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NATHALIA DA CUNHA MURASAKI
Dissertao apresentada Escola Politcnica da Universidade de So
Paulo para obteno do Ttulo de Mestre em Engenharia
So Paulo 2005
CINTICA DE INATIVAO TRMICA DA PEROXIDASE E DA
POLIFENOLOXIDASE PRESENTES NA GUA DE COCO VERDE POR
PROCESSO TRMICO CONTNUO
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NATHALIA DA CUNHA MURASAKI
CINTICA DE INATIVAO TRMICA DA PEROXIDASE E DA
POLIFENOLOXIDASE PRESENTES NA GUA DE COCO VERDE POR
PROCESSO TRMICO CONTNUO
Dissertao apresentada Escola Politcnica da Universidade de So
Paulo para obteno do Ttulo de Mestre em Engenharia
rea de Concentrao: Engenharia Qumica
Orientadora: Prof. Livre-Docente Carmen Ceclia Tadini
So Paulo 2005
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FICHA CATALOGRFICA
Murasaki, Nathalia da Cunha
Cintica de inativao trmica da peroxidase e da polifeno- loxidase
presentes na gua de coco verde por processo trmico contnuo / N.C.
Murasaki. -- So Paulo, 2005.
78p.
Dissertao (Mestrado) - Escola Politcnica da Universidade de So
Paulo. Departamento de Engenharia Qumica.
1.Processos contnuos 2.Enzimas 3.Inativao trmica 4.gua de coco
I.Universidade de So Paulo. Escola Politcnica. Departamento de
Engenharia Qumica II.t.
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Aos meus pais Snia e Jacir,
s minhas irms Adriana e Gabriela e
ao Andr com carinho
-
AGRADECIMENTOS
Ao bondoso Deus. Prof. Dra. Carmen C. Tadini pela orientao e
dedicao com seus orientados. Ao Prof. Dr. Pedro Oliveira Vitoriano
e Dr. Amauri Rosenthal pela importante
contribuio durante a elaborao desse trabalho.
Aos professores Dra. Beatriz Kilikian e Dr. Aldo Tonso pela
orientao no PAE.
Aos meus tios Jos Roberto Cardoso, Marisa Ortegosa da Cunha e
Jos Nilson
Machado pelo incentivo e exemplo.
Aos colegas: Carolina Singer, Cynthia Ditchfield, Denise
Tavares, Fabiana
Hilsenrath, Gisele Miyashira, Ivan Nunes, Ktia Matsui, Laura
Carr, Patrcia
Hamano, Sandra Orosco, Tatiana Matuda, Tatiana Tribess, Vanessa
Duarte e Prof.
Dr. Jorge Gut, pelas grandes amizades, pelo incentivo, colaborao
e horas de
descontrao. Aos amigos Aurea Sugai e Bruno Esteves, que tambm
foram os
abridores oficiais de coco e Lucia Collet pela importante
colaborao e ajuda na
parte experimental.
Ao Rodrigo Martins pela sua valiosa ajuda no incio da minha
parte experimental. Aos meus pais Snia e Jacir e irms Adriana e
Gabriela pelo incentivo e apoio. Ao querido Andr pela dedicao,
incentivo e companhia. Aos amigos Mariana, Gustavo, Mrcia,
Fernando, Priscila e Fbio pelos momentos
de descontrao.
A todos que, direta ou indiretamente, contriburam na execuo
deste trabalho. Capes pela bolsa concedida.
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RESUMO
Considerando a necessidade da pasteurizao da gua de coco verde,
aps a abertura
do fruto, devido ao de microrganismos e das enzimas presentes,
peroxidase
(POD) e polifenoloxidase (PFD), o presente trabalho tem como
objetivo estudar o
comportamento da atividade dessas enzimas, atravs de processo
trmico contnuo.
Na primeira parte foi estudada a cintica de inativao trmica das
enzimas em
processo de pasteurizao da gua de coco, realizado em trocador de
calor a placas
(TCP) de laboratrio, ARMFIELD FT 43A, a temperatura de 90C em
diferentes
tempos de reteno. Amostras da gua de coco no processada e
processada foram
congeladas a 30 C para as anlises enzimticas. Na segunda parte,
com base nos
resultados obtidos de cintica, foram realizados processos a 90 C
com tempos de
reteno de 120, 180 e 200 s para o estudo do comportamento dessas
enzimas
durante o armazenamento. Anlises de pH, acidez, turbidez e
atividade enzimtica
tambm foram realizadas durante o tempo de armazenamento de
amostras da gua de
coco processada e no processada em temperatura ambiente,
refrigerada (10 C) e
congelada (- 20 C). Cada lote de gua de coco foi caracterizado
pela densidade,
teores de slidos totais e solveis, cinzas, pH, acidez e
turbidez. Nos processos
trmicos contnuos realizados a 90 C a POD e PFD presentes na gua
de coco
apresentaram pelo menos duas isoenzimas com estabilidades
diferentes e a PFD
mostrou-se mais termorresistente que a POD. A POD presente na
gua de coco
processada, durante o armazenamento a 30 C, apresentou-se mais
estvel que a
PFD. A gua de coco processada que apresentou maior estabilidade
fsico-qumica e
enzimtica foi a armazenada congelada.
-
ABSTRACT Considering the need for green coconut water
pasteurization after opening the fruit
due to microbial and enzymatic (peroxidase (POD) and polyphenol
oxidase (PFD))
action, the objective of this work is to study the behavior of
the activity of these
enzymes during continuous thermal processing. The first stage of
the work was the
study of the enzymes thermal inactivation kinetics during
continuous pasteurization
of coconut water, performed in a laboratory plate heat
exchanger, Armfield 43 A,
at a temperature of 90 C with different holding times. Samples
of unprocessed and
processed coconut water were frozen at - 30 C for enzymatic
analyses. In the second
stage, based on the results obtained, processing was performed
at 90 C with holding
times of 80, 120, 180 and 200 s for studying the behavior of
these enzymes during
storage. Analyses of the pH, titratable acidity, turbidity and
enzymatic activity were
conducted during storage in processed and unprocessed samples
kept at ambient
temperature, refrigerated (10 C) and frozen (- 20C). Each
coconut water batch was
characterized by density, total and soluble solids, ashes, pH,
titratable acidity and
turbidity. For the continuous thermal processes carried out at
90 C both POD and
PFD presented at least two isozymes with different thermal
stability, and PFD was
more thermally resistant than POD. During storage at - 30C POD
in processed
coconut water was more stable than PFD. The highest
physicochemical and
enzymatic stability was achieved for processed coconut water
under frozen storage.
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SUMRIO
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE SIGLAS
LISTA DE SMBOLOS
1.
INTRODUO.....................................................................................................1
1.1
OBJETIVO..........................................................................................................2
2. REVISO DA
LITERATURA............................................................................3
3. MATERIAIS E
MTODOS................................................................................23
3.1 MATRIA
PRIMA...............................................................................................23
3.2 MATERIAL E
EQUIPAMENTOS............................................................................23
3.3
REAGENTES......................................................................................................26
3.4 PARTE
EXPERIMENTAL.....................................................................................26
3.4.1 Processamento
contnuo........................................................................26
3.4.2
Amostragem...........................................................................................28
3.4.3
Anlises..................................................................................................30
3.4.3.1 Anlises
fsico-qumicas.........................................................30
3.4.3.2 Anlise da atividade
enzimtica..............................................31
4. RESULTADOS E
DISCUSSO..........................................................................33
4.1 CARACTERIZAO DOS LOTES DE GUA DE
COCO............................................33
4.2 CINTICA DE INATIVAO
ENZIMTICA...........................................................35
4.3 ATIVIDADE ENZIMTICA DA POD E PFD E ANLISES FSICO QUMICAS
DA
GUA DE COCO VERDE DURANTE TEMPO DE
ARMAZENAMENTO......................40
5.
CONCLUSES.....................................................................................................71
6. SUGESTES PARA TRABALHOS
FUTUROS..............................................73
7. LISTA DE
REFERNCIAS...............................................................................
74
-
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1
Parmetros de cintica e as constantes de velocidade para
mecanismos de uma reao de acordo com a equao:
( ) ( )tdbba -+-= 111 exp1 . k1 e k2 so as constantes de
velocidade e 12 gg a razo das atividades molares das
formas E1 e
E2..........................................................................
17
Tabela 2.2 Mecanismo rvore demonstrando o carter diversificado
da
atividade enzimtica. Os mecanismos no mesmo nvel na
rvore do perfis de atividade tempo idnticos,
correspondentes a: a. para o 1 nvel: ( )tda -= 1exp ; b.
para o 2 nvel: ( ) ( )tdbba -+-= 111 exp1 ; c. para o 3 nvel
( ) ( ) ( )tdbtdba --+-= 2111 exp1exp ; d. para o 4 nvel:
( ) ( ) ( )tdbtdbbba -+-+--= 221121 expexp1
........................ 18 Tabela 3.4.1.1 Conjuntos de tubos de
reteno utilizados no trocador de
calor a placas para obteno dos tempos de reteno de 20,
40, 80, 120, 160, 180 e 300 s, de acordo com a vazo do
produto....................................................................................
27
Tabela 4.1.1 Correspondncia entre os lotes de gua de coco e
as
condies de
processo..............................................................
33
Tabela 4.1.2 Valores mdios obtidos nas anlises de acidez, pH,
cinzas,
slidos totais, slidos solveis, densidade e turbidez da gua
extrada dos
cocos....................................................................
34
Tabela 4.2.1 Tempos reais dos processos realizados no trocador
de calor a
placas, de acordo com o volume dos tubos de reteno..........
35
Tabela 4.2.2 Valores da atividade residual da POD e PFD na gua
de
coco processada a 90 C em tempos de reteno variando
entre 21,5 e 379,8
s..................................................................
36
Tabela 4.2.3 Parmetros do modelo multicomponente de primeira
ordem
com 2 e 3 parmetros para a POD e PFD, respectivamente.... 38
Tabela 4.3.1 Valores mdios das atividades iniciais da POD e PFD
na
gua de coco processada e no
processada.............................. 40
-
Tabela 4.3.2 Valores da atividade residual da POD na gua de coco
no
processada, armazenada
congelada......................................... 43
Tabela 4.3.3 Valores da atividade residual da PFD na gua de coco
no
processada, armazenada
congelada.......................................... 45
Tabela 4.3.4 Valores da atividade residual da POD presente na
gua de
coco processada, durante tempo de armazenamento sob
refrigerao..............................................................................
48
Tabela 4.3.5 Valores da atividade residual da POD presente na
gua de
coco processada, durante o armazenamento congelado...........
49
Tabela 4.3.6 Valores da atividade residual da PFD presente na
gua de
coco processada, durante o armazenamento sob
refrigerao..............................................................................
53
Tabela 4.3.7 Valores da atividade residual da PFD presente na
gua de
coco processada, durante o armazenamento congelado...........
54
Tabela 4.3.8 Valores de pH, acidez e turbidez da gua de coco
no
processada de acordo com a condio de armazenamento...... 57
Tabela 4.3.9 Valores de pH, acidez e turbidez da gua de coco
processada
ao longo do tempo de acordo com a condio de
armazenamento........................................................................
63
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LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Esquema cclico para a formao do composto e
subsequente oxidao de substratos doadores de eltrons........
8
Figura 2.2 Reaes catalisadas pela PFD. (a) hidroxilao de
monofenol
em O-difenol; (b) dehidrogenao de O-difenol em O-
quinonas....................................................................................
12
Figura 2.3 Mecanismo de formao da melanina da
tirosina..................... 12
Figura 3.2.1 Espectrofotmetro UV-VIS, marca FEMTO, modelo
700
plus............................................................................................
24
Figura 3.2.2 pH-STAT, marca RADIOMETER, modelo
PHM-290............ 24
Figura 3.4.1.1 Trocador de calor ARMFIELD modelo FT-43, com tubo
de
reteno forma de
S...............................................................
27
Figura 3.4.2.1 Fluxograma de amostragem da gua de coco no
processada
e processada armazenada em trs condies de
armazenamento (ambiente, refrigerada e congelada)...............
29
Figura 4.2.1 Isoterma de inativao trmica a 90 C da POD e
PFD,
presente na gua de
coco..........................................................
39
Figura 4.3.1 Dados da atividade enzimtica residual da PFD da gua
de
coco logo aps o processo comparados com os dados
experimentais que geraram o modelo de cintica
multicomponente de 1a ordem com 3 parmetros....................
41
Figura 4.3.2 Dados da atividade enzimtica residual da POD da gua
de
coco logo aps o processo, comparados com os dados
experimentais que geram o modelo de cintica
multicomponente de 1a ordem com 2 parmetros.....................
42
Figura 4.3.3 Variao da atividade da POD presente na gua de coco
no
processada congelada, durante o tempo de armazenamento....
47
Figura 4.3.4 Variao da atividade da PFD presente na gua de coco
no
processada congelada, durante o tempo de
armazenamento.........................................................................
47
-
Figura 4.3.5 Atividade da POD presente na gua de coco
processada,
armazenada
refrigerada............................................................
51
Figura 4.3.6 Atividade da POD presente na gua de coco
processada,
armazenada
congelada..............................................................
51
Figura 4.3.7 Atividade da PFD presente na gua de coco
processada, armazenada
refrigerada...........................................................
55
Figura 4.3.8 Atividade da PFD presente na gua de coco
processada,
armazenada
congelada..............................................................
55
Figura 4.3.9 Valores da acidez medida na gua de coco no
processada
armazenada em temperatura ambiente, refrigerada e
congelada..................................................................................
60
Figura 4.3.10 Valores do pH medido na gua de coco no
processada
armazenada em temperatura ambiente, refrigerada e
congelada..................................................................................
60
Figura 4.3.11 Valores da turbidez medida na gua de coco no
processada
armazenada em temperatura ambiente, refrigerada e
congelada..................................................................................
60
Figura 4.3.12 Variao da acidez da gua de coco no processada
em
relao ao tempo de armazenamento para cada condio
(ambiente, refrigerada e congelada).
61
Figura 4.3.13 Variao do pH da gua de coco no processada em
relao
ao tempo de armazenamento para cada condio (ambiente,
refrigerada e
congelada)...........................................................
61
Figura 4.3.14 Variao da turbidez da gua de coco no processada
em
relao ao tempo de armazenamento para cada condio
(ambiente, refrigerada e
congelada)......................................... 62
Figura 4.3.15 Valores da acidez medida na gua de coco
processada
armazenada em temperatura ambiente, refrigerada e
congelada..................................................................................
66
Figura 4.3.16
Valores do pH medidos na gua de coco processada
armazenada em temperatura ambiente, refrigerada e
congelada..................................................................................
66
-
Figura 4.3.17 Valores da turbidez medida na gua de coco
processada
armazenada em temperatura ambiente, refrigerada e
congelada...... 67
Figura 4.3.18 Variao da acidez da gua de coco processada em
relao ao
tempo de armazenamento para cada condio (ambiente,
refrigerada e
congelada)...........................................................
67
Figura 4.3.19 Variao do pH da gua de coco processada em relao
ao
tempo de armazenamento para cada condio (ambiente,
refrigerada e
congelada)...........................................................
68
Figura 4.3.20 Variao da turbidez da gua de coco processada em
relao
ao tempo de armazenamento para cada condio (ambiente,
refrigerada e
congelada)...........................................................
68
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LISTA DE SIGLAS
ABIA Associao Brasileira das Indstrias de Alimentao
FPLC Cromatografia lquida de protena rpida
OMS Organizao Mundial de Sade
PFD Polifenoloxidase
POD Peroxidase
UNICEF Fundo das Naes Unidas para a Infncia
-
LISTA DE SMBOLOS
a Atividade da frao da isoenzima menos resistente em
relao a atividade enzimtica total
A0 Atividade enzimtica no tempo zero
A Atividade enzimtica a qualquer tempo
Coi Atividade da enzima por unidade de volume no tempo zero
Ci Atividade da enzima por unidade de volume no tempo t
D Forma inativa da enzima
E1 Forma ativa nativa da enzima
k Constante de reao (s-1)
PFD0 Atividade da PFD presente na gua de coco no processada
PFDi Atividade inicial da PFD
POD0 Atividade da POD presente na gua de coco no processada
PODi Atividade inicial da POD
r Taxa de reao
S Substrato
gi Atividade especfica molar da isoenzima
-
1
1. INTRODUO
A gua de coco verde, pela sua rica composio nutricional, atua
como
estimulante de vrios processos do trato digestivo, auxilia as
funes cardacas e na
reposio de sais minerais e gua perdidos por atletas, alm de ser
recomendada para
diabticos. Tais benefcios sade fazem da gua de coco um
concorrente potencial
a refrigerantes e bebidas isotnicas e segundo a Associao
Brasileira das Indstrias
de Alimentao (ABIA), em 2002 o consumo de gua de coco
representou cerca de
1,4 % desse mercado, estimado em 10 bilhes de litros/ano. Essa
pequena
participao no mercado d a dimenso das possibilidades de
crescimento do
consumo da gua de coco (PESSOA; SILVA; CAMARGO, 2002).
O processo de pasteurizao, um dos mais empregados em
alimentos
lquidos, tem o objetivo de destruir os microrganismos patognicos
e deterioradores e
inativar enzimas presentes nesses alimentos que tenham uma ao
indesejada e
possam alterar as suas caractersticas. A obteno do melhor binmio
tempo-
temperatura importante para minimizar alteraes nas propriedades
nutricionais e
sensoriais do produto.
Couto et al. (2004) realizaram um estudo de aceitao de gua de
coco in
natura, refrigerada e de duas marcas industrializadas (Ind. A e
Ind. B), disponveis
no mercado varejista. As amostras foram analisadas por 40
provadores, atravs do
mtodo de escala hednica de nove pontos. Tanto a amostra Ind. B,
quanto a amostra
in natura diferiram significativamente das demais, sendo a mdia
obtida para a Ind.
B 5,8, inferior a in natura ( mdia 7,5). A gua de coco in natura
foi a que obteve
melhor aceitao pelos provadores, seguida pela Ind. B, no entanto
a gua de coco
Ind. A e refrigerada apresentaram tendncia para a rejeio. A
justificativa para a
maior aceitao da amostra in natura pode ser atribuda s
caractersticas sensoriais
(aparncia lmpida, aroma, sabor e textura homognea) descritas
pelos provadores
como sendo atributos caractersticos de gua de coco.
A aplicao de tecnologias de processamento e conservao da gua de
coco
necessria, pois aps a abertura da fruta, alm de ficar exposta ao
dos
microrganismos presentes no ambiente, reaes qumicas acontecem
devido ao
de enzimas como a peroxidase (POD) e a polifenoloxidase (PFD)
que provocam o
-
2
seu escurecimento, modificando as suas caractersticas sensoriais
e seu valor
nutricional.
1.1. Objetivo
Este trabalho teve como objetivo o estudo da cintica de inativao
trmica
das enzimas peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PFD) presentes
na gua de coco
verde, por processo trmico contnuo em diferentes tempos de
reteno.
Objetivos especficos:
- Obter dados de atividade residual da POD e PFD da gua de
coco
processada a temperatura de processo a 90 C, em 7 tempos de
reteno (0; 20; 40; 80; 160; 180 e 300 s);
- Ajustar os resultados obtidos da atividade residual das
enzimas a
modelos cinticos multicomponentes de 1a. ordem, existentes
na
literatura;
- Verificar a influncia da condio de armazenamento (refrigerao
e
congelamento) sobre a atividade residual das enzimas presentes
na
gua de coco processada.
-
3
2. REVISO DA LITERATURA
A gua de coco verde possui muitas aplicaes, alm de ser uma
bebida
refrescante utilizada na alimentao humana. Na biotecnologia, a
gua de coco pode
ser empregada como meio de cultura bacteriolgica e como meio de
crescimento
para fermentao de levedo e vinagre. Suas aplicaes medicinais
tambm so
importantes como no auxilio do tratamento de distrbios
intestinais, na recuperao
de problemas do estmago, na reduo do colesterol, no tratamento
da artrite, no
controle da presso arterial, na reduo da febre e tambm pode ser
usado como
calmante natural. Durante a segunda guerra mundial, a gua de
coco era empregada
na rehidratao oral e na perfuso intravenosa, substituindo o soro
fisiolgico, para
os soldados japoneses (ANZALDO et al., 1982); (DUPAIGNE, 1971);
(JARMAN;
GRIMWOOD, 1975); (SISON, 1977); (JASPER, 1979 apud MACIEL;
OLIVEIRA;
da SILVA, 1992); (PINTO, 1983 apud MACIEL; OLIVEIRA; da SILVA,
1992).
O coco verde, com 6 a 7 meses de desenvolvimento, contm cerca de
400
mL/fruto de uma deliciosa bebida, refrescante e nutritiva. A gua
de coco uma
mistura relativamente diluda, contendo 5% de slidos totais,
apresentando um
contedo de sais minerais e acares que a torna uma bebida
isotnica. A gua do
coco ano verde, com 7 meses, apresenta, em mdia: sacarose 280
mg/100mL;
glicose 2378 mg/100mL; frutose 2400 mg/100mL; P 7,40 mg/100g; Ca
17,10
mg/100g; Na 7,05 mg/100g ; Mg 4,77 mg/100g; Mn 0,52 mg/100g; Fe
0,04
mg/100g; K 156,86 mg/100g; acidez 1,23 mEq/100g; pH 4,91; slidos
solveis
5Brix, vitamina C 1,2 mg/100mL; protena 370 mg/100g e valor
calrico de 27,51
Kcal/100g (PIERIS, 1971); (GONZALEZ, 1990 apud CAMPOS et al.,
1996);
(ROSA; ABREU, 2000).
A composio eletroltica da gua de coco apresenta-se mais prxima
do
fluido intracelular do que do plasma extracelular. Os ctions
predominantes so o
potssio, clcio e o magnsio. uma soluo hipotnica mais cida, porm
com
densidade comparvel com o plasma sanguneo (CAMPBELL-FALCK et al,
2000).
Apesar da alta concentrao de acares e potssio presentes na gua
de coco,
existe uma controvrsia sobre o seu uso para rehidratao oral.
Inmeros estudos
defendem seu uso, porm outros defendem o uso exclusivo do soro
oral lanado pela
-
4
OMS (Organizao Mundial de Sade) e UNICEF (Fundo das Naes Unidas
para a
Infncia). Sua acidez, hipotonicidade e alto teor de potssio no
fazem a gua de
coco um soro ideal para ser utilizada por um longo tempo, mas
uma alternativa em
situaes de emergncia. Quando utilizada em pequenos volumes e por
curto perodo
de tempo, a gua de coco se apresenta eficaz na hidratao
intravenosa,
principalmente em regies onde falta soro e a gua de coco
abundante e barata. Por
ser boa fonte de potssio, cloreto e clcio, pode ser a melhor ind
icao em situaes
especficas em que o teor desses eletrlitos deva ser aumentado
(CAMPBELL-
FALCK et al, 2000).
Os maiores constituintes da gua de coco so os acares e os
minerais, que
conferem o sabor agradvel gua e os menos presentes so as
gorduras e as
substncias nitrogenadas (ANZALDO et al., 1982); (JAYALEKSHMY et
al., 1986
apud MACIEL; OLIVEIRA; da SILVA, 1992); (JASPER, 1979 apud
MACIEL;
OLIVEIRA; da SILVA, 1992).
De acordo com Anzaldo (1985); Jayalekshmy et al. (1986) apud
Campos et
al. (1996), a composio da gua de coco muda de acordo com o
estgio de
maturao do fruto. O nvel de acares totais, slidos totais e
acidez total aumenta
at o sexto ms de desenvolvimento e depois diminui enquanto que a
concentrao
de lipdios e protenas aumenta at o estgio final de
desenvolvimento. Portanto, as
diferenas encontradas na composio da gua de coco podem ser
devido variedade
do coco, o seu estgio de desenvolvimento, prticas de cultivo,
bem como condies
de transporte e armazenamento.
Atualmente, o Brasil possui 90 mil hectares de rea plantada, trs
vezes mais
do que h cinco anos, dos quais menos de 50 % esto em produo
efetiva, com isso
o mercado nacional de gua de coco gira em torno de 600 milhes de
litros ao ano
(PAGEL, 2005).
A gua de coco comercializada dentro do prprio fruto, apresenta
problemas
relacionados ao transporte, armazenamento e perecibilidade do
produto. A gua de
coco verde envasada insere-se na linha dos produtos de
convenincia, apresentando
praticidade no manuseio, transporte, estocagem, uma vida de
prateleira prolongada,
alm de permitir o seu consumo em locais fora das regies
produtoras. Com o
-
5
desenvolvimento de mquinas para extrair a gua e tecnologia de
envase, a venda da
gua de coco em embalagem longa vida dobrou nos ltimos cinco
anos, aumentando
de 60 milhes para 120 milhes de unidades (ROSA; ABREU,
2000);(PAGEL,
2005).
De acordo com Manoel Cuenca, economista da Embrapa, o consumo da
gua
de coco na Europa e nos Estados Unidos ainda pequeno porque no h
uma cultura
de consumo do produto nesses pases. Ele tambm ressaltou que o
maior problema
enfrentado pelas empresas que exportam gua de coco para a Europa
a conservao
do produto (MAZENOTTI, 2004).
A industrializao da gua de coco fundamental para evitar a
deteriorao
provocada pelos microrganismos presentes no ambiente e a alterao
de suas
caractersticas originais provocada pelas enzimas peroxidase
(POD) e
polifenoloxidase (PFD). Presentes naturalmente na gua de coco,
essas enzimas
possuem finalidades especficas e vitais para o fruto in vivo,
porm, em contato com
o ar atmosfrico, desencadeiam reaes indesejveis, principalmente
no que diz
respeito alterao de cor. O escurecimento enzimtico em frutas e
vegetais
normalmente devido a oxidao de compostos fenlicos em quinonas,
que so
polimerizadas em pigmentos marrom, vermelho e preto (GALEAZZI,
1984 apud
CAMPOS et al., 1996); (ROSA; ABREU, 2000); (VALDERRAMA;
CLEMENTE,
2004).
Com o objetivo de aumentar a vida de prateleira da gua de coco,
diversas
pesquisas esto sendo desenvolvidas. Como a esterilizao causa uma
forte alterao
no sabor, vrios tratamentos como: filtrao, pasteurizao, ajuste
do teor de
acares, pH, slidos totais, concentrao por osmose reversa e adio
de
conservantes esto sendo estudados para a preservao da gua de
coco (REDDY;
DAS; DAS, 2004).
A ultrafiltrao representa uma alternativa aos processos
convencionais de
tratamento trmico, pois pode operar temperatura ambiente, no
prejudicando as
qualidades sensoriais e nutricionais do produto final (ARAGO,
2002 apud SOUZA
et al, 2004).
Souza et al. (2004) realizaram o processo de ultrafiltrao com
uma
membrana monotubo, com massa molar de 50 kDa, presso de
transmembrana de 2,0
-
6
bar e velocidade tangencial de 5 m/s. A gua de coco desenvolveu
uma cor rosada
aps 24 horas, devido ao enzimtica. A ultrafiltrao apresentou uma
reduo
acentuada da carga microbiana inicial, porm no evitou a alterao
de cor causada
pela ao enzimtica (SOUZA et al., 2004).
A aplicao de tratamentos auxiliares e a adio de aditivos
especficos
(conservantes, antioxidantes, acidulantes, etc.) permitem
estender a vida de prateleira
do produto para at seis meses. O pH tambm deve ser corrigido com
acidulantes
orgnicos adequados e mantido em valores inferiores a 4,5 (ROSA;
ABREU, 2000).
A pasteurizao deve ser conduzida de forma a reduzir os nveis
de
contaminao microbiolgica, numa faixa de temperatura de processo
de 75 a 90 C
e o binmio, tempo-temperatura, deve ser otimizado considerando
os atributos
sensoriais e o tipo de equipamento disponvel. Esta etapa
executada em
equipamentos do tipo trocadores de calor a placas, dotados de
sistema de
aquecimento e resfriamento (ROSA; ABREU, 2000).
Campos et al. (1996) determinaram a composio qumica e
fsico-qumica
da gua de coco verde e estudaram a aplicao de alguns aditivos
sobre a atividade
enzimtica, sem afetar as propriedades sensoriais da gua de coco.
Esses autores
determinaram o efeito do tratamento trmico na atividade
enzimtica da peroxidase e
polifenoloxidase. Os testes foram realizados submergindo tubos
contendo 10 mL de
gua de coco em banho de gua termostatizado entre as temperaturas
de 70 e 90 C.
Assim que os tubos alcanavam a temperatura desejada, eram
coletados no intervalo
especfico de tempo e imediatamente refrigerados. Os aditivos
estudados foram:
cido ascrbico, cido srbico e benzico, metabissulfito de potssio,
EDTA, cido
ctrico, dixido de carbono e cistena.
Os referidos autores relataram o pH 6,0 como o de maior
atividade da PFD e
pH 5,5 como o de maior atividade da POD em gua de coco verde. De
acordo com
esses valores, a gua de coco apresenta um pH favorvel para a
atividade de ambas
enzimas. Estes mesmos autores constataram que o tratamento
trmico a 90 oC foi o
mais eficiente, no entanto, tempos de reteno de 550 e 310
segundos foram
necessrios para a completa inativao da polifenoloxidase e
peroxidase,
respectivamente, portanto a polifenoloxidase apresentou maior
resistncia trmica
que a peroxidase. Os experimentos realizados com os aditivos
indicaram o cido
-
7
ascrbico como o inibidor mais eficiente para ambas enzimas. Os
resultados obtidos
na anlise sensorial indicaram que o melhor binmio
tempo-temperatura, que no
apresentou alterao nas propriedades sensoriais da gua de coco,
foi 100 s a 90 oC
(CAMPOS et al., 1996).
Duarte; Coelho; Leite (2002) estudaram a determinao da
atividade
enzimtica da peroxidase e polifenoloxidase presentes na gua de
coco verde fresca e
caracterizaram essas enzimas por cromatografia lquida de protena
rpida (FPLC) e
eletroforese. Os autores obtiveram uma atividade de 0,3 U/mL
para a POD e 5,0
U/mL para a PFD, valores menores do que os encontrados por
Campos et al. (1996),
114,3 U/mL e 32,1 U/mL, respectivamente. Essa diferena pode ser
explicada pela
diferena na variedade, cultivares e desenvolvimento do fruto e
procedimento de
determinao da atividade enzimtica. Pela cromatografia, os tempos
de reteno de
0,30 min e 1,30 min foram obtidos para a peroxidase e
polifenoloxidase,
respectivamente. O mtodo de eletroforese apresentou um peso
molecular para a
peroxidase de 44,63 KDa e no foi possvel detectar o peso
molecular da
polifenoloxidase, esse fato pode ser explicado por uma baixa
concentrao dessa
enzima nas amostras analisadas.
Tadini; Murasaki (2002) estudaram a inativao trmica das enzimas,
POD e
PFD, presentes na gua de coco verde em processo descontnuo nas
temperaturas
80 oC, 85 oC e 90 oC, durante tempos de inativao de 0 a 500
segundos. Isotermas
de inativao trmica dessas enzimas apresentaram um desvio da
cintica de primeira
ordem, indicando a presena de isoenzimas, com fraes mais
termorresistentes e
fraes menos termorresistentes.
De acordo com Robinson (1991), quanto maior for a estabilidade
das
isoperoxidases frente temperatura, mais no linear a curva de
inativao trmica.
Tadini; Murasaki (2003) observaram que para a POD presente na
gua de coco,
quanto maior a temperatura de inativao trmica em processo
descontnuo, maior
foi desvio da cintica de primeira ordem.
Peroxidases e catalases so largamente distribudas nos reinos
vegetal e
animal, ambas na forma de hemoprotenas, utilizando o perxido de
hidrognio como
-
8
substrato oxidante, porm a presena de ons metlicos, como selnio
e vandio ou
um grupo prosttico flavina j foi encontrada (ROBINSON,
1991).
A peroxidade faz parte de um grande grupo de enzimas chamadas
de
oxidoredutoras. As peroxidases so encontradas nos tecidos
vegetais em grupos de
isoenzimas que podem ser separadas e detectadas em gis aps
eletroforese. Em
plantas consumidas como alimentos, as peroxidases podem ser
responsveis pela
perda de cor, sabor e textura, assim como atributos
nutricionais. A atividade
enzimtica da peroxidase vem sendo considerada importante na
qualidade do
processamento de alimentos, pela sua conhecida termostabilidade
(ROBINSON,
1991).
Durante o amadurecimento das frutas e particularmente durante o
climatrio,
a atividade da peroxidase aumenta de acordo com a atividade de
outras enzimas,
como a poligalacturonase e a celulase, que esto normalmente
associadas ao
processo de amadurecimento. A peroxidase promove um grande nmero
de reaes e
conseqentemente possui uma versatilidade que no excedida por
nenhuma outra
enzima. A peroxidase no existe sozinha nas frutas e vegetais,
como as outras
enzimas nas plantas. Existem naturalmente vrios compostos
fenlicos nos tecidos
vegetais, que podem ser oxidados pela peroxidase na presena de
uma pequena
quantidade de hidroperxido. Devido diversidade dos compostos
suscetveis
oxidao causada pela peroxidase, a variedade de produtos formados
muito
extensa. As peroxidases utilizam tanto um substrato oxidante
quanto um redutor. O
oxidante usualmente um perxido ou um cido perxido, ROOH
(ROBINSON,
1991).
Geralmente, as peroxidases so definidas como as enzimas que
catalisam a
seguinte reao peroxidativa global:
ROOH + AH2 H2O + ROH + A-
A primeira etapa da oxidao inicial do substrato doador (AH2)
produz um
radical (A-) livre. O perxido de hidrognio geralmente o
substrato oxidante
(ROOH).
O composto I produzido pela adio de 2 eltrons forma nativa
da
peroxidase.
-
9
Per Fe V = 0 + e- + H+ Per Fe IV OH
Composto I Composto II
Per Fe IV OH + e- + H+ Per Fe III H2O
Composto II Enzima nativa
A Figura 2.1 apresenta a reduo do composto II resultando na
reformao da
peroxidase nativa no estado de oxidao III.
As taxas de inativao e reativao da atividade da peroxidase
dependem de
vrios fatores, como temperatura, tempo de aquecimento, pH,
concentrao salina e
concentrao de sacarose (GIBRIEL et al., 1978) (ROBINSON,
1991).
GIBRIEL et al. (1978) estudaram a cintica de inativao e
reativao
trmica da peroxidase em cenoura, damasco e espinafre. Nas
cenouras processadas a
70 C por diferentes perodos de tempo, o ganho da atividade
enzimtica foi maior
quando tempos menores foram utilizados. O ganho mximo da
atividade foi obtido
aps 1-2 horas de armazenamento aps aquecimento. Extratos
armazenados a 5 C
mostraram maior reativao enzimtica do que as amostras
armazenadas a 4 ou 18C.
interessante notar que, em todos os casos, a atividade da
peroxidase aps 4 horas
de armazenamento foi igual ou superior ao nvel original antes do
aquecimento.
Resultados obtidos no espinafre apresentaram um modelo
semelhante aos
obtidos no extrato de cenoura. No extrato de damasco, uma
significante reduo da
atividade da peroxidase foi observada durante o
armazenamento.
-
10
Fig. 2.1 Esquema cclico para a formao do composto I e
subsequente oxidao de
substratos doadores de eltrons (ROBINSON, 1987 apud
ROBINSON,
1991).
-
11
A polifenoloxidase (PFD) tem recebido ateno contnua de
pesquisadores,
por estar envolvida no escurecimento enzimtico de frutas e
vegetais, bem como em
crustceos. Diferentes nomes tm sido associados a esta enzima
como a tirosinase,
creolase, catecolase, difenolase e fenolase, fato que reflete a
habilidade desta enzima
de utilizar diferentes compostos fenlicos como substrato
(ZAWISTOWSKI;
BILIADERIS; ESKIN, 1991).
A estabilidade trmica e as propriedades trmicas da PFD tm sido
citadas em
diversos trabalhos, o problema que, em alguns so realizadas
anlises em condies
experimentais diferentes, para estudar as caractersticas das
enzimas, em outros, o
estudo sobre diferentes procedimentos de extrao e purificao e,
portanto torna-
se difcil uma comparao direta entre os resultados obtidos
(WEEMAES et al.,
1998).
Apesar de investigaes sugerirem que o papel da PFD est
relacionado com
o mecanismo da respirao, ainda no h um consenso sobre o
verdadeiro
envolvimento que a PFD exerce sobre os tecidos vegetais,
particularmente na
biossntese de fenlicos de plantas (VAUGHN; DUKE, 1984a, apud
ZAWISTOWSKI; BILIADERIS; ESKIN, 1991).
A determinao precisa da PFD continua sendo um desafio, o que
pode ser
constatado nos numerosos mtodos descritos na literatura. Isto
devido as quinonas
formadas durante o curso da reao enzimtica, proveniente de reaes
secundrias,
substratos no reagentes, oxignio e outros constituintes da
enzima. Estas reaes
levam formao de molculas polimricas complexas interferindo na
anlise. A
existncia de outras enzimas com propriedades moleculares
similares, tais como
lacase e peroxidase, pode causar erro na medida da atividade da
PFD.
A PFD uma enzima contendo cobre capaz de catalisar dois
diferentes tipos
de reao: a hidroxilao de monofenis a O- difenis e a de
hidrogenao de O-
difenis a O-quinonas, conforme a Figura 2.2. Os ltimos produtos
conduzem
subseqentemente a uma srie de reaes no enzimticas que produzem
pigmentos
e melanina de cor marrom escura, conforme Figura 2.3.
-
12
Fig. 2.2 Reaes catalisadas pela PFD. (a) hidroxilao de monofenol
em O-difenol;
(b) dehidrogenao de O-difenol em O-quinonas (ZAWISTOWSKI;
BILIADERIS; ESKIN, 1991)
Fig 2.3 Mecanismo de formao da melanina da tirosina (MASON, 1984
apud
ZAWISTOWSKI, BILIADERIS; ESKIN, 1991).
-
13
Ainda segundo Vmos-Vigyz (1981), apud Zawistowski, Biliaderis;
Eskin
(1991), a PFD geralmente considerada uma enzima de baixa
termoestabilidade.
Tratamentos trmicos de durao relativamente curta a 70-90 C so
suficientes para
reduzir substancialmente ou eliminar completamente a atividade
da PFD, em
produtos de origem vegetal. No entanto, a enzima relativamente
estvel sob
armazenamento a temperatura abaixo de zero.
De acordo com diversos autores, a inativao da polifenoloxidase
por
tratamento trmico o mtodo mais eficaz para controlar o
escurecimento
enzimtico (WEEMAES et al, 1998). Tate et al. (1964) apud Weemaes
et al (1998),
ressaltaram a importncia de um rpido tratamento trmico, pois o
processo lento
resulta na ativao da PFD presente nos tecidos vegetais.
Entretanto, o tratamento
trmico pode ser responsvel por mudanas indesejveis na textura e
sabor. Alm
disso, o tratamento trmico para inativao da PFD em produtos com
antocianinas
no pode ser aplicado devido sua degradao.
Weemaes et al. (1998) estudaram a estabilidade trmica da PFD em
extrato
de ma, abacate, uva, pra e ameixa. A inativao trmica das enzimas
estudadas foi
descrita como cintica de primeira ordem. No entanto, no caso da
ameixa, uma queda
na atividade enzimtica foi observada nos primeiros 30 segundos.
Como a PFD
presente na ameixa formada por pelo menos duas isoenzimas,
possvel que o
decaimento inicial rpido causado pelo aquecimento seja devido a
isoenzima com
menor termoestabilidade. O decrscimo mais lento foi decorrente
da isoenzima mais
termoestvel.
Cano; Marin; Fster (1990) constataram que o efeito do
congelamento de
fatias de banana, sem um tratamento prvio, sobre a atividade da
PFD e da POD,
difere dependendo da maturidade da fruta e do sistema enzimtico.
A peroxidase
uma enzima ligada membrana celular e sua solubilidade afetada
com a condio
de congelamento do tecido vegetal. Quanto menor a umidade, maior
o nmero de
cristais de gelo no protoplasma e maior o dano causado, assim a
disponibilidade da
peroxidase pode aumentar tanto quanto sua atividade residual. Os
autores tambm
constataram que o valor da atividade residual da PFD no diminuiu
em conseqncia
do congelamento de fatias de banana nos primeiros dias de
armazenamento, no
entanto, foi observada aps 20 dias, uma atividade residual de
34%, sugerindo que o
-
14
processo de congelamento afeta diferentemente a atividade dessas
duas enzimas
(POD e PFD) presentes na banana.
Cintica de inativao enzimtica:
As reaes enzimticas nos alimentos normalmente ocorrem a uma taxa
que
limitada pela concentrao das enzimas presentes.
Geralmente considerado que a inativao trmica de enzimas segue
a
cintica de primeira ordem, eq. (2.1a) e (2.1b) (TOLEDO,
1991):
AkdtdA
r =-= (2.1a)
tkAA
-=
0
ln (2.1b)
em que:
A0 a atividade enzimtica no tempo zero
A a atividade enzimtica a qualquer tempo
k a constante de velocidade de 1 ordem
r a taxa de reao
Desvios dessa cintica tm sido descritos por vrios pesquisadores.
Modelos
tm sido propostos para explicar as inativaes no lineares. Entre
os modelos, um
multicomponente de 1 ordem expresso como a soma da cintica de
seus
componentes, supondo que cada componente segue a inativao da 1
ordem durante
o aquecimento. Este modelo tem sido estudado principalmente para
a inativao
trmica de enzimas consistindo de isoenzimas com estabilidades
trmicas diferentes
(CERF, 1977; BAILEY; OLLER, 1986 apud FUJIKAWA; ITOH, 1996).
Teoria
(TOLEDO, 1991); (HELDMAN; LUND, 1992); (FUJIKAWA; ITOH,
1996);
(POLAKOVIC; VRBEL, 1996); (BOBROVNIK, 2000)
-
15
Considerando uma amostra de enzimas constituda de m componentes
que so
independentemente inativadas termicamente seguindo a cintica de
1 ordem sob
certas condies:
Por definio temos, eq. (2.2):
( )tkexpCC ii i -= 0 (2.2)
iC0 e iC so as atividades da enzima por unidade de volume no
tempo 0 e t,
respectivamente, sendo k1>k2.......>km>0. Ento, eq.
(2.3):
=
=m
iiCC
1
, =
=m
ii
CC1
00 (2.3)
Se a definido como a razo residual de 0CC no tempo t, a razo
expressa
usando as eq. 2.2 e 2.3, como segue:
( )
=
=
-=
m
i
m
ii
i
i
C
tkCa
10
10 exp
(2.4)
Polakovic; Vrbel (1996) apresentam uma reviso sobre avaliao
isotrmica
de cintica de inativao de enzimas utilizando dados de literatura
exibindo desvios
da cintica de 1 ordem.
Segundo os autores, a informao principal para elucidar a cintica
da
inativao enzimtica pela medida da atividade. A medida da
atividade d uma
informao ambgua se a enzima ativa representada por uma nica
forma. A
atividade total da enzima, A, geralmente igual soma das
atividades das formas
ativas da enzima, Ai, eq (2.5). :
i
m
ii
m
ii CAA
====
11g (2.5)
em que ig so as atividades especficas molares das isoenzimas e
so funo da
concentrao do substrato S, temperatura T, pH e de outras
variveis:
( ),.....,, pHSTfi =g (2.6)
-
16
A atividade usualmente dada como um valor relativo a atividade
inicial i
A0 ,
definida pela eq.(2.4) e reescrita como:
=
=
== m
ii
m
iii
iC
C
AA
a
10
1
0 g
g (2.7)
As eq. (2.5) a (2.7) refletem os problemas metodolgicos
encontrados na
anlise da cintica de inativao enzimtica. Como a inativao
representada por
um conjunto de reaes entre diferentes isoenzimas, para a avaliao
da cintica seria
altamente til conhecer o contedo de cada isoforma. Alm disso, no
se conhece a
atividade molar das isoformas. Ento, segundo Polakovic; Vrbel
(1996), difcil
decidir pela curva de inativao se uma reao reversvel ou
irreversvel, se reaes
paralelas tomam lugar sobre uma mesma isoforma ou no, ou se
compostos
intermedirios so ativos ou inativos.
Tem sido demonstrado como equaes de cintica simples
(principalmente
cintica de 1 ordem) podem distinguir um comportamento cintico
mais complexo.
Considerando como exemplo o mecanismo reversvel simples:
k1
1E D (2.8)
k2
onde 1E a forma ativa nativa e D representa a forma inativa da
enzima. Se somente
1E est presente inicialmente, a seguinte relao da atividade a,
no tempo t, obtida:
( )( )tkkkk
kkk
ka +-
+
-++
= 2121
2
21
2 exp1 (2.9)
A eq. (2.9) representa matematicamente uma funo uniexponencial
na forma
de: ( ) ( )tdbba -+-= 111 exp1 (2.10)
onde 21
11 kk
kb
+= e ( )211 kkd += , que tem um valor de 1 para 0=t e
assimptoticamente aproxima um valor diferente de zero para tempo
infinito.
A Tabela 2.1 mostra que existem outros dois mecanismos cuja
relao entre a
atividade enzimtica e o tempo pode ser expressa na forma da eq.
(2.10).
-
17
O nmero de mecanismos equivalentes aumenta consideravelmente se
o
mecanismo de inativao torna-se mais complexo. A Tabela 2.2
mostra que seis
mecanismos, consistindo de duas reaes, correspondem eq. (2.11)
escrita da
seguinte forma (para duas isoformas):
( ) ( ) ( )tdbtdba --+-= 2111 exp1exp (2.11)
que a equao integral mais comum aplicada s inativaes que
apresentam desvios
significativos da 1 ordem.
Tabela 2.1 Parmetros de cintica e as constantes de velocidade
para mecanismos
de uma reao de acordo com a equao: ( ) ( )tdbba -+-= 111 exp1
.
k1 e k2 so as constantes de velocidade e 12 gg a razo das
atividades
molares das formas E1 e E2.
Mecanismo 1b 1d k2
1E D D k1 21
1
kkk+
21 kk +
k2 1E D 2E
k1
-
+ 12
21
1 1gg
kkk
21 kk +
1E " 2E
k1 121
gg
- 1k
Fonte: POLAKOVIC; VRBEL, 1996
-
18
Tabela 2.2 Mecanismo rvore demonstrando o carter diversificado
da atividade
enzimtica. Os mecanismos no mesmo nvel na rvore do perfis de
atividade tempo idnticos, correspondentes a: a. para o 1
nvel:
( )tda -= 1exp ; b. para o 2 nvel: ( ) ( )tdbba -+-= 111 exp1 ;
c. para o
3 nvel ( ) ( ) ( )tdbtdba --+-= 2111 exp1exp ; d. para o 4
nvel:
( ) ( ) ( )tdbtdbbba -+-+--= 221121 expexp1 .
Fonte: POLAKOVIC; VRBEL, 1996
D E 1
D E 1 2 1 1 D D E
2 1 1 1 ; D E D E
2 1 E E D E E 2 1
2 2 1 1 ; D E D E
2 1 1 D D E
2 1 1 1 ; E E D E
2 1 1 1 ; D E D E
D E E 2 1
3 2 1 E E E
3 2 1 E E E
2 2 1 1 ; D E D E
2 2 1 1 ; D E D E D E E E 2 3 1 ;
D E E E 2 3 1 ;
D E E E 2 3 1 ;
D E E E 2 3 1 ;
4 2 3 1 ; E E E E
4 2 3 1 ; E E E E
4 2 3 1 ; E E E E
2 1 E E
D E E E 1 2 1 ;
D E E E 1 2 1 ;
3 1 2 1 ; E E E E
3 1 2 1 ; E E E E
D E E 2 1
D E E 2 1 3 2 1 E E E
3 2 1 E E E
-
19
Efeito da temperatura:
Investigaes dos efeitos da temperatura sobre a inativao
enzimtica so
comumente conduzidas para obter as condies timas de processo. Se
os parmetros
de cintica so avaliados a cada temperatura, isto providencia uma
oportunidade para
melhorar a anlise do mecanismo e cintica de inativao. Isto
consiste de: 1. o
mecanismo de inativao deve ser validado a cada temperatura; 2. a
equao de
cintica deve conter parmetros que no devem mudar com a
temperatura; 3. os
parmetros dependentes da temperatura devem apresentar uma
correlao
consistente, como por exemplo, esperado que as constantes de
velocidade
obedeam a equao de Arrhenius.
Exemplos de parmetros cinticos no dependentes da temperatura so
a
razo das atividades iniciais nos modelos das isoenzimas ou a
razo das atividades
molares nos modelos seqenciais.
Murasaki; da Silva; Tadini (2004) estudaram a inativao trmica da
POD e
PFD presentes na gua de coco verde por processo trmico
descontnuo. Os autores
sugeriram que, no mnimo, duas isoenzimas da POD e da PFD, esto
presentes com
diferentes termoestabilidades. Um modelo multicomponente de
primeira ordem de 3
parmetros foi proposto para explicar a inativao trmica em
processo descontnuo
para a PFD e um modelo multicomponente de primeira ordem de 4
parmetros para
explicar a inativao trmica em processo descontnuo para a POD. Os
modelos
indicaram que tempos de inativao superior a 400 s a 90 C no
trouxeram
benefcios em relao inativao da POD e PFD, no entanto, a gua de
coco seria
sobre-processada, diminuindo a sua qualidade nutricional e
sensorial.
A cintica de inativao da polifeno loxidase e peroxidase tambm
foi
estudada por Ditchfield; Tadini (2004). Os autores estudaram
essas duas enzimas
presentes no pur de banana, em trocador tubular com tempo de
reteno variando de
5,5 a 5,3 s e temperaturas de 69,8 a 100,1 C. As bananas foram
despolpadas e
acrescidas de cido ascrbico (0,2 %) e cido ctrico para reduzir o
pH a valor
inferior a 4,5. Aps o tratamento trmico do pur, as enzimas foram
extradas
segundo Cano; Marin; Fster (1990).
-
20
Os autores ajustaram os dados ao modelo multicomponente de
primeira
ordem, pois as enzimas apresentaram inativao bifsica indicando
uma taxa de
inativao na segunda fase menor que na primeira, devido presena
de duas
isoenzimas. A melhor condio de processo foi de 2,87 s na
temperatura de
referncia de 96,4 C, pois a partir dessa condio houve alterao da
qualidade do
pur e a reduo da atividade enzimtica no foi significativa.
Soysal; Sylemez (2005) estudaram o tratamento trmico descontnuo
da
POD em cenoura. Foram imersos tubos contendo 2 mL do extrato cru
da cenoura em
banho de gua com temperatura variando de 35-75 C. As amostras
foram retiradas
em diferentes intervalos de tempo e rapidamente resfriadas em
banho de gelo.
O grfico mono-log da porcentagem da atividade residual pelo
intervalo de
tempo apresentou dois trechos lineares para temperaturas abaixo
de 75 C, indicando
a existncia de fraes mais e menos resistentes. Este resultado
pode ser descrito por
um modelo bifsico de primeira ordem. Esse modelo baseado na
presena de 2
grupos de isoenzimas com estabilidades trmicas distintas, uma
frao menos
resistente, que sofre uma rpida inativao e uma frao mais
resistente que no foi
inativada num curto perodo de tempo. A inativao trmica a 75 C
apresentou-se
monofsica, indicando a inativao da frao mais resistente
(SOYSAL;
SYLEMEZ, 2005).
Esses autores tambm estudaram a inativao enzimtica por
microondas.
Um recipiente contendo aproximadamente 350 mL de gua e um
suporte para os
tubos foram colocados no centro do microondas e os tubos
contendo 5 mL de extrato
de enzima foram posicionados acima da superfcie da gua. A gua
foi utilizada para
dissipar o calor e impedir que a temperatura se elevasse muito.
O aquecimento por
microondas foi realizado a 70, 210, 350 e 700 W de potncia em
tempos variando de
15 s a 12 min. O extrato enzimtico foi imediatamente resfriado
imergindo os tubos
em banho de gelo.
A inativao da POD pelo aquecimento por microondas seguiu a
cintica de
primeira ordem para todos nveis de microondas utilizados. O
comportamento
bifsico da inativao enzimtica foi observado no tratamento com
microondas a 70
e 210 W, sendo que a 350 e 700 W, a inativao foi monofsica. Como
o controle de
temperatura no foi aplicado ao sistema, a inativao da POD em
cenouras pode ter
-
21
sido causada pela combinao da temperatura com o efeito das
microondas. A fase
monofsica para os altos valores de potncia pode ser explicada
pela elevao da
temperatura que inativou a frao mais resistente da enzima
(SOYSAL;
SYLEMEZ, 2005).
Valderrama; Clemente (2004) estudaram a inativao da POD presente
no
extrato enzimtico da casca e polpa de mas tipo Gala e Fuji. Em
ambos os tipos, a
atividade da peroxidase foi maior na casca. O concentrado
enzimtico extrado da
casca e da polpa foi submetido a tratamento trmico a 65, 70, 75
e 80 C e a mxima
inativao obtida foi de 70 % para a isoenzima aninica isolada da
casca e da polpa
em mas dos tipos Gala e Fuji. Entretanto, o mesmo tratamento
aplicado a
isoenzima catinica apresentou uma inativao mxima de 20 %. A
inativao
trmica da peroxidase mostrou-se no linear em relao aos fatores
de tempo e
temperatura, concluindo que as isoenzimas possuem diferentes
resistncias trmicas.
Collet et al. (2005) estudaram a cintica de inativao da
pectinesterase (PE)
em pasteurizao contnua de suco de laranja utilizando um trocador
de calor a
placas. Os experimentos foram realizados em trs temperaturas
(82,5 C, 85,0 C e
87,5 C) e tempos de reteno variando entre 11,1 e 8,5 s.
Os autores observaram a influncia do pH do suco de laranja no
processado
na inativao da atividade enzimtica. Dessa maneira, os resultados
obtidos foram
classificados de acordo com o pH. Os autores ajustaram os dados
referentes ao
intervalo do pH do suco natural entre 3,8 3,9, a um modelo
multicomponente de
primeira ordem com trs parmetros, proposto por Fujikawa e Itoh
(1996), que
considera a presena de dois grupos de isoenzimas com
termoresistncias diferentes.
Comparando os modelos obtidos para as trs temperaturas, o
processo a 82,5 C
apresentou uma maior inativao enzimtica do que a 85,0 C, fato
que pode ser
explicado pela diferena na proporo das duas isoenzimas presentes
no suco de
laranja e seu diferente comportamento frente ao pH.
Tadini; Tribess; Silva (2004) estudaram a correlao dos parmetros
do
modelo no- linear com o pH na inativao trmica da pectinesterase
(PE) em suco de
laranja minimamente pasteurizado, em trocador de calor a placas.
Duas variedades de
laranja, Citrus aurantium L. e Citrus aurantifolia, foram
utilizadas para obter
misturas de pH ajustado nos valores 3,6; 3,7; 3,8; 3,9; 4,0 e
4,1. Os sucos foram
-
22
processados em trs temperaturas diferentes (82,5 C, 85,0 C e
87,5 C) em 6
tempos de reteno, para cada condio.
Com os resultados de cintica obtidos, os autores propuseram um
modelo de
primeira ordem com trs parmetros, indicando a presena de duas
isoenzimas com
diferentes termoresistncias. O parmetro a (atividade da frao da
isoenzima 1 em
relao a inativao enzimtica total) para cada pH estudado, foi
influenciado pela
temperatura de processo, com um aumento da termolabilidade da
frao da
isoenzima com o aumento da temperatura. A constante de
velocidade k1 variou de
maneira similar em relao ao pH e temperatura, tendo pontos
mnimos em pH 3,8 e
3,9 em temperatura de 85,0 C. Os maiores valores da constante de
velocidade foram
encontrados nos valores extremos de pH e temperatura. Esses
mesmos autores
encontraram uma maior inativao no pH 3,6 e 85,0 C e pH 3,7 a
85,0 C e 87,5 C.
Nesses casos 99,9% de inativao foi obtida em tempos de reteno
menores que 15
segundos. Com os dados de cintica obtidos, os autores observaram
um ponto de
inflexo na inativao da pectinesterase no pH 3,8, com mnima
inativao.
-
23
3. MATERIAIS E MTODOS
A parte experimental foi constituda de duas etapas. Na primeira
etapa, a gua
extrada de cocos verdes foi submetida a processo trmico contnuo
em trocador de
calor a placas. Foram realizados ensaios de pasteurizao contnua
da gua de coco
verde em trocador de calor a placas, a temperatura de 90C em
tempos de reteno
de 0; 20; 40; 80; 160; 180 e 300 s. Anlises fsico-qumicas e de
atividade residual
das enzimas na gua de coco no processada e processada foram
conduzidas para
cada ensaio.
Na segunda etapa, medidas da atividade residual das enzimas
presentes na
gua de coco processada foram realizadas em amostras armazenadas
refrigeradas
(10 C) e congeladas (- 30 C). Tambm foram realizadas anlises
fsico-qumicas
(pH, acidez e turbidez) da gua de coco processada armazenada em
trs condies
diferentes (no ambiente, refrigerada a 10 C e congelada a - 20
C). Foram realizados
4 processamentos a 90 C com tempos de reteno de 80 s, 120 s, 180
s e 200 s.
Amostras de gua de coco no processada tambm foram analisadas
para
comparao dos resultados.
3.1. Matria prima
Coco verde adquirido no comrcio da cidade de So Paulo
3.2. Material e Equipamentos
Balana digital, marca CHYO, modelo JK-200, preciso 0,0001 g,
220V;
Balana eletrnica de preciso, marca METTLER, modelo PE 11,
preciso
0,1g, 110V;
Banho de gua termostatizado, marca MLW, modelo U2C, 110V,
0,95kW.
Banho de gua termostatizado, marca QUIMIS, modelo Q-215 D2,
220V,
1600W;
Cronmetro analgico com preciso de 0,1s;
Densmetro, preciso 0,001g/L;
-
24
Espectrofotmetro UV-VIS, marca FEMTO, modelo 700 PLUS,
apresentado
na Figura 3.2.1, provido de jaqueta acoplada em banho de gua
termostatizado
para manter a temperatura constante e cubetas de vidro tico 40
mm, marca
HELLMA;
Fig. 3.2.1 Espectrofotmetro UV-VIS, marca FEMTO, modelo 700
plus.
Freezer horizontal, marca METALFRIO, modelo double action, 110
V,
-20 C
Freezer Plasma vertical, marca FANEM, modelo 349 FV, 220 V, -30
C,
com indicador digital com preciso de 0,5 C;
Mquina de cubos de gelo, marca DROPSGELO PROSDCIMO, 110 V;
pH - STAT, marca RADIOMETER, modelo PHM-290, com auto bureta
ABU
901, preciso 0,001 pH, apresentado na Figura 3.2.2;
Fig. 3.2.2 pH-STAT, marca RADIOMETER, modelo PHM-290.
-
25
Refratmetro, marca CARLZEISSJENA, modelo I, preciso 0,1
Brix.
Refrigerador, marca PROSDCIMO, modelo C41, 110V, mantido a 10
C;
Termmetro de alta preciso, marca INCOTERM, modelo 1056;
Termmetro de alta preciso, marca INCOTERM, modelo 2079;
Trocador de calor ARMIFIELD modelo FT-43 A, tipo placas, de
laboratrio,
com acessrios e componentes: unidade processadora de
pasteurizao,
console de controle, unidade de refrigerao modelo FT61-B,
interface de
aquisio de dados ARMFIELD, modelo FT43 A-90 IFD, transformador
de
voltagem (10A) de 110V para 220 V. A unidade processadora do
trocador de
calor a placas tem as seguintes especificaes:
Bomba de alimentao: peristltica, construo sanitria e
velocidade varivel, capacidade mxima 30 L/h;
Controlador de temperatura: microprocessador com ao PID para
o
aquecedor de gua, faixa de 0 a 100 C;
Placas lisas de ao inox AISI 316, com gaxetas em Teflon
sanitrio;
Sensores de temperatura: seis sensores semicondutores, providos
de
poo de ao inoxidvel para uso em nove possveis pontos de
medio;
Sistema de aquecimento: bomba centrfuga de circulao de gua
quente aquecida por uma resistncia eltrica de capacidade 1,5
kW.
A vazo de gua quente varivel atravs da vlvula de agulha do
rotmetro at 1,5 L/min;
Tanque de alimentao com capacidade de 4 litros;
Tubos de reteno: S 75,8 cm3, Cilndrico 240,0 cm3, Kitassatos
de 500 e 1000 cm3;
Vlvula de desvio de ao inoxidvel, do tipo de trs vias;
Vidraria comum de laboratrio
-
26
3.3. Reagentes
Solues de hidrxido de sdio 0,001 M; 0,01 M; 0,1 M;
Soluo tampo citrato 0,2M/fosfato 0,4M pH 6,5;
Soluo tampo fosfato (0,2M) monobsico/dibsico pH 6,0;
Soluo tampo cido ctrico/hidrxido de sdio/cido clordrico pH
4,0;
Soluo tampo di-sdio hirogenofosfato/potssio di-hidrogenofosfato
pH 7,0;
Soluo tampo cido brico/cloreto de potssio/hidrxido de sdio pH
10,0;
Soluo perxido de hidrognio 15 mL/L
Substrato fenlico catecol, procedncia MERCK 1596140005;
Substrato fenlico p-fenilenediamina 10 g/L, MERCK 8072460005
3.4. Parte experimental
3.4.1. Processamento contnuo
Para o processamento contnuo foi utilizado o trocador de calor a
placas da
marca ARMFIELD modelo FT-43, Figura 3.4.1.1, provido de placas
lisas com uma
seo de regenerao com arranjo de dez passes de uma passagem, uma
seo de
aquecimento com arranjo de seis passes de uma passagem e uma seo
de
resfriamento com arranjo de quatro passes de uma passagem.
Para cada tempo de reteno dos processos da gua de coco a 90 C
foram
utilizados diferentes tubos de reteno, como apresentado na
Tabela 3.4.1.1. Os
kitassatos foram imersos em banho de gua termostatizado, marca
QUIMIS, para que
no houvesse queda da temperatura durante a passagem do produto
pelos tubos de
reteno.
Aps a montagem dos tubos de reteno no trocador de calor a
placas, as
mangueiras com os tubos foram soltos e cheios de gua. Os volumes
dos tubos de
reteno foram medidos em proveta.
-
27
Fig. 3.4.1.1 Trocador de calor ARMFIELD modelo FT-43, com tubo
de reteno
forma de S.
Tabela 3.4.1.1 Conjuntos de tubos de reteno utilizados no
trocador de calor a
placas para obteno dos tempos de reteno de 20, 40, 80, 120,
160, 180 e 300 s, de acordo com a vazo do produto.
Para o estudo de cintica de inativao da POD e PFD foram
utilizados 5
lotes diferentes de gua de coco verde, sendo que os processos a
90C por 40 e 80 s
foram realizados com o mesmo lote de gua de coco. Foi utilizado
um lote diferente
de gua de coco para cada processo realizado para o estudo da
atividade enzimtica
na gua de coco, durante o perodo de armazenamento.
Os cocos de cada lote foram lavados e pesados antes e aps a
abertura da
fruta. A gua extrada foi recolhida num recipiente de ao-
inoxidvel imerso em
banho de gelo, para manter a atividade inicial das enzimas
peroxidase e
polifenoloxidase na alimentao do trocador durante todo o
processo.
V (cm3) Conjuntos
84,80 tubo S + mangueiras
306,67 tuboS+ tubo cilndrico+ mangueiras
612,50 kitassato 500 + mangueiras
780,00 tubo cilndrico+ kitassato 500 + mangueiras
1220,00 Tubo cilndrico+ kitassato 1000 + mangueira
-
28
3.4.2. Amostragem
Para o estudo de cintica de inativao enzimtica, para cada
processamento,
amostras de 2,5 mL de gua de coco no processada foram recolhidas
em 6 tubinhos
imersos em banho de gelo e imediatamente congelados para
posterior anlise da
atividade inicial da POD e PFD.
Amostras de 2,5 mL da gua de coco processada foram recolhidas em
tubinhos
imersos em banho de gelo e imediatamente congelados para
posterior anlise da
atividade enzimtica da POD e PFD.
Para a caracterizao de cada lote, gua de coco foi extrada de 40
cocos e
anlises de densidade, slidos solveis, slidos totais, cinzas, pH,
acidez e turbidez,
foram conduzidas.
O fluxograma, mostrado na Figura 3.4.2.1, apresenta a amostragem
realizada
para o estudo do comportamento da atividade das enzimas
presentes na gua de coco,
durante o tempo de armazenamento.
Amostras de gua de coco processada e no processada foram
recolhidas em
garrafas de 250 mL para anlises fsico-qumicas (pH, acidez e
turbidez) durante o
tempo de armazenamento em temperatura ambiente, refrigerada e
congelada.
Amostras de 2,5 mL da gua de coco no processada foram recolhidas
em
tubinhos imersos em banho de gelo, para medida da atividade da
POD e PFD. As
amostras foram armazenadas congeladas a 30 C.
Amostras de 2,5 mL da gua de coco processada foram recolhidas em
tubinhos
imersos em banho de gelo, para medida da atividade enzimtica da
POD e PFD.
Metade dos tubinhos foi armazenada em geladeira (10 C) e outra
metade
armazenada em freezer (-30 C).
Em intervalos regulares (diariamente para as amostras no
ambiente, 3 dias para
as amostras armazenadas refrigeradas e 7 dias para as amostras
congeladas) as
anlises fsico-qumicas e/ou da atividade enzimtica foram
conduzidas.
-
Figura 3.4.2.1 Fluxograma de amostragem da gua de coco no
processada e processada armazenada em trs condies de
armazenamento
(ambiente, refrigerada e congelada).
GUA DE
COCO
gua de coco no processada
gua de coco processada
Caracterizao do lote
30 Garrafas de 250 mL
30 Garrafas de 250 mL
40 Tubinhos com 2,5 mL
Ambiente
Geladeira
Congelador
Anlises fsico-qumicas
Congelador
Anlise da atividade da POD e
PFD
80 tubinhos com 2,5 mL
Geladeira
Ambiente
Congelador
Congelador
Geladeira
Anlises fsico-qumicas
Anlise da atividade da POD e
PFD
Atividade enzimtica
inicial
-
30
3.4.3. Anlises
3.4.3.1. Anlises fsico-qumicas
Slidos solveis (Brix): Medido em refratmetro da marca
Carlzeissjena,
com correes de acidez e temperatura (KIMBALL, 1991).
Slidos totais: obtidos segundo o mtodo da AOAC e Instituto
Adolfo Lutz,
secando 10g da amostra de gua de coco a 70C, sob baixa presso
(< 100
mmHg), com pesagens consecutivas em intervalos de duas horas, at
peso
constante (ESTADOS UNIDOS, 1995); (BRASIL, 1976).
Cinzas: As anlises de cinzas foram realizadas logo aps o
processo de
slidos totais, segundo o Instituto Adolfo Lutz , em cpsulas de
porcelana em
mufla a 550C (BRASIL, 1976).
Densidade: Medido com o densmetro com preciso 0,001g/L
(BRASIL,
1976).
pH: As medidas de pH foram obtidas diretamente no pH-stat
Radiometer,
modelo PHM-29.
Acidez titulvel: Realizado no pH-Stat at atingir pH de 8,2,
referente a pH
de mudana de colorao do indicador fenolftalena (ESTADOS
UNIDOS,
1995).
Turbidez: Determinada por espectrofotometria a 610 nm (relativa
gua
destilada). No comprimento de onda, para cada amostra foi lida
a
Absorbncia (A). Os valores de Transmitncia foram calculados de
acordo
com a relao:
Tr = (10 A)*100
A turbidez foi calculada a partir de: T = 100-Tr
-
31
3.4.3.2. Anlise da atividade enzimtica
Atividade da enzima peroxidase (POD)
Preparao das solues utilizadas:
A soluo tampo citrato 0,2M/fosfato 0,4M (pH 6,5) foi preparada a
partir
das solues de Na2HPO4 e cido ctrico. Essas duas solues foram
misturadas na
proporo de 2,45 mL Na2HPO4: 1 mL cido ctrico. O acerto para pH
6,5 foi feito
pela adio da soluo de Na2HPO4 para aumentar o pH e cido ctrico
para
diminuir.
A soluo de Na2HPO4 foi preparada adicionando-se 35,814 g de
Na2HPO4
com 250 mL de gua destilada em um balo volumtrico. A soluo de
cido ctrico
foi preparada adicionando-se 4,2016 g de cido ctrico com gua
destilada em um
balo volumtrico de 100 mL.
A soluo de p-fenilenediamina foi preparada adicionando-se 0,25 g
de
p-fenilenediamina com gua destilada em um balo volumtrico de 25
mL. Como a
soluo fenlica degrada com o tempo, foi preparada no dia da
anlise.
A soluo de perxido de hidrognio foi preparada adicionando-se 1,5
mL de
perxido de hidrognio com gua destilada em um balo volumtrico de
100 mL.
Procedimento:
A metodologia utilizada para a anlise da POD foi adaptada da
metodologia
sugerida por Cano; Marin; Fster (1990), para anlise dessa enzima
em banana.
Em um tubo de ensaio, foram adicionados e homogeneizados: 10,8
mL de
soluo tampo citrato 0,2 M/fosfato 0,4 M pH 6,5; 0,8mL de
p-fenilinediamina
10 g/L e 0,4 mL de perxido de hidrognio 15 mL/L. A mistura foi
transferida para a
cubeta de vidro tico e esta foi inserida na cmara de leitura
provida de jaqueta
acoplada a um banho de gua termostatizado ajustado temperatura
de 25 C. Aps
a obteno do valor de referncia (0,000 de absorbncia), 1mL de gua
de coco foi
adicionado na prpria cubeta e agitado com uma bagueta de
vidro.
-
32
A absorbncia foi lida no espectrofotmetro ajustado ao
comprimento de
onda de 485 nm em intervalos de tempo de 10 segundos, pois a
absorbncia variou
muito rapidamente .
Todas as anlises da atividade enzimtica foram realizadas em
duplicata. A
unidade da atividade da POD medida foi definida como:
(U/s.mL.Brix) e a atividade
residual como: (POD/PODi).
Atividade da enzima polifenoloxidase (PFD)
Preparao das solues ut ilizadas:
A soluo tampo fosfato 0,2 M de pH 6,0 foi preparada em um
balo
volumtrico de 1L, adicionando-se 57 mL de soluo de NaOH 0,2 M e
500 mL de
soluo de KH2PO4 0,2 M e completando o volume com gua
destilada.
A soluo de catecol 0,2 M foi preparada adicionando-se 0,5555 g
de catecol
com 25 mL de gua destilada em um balo volumtrico. Como a soluo
fenlica
degrada com o tempo, foi preparada no dia da anlise.
Procedimento:
Em um tubo de ensaio, foram adicionados e homogeneizados: 5,5 mL
de
soluo tampo fosfato 0,2 M (pH 6,0) e 1,5 mL de soluo de catecol
0,2 M. A
mistura foi transferida para a cubeta de vidro tico e esta
inserida na cmera de
leitura provida de jaqueta acoplada a um banho de gua
termostatizado ajustado
temperatura de 25 C. Aps a obteno do valor referncia (0,000 de
absorbncia),
1 mL de gua de coco foi adicionado na prpria cubeta e agitado
com uma bagueta
de vidro.
A absorbncia foi lida no espectrofotmetro ajustado ao
comprimento de
onda de 425 nm em intervalos de tempo de 30 segundos (PONTING;
JOSLYN,1948
apud CAMPOS et al.,1996).
Todas as anlises da atividade enzimtica foram realizadas em
duplicata. A
unidade da atividade da PFD medida foi definida como:
(U/s.mL.Brix) e a atividade
residual como: (PFD/PFDi).
-
33
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Caracterizao dos lotes de gua de coco
A Tabela 4.1.1 apresenta a correspondncia entre os lotes de gua
de coco e
as condies de processo. Os lotes A, B, C, D e E foram utilizados
nos processos
para o estudo de cintica de inativao das enzimas POD e PFD,
enquanto que os
lotes F, G e I foram utilizados nos processos para o estudo do
comportamento da
atividade enzimtica da POD e PFD e anlises fsico-qumicas, da gua
de coco no
processada e processada durante o tempo de armazenamento em
temperatura
ambiente, refrigerada e congelada. A gua de coco do lote H a
mesma utilizada no
estudo de cintica, que corresponde ao processo a 90 C por 180 s
e foram utilizadas
duas nomenclaturas para o mesmo lote, para facilitar a
identificao nos resultados
que sero apresentados.
Tabela 4.1.1 Correspondncia entre os lotes de gua de coco e as
condies de
processo.
Os cocos de todos os lotes foram pesados antes e aps a extrao da
gua de
coco e o rendimento mdio foi de 27,8 %. Tambm foram medidos os
volumes de
gua extrada dos cocos e constatou-se uma variao de 270 a 960 mL
de gua entre
os cocos. Essa variao no foi apenas entre os lotes, mas tambm
entre os cocos do
mesmo lote.
Lote Condio de processo
A 90 C, 20 s B 90 C, 40 s B 90 C, 80 s C 90 C, 160 s
D, H 90 C, 180 s E 90 C, 300 s F 90 C, 80 s G 90 C, 120 s I 90
C, 200 s
-
34
A Tabela 4.1.2 apresenta os valores mdios obtidos nas anlises de
acidez,
pH, cinzas, slidos totais, slidos solveis, densidade e turbidez,
realizadas para a
caracterizao dos lotes de gua de coco.
Tabela 4.1.2 Valores mdios obtidos nas anlises de acidez, pH,
cinzas, slidos
totais, slidos solveis, densidade e turbidez da gua extrada
dos
cocos.
Lote Acidez1
(%) pH Cinzas
(%) ST (%)
SS2 (Brix)
Densidade (g/mL)
Turbidez
(%)
A 0,01+0,01 5,220+0,000 0,3615+0,0097 5,1976+0,0080 5,1+0,0
1,022+0,000 83,887
B 0,13+0,00 4,993+0,007 0,4196+0,0056 3,1112+0,3692 5,1+0,0
1,021+0,001 54,003
C 0,02+0,00 5,271+0,004 0,3699+0,0216 4,0370+0,0158 5,1+0,0
1,022+0,000 61,293
D,H 0,12+0,03 4,925+0,002 0,3297+0,0454 5,1832+0,3848 5,0+0,0
1,021+0,000 37,037
E 0,08+0,01 5,067+0,020 0,3542+0,0112 4,9229+0,0145 5,1+0,0
1,022+0,000 64,069
F 0,09+0,00 4,989+0,004 0,3559+0,0056 5,8322+0,2464 5,4+0,0
1,023+0,000
G 0,09+0,01 5,192+0,000 0,3721+0,0034 5,6365+0,0161 5,2+0,0
1,022+0,000 62,436
I 0,05+0,01 5,320+0,002 0,3733+0,0020 6,0704+0,0103 5,6+0,0
1,022+0,000 51,600
1 Acidez expressa em porcentagem de cido mlico 2 Teor de slidos
solveis expresso em Brix corrigido pela temperatura e pela
acidez
A ANOVA foi aplicada a esses dados com intervalo de confiana de
95 %. A
anlise indicou diferena significativa na acidez, pH, slidos
totais e densidade entre
os lotes. No houve diferena significativa para os dados de
cinzas. Pelo fato de a
anlise de turbidez no ter sido realizada em duplicata, seus
dados foram analisados
pelo teste pareado que indicou diferena significativa entre os
lotes. Os valores de
slidos solveis foram analisados pelo teste pareado, pois apesar
de terem sido
realizadas medidas em duplicata os resultados foram iguais. Os
lotes A, B, C e E
apresentaram o mesmo teor de slidos solveis e diferiram dos
demais.
-
35
4.2 Cintica de inativao enzimtica
Para o estudo da cintica de inativao enzimtica, foram
processados os
lotes A, B, C, D e E de gua de coco no trocador de calor a
placas, conforme descrito
no item 3.4.1. O tempo real de processo foi calculado de acordo
com o volume dos
tubos de reteno e a vazo do produto, como apresentado na Tabela
4.2.1. A
temperatura mdia real de todos os processos realizados para o
estudo de cintica de
inativao da POD e PFD foi de 88,0 + 1,3 C.
Tabela 4.2.1 Tempos reais dos processos realizados no trocador
de calor a placas,
de acordo com o volume dos tubos de reteno.
Lotes Volume do arranjo (mL)
Vazo (g/min)
Tempo real (s)
A 84,8 241,8 21,5 B 306,7 497,2 37,8 B 306,7 262,9 71,5 C 612,5
233,4 160,9
D,H 780,0 281,8 169,6 E 1220,0 248,6 301,0 F 306,7 231,3 81,3 G
612,5 339,4 110,7 I 780,0 218,2 218,9
A Tabela 4.2.2 apresenta os valores de atividade residual das
enzimas
presentes na gua de coco processada a 90 C por tempos de reteno
variando entre
21,5 s e 379,8 s. A modelagem de cintica foi baseada nos dados
desse trabalho,
juntamente com os dados obtidos por Murasaki; da Silva; Tadini
(2004). O valor de
atividade residual a razo entre a atividade enzimtica aps o
processo e da gua de
coco no processada. A atividade enzimtica inicial na gua de coco
variou de
4,6170x10-6 a 2,3033x10-3 (U/s.mL.Brix) para a POD e de
1,8695x10-5 a 5,7601x10-
5 (U/s.mL.Brix) para a PFD.
-
36
Tabela 4.2.2 Valores da atividade residual da POD e PFD na gua
de coco
processada a 90 C em tempos de reteno variando entre 21,5 e
379,8 s.
Condio de processo
POD/POD0 PFD/PFD0
No processada 1,0000 1,0000
90 C; 21,5 s 0,0353
0,0343 0,3257
90 C; 26,6 s 0,0303 0,5023
0,0303 0,4027
90 C; 37,8 s 0,1380 0,4191
0,1287 0,4443
90 C; 45,5 s 0,0175 0,2136
0,0117 0,2136
90 C; 71,5 s 0,0226 0,2592
0,0210 0,2474
90 C; 76,9 s 0,0126 0,3194
0,0063 0,4161
90 C; 138,9 s 0,0144 0,2087
0,0096 0,2239
90 C; 160,9 s 0,0328 0,3747
0,0317 0,2715
90 C; 169,9 s 0,0472 0,2238
0,0184 0,2177
90 C; 200,6 s 0,0150 0,1310
0,0150 0,1416
90 C; 287,5 s 0,0230 0,1376
0,0230 0,1340
90 C; 301 s 0,0377 0,2048
0,0373 0,2065
90 C; 379,8 s 0,0221 0,0924
0,0221 0,1597
-
37
Esses valores de atividade residual foram ajustados segundo os
modelos
multicomponentes de primeira ordem propostos por Polakovic;
Vrbel (1996).
Segundo os autores, para a obteno da curva de cintica de
inativao so
necessrios pelo menos 6 pontos, excluindo o valor inicial .
Os valores de atividade residual da POD foram ajustados ao
modelo
multicomponente de 1a ordem com 2 parmetros, apresentado na eq.(
4.2.1):
A/A0 = (1-a) + a e-k1t (4.2.1)
Onde: a a atividade da frao da isoenzima menos termorresistente
em relao a
atividade enzimtica total;
k1 a constante de reao (s-1) da isoenzima.
Os valores de atividade residual da PFD foram ajustados ao
modelo
multicomponente de 1a ordem com 3 parmetros, eq. (4.2.2):
A/A0 = a e-k1t + (1-a) e-k2t (4.2.2)
Onde: a a atividade da frao da isoenzima 1 menos
termorresistente em relao a
atividade enzimtica total;
k1 a constante de reao (s-1) da isoenzima 1;
k2 a constante de reao (s-1) da isoenzima 2, na mesma
temperatura.
A Tabela 4.2.3 apresenta os resultados da regresso no linear
utilizando o
mtodo de Marquardt, do programa estatstico Statgraphics V. 4.0,
para o modelo da
POD e PFD.
-
38
Tabela 4.2.3 Parmetros do modelo multicomponente de primeira
ordem com 2 e 3
parmetros para a POD e PFD, respectivamente.
O modelo multicomponente de 1a ordem com 3 parmetros foi o que
melhor
elucidou a cintica de inativao da PFD a 90 C, assim como o
modelo proposto por
Murasaki; da Silva; Tadini (2004).
Murasaki; da Silva; Tadini (2004) propuseram um modelo
multicomponente
de 1a. ordem com 3 parmetros para explicar a cintica de inativao
da POD a
90 C. Segundo Polakovic; Vrbel (1996) o modelo a ser escolhido
deve ser o mais
simples que apresenta uma boa correlao dos dados, por isso o
modelo de 1a. ordem
com 2 parmetros foi proposto, pois o coeficiente de determinao
obtido
(R2 = 97,16%) indicou um bom ajuste dos dados experimentais.
A Figura 4.2.1 apresenta a isoterma de inativao trmica a 90 C da
POD e
PFD, com os dados obtidos experimentalmente e os modelos
propostos.
Parmetros do modelo
a k1 (s-1) k2 (s-1) R2 POD 0,9688 0,2028 97,16 PFD 0,6367 0,0920
0,0028 83,28
-
39
Fig. 4.2.1 Isoterma de inativao trmica a 90 C da POD e PFD,
presente na gua
de coco.
Os resultados obtidos neste trabalho confirmam a presena de
duas
isoenzimas POD e PFD presentes na gua de coco, apresentando
termoestabilidade
diferente. A PFD mostrou-se mais termorresistente do que a POD,
quando a gua de
coco foi submetida a processo contnuo a 90 C. Murasaki; da
Silva; Tadini (2004)
tambm observaram que a polifenoloxidase foi mais
termorresistente do que a
peroxidase em processo descontnuo da gua de coco verde.
Pela Figura 4.2.1, observa-se que tempos superiores a 200 s a 90
C no
causaram um acrscimo significativo na inativao da PFD,
entretanto se tempos
superiores a 200 s a 90 C forem empregados, poder causar maiores
perdas
sensoriais na gua de coco. Observa-se tambm que nessa condio (90
C, 200 s)
uma inativao mxima de 80 % da PFD foi obtida, enquanto que para
a POD a
inativao foi da ordem de 97 %.
Em funo desses resultados, foi proposta uma segunda etapa neste
trabalho,
para verificar a estabilidade enzimtica e fsico-qumica da gua de
coco verde no
processada e processada (90 C, 120 s; 90 C, 180 s; 90 C, 200 s)
sob trs diferentes
condies de armazenamento (no ambiente, refrigerada e
congelada).
Isoterma de cintica de inativao da POD e PFD a 90 C
0.0000
0.1000
0.2000
0.3000
0.4000
0.5000
0.6000
0.7000
0.8000
0.9000
1.0000
1.1000
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0
Tempo de reteno (s)
A/A
i
dados experimentais POD modelo POD dados experimentais PFD
modelo PFD
-
40
4.3 Atividade enzimtica da POD e PFD e anlises fsico-qumicas da
gua de
coco verde durante o armazenamento
Para o estudo da atividade enzimtica e anlises fsico-qumicas da
gua de
coco verde durante o armazenamento, a gua de coco dos lotes F,
G, H e I foram
processadas conforme descrito no item 3.4.1. A amostragem foi
feita de acordo com
a Figura 3.4.2.1. Essas condies de processo foram escolhidas com
base no modelo
de cintica obtido. A temperatura real mdia dos processos dos
lotes G, H e I foi
89,2+1.7 C, enquanto que a temperatura real mdia do processo do
lote F foi 85,5 +
3,2 C.
A Tabela 4.3.1 apresenta os valores mdios das atividades
iniciais da POD e
PFD presentes na gua de coco processada e no processada.
Os dados da atividade da POD presente na gua de coco do lote F,
processada
a 90 C por 80 s, no foram apresentados, pois as anlises foram
prejudicadas por
causa de problemas com o substrato.
Tabela 4.3.1 Valores mdios das atividades iniciais da POD e PFD
na gua de coco
processada e no processada.
Condio de processo (s)
POD1 (U/s.mL.Brix) POD/POD0 PFD2 (U/s.mL.Brix) PFD/PFD0
No processada 1,00 8,3209E-05 1,00 No processada 1,8600E-03 1,00
5,0568E-05 1,00 No processada 2,1346E-03 1,00 2,9852E-05 1,00 No
processada 2,1607E-03 1,00 1,8696E-05 1,00
85,5 C, 80 s 5,9837E-5+1,83325E-8 0,72+0,00 90 C, 120 s
1,0354E-4+9,1285E-6 0,05+0,00 8,8763E-6+1,0365E-6 0,30+0,04 90 C,
180 s 5,0005E-5+2,2405E-5 0,03+0,01 1,2817E-5+2,5555E-6 0,25+0,05
90 C, 200 s 7,0421E-5+7,1734E-6 0,03+0,00 5,9431E-6+1,5770E-7
0,32+0,01 1Atividade da enzima POD presente na gua de coco,
expressa como Unidades de atividade por segundo por mL de gua de
coco por graus Brix 2Atividade da enzima PFD presente na gua de
coco, expressa como Unidades de atividade por segundo por mL de gua
de coco por graus Brix
-
41
As Figuras 4.3.1 e 4.3.2 apresentam os dados de atividade
residual da PFD e
POD obtidos da gua de coco processada nas condies de processo
indicadas na
Tabela 4.3.1. Observa-se que exceo condio 85,5 C por 80 s (lote
F), os dados
obtidos da atividade enzimtica residual tanto para a PFD quanto
para POD
validaram os modelos de cintica propostos.
O valor obtido da atividade residual da PFD referente ao lote F
difere muito
dos demais valores, pois a temperatura real de processo foi de
85,5 C e no 90 C,
resultando em uma inativao enzimtica menor. Os valores obtidos
da atividade
residual referentes aos outros lotes (G, H e I) validaram o
modelo proposto.
Os valores da atividade residual da POD para os lotes G, H e I
tambm
validaram o modelo proposto de cintica de inativao. No foi
possvel verificar a
atividade residual da POD presente no lote F, pois as anlises
dessa enzima foram
prejudicadas por problemas no substrato.
Fig. 4.3.1 Dados da atividade enzimtica residual da PFD da gua
de coco logo aps
o processo comparados com os dados experimentais que geraram
o
modelo de cintica multicomponente de 1a ordem com 3
parmetros.
Atividade residual da PFD
0.0000
0.2000
0.4000
0.6000
0.8000
1.0000
1.2000
0 50 100 150 200 250 300 350 400Tempo de reteno (s)
PFD
/PFD
0
dados experimentais modelo validao lotes G, H e I lote F
-
42
Fig. 4.3.2 Dados da atividade enzimtica residual da POD da gua
de coco logo
aps o processo, comparados com os dados experimentais que geram
o
modelo de cintica multicomponente de 1a ordem com 2
parmetros.
As Tabelas 4.3.2 e 4.3.3 apresentam os valores da atividade
residual da POD
e da PFD presentes na gua de coco no processada dos lotes F, G,
H e I,
armazenadas congeladas at 55 dias. A atividade residual da POD e
PFD presentes
na gua de coco no processada a razo da atividade da enzima
determinada nos
diferentes tempos de armazenamento pela atividade inicial da
enzima nos dias de
processo da gua de coco no processada extrada dos cocos.
As Figuras 4.3.3 e 4.3.4 apresentam a atividade da POD e PFD
presentes na
gua de coco congelada, durante o tempo de armazenamento. Houve
uma pequena
variao da atividade da POD entre os dias de armazenamento e
entre os lotes,
comparado com a variao da PFD entre os dias e entre os lotes. A
menor variao
da atividade da PFD durante o tempo de armazenamento foi no lote
I, lote que
tambm apresentou a menor atividade enzimtica inicial, 4,5 vezes
menor que do
lote F. A variao na atividade enzimtica durante o tempo de
armazenamento
mostra que o congelamento em freeze
