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5 3 Criofratura
Ao fi nal desta aula, você deverá ser capaz de:• Conhecer os princípios da criofratura.• Entender as informações contidas numa réplica de criofratura.• Correlacionar a criofatura à construção do modelo do mosaico fl uido de membrana.
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OBJETIVOS
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planos de corte
O “empilhamento" de váriosperfis bidimensionais em sériepermite reconstruir o aspectotridimensional da estrutura.
Em cortes ultrafi nos, a membrana plasmática aparece sempre como
uma estrutura trilaminar, com uma faixa clara limitada por duas linhas mais
escuras. O aspecto trilaminar da membrana plasmática é chamado unidade
de membrana.
Esse aspecto difi culta a determinação da real estrutura da membrana,
levando a conclusões erradas acerca da distribuição de proteínas e lipídeos
(vide boxe), porém o desenvolvimento da técnica da criofratura abriu um
novo horizonte de informações sobre as membranas celulares.
Uma das limitações do microscópio eletrônico de transmissão sempre foi o
fato de que as imagens observadas eram cortes ultrafi nos das amostras, isto é,
imagens bidimensionais de estruturas (células) tridimensionais (Figura 3.1).
Isto pôde ser contornado com a observação de cortes seriados, uma técnica
bastante trabalhosa (Figura 3.2), e também com a microscopia de varredura.
Entretanto, a resolução do microscópio eletrônico de varredura é menor que a
do microscópio de transmissão, não permitindo a visualização de vários detalhes,
principalmente do interior da célula (vide Aula 2) .
INTRODUÇÃO
Figura 3.1: No microscópio de transmissão o corte ultrafi no de uma célula resulta numa imagem bidimensional onde se vê o contorno (perfi l) trilaminar da membrana plasmática e as organelas internas(não representadas).
Figura 3.2: Cortes em série de uma estrutura podem dar uma noção de sua formatridimensional.
plano de corteperfil bidimensional,membrana de aspecto trilaminar
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Proteínas e outras moléculashidrofílicas não atravessariam
o “miolo” lipídico da membrana.
Lipídeos e outrassubstâncias hidrofóbicasnão cruzariam a “couraça”de proteínas da membrana.
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Há muito tempo já era sabido que a membrana plasmática
era composta principalmente de proteínas e lipídeos; entretanto, a
observação da estrutura trilaminar da membrana em cortes ultrafi nos
levou à conclusão errada de que a estrutura da membrana seria um
"sanduíche" de proteínas recheado por uma bicamada lipídica.
Uma membrana com essa organização seria não apenas
muito rígida, difi cultando os movimentos celulares, como seria
quase impossível que substâncias passassem através dela: aquelas
hidrofílicas fi cariam impedidas de passar pela bicamada lipídica, assim
como seria impossível que as substâncias hidrofóbicas atravessassem a
cobertura de proteínas (veja o esquema na Figura 3.3).
Fundamentos da técnica
A técnica da criofratura começou a ser desenvolvida na década de 60
e a idéia inicial foi reduzir ao máximo os artefatos decorrentes da fi xação
química por aldeídos. O objetivo era parar instantaneamente a atividade
celular, provocando a fi xação das células sem que nenhum processo de
decomposição celular tivesse tempo de acontecer.
O procedimento básico para criofratura consiste em 4 etapas :
a. congelamento das células em nitrogênio líquido;
b. fratura das células;
c, d. evaporação da superfície fraturada com carbono e platina
formando um "molde" da superfície fraturada (chamado réplica);
e, f. digestão dos restos celulares, de modo que apenas a réplica
metálica é observada ao microscópio eletrônico de transmissão.
Figura 3.3: O "modelo do sanduíche" da membrana era rígido e não explicava os movimentoscelulares e o transporte através da membrana, embora correspondesse à imagem de microscopiaeletrônica de transmissão de cortes ultrafi nos.
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Figura 3.4: Principais etapas na produção de uma réplica.
CONGELAMENTO
Algumas adaptações tiveram de ser feitas para que os cristais de
gelo que se formavam no processo de congelamento não perfurassem
as células, lesando-as gravemente e impedindo a observação de sua
organização. Assim, antes de congelar as amostras, elas são brevemente
fi xadas em aldeídos e infi ltradas com glicerol, uma substância que
difi culta a formação de cristais de gelo (Figura 3.5). Um outro fator
que impede a formação de cristais é fazer um congelamento ultra-
rápido, o que requer equipamentos ainda mais sofi sticados.
Figura 3.5: Para criofratura, as células são inicialmente fi xadas com aldeídos, a seguir infi ltradas com glicerol, que impedirá a formação de cristais de gelo quando congeladas.
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FRATURA
Depois de congeladas, as amostras são colocadas numa câmara
a vácuo e aí fraturadas, também a baixa temperatura. Para observar a
superfície exposta após a fratura, não seria possível retirar a amostra do
aparelho, pois à temperatura ambiente ela simplesmente derreteria.
Por esse motivo, é necessário fazer um molde que reproduza a
superfície fraturada com todos os detalhes.
Figura 3.6: O material congelado é fraturado, expondo o interior celular.
REPLICAÇÃO
Ainda sob vácuo e baixa temperatura, a superfície exposta é
recoberta com uma fi na camada de platina. Lembre que o carbono é
um átomo leve, pouco efi ciente para barrar os elétrons do microscópio
eletrônico. A platina é evaporada em ângulo lateral, assim não se deposita
em toda a superfície da amostra. Lembre também que a platina é um
metal pesado, barrando os elétrons
que colidirem com seus átomos.
Imediatamente após, é feito um
sombreamento com carbono, que
forma a base da réplica.
Essa réplica de carbono e
platina é que será observada ao
microscópio eletrônico. Para que
a réplica não sofra interferência de
restos celulares da amostra inicial,
ela é limpa com a ajuda de ácido e
bases fortes.
Figura 3.7: A platina evaporada em ângulo se deposita apenas em algumas partes da superfície fraturada. O carbono forma um fi lme contínuo sobre a superfície fraturada.
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INTERPRETAÇÃO DAS RÉPLICAS
O aspecto de algumas réplicas era muito diferente das imagens
dos cortes ultrafi nos. Embora algumas estruturas fossem identifi cadas
(Figura 3.8), muitas vezes observava-se apenas grandes áreas que
pareciam corresponder à superfície celular (Figura 3.9). Nessas
superfícies de membrana havia sempre um grande número de
partículas distribuídas: as partículas intramembranosas (Figura 3.9).
Em 1966 foi possível demonstrar que a fratura ocorre
preferencialmente no plano médio da membrana, isto é, separando as
duas camadas de fosfolipídeos que a formam (Figura 3.10 ), e que as
partículas inseridas nas membranas correspondiam a proteínas delas.
Essa foi uma das evidências mais importantes para a sustentação do
modelo do mosaico fl uido, proposto por Singer e Nicolson em 1972.
Figura 3.8: Quando a célula é fraturada em seu plano médio é possível reconhecer o núcleo pelo seu envoltório duplo e complexos de poro. Vacúolos e organelas intracelulares são de identifi cação mais difícil.
Figura 3.9: Quando a fratura expõe a superfície da célula, observamos várias partículas intramembranosas, setas que correspondem às proteínas da membrana.
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Figura 3.10: O plano de fratura preferencial divide os folhetos da bicamada lipídica. Podem ser observados o folheto voltado para o citoplasma (face P) ou o lado voltado para o meio extracelular (face E) da membrana.
Figura 3.11: Esquema de uma hemácia (A) sendo fraturada (B) e (C) e expondo, ora a face E da membrana, voltada para o exterior (D1), ou a face P, voltada para o citoplasma (D2).
CONCLUSÃO
A criofratura continua sendo uma técnica importante no estudo das células, entretanto,
muitas variações foram introduzidas, permitindo a observação não apenas do "miolo" da
membrana, mas também das faces voltadas para o citoplasma, para o meio extracelular e
também de estruturas citoplamáticas, como os microtúbulos.
(A) (B) (C) (D1) (D2)
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RESUMO
A técnica de criofratura consiste em fraturar células ou tecidos depois de congelados.
A fratura tem grande probabilidade de ocorrer entre as duas camadas de fosfoli-
pídeos que formam as membranas, expondo uma matriz homogênea (os lipídeos)
com partículas de diversos tamanhos nela inseridas. Essas partículas "intramembranosas"
correspondem a proteínas que atravessam a bicamada lipídica. Para que a face
fraturada possa ser observada é feita uma réplica em carbono e platina da mesma.
Finalmente, os restos da amostra são separados da réplica que é colocada sobre uma
grade e levada ao microscópio eletrônico de transmissão.
O plano de fratura ocorre preferencialmente entre os dois folhetos de bicamada lipídica,
expondo o plano hidrofóbico do lado voltado para o citoplasma (face P) ou do lado
voltado para o meio extracelular (face E).
EXERCÍCIOS
1. Liste as etapas do procedimento para criofratura, explicando os objetivos de cada uma.
2. Qual a parte da membrana que é exposta na fratura?
3. A que correspondem as partículas intramembranosas observadas nas réplicas?
4. Qual a contribuição da criofratura na elaboração do modelo do mosaico fl uido?
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