 65C - DNA - ácido desoxirribonucléico - EDTA - ethylenediamine tetraacetic acid - FPLC - cromatografia líquida rápida de proteínas - HPLC - cromatografia líquida de alta performance - kDa - kilo dalton - KM - constante de Michaelis - mA - milampéres - mg - miligrama - min. - minutos - mL – mililitro - MLV – musculatura vascular lisa - mM - milimolar - PDE - fosfodiesterase - pH - logarítico do inverso da concentração de íons hidrogênio - Pi - fosfato inorgânico - pI - ponto isoelétrico - p-NP - p-nitrofenol - p-NPP - p-nitrofenil fosfato - p-NP-TMP - p-nitrofenil timidina fosfato - PPi - pirofosfato inorgânico - RNA - ácido ribonucléico - rpm - rotações por minuto - SDS - dodecil sulfato de sódio - SDS-PAGE - gel de poliacrilamida - dodecil sulfato de sódio - SH - sulfidrila - TEMED - N,N,N',N',-tetrametilenodiamino - Tris -Tris (hidróxidomeltil) aminometano - UDP - uridina 5'-difosfato - UTP - uridina 5'-trifosfato - V - volt - W - watts

I

ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO 02 1.1. Aspectos Gerais................................................................................................ 02 1.2. Características das serpentes do gênero Bothrops e ação do veneno

botrópico............................................................................................................ 03

1.3. Patogenia do veneno botrópico........................................................................ 04 1.4. Função e composição do veneno..................................................................... 06 1.5. Estratégia de envenenamento.......................................................................... 06 1.6. Mecanismo de ação de venenos...................................................................... 08 1.7. Classificação dos receptores purínicos............................................................. 09 1.7.1. Receptores P1................................................................................................... 09 1.7.2. Receptores P2................................................................................................... 11 1.7.3. Distribuição filogenética dos receptores de purinas.......................................... 13 1.8. Vias de liberação de Purinas............................................................................ 13 1.9. Enzimas com atividade fosfoesterásica presente em venenos de serpentes... 14 1.9.1. Fosfodiesterase................................................................................................. 14 1.9.2. 5’-nucleotidase.................................................................................................. 16 1.9.3. Fosfomonoesterase não-específica (fosfatase)................................................ 17 1.9.4. ADPase/ATPase .............................................................................................. 17

2. OBJETIVO 20 2.1. Objetivo Geral................................................................................................... 20 2.2. Objetivos Específicos........................................................................................ 20

3. MATERIAIS E MÉTODOS 22 3.1. Reagentes......................................................................................................... 22 3.2. Dosagem de proteína........................................................................................ 22 3.3. Hidrólise de ATP, ADP e AMP.......................................................................... 22 3.4. Ensaio de atividade Fosfodiesterase................................................................ 22 3.5. Ensaio de atividade fosfatásica não específica................................................ 23 3.6. Dependência da concentração de Mg-ATP,Mg-ADP e Mg-AMP sobre a

atividade nucleotidásica do veneno.................................................................. 23

3.7. Dependência do pH sobre as atividades fosfatásicas Cromatografia de troca iônica da fração FI em DEAE-Sepharose.........................................................

23

3.8. Curva de termoestabilidade.............................................................................. 23 3.9. Fracionamento do veneno em Sephacryl S100 (Exclusão molecular)............. 24 3.10. Cromatografia de troca iônica da fração FI em DEAE Sepharose.................... 24 3.11. Cromatografia líquida de alta performance (HPLC).......................................... 25 3.11.1. Fracionamento de proteínas (troca iônica)....................................................... 25

II

3.11.2. Determinação da hidrólise de nucleotídeos por HPLC..................................... 26 3.12. Cromatografia de afinidade............................................................................... 26 3.13. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE).................................................. 27 3.13.1. Em condições não desnaturantes (sem SDS).................................................. 27 3.13.2. Em condições desnaturantes (com SDS e 2-β mercaptoetanol)...................... 27 3.14. Coloração do gel............................................................................................... 28 3.14.1. Coloração por Comassie Brilhant Blue R-250.................................................. 28 3.14.2. Inpregnação por AgNO3.................................................................................... 28 3.14.3. Atividade enzimática em gel............................................................................. 28 3.15. Eletroforese Preparativa................................................................................... 29 3.16. Análises densitométricas................................................................................... 29 3.17. Estatística.......................................................................................................... 30

4. RESULTADOS 32 4.1. Efeito da temperatura sobre as atividades nucleotidásicas presente no

veneno bruto de Bothrops jararaca................................................................... 32

4.1.1. Gráfico de primeira ordem da curva de inativação térmica............................... 32 4.1.2. Gráfico de segunda ordem da curva de inativação térmica.............................. 37 4.2. Efeito de Cisteína e do Fluoreto de sódio sobre as atividades

nucleotidásicas presentes no veneno de Bothrops jararaca............................. 37

4.3. Estudo do metabolismo de nucletídeos catalisado pelo veneno de Bothrops jararaca.............................................................................................................

40

4.3.1. Influência do pH sobre as atividades hidrolíticas de ATP, ADP ,AMP e p-nitrofenil fosfato catalisadas por veneno bruto de B. jararaca..........................

40

4.3.2. Curso temporal de hidrólise de nucleotídeos.................................................... 44 4.4. Determinação do mecanismo de hidrólise de ATP, por HPLC......................... 47 4.5. Parâmetros cinéticos das atividades fosfatásicas do veneno........................... 53 4.6. Fracionamento do veneno de Bothrops jararaca.............................................. 55 4.6.1. Fracionamento por cromatografia de exclusão molecular................................ 55 4.6.2. Fracionamento por cromatografia de troca iônica (DEAE)............................... 59 4.6.3. Determinação da atividade nucleotidase pelas frações obtidas pela DEAE..... 62 4.6.4. Fracionamento por cromatografia de afinidade HiTrap-Blue (Cibacron Blue).. 66 4.6.5. Fracionamento da fração FI em coluna de afinidade HiTrap-Blue.................... 70 4.6.6. Fracionamento do veneno utilizando coluna de afinidade ADP-sepharose...... 73 4.7. Purificação das nucleotidases em gel de eletroforese não desnaturante......... 76 4.7.1. Determinação das atividades nucleotidásicas em gel não desnaturante......... 80 4.7.2. Determinação da massa nativa das atividades nucleotidásicas por

eletroforese não desnaturante (Gel de poro transverso).................................. 80

4.8. Análise bidimensional das proteínas presente nas bandas com atividade em gel nativo...........................................................................................................

87

4.9. Purificação das nucleotidases por eletroforese em gel não desnaturante........ 87

III

4.9.1. Fracionamento do veneno por eletroforese preparativa................................... 89 4.9.2. Determinação das atividades nucleotidásicas das frações eluídas da PAGE

preparativa (PREPCELL).................................................................................. 92

5. DISCUSSÃO 97 5.1. Discussão geral dos resultados........................................................................ 97 5.2. Hipótese de participação das nucleotidases no envenenamento..................... 100

6. CONCLUSÕES 106

7. REFERÊNCIAS 108

RESUMO E ABSTRACT

RESUMO

As enzimas envolvidas na liberação de purinas estão presentes em todos

os venenos. A presença ubíqua dessas proteínas as coloca em posição de

destaque tanto em termos evolutivos quanto em termos fisiológicos,

principalmente quando relacionamos os diversos efeitos farmacológicos

desenvolvidos pelas purinas com alguns dos efeitos fisiopatológicos observados

durante o envenenamento. Nossos estudos demonstram que o veneno de

Bothrops jararaca se apresenta como um complexo protéico formado por quatro

subunidades de aproximadamente 30 kDa, firmemente ligadas. Cada subunidade

parece apresentar uma atividade catalítica diferente: Fosfodiesterase, ATPase,

ADPase e 5'-Nucleotidase. Esse complexo permite um perfeito acoplamento entre

as reações podendo metabolizar o ATP por duas vias diferentes: uma rápida que

conta com apenas duas enzimas, a Fosfodiesterase e a 5'-Nucleotidase e que

apresenta como produtos ADO, PPi e Pi ;e uma outra mais lenta que promoveria

a retirada seqüencial de Pi do ATP contando com a participação de uma ATPase,

uma ADPase e da 5'-Nuclotidase, apresentando como produtos ADO e 3Pi.

Devido a ação pró-inflamatória da adenosina aumentando a permeabilidade

vascular e inibindo a agregação plaquetária ns concluímos que o aumento na

concentração de adenosina com conseqüente diminuição das concentrações de

ATP e ADP, promovido pelo sistema de nucleotidases, está relacionado com o

desenvolvimento de edema e disfunção plaquetária observada na região da

picada durante o envenenamento, levando a um aumento de difusão dos

componentes do veneno causado pelo aumento na permeabilidade vascular e

efeito anti-plaquetário. O extravasamento de fluído para o meio intersticial irá

promover a ativação de componentes tóxicos do veneno e difusão para os tecidos

da presa resultando em sua morte e digestão.

ABSTRACT

The enzymes involved in the purines liberation are present in all the poisons. The

ubiquitous presence of those proteins places them in position of so much prominence in

evolutionary terms as in physiologic terms, mainly when we related the several

pharmacological effects developed by the purines with some of the effects physiopathology

observed during the envenomation. Our studies demonstrate that the poison of Bothrops

jararaca comes as a complex proteic formed by four sub-unidades of approximately 30

kDa, firmly tied up. Each sub unit seems to present a different catalytic activity:

Fosfodiesterase, ATPase, ADPase and 5'-Nucleotidase. That complex one allows a perfect

joining among the reactions being able to metabolize ATP for two different roads: a fast

one that counts with just two enzymes, Fosfodiesterase and for 5'-Nucleotidase and that

presents as products ADO, PPi and Pi; e another one slower than it would promote the

retreat sequential of Pi of ATP counting with the participation of an ATPase, an ADPase

and of 5'-Nuclotidase o'clock, presenting as products ADO and 3Pi. Due to pro-

inflammatory action of the adenosine increasing the vascular permeability and inhibiting

the aggregation platelet us concluded that the increase in the adenosine concentration with

consequent decrease of the concentrations of ATP and ADP, promoted by the nucleotidases

system, is related with the edema development and dysfunction platelet observed in the area

of the pricked during the envenomation, taking to an increase of diffusion of the

components of the poison caused by the increase in the vascular permeability and effect

anti-platelet. The release of having flowed for the middle interstitial will promote the

activation of components toxins of the poison and diffusion for the tissue of the prey

resulting in its death and digestion.

INTRODUÇÃO

2

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos Gerais As serpentes venenosas são classificadas de acordo com suas

características morfológicas, compreendendo cinco famílias: Crotalidae, Viperidae,

Elapidae, Hydrophiidae e Colubrinae. Nas Américas as serpentes peçonhentas são

representadas pelas famílias Elapidae, com os gêneros Leptomicrurus e Micrurus e,

pela família Crotalidae, com os gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e Sistrurus

(Underwood, 1979 citado por Cavinato, 1995; Varanda e Giannini, 1994).

Os ofídios podem ser classificados quanto ao tipo de dentição que possuem,

estando essa característica relacionada com a capacidade de inoculação de

veneno. Os dentes das serpentes não servem para cortar ou mastigar, eles são

voltados para trás, auxiliando na passagem da presa ingerida. São quatro tipos de

dentições de serpentes em relação à capacidade de inocular veneno em outro

organismo: Áglifas - não apresentam dentes especializados na inoculação de

veneno (ex. Boídeos e alguns Colubrídeos); Opistóglifas - Um par de dentes

sulcados localizados na região posterior da maxila superior (alguns Colubrídeos);

Proteróglifas - um par de dentes sulcados, fixos na região anterior da maxila

superior (ex. Elapídeos); Solenóglifas - um par de dentes móveis localizados na

região anterior da maxila superior, que se deslocam para frente durante o bote (ex.

Viperídeos). A família Crotalidae pertence à série solenóglifa, pois possui um par de

presas inoculadoras de veneno, providas de um canal central que se comunica com

o canal excretor da glândula de veneno (Veronese, 1987).

O gênero Bothrops é composto de várias espécies e na América distribui-se

desde a América do Norte até a Argentina (Hoge e Romano-Hoge, 1978/79 citado

por Cavinato, 1995). A grande maioria das picadas de serpentes na América Latina

é causada por espécies classificadas no gênero Bothrops (Gutiérrez e Lomonte,

1989). No Brasil, em todas as regiões, o gênero Bothrops é o maior representante

da família Crotalidae, possuindo 32 espécies e uma ampla distribuição geográfica.

3

1.2. Características das serpentes do gênero Bothrops

As espécies do gênero Bothrops caracterizam-se morfologicamente pela

presença de fosseta loreal, olhos pequenos com pupilas em fenda, cabeça

triangular e escamada, presas inoculadoras de veneno implantadas no osso maxilar

e o corpo tende a ser grosso e não muito longo. Os membros deste gênero são

chamados também de “lanceheads”, devido ao formato triangular característico da

cabeça que a maioria das espécies possui. São responsáveis por 80% a 90% dos

acidentes ofídicos no Brasil. Habitam preferencialmente ambientes úmidos como

matas, áreas cultivadas e locais de proliferação de roedores, em zonas rurais.

Possuem hábitos noturnos e são consideradas agressivas quando se sentem

ameaçadas, atacando em silêncio. Distribuem-se por todo território nacional e cada

espécie tem sua distribuição geográfica característica. As espécies mais

importantes são B.asper na América Central, B.atrox e B.jararaca na América do

Sul (Campbell e Lamar, 1989; Barraviera e Pereira, 1994).

Bothrops atrox, chamada de “jararaca” ou de “jararacuçu” conforme a área da

Região Norte em que aparece, tem ampla distribuição geográfica e domínio

progressivo. Habita tanto florestas como áreas desmatadas, adaptando-se

facilmente. É a maior responsável por acidentes ofídicos no Norte do Brasil e pode

atingir comprimento superior a 1,5m (Barraviera e Pereira, 1994) Figura 1A.

Figura 1. Distribuição geográfica das duas principais espécies de serpentes do gênero Bothrops de importância médica no Brasil, Bothrops atrox painel A e Bothrops jararaca painel B (Barraviera e Pereira, 1994; Campbell e Lamar, 1989). Em verde local de incidência das serpentes.

B. atrox B. jararacaB. atrox B. jararaca

A B

B. atrox B. jararacaB. atrox B. jararaca

A B

4

Bothrops jararaca, conhecida popularmente por jararaca, é responsável pelo

maior número de acidentes ofídicos por viver no campo e nos lugares comuns ao

homem. Ocorre nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, no Paraguai e na Argentina,

ocupando uma diversidade de habitats, tendo preferência por regiões aberta

próximas à vegetação (Campbell e Lamar, 1989) Figura 1B.

1.3. Patogenia do veneno botrópico

A fisiopatologia do envenenamento botrópico decorre das principais ações

apresentadas pelo veneno: inflamatória, miotóxica, coagulante e hemorrágica. O

acidente botrópico causa manifestações locais e sistêmicas.

Nas lesões locais tem sido observados dor e edema de intensidades

variáveis podendo ocorrer necrose de tecidos e/ou formação de abscessos (Figura

2). A necrose pode ser causada pelo próprio veneno e/ou pela isquemia de vasos

da região afetada (Secretaria Estadual de Saúde, 1993). O edema pode ser

resultado da ação simultânea do veneno na microvasculatura, aumentando a

permeabilidade de capilares e veias ou da ação indireta de mediadores endógenos,

liberados por componentes do veneno, como histamina, prostaglandinas e cininas.

Além do edema, o veneno induz infiltrado de células inflamatórias (Gutiérrez e

Lomonte, 1989).

Quanto às manifestações sistêmicas, as mais freqüentes são a alteração da

coagulação sangüínea, seguida de hemorragia, choque e insuficiência renal. O

choque é causado pela grande hemorragia, seqüestro de líquidos e liberação de

substâncias vasoativas. A patogênese da lesão renal com necrose tubular inclui a

ação indireta do veneno sobre as células dos túbulos renais e sobre

a coagulação intravascular, responsável pela oclusão vascular e isquemia (Amaral

et al., 1986; Secretaria Estadual de Saúde, 1993).

A ação coagulante dos venenos de Bothrops, devido fundamentalmente a

proteases, é feita pela transformação de fibrinogênio em fibrina, conhecida como

ação do tipo trombina. Além disso, o veneno ativa o fator X e a pró-trombina da

cascata de coagulação sanguínea. A ação necrosante decorre do efeito direto de

proteases, fosfolipases, hialuronidases e outras enzimas sobre os tecidos. Pode

haver liponecrose, mionecrose e lise das paredes vasculares. Estas lesões podem

5

Figura 2 - Local da ferida produzida pela picada de Bothrops jararaca, observar a formação de edema, bolhas e tecido necrosado. (de Andrade et al., 1989)

ser agravadas por infecções secundárias. A mionecrose é agravada pela presença

de miotoxinas, enzimas que possuem ação direta no tecido muscular. Algumas

miotoxinas possuem estrutura similar a fosfolipase A2, e já foram purificadas de

vários venenos do gênero Bothrops (Gutierrez et al., 1986; Lomonte et al., 1994;

Arni e Gutierrez, 1993; Angulo et al., 1997). O efeito hemorrágico pode ser local ou

sistêmico afetando pulmões, cérebro e rins, e parece ser originado por

hemorraginas. As toxinas hemorrágicas são metaloproteinases ácidas que agem

sobre vasos capilares, destruindo inicialmente a membrana basal e causando sua

ruptura e extravasamento de sangue. Estas toxinas já foram caracterizadas em

Elapinae, Viperinae e principalmente em Crotalinae (Assakura et al., 1992; Paine et

al., 1992; Sanchez et al., 1995; Chung et al., 1996; Khow et al., 2002; Stroka et al.,

2005). As hemorraginas explicam casos de hemorragias sistêmicas, por vezes

fatais, mesmo na ausência de alterações na coagulação sangüínea. Se a

administração do antiveneno é feita rapidamente após a picada, geralmente

consegue-se com sucesso a neutralização dos efeitos sistêmicos, mas a

neutralização dos efeitos locais é uma tarefa mais difícil, e pode resultar em

seqüelas permanentes, com perda de tecidos (Gutiérrez e Lomonte, 1989;

Secretaria Estadual de Saúde, 1993; Barraviera e Pereira, 1994). A mortalidade

6

sem tratamento chega à cerca de 7%, mas com tratamento é reduzida a 0,5-3%

(Campbell e Lamar, 1989).

1.4. Função e composição do veneno Embora venenos de serpentes também possuam um papel de autodefesa,

isto é de pouca importância considerando sua composição. A função primária é sem

dúvida imobilizar e matar a presa (Karlsson, 1979), enquanto simultaneamente é

disparado o processo de digestão (Thomas e Pough, 1979; Kardong, 1980; 1998).

Venenos de serpentes são misturas complexas de compostos orgânicos e

inorgânicos, muitos dos quais apresentam alta atividade biológica (Berger e Bhatti,

1989). Dos componentes orgânicos dos venenos, destacam-se as proteínas,

muitas delas apresentando atividade enzimática. A fração protéica responde por

cerca de 90% a 95% do peso seco do veneno bruto. Os outros componentes

orgânicos presentes nos venenos são aminoácidos livres, pequenos peptídeos,

nucleotídeos, nucleosídeos, carboidratos sob a forma de glicoproteínas, lipídeos e

aminas biogênicas. Entre os constituintes inorgânicos, os mais freqüentemente

encontrados são íons de cálcio, zinco, magnésio, potássio, sódio, fósforo, ferro,

cobalto e manganês, além de fosfatos, sulfatos, citrato e cloretos. Alguns destes

compostos inorgânicos possuem a função de neutralizar as cargas e manter a

estabilidade estrutural de certas proteínas do veneno, como metaloproteinases

(Varanda e Giannini,1994), e ainda inibem determinadas reações enzimáticas

impedindo a degradação do veneno por autólise (Francis et al., 1992; Ownby e

Gutierrez,1998).

1.5. Estratégia de envenenamento

Os estudos comparativos das atividades enzimáticas do veneno de diferentes

serpentes mostraram uma grande heterogeneidade. Alguns componentes são

típicos de venenos de certas famílias de serpentes, enquanto outros são

encontrados em todos os grupos. Dessa forma, os níveis de atividade enzimática

podem diferir quantitativamente de espécie para espécie, inclusive nas que

apresentam um alto grau de parentesco (Iwanaga e Suzuki, 1979). Além disso,

7

parece que a composição dos venenos está sujeita a variações intraespecíficas,

relacionadas à variação geográfica, variação sazonal, tipo de dieta e

comportamento alimentar, idade, sexo, habitat, e até mesmo quanto ao intervalo de

extrações de veneno e condições de armazenamento dos mesmos.

Esta complexidade e a variabilidade na composição dos venenos levaram

alguns autores a buscar relacioná-la com os hábitos alimentares das serpentes

(Chippaux et al, 1991; Jorge da Silva e Aird, 2001), permanecendo, entretanto difícil

de explicar a natureza onipresente de alguns componentes do veneno relativamente

não-tóxicos. A ocorrência quase universal dessas enzimas sugere um papel central

no envenenamento, contudo nenhuma explicação satisfatória foi sugerida para

justificar sua presença em venenos.

Alguns trabalhos (Cousin e Bon, 1999) têm ressaltado que venenos de

serpentes são ricos em proteínas e enzimas os quais não apresentam funções

conhecidas no envenenamento, como exemplo: o fator de crescimento do nervo

(NGF), L-aminoácido oxidase (LAO) e fosfodiesterase (PDE). Francis et al. (1997)

mostraram ainda que veneno da cobra coral brasileira, Micrurus frontalis, contém

quantidades significantes de guanosina. Evidências preliminares sugerem que uma

fração significante desses nucleosideos não está livre em solução, mas

aparentemente ligada fortemente a neurotoxinas pós-sinápticas, fosfolipases, e

possivelmente combinado com outras estruturas. Intrigado por estes resultados Aird

(2002) procurou uma explicação para o papel das purinas em venenos e nessa

busca descobriram relatos da ocorrência de purinas, livres em solução, como

adenosina, guanosina e inosina, desde a década de 50 (Fischer e Dorfel,1954;

Doery, 1956 citados por Aird 2002 e Takasaki et al., 1991; Aird, 2005). Com base

em seus estudos ele postulou que as purinas poderiam estar envolvidas nas três

estratégias fundamentais de envenenamento por ofídios (tópico 1.6.1), que parecem

ser empregadas por todas as serpentes venenosas. Ele sugere que purinas atuem

como toxinas multifuncionais, mostrando efeitos sincrônicos em virtualmente todos

os tipos de células, e que purinas exógenas e/ou liberadas por vias endógenas

possuem um papel central em todas as três estratégias de envenenamento.

Apresentando explicações hipotéticas para a presença de muitas enzimas de

veneno que até então não haviam sido explicados. Embora ainda estejam faltando

evidências experimentais no estudo com venenos para a maioria das hipóteses

8

apresentadas por Aird, as pesquisas farmacológicas em outros campos provêem

ampla evidência para suportá-las.

Para realizar seus objetivos, serpentes empregam uma grande variedade de

mecanismos bioquímicos que necessariamente refletem tanto a biologia da

serpente quanto a natureza de sua presa principal. Estes mecanismos podem se

agrupar em três estratégias fundamentais de envenenamento. Duas delas são

estratégias de imobilização da presa e podem ser denominados como: estratégias

‘hipotensiva' e 'paralisante'. Ambas têm por objetivo impedir a fuga da presa, no

caso de grupos de serpentes que apresentam hábitos de caça que consistem em

golpear e libertar a presa para depois localizá-la e ingeri-la (a maioria dos

Viperidae), ou superar a resistência da presa, no caso de cobras que agarram

fortemente suas presas (muitos Elapidae e todos os Colubridae). A terceira

estratégia é digestiva, a degradação dos tecidos da presa começa a partir da

inoculação do veneno, antes mesmo que a presa tenha sido engolida.

Normalmente, todas as três estratégias operam simultaneamente e os componentes

individuais do veneno freqüentemente participam em mais que um desses

processos.

1.6. Mecanismo de ação de venenos

O envenenamento por serpentes emprega três estratégias bem integradas:

imobilização da presa por hipotensão arterial (efeito vasculotóxico e hemotóxico),

imobilização de presa por paralisia (efeito neurotóxico e miotóxico), e digestão da

presa (Gutiérrez et al., 1990; Daltry et al., 1996). As purinas constituiriam toxinas

multifuncionais perfeitas, uma vez, que com base em seus efeitos farmacológicos

poderiam participar simultaneamente em todas as três estratégias de

envenenamento, apresentando dessa forma um papel central nas estratégias de

envenenamento da maioria das serpentes (Aird, 2002). Purinas aparentemente

ligam-se em outras toxinas que então servem como “acompanhantes” orientando e

depositando-as a um subtipo específico de receptor purinérgico (Aird, 2002 e 2005).

As ações farmacológicas como: supressão passageira de neurotransmissores,

liberação de histamina e analgesia, parecem ser erroneamente atribuídas a uma

9

variedade de proteínas tóxicas. Tais efeitos poderiam estar relacionados a liberação

de purinas por estas toxinas, e/ou presente no próprio veneno.

1.7. Classificação dos receptores purínicos

Atualmente as duas famílias de receptores de purinas originalmente propostas

por Burnstock (1978) ainda são aceitas, embora as subdivisões das classes tenham

sofrido algumas mudanças na nomenclatura (figura 3). Os receptores de adenosina,

ou receptores P1 ligam ao nucleosídeo adenosina, e em alguns casos, inosina,

enquanto receptores de P2 ligam nucleotídeos como: ATP, ADP, UTP e UDP

(Ralevic e Burnstock. 1998).

1.7.1 Receptores P1

Receptores P1, que aparentemente desempenham um papel central no

envenenamento, são divididos em quatro sub-tipos: A1, A2a, A2b e A3. Essa

classificação é baseada em evidências estruturais, bioquímicas e farmacológicas,

uma característica comum a todos é o fato de estarem acoplados a proteína G.

Receptores A1, o mais amplamente estudado da classe, têm uma distribuição quase

onipresente dentro do sistema nervoso central (Reppert et al., 1991; Dixon et al.,

1996; Ralevic e Burnstock, 1998). Apresentam um efeito depressor da atividade do

sistema nervoso suprimindo a liberação de quase todos neurotransmissores.

São achados receptores de A1 em muitos outros tecidos, inclusive coração

(Olsson e Pearson, 1990; Dixon et al., 1996), rim (Olivera et al., 1989; Agmon et al.,

1993; Barrett e Droppleman, 1983; Munger e Jackson, 1994), fígado (Dixon et al.,

1996), aorta (Dixon et al., 1996), baço (Fozard e Milavec-Kiizman, 1993), tubo

deferente (Hourani e Jones, 1994), brônquio (Ali et al., 1994), jejuno (Hancock e

Coupar, 1995), duodeno (Nicholls et al., 1996), e tecido adiposo (Londos et al.,

1985).

Por transcrição reversa usando PCR, Dixon et al. (1996) descobriu mRNA de

receptor A2a em todas as regiões de cérebro, com níveis mais altos no corpo

estriado e tubérculo olfatório. Na periferia, foram descobertos farmacologicamente

10

Figura 3 – Quadro de classificação de receptores purinérgicos (Baseado na classificação proposta por Ralevic e Bunstock, 1998).

receptores de A2a em coração (Martin et al., 1993; Dubey et al., 1998; Belardinelli et

al., 1998), aorta (Conti et al., 1993), retina (McIntosh e Blazynski, 1994), nervo

frênico (Correia-de-Sá e Ribeiro, 1994), baço, pulmão, útero, pele, bexiga e músculo

esquelético (Dixon et al., 1996).

Receptores A2b são os que se apresentam menos estudados. Eles são

essencialmente onipresentes, ocorrendo ao longo do cérebro (Daly et al., 1983) e

em todos os tecidos examinados por Dixon et al. (1996), porém com níveis muito

baixos, quando comparados as anteriores.

Também são distribuídos amplamente receptores A3, mas o papel fisiológico

deles é muito pouco conhecido (Ralevic e Burnstock, 1998). Porém, alguns

trabalhos atribuem a eles um efeito cardio-protetor por prevenir a apoptose (Kohno

et al., 1996 a,b; Yao et al., 1997; Shneyvays et al., 1998; Jacobson, 1998) (Liang e

11

Jacobson, 1998), liberação de histamina por mastócitos (Ramkumar et al., 1993), e

regulação da pressão sanguínea central (Stella et al., 1998) TABELA I.

TABELA I

Receptor de adenosina (P1) Sub-tipo Segundo

mensageiro Principal tecido

A1 Gi (1-3): cAMP

reduzido

Cérebro; terminais nervosos

autônomos; cordão espinhal;

coração; testículos

A2a Gs:aumento de

cAMP Cérebro; coração; pulmão; baço

A2b Gs:aumento de

cAMP Intestino grosso; bexiga

A3

Gi, Go/n: cAMP

reduzido

Aumento de

Ins(1,4,5)P3

Cérebro; Pulmão; Testículos;

Coração; fígado

(Baseado na revisão de Ralevic e Burnstock, 1998)

1.7.2 Receptores P2

São reconhecidas atualmente duas subdivisões da classe de receptores P2.

Receptores P2X controlam canais iônicos ou poros não seletivos enquanto

receptores P2Y são associados a proteína G . A família de receptores P2 também

inclui receptores sensíveis tanto a pirimidinas como a purinas. A nomenclatura de

receptores P2 está agora baseada em estrutura, e substituiu a nomenclatura

anterior que estava baseada na farmacologia. Em tecidos de mamíferos têm sido

definido cinco receptores de P2Y (conhecido como P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, e

P2Y,) e sete receptores P2X (P2X17) (Ralevic e Burnstock, 1998; Di Virgilio et al.,

2001). Receptores P2Y são significativamente mais sensíveis a ATP que receptores

P2X.

12

Todos os receptores P2Y têm sete regiões trans-membrana e transduzem

sinais ativando fosfolipase C, ou ativando ou inibindo a adenilato ciclase. Todos os

receptores P2Y são ativados por ATP, mas alguns sub-tipos da classe também são

ativadas por ADP, UTP, UDP, ou GTP. Os receptores P2Y são amplamente

distribuídos e foram relatados em tecidos cardíacos, vascular, conectivo, imune e

neural (Ralevic e Burnstock, 1998). Eles estão presentes na maioria das células do

sangue e são conhecidos por participarem na resposta de células quimiotácticas

dendríticas humanas (Liu et al. 1999). Eles parecem funcionar nos macrófagos

como detectores extremamente sensíveis ao dano tecidual, respondendo a

concentrações de ATP tão baixas quanto 0.1 mM (Oshimi et al., 1999). Receptores

P2Y presentes no músculo liso e endotélio de vasos sanguíneo produzem

vasodilatação (Burnstock e Warland, 1987; Boeynaems e Pearson 1990; Brizzolara

e Burnstock, 1991; Boarder e Hourani, 1998).

Receptores P2X consistem em subunidades com duas regiões transmembrana.

A transdução do sinal acontece pela entrada rápida de Ca2+ e Na+ e saída de K+. A

estequiometria das subunidades é desconhecida para a maioria dos sub-tipos da

classe, embora se acredita que receptores P2X1 e P2X3 formam trímeros ou

hexameros. De interesse particular para envenenamento são receptores P que têm

um carboxiterminal extenso. Acredita-se que receptores de P2X7 formam um canal

ATP-ativado formado por um número desconhecido de subunidades. Por algum

meio, talvez o recrutamento de subunidades adicionais, os canais P2X7 podem ser

convertidos a poros não-seletivos (Di Virgílio et al., 2001) que resultam em células

necrótica mortas ou apoptóticas, dependendo das concentrações de ATP

extracellular (Di Virgilio, 1998; 2000 citado por Aird, 2002).

Proteínas, incluindo os diferentes tipos de receptores P2X, apresentam uma

distribuição bem difundida entre os tecidos os quais expressam mais de um de seus

subtipos. Receptores P2X são bem conhecidos em tecidos excitáveis como músculo

liso e nervos, embora eles também tenham sido identificados em tecidos

endócrinos, plaquetas, pró-mielócitos células HL6O, e quase todas células do

sangue estudadas até agora (Ralevic e Burnstock, 1998; Di Virgilio et al., 2001).

TABELA II.

13

1.7.3 Distribuição filogenética dos receptores de purinas

A maioria dos estudos sobre receptores de purinas foi executada em

mamíferos, entretanto na literatura vem crescendo e ganhando corpo um grande

número de trabalhos demonstrando a presença de receptores P1 e P2 em todos os

organismos. Eles são extensamente distribuídos em bactérias, plantas superiores,

protozoários, platelmintos, celenterados, anelídeos, moluscos, equinodermos,

artrópodes e todas as classes vertebradas (Burnstock, 1996). Além disso, em todos

os animais, os agonistas, adenosina e ATP, promovem respostas semelhantes às

observadas em mamíferos, sugerindo que os dados farmacológicos obtidos em

mamíferos sejam provavelmente aplicáveis à extensiva gama de organismos

comidos ou envenenados por serpentes. Além disso, organismos inferiores também

empregam receptores de purina de alguns modos modernos. Insetos hematófagos

percebem a presença de ATP no sangue dos hospedeiros, que serve como um fago-

estimulante (Galun et al., 1963; Galun e Kindler, 1968; Galun e Margalit, 1969; Galun

et al., 1985).

1.8. Vias de liberação de Purinas

As purinas envolvidas no envenenamento podem ter sua origem no próprio

veneno fazendo parte de sua composição ou serem geradas a partir de precursores

endógenos da presa por ação conjunta de várias enzimas. Vários trabalhos relatam

a presença de purinas livres em venenos, e em alguns casos elas contribuíam com

até 10% da absorbância a 280 nm desses venenos (Eterovic et al., 1975). A

geração de purinas a partir de precursores endógenos da presa justifica a presença

de muitas atividades enzimáticas até agora não esclarecidas em venenos de

serpentes, tais como: 5'-nucleotidase, endonucleases (inclusive ribonuclease),

fosfodiesterase, ATPase, ADPase, fosfomonoesterase, NAD-nucleotidase,

fosfolipases A2, citotoxinas, miotoxinas e heparinase que também participam na

liberação de purinas, além das suas funções melhor conhecidas.

14

TABELA II

Receptor de ATP (P2)

Sub-tipo Segundo

mensageiro Principal tecido

P2X1

Influxo de Ca2+ & Na+

(Canal de cátion)

Músculo liso; Ganglio sensorial; Cerebelo (pós-sináptico); Coração; plaquetas

P2X2 Influxo de Ca2+

(Canal de cátion) Gânglio autônomo; Cérebro; Pituitária; Gânglio

sensorial; Músculo liso; retina P2X3 Canal iônico Ganglio sensorial; Neurônio simpático

P2X4 Influxo de Ca2+

(Canal de cátion) Cérebro; Pâncreas; Testículos; Colo; Músculo liso

P2X5 Canal iônico Coração; Intestino; Bexiga; Gânglios autônimos; pele; Timo; cordão espinhal

P2X6 Canal iônico Músculo esquelético; cérebro; neurônio motor espinhal; gânglio autônomo

P2X7

Canais de grande poro de ação prolongada

Células apoptóticas; macrófagos; linfócitos; microglia; pele

P2Y1 Gq/Gn

PLC-β ativado Músculo:NMJs; endotélio; epitélio; células de defesa;

plaquetas; osteoclasto

P2Y2 Gq/Gn; ?Gi

PLC-β ativado Epitélio; endotélio; células de defesa; rins;

osteoclastos

P2Y4 Gq/Gn; ?Gi

PLC-β ativado Células endoteliais

P2Y6 Gq/Gn

PLC-β ativado Célula epitelial; timo; células-T; placenta

P2Y11 Gq/Gn &GS

PLC-β ativado Granulócitos; intestino; baço

P2Y12

Gi Inibição da

adenilato ciclase plaquetas

(Baseado na revisão de Ralevic e Burnstock, 1998)

1.9. Enzimas com atividade fosfoesterásica presente em venenos de

serpentes

1.9.1. Fosfodiesterase

Também chamada de exonuclease, é uma das enzimas mais estudadas,

amplamente distribuída entre os venenos das cinco famílias de serpentes

venenosas. Geralmente usada para estudos da degradação de ácidos nucléicos,

removendo 5’-mononucleotídeos sucessivos da cadeia de polinucleotídeos

15

começando pelo terminal 3’-hidroxila. Usando nucleotídeos sintéticos e a enzima

purificada de Crotalus adamanteus, verificou-se que a extremidade 3’-hidroxila livre

é essencial para atividade da enzima (Varanda e Giannini, 1994).

Alguns venenos contêm mais de uma exonuclease, como no caso de

C.adamanteus, que possui três exonucleases com atividades paralelas à

desoxirribonuclease (DNAase) (Iwanaga e Suzuki, 1979). Quatro isoenzimas da

fosfodiesterase foram identificadas no veneno de Trimeresurus flavoviridis (Habu

snake), sendo metaloglicoproteínas com atividade fosfomonoesterásica desprezível

(Kini e Gowda, 1984).

As fosfodiesterases de veneno são termosensíveis, sendo inativadas a 50oC. A

enzima isolada de Bothrops atrox é uma glicoproteína de cadeia única com massa

130.000 kDa, com pI 9.0. Para substratos artificiais, a enzima é ativa em pH 8.0 -

9.9, com pico em pH 8.4 - 9.2, sendo Mg+2 dependente. A atividade é inibida em

50% por agentes redutores como cisteína 7.5mM. EDTA também é um potente

inibidor, mas a inibição é reversível com a adição de excesso de magnésio. Dos

cátions testados, apenas Cu+2 0.1mM inibe a atividade (Iwanaga e Suzuki, 1979).

Uma fosfodiesterase foi purificada do veneno de Cerastes cerastes, tendo atividade

ótima em pH 9.0 e temperatura de 56oC. Cisteína, ADP e AMP são inibidores da

enzima, sendo a cisteína um inibidor não-competitivo e o ADP competitivo. EDTA

na concentração de 0.5mM causa completa inibição que é revertida com adição de

Ca+2 e Mn+2 (Halim et al, 1987).

Pouco se conhece sobre o sítio ativo da enzima, mas foi demonstrado que a

fosfodiesterase de venenos requer, para atividade, resíduos de triptofano e tirosina

intactos, grupos SH e pontes de enxofre. O p-nitrofenil timidina-5’-fosfato é um dos

substratos artificiais mais rapidamente hidrolisados. A fosfodiesterase de venenos

possui também uma atividade endonucleásica. Ocorre cerca de uma clivagem

endonucleásica para cada clivagem exonucleásica. Adenosinatrifosfato (ATP) e

adenosinadifosfato (ADP) são também hidrolisadas pela fosfodiesterase. Em

Bothrops jararaca a relação entre a atividade ATPásica e fosfodiesterásica. é de

42.0, enquanto em Bothrops atrox é de 74.6. A ligação 5’,5’-fosfodiéster parece

corresponder à ligação 5’,3’. Essa observação sugere que o elemento básico para a

atividade hidrolítica da enzima é o grupo “5’-fosforil nucleosídico” (Iwanaga e

Suzuki, 1979).

16

1.9.2. 5’-Nucleotidase

A 5’-nucleotidase é uma fosfomonoesterase específica, que hidrolisa fosfato

monoéster que se liga na posição 5’ de DNA e RNA. Diferentes mononucleotídeos

podem ser hidrolisados, mas 5’-AMP é o substrato mais susceptível. A enzima não

hidrolisa 3’-AMP, p-nitrofenilfosfato e ribose-5’-fosfato, que são substratos de

fosfomonoesterases não-específicas (Iwanaga e Suzuki, 1979).

O pH ótimo varia para o veneno de cada espécie, mas a atividade máxima está

em um pH próximo de 8,0 e a enzima não requer metais para apresentar atividade

máxima sugerindo que hidrolisa os nucleotídeos sem estarem formando complexo

com metais. A atividade é completamente inibida por 1mM de EDTA de maneira

reversível. A enzima presente no veneno de Crotalus é uma zinco metaloproteina. A

remoção total do zinco resulta na perda da atividade AMPásica, que pode ser

restaurada pela re-adição de zinco na concentração de 1.5M. A reativação também

pode ser feita com adição de íons de cobalto ou cobre (Fini et al., 1990). A

necessidade de Zn2+ parece ser estrutural pois altas concentrações podem inibir a

enzima (Iwanaga e Suzuki, 1979). Essa inibição observada por Iwanaga pode ser

resultado da formação de complexo Zn-AMP, já que a hidrólise de AMP não parece

depender de metais.

Recentemente, as 5’-nucleotidases de venenos, como os de Bothrops,

Crotalus, Haemachantus e Vipera, foram classificadas como sendo do tipo de baixo

Km e forma solúvel. Possuem preferência por hidrolisar AMP, são inibidas de

maneira competitiva por ATP e ADP, possuem uma estreita relação com zinco e pH

ótimo entre 7.0 e 8.0 (Zimmermann, 1992).

Uma potente 5’-nucleotidase purificada do veneno de Trimeresurus gramineus

possui a ação de inibir a agregação plaquetária. Esta enzima é uma glicoproteína

com cadeia polipeptídica única de peso molecular de 74kDa. Possui atividade

nucleotidásica também sobre ADP, que resulta na formação de adenosina. A

remoção do ADP liberado pelos indutores de agregação plaquetária e o acúmulo de

adenosina são responsáveis pelo efeito da 5’-nucleotidase do veneno (Ouyang e

Huang, 1983).

17

1.9.3. Fosfomonoesterase não-específica (fosfatase):

Tem sido descrito a presença de duas atividades fosfatásicas em venenos de

serpentes. Essas atividades apresentem diferentes pHs ótimos, uma em torno de

5.0 (ácida) e a outra 8.5 (alcalina). Alguns venenos contêm ambas as fosfatases,

ácida e alcalina, enquanto outros possuem apenas uma delas.

A fosfatase alcalina purificada de Bothrops atrox possui pH ótimo em 9.5, é

instável ao tratamento térmico e ácido. A enzima é ativada por 1mM de Mg+2 ou

Ca+2, e fortemente inibida por 0.1mM de EDTA, 1mM de cisteína ou 1mM de Zn+2.

Esta enzima é responsável pela hidrólise de mononucleosídeos 3’,5’-fosfato, como

5’-AMP e 3’-AMP. Possui massa molecular de aproximadamente 90-100kDa

(Iwanaga e Suzuki, 1979). A fosfatase alcalina possui forte reação em alguns

venenos, mas pode estar ausente em outros, às vezes em venenos da mesma

espécie. A enzima possui pI entre 3.6 e 4.8, é inativada também por 2-

mercaptoetanol (Acosta et al., 1994).

A fosfatase ácida possui atividade ótima em pH entre 4.5 e 5.0, é inibida por

10mM de fluoreto de potássio e 10mM de EDTA, enquanto o zinco não afeta a

atividade. A enzima purificada da serpente marinha Lacticauda semifasciata

hidrolisa p-nitrofenilfosfato, 2’-AMP, 3’-AMP, 5’-AMP e ATP (Iwanaga e Suzuki,

1979). A fosfatase ácida purificada de veneno de abelha é uma glicoproteína e,

existe em duas formas, com pesos moleculares de 96 e 45kDa. Ela é um potente

alérgeno para pacientes alérgicos a veneno de abelha, capaz de induzir liberação

de histamina de basófilos humanos sensibilizados e induzir reações de pústula e

edema (Barboni et al., 1987).

1.9.4. ADPase/ATPase

Há mais de cinqüenta anos, desde que foi descoberta uma atividade

pirofosfatásica, que pesquisadores vem registrando a presença de atividade

ATPásica em venenos de serpentes (Zeller, 1950; Johnson et al., 1953; Schiripa e

Schenberg, 1964; Pereira Lima et al., 1971; Schenberg et al., 1975; Wei et al., 1981

citado por Aird, 2002; Kini e Gowda, 1982a,b; Mukherje et al., 2000). Pereira Lima et

al. (1971) propuseram que a atividade hidrolítica sobre o ATP era catalisada por

18

uma ATPase livre distinta da fosfodiesterase por que observaram níveis

desproporcionais dessas atividades, em diferentes venenos, outros autores no

entanto relatam uma distribuição proporcional (Boman, 1959 citado por Aird, 2002,

Suzuki e Iwanaga, 1960, Pfleiderer e Ortlanderl, 1963 citado por Aird, 2002). Dez

anos após a descoberta da presença de atividade ATPásica em venenos Sugino

(1960) mostrou que ADP e ATP são substratos para fosfodiesterase, e alguns anos

depois Sulkowski et al. (1963) mostraram evidências que aquele ATP era

hidrolisado através de uma fosfomonoesterase presente no veneno (fosfatase). Kini

e Gowda (1982b) observaram que íons Mg2+ eram essenciais para as duas enzimas

com atividade ATPásica isolada de veneno de Daboja russellii, contudo a

dependência de magnésio também é característica de fosfodiesterases e

fosfomonoesterases (Iwanaga e Suzuki, 1979).

Ultimamente tem sido mais fácil entender a considerável confusão existente

entre essas diferentes enzimas, devido ao aparecimento de novas seqüências.

Enzimas que clivam ésteres de fosfato (A superfamília das fosfoesterase) exibem

três diferentes seqüências para seus temas estruturais, estas seqüências são

conhecidas como os temas de assinaturas das fosfoesterases (Koonin, 1994; Zhuo

et al., 1994; Zimmermann, 1996). Estas seqüências conservadas foram descobertas

em vertebrados, invertebrados e 5'-nucleotidases bacterianas (EC 3.1.3.5), ATP-

difosfohidrolase de mosquito (apirase) (EC 3.6.1.5), diadenosina tetrafofatases de

bactérias (EC 3.6.1.14) (Blanchin-Roland et al., 1986), Ser/Thr fosfoproteina

fosfatases (EC 3.1.3.16) e esfingomielina fosfomonoesterases (EC 3.1.3.).

Até hoje não existe registro que qualquer um tenha tido sucesso no isolamento

de uma ATPase ou ADPase de veneno, demonstrando que essas atividades sejam

distintas da fosfodiesterase e da fosfomonoesterase; porém, a capacidade dos

venenos para hidrolisar ATP e ADP apresentando como produtos de reação,

adenosina, pirofosfato e ortofosfato vem sendo documentado a mais de cinqüenta

anos (Johnson et al., 1953).

OBJETIVO

20

2. OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho é estudar as enzimas envolvidas na liberação

de purinas e metabolismo de ATP presente no veneno de Bothrops jararaca,

principal serpente envolvida com acidentes ofídicos no Brasil.

2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Identificar as enzimas responsáveis pela hidrólise de ATP e ADP

catalisada pelo veneno de Bothrops jararaca.

• Caracterizar a cinética de hidrólise desses substratos.

• Purificar a ou as enzimas envolvidas nesse processo.

MATERIAIS E MÉTODOS

22

3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Reagentes O veneno de Bothrops jararaca foi fornecido pelo Instituto Butantan – São

Paulo. Os demais reagentes possuem grau de pureza analítico e foram adquiridos

na sua maioria na Sigma-Aldrich, Bio-Rad e Pharmacia.

3.2. Dosagem de proteína

Para normalizarmos a concentração de proteínas que foi utilizada nos ensaios

de atividade enzimática, eletroforese e cromatografia, utilizamos o método descrito

por Bradford (1976) ou por determinação espectrofotométrica a 280 nm segundo

Brown (1980). As dosagens de proteínas foram realizadas utilizando Albumina

Bovina (BSA) como padrão.

3.3. Hidrólise de ATP, ADP e AMP

A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi monitorada medindo o fosfato inorgânico

liberado enzimaticamente utilizando o método de Fiske e Subbarow (1925). Os

ensaios foram feitos em um meio de reação contendo: 50 mM de Tris-HCl pH 8,0; 3

mM de MgCl2; 3 mM de ATP ou ADP ou AMP; as reações foram iniciadas pela

adição de veneno bruto de B. jararaca em concentrações que variaram entre 0,025

à 0,1 mg/mL, dependendo do ensaio.

3.4. Ensaio de atividade fosfodiesterase

A atividade fosfodiesterase (PDE) foi determinada segundo Razzel (1963)

utilizando p-nitrofenil timidina fosfato (p-NP-TMP) como substrato artificial. O ensaio

foi feito diretamente em uma cubeta contendo 50 mM de tampão Tris-HCl pH8,8, 5

mM de MgCl2, 0,5mM de p-NP-TMP e 0,02mg/mL de proteina a 25C e

constantemente monitorado à 400nm em um espectrofotômetro Specord M-500

Zeiss.

23

3.5. Ensaio de atividade fosfatásica não específica

A atividade foi determinada utilizando p-nitrofenilfosfato (p-NPP) como

substrato artificial (Sulkowski et al.,1963). A mistura de reação foi composta de 25

mM de Tris-HCl pH 6,8 ou 7,2; 5 mM de MgCl2. 10 mM de p-NPP e 0,1 mg/mL de

proteína. O p-nitrofenol (p-NP) liberado foi determinado pela variação da absorvância

a 410 nm.

3.6. Dependência da concentração de Mg-ATP, Mg-ADP e Mg-AMP sobre a atividade nucleotidásica do veneno.

O meio de reação para as atividades ATPase, ADPase e AMPase continha: 20

mM de Tris-HCl pH 8,8; 5-6 mM de MgCl2; para diferentes concentrações de Mg-

ATP (25-200 μM), Mg-ADP (20-2000μM) ou Mg-AMP (10-1300μM), e iniciada pela

adição de 10 μg de veneno. A concentração de Mg2+ (íon livre) Mg-ATP, Mg-ADP e

Mg-AMP foram calculados usando um método interativo que calcula os complexos

envolvidos no equilíbrio entre Mg2+, H+, tampões aniônicos e as diferentes formas de

nucleotideos. As quantidades no equilíbrio foram calculadas como descrito por

Fabiato e Fabiato (1979) com modificações introduzidas por Sorenson et al. (1986).

3.7. Dependência do pH sobre as atividades fosfatásicas.

Os ensaios de dependência de pH foram feitos seguindo os protocolos

previamente descritos para cada substrato, utilizando os tampões a seguir para os

diferentes intervalos de pH: tampão citrato de pH 2,5 a 3,6; tampão acetato de pH

3,6 a 5,6; tampão Tris-maleico de pH 5,2 a 8,4; tampão Tris-HCl de pH 8,0 a 9,2 e

tampão Tris-carbonato de pH 9,2 a 10,6.

3.8. Curva de termoestabilidade

Os ensaios de estabilidade térmica foram feitos de acordo com Perry e Wetzel

(1984). 15mg de veneno bruto foram diluídos em 15 mL de uma solução tampão

contendo 20 mM de Tris-HCl pH 8,0 com 100 mM NaCl e incubados a 65C. Nos

tempos indicados (0; 5; 10; 16; 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60 e 124 min) foram

retiradas alíquotas de 1 mL do meio de incubação e rapidamente resfriadas a 4oC,

24

utilizando um banho de gelo. As atividades foram determinadas a temperatura

ambiente para ATP, ADP, AMP, pNTP e pNPP como descrito anteriormente. Os

resultados de inativação, para cada substrato, foram normalizados como percentual

do controle. Para quantificar o efeito da temperatura foram utilizados dois

tratamentos: num deles o decaimento exponencial da atividade enzimática foi

linearizado utilizando uma escala logarítmica e a partir da equação da reta foram

determinados os valores de D0,5 para cada substrato. O valor de D0,5 foi definido

como o tempo necessário para inibir 50% da atividade em função da temperatura, o

segundo tratamento é denominado de gráfico de segunda-ordem construído a partir

logaritmo natural da razão entre a atividade inicial e a atividade remanescente no

tempo t (A0/AT) (Matthews et al. 1987).

3.9. Fracionamento do veneno em Sephacryl S100 (exclusão molecular)

100 mg de veneno bruto de bothrops jararaca foram dissolvidos em 3,5 mL de

tampão de eluição contendo: Tris–HCl 2,5 mM; 150 mM de NaCl pH 7,2,

centrifugado a 14000 rpm por 10 minutos ou filtrado utilizando uma membrana de

nitrocelulose 0,45 μm e aplicado sobre um gel de sephacryl-S100 HR (Pharmacia)

empacotado manualmente em uma coluna com 72,5 cm (h) x 2,6 cm (D) (BioRad).

Foi utilizado um fluxo de 1,3 mL/min e coletadas amostras de 2,6 mL. Em outro

fracionamento 50 mg de veneno foram dissolvidos em 2mL. O sobrenadante foi

aplicado em coluna de gel filtração Sephacryl S100 HR pré-empacotada (HiPrep™

26/60 320 mL) utilizando um fluxo de 1mL/min em sistema FPLC (Pharmacia). As

cromatografias foram executadas em temperatura ambiente e a eluição das

proteínas monitorada pela absorvância a 280nm. Os tubos contendo as amostras

(2,6mL e 2,0 mL cada) foram reunidos em 8 frações, de acordo com o perfil protéico

obtido no cromatograma. Essas frações foram nomeadas de FI a FVIII.

3.10. Cromatografia de troca iônica da fração FI em DEAE Sepharose

A fração FI, que apresentou todas as atividades, foi submetida à cromatografia

de troca iônica em DEAE Sepharose (20mL, sistema FPLC -Pharmacia). Um volume

25

de 10 mL da FI (0,3 mg/mL de proteína), da cromatografia de gel filtração, foi diluído

em 50 mL de Tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Este procedimento permitiu diminuir

a concentração de NaCl da amostra para 50 mM, eliminando o processo de diálise e

posterior concentração, que poderiam propiciar a formação de agregados. Os 60 mL

de amostra foram aplicados em dois estágios na coluna de troca iônica DEAE

Sepharose, utilizando um super-loop de 30 mL. Como tampão A foi utilizado Tris 20

mM, NaCl 50mM, pH 8,0 e como tampão B Tris 20 mM, NaCl 1M, pH8,0 em um

fluxo de 2,5 mL/min. Após lavar a coluna com o tampão A para retirar as proteínas

não retidas, foi aplicado um gradiente de NaCl não linear nas seguintes

concentrações: 100, 150, 200, 250,300 e 1000mM. Para cada concentração de NaCl

utilizada, a coluna foi lavada o equivalente a 5 vezes o seu volume (100mL). A

eluição das proteínas foi monitorada através da absorvância a 280nm. Os tubos

contendo 5mL cada foram reunidos em 6 frações de acordo com o perfil protéico. As

frações foram então nomeadas NR (não retido), F100, F150, F200, F250 e F300. Os

números correspondem às concentrações de NaCl no tampão de eluíção.

3.11. Cromatografia líquida de alta performance (HPLC)

A cromatografia líquida de alta performance foi adotada como método de

fracionamento com o objetivo de isolar e purificar as proteínas de interesse ou para

medidas de atividade enzimática pela análise do desaparecimento dos substratos e

acúmulo dos produtos formados.

3.11.1. Fracionamento de proteínas (troca iônica)

Foram utilizadas duas resinas trocadoras de ânions, uma DEAE-BioRad

(Dietilaminoetil), e uma Mono-Q PC 1.6/5 (Smart System Pharmacia). As amostras

de veneno bruto ou de frações semi-purificadas, foram previamente centrifugadas

em uma centrífuga eppendorf a 10.000g e filtradas em membrana Millipore de 0,22

μm. A concentração de proteína aplicada foi dosada como descrito anteriormente ou

estimada espectrofotométricamente por leitura a 280nm utilizando BSA como

padrão. As amostras foram diluídas no mesmo tampão utilizado para equilibrar as

colunas. No fracionamento utilizado DEAE a coluna foi equilibrada em tampão Tris-

26

HCl 20 mM pH 8.8 e as proteínas eluídas com concentrações crescentes de Tris-HCl

20 mM pH 8.8 com NaCl 1,5M (Tampão B) conforme os passos a seguir: 0% de B

(de 0 a 10min), 5% de B (de 10,1 a 30 min), 10% de B (de 30,1 a 50 min) , 15% de B

(de 50,1 a 70 min), 20% de B (70,1 a 90 min), 100% de B (90,1 a 100 min), 0% de B

(de 105,1 à 130 min) com um fluxo de 0,5 mL/min; No fracionamento utilizando

Mono-Q, a coluna foi equilibrada em Tris-HCl 20mM pH 8,0 e as proteínas eluídas

por gradiente linear de 0 a 0,3M (23min) e 1 M de NaCl (conforme indicado),

utilizando um fluxo de 0,1 mL/min.

3.11.2.Determinação da hidrólise de nucleotídeos por HPLC

Os nucleotídeos foram analisados utilizando um sistema HPLC Shimadzu. Nos

tempos indicados 100 µl do meio de reação foram imediatamente transferido para

um banho de gelo e depois injetado sobre uma coluna Whatman Partisil 10 SAX

(Phenomenex 250 x 4,6mm) equilibrada com tampão fosfato 20 mM pH 7,0 (Tampão

A). Os nucleotídeos foram eluídos com um gradiente continuo de 20 mM

NaH2PO4/Na2HOP3, pH 7.0 (Tampão A), a 480 mM H3PO4, pH 6.8 (Tampão B), com

um fluxo de 1 mL/min. O tampão B aumentou linearmente para 80% em 8 min e

então imediatamente indo para 0% de B e permanecendo assim nos 7 minutos

seguintes. A identidade de cada nucleotídeos foi calculada a partir do tempo de

retenção usando padrões comerciais monitorando a absorvância a 259 nm. Os

tempos de retenção foram adenosina (ADO) entre 3,63 e 3,83min, AMP entre 7,39 e

7,56 min, ADP entre 10,08 e 10,61 e ATP entre 12,6 e 13,47 min.

3.12. Cromatografia de afinidade

Foram utilizadas duas colunas uma HiTrap-Blue Pharmacia (Cibacron Blue) e

um ADP-sepharose Sigma. No fracionamento pela HiTrap-Blue 20 mg da fração FI

(liofilizado) foram diluídos em 2,2 mL de tampão Tris-HCl 20mM pH 8,0 (Tampão A)

e após centrifugação, a 14000 rpm por 10 min, foi aplicado sobre a coluna

equilibrada no mesmo tampão e as proteínas retidas foram eluídas utilizando um

tampão Tris-HCl 20mM pH 8,0 contendo 1 ou 2M de NaCl (Tampão B), por

gradiente linear ou discreto variando a concentração do tampão B de 5 em 5%.

27

Quando utilizamos a ADP-sepharose (Sigma) 10mg do Pool S-100 (liofilisado)

foram diluídos em tampão de equilíbrio (tampão A) e centrifugados à 14000rpm por

10 min. O tampão A era composto de 20 mM de tampão Tris.HCl pH 8,0 e 100 mM

de NaCl. As proteínas retidas foram eluídas no mesmo tampão contendo variadas

concentrações de ATP ou ADP ou AMP ou p-NP-TMP entre 50 à 1000 μM.

3.13. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

Esse procedimento foi usado com o objetivo de isolar e purificar as proteínas de

interesse, como critério de pureza e como preparação das proteínas para posterior

sequênciamento.

3.13.1. Em condições não desnaturantes (sem SDS) Os géis em condições não-desnaturantes possibilitam separar proteínas sem

perda da atividade enzimática. Para tanto foram utilizados géis de separação com

variadas concentrações de acrilamida (7, 9, 11, 12, 13 e 15%). Sobre o gel de

separação foi utilizado um gel de empacotamento de 4% de acrilamida. As proteínas

no gel foram submetidas a uma corrente constante de 20 mA, em tempos variados

de 4 a 20h de corrida, em ambiente refrigerado (10oC) segundo adaptação do

método descrito por Davis (1964). Os géis foram polimerizados em um sistema de

eletroforese vertical Mini-PROTEIN II, Bio-Rad. A corrida foi executada em um meio

contendo Tris 25 mM, glicina 0,192M em pH 8,8. O tampão de amostra não

desnaturante continha 60 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 10% de glicerol e 0,025% de azul

de bromofenol.

3.13.2. Em condições desnaturantes (com SDS e 2-β mercaptoetanol)

Nessas condições as amostras foram analisadas quanto ao grau de pureza.

Foram utilizados géis na maioria das vezes com 12% de acrilamida, acrescentando-

se 0,1% de SDS e β-mercaptoetanol. As proteínas no gel foram submetidas a uma

voltagem constante de 150 V durante aproximadamente 40 min de corrida, segundo

o método descrito por LaemmLi (1970). Os géis foram polimerizados em um sistema

28

de eletroforese vertical Mini-PROTEIN II, Bio-Rad. O tampão de corrida contém: Tris

0,025 M, glicina 0,192 M e 0,1% de SDS. O tampão de amostra contém 0,06 M de

Tris-HCl, pH 6,8, 2% de SDS, 5% de 2-β mercaptoetanol, 10% de glicerol e 0,025%

de azul de bromofenol. As amostras foram diluídas em 3:1 de tampão de amostra

(4X concentrado).

3.14. Coloração do gel 3.14.1. Coloração por Comassie Brilhant Blue R-250

Para visualização do perfil total de proteínas, os géis foram corados com

Comassie Brilhant Blue R-250 durante 2h e descorados com uma solução composta

de ácido acético 10% e metanol 40% (v:v) (Weber e Osborn, 1969).

3.14.2. Impregnação por AgNO3

O perfil de proteínas também foi visualizado por impregnação por prata. Os géis

de acrilamida foram incubados com ácido acético a 10%, sob agitação durante 5

min, seguido de duas lavagens com água por dois minutos. A impregnação com

prata foi desenvolvida em solução contendo 10mg de nitrato de prata; 100 µL de

formamida a 37%, em 200 mL de água por 30 min. Em seguida, os géis foram

lavados com água por 10 s e a coloração desenvolvida em solução contendo 60 g

de carbonato de sódio (Fisher Chemical); 100 µL de formamida e 400 μL tiosulfato

de sódio (Fisher Chemical). O processo de coloração foi interrompido com ácido

acético a 10%, tão logo as bandas foram visualizadas.

3.14.3. Atividade enzimática in gel

Enzimas que produzem fosfato inorgânico são hábeis em corar géis pela

insolubilidade do fosfato de cálcio produzido em meio levemente alcalino (Nimmo e

Nimmo, 1882). As bandas brancas do sal de cálcio precipitado são claramente

visíveis quando observadas sobre um fundo escuro e podem ser fotografadas ou

29

digitalizadas. Após a eletroforese em gel de poliacrilamida as fatias de gel foram

incubadas a 37oC em um meio de reação contendo: 20 mM Tris-HCl pH 7,3; 20 mM

de CaCl2; 3 mM de MgCl2 e 3 mM de substrato (ATP, ADP ou AMP) por 4 horas ou

por 12 horas a 10oC.

3.15. Eletroforese Preparativa

Foi utilizado um sistema preparativo da BioRad (PREPCELL). A eletroforese foi

feita utilizando um gel de empacotamento (3%) sem SDS de 1,5 cm de altura e um

gel de separação de 8% com 5,5 cm. As amostras foram preparadas diluindo-se 100

mg de veneno bruto em 4 mL de tampão de amostra (1x) contendo: 0,06 M de Tris-

HCl, pH 6,8, 10% de glicerol e 0,025% de azul de bromofenol, sem SDS e β-

mercaptoetanol. Antes de aplicar sobre o gel, a amostra foi centrifugada a 10000

rpm por 10min a fim de retirar elementos não solúveis presente no veneno bruto. A

corrida foi feita com potência constante de 12W utilizando um meio contendo: Tris

0,025 M e glicina 0,192M. As amostras que saem do gel por mobilidade

eletroforética são arrastadas por um tampão de eluíção apresentando uma

concentração 10 vezes menor que o tampão de corrida com um fluxo ajustado para

0,75 mL/min sendo coletadas alíquotas de 1,87 mL.

3.16. Análises densitométricas

Essa técnica é utilizada para determinação do peso molecular de proteínas

imobilizadas em gel e na determinação das quantidades relativas das proteínas

presentes na amostra. Para tanto utilizamos o programa de análise de imagens Gel-

Perfect, desenvolvido por Bozzo e Retamal (1991). Os géis corados com Comassie

Brillant Blue ou por precipitação por nitrato de prata, foram digitalizados com auxílio

de um scanner de mesa de 19800 DPI de resolução interpolada. A imagem obtida é

transformada em 256 tons de cinza através do Adobe® PhotoShop 7.0, um programa

comercial de tratamento de imagens. O princípio da análise densitométrica utilizado

pelo programa Gel-Perfect, é a conversão dos diferentes tons de cinza em tons de

cores, mediante um algoritmo matricial. Para o cálculo de área, este programa utiliza

outro algoritmo gaussiano. O fator de Gauss será utilizado para calcular as áreas

30

das projeções laterais, que em última análise seriam reflexos das intensidades dos

tons de cores contidos no diagrama do gel. Dessa forma será determinado o padrão

de mobilidade relativa da proteína de interesse bem como sua percentagem em

relação ao conteúdo protéico (corado com Comassie) total na raia do gel analisado.

3.17. Estatística

Os resultados foram expressos como a média ± S.D.. As médias foram comparadas usando um teste-t padrão e p<0,05 foi considerado como indicativo de uma diferença estatística significativa.

RESULTADOS

32

4. RESULTADOS

4.1. Efeito da temperatura sobre as atividades nucleotidásicas presente no veneno bruto de Bothrops jararaca.

A estabilidade de uma proteína é determinada pela diferença líquida de energia

livre entre a forma enovelada (nativa) e não enovelada (desnaturada). Portanto as

forças que estabilizam essa estrutura estão relacionadas com interações entre a

estrutura primária da proteína (efeito entrópico) e o meio onde ela se encontra,

interferindo na variação de entalpia (∆H) da estrutura. Dessa forma diferenças na

seqüência de aminoácidos de uma estrutura protéica resultam em diferenças na

cinética de inativação térmica, podendo esse parâmetro se constituir numa

ferramenta importante para caracterização de proteínas (Matthews et al., 1987). Os

perfis de inativação por temperatura das atividades nucleotidásicas foram obtidos

medindo-se a hidrólise de ATP, ADP, AMP, p-NP-TMP e p-NPP a 25oC após incubar

o veneno a 65oC, por diferentes tempos, em um meio tamponado a pH 7,0 na

presença de 150 mM de NaCl (Figura 1). Os resultados demonstram que as

atividades podem ser divididas em dois grupos: um mais termoestável representado

pelas atividades de hidrólise de AMP (3mM) e ADP (3mM) e outro mais termo

sensível relativo às atividades de hidrólise de ATP (3mM), p-NP-TMP (0,5 mM) e p-

NPP (10mM).

4.1.1. Gráfico de primeira ordem da curva de inativação térmica

Para estimar quantas enzimas estariam presente em cada um dos grupos

definidos acima, calculamos as constantes de inativação térmica, para cada

substrato, a partir das representações dos resultados como gráficos de primeira e de

segunda ordem. Nessa representação as atividades no tempo zero foram normalizadas como

100% (controle) e o gráfico construído em escala logarítmica (Figura 2). As

diferenças observadas nos coeficientes angulares (m) das curvas refletem

diferenças na sensibilidade térmica das estruturas protéicas envolvidas na hidrólise

dos substratos. A partir da equação da reta é possível calcular uma constante que

represente a velocidade de inibição da proteína em função da temperatura. Essa

33

Figura 1. Cinética de inativação térmica das atividades nucleotidásicas. O veneno bruto foi incubado a 65oC em solução salina (150mM NaCl). Nos tempos indicados na figura uma alíquota do meio de reação foi retirada e imediatamente colocada a 4oC. As atividades foram medidas a 25oC para (●) ATP (3 mM), (○) ADP(3 mM), (▼) AMP (3 mM), (∇) p-NP-TMP (0,5mM) e (■) p-NPP (10mM). Todos as atividades foram normalizadas para 100% no tempo zero. Os resultados são a media de três experimentos.

% d

e at

ivid

ade

Tempo (min)0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

% d

e at

ivid

ade

Tempo (min)0 10 20 30 40 50

0

20

40

60

80

100

34

Figura 2. Gráfico de primeira ordem dos resultados de inativação térmica. As atividades foram normalizadas como % do controle (tempo zero) e o gráfico construído utilizando uma escala logarítmica. Hidrólise de (●) ATP (3 mM), (○) ADP(3 mM), (▼) AMP (3 mM), ( ) p-NP-TMP (0,5mM) e (■) p-NPP (10mM).

Tempo (min)0 10 20 30 40 50 60

% d

e at

ivid

ade

1

10

100

35

constante, aqui denominada como valor de D0,5, foi calculada para cada

substrato e representa o tempo necessário para que, a uma temperatura constante

de 65 oC, seja inibida 50% da atividade enzimática.

Com exceção da atividade de hidrólise de ATP, todas as atividades testadas

apresentaram um comportamento monofásico nessas condições de ensaio,

apresentando dessa forma um único valor de D0,5. Para a atividade de hidrólise de

ATP foram calculados um valor de D0,5 para cada fase da curva de inativação

térmica. Na tabela I estão representados os valores de D0,5 obtidos a partir do gráfico

de primeira ordem para todos os substratos. As atividades de hidrólise de ADP e

AMP, que fazem parte do mesmo grupo em relação à estabilidade à temperatura,

apresentam uma diferença de 12 minutos nos valores calculados para suas

constantes de inativação térmica (valores de D0,5). Essa diferença nos permite

assumir que as atividades de hidrólise de ADP e AMP sejam catalisadas por

estruturas protéicas distintas. O segundo grupo analisado, formado pelas as

atividades mais sensíveis a temperatura, que hidrolisam ATP, p-NP-TMP e p-NPP,

se mostrou um pouco mais complexo com relação à interpretação dos seus

resultados. Quando consideramos apenas os primeiros 25 minutos de exposição à

temperatura, as atividades apresentam valores de D0,5 muito próximos: 6,3; 6,8 e 5,0

min respectivamente, indicando que essas atividades podem estar sendo catalisadas

pela mesma estrutura. Depois desse tempo a hidrólise de ATP muda de inclinação

enquanto a de p-NP-TMP permanece constante e a de p-NPP, que já é inicialmente

muito baixa, não pode mais ser monitorada. O comportamento bifásico da curva de

inativação térmica pode ser interpretado de algumas formas: uma delas considera a

existência, em uma mistura, de duas proteínas apresentando diferentes

sensibilidades à temperatura. Esse efeito seria observado tanto em preparações

onde estão presentes duas proteínas totalmente diferentes que utilizem o mesmo

substrato, bem como em preparações purificadas que apresentem mais de uma

isoforma de uma mesma proteína (Perry e Wetzel, 1984); uma segunda

interpretação, que não invalida a primeira, considera que as curvas de inativação

térmica de proteínas sejam bifásicas apresentando uma fase inicial com perda

rápida e reversível da estrutura secundária seguida de uma fase mais lenta, porém

com modificações irreversíveis da estrutura secundária da proteína (Twomey and

Doonan, 1987 e Doonan's Home Page). Nesse caso quando uma proteína apresenta

36

TABELA I. Valores de D0,5 (tempo necessário para inibir 50% da atividade

enzimática para uma temperatura constante de 65C) para a inativação das

atividades nucleotidásicas pela temperatura.

Os resultados apresentados foram média de três experimentos (n=3). Os valores de D0,5 para ATP são correspondentes a cada inclinação da curva de inativação térmica.

0,98736AMP

0,99048ADP

0,9885p-NPP

0,9966,8p-NP-TMP

0,98611,5

0,9986,3ATP

r2Valor de D0,5(min)Nucleotídeo

0,98736AMP

0,99048ADP

0,9885p-NPP

0,9966,8p-NP-TMP

0,98611,5

0,9986,3ATP

r2Valor de D0,5(min)Nucleotídeo

37

um perfil de inativação térmica monofásico, o ponto de inativação irreversível ainda

não teria sido alcançado.

Dessa forma poderíamos explicar o comportamento da curva de inativação

térmica obtida quando ATP foi utilizada como substrato de duas maneiras: a primeira

delas a hidrólise de ATP estaria sendo catalisado por pelo menos duas enzimas

diferentes, uma com a mesma cinética de inativação observada para a hidrólise de

p-NP-TMP, e outra um pouco mais termo resistente; a segunda interpretação seria

que a enzima responsável pela hidrólise de ATP estaria alcançando o ponto de

inativação irreversível em um tempo menor que as demais, deixando claro sua

diferença estrutural em relação às outras. Qualquer que seja a interpretação

adotada, a hidrólise de ATP, catalisada pelo veneno, conta com pelo menos uma

estrutura protéica diferente das envolvidas na catálise dos outros substratos.

4.1.2. Gráfico de segunda ordem da curva de inativação térmica

Para testar se a hidrólise de ATP estaria sendo realmente catalisada por uma

estrutura diferente das demais, os mesmos resultados foram representados agora

como um gráfico de segunda-ordem (Matthews et al. 1987). O gráfico é feito a partir

do logaritmo natural da razão entre a atividade inicial e a atividade remanescente no

tempo t (A0/AT). As curvas apresentaram diferentes inclinações confirmando a

existência de diferentes estruturas responsáveis pela hidrólise dos substratos, ATP,

ADP, AMP e p-NP-TMP (Figura 3). Os valores de m obtidos a partir da regressão

linear dos pontos da figura 3 estão apresentados na Tabela II.

4.2. Efeito de Cisteína e do Fluoreto de sódio sobre as atividades nucleotidásicas presentes no veneno de Bothrops jararaca.

Um outro recurso aplicado para auxiliar a caracterização de enzimas foi a

utilização de inibidores específicos. Nós testamos o efeito de dois inibidores

clássicos de atividades tipo fosfoesterhidrolases, o fluoreto de sódio (NaF 10mM)

inibidor de fosfatases ácidas de venenos (Tu e Chua, 1966) e a cisteína (Cys 5mM)

potente inibidor de fosfatases alcalinas (Suzuki e Iwanaga, 1958 a e b) e

fosfodiesterases (Razzell e Khorana, 1959) de venenos. Os inibidores foram

38

Figura 3. Gráfico de segunda-ordem dos resultados de estabilidade térmica das atividades nucleotidásicas. O gráfico de segunda-ordem foi feito a partir da razão entre a atividade inicial e a atividade remanescente no tempo t (A0/AT). Painel A perfil de estabilidade térmica para ATP, ADP, AMP, p-NP-TMP e p-NPP. Painel B detalhe evidenciando a diferença de sensibilidade térmica das estruturas responsáveis pela hidrólise de ADP e AMP.

Tempo (min)0 10 20 30 40 50

ln (A

0/A

T)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

AMP ADP

Tempo (min)0 10 20 30 40 50

ln (A

0/A

T)

0

1

2

3

4

5AMPADP ATPp-NTPpNPP

A

B

Tempo (min)0 10 20 30 40 50

ln (A

0/A

T)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

AMP ADP

Tempo (min)0 10 20 30 40 50

ln (A

0/A

T)

0

1

2

3

4

5AMPADP ATPp-NTPpNPP

A

B

39

TABELA II. Valores de m do gráfico de segunda-ordem. Os valores de m foram obtidos a partir a regressão linear das curvas dos gráficos de segunda-ordem da Figura 3. Os resultados apresentados são a média de três experimentos (n=3).

0,9881,1 x 10-30,1189p-NPP

0,9972109 x 10-20,1047p-NP-TMP

0,98970,4 x 10-20,0832ATP

0,98431,0 x 10-20,0181AMP

0,98413,0 x 10-20,0135ADP

r2Taxa de Inibição(nU/s)

Coef. angular

(m)Nucleotídeo

0,9881,1 x 10-30,1189p-NPP

0,9972109 x 10-20,1047p-NP-TMP

0,98970,4 x 10-20,0832ATP

0,98431,0 x 10-20,0181AMP

0,98413,0 x 10-20,0135ADP

r2Taxa de Inibição(nU/s)

Coef. angular

(m)Nucleotídeo

40

testados sobre as atividades nucleotidásicas utilizando ATP, ADP, AMP, p-NP-TMP

e p-NPP como substratos. Quando cisteína (5mM) foi adicionada ao meio de reação

praticamente aboliu as atividades de hidrólise de ATP e p-NP-TMP, porém não

apresentou efeito inibitório sobre a hidrólise de ADP, AMP e p-NPP Figura 4A.

Desse grupo de atividades resistentes a cisteína só a 5'-nucleotidase já teve esse

efeito relatado (Björk, 1964 e Campos e Yarleque, 1974). O efeito da cisteína sobre

as atividades de hidrólise de ATP e p-NP-TMP sugere que as enzimas envolvidas na

catálise desses substratos apresentem similaridades estruturais. No entanto quando

trocamos cisteína por fluoreto de sódio (NaF) as atividades alteradas passam a ser

as de hidrólise de AMP, ATP e p-NPP, não sendo observado qualquer efeito

inibitório sobre as atividades de hidrólise de ADP e p-NP-TMP, Figura 4B. A Tabela

III apresenta os percentuais de inibição e os valores de p obtidos para cada

atividade.

O conjunto de resultados apresentados até agora, tanto de inativação térmica

como de efeito de inibidores, demonstra claramente que cada atividade testada é

catalisada por uma enzima diferente, sugerindo portanto que o veneno de Bothrops

jararaca apresenta uma ADPase e uma ATPase independentes como parte do

conjunto de enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos presente no

veneno de Bothrops jararaca.

Assumindo a existência de uma ADPase e de uma ATPase independentes nós

estudamos a cinética de hidrólise de nucleotídeos em diferentes condições

experimentais procurando compreender o papel global dessas enzimas no

envenenamento.

4.3. Estudo do metabolismo de nucleotídeos catalisado pelo veneno de Bothrops jararaca.

4.3.1. Influência do pH sobre as atividades hidrolíticas de ATP, ADP, AMP,

p-NP-TMP e p-nitrofenil fosfato catalisadas pelo veneno bruto de B.

jararaca

As curvas de variação da atividade enzimática em função do pH do meio

refletem o pH no qual importantes grupos trocadores de prótons presentes no sítio

41

Figura 4. Efeito inibitório de cisteína e Fluoreto de sódio sobre as atividades nucleotidásicas. Os meios de reação e a metodologia para cada atividade foram determinadas como descrito nos métodos. As concentrações de inibidores foram (A) 5 mM Cisteína e (B) 10mM de NaF. Os resultados são a média de pelo menos 3 experimentos (p< 0,05).

p-NP-TMP ATP ADP AMP pNPP0

20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120

140

160

% o

f con

trol

% o

f con

trol

* *

**

*

*

**

*

A

B


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120

140

160

% o

f con

trol

% o

f con

trol

* *

**

*

*

**

*


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120

140

160

% d

o co

ntro

le%

do

cont

role

* *

**

*

*

**

*

A

B


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120

140

160

% o

f con

trol

% o

f con

trol

* *

**

*

*

**

*


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120

140

160


20

40

60

80

100

120

140

160

% o

f con

trol

% o

f con

trol

* *

**

*

*

**

*

A

B


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120

140

160


20

40

60

80

100

120

140

160

% o

f con

trol

% o

f con

trol

* *

**

*

*

**

*


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120


20

40

60

80

100

120

140

160


20

40

60

80

100

120

140

160

% d

o co

ntro

le%

do

cont

role

* *

**

*

*

**

*

A

B

42

TABELA III. Efeito de inibidores sobre as atividades nucleotidásicas correspondentes aos dados da figura 4.

NaF (10 mM) Cisteína (5 mM) Substrato % do

controle D.P. n p % do controle D.P. n p

p-NPP-TMP 96,95 0,963 6 0,000003 5,33 1,31 3 0,01789 ATP 39,02 5,8 3 0,010500 1,53 0,388 4 0,00002 ADP 94,46 10,73 3 0,523000 141,87 30,53 6 0,03420 AMP 24,02 1,65 4 0,003000 177,81 47,00 4 0,01790

p-NPP 54,59 4,32 3 0,012300 91,53 9,0 4 0,00260

43

Figura 5. Efeito do pH sobre as atividades nucleotidásicas. Os ensaios foram feitos como descrito nos métodos, para cada atividade, utilizando os seguintes tampões: Citrato (pH 2,5 a 3,6); acetato (pH 3,6 a 5,6); Tris-Maleico (pH 5,2 a 8,4); Tris-HCl (pH 8,0 a 9,2) e Tris-carbonato (9,2 a 10,6). Nos painéis estão representadas as curvas da influência do pH para (A) ATP, (B) ADP, (C) AMP e (D) p-NPP.

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

600

700

3 4 5 6 7 8 9 10 110

50

100

150

200

250

300

350

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

pH pH

pH pH

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

A B

C D

3 4 5 6 7 8 9 10 110

50

100

150

200

250

300

350

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

3 4 5 6 7 8 9 10 110,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

pH

pH pH

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

A B

C D

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

600

700

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

600

700

3 4 5 6 7 8 9 10 110

50

100

150

200

250

300

350

3 4 5 6 7 8 9 10 110

50

100

150

200

250

300

350

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

pH pH

pH pH

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

A B

C D

3 4 5 6 7 8 9 10 110

50

100

150

200

250

300

350

3 4 5 6 7 8 9 10 110

50

100

150

200

250

300

350

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

3 4 5 6 7 8 9 10 110

100

200

300

400

500

3 4 5 6 7 8 9 10 110,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3 4 5 6 7 8 9 10 110,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

pH

pH pH

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

nmol

/ mg

min-1

A B

C D

44

catalítico estão em seus estados de ionização adequados à catálise. Na Figura 5

observamos as curvas de dependência de pH sobre as atividades de hidrólise de

ATP, ADP, AMP e p-NPP. Com exceção da atividade de hidrólise de p-NPP todas

as atividades apresentaram um pH ótimo muito próximo a pH 8,5. As atividades de

hidrólise de ATP e ADP apresentaram um pH ótimo entre pH 8,5 e 9,2, (Figura 5A e

B); a hidrólise de AMP um pH ótimo entre pH 7,5 e 8,5, (Figura 5C), muito

semelhante aos valores apresentados para diferentes espécies de serpentes entre

pH 7,8 e 9.5, (Iwanaga,1979). A hidrólise de p-NPP apresentou um pH ótimo

próximo de pH 6,8. A dependência do pH para atividade de hidrólise de p-NP-TMP

também foi determinada apresentado pH ótimo semelhante ao das outras atividades

testadas, próximo de pH 8,8 (dados não mostrados). De acordo com esses

resultados todas as atividades, de hidrólise de nucleotídeos, apresentaram um pH

ótimo semelhante (entre pH 8 e 9) sugerindo que essas enzimas possam apresentar

uma atividade proporcional entre elas em qualquer pH no qual estejam inseridas

mantendo assim a eficiência do sistema em transformar ATP em adenosina (ADO).

4.3.2. Curso temporal de hidrólise de nucleotídeos

Com o objetivo de verificar as velocidades iniciais de hidrólise dos substratos

catalisados pelas nucleotidases do veneno de Bothrops jararaca, e estimar a

estequiometria de liberação de fosfato a partir da hidrólise dos nucleotídeos,

acompanhamos o curso temporal de hidrólise de ATP, ADP, AMP, p-NP-TMP e p-

NPP. Nesse ensaio foram utilizados meios de reação contendo: 20 mM de Tris-HCl

pH 8,8; 5 mM de MgCl2; 3mM de nucleotídeos (ATP ou ADP ou AMP) ou 0,5mM de

p-NP-TMP. Para a atividade de hidrólise de p-NPP utilizamos um meio idêntico

tamponado em pH 6,8 contendo 10 mM de p-NPP (Figura 6). Como podemos

observar o veneno de Bothrops jararaca hidrolisa p-NP-TMP e AMP com uma

velocidade muito superior à observada para a hidrólise de ATP, ADP e p-NPP. A

estequiometria de liberação de fosfato a partir da hidrólise dos nucleotídeos foi

calculada em função da quantidade de fosfato (Pi) liberado no meio após a exaustão

da reação. Esse ponto foi considerado alcançado após decorrer três vezes o tempo

necessário para saturar a curva de hidrólise de substrato em função do tempo.

Nessas condições ATP (3mM) libera um pouco mais de 2 moles de Pi para cada

mol de ATP hidrolisado, diferente dos 3 moles de Pi por mol de ATP esperados já

45

Figura 6. Curso Temporal de hidrólise de nucleotídeos. Os ensaios foram feitos em um meio de reação contendo: 50 mM de tampão MOPS-Tris pH 8,0; 3 mM de MgCl2: 3 mM de substrato (ATP ou ADP ou AMP); 0,08 mg/mL de v.b. de Bothrops jararaca. Nos tempos indicados foram retiradas alíquotas de 0,1 mL de meio de reação e o fosfato liberado determinado segundo descrito nos métodos. Nas hidrólises de p-NP-TMP e p-NPP foi determinado o p-nitrofenol liberado no meio de reação a 400 e 410 nm respectivamente. A atividade de hidrólise de p-NPP foi feita em pH 6,8.

Tempo (min)0 10 20 30 40 50 60 70

nmol

es/m

g

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

p-NP-TMP p-NPP AMP ATP ADP

46

Pi liberado razão

nmol / mg min-1 AxP / Pi

ATP 29,13 1:2,4

ADP 56,22 1:1,6

AMP 1444 1:1

TABELA IV. Velocidade inicial de hidrólise dos nucleotídeos (mM) e estequiometria de liberação de Pi. As medidas de velocidade de hidrólise de nucleotídeos foram determinadas em um meio de reação contendo: 50 mM de tampão MOPS-Tris pH 8,0; 3 mM de MgCl2; 3 mM de substrato (ATP ou ADP ou AMP); 0,08 mg/mL de v.b. de Bothrops jararaca. A proporção AxP/Pi foi determinada após a exaustão do substrato no meio reacional.

47

que o veneno apresenta a capacidade de hidrolisar ATP, ADP e AMP. A hidrólise de

ADP também produziu menos Pi que o esperado, um pouco mais de 1,5 mol por mol

de ADP, Tabela IV. Em função desse resultado resolvemos investigar as vias de

hidrólise de ATP, ADP e AMP catalisadas pelo veneno de Bothrops jararaca.

Apenas a quantificação da liberação de Pi no meio de reação não representa

um bom método para determinação da seqüência de reações de uma via metabólica

onde todas as enzimas envolvidas atuam liberando Pi a partir da hidrólise dos seus

substratos (ATP ADP e AMP). Dessa forma aplicamos um modelo experimental

onde fosse possível quantificar paralelamente o fluxo de nucleotídeos presente no

meio reacional, utilizando HPLC, enquanto se dosava o fosfato inorgânico liberado

no meio.

4.4. Determinação do mecanismo de hidrólise de ATP por HPLC.

A Figura 7 mostra o fluxo de intermediários formados durante a hidrólise de

ATP. Quando 3 mM de ATP são incubados com veneno de Bothrops jararaca, ATP

tem seus grupamentos fosfatos retirados seqüencialmente até formar adenosina

sendo possível detectar a presença de intermediários como ADP e AMP Figura 7 de

B a D. A Figura 7E mostra o acompanhamento detalhado da hidrólise de ATP. Nos

primeiros minutos de reação todas as enzimas envolvidas estão trabalhando. Após

400 minutos a hidrólise de AMP e ADP sofre retro inibição por Pi ou ADO, sendo

abolidas, enquanto a hidrólise de ATP continua. Esse resultado pode explicar a

estequiometria de liberação de fosfato observadas quando utilizamos altas

concentrações de ATP e ADP como mostrado anteriormente.

A mesma abordagem foi utilizada para baixas concentrações de ATP (100μM)

(Figura 8), nessas condições aparentemente o ATP é diretamente transformado em

adenosina sem que seja possível observar a presença de intermediários no meio. Na

(Figura 8D) podemos observar que a produção de adenosina (ADO) a partir de ATP

é linear com uma proporção de 1:1 ATP/ADO. A dosagem de fosfato revelou que

apenas 200 nmoles de Pi são produzidos a partir dos 200 nmoles de ATP

adicionados ao meio de reação, apresentando uma estequiometria de 1:1 ATP/Pi

(Figura 9). O método usado detecta somente fosfato inorgânico livre (Pi), não

detectando PPi ou PPPi. Esse resultado nos leva a uma única interpretação que a

hidrólise de ATP catalisada pelo veneno em baixas concentrações de substrato

48

Figura 7. Análise dos produtos de hidrólise de ATP (3mM) por HPLC. Os nucleotídeos foram analisados usando um sistema HPLC equipado com uma coluna de troca aniônica. Nos tempos indicados foram retiradas alíquotas de meio de incubação (50 μl) e imediatamente colocadas em nitrogênio liquido. As amostras foram posteriormente descongelas, por um minuto a temperatura ambiente, e imediatamente injetadas na coluna equilibrada com tampão A. Os nucleotídeos foram eluídos com um gradiente contínuo dos tampões A e B, sob um fluxo de 1 mL/min. A identidade de cada nucleotídeo foi determinada a partir dos tempos de retenção utilizando padrões autênticos monitorando a absorbância a 259nm (painel A). Painéis de B a D perfil cromatográfico após a hidrólise de ATP (3mM em condições iniciais). Painel E curso temporal de liberação dos produtos de hidrólise de ATP.

A

B

C

1016 min

50

0

50

0100

50

0100 570 min

100

0 5 10

0 200 400 600 800 1000 12000

10

20

30

40

50

0 200 400 600 800 1000 12000

50

100

150

mAb

s25

9 nm

( ●) A

DP

(○) A

MP(

▼) A

DO

(nm

ol)

(□) ATP(nm

ol)

Time (min)

Time (min)

0100

50

D

EA

13.015

13.015

ATP13.015

10.09

10.09

10.09

7.39

7.39

7.39

3.67

3.67

3.67

ADP10.09

AMP7.039

ADO3.67

0 min13.015

A

B

C

1016 min

50

0

50

0100

50

0100 570 min

100

0 5 10

0 200 400 600 800 1000 12000

10

20

30

40

50

0 200 400 600 800 1000 12000

50

100

150

mAb

s25

9 nm

( ●) A

DP

(○) A

MP(

▼) A

DO

(nm

ol)

(□) ATP(nm

ol)

Time (min)

Time (min)

0100

50

D

EA

13.015

13.015

ATP13.015

10.09

10.09

10.09

7.39

7.39

7.39

3.67

3.67

3.67

ADP10.09

AMP7.039

ADO3.67

0 min13.015

49

Figura 8. Análise dos produtos de hidrólise de ATP (100μM) por HPLC. Os nucleotídeos foram analisados usando um sistema HPLC conforme descrito na figura. Nos Painéis de A a C perfil cromatográfico após a hidrólise de ATP (100μM em condições iniciais). Painel D apresenta o gráfico das concentrações de purinas no meio de reação em função do tempo. (●) ATP, (○) ADO e (■) purinas totais.

50

100

0100

min

mAb

s

50

0

A B

DC

Purine(μM

)

13.015

13.015

3.67

3.67

3.67

50

100

0100

min

mAb

s

50

0

A B

DC

Purine(μM

)

13.015

13.015

3.67

3.67

3.67

50

Figura 9. Análise estequiométrica dos produtos de hidrólise de ATP por HPLC. 200 nmoles de ATP foram incubados a 37 C em um meio contendo: 50 mM de Tris-HCl pH 8,0; 5 mM de MgCl2; e 100 μg/mL de veneno. Na figura estão representados as quantidades de substratos presente no meio de reação (●)ATP; (○) ADO e (▼) Pi. O fosfato inorgânico foi determinado colorimetricamente como descrito em métodos.

0 10 20 30 40 50

0

50

100

150

200

250ATPADOPi

mm

oles

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0

50

100

150

200

250ATPADOPi

mm

oles

Tempo (min)

51

TABELA V. Velocidade inicial de hidrólise dos nucleotídeos (μM)

e estequiometria de liberação de Pi.

Pi liberado razão

nmol / mg min-1 AxP/ Pi

ATP 58,5 1:1

ADP 164,5 1:2

AMP 1342,8 1:1

As medidas de velocidade de hidrólise de nucleotídeos foram determinadas por HPLC utilizando um meio de reação contendo: 50 mM de tampão Tris pH 7,2; 3 mM de MgCl2: 22,5 mM de NaCl; 200 μM de ATP ou ADP ou AMP; 0,025 mg/mL de v.b. de Bothrops jararaca. A proporção AxP/Pi foi determinada após a exaustão do substrato no meio reacional.

52

Figura 10 - Esquema proposto para o metabolismo de ATP catalisado pelo veneno de Bothrops jararaca. A rota utilizada quando ATP esta em baixas concentrações (100μM) é 2 vezes mais rápida que a observada para altas concentrações (3mM)

ADP

AMP

ADO

Pi

Pi

Pi

PPi

ATP-pirofosfatase/PDE

ATPase

ADPase

5'-nucleotidase

ATP

ADP

AMP

ADO

Pi

Pi

Pi

PPi


ATPase

ADPase

5'-nucleotidase

ATPBaixo ATP

[100μM]Alto ATP

[3mM]

ADP

AMP

ADO

Pi

Pi

Pi

PPi


ATPase

ADPase

5'-nucleotidase

ATP

ADP

AMP

ADO

Pi

Pi

Pi

PPi


ATPase

ADPase

5'-nucleotidase

ATPBaixo ATP

[100μM]Alto ATP

[3mM]

53

apresenta como produtos adenosina, fosfato inorgânico e pirofosfato como

representada pelo esquema de reação abaixo.

ATP → ADO + PPi + Pi

Na Tabela IV observamos a estequiometria de liberação de fosfato a partir de

ATP, ADP e AMP utilizando a mesma metodologia acima. A partir desse conjunto de

resultados, propomos os seguintes esquemas de reação para o metabolismo de ATP

e ADP catalisado pelo veneno (Esquema I).

4.5. Parâmetros cinéticos das atividades fosfatásicas do veneno.

Uma vez conhecida a estequiometria de liberação de fosfato para ATP, ADP e

AMP os parâmetros cinéticos para hidrólise desses substratos a partir do fosfato

liberado no meio de reação foram determinados, mesmo utilizando veneno bruto.

Isso foi possível uma vez que as atividades se comportam como um sistema

acoplado de degradação de ATP onde o último passo, de hidrólise de AMP, não

limita a velocidade dos passos anteriores apresentando uma velocidade bem mais

alta. A Figura 11(Figura 11 de A a C) mostra a representação de Michaelis-Menten

para o gráfico de concentração de substrato versus velocidade de formação de

produto para as três atividades e o gráfico recíproco de Lineweaver-Burk (Figura

11D). A velocidade de formação de produto aumenta com o aumento da

concentração de substrato de acordo com uma hipérbole retangular. O valor de KM

para atividades ATPase/PDE calculado a partir de três experimentos foi de 93,18 ±

5,91 μM e sua VMáx. 373,71 ± 18,38 nmoles de Pi/ mg min-1 (Fig. 11A). A atividade

ADPase tem um valor de KM de 336,56 ± 14,89 μM e de VMáx. de 311,56 ± 5,65

nmoles de Pi/ mg min-1 (Fig. 11B) (n=3). O valor de KM para a atividade AMPase foi

472,0 ± 9,73μM VMáx. 2056,75 ± 241,34 nmoles de Pi/ mg min-1 (Fig. 11C) (n=3). Os

valores de KM foram obtidos a partir das velocidades iniciais considerando as

velocidades abaixo de 80% da velocidade na saturação. A razão VMax/KM revela que

a AMPase apresenta uma eficiência catalítica ligeiramente maior que a ATPase e

mais de quatro vezes superior a da ADPase. A razão das velocidades máxima da

ATPase/ADPase foi de 1:1 e da AMPase/ATPase de 5.5:1.

54

Figura 11. Determinação dos parâmetros cinéticos de hidrólise dos nucleotídeos. Os painéis de A à C representam os gráficos de Michaelis-Menten para as hidrólise de (A) ATP, (B) ADP e (C) AMP. 100 μg de veneno foram incubados a 37oC com diferentes concentrações indicadas em um meio de reação contendo: ≥ 5mM Mg2+(livre) e 20 mM de Tris-HCl pH 8,8. Após 10 min as reações foram paralisadas e as concentrações de ortofosfato inorgânico medidas. Painel D gráfico de Lineweaver-Burk para as atividades de hidrólise de ATP (●), (○) ADP e (▲) AMP. Os dados representados foram média de três experimentos e as concentrações de Pi e Mg-AxP foram calculados como descrito em métodos.

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000

100

200

300

400

500

600

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

50

100

150

200

250

-0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

2x10-3

4x10-3

6x10-3

8x10-3

10x10-3

12x10-3

14x10-3

16x10-3

18x10-3

ATPADPAMP

0 100 200 300 400 5000

200

400

600

800

1000

1/V

1/[S]

nmol

Pi /

mg

min

-1nm

olPi

/ m

g m

in-1

[Mg-ATP] (μM)

[Mg-AMP] (μM)

A B

C

nmol

Pi /

mg

min

-1

[Mg-ADP] (μM)D

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16000

100

200

300

400

500

600

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

50

100

150

200

250

-0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

2x10-3

4x10-3

6x10-3

8x10-3

10x10-3

12x10-3

14x10-3

16x10-3

18x10-3

ATPADPAMP

0 100 200 300 400 5000

200

400

600

800

1000

1/V

1/[S]

nmol

Pi /

mg

min

-1nm

olPi

/ m

g m

in-1

[Mg-ATP] (μM)

[Mg-AMP] (μM)

A B

C

nmol

Pi /

mg

min

-1

[Mg-ADP] (μM)D

55

4.6. Fracionamento do veneno de Bothrops jararaca Nos últimos cinqüenta anos nenhum grupo teve sucesso no isolamento das

enzimas envolvidas na hidrólise de ATP e ADP (Aird, 2002) presente em venenos, e

praticamente todas as preparações purificadas de fosfodiesterase e 5'-nucleotidase

são contaminadas com atividade de hidrólise de ATP e/ou ADP, freqüentemente

atribuída a fosfatases não específicas. Na tentativa de entender melhor essa

realidade, aliado ao fato de que pelo menos em termos cinéticos as atividades

ADPase e a ATPase sejam catalisadas por enzimas distintas da outras atividades

fosfoesterásicas, como a 5´-nucleotidase e fosfodiesterase, repetimos alguns passos

percorridos por esses grupos, que buscaram o isolamento dessas enzimas, na

tentativa de obter respostas que possam esclarecer esse fato.

Na tentativa e isolar e purificar a atividade ADPase foram utilizadas técnicas

cromatográficas e eletroforéticas, tais como: cromatografia por exclusão molecular

(sephacryl-S100); cromatografia de troca iônica (DEAE), cromatografia por afinidade

(Hi-Trap Blue) e eletroforese não desnaturante.

4.6.1 Fracionamento por cromatografia de exclusão molecular Como primeira abordagem de isolamento das atividades nucleotidásicas do

veneno, utilizamos cromatografia por exclusão molecular objetivando obter uma

preparação enriquecida com as atividades de interesse, uma vez que os dados

literários, pelo menos para outras serpentes, indicavam que todas as enzimas com

atividade nucleotidásica apresentavam uma faixa muito próxima de massas

moleculares, entre 100 e 130 kDa (Iwanaga e Suzuki, 1979). Na Figura 12

observamos o perfil cromatográfico quando utilizamos uma coluna de exclusão

molecular Sephacryl-S100 empacotada manualmente. 30 mg de amostra de veneno

foram diluídos em meio contendo 20 mM deTris-HCl pH 7,2 com 150mM NaCl e

após centrifugação à 15000 rpm por 10 min, o sobrenadante (limpo e transparente)

foi aplicado sobre a coluna. Os picos protéicos foram agrupados e nomeados de FI,

FII, FIII, FIV, FV, FVI, FVII e FVIII. Como esperado as atividades eluíram todas

juntas, no entanto estavam dentro do volume de exclusão da coluna (V0 = 130mL)

entre 60 e 96mL (Figura 12ª). A fração FI apresentou um incremento das atividades

na ordem de 20 vezes quando comparado com o veneno bruto (Figura 12B). A

56

Figura 12. Cromatografia de gel filtração. Painel A 30 mg de veneno bruto de Bothrops jararaca foram diluídos em 2,5 mL do tampão de eluição, Tris-HCl 2,5 mM 150 mM de NaCl pH 7,2, centrifugado e filtrado e aplicado sobre uma coluna de exclusão sephacryl-S100 de 72,5 cm x 2,5 (BioRad), utilizado um fluxo de 1,3 mL/min e coletadas amostras de 2,6 mL e monitoradas espectrofotométricamente a 280 nm, a barra horizontal delimita a região onde estão presentes todas as atividades. Painel B determinação da atividade AMPase no veneno bruto e na fração FI.

Número da Fração0 20 40 60 80 100

AB

S 2

80 n

m

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Tempo min0 20 40 60 80 100 120 140

nmol

es d

e P

i / m

g P

TN

0

100

200

300

400

500

V. Bruto

Pool S-100

nmol

es p

NP/

mg

ptn

0

100

200

300

400

500

600

V.B.

S-100

A

B

Número da Fração0 20 40 60 80 100

AB

S 2

80 n

m

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Tempo min0 20 40 60 80 100 120 140

nmol

es d

e P

i / m

g P

TN

0

100

200

300

400

500

V. Bruto

Pool S-100

nmol

es p

NP/

mg

ptn

0

100

200

300

400

500

600

V.B.

S-100

A

B

FI

FII FIII

FV

FIV FVI

FVII

FVIII

57

Figura 13. SDS-PAGE 12% do veneno bruto e do Pool S100 com β-mercaptoetanol. Foram aplicados 50μg de VB e fração FI sobre o gel e para "corrida" foi aplicada uma voltagem constante de 150V durante 2h a temperatura ambiente.

PM VB FI

66.000

45.000

18.000

14.000

Da

21.000

58

Figura 14 - Cromatografia gel filtração. Amostra de 50 mg de veneno foi aplicada na coluna e eluída com Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0 em um fluxo de 1 mL/min. O perfil de eluíção das proteínas foi monitorado a 280 nm. Os tubos, contendo 2 mL cada, foram agrupados de acordo com os picos protéicos e as frações nomeadas FI a FVIII.

VoVo

59

análise por eletroforese apresentou um resultado bastante surpreendente, o pool S-

100 apresentou uma grande quantidade de proteínas de baixo peso sugerindo que

as proteínas do veneno mostram uma grande tendência de formar complexos

(agregados solúveis), mesmo na presença de 150 mM de NaCl no tampão de

eluíção, (Figura 13). Para diminuir a interação proteína-proteína repetimos o

fracionamento equilibrando a coluna com uma força iônica mais alta (300mM de

NaCl), (Figura 14). Como podemos observar além da coluna resolver melhor o

fracionamento, isolando o pico com atividade (FI), todas as proteínas foram incluídas

dentro do volume de retenção da coluna (> 100mL). Embora o aumento da força

iônica tenha diminuido bastante a interação proteína-proteína, a análise por

eletroforese das frações de alto peso (FI, FII, FIII e FIV) revela ainda a presença de

proteínas de baixo peso eluindo na fração FI, (Figura 15). Essa fração apresentou

proteínas com massas entre 50 e 250kDa, o que sugere a existência de uma grande

força de atração estabilizando esses complexos protéicos. Um outro aspecto

interessante nesse fracionamento está na presença da proteína de 133 kDa que elui

nas frações FI e FII e dentro do volume de retenção dessa coluna, que exclui

proteínas acima de 100 kDa. Esse resultado pode ser interpretado de duas

maneiras: as proteínas de alto peso presente nessas frações poderiam estar

interagindo diretamente com a matriz da coluna, retardando sua saída e

aumentando assim o volume de eluíção, para isso teríamos que assumir que essas

proteínas apresentem uma afinidade muito alta por açúcares, já que essa matriz foi

especialmente desenvolvida visando diminuir a interação de glicoproteínas com a

fase estacionária (matriz formada por esferas de alil dextran e N,N’-

metilenobisacrilamida); uma segunda interpretação seria que a etapa de

concentração das amostras, envolvendo diálise e liofilização, que propiciaria a

interação entre as proteínas formando agregados, solúveis, que são detectados na

eletroforese como proteínas de alto peso. A interação proteína-proteína presente

nessa fração parece bastante forte uma vez que esses oligômeros protéicos de alto

peso se mostram estáveis mesmo na presença de 0,1% de SDS.

4.6.2. Fracionamento por cromatografia de troca iônica (DEAE) A fração FI obtida a partir do fracionamento do veneno em Sephacryl S100 foi

recromatografada em coluna de troca aniônica DEAE. Para minimizar a formação

60

Figura 15 - Perfil eletroforético de algumas frações da Sephacryl S-100. Gel de poliacrilamida (12%) em condições desnaturantes sem β-mercaptoetanol. PM - Marcadores de peso molecular; VB - veneno bruto; FI, FII, FIII e FIV - Frações obtidas na cromatografia em Sephacryl S-100. Para VB,FI,FII e FIII foram aplicados 15 μg fr proteína e para FIV foram aplicados 10μg de proteina. Gel corado com Coomassie.

61

Figura 16 - Perfil eletroforético de algumas frações da DEAE. Um total de 3,0 mg de proteína da fração FI foi aplicada em DEAE Sepharose e eluída com um gradiente não linear, com concentrações de NaCl de 100, 150, 200, 250, 300, e 1000 mM. Tampão A: Tris 20 mM, NaCl 50mM, pH8,0. Tampão B: Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 8,0. Fluxo de eluição 2,5 mL/min. As frações foram nomeadas de acordo com a concentração de sal em que foram eluídas.

62

de agregados a fração FI obtida da Sephacryl S100 foi diretamente diluída em

tampão Tris 20 mM pH 8,0 ajustando a concentração de NaCl para 50 mM. Os 60

mL dessa amostra foram aplicados à coluna em duas etapas utilizando um super-

loop de 30 mL. Na (Figura 16) observamos o perfil de eluíção utilizando um

gradiente descontínuo de NaCl monitorando a presença de proteínas a 280 nm. As

amostras obtidas na DEAE foram agrupadas em frações nomeadas de acordo com

a concentração de NaCl, F100, F150, F200, F250, F300. Para a análise

eletroforética foram retiradas alíquotas de 50 μL das frações e aplicadas sobre um

gel SDS-PAGE 12%. Podemos observar uma grande complexidade protéica, nas

frações F100, F150, F200 e apenas uma proteína majoritária na fração F250 (Figura

17). Mesmo sem a etapa de concentração podemos observar a presença de

proteínas acima de 100kDa. Quando comparamos o perfil protéico das frações

DEAE obtidos em condições desnaturantes com o perfil obtido em condições não

desnaturante, (Figura 18 A), observamos que as proteínas que compõe as frações,

apesar de possuírem as mesmas faixas de massas moleculares, formam agregados

com diferentes padrões de mobilizações eletroforética. Essa diferença também

ocorre na região onde se concentram as bandas com atividades nucleotidásicas

observadas no veneno bruto, (Figura 18C).

4.6.3. Determinação da atividade nucleotidase pelas frações obtidas pela DEAE.

As frações obtidas a partir do fracionamento de FI em DEAE Sepharose

tiveram sua atividade nucleotidásica determinada para a hidrólise de ATP e AMP.

As frações F100, F150, F200 foram capazes de hidrolisar os dois nucleotídeos,

porém apresentando diferenças na capacidade de utilização desses substratos,

enquanto a fração F250, que apresentou uma única banda de 68kDa, só foi capaz

de hidrolisar AMP (Figura 19). As frações que apresentam as duas atividades

(F100, F150 e F200) aparentemente apresentam a mesma composição de

proteínas, levando em consideração a distribuição de massas, contudo existem

diferenças nas quantidades relativas de cada banda, (Figura 17). O padrão de

migração eletroforética das proteínas em gel nativo apresentou diferenças ainda

mais marcantes no padrão de distribuição de bandas entre as frações, (Figura 18).

Essas diferenças de composição protéica, e de comportamento em relação à

63

Figura 17 - Eletroforese em gel das frações da DEAE Sepharose. A SDS-PAGE 12% correu por 2h a uma voltagem constante de 100V. Foram aplicados 15 μg de proteína para FI. Para as frações foram aplicados 50 μl de amostra. Total de proteínas: NR = 3 μg ; F100 = 5 μg; F150 = 6,7 μg; F200 = 10 μg; F250 = 2 μg; F300 não determinada. PM - marcador de peso molecular. A presença de proteínas foi determinada por precipitação com nitrato de prata.

kDa PMkDa PM

64

Figura 18 - Eletroforese em gel não desnaturante das frações da DEAE Sepharose. A PAGE 12% correu por 16h a uma voltagem constante de 100V. Foram aplicados 15 μg de proteína para FI. Para as frações foram aplicados 50 μl de amostra. Total de proteínas: NR = 3 μg ; F100 = 5 μg; F150 = 6,7 μg; F200 = 10 μg; F250 = 2 μg; F300 não determinada. (A) A presença de proteínas foi determinada por precipitação com nitrato de prata. (B) 50μg da Fração FI foram corridas nas mesmas condições anteriores e a presença de proteínas determinada por coomassie blue ou (C) incubada com meio de reação contendo 20mM de Tris-HCl pH 7,0; 3mM de AMP; 3mM de MgCl2 e 20 mM de CaCl2, as bandas com atividade identificadas pela formação de precipitado branco de fosfato de cálcio.

FI FI

A B CFI FIFI FI

A B C

65

Figura 19 - Atividade nucleotidásica das frações da DEAE Sepharose. A atividade nucleotidásica foi feita utilizando um meio de reação contendo: 50 mM de Tris pH 8,8; 5mM de MgCl2; 5 mM de ATP ou AMP; 100μl das frações. O fostato liberado determinado pelo método de Fiske e Subarrow.

Fração0 5 10 15 20 25 30 35 40

nmol

es d

e P

i

0

5

10

15

20

25

30AMP ATP

NaC

l mM

0

200

400

600

800

1000

1200

66

formação dos complexos, provavelmente estão relacionados com a utilização

diferenciada dos substratos. Um outro aspecto interessante é que as frações que

apresentaram as duas atividades apresentaram também bandas de alto peso, entre

120 e 130 kDa. Como foram omitidas, nesses experimentos, as etapas de

concentração (diálise e liofização) que poderiam estar favorecendo a formação de

agregados gerando bandas de alto peso nas análises eletroforéticas, as proteínas

de alto peso (acima de 100kDa) presentes na fração devem então apresentar uma

alta afinidade por açúcares, explicando sua presença dentro do volume de retenção

da Sephacryl S100. Essa mesma propriedade poderia também estar relacionada

com a formação e estabilização dos complexos observados na análise por

eletroforese no gel nativo da Figura 18.

Como as frações com atividades obtidas na DEAE apresentaram variações

nas quantidades de proteínas de mesma massa e diferenças significativas no

padrão de migração eletroforética em gel não desnaturante é possível que essas

variações estejam interferindo na estrutura do complexo regulando as atividades

enzimáticas provocando as diferenças nas proporções de atividades ATPase e 5'-

nucleotidase das frações. Essa capacidade de formar complexos certamente deve

estar relacionada também com a freqüente dificuldade observada no isolamento

dessas proteínas. As mudanças na estrutura do complexo durante as etapas de

purificação poderiam estar envolvidas na perda ou diminuição do níveis dessas

atividades dificultando seu isolamento.

4.6.4. Fracionamento por cromatografia de afinidade HiTrap-Blue (Cibacron Blue)

Como nas condições aplicadas no fracionamento pela troca iônica as

atividades co-eluíram, resolvemos utilizar uma coluna de afinidade HiTrap-Blue HP

(5mL) da Pharmacia para FPLC. A coluna foi equilibrada com 20mM de Tris-HCl pH

6,8 (tampão A). 22mg de veneno bruto de Bothrops jararaca foram diluídos em

tampão A, centrifugados a 14000 rpm por 10 min e o sobrenadante aplicado à

coluna utilizando um fluxo de 1mL/min. As proteínas foram eluídas utilizando um

gradiente discreto com tampão B contendo 20mM de Tris-HCl pH 8,8 com 2M e

NaCl nas concentrações de 100, 200, 300, 400, 500 600 e 2000 mM (Figura 20).

Em cada etapa foram passados 3 vezes o volume da

67

Figura 20. Cromatografia de afinidade HiTrap Blue. Um total de 22 mg de veneno foram aplicados em HiTrap Blue HP e eluída com um gradiente não linear, com concentrações de NaCl de 100, 200, 300, 400, 500, 600 e 2000 mM. Tampão A: Tris-HCl 20 mM pH 6,8. Tampão B: Tris-HCl 20 mM, NaCl 2 M, pH 8,8. Fluxo de eluição 1 mL/min. As frações foram nomeadas de acordo com a concentração de sal em que foram eluídas.

Fração0 20 40 60 80 100 120 140 160

280

nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 20 40 60 80 100 120 140 160

% N

aCl 2

M

0

20

40

60

80

100

120

P100

NR

P200

P300P400

P500

P600

P2000

Fração0 20 40 60 80 100 120 140 160

280

nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 20 40 60 80 100 120 140 160

% N

aCl 2

M

0

20

40

60

80

100

120

P100

NR

P200

P300P400

P500

P600

P2000

68

Figura 21. Determinação da atividade nucleotidásica das frações HiTrap-Blue. Para as atividades de hidrólise de ATP, ADP e AMP foi utilizando um meio

de reação contendo: Tris-HCl 20 mM pH 8,8; 5mM de MgCl2; 5mM de substrato

(ATP,ADP ou AMP) e 0,2 mL das frações. As atividades foram determinadas a

partir do fosfato liberado no meio de reação pelo método de Fiske e Subarrow.

Para a atividade p-NP-TMP o meio de reação continha: 50 mM de Tris-HCl pH

8,8; 5 mM de MgCl2; 10 μL das frações HiTrap Blue. A atividade foi monitorada a

410nm.

NaCl mM

0 100 200 300 400 500 600 700

nmol

Pi/m

g m

in-1

(ATP

)

0

50

100

150

200

250

nmol

PN

P / m

g m

in-1

0,0

5,0e+5

1,0e+6

1,5e+6

2,0e+6

2,5e+6

nmol

Pi /

mg

min

-1 (A

DP

)

0

200

400

600

800

1000

nmol

Pi /

mg

min

-1(A

MP)

0

2000

4000

6000

8000

69

Figura 22. Eletroforese em gel das frações da HiTrap-Blue HP. A SDS-PAGE 12% correu por 2h a uma voltagem constante de 100V. Foram aplicados 10 μg de proteína de cada fração: VB (veneno bruto); NR (não retido); P100; P200; P300. PM - marcador de peso molecular. A presença de proteínas foi determinada por precipitação com nitrato de prata.

PM VB NR P100 P200 P300

66

4529

1814

kDa PM VB NR P100 P200 P300PM VB NR P100 P200 P300

66

4529

1814

kDa

70

coluna. As frações obtidas foram agrupadas e nomeadas de acordo com a

concentração de NaCl: NR (não retido), P100, P200, P300, P400, P500, P600 e

P2000. As frações eluídas foram concentradas, em um concentrador Speed Vac. e

a atividade nucleotidásica determinada utilizando ATP, ADP, AMP e p-NP-TMP

como substratos, (Figura 21). As atividades fosfodiesterase (p-NP-TMPase) e 5'-

nucleotidase (AMPase) estão separadas uma da outra porém ambas as frações são

contaminadas com atividade ATPase. A atividade 5'-nucleotidase também co-elui

com a atividade ADPase. Esse resultado reproduz exatamente o panorama das

preparações purificadas de 5'-nucleotidase e fosfodiesterase de venenos obtidas

por outros grupos (Iwanaga e Suzuki, 1979). As amostras com atividade obtidas na

HiTrap Blue foram analisadas por eletroforese (Figura 22). Embora tenhamos

conseguido separar parcialmente as atividades de interesse todas as frações

apresentaram uma grande quantidade de proteínas entre 23 e 45 kDa com massas

moleculares menores que os 100 kDa esperados para essas atividades.

4.6.5. Fracionamento da fração FI em coluna de afinidade HiTrap-Blue. Como as atividades ADPase e 5'-nucleotidase co-eluíram nas condições

anteriores modificamos o protocolo e aplicamos a fração FI (Sephacryl S-100)

enriquecida com as atividades nucleotidásicas na coluna HiTrap-Blue. 20 mg de

fração FI foram diluídos em 2,2 mL de tampão A contendo 20mM de Tris-HCl, pH

8,0. A amostra foi centrifugada e 2mL do sobrenadante foram aplicados a coluna

utilizando um fluxo de 2mL/min. Após passar 5 vezes o volume da coluna de

tampão A (25 mL) as proteínas retidas foram eluídas por gradiente linear de NaCl

de 0 a 100% de tampão B, contendo: 20mM de Tris pH8,0 e NaCl 1M, em 27 min. A

presença de proteínas foi monitorada a 280nm. Após o fracionamento foram

determinadas as atividades de hidrólise de ADP e AMP pelas frações. 50 μL das

frações foram adicionados a um meio de reação contendo 20mM de Tris-HCl, pH

8,8; 3 mM de MgCl2; 3 mM de ADP ou AMP, (Figura 23). Nessas condições foi

possível separar parcialmente as atividades, confirmando os resultados obtidos a

partir dos estudos da cinética de utilização de substratos pelo veneno bruto.

71

Figura 23. Cromatografia de afinidade HiTrap-Blue em gradiente. Um total de 20 mg de FI foram aplicados em coluna HiTrap-Blue HP e eluída com um gradiente linear de 0 a 100% de tampão B: Tris-HCl 20 mM, NaCl 1 M, pH 8,0. Fluxo de eluição 2 mL/min. As atividades de hidrólise de ADP e AMP foram determinada utilizando um meio de reação contendo: 20mM de Tris-HCl, pH 8,8; 3 mM de MgCl2; 3 mM de ADP ou AMP e 50 μL das frações. A atividade foi determinada quantificando o Pi liberado no meio.

Fração

0 10 20 30 40 50

Abs

660

nm

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00ADPAMP

% N

aCl 1M

0

20

40

60

80

100

120

Fração

0 10 20 30 40 50

Abs

660

nm

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00ADPAMP

% N

aCl 1M

0

20

40

60

80

100

120

72

Figura 24 - Fracionamento do veneno em coluna ADP-Sepharose. 33 mg de veneno foram diluídos em tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0 com 100 mM de NaCl. As setas indicam a mudança de tampão primeiro com 0,5 mM de p-NP-TMP, depois com 1 mM de ADP. A proteína foi determinada pelo método de Bradford. O fosfato foi determinado utilizando reagente de Fiske e Subarrow e o p-nitrofenol liberado determinado à 410 nm.

p-NP-TMP

ADP

p-NP-TMP

ADP

73

4.6.6. Fracionamento do veneno utilizando coluna de afinidade ADP-Sepharose

Na tentativa de isolar completamente a atividade ADPase das outras

atividades, o veneno foi fracionado utilizando agora uma coluna de afinidade ADP-

Sepharose Sigma(2mL). 33 mg de veneno foram diluído, em Tampão A contendo

20 mM de Tris, pH 8,0; 100 mM de NaCl, centrifugado e aplicado a coluna de

afinidade. Para que houvesse um maior carregamento de proteínas na coluna a

amostra foi passada 5 vezes pela coluna. Após a aplicação a coluna foi lavada com

50mL de tampão A. As proteínas retidas foram eluídas em tampão contendo 20 mM

de Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM de NaCl com substrato (0,5 mM de p-NP-TMP ou 1mM

de ADP), (Figura 24). Uma vez que todas as enzimas de interesse apresentam

diferentes afinidade por nucleotídeos tentamos eluílas utilizando seu substrato

preferencial. Após o carregamento das proteínas na coluna tentamos eluír a

fosfodiesterase (PDE) com p-NP-TMP. Ao passar pela coluna esse substrato foi

imediatamente hidrolisado liberando p-nitrofenol (produto de cor amarela), no

entanto quando dosamos proteína nessas frações por Bradford nenhuma proteína

foi detectada. A coluna foi então lavada com tampão A e em seguida adicionado

tampão de eluíção contendo 1 mM de ADP. A fração obtida continha proteína e foi

capaz de hidrolisar todos os substratos (ATP, ADP, AMP e p-NP-TMP). A análise

por eletroforese revelou a presença de uma única banda protéica com massa de

110kDa, (Figura 25A). A massa obtida nessa fração está de acordo com as massas

obtidas em trabalhos de isolamento e caracterização dessas enzimas utilizando gel

filtração: a fosfatase não-específica entre 90 e 100kDa (Sulkowski et. al., 1963;

Suzuki e Iwanaga, 1960); a fosfodiesterase entre 115 e 130 kDa (Frischauf e

Ecksntein, 1973; Philipps, 1975); e a 5'nucleotidase uma massa próxima a 100kDa

(Chen e Lo, 1968, Sulkowski et al. 1963, Suzuki e Iwanaga, 1960). Nos nossos

resultados, também utilizando gel filtração, a fração com atividade elui próximo do

volume morto (V0) da coluna, região esperada para proteínas de massa próxima a

100 kDa. O fato de p-NP-TMP não eluir nenhuma proteína, mas ser hidrolisado ao

passar pela coluna indica que a PDE não esteja ligada à coluna pelo sítio ativo,

permitindo assim que o substrato possa ser hidrolisado. Como ADP eluiu todas as

atividades juntas propomos o seguinte modelo representado na (Figura 26).

74

Figura 25. Eletroforese da fração eluída por ADP da ADP-Sepharose. A SDS-PAGE 12% correu por 2h a uma voltagem constante de 100V. Foram aplicados 15 μg de proteína da fração FADP: PM - marcador de peso molecular. A presença de proteínas foi determinada por Commassie Blue. Painel A na ausência de agente redutor. Painel B na presença de agente redutor na amostra e durante a corrida no tampão do compartimento superior do sistema de eletroforese.

50

30

35

75

105

160250

50

30

35

75

105

160250

A BPM PMkDa kDa

FADP FADP

kDa34333229

50

30

35

75

105

160250

50

30

35

75

105

160250

A BPM PMkDa kDa

FADP FADP

kDa34333229

75

Figura 26. Representação esquemática da eluição das nucleotidases da ADP-Sepharose.

Matriz(Sepharose) ADP

ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

p-NP-TMP

p-NPTMP+

Tampão de eluição com p-NP-TMP

Eluíção

Complexo de nucleotidases


ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

p-NP-TMP

p-NPTMP+


Eluíção



ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP


Tampão de eluição com ADP


ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP

Complexo de nucleotidasesMatriz(Sepharose) ADP

ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP




ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP


Eluíção


ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP


Eluíção


ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

p-NP-TMP

p-NPTMP+


Eluíção



ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

p-NP-TMP

p-NPTMP+


Eluíção



ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP




ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP

Complexo de nucleotidasesMatriz(Sepharose) ADP

ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP




ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP


Eluíção


ADP

ADP

ADP

ADPADP

ADP

ADP

ADP

ADPase

ATPase

5'-nucleotidase

PDE

ADP


Eluíção

76

Nesse esquema as proteínas estariam ligadas uma a outra formando um complexo

que se fixaria à coluna pela ADPase deixando livre o sítio da fosfodiesterase (PDE)

para hidrolisar p-NP-TMP, eluíndo apenas os produtos, timidina-fosfato e p-

nitrofenol (amarelo a pH alcalino). A troca de tampão, contendo ADP removeria o

complexo, explicando a presença de todas as atividades na fração eluída. No

entanto, quando a mesma amostra é corrida na presença de agente redutor (β-

mercaptoetanol), tanto no tampão de amostra como no tampão de corrida, a banda

de 110 kDa origina quatro bandas com massas menores, 34kDa, 33kDa, 32kD e

29kDa, sendo que as duas últimas são mais intensas. Esse resultado sugere que a

proteína de 110kDa é na verdade um oligômero formado por quatro sub-unidades

de massa aproximada de 30kDa. Proteínas apresentando a mesma massa

molecular também aparecem no fracionamento do veneno pela HiTrap-Blue, que

também teve β-mercaptoetanol no tampão de amostra na sua análise eletroforética,

contudo naquele ensaio não foi adicionado agente redutor no tampão de corrida,

podendo ser notada a presença, ainda que em baixa quantidade, de proteínas de

alto peso nessas frações, (Figura 22). A presença de quatro cadeias peptídicas na

presença de agente redutor, coincidindo com quatro atividades presentes na fração,

nos permite especular que cada cadeia presente nessa proteína possa apresentar

um sítio catalítico específico para cada substrato. Esse fato poderia explicar não só

a contaminação das atividades em preparações purificadas de 5´-nucleotidase e

fosfodiesterase por outros grupos, mas também pode explicar de certa forma a

perda de atividade à medida que avançamos no fracionamento durante as etapas

de purificação, retirando algum peptídeo regulador no controle dessas atividades.

4.7. Purificação das nucleotidases em gel de eletroforese não desnaturante.

Em paralelo ao fracionamento por técnicas cromatográficas utilizamos também

eletroforese em condições não desnaturantes com o objetivo de isolar a atividade

ADPase das demais. Em uma primeira abordagem padronizamos as condições de

corrida. Em uma corrida "piloto" utilizamos gel 12%, idêntico ao utilizado nas

análises eletroforéticas das frações obtidas por cromatografia, sem

77

Figura 27. Atividade nucleotidásica em gel de eletroforese em condições não desnaturantes. A PAGE 12% correu por 4h a uma voltagem constante de 100V a 15oC. (A) 50μg de veneno bruto foram aplicadas por poço, as bandas nomeadas B1, B2 e B3 foram cortadas e suas proteínas extraídas por sonicação (B) 50μg do veneno bruto (VB) e da Fração FI foram corridas nas mesmas condições anteriores. As proteínas extraídas de B1, B2 e B3 foram reaplicadas. Os géis foram incubados com meio de reação contendo 20mM de Tris-HCL pH 7,0; 3mM de AMP; 3mM de MgCl2 e 20 mM de CaCl2, as bandas com atividade identificadas pela formação de precipitado branco de fosfato de cálcio.

VB FI B1 B2 B3B1B2B3

B

B1B2

B3

A

VB VB FI B1 B2 B3B1B2B3

B

B1B2

B3

A

VB

78

no entanto adicionar SDS a nenhum dos tampões, (Figura 27). As bandas com

atividade foram identificadas incubando-se os géis com meio de reação contendo:

20mM de Tris pH7,0; 3 mM de MgCl2; 20 mM de CaCl2; 3mM de substrato (ATP ou

ADP ou AMP) ou para atividade fosfodiesterase um meio contento 20mM de Tris-

HCl pH 8,8, 3 mM de MgCl2; 0,5 mM de p-NP-TMP. Nesse pH, o fosfato proveniente

da hidrólise dos nucleotídeos forma facilmente um precipitado insolúvel de fosfato

de cálcio de cor branca, possibilitando a identificação das bandas protéicas com

atividade. A atividade fosfodiesterase também pode ser identificada pela formação

de uma banda amarela, pela hidrólise de p-NP-TMP. Contudo cuidados adicionais

devem ser tomados uma vez que o p-NP (produto de cor amarela) formado é

solúvel, devendo, portanto a marcação ser imediatamente registrada por foto ou por

digitalização antes que o produto se difunda no gel e para o meio de reação. No

painel A vemos o padrão de bandas formadas quando utilizamos AMP como

substrato. Nessas condições podemos observar três bandas no gel, nomeadas de

B1, B2 e B3. B1 praticamente não entra no gel, podendo ser um agregado protéico,

B2 é a banda mais intensa e B3 é a banda de maior mobilidade eletroforética,

porém com uma baixa atividade. O mesmo padrão de bandas pode ser observado

quando comparamos o veneno bruto com a fração FI da Sephacryl S-100, (Figura

27B). As bandas com atividades obtidas no primeiro gel foram cortadas e eluídas

por maceração e sonicação de acordo com método descrito por Retamal et al.

(1999) e novamente submetida a eletroforese não desnaturante, (Figura 27B). O

procedimento permite retirar as proteínas do gel preservando ainda a atividade e o

padrão de mobilidade eletroforética. A banda B1 é formada por um agregado de

proteínas que se desfaz parcialmente após a extração e sonicação sendo possível

observar a presença da banda B2 após o procedimento. Como as bandas se

separaram pouco, buscamos uma melhor condição de corrida utilizando várias

concentrações de acrilamida e em diferentes tempos de corrida. Utilizando um

sistema de eletroforese de placa (Sigma) montamos transversalmente um gel

descontínuo de 7%, 9%, 11%, 13% e 15% e depois corremos no sentido normal

utilizando um gel de empacotamento de 4% e pH 6,8. Os poços para aplicar as

amostras foram ajustados exatamente sobre os diferentes percentuais de

79

Figura 28. Determinação das condições de corrida para a separação das bandas com atividade em gel eletroforese não desnaturante. No painel A, o gel em gradiente descontínuo de concentração de acrilamida, correu a uma voltagem constante de 100V por 4h a temperatura ambiente e as proteínas foram coradas por commassie blue. Ainda no painel A à direita gel 15% com 16 horas de corrida sob refrigeração. No Painel B observamos as bandas com atividade obtidas utilizando géis com diferentes concentrações de acrilamida. As corridas ocorreram a voltagem constante de 100V por 4 horas nos géis de 7, 9, 11, 13 e 15% ou como indicado nas figuras utilizando gel a 15% com tempo de corrida de 9, 12 ou 16h.

7% 9% 11% 13% 15% 15%/9h 15%/12h 15% 16h

7% 9% 11% 13% 15% 15% 16hA

B7% 9% 11% 13% 15% 15%/9h 15%/12h 15% 16h7% 9% 11% 13% 15% 15%/9h 15%/12h 15% 16h

7% 9% 11% 13% 15% 15% 16hA

B

80

acrilamida e a corrida executada a voltagem constante de 100V por 4h, (Figura 28). É possível observar que ocorre aumento de resolução das bandas protéicas

diretamente relacionado ao aumento do percentual de acrilamida, (Figura 28A).

Esse aumento de resolução é também acompanhado pela melhor separação das

bandas com atividade (Figura 28B), no entanto apesar de bem definidas as bandas

ficam muito próximas dificultando o corte do gel, para posterior purificação das

proteínas. Esse problema foi parcialmente resolvido aumentando o tempo de

corrida, onde obtivemos um aumento da separação das bandas de atividade a

partir de 12h de corrida. Nessas condições são perdidas algumas proteínas de

maior mobilidade eletroforética (na parte inferior do gel), mas são preservadas todas

as proteínas de interesse que apresentam uma baixa mobilidade eletroforética,

(Figura 28A e B) gel 15% 16h de corrida.

4.7.1. Determinação das atividades nucleotidásicas em gel não desnaturante.

Uma vez padronizadas as condições de corrida preparamos um gel 15% e

corremos a uma voltagem constante de 100V por 20h sob refrigeração. Após a

corrida o gel foi cortado no sentido dos poços e as fatias obtidas incubadas em meio

de reação contendo: 20 mM de Tris pH 8,8; 3 mM de MgCl2; 20 mM de CaCl2; 3mM

de ATP ou ADP ou AMP ou 0,5mM de p-NP-TMP (figura 29). Nesse gel podemos

observar que todas as atividades se concentram na banda B2, e em menor

intensidade na banda B1. A banda B3 só esta presente quando o meio de reação

tem ATP ou AMP como substratos.

4.7.2. Determinação da massa nativa das atividades nucleotidásicas por eletroforese não desnaturante (Gel de poro transverso).

A fim de confirmar as massas moleculares das nucleotidases determinadas por

gel filtração e por SDS-PAGE, resolvemos utilizar uma técnica de eletroforese em

gradiente de poro transverso não desnaturante desenvolvida por Retamal e Babul

(1988). Dessa forma foi montado um gel em gradiente de 6% a 18% de acrilamida e

a corrida executada aplicando a amostra no sentido transversal ao sentido do

gradiente. A partir da variação da mobilidade eletroforética das proteínas em

81

Figura 29. Determinação das atividades nucleotidásicas em gel não desnaturante. 50 μg de veneno bruto foram aplicados em cada poço da PAGE não desnaturante que correu a 100V por 20h sob refrigeração. As fatias de gel foram incubadas em meio de reação e as bandas visualizadas por precipitação de fosfato de cálcio (ATP, ADP e AMP) ou por acúmulo de p-NP (p-NP-TMP). As setas indicam a localização de B1, B2 e B3.

ATPADP

AMPp-N

P-TMP

B1

B2

B3

ATPADP

AMPp-N

P-TMP

B1

B2

B3

82

Figura 30. Gel não desnaturante em gradiente de 6 a 18% de acrilamida. 25μg de veneno bruto foram aplicados em cada poço e a corrida feita a voltagem constante de 100V por 16h sob refrigeração. O gel foi incubado em meio de reação contendo: 20 mM de Tris pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 20mM de CaCl2 e 3mM de AMP. As bandas de atividade foram identificadas pela precipitação de fosfato de cálcio. Painel A imagem capturada utilizando um fundo escuro. Painel B determinação da presença de proteínas por commassie blue. Painel C A imagem capturada utilizando um fundo claro. Painel D o meio de reação foi trocado por um meio contento p-NP-TMP, formando uma marcação amarela na banda B2.

A B

C

B1

B2B3

B1

B2

B3

D

A B

C

B1

B2B3

B1

B2

B3

D

83

função da concentração de acrilamida utilizando a formula 100log (Rf x 100)

construímos um gráfico de Fergunson (1964) e calculamos as pendentes negativas

das curva de migração eletroforética das atividades (m). As massas moleculares

das proteínas foram determinadas utilizando uma curva padrão, obtida nas mesmas

condições, construída a partir das pendentes (m) extraídas da tese de Retamal

(1988) com os seguintes valores: 2,44 (α-lactoalbumina, 14kDa) ; 3,88 (anidrase

carbônica, 29 kDa); 5,68 (ovoalbumina, 45 kDa); 6,58 (albumina bovina

(monômero), 66 kDa); 9,6 (albumina bovina (dímero), 132 kDa); 14,7 urease

(trímero), 272 kDa); 24,2 (urease (hexâmero), 545 kDa) apresentada na (Figura

31C). Na figura 30 observamos a variação de mobilidade das bandas de atividade

utilizando um gel em gradiente de 6 à 18% de acrilamida, a corrida ocorreu a

voltagem constante de 100V por 16h sob refrigeração. O gel foi incubado em meio

de reação contendo: 20 mM de Tris pH 8,8; 3 mM de MgCl2; 20mM de CaCl2 e 3mM

de AMP. Figura 30A as bandas com atividade apresentando precipitação de fosfato

de cálcio foram contrastadas utilizando um fundo escuro. A distribuição de proteínas

no gel revelado por commassie blue, Figura 30B. Figura 30C precipitação de fosfato

de cálcio utilizando um fundo claro. Figura 30D o gel após a marcação, por

precipitação de fosfato de cálcio, teve o meio de reação trocado por um meio

contendo p-NP-TMP como substrato, marcando a banda B2 de amarelo. Como a

marcação da porção superior da banda B2 parece ter migrado diferente da

marcação da porção inferior, determinamos as massas a partir dos Rfs dividindo a

banda B2 em B2a e B2b segundo diagrama da (Figura 31A). A banda B1 não teve

sua massa determinada por que não entra no gel mesmo em baixas concentrações

de acrilamida. A partir dos gráficos de Fergunson obtivemos os seguintes valores de

m: Banda B2a m= 9,2 correspondendo a uma massa de 120 kDa, B2b m=8,0

correspondendo a uma massa de 93 kDa e B3 m=6,1 correspondendo a uma

massa de 68 kDa. A determinação da massa nativa, das proteínas com atividade

nucleotidásica, também foi feita a partir das bandas purificadas de B2 e B3. Nesse

segundo ensaio reproduzimos exatamente as condições utilizadas na construção da

curva padrão descrita por Retamal (1988), gel em gradiente de 6% a 18% 100V e

tempo de corrida de corrida de 4h. Nesse ensaio fizemos uma corrida preparativa

em gel 15% por 20h e 100V sob refrigeração. As bandas com atividade, B2 e B3

84

Figura 31. Determinação da massa molecular das bandas de atividade em gel de poro transverso não desnaturante do gel da figura 30. Painel A diagrama identificando os pontos de onde foram determinados os Rfs das bandas com atividade. Painel B Gráfico de Fergunson das bandas B2a, B2b e B3. Painel D tabela com os valores das pendentes negativas (m) e a massa estimada para cada banda.

% Acrilamida

6 8 10 12 14 16 18

100

log

(Rfx

100)

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Banda 2 Banda 3 Banda 4

Molecular Weight14000 29000 45000 66000 132000 272000 545000

Neg

ativ

e Pe

nden

t

2

4

67

10

15

24

B2aB2bB3

686,3Banda 3

928,0Banda 2b

1239,3Banda 2a

KDam

A

B

C

D

♦ Banda 2a◊ Banda 2b

Banda 3

Massa Molecular

Pend

ente

neg

ativ

a

B1

6% 18%

% Acrilamida

6 8 10 12 14 16 18

100

log

(Rfx

100)

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Banda 2 Banda 3 Banda 4

Molecular Weight14000 29000 45000 66000 132000 272000 545000

Neg

ativ

e Pe

nden

t

2

4

67

10

15

24

B2aB2bB3

686,3Banda 3

928,0Banda 2b

1239,3Banda 2a

KDam

A

B

C

D

♦ Banda 2a◊ Banda 2b

Banda 3

Massa Molecular

Pend

ente

neg

ativ

a

B1

6% 18%

85

Figura 32. Determinação da massa das bandas isoladas com atividade em gel nativo. 50μg de veneno/poço foram aplicados em Gel preparativo 15% a 100V por 20h sob refrigeração. (A) Fatia de gel incubada com p-NP-TMP, (B) gel incubado com AMP e Cálcio, as setas indicam direção do corte para a purificação das bandas B2 e B3. (C) Gel em poro transverso da banda B2, proteínas identificadas por commassie blue. (D) Gel em poro transverso da banda B3, proteínas identificadas por precipitação com prata. (E) Gráfico de Fergunson das bandas B2 e B3.

6 % 18%

% de acrilamida6 8 10 12 14 16 18 20

100

log

(Rfx

100)

60

80

100

120

140

160

180

200

Banda 3 m = 9,23 117 kDa Banda 4 m = 6,3 68 kDa

15%A B C

D

15%

E

Banda 2

6 % 18%Banda 3

B2

B3

Δ Banda 2 m=9,2 117kDa

●Banda 3 m=6,3 68kDa

6 % 18%

% de acrilamida6 8 10 12 14 16 18 20

100

log

(Rfx

100)

60

80

100

120

140

160

180

200


15%A B C

D

15%

E

Banda 2

6 % 18%Banda 3

B2

B3

6 % 18%

% de acrilamida6 8 10 12 14 16 18 20

100

log

(Rfx

100)

60

80

100

120

140

160

180

200


15%A B C

D

15%

E

Banda 2

6 % 18%Banda 3

B2

B3

Δ Banda 2 m=9,2 117kDa

●Banda 3 m=6,3 68kDa

86

foram cortadas e as fatias de gel pré-incubadas por 40 min em tampão de amostra

sem SDS. As fatias com as bandas foram montadas em sistema de placa sobre um

gel descontínuo (de empacotamento) polimerizado sobre um gel de separação em

poro transverso de 6 a 18% de acrilamida, (Figura 32). Os Rfs foram então

determinados utilizando um programa de análise densitométricas Gel-Perfect

(Bozzo e Retamal, 1991) e construído um gráfico de Fergunson e determinas as

pendentes negativas para B2 e B3, que apresentaram um valor de m de -9,2 e -6,3,

correspondendo a uma massa de 117kDa e 68kDa, respectivamente. As massas

das bandas purificadas foram muito próximas às observadas utilizando veneno

bruto, mesmo tendo sido utilizados diferentes tempos de corrida. Esse resultado

mostra que o aumento do tempo de corrida não interferiu na inclinação da curva

obtida pelo gráfico de Fergunson. A banda B2 que contém todas as atividades

apresentou a massa molecular que havia sido determinada por gel filtração ou por

eletroforese da fração obtida pela ADP-Sepharose, (110kDa). A banda B3 que

apresenta marcação na presença de AMP possui uma massa igual a da proteína

presente na fração F250 obtida na DEAE que coincidentemente também hidrolisa

AMP.

Os resultados em gel nativo se tornam bastante interessantes quando

comparamos com os resultados obtidos utilizando a coluna de afinidade ADP-

Sepharose. A fração obtida na ADP-Sepharose apresentava uma massa

aproximada de 110kDa e todas as atividades. Essa banda (110kDa) dava origem a

quatro proteínas de baixo peso, sendo duas de maior intensidade com massa

aproximada de 30kDa (33kDa, 29kDa), quando tratada com agente redutor. A

banda de 68kDa (B3) em gel nativo não apresenta todas as atividades, como

podemos observar na figura 29, onde não é possível observar marcação dessa

banda na presença de ADP e nem de p-NP-TMP no meio de reação. Esse resultado

a princípio poderia sugerir que a banda B3 fosse um segundo complexo de

nucleotidases menos ativo e que apresenta somente as atividades ATPase e 5`-

nucleotidase. Dessa forma B3 seria na verdade um pedaço do complexo presente

em B2 que perdeu duas cadeias de 30 kDa. A perda desses dois fragmentos

coincide com a perda das atividades ADPase e p-NP-TMP pelo complexo e

diminuição das atividades remanescentes. O fato do complexo presente em B3 ser

menos ativo que o presente em B2 sugere que a integridade do complexo seja

importante para manter a atividade catalítica do sistema com um todo, explicando a

87

sucessiva perda de atividade observada durante as etapas de fracionamento

dessas atividades. Dessa forma o complexo de nucleotidases do veneno Bothrops

jararaca seria um tetrâmero de 120kDa. As diferentes bandas observadas em gel

nativo seriam formadas por diferentes estados de agregação, a banda de massa

aproximada de 68kDa (B3) seria um dímero, B2b um trímero com 92 kDa e B2a um

tetrâmero de 120kDa

4.8. Análise bidimensional das proteínas presente nas bandas com atividade em gel nativo

Com o objetivo de conhecer melhor a distribuição de proteínas nas bandas

com atividade, foi feita uma eletroforese bidimensional. Na primeira dimensão

aplicamos 60μg de veneno bruto por poço e corremos um gel não desnaturante com

15% de acrilamida a voltagem constante de 100V por 16h. O gel foi cortado em

fatias no sentido dos poços, uma das fatias foi incubada em tampão com meio de

reação contendo AMP, outra fatia teve as proteínas coradas por commassie blue.

Uma terceira fatia foi incubada por 40 min em tampão de amostra com SDS e β-

mercaptoetanol. Após a incubação o gel foi montado sobre um gel descontínuo com

2 cm de gel de empacotamento sobre um gel de separação 12% com SDS. A

corrida foi feita a 150V por 2h a temperatura ambiente (Figura 33 A). As proteínas

presentes nas bandas com atividade se distribuem entre as massas de 15 a 75kDa.

Apenas a proteína de massa aproximada de 30 kDa está presente em toda a

extensão da região das bandas com atividade.

4.9. Purificação das nucleotidases por eletroforese em gel não desnaturante.

Na tentativa de obter material, por eletroforese, em quantidade suficiente para

purificar as atividades corremos 8 géis nativos, todos de mesmo tamanho, nas

mesmas condições. Foram aplicados 50 μg de veneno por poço em géis com 15%

de acrilamida, a corrida ocorreu a 100V por 16h sob refrigeração. Os oitos géis

correram simultaneamente aos pares utilizando quatro sistemas de eletroforese

Mini-protean III da BIORAD. Após a corrida os géis foram mantidos

88

Figura 33. Análise bidimensional das atividades nucleotidasicas do veneno. Painel A - 60 μg de veneno foram aplicados a um gel 15% sem SDS (1D) e a corrida foi feita a 100V por 16h. A 1D teve as bandas identificadas por atividade (precipitação de fosfato de cálcio) (A) ou por Commassie Blue (B). 2D SDS-PAGE 12% a 100V por 2h e as proteínas identificadas por Commassie Blue (C). Painel B - SDS-PAGE 12% da fração B123 extraída do gel nativo 7%, PM - padrão de peso molecular. O gel correu por 1h à 150V e as proteínas identificadas por Commassie Blue.

kDa PM

25016010575

50

25

3530

1510

A

B

C

B123

kDa72

52

32

23

kDa25016010575

50

35

3025

15

PM B123

A B

kDa PM

25016010575

50

25

3530

1510

A

B

C

B123

kDa72

52

32

23

kDa25016010575

50

35

3025

15

PM B123

kDa PM

25016010575

50

25

3530

1510

A

B

C

B123

kDa72

52

32

23

kDa25016010575

50

35

3025

15

PM B123

A B

89

em refrigeração enquanto uma fatia foi incubada em meio de reação contendo: 20

mM de Tris pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 20 mM de CaCl2 e 3 mM de AMP por 40 min à

37oC. Essa fatia foi utilizada como gabarito para o corte da região com atividade dos

demais géis, contendo as bands B1, B2 e B3. As proteínas foram extraídas do gel

usando 2 mM de Tris-HCl pH 8,0. Após concentrar utilizando um concentrador

Speed Vac uma amostra contendo 20μg da fração, nomeada B123 (relacionando as

bandas 1, 2 e 3), teve sua complexidade protéica analisada por eletroforese

utilizando um gel SDS-PAGE 12%, (Figura 33B). A fração apresentou o mesmo

padrão de distribuição protéica que o observado na bidimensional na região das

bandas com atividade, (Figura 33A) (proteínas indicadas por setas).

4.9.1. Fracionamento do veneno por eletroforese preparativa Devido à baixa mobilidade eletroforética, das proteínas com atividade, em

relação às demais proteínas presente no veneno, tentamos isolar utilizando um

sistema de eletroforese preparativa PREPCELL da BIORAD. O sistema além de

permitir processar uma grande quantidade de proteínas também possibilita a coleta

das amostras eluídas do gel. Foram aplicados 100mg de veneno bruto diluídos em

4 mL de tampão de amostra sem SDS e aplicados ao gel que correu a uma

potência constante de 12W sob refrigeração. A eluíção foi continuamente

monitorada a 280 nm e as frações protéicas retiradas até o retorno da linha de

base, a primeira corrida teve uma duração de 20 horas, sob tempertura controlada à

10oC. As frações protéicas eluídas do gel não apresentaram atividade

nucleotidásica, (figura 34A). O gel foi então cuidadosamente retirado do sistema e

uma fatia incubada em meio de reação contendo 20 mM de Tris pH 7,5; 3 mM de

MgCl2; 20 mM de CaCl2 e 3 mM de AMP por 40 min à 37 oC. As proteínas com

atividade estavam retidas no gel apresentando o mesmo padrão de bandas

observado quando utilizamos o sistema de mini gel, (Figura 34B). Na tentativa de

eluir as proteínas, por eletroforese, repetimos a corrida nas mesmas condições

utilizando um tempo mais longo, 40 horas. Mais uma vez não havia atividade no

eluato e a atividade foi encontrada no gel. Os dois géis foram cortados em quatro

partes no sentido transversal acompanhando a marcação das bandas de atividade.

As proteínas foram extraídas do gel por maceração e sonicação em meio

tamponado. A análise

90

Figura 34. Fracionamento do veneno por eletroforese preparativa não desnaturante. 100 mg de veneno foram aplicados sobre um gel de separação de 8% de acrilamida com potência constante de 12W por 20h a 10C. As proteínas foram eluídas em tampão de corrida 10 vezes diluído utilizando um fluxo de 0,75mL/min. (A) Perfil protéico das proteínas eluídas do gel monitorado a 280nm. As linhas tracejadas mostram atividade nucleotidásica em meio contendo AMP. (B) Determinação da atividade em gel por precipitação de fosfato de cálcio utilizando um meio contendo: 20 mM de Tris pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 20mM de CACl2 e 3mM de AMP.

Abs

280

nm

0.10

0.05

Tempo (horas)

160 8

-_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 0.00

F4

F3

F1F2

A B

Abs

280

nm

0.10

0.05

Tempo (horas)

160 8

-_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 0.00

F4

F3

F1F2

A B

91

Figura 35. SDS-PAGE das frações com atividades extraídas da PAGE preparativa. 50 μg das frações extraídas do gel foram aplicadas em dois géis com 12% acrilamida a 150V por 1h a temperatura ambiente. As amostras foram preparadas sem agente redutor (A) e com agente redutor (B). As proteínas foram identificadas com commassie blue. PM - Padrão de peso molecular.

10

20

30

5060

80

120

250

70

90

PM F1 F2 F3 F4 PM F1 F2 F3 F4

10

20

30

5060

80

120

250

70

90

A B

10

20

30

5060

80

120

250

70

90

PM F1 F2 F3 F4 PM F1 F2 F3 F4

10

20

30

5060

80

120

250

70

90

A B

92

por eletroforese das frações revela que as proteínas estão divididas em dois grupos

um de alto peso com massas entre 120 e 160 kDa, e outro numa faixa próxima a

30kDa, (Figura 35A). No entanto quando utilizamos um tampão de amostra com

agente redutor (β-mercapetanol) as bandas de alto peso desaparecem e se

intensificam as bandas na faixa de 30 kDa. Este resultado confirma que as bandas

com atividade são na verdade oligômeros protéicos formados por cadeias de 30kDa

provavelmente estabilizados por pontes de enxofre. As massas apresentadas para

os complexos nessa preparação estão um pouco acima daquelas determinadas em

estado nativo. Essa variação da massa pode ser atribuída à agregação ao

complexo de peptídeos que estão presentes em grande quantidade na preparação,

podendo ser observados na porção inferior do gel com as amostras tratadas com

agente redutor, (Figura 35B). Esses peptídeos também estavam presentes, em

grande quantidade na análise bidimensional da região com atividade (Figura 33A).

4.9.2. Determinação das atividades nucleotidásicas das frações eluídas da PAGE preparativa (PREPCELL)

As frações extraídas da PAGE preparativa preservavam a capacidade de

hidrolisar os substratos p-NP-TMP, ATP, ADP e AMP. As frações F1 e F3

apresentaram uma atividade global mais intensa que as frações F2 e F4, (Figura

36). No entanto quando expressamos o resultado levando em conta agora a

distribuição relativa das atividades em cada fração, percebemos uma grande

mudança no perfil sugerindo a existência de diferenças na composição das frações

ou diferenças na atividade das enzimas presentes nas frações, (Figura 37). A

análise por eletroforese mostra que todas as frações apresentam bandas de alto

peso. As duas frações de maior atividade, F1 e F3, apresentam uma única banda

de alto peso próximo de 160 kDa. A fração F2 além de apresentar duas bandas de

alto peso uma de 120kDa e outra de 160kDa, essas bandas apresentam uma baixa

concentração de proteína, quando comparadas às bandas de alto peso presente

nas frações F1 e F3. A diminuição da concentração das proteínas de alto peso é

acompanhada pelo aumento da concentração das proteínas de 30kD na fração. A

fração F4 praticamente não possui a banda de 160kDa que parece ter originado a

93

Figura 36 - Determinação das atividades nucleotidásica das frações extraídas do gel preparativo. As atividades de hidrólise de ATP, ADP e AMP foram determinadas pela liberação de Pi no meio de reação utilizando o método de Fiske e Subarrow. O meio de reação continha: 5mM de MgCl2; 50 mM de Tris pH 8,8; 2mM de ATP ou ADP ou AMP e 20 μg/mL das frações. A atividade p-NP-TMP foi determinada pela liberação de fenolato lendo diretamente a 410nm. O meio de reação foi idêntico ao descrito acima substituindo os nucleotídeos por 0,5mM de p-NP-TMP.

F1F2F3F4

F1F2F3F4

94

Figura 37 - Distribuição relativa das atividades nucleotidásicas nas frações obtidas na PAGE preparativa, apresentada na figura 36.

p-NP-TMP AMP ADP ATP

%

0

20

40

60

80F1 F2F3F4

95

banda de 120kDa. Nessa fração também podemos ver um aumento da banda de

baixo peso. Essas mudanças na estrutura do complexo parecem estar relacionadas

com a alteração na capacidade de utilização dos diferentes substratos. Estes

resultados se assemelham bastante com o conjunto de resultados obtidos com gel

nativo, onde observamos que as bandas com atividade diferiam em massa na

ordem de 30 kDa, (120, 92 e 68 kDa) e essas diferenças eram também

acompanhadas de alterações na utilização de substratos (Figuras 25, 27,28).

DISCUSSÃO

94

5. Discussão 5.1. Discussão geral dos resultados

Os resultados descritos nesse estudo demonstram que o veneno de Bothrops

jararaca apresenta, como integrantes do grupo de enzimas envolvidas na hidrólise

de nucleotídeos, uma ADPase e uma ATPase independentes. Os dados obtidos a

partir das curvas de inativação térmica, ação de inibidores e dos mecanismos de

metabolização de ATP, dão suporte a essa afirmativa. Com relação à sensibilidade

térmica todas as atividades apresentaram diferenças nos valores de D (Tabela I)

podendo ser divididas em dois grupos, um que desnatura muito rápido com um valor

de D abaixo de 10 minutos onde estão incluídas as atividades de hidrolise de ATP,

p-NPP e p-NP-TMP, e outro mais termo resistente, que hidrolisa ADP e AMP, com

valores de D acima de 35 minutos. As duas atividades termo resistentes apresentam

diferenças quanto à sensibilidade a fluoreto, a hidrólise de AMP é praticamente

abolida enquanto a de ADP não é afetada. A única explicação para este fato é a

existência de uma ADPase distinta das outras quatro atividades. O sistema conta

com pelo menos duas enzimas envolvidas na hidrólise de ATP. Uma ATPase

clássica que requer uma alta concentração de ATP (3 mM) e apresenta ADP e Pi

como produtos (Fig. 7), e a Fosfodiesterase (PDE) que requer baixas concentrações

de ATP (100μM) e apresenta como produtos AMP e PPi (Fig. 8). Embora ambas

atividades sejam bastante sensíveis à temperatura elas apresentam diferenças

significativas quanto aos perfis de inativação térmica, ATP 3mM apresenta menor

sensibilidade à temperatura e uma curva bifásica enquanto a fosfodiesterase,

monitorada pela hidrólise de p-NP-TMP, é mais sensível e apresenta um perfil

monofásico nas mesmas condições (Figuras 2 e 3, Tabela I). Dessa forma o

metabolismo de ATP até adenosina catalisado pelo veneno de Bothrops jararaca

pode seguir duas rotas, uma rápida e que responde a baixas concentrações de ATP,

na qual estão presentes as enzimas fosfodiesterase e 5'-nucleotidase, e outra mais

lenta e que responde a concentrações mais altas de ATP que promove a retirada

seqüencial dos fosfatos do ATP. Essa via contaria com a ação da ATPase, ADPase

e da 5'-nucleotidase, (Fig. 10). As enzimas da via rápida além de apresentarem a

mesma eficiência catalítica, permitindo um perfeito acoplamento entre as reações

95

não possibilitando que se acumule intermediários durante as reações (Fig. 8 e 11),

são quatro vezes mais eficientes que a rota lenta.

Essas atividades, presentes no veneno de Bothrops jararaca, são eluídas em

um volume que corresponde a uma massa nativa de aproximadamente 100 kDa

determinada por gel filtração (Fig. 14) contudo a análise por eletroforese da fração

com atividade (FI) revelou a presença de proteínas com massas fora da faixa

esperada (entre 50 - 160 kDa), sugerindo uma forte interação entre proteína-proteína

e entre proteína-matriz. Uma fração protéica contendo uma única banda com 110

kDa foi obtida utilizando uma coluna de afinidade ADP-sepharose, essa fração que

foi capaz de hidrolisar todos os substratos, apresentou um comportamento incomum

durante sua eluíção da coluna. Como cada nucleotidase apresenta um substrato

preferencial apresentando diferentes afinidades para cada nucleotídeos, carregamos

a coluna com veneno bruto e tentamos eluir as proteínas utilizando seus substratos

preferenciais. Quando p-NP-TMP foi adicionado ao tampão de eluíção, esse

substrato foi prontamente hidrolisado liberando p-nitrofenol (amarelo em pH

alcalino), no entanto nenhuma proteína foi eluída da coluna nessas condições. As

proteínas só foram eluídas na passagem de ADP. Para que p-NP-TMP fosse

hidrolisado durante sua passagem pela coluna o sítio ativo da fosfodiesterase teria

de estar livre e, portanto não participando da ligação da proteína a coluna. Uma

possível interpretação para esse resultado seria que a proteína estaria se ligando a

coluna não através dos sítios catalíticos, mas sim pela interação com a cadeia

polissacarídica da matriz. Essa explicação foi descartada um vez que todas as

atividades eluíram na presença de ADP. Esse resultado permite uma única

interpretação, que todas as proteínas estivessem ligadas entre si e que a ADPase

estivesse ligada a coluna e portanto a presença de ADP no tampão de eluíção

promoveria a liberação de todo o complexo, conforme ilustrado na figura 26. A fração

eluída apresentou uma única banda com 110 kDa, no entanto quando essa fração

foi tratada com agente redutor a banda de 110kDa da origem a quatro bandas de

baixo peso sendo que duas bandas majoritárias com massa próxima a 30 kDa (29 e

32 kDa). Esse resultado pode explicar por que as atividades sempre eluíam juntas, a

proteína de alto peso (entre 110 a 130kDa) é um oligômero protéico formado por um

conjunto de 3 ou quatro unidades de aproximadamente 29 e/ou 32 kDa. O

fracionamento utilizando gel não desnaturante revelou a presença de três bandas

96

com atividades (Figs. 27, 28 e 29). A determinação das massas das proteínas, por

eletroforese em gel não desnaturante em gradiente de poro transverso, demonstrou

que as bandas com atividade possuíam massas de aproximadamente 120, 92 e 68

kDa (Fig. 31 e 32). Valores muito próximos a estes podem ser obtidos pela

combinação de duas, três ou quatro sub-unidades de 29 e 32 kDa, formando

dímeros, trímeros e tetrâmeros respectivamente. Esse oligômero protéico apresenta

grupamentos SH importantes na sua estabilização, já que ele é totalmente

dissociado na presença de β-mercaptoetanol. Nem todas as subunidades devem ser

estabilizadas por estes grupamentos uma vez que a alta força iônica pode

desorganizá-lo, pelo menos parcialmente, como foi mostrado no fracionamento

utilizando a DEAE (Figs.19), HiTrap-Blue (Figs. 21 e 23) e por eletroforese não

desnaturante (Fig. 29). As bandas de 30 kDa apareceram em todas as análises das

frações semi-purificadas feitas na presença de agente redutor, Figuras 22, 25B, 33 A

e B, 35B.

Esses resultados talvez possam estar relacionados com o fato de nenhum

grupo ter tido sucesso no isolamento das atividades ADPase e ATPase presente em

venenos ao longo desses anos. Um outro fator que talvez tenha dificultado bastante

a interpretação dos resultados de purificação dessas proteínas seja o fato delas

pertencerem a chamada "Superfamília das fosfoesterases". A superfamília apresenta

três seqüências para o mesmo "motivo estrutural" que tem sido coletivamente

conhecido como "motivo estrutural" de assinatura das fosfoesterases (Koonin, 1994;

Zhuo et. al., 1994; Zimmermann, 1996). Essas seqüências conservadas foram

descobertas em vertebrados, invertebrados e bactérias: 5'-nucleotidases (EC

3.1.3.5), ATP-difosfohidrolase de mosquito (Apirase) (EC 3.6.1.5) (Blanchin-Roland

et. al., 1986) Ser/Thr fosfoproteina fosfatase (EC 3.1.3.16) e esfingomielina

fosfomonoesterase (EC 3.1.3.-). Dessa forma como todas essas enzimas

apresentam seqüências comuns fica fácil atribuir a hidrólise de ADP e ATP

catalisada pelo veneno às outras enzimas com maior atividade presente no veneo

como, a fosfodiesterase, a 5'-nucleotidase. No caso especificamente de Bothrops

jararaca esse aspecto se torna um fator ainda mais complicador uma vez que os

resultados apontam para uma única proteína oligomérica multicatalítica que parece

ter a possibilidade de formar, durante as etapas de purificação, diferentes

97

combinações entre as sub-unidades de 29, 32, 34 e 35 kDa que poderiam resultar

em diferentes capacidades de utilização e preferência pelos substratos.

5.2. Hipótese de participação das nucleotidases no envenenamento

As enzimas envolvidas na liberação de purinas estão presentes em todos os

venenos. A presença ubíqua dessas proteínas as coloca em posição de destaque

tanto em termos evolutivos quanto em termos fisiológicos, principalmente quando

relacionamos os diversos efeitos farmacológicos desenvolvidos pelas purinas com

alguns dos efeitos fisiopatológicos observados durante o envenenamento (Aird,

2002). É razoável pensar que cada substância, presente na composição do veneno,

deva estar envolvida em alguma atividade essencial ao processo de

envenenamento. Dentre as muitas funções que esses componentes precisam

desenvolver para que o envenenamento evolua a seu objetivo final, paralisação e

morte da presa, talvez uma das ações mais importantes estejam relacionadas às

ações envolvidas na disseminação dos componentes tóxicos do veneno para todos

os tecidos da vítima. Essa ação recorre sobre o sistema circulatório e envolve

aumento de permeabilidade vascular. O envenenamento botrópico provoca

rapidamente um forte edema local seguido de hemorragia e necrose. O aumento de

permeabilidade que provoca o edema local permite a difusão do veneno para todo o

organismo através do sistema circulatório.

Adenosina é um importante modulador do processo inflamatório (Kowaluk,

1998). A ativação de receptores A3 modula o glicocálix do endotélio capilar

promovendo aumento da permeabilidade vascular provavelmente alterando a trama

formada pelo glicocálix (Platts e Duling, 2004). A modulação de receptores A3

também promove a degranulação de mastócitos que promove um aumentando na

permeabilidade vascular (Shepherd et al., 1996, Tilley et al., 2000).

A modulação do glicocálix por adenosina provavelmente envolve a ação

simultânea sobre receptores A2A e A3 presentes na superfície de células endotéliais,

leucócitos e principalmente mostócitos Figura 38 (Platts e Duling, 2004; Di Virgilio,

et al. 2005).

O glicocálix endotelial é uma dinâmica matriz extracelular na superfície da

célula composta de proteoglicanos, glicoproteínas e proteínas adsorvidas que tem

98

sido envolvido na regulação e modulação do hematócrito do tubo capilar,

permeabilidade e hemostasia. O mecanismo de ação da adenosina esquematizado

na Figura 38 mostra uma potencial ligação entre conhecidos metabólitos teciduais

vasoativos e a adenosina na regulação do glicocálix. Evidências têm se acumulado

indicando que além desses efeitos, adenosina pode modular a resposta das células

endoteliais a estímulos inflamatórios durante o desenvolvimento de lesão

inflamatória. Por exemplo, adenosina suprime a expressão do fator tecidual

estimulado por TNF-β, principal iniciador da coagulação, nas células endoteliais

(Deguchi et al., 1998). Estes efeitos podem estar relacionados com o

desenvolvimento de edema observado durante o envenenamento.

Figura 38. Possível mecanismo envolvido no dano ao glicocálix por adenosina (Platts e Duling, 2004).

Adenosina

Endotélio Mastócito Leucócito

Glicocálix

ROS, cininas, enzimas

MLV

Mudança na tensão da

trama

Adenosina


Glicocálix


MLV

Adenosina


Glicocálix


Adenosina


Glicocálix


Adenosina


Adenosina


Adenosina

EndotélioEndotélio MastócitoMastócito LeucócitoLeucócito

Glicocálix


MLV

Mudança na tensão da

trama

99

Pacientes picados por Bothrops jararaca desenvolvem hemorragia sistêmica e

edema local. Estes efeitos são em parte atribuídos à disfunção de plaquetas

resultando em hipoagregação (Cardoso et al.,1993; Sano-Martins et al., 1997). ADP

e ATP apresentam um papel crucial na ativação de plaquetas, e seus receptores tem

sido considerados potencias alvos para drogas antitrombóticas (Rozalski et al.,

2005), a remoção desses nucleotídeos pode contribuir para efetividade do

envenenamento por Bothrops jararaca (Santoro e Sano-Martins, 2004). O receptor

P2X (1) ATP acoplado aos canais de cátions e dois receptores acoplados a proteína

G P2Y(1) e P2Y(2), seletivamente contribuem para a agregação plaquetária e

formação de trombo (Gachet, 2006). O sistema que controla a sinalização

purinérgica em plaquetária é composto por: uma ecto-nucleosideo trifosfato

difosfohidrolase (apirase), uma ecto-5'-nucleotidase (AMPase) e recentemente

descoberta uma ecto-nucleotideo pirofosfatase/fosfodiesterase (Furstenau et al.

2006), que é bastante similar em relação as atividades ao sistema presente em

veneno de Bothrops jararaca.

As nucleotidases isoladas de venenos são glicoproteinas (Frischauf e

Eckstein, 1973; Oshima e Iwanaga, 1969), a fração contendo todas as atividades

apresentou uma grande afinidade pela matriz estacionária da Sephacryl S-100

mesmo na presença de alta força iônica (figura 12-15). Isto implica a porção glicídica

dessas enzimas permitiria sua ligação ao glicocálix das células direcionando a ação

dessas enzimas sobre estruturas de membrana, aumentando seus efeitos sobre

receptores purinérgicos, atuando, portanto como ecto-nucleotidases exógenas sobre

diversos sistemas celulares como linfócitos, mastócitos e células do endotélio

vascular, regulando seus sistemas purinérgicos de sinalização (Figura 39).

Nós concluímos que o aumento na concentração de adenosina com

conseqüente diminuição das concentrações de ATP e ADP, promovido pelo sistema

de nucleotidases descrito nesse trabalho, pode estar relacionado com o

desenvolvimento de edema e disfunção plaquetária observada na região da picada

durante o envenenamento, levando a um aumento de difusão dos componentes do

veneno causado pelo aumento na permeabilidade vascular. O extravasamento de

fluído vascular para o meio intersticial pode ser importante também na ativação de

vários componentes tóxicos que se encontram inibidos na peçonha. A atividade 5'-

nucleotidase do veneno tem um aumento na ordem de 2 ou 3 vezes após a diálise,

100

esse efeito foi atribuído a retirada de Zn2+, componente do veneno presente em altas

concentrações e que desenvolve um potente efeito inibidor sobre essa atividade

(Suzuki e Iwanaga, 1958 a,b). Um outro exemplo de inibidor de atividade enzimática

presente no veneno é o citrato, que também esta presente em altas concentrações

na composição do veneno, e exerce potente efeito inibidor sobre as proteases do

veneno (Odell et al.,1998). Esses inibidores exercem um efeito protetor da glândula

de veneno contra danos promovidos pela ação de atividades hidrolíticas e tóxicas.

No entanto esses inibidores precisam ser retirados para que o veneno possa

desenvolver seus efeitos sobre os tecidos da presa.

Dessa forma essas enzimas estariam envolvidas no aumento de

permeabilidade vascular que irá permitir que os componentes tóxicos se ativem e se

difundam para todos os tecidos provocando alterações na homeostasia de diferentes

tecidos alvos resultando na paralisação, morte e posterior digestão da presa.

Figura 2. Esquema hipotético da ação do complexo de nucleotidases sobre o sistema de membranas do endotélio vascular.

PDE

5'-N

ATP

Aumento de permeabilidade do

epitélio vascular

COMPONENTES TÓXICOS DO

VENENOOligossacarídeosde glicoproteínas

NUCLEOTIDASESDO VENENO

(Glicoproteínas)

Glicocálix

LUZ DO VASO

MEIO EXTRACELULAR

EPITÉLIOVASCULAR

Plasma

EDEMAAtivação

ATPaseADPase

ADENOSINA

MastócitosLinfócitos

Componentes vaso ativos

EAO, cininas, enzimas

PDE

5'-N

ATP


epitélio vascular




(Glicoproteínas)

Glicocálix

LUZ DO VASO

MEIO EXTRACELULAR

EPITÉLIOVASCULAR

Plasma

EDEMAAtivação

ATPaseADPase

ADENOSINA



cininas, enzimas

PDE

5'-N

ATP


epitélio vascular




(Glicoproteínas)

Glicocálix

LUZ DO VASO

MEIO EXTRACELULAR

EPITÉLIOVASCULAR

Plasma

EDEMAAtivação

ATPaseADPase

ADENOSINA



EAO, cininas, enzimas

PDE

5'-N

ATP


epitélio vascular




(Glicoproteínas)

Glicocálix

LUZ DO VASO

MEIO EXTRACELULAR

EPITÉLIOVASCULAR

Plasma

EDEMAAtivação

ATPaseADPase

ADENOSINA



cininas, enzimas

CONCLUSÕES

106

6. CONCLUSÕES

• Os resultados de purificação revelam uma grande dificuldade no isolamento dessas atividades sugerindo que elas estejam formando um oligômero de massa aproximada de 110kDa que da origem a subunidades de 30 kDa na presença de agente redutor.

• O reagrupamento do oligômero formado por duas, três ou quatro subunidades

catalíticas de 30kDa provoca diferenças na capacidade de utilização de substrato. A forma dimérica parece ser a menor unidade ativa desse sistema.

• Este Complexo apresenta atividades semelhantes às observadas para ecto-

nucleotidases envolvidas na regulação purinérgica de diversos sistemas celulares.

• A ligação desse complexo a sistemas de membranas poderia mimetizar a ação

das ecto-nucleotidases endógenas promovendo alterações na regulação purinérgica pela retirada dos moduladores ATP e ADP, e aumento das concentrações de ADENOSINA.

• O edema decorrente do aumento da permeabilidade vascular induzido por

adenosina permitiria o dreno de vários componentes tóxicos da peçonha, facilitando sua disseminação promovendo um efeito sistêmico do envenenamento.

• A necessidade de disseminação dos componentes tóxicos da peçonha nos

diferentes tecidos da presa é fundamental ao processo de envenenamento de todas as serpentes venenosas, este fato poderia justificar a presença ubíqua das NUCLEOTIDASES em venenos de serpentes.

REFERÊNCIAS

108

6. REFERÊNCIA ACOSTA, A., RAEL, E.D., MADDUX, N.L., LIEB, C.S. (1994). Detection of alkaline

phosphatase in venom by blotting methods. Toxicon 32(2): 227-231.

AGMON, Y., DINOUR, D., BREZIS, M. (1993) Disparate effects of adenosine A1- and

A2-receptor agonists on intrarenal blood flow. Am J Physiol. 265 (6 Pt 2): F802-

F806.

AIRD, S.D. (2002) Ophidian envenomation strategies and the role of purines.Toxicon

40 (4): 335-393.

AIRD, S.D. (2005) Taxonomic distribution and quantitative analysis of free purine and

pyrimidine nucleosides in snake venoms. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol

Biol. 140 (1): 109-126.

ALI, S., MUSTAFA, S.J., METZGER, W.J. (1994) Adenosine-induced

bronchoconstriction and contraction of airway smooth muscle from allergic rabbits

with late-phase airway obstruction: evidence for an inducible adenosine A1

receptor. J Pharmacol Exp Ther. 268 (3): 1328-1334.

AMARAL, C.F., DA SILVA, O.A., GOODY, P., MIRANDA, D. (1985) Renal cortical

necrosis following Bothrops jararaca and Bothrops jararacussu snake bite.Toxicon.

23 (6): 877-885.

AMARAL, C.F., DE REZENDE, N.A., DA SILVA, O.A., RIBEIRO, M.M., MAGALHAES,

R.A., DOS REIS, R.J., CARNEIRO, J.G., CASTRO, J.R. (1986) Acute kidney

failure secondary to ophidian bothropic and crotalid accidents. Analysis of 63

cases. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 28 (4): 220-227.

ANGULO, Y., CHAVES, E., ALAPE, A., RUCAVADO, A., GUTIERREZ, J.M.,

LOMONTE, B. (1997) Isolation and characterization of a myotoxic phospholipase

A2 from the venom of the arboreal snake Bothriechis (Bothrops) schlegelii from

Costa Rica. Arch Biochem Biophys. 15, 339 (2): 260-266.

ARNI, R.K., GUTIERREZ, J.M. (1993) Crystallization and preliminary diffraction data of

two myotoxins isolated from the venoms of Bothrops asper (Terciopelo) and

Bothrops nummifer (jumping viper).Toxicon. 31 (8): 1061-1064.

109

ASSAKURA, M.T., SALOMAO, M.G., PUORTO, G., MANDELBAUM, F.R. (1992)

Hemorrhagic, fibrinogenolytic and edema-forming activities of the venom of the

colubrid snake Philodryas olfersii (green snake). Toxicon. 30 (4): 427-438.

BARBONI, E., KEMENY, D.M., CAMPOS, S., VERNON, C.A. (1987) The purification of

acid phosphatase from honey bee venom (Apis mellifica). Toxicon. 25 (10): 1097-

1103.

BARRAVIERA, B., PEREIRA, P.C.M. (1994) Acidentes por Serpentes do Gênero

“Bothrops”. In: Venenos animais. B. BARRAVIERA Ed., Rio de Janeiro: Editora de

Publicações Científicas LTDA. 261-279.

BARRETT, R.J., DROPPLEMAN, D.A. (1993) Interactions of adenosine A1 receptor-

mediated renal vasoconstriction with endogenous nitric oxide and ANG II. Am J

Physiol. 265 (5 Pt 2): F651-F659.

BELARDINELLI, L., SHRYOCK, J.C., SNOWDY, S., ZHANG, Y., MONOPOLI, A.,

LOZZA, G., ONGINI, E., OLSSON, R.A., DENNIS, D.M. (1998) The A2A

adenosine receptor mediates coronary vasodilation. J Pharmacol Exp Ther. 284

(3): 1066-1073.

BERGER, B.J., BHATTI, A.R. (1989) Snake venom components and their cross-

reactivity: a rewiew. Biochem Cell Biol. 67 (9): 597-601.

BJÖERK, W. (1964) Activation and stabilization of snake venom 5`-nucleotidase.

Biochim. Biophys. Acta (Amst.). 89: 483-494.

BLANCHIN-ROLAND, S., BLANQUET, S., SCHMITTER, J.M., FAYAT, G. (1986) The

gene for Escherichia coli diadenosine tetraphosphatase is located immediately

clockwise to folA and forms an operon with ksgA. Mol Gen Genet. 205 (3): 515-

522.

BOARDER, M.R., HOURANI, S.M. (1998) The regulation of vascular function by P2

receptors: multiple sites and multiple receptors. Trends Pharmacol Sci. 19 (3): 99-

107.

BOEYNAEMS, J.M., PEARSON, J.D. (1990) P2 purinoceptors on vascular endothelial

cells: physiological significance and transduction mechanisms. Trends Pharmacol

Sci. 11 (1): 34-37.

BOMAN, H. (1959) On the specificity of snake venom phosphodiesterase. Ann. N.Y.

Acad. Sci. 81: 800-803.

110

BOZZO, S. e RETAMAL, C. (1991) Geles unidimensionales. Un nuevo método

densitométrico para computadores personales. Arch Biol Med Exp. 24, R-181.

BRADFORD, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt.

Biochem. 72: 248-254.

BRIZZOLARA, A.L., BURNSTOCK, G. (1991) Endothelium-dependent and

endothelium-independent vasodilatation of the hepatic artery of the rabbit. Br J

Pharmacol. 103(1): 1206-1212.

BROWN S.B. (1980). Ultraviolet and visible spectroscopy. An introduction to

spectroscopy to biochemists. In: Brown SB editor. London: Academic Press; p.14-

69.

BURNSTOCK, G. (1978). A basis for distinguishing two types of purinergic receptors. In:

Straub, R.W., Bolis, S. (Eds). Cell Membrane Receptors for Drugs and Hormones:

A Multidisciplinary Approach. Raven Press, New York. 107-119.

BURNSTOCK, G., WARLAND, J.J. (1987) P2-purinoceptors of two subtypes in the

rabbit mesenteric artery: reactive blue 2 selectively inhibits responses mediated via

the P2y-but not the P2x-purinoceptor. Br J Pharmacol. 90 (2): 383-391.

BURNSTOCK, G., WOOD, J.N. (1996) Purinergic receptors: their role in nociception

and primary afferente transmission. Curr. Opinion Neurobiol. 6: 526-532.

CAMPBELL, J.A. e LAMAR, W.W. (1989) The venomous reptiles of Latin America. New

York: Ithaca.

CAMPOS, S. e Yarleque, A. (1974) 5`-nucleotidasa en el veneno de la serpiente

Lachesis muta 1. Bol. Soc.Química Perú XL. 202-212.

CARDOSO, J.L., FAN, H.W., FRANÇA, F.O.S., JORGE, M.T., LEITE, R.P., NISHIOKA,

S.A., AVILA, A., SANO-MARTINS, I.S., TOMY, S.C., SANTORO, M.L.,

CHUDZINSKI, A.M., CASTRO, S.C.B., KAMIGUTI, A.S., KELEN, E.M.A., HIRATA,

M.H., MIRANDOLA, R.M.S, THEAKSTON, R.D.G., AND WARRELL, D.A. (1993)

Randomized comparative trial of three antivenoms in the treatment of envenoming

by lance-headed vipers (Bothrops jararaca) in Sao Paulo, Brazil. QJ med. 86 (5):

315 -325.

111

CAVINATO, R.A., REMOLD, H & KIPNIS, T.L. (1998) Purification and variability in

thrombin-like activity of Bothrops atrox venom from different geographic regions.

Toxicon, 36: 257-267.

CHIPPAUX, J.P., WILLIANS, V., WHITE, J. (1991) Snake venom variability: methods of

study, results and interpretation. Toxicon 29: 1279-1303.

CHUNG, M.C., PONNUDURAI, G., KATAOKA, M., SHIMIZU, S., TAN, N.H. (1996)

Structural studies of a major hemorrhagin (rhodostoxin) from the venom of

Calloselasma rhodostoma (Malayan pit viper). Arch Biochem Biophys. 15; 325(2):

199-208.

CONTI, A., MONOPOLI, A., GAMBA, M., BOREA, P.A., ONGINI,E. (1993) Effects of

selective A1 and A2 adenosine receptor agonist on cardiovascular tissues, Naunyn-

Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 348, 108-112.

CORREA-DE-SÁ, P., RIBEIRO, J.A. (1994) Tonic adenosine A2A receptor activation

modulates nicotinic autoreceptors function at the rat neuromuscular junction. Eur.

J. Pharmacol. 271, 349-355.

COUSIN X, BON C. (1999) Acetylcholinesterase from snake venom as a model for its

nerve and muscle counterpart. J Nat Toxins. 8(2): 285-294

DALTRY, J.C., WÜSTER, W., THORPE, R.S. (1996) Diet and snake venom evolution.

Nature, 379(6565): 537-540.

DALY, J.W., BUTTS-LAMB, P., PADGETT, W. (1983) Subclasses of adenosine

receptors in the cerebral nervous system. Interaction with caffeine and related

methylxanthines. Cell. Mol. Neurobiol. 3: 69-80.

DAVIS, B. J. (1964) Disc electrophoresis. II. method and application to human serum

proteins. Annals New York Academy of Sciences. 121: 404-427.

DE ANDRADE, J.G., PINTO, R.N., DE ANDRADE, A.L., MARTELLI, C.M., ZICKER, F.

(1989) Bacteriologic study of abscesses caused by bites of snakes of the genus

Bothrops. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 31(6): 363-367.

DEGUCHI, H., TAKEYA, H., URANO, H., GABAZZA, E.C., ZHOU, H. AND SUZUKI, K.

(1998) Adenosine regulates tissue factor expression on endothelial cells.Thromb.

Res. 91: 57-64.

DI VIRGILIO F. (1998) ATP as a death factor. Biofactors.8(3-4): 301-303

112

DI VIRGILIO F. (2000) Dr. Jekyll/Mr. Hyde: the dual role of extracellular ATP. J Auton

Nerv Syst. 81(1-3): 59-63

DI VIRGILIO, F., BARICORDI, O.R., ROMAGNOLI, R., BARALDI, P.G. (2005)

Leukocyte P2 receptors: a novel target for anti-inflammatory and anti-tumor

therapy. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 5 (1): 85-99.

DI VIRGILIO, F., CHIOZZI, P., FERRARI, D., FALZONI, S., SANZ, J.M., MORELLI, A.,

TORBOLI, M., BOLOGNESI, G., BARICORDI, O.R., (2001) Nucleotide receptors:

an emerging family of regulatory molecules in blood cells. Blood 97: 587-600.

DIXON, A.K., GUBITZ, A.K., SIRINATHSINGHJI, D.J., RICHARDSON, P.J., FREEMAN,

T.C. (1996) Tissue distribution of adenosine receptor mRNAs in the rat. Br J

Pharmacol. 118(6): 1461-1468.

DOERY, H.M. (1956) Purine compounds in snake venoms. Nature. 177 (4504): 381-

382.

DOONAN'S HOME PAGE - Thermostability of Proteins - What Does It Depend On and

How Can It Be Modified? http://homepages.uel.ac.uk/S.Doonan/thermo.html

DUBEY, R.K., GILLESPIE, D.G., JACKSON, E.K. (1998) Adenosine inhibits collagen

and protein synthesis in cardiac fibroblast: role of A2B receptors. Hypertension. 31:

943-948.

ETEROVIC, V.A., HERBERT, M.S., HANLEY, M.R., BENNETT, E.L. (1975) The lethality

and spectroscopic properties of toxins from Bungarus multicinctus (Blyth) venom.

Toxicon. 13: 37-48.

FABIATO, A. e FABIATO, F. (1979) Calculator programs for computing the

concentrations of the solutions containing multiple metals and ligands used for

experiments in skinned muscle cells. J. Physio (Paris). 75: 463-505.

FERGUSON, K.A. (1964) Starch Gel Eletrophoresis: Application to the Classification of

Pituitary Proteins and Polypeptides. Metabolism. 13: 985-1002.

FINI, C., PALMERINI, C.A., DAMIANI, P., STOCHAJ, U., MANNHERZ, H.G., FLORIDI,

A. (1990) 5’-nucleotidase from bull seminal plasma, chicken gizzard and snake

venom is a zinc metalloprotein. Biochim Biophys Acta. 1038 (1): 18-22.

FISCHER, F.G., DORFEL, H. (1954) Adenosine in the venom of puffadder Bitis arietans.

Snake venoms I.. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 296 (5-6): 232-238.

113

FISKE, C.H. e SUBBAROW, Y. (1925) The colorimetric determination of phosphorus. J.

Biol. Chem. 66: 375-400.

FOZARD, J.R., MILAVEC-KRIZMAN, M. (1993) Contraction of the rat isolated spleen

mediated by adenosine A1 receptor activation. Br. J. Pharmacol. 109: 1059-1063.

FRANCIS B, SEEBART C, KAISER II. (1992) Citrate is an endogenous inhibitor of

snake venom enzymes by metal-ion chelation. Toxicon. 30 (10): 1239-1246.

FRANCIS, B., JORGE DA SILVA JR, N., CASAIS E SILVA,L.L., SEEBART, C.,

KAISER, I.I. (1997). Toxins isolated from the venom of the brasilian coral snake

(Micrurus frontalis frontalis) include hemorragic type phospholipase A2 and

postsynaptic neurotoxins. Toxicon 35: 1193-1203.

FREITAS MA, GENO PW, SUMNER LW, COOKE ME, HUDIBURG SA, OWNBY CL,

KAISER II, ODELL GV. (1992) Citrate is a major component of snake

venoms.Toxicon. 30(4): 461-464.

FRISCHAUF A.M. e ECKSTEIN, F. (1973) Purification of a phosphodiesterase from

Bothrops atrox venom by affinity chromatography. Eur. J. Biochem. 32 (3): 479-485. FURSTENAU, C.R., TRENTIN, D. DA. S., BARRETO-CHAVES, M.L., SARKIS, J.J.

(2006) Ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase as part of a multiple

system for nucleotide hydrolysis by platelets from rats: kinetic characterization and

biochemical properties. Platelets, 17 (2): 84-91.

GACHET, C. (2006) Regulation of platelet functions by P2 receptors. Annu. Rev.

Pharmacol Toxicol. 46: 277-300.

GALUN, R. e KINDLER, S.H. (1968) Chemical basis of feeding in the tick Ornithodoros

tholozani. J. insect Physiol. 14: 1409-1421.

GALUN, R. e MARGALIT, J. (1969) Adenosine nucleotides as feeding stimulants of the

tsetse fly Glossina austeni Newst. Nature. 222: 583-584.

GALUN, R., AVI-DOR, Y., BAR-ZEEV, M. (1963) Feeding response in Aedes aegypti:

stimulation by adenosine triphosphate. Science 142: 1674-1675.

GALUN, R., KOONTZ, L.C., GWADZ, R.W., RIBEIRO, J.M.C. (1985) Effect of ATP

analogues on the gorging response of Aedes aegypti. Physiol. Entomol. 10: 275-

281.

GUTIÉRREZ, J.M. e LOMONTE, B. (1989) Local tissue damage induced by Bothrops

snake venoms. A review, Mem. Inst. Butantan, 51(4): 211-223.

114

GUTIÉRREZ, J.M., AVILA, C., CAMACHO, Z., LOMONTE, B. (1990) Ontogenetic

changes in venom of the snake Lachesis muta stenophrys (Bushmaster) from

Costa Rica. Toxicon, 28: 419-426.

GUTIÉRREZ, J.M., LOMONTE, B. e CERDAS L. (1986) Isolation and partial

characterization of a myotoxin from the venom of the snake Bothrops nummifer.

Toxicon; 24(9): 885-894.

HALIM, H.Y., SHABAN, E.A., HAGAG, M.M., DAOUD, E.W., el-ASMAR, M.F. (1987)

Purification and characterization of phosphodiesterase (exonuclease) from

Cerastes cerastes (Egyptian sand viper) venom. Toxicon. 25 (11): 1199-1207.

HANCOCK, D.L., COUPAR, I.M. (1995) Functional characterization of the adenosine

receptor mediating inhibition of peristalsis in the rat jejunum. Br. J. Pharmacol. 115:

739-744.

HOURANI, S.M.O., JONES, D.A. (1994) Post-junctional excitatory adenosine A1

receptors in rat vas deferents. Gen Pharmacol. 25: 417-420.

IWANAGA, S. & SUZUKI, T. (1979) Enzymes in snake venom. In: Lee C.Y. (Ed.) Snake

Venoms. Handbook of Exp. Pharmacol., 52. Springer-Verlag, Berlin. 61-158

JACOBSON, K.A. (1998) Adenosine A3 receptors; novel ligands and paradoxical effects.

Trends Pharmacol. Sci. 19: 184-191.

JOHNSON, M. KAYE, M.A.G., HEMS, R. KREBS, H.A., (1953) Enzynatic Hydrolysis of

adenosine phosphates by cobra venom. Biochem. J. 54: 625-629

JORGE DA SILVA JR., N., AIRD, S.D., (2001) Prey specificity, coniparative lethality and

compositional differences of coral snake venoms. K Comp. Biochein. Physiol.

128C: 425-456.

KARDONG, K.V. (1998) Vertebarados-Comparative Anatomy, Function, Evolution.

McGraw-Hill, Boston. 747

KARDONG, K.V., (1980) Evolutionary patterns in advanced snakes. American Zoologist

20: 269-282.

KARLSSON, E. (1979) Chemistry of protein toxins in snake venoms. In: Lee, C.Y. (Ed.).

Snake Venoms, Handbook of exp. Pharm., 52. Springer-Verlag, Berlin. 159-212.

KHOW, O., CHANHOME, L., OMORI-SATOH, T., PUEMPUNPANICH, S., SITPRIJA, V.

(2002) A hemorrhagin as a metalloprotease in the venom of Trimeresurus

purpureomaculatus: purification and characterization.Toxicon. 40(4): 455-461.

115

KINI, R.M. AND GOWDA, T.V. (1982a) Studies on snake venom enzymes: Part I.

Purification of ATPase, a toxic component of Naja naja venom & its inhibition by

potassium gymnemate. Indian J. Biochem. Biophys. 19: 152154.

KINI, R.M. AND GOWDA, T.V. (1982b) Studies on snake venom enzymes: Part II.

Partial characterization of ATPases from Russell’s viper (Vipera russelli) venom &

their interation with potassium gymnemate. Indian J. Biochem. Biophys. 19: 342-

346.

KINI, R.M. e GOWDA, T.V. (1984) Rapid method for separation and purification of four

isoenzymes of phosphodiesterase from Trimeresurus flavoviridis (Habu snake)

venom. J Chromatogr, 29: 299-305.

KOHNO Y, JI X, MAWHORTER SD, KOSHIBA M, JACOBSON KA. (1996a) Activation

of A3 adenosine receptors on human eosinophils elevates intracellular

calcium.Blood. 88(9): 3569-3574.

KOHNO, Y., SEI, Y., KOSHIBA, M. KIM, H.O., JACOBSON, K.A. (1996b) Induction os

apoptosis in HL-60 human promyelocytic leukemia cells by adenosine A3 receptors

agonists. Biochem. Biophys. Res. Commun. 219: 904-910.

KOONIN, E.V. (1994) Conserved sequence pattern in wide variety of phosphoesterase.

Protein Sci. 3: 356-358.

KOWALUK, E.A. (1998). Adenosine modulation: a novel approach to analgesia and

inflammation. Expert Opin Investig Drugs. 7 (4): 535-543

LAEMMLI, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

LIANG, B.T., JACOBSON, K.A. (1998) A physiogical role of the adenosine A3 receptor:

sustained cardioprotection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 6995-6999.

LIU, Q., BOHLEN, H. TITZER, S., CHRISTENSEN, O., DIEHL, V., HESCHELER, J.,

FLEISCHMANN, B.K. (1999) Expression and a role of functionally coupled P2Y

receptorsw in human dendritic cells. FEBS Lett. 445: 402-408.

LOMONTE B, GUTIERREZ JM, BORKOW G, OVADIA M, TARKOWSKI A, HANSON

LA. (1994) Activity of hemorrhagic metalloproteinase BaH-1 and myotoxin II from

Bothrops asper snake venom on capillary endothelial cells in vitro.Toxicon. 32 (4):

505-510.

116

LONDOS, C., HONNER, R.C., DHILLON, G. (1985) cAMP-dependent protein kinase

and lipolysis in rat adipocytes: III-Multiple modes of insulin regulation os lipolysis

and regulation of insulin responses by adenylate cyclase regulators. J. Biol.

Chem.260: 15139-15145.

MARTIN, P.L., UEEDA, M., OLSSON, R.A (1993) 2-PHenylethoxy-9-methyladenine: an

adenosine receptor antagonist that discriminates between A2 adenosine receptors

in the aorta and the coronary vessel from guinea-pig. J. Pharmacol. Exp. Ther.

265: 248-253.

MATTHEWS BW, NICHOLSON H, BECKTEL WJ. (1987) Enhanced protein

thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding.

Proc Natl Acad Sci U S A.;84(19): 6663-6667.

McINTOSH, H.H., BLAZYNSKI, C. (1994) Characterization and localization of adenosine

A2 receptors in bovine rod outer segments. J Neurochem. 62(3): 992-997.

MUKHERJE, A.K., GHOSAL, S.K. AND MAITY, C.R. (2000) Some biochemical

properties of Russell’s viper (Daboia russelli) venom from Eastern India:

correlation with clinico-pathological manifestation in Russell’s viper bite. Toxicon

38: 163-175.

MUNGER, K.A., JACKSON, E.K., (1994) Effects of selective A1 receptor blockade on

glomerular hemodynarnics: Involvement of reninangiotensin system. Am. J.

Physiol. 267: F783-F790.

NICHOLLS, J., BROWNHILL, V.R., HOURANI, S.M. (1996) Characterization of P1-

purinoceptors on rat duodenum longitudinal muscle and muscularis mucose. Br. J.

Pharmacol. 117: 170-174.

NIMMO H. G. e NIMMO G. A. (1982) A general method for the localization of enzymes

that produce phosphate, pyrophosphate, or CO2 after polyacrylamide gel

electrophoresis. Anal. Biochem. 121 (1): 17-22

ODELL GV, FERRY PC, VICK LM, FENTON AW, DECKER LS, COWELL RL, OWNBY

CL, GUTIERREZ JM (1998) Citrate inhibition of snake venom proteases. Toxicon.

36 (12): 1801-1806.

OLIVEIRA, A., LAMAS, S., RODRIGUEZ-PUYOL, D., LOPEZ-NOVOA, J.M. (1989)

Adenosine induces mesangial cell contraction by an A1-type receptor. Kidney Int.

35: 1300-1305.

117

OLSSON, R.A., PEARSON, J.D. (1990) Cardiovascular purinoceptors. Physiol. Rev. 70:

761-845.

OSHIMA, G. e IWANAGA, S. (1969) Occurrence of glycoproteins in various snake

venoms. Toxicon, 7 (3): 235-238.

OSHIMI, Y., MIYAZAKI, S., ODA, S. (1999) ATP-induced Ca2+ response mediated by

P2U and P2Ypurinoceptors in human macrophages: signalling from dying cells to

macrophages. Immunology 98: 220-227.

OUYANG, C., HUANG, T.F. (1983) Inhibition of platelet aggregation by 5’-nucleotidase

purified from Trimeresurus gramineus snake venom. Toxicon, 21 (4): 491-501.

PAINE, M.J., DESMOND, H.P., THEAKSTON, R.D., CRAMPTON, J.M. (1992)

Purification, cloning, and molecular characterization of a high molecular weight

hemorrhagic metalloprotease, jararhagin, from Bothrops jararaca venom. Insights

into the disintegrin gene family. J Biol Chem. 267 (32): 22869-22876.

PEREIRA LIMA, F.A., SCHENBERG, S., SCHIRIPA, L.N., NAGAMORI, A. (1971)

ATPase and phosphodiesterase differentiation in snake venoms. In: de Vries, A.,

Kochva, E. (Eds.) Toxins of Animal and Plant Origin. Gordon and Breach, New

York. 463-470.

PERRY, L.J., WETZEL, R. (1984) Disulfide bond engineered into T4 lysozyme:

stabilization of the protein toward thermal inactivation. Science. 226(4674): 555-

557.

PFLEIDERER G, ORTANDERL F. (1963) Identity of phosphodiesterase and ATP

pyrophosphatase from snake venom. Biochem Z. 337: 431-435.

PHILIPPS, G.R. (1975) Purification and characterization of phosphodiesterase from

Crotalus venom. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 356 (7): 1085-1096.

PLATTS, S.H., DULING, B.R. (2004) Adenosine A3 receptor activation modulates the

capillary endothelial glycocalyx. Circ Res. 94 (1): 77-82.

RALEVIC, V., BURNSTOCK, G., (1998) Receptors for purines and pyramidines.

Pharmacol. Rev. 50: 413-492.

RAMKUMAR, V., STILES, G.L., BEAVEN, M.A., ALI, H. (1993) The A3 adenosine

receptor is the unique adenosine receptors which facilitates release of allergic

mediators in mast cells. J. Biol. Chem. 268: 16887-16890.

118

RAZZELL, W.E. (1963) Phosphodiesterase. In Colowick, S. P., Kaplan, N. O. (Eds.):

Methods in Enzimology – New York-London: Academic Press 6: 236-245.

RAZZELL, W.E. e KHORANA, H.G. (1959) Studies on polypeptides III - Enzymic

degradation. Substrate specificity and properties of snake venom

phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 234: 2105-2113.

REPPERT, S.M., WEAVER, D.R., STEHLE, J.H. RIVKEES, S.A. (1991) Molecular

cloning and characterization of a rat A1-receptor that is widely expressed in brain

and spinal cord. mol. Endocrinol. 5: 1037-1048.

RETAMAL, C. (1988) Caracterizacion estructural de las formas mutada i norma de

fosfofructo quinasa-2 de Escheria coli. Universidad de Chile, Faculdad de Ciencias

(Dissertação de Tese de Mestrado)

RETAMAL, C. e BABUL, J. (1988) Determination of the molecular weight of proteins by

electrophoresis in slab gels with a transverse pore gradient of crosslinked

polyacrylamide in the absence of denaturing agents. Anal Biochem,175 (2): 544-

547.

RETAMAL, C.A., THIEBAUT, P., ALVES, E.W. (1999) Protein purification from

polyacrylamide gels by sonication extraction. Anal Biochem, 268: 15-20.

ROZALSKI, M., NOCUN, M. AND WATALA, C. (2005) Adenosine diphosphate

receptors on blood platelets - potential new targets for antiplatelet therapy. Acta

Biochim. Pol. 52 (2): 411-415.

SANCHEZ, E.F., COSTA, M.I., CHAVEZ-OLORTEGUI, C., ASSAKURA, M.T.,

MANDELBAUM, F.R., DINIZ, C.R. (1995). Characterization of a hemorrhagic

factor, LHF-I, isolated from the bushmaster snake (Lachesis muta muta) venom.

Toxicon. 33 (12): 1653-1667.

SANO-MARTINS, I.S., SANTORO, M.L., CASTRO, S.C., FAN, H.W., CARDOSO, J.L. e

THEAKSTON R.D.(1997). Platelet aggregation in patients bitten by the Brazilian

snake Bothrops jararaca. Thromb. Res., 87 (2): 183-195.

SANTORO, M. L., AND SANO-MARTINS, I.S. (2004) Platelet dysfunction during

Bothrops jararaca snake envenomation in rabbits. Thromb Haemost. 92 (2): 369-

383.

SCHIRIPA L.N., SHENBERG, S. (1964) Estudo da ATPase, ADPase e 5'-Nucleotidase

de venenos ofídicos. Ciência e cultura 16: 194-195.

119

SECRETARIA ESTADUAL DE SAÚDE (1993) Acidentes por animais peçonhentos -

Identificação, diagnóstico e tratamento. São Paulo/SP.

SHENBERG, S., PEREIRA LIMA, F.A. SHIRIPA, L.N., NAGAMORI, A. (1975). A Snake

venom ADPase. Toxicon 13: 121-122.

SHEPHERD, R.K., LINDEN, J., DULING, B.R. (1996). Adenosine-induced

vasoconstriction in vivo. Role of the mast cell and A3 adenosine receptor.Circ Res.

78 (4): 627-634.

SHNEYVAYS V, NAWRATH H, JACOBSON KA, SHAINBERG A. (1998). Induction of

apoptosis in cardiac myocytes by an A3 adenosine receptor agonist. Exp Cell Res.

243 (2): 383-397.

SORENSON, M.M., COELHO, H.S., REUBEN, J.P. (1986). Caffeine inhibition of

calcium accumulation by the sarcoplasmic reticulum in mammalian skinned fibers.

J Membr Biol.;90(3):219-230.

STELLA L, DE NOVELLIS V, MARABESE I, BERRINO L, MAIONE S, FILIPPELLI A,

ROSSI F. (1998) The role of A3 adenosine receptors in central regulation of

arterial blood pressure. Br J Pharmacol. 125(3): 437-440.

STROKA, A., DONATO, J.L., BON, C., HYSLOP, S., DE ARAUJO, A.L. (2005)

Purification and characterization of a hemorrhagic metalloproteinase from Bothrops

lanceolatus (Fer-de-lance) snake venom. Toxicon. 45(4): 411-420.

SUGINO, Y. (1960) Studies on deoxynucleosidic compounds. II. Deoxycytidine

diphosphate choline in sea urchin eggs. Biochim. Biophys. Acta. 40: 425-434.

SULKOWSKI, E., BJÖRK, W., LASKOWSKI, M. Sr. (1963) A specific and nonspecific

alkaline monophosphatase in venom of Bothrops atrox and their occurrence in

purified venom phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 238: 2477-2486.

SUZUKI, T. e IWANAGA, S. (1958a) Studies on snake venom. II Some observations on

alkaline phosphatases of Japanese and Formosan sanke venom. J. Pharm. Soc.

Jpn. 78: 354-361.

SUZUKI, T. e IWANAGA, S. (1958b) Studies on snake venom. IV. Purification of

alkaline phosphatases in cobra venoms. J. Pharm. Soc. Jpn. 78: 368-375.

SUZUKI, T. e IWANAGA, S. (1960) Studies on snake venom alkaline phosphatases.

Protein Nucl. Acid Enzymes. 6: 265-279.

120

TAKASAKI, C., YOSHIDA, H., SHIMAZU, T., TERUUCHI, T., TORIBA, M., TAMIYA, N.

(1991). Studies on the venom components of the long-glanded coral snake,

Maticora bivirgata. Toxicon. 29 (2): 191-200.

THOMAS, R.G., POUGH, F.H. (1979). The effect of rattlesnake venom on digestion of

prey. Toxicon. 17: 221-228.

TILLEY, S.L., WAGONER, V.A. SALVATORE, C.A., JACOBSON, M.A. AND KOLLER,

B.H. (2000) Adenosine and inosine increase cutaneous vasopermeability by

activating A(3) receptors on mast cells. J. Clin. Invest. 105: 361-367.

TU, A.T., e CHUA, A. (1966) Acid and alkaline phosphomonoesterase activities in

snake venoms. Comp. Biochem. Physiol. 17: 297-307.

TWOMEY, C.M. e DOONAN, S. (1997) A comparative study of the thermal inactivation

of cytosolic and mitochondrial aspartate aminotransferases. Biochim. Biophys.

Acta. 1342: 37-44.

VARANDA, E.A., GIANNINI, M.J.S.M. (1994) Bioquímica de venenos de serpentes. In:

Venenos animais, B. BARRAVIERA Ed., Rio de Janeiro: Editora de Publicações

Científicas LTDA. 205-223.

VERONESE, R., (1987). Doenças Infecciosas e Parasitárias. cap. 113: 1068.

WEBER, K. AND OSBORN, M. (1969). The reliability of molecular weight

determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol.

Chem. V. 244 n. 16 p. 4406-4412.

WEI, Q., ZHOU, D.Y., XU, Q.Y. (1981) ADPase, ATPase and 5´-nucleotidase of snake

venoms from Guangxi China. Zool. Res. 2: 143-146.

YAO, Y., SEI, Y., ABBRACCHIO, M.P., JIANG, J., (1997) Adenosine A3 receptor

agonists protect HL-60 and U-937 cells from apoptosis induced by A3 antagonists.

Biochem. Biophys. res. commun. 232: 317-322.

ZELLER, E.A. (1950) The formation of pyrophosphate from adenosine triphosphate in

presence of snake venom. Arch. Biochem. 28: 138-139.

ZHUO, S. CLEMNS, J.C., STONE, R.L. e DIXON J.E. (1994) Mutational analysis of

Ser/Thr phosphatase. Identification of residues important in phosphoesterase

substrate binding and catalysis. J. Biol. Chem. 269: 26234-26238

ZIMMERMANN, H. (1992) 5’-nucleotidase: molecular structure and functional aspects.

Biochem. J. 285: 345-366.

121

ZIMMERMANN, H. (1996). Biochemistry, localization and functional roles of ecto-

nucleotidases in nervous system. Prog. Neurobiol 49: 589-618.

Documents

CARACTERIZAÇÃO DAS NUCLEOTIDASES PRESENTES NO … · caracterizaÇÃo das nucleotidases presentes no veneno da serpente bothrops jararaca – Ênfase para as atividades atpase e