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CINTIA DO COUTO MASCARENHAS
AVALIAÇÃO DE MUTAÇÕES PONTUAIS NO GENE ABL POR MÉTODO DE CROMATOGRÁFIA LÍQUIDA DESNATURANTE DE ALTA PERFORMANCE (D-HPLC) EM PACIENTES COM LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA TRATADOS COM INIBIDORES DE
TIROSINA QUINASE
ORIENTADOR: Prof. Dr. Cármino Antonio De Souza
CO-ORIENTADORA: Drª. Kátia Bórgia Barbosa Pagnano
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa
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CINTIA DO COUTO MASCARENHAS
AVALIAÇÃO DE MUTAÇÕES PONTUAIS NO GENE ABL POR MÉTODO DE CROMATOGRÁFIA LÍQUIDA DESNATURANTE DE ALTA PERFORMANCE (D-HPLC) EM PACIENTES COM LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA TRATADOS COM INIBIDORES DE
TIROSINA QUINASE
ORIENTADOR: Prof. Dr. Cármino Antonio De Souza-UNICAMP
CO-ORIENTADORA: Drª. Kátia Bórgia Barbosa Pagnano-UNICAMP
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa-UNICAMP
Campinas, UNICAMP, 17 de junho de 2009
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, para a obtenção do título de Mestre em Clínica Médica, área de concentração em Ciências Básicas.
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DA UNICAMP
Bibliotecário: Sandra Lúcia Pereira – CRB-8ª / 6044
Título em inglês : Evaluation of point mutations in the ABL gene using denaturing high performance liquid chromatography in patients with chronic myeloid leukemia treated with tyrosine kinase inhibitors
Keywords: • Mutation
• Chronic myeloid leukemia
Titulação: Mestrado em Clínica Médica
Área de concentração: Ciências Básicas
Banca examinadora:
Profº. Drº. Cármino Antonio de Souza
Profº. Drº. Israel Bendit
Profº. Drº. Afonso Celso Vigorito
Data da defesa: 17-07-2009
Mascarenhas, Cíntia do Couto M373a Avaliação de mutações pontuais no gene ABL por método de
cromatografia líquida desnaturante de alta performance (D-HPLC) em pacientes com leucemia mielóide crônica tratados com inibidores de tirosina quinase / Cíntia do Couto Mascarenhas. Campinas, SP : [s.n.], 2009.
Orientadores : Cármino Antonio de Souza, Kátia Bórgia Barbosa
Pagnano Dissertação ( Mestrado ) Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Ciências Médicas. 1. Mutação. 2. Leucemia mielóide crônica. I. Souza, Cármino
Antonio de. II. Pagnano, Kátia Bórgia Barbosa . III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
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DEDICATÓRIA
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus queridos e insubistituíveis:
Pais, Sogros, Irmãos e Esposo.
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AGRADECIMENTOS
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AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente a todos aqueles que participaram deste trabalho:
Ao Dr. Carmino, Dra. Katia e Dr. Fernando, pelo apoio, confiança em mim, sugestões, soluções
para todos os obstáculos, pela oportunidade e entusiasmo.
A toda minha saudosa família.
A equipe de pesquisa clínica pelos ensinamentos e ajuda com os pacientes.
A todos os pacientes e controles que contribuíram para o estudo.
Ao Anderson, Gustavo e Manoela que foram fundamentais para que este trabalho fosse iniciado e
concluído, pelas incontáveis horas de ajuda, pelos ensinamentos e amizade.
Aos queridos amigos do Hemocentro pela vontade e prontidão para ajudar-me, além de me
proporcionar incontáveis momentos de lazer o que tornou possível a vida longe da minha família.
A toda equipe dos laboratórios de biologia molecular, citogenética, hematologia, onco-hematologia,
hematologia e citometria de fluxo.
A todos que depositaram seus votos de confiança em mim.
A FAPESP por financiar este estudo.
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RESUMO
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RESUMO
O desenvolvimento da Leucemia Mielóide Crônica (LMC) tem como característica a
formação do cromossomo Philadelphia que envolve a quebra do gene BCR gerando um rearranjo
molecular denominado BCR-ABL, cujo produto final é uma proteína de fusão citoplasmática que
determina a patogenia da doença. Esta proteína é uma tirosina quinase (TK) que possui
capacidade de auto-ativaçãoe para a inativação desta proteína, foram desenvolvidos os inibidores
da tirosina quinase (ITK), que tem a capacidade de se ligar no mesmo sítio de ligação da molécula
de ATP. Esta ligação impede a transferência dos grupos fosfatos aos substratos subseqüentes,
bloqueando a cascata de transdução de sinais e prevenindo a ativação das vias mitogênica
dependente da quinase Bcr-Abl e anti-apoptóticas levando à morte do fenótipo BCR-ABL.Um dos
principais mecanismos de resistência ao tratamento com ITK são as mutações pontuais, sendo a
T315I foco de estudos mais detalhados por tornar a proteína mutante altamente insensível a todas
as drogas inibidoras da proteína TK disponíveis atualmente Foi utilizado neste trabalho a técnica
de D-HPLC para fazer screening de mutações nos pacientes com LMC com resposta sub ótima ou
falha de tratamento de acordo com os critérios da Leukemia Net. Para o screening do éxon 6 foram
selecionados 93 pacientes com LMC: 5 eram intolerantes, 67 resistentes e 21 com resposta sub-
ótima. Como controle negativo foi usado o sangue periférico doadores de sangue do Hemocentro
da UNICAMP. Para o screening de mutações de todo o gene BCR-ABL foram estudados 37
pacientes com LMC e como controle negativo, usamos a linhagem celular HL60 que não possui a
translocação BCR-ABL. No screening do éxon 6, 23 amostras (25%) mostraram um perfil de
eluição no D-HPLC anormal em relação ao controle, o que sugeriu a presença de mutação. A
sobrevida global (OS) para todo grupo foi de 80% em uma mediana de tempo de observação de 30
meses. OS para pacientes sem mutações foi de 87% e para os pacientes com mutações foi de
56% em uma mediana de tempo de observação 37 e 10 meses, respectivamente (p <0,0001, RR =
68). No screening de todo o gene BCR-ABL 17 (46%) tiveram perfil cromatográfico diferente do
controle Como estávamos estabelecendo a padronização do método, procedemos com o
seqüenciamento de todas as amostras e os resultados obtidos foram comparados com a
seqüência depositada no banco de dados GenBank (U07563). Das 17 amostras com alteração do
perfil cromatográfico, observamos a presença de mutação em 13 amostras. Acreditamos que isso
se deva a sensibilidade do método de D-HPLC que é capaz de identificar tanto polimorfismos
quanto mutações com maior eficiência que o seqüenciamento. Em resumo, o D-HPLC demonstrou
ser um método sensível e prático para o acompanhamento do aparecimento de mutações no
domínio da quinase na rotina clínica. Mutações nessa região estudada são clinicamente relevantes
e podem conferir um pior prognóstico. A detecção precoce pode ser uma ferramenta importante
para otimizar a terapêutica na LMC.
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ABSTRACT
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ABSTRACT
The development of chronic myeloid leukemia (CML) is the formation of the characteristic
Philadelphia chromosome involving breach of the BCR gene generating a molecular rearrangement
called BCR-ABL, whose final product is a cytoplasmic fusion protein that determines the
pathogenesis of the disease. This is a protein tyrosine kinase (TK) that has self-ativaçãoe to
inactivate this protein have developed the inhibitors of tyrosine kinase (ITK), which has ability to
connect on the same site of binding of molecule of ATP. This connection prevents the transfer of
phosphate groups to substrates subsequent, blocking the cascade of signal transduction and
preventing the activation of mitogenic pathways dependent kinase BCR-ABL and anti leading to
apoptotic death phenotype of BCR-ABL.One major mechanisms of resistance to treatment with ITK
are mutations off, and the T315I focus of more detailed studies by making mutant protein highly
insensitive to all drugs Inhibit TK protein currently available was used in this work to D-HPLC
technique to screening for mutations in patients with CML with sub-optimal response or failure of
treatment according to the criteria Leukemia Net For the screening of exon 6 were selected 93 CML
patients: 5 were intolerant, 67 resistant and 21 with answer sub-optimal. The negative control we
used the peripheral blood donors Blood from the blood of UNICAMP. For the screening of
mutations throughout the BCR-ABL gene were studied 37 patients with CML and control negative,
we used the HL60 cell line that does not have the translocation BCR-ABL. In the screening of exon
6, 23 samples (25%) showed a profile of the D-HPLC elution abnormal in the control, which
suggested the presence of mutation. The overall survival (OS) for whole group was 80% in a
median time of observation of 30 months. OS for patients with mutations was 87% and for patients
with mutations was 56% in the median observation time of 37 and 10 months respectively (p
<0.0001, RR = 68). In screening the entire gene BCR-ABL 17 (46%) had chromatographic profile
different from the control we were setting the standardization of methods, procedures with the
sequencing of all samples and the results were compared with the sequence deposited in the
GenBank database (U07563). Of the 17 samples with change the chromatographic profile, we
observed the presence of mutation in 13 samples. We believe that this is due to sensitivity of the
method of D-HPLC is able to identify the mutations both polymorphisms with greater efficiency to
the sequencing. In summary, the D-HPLC has proved a sensitive and practical method for
monitoring the appearance of mutations in the kinase domain in the clinical routine. Mutations
studied in this region are clinically relevant and may confer worse prognosis. Early detection can be
a tool important to optimize therapy in CML.
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LISTA DE FIGURAS
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: ESTRUTURA DO CROMOSSOMO PHILADELPHIA E A LOCALIZAÇÃO DAS REGIÕES DE POSSÍVEIS
QUEBRAS CROMOSSÔMICAS (MELO AND CHUAH 2007). ....................................................................... 27
FIGURA 2: ESTRUTURA QUÍMICA DOS INIBIDORES DE TIROSINA QUINASE: NILOTINIBE, IMATINIBE E
DASATINIBE ............................................................................................................................................. 29
FIGURA 3 DEFINIÇÕES DE RESPOSTA AO TRATAMENTO DA LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA COM INIBIDORES DE
TIROSINA KINASE, MENSURANDO A REDUÇÃO NO NÚMERO DE LOGS DOS TRANSCRITOS BCR-ABL,
SEGUNDO OS CRITÉRIOS DA LEUKEMIA NET. *WBBC: CONTAGEM DE CÉLULAS BRANCA DO SANGUE
PERIFÉRICO. † PADRONIZAÇÃO DA REPRESENTAÇÃO DO BASELINE REPRESENTADO POR 100% NA
ESCALA INTERNACIONAL; 0,1 ≅ REDUÇÃO DE 3 LOGS EM RELAÇÃO AO VALOR INICIAL DE TRANSCRITOS
QUANTIFICADOS. 1. HUGHES T, DEININGER M, HOCHHAUS A, ET AL. MONITORING CML PATIENTS
RESPONDING TO TREATMENT WITH TYROSINE KINASE INHIBITORS – REVIEW AND RECOMMENDATIONS
FOR “HARMONIZING” CURRENT METHODOLOGY FOR DETECTING BCR-ABL TRANSCRIPTS AND KINASE
DOMAIN MUTATIONS AND FOR EXPRESSING RESULTS. PREPUBLISHED ONLINE. MARCH 7, 2006. DOI
10/1182/BLOOD-2006-01-0092(BACCARANI, SAGLIO ET AL. 2006; HUGHES, DEININGER ET AL.
2006) ...................................................................................................................................................... 30
FIGURA 4 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AOS INIBIDORES DE TK SEGUNDO APPERLEY, JF ET AL, 2007
PARTE I (APPERLEY 2007). ................................................................................................................... 32
FIGURA 5 REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO DOMÍNIO ABL QUINASE, COM SITIO DE CONTATO DE
NUCLEOTÍDEO (B), ALÇA DO FOSFATO (P-LOOP), DOMÍNIO CATALÍTICO (C) E LOOP DE ATIVAÇÃO (A),
AS MUTAÇÕES EM VERMELHO OCORREM COM UMA FREQUENCIA DE 10%, AS MUTAÇÕES EM VERDE
CERCA DE 2% E AS MUTAÇÕES EM PRETO SÃO MENOS FREQUENTES. MELO ET AL, 2007(MELO AND
CHUAH 2007). ........................................................................................................................................ 33
FIGURA 6 ESTRUTURA MOLECULAR DA PRIMEIRA MUTAÇÃO DESCRITA E A ÚNICA INSENSÍVEL A TODOS OS
TKI, A T315I, POR GORRE ET AL EM 2001. ........................................................................................... 34
FIGURA 7 NILOTINIBE (AMN) MUTAÇÕES ALTAMENTE SENSÍVEIS (VERMELHO), MUTAÇÕES DE MÉDIA
SENSIBILIDADE (LARANJADO), MUTAÇÕES DE BAIXA SENSIBILIDADE OU INSENSÍVEIS (AZUL). .............. 36
FIGURA 8 CARIÓTIPO DE UM DOS PACIENTES COM LMC DO SEXO FEMININO PH+ QUE FORAM INSERIDOS NO
ESTUDO. TODOS OS PACIENTES INCLUÍDOS APRESENTARAM ANÃLISE CITOGENÉTICA POSITIVA PARA O
CROMOSSOMO PHILADELPHIA. ............................................................................................................... 43
FIGURA 9 GEL DE AGOROSE A 1%, MOSTRANDO OS PRODUTOS DA PCR DO EXON 6 DO GENE ABL. M É O
MARCADOR DE PESO MOLECULAR. B É O BRANCO, 01 É O PRODUTO DA PCR DE UM INDIVÍDUO
CONTROLE, 02 A 05 PRODUTOS DA PCR DE AMOSTRAS DE PACIENTES PORTADORES DE LMC ......... 44
FIGURA 10 AMOSTRA DE RNA EXTRAÍDA PELO PROTOCOLO DE TRIZOL. AS AMOSTRAS FORAM
VISUALIZADAS EM GEL DESNATURANTE 1,2%. 01- CONTROLE, 02- PACIENTE. ................................... 45
15
FIGURA 11 GEL DE AGAROSE A 1,5%, COM AMPLIFICAÇÃO DO GENE DA BETA ACTINA. M, MARCADOR DE
PESO MOLECULAR 100 PB; NAS COLUNAS 1 A 7 SÃO AMOSTRAS DE CDNA DE PACIENTES COM LMC.
................................................................................................................................................................ 46
FIGURA 12 FORMAÇÃO DOS HOMODUPLEXES E HETERODUPLEXES A PARTIR DA DESNATURAÇÃO E
RENATURAÇÃO DO PRODUTO DE PCR. APÓS A DETECÇÃO PELA LUZ UV FORMAM-SE OS PICOS. ...... 48
FIGURA 13 EXEMPLOS DE ANÁLISE POR D-HPLC. A) PADRÃO NORMAL QUE SUGERE A AUSÊNCIA DE
MUTAÇÃO E B) PADRÃO ALTERADO, QUE SUGERE A PRESENÇA DE MUTAÇÃO. ..................................... 49
FIGURA 14 EXEMPLO DO PERFIL CROMATOGRÁFICO E O RESULTADO DO SEQÜENCIAMENTO DE UMA DAS
AMOSTRAS CONTROLE E OUTRA AMOSTRA MUTADA (T315I). ............................................................... 49
FIGURA 15 PERFIL DE AMOSTRAS DE CÉLULAS HL-60 E PACIENTES USADOS PARA A PADRONIZAÇÃO DA
TÉCNICA NO GENE BCR-ABL. FRAGMENTO CORRESPONDENTE AO QUE CHAMAMOS DE ABL-B, ABL-
C E ABL-D. ............................................................................................................................................. 50
FIGURA 16 PERFIL CROMATOGRÁFICO DE UM PACIENTE COM LMC QUE DESENVOLVEU A MUTAÇÃO T315I
DURANTE O TRATAMENTO COM MESILATO DE IMATINIBE. A) PERFIL DA AMOSTRA NA PRIMEIRA ANÁLISE,
B) O PERFIL APÓS 3 MESES DE TRATAMENTO, C) AOS 6 MESES DE TRATAMENTO COM PERDA DE
RESPOSTA HEMATOLÓGICA E CITOGENÉTICA E D) AOS 12 MESES DE TRATAMENTO. ........................... 53
FIGURA 17 NOVAS MUTAÇÕES ENCONTRADAS NO SCREENING DO ÉXON 6, PRIMEIRA COLUNA: PERFIL DE
SEQUENCIAMENTO NORMAL, SEGUNDA COLUNA: PERFIL DE SEQUENCIAMENTO ALTERADO, TERCEIRA
COLUNA: PERFIL CROMATOGRÁFICO ALTERADO .................................................................................... 55
FIGURA 18 EXEMPLO DE UMA AMPLIFICAÇÃO DE TRÊS DIFERENTES REGIÕES DO TRANSCRITO BCR-ABL.
ABL-B (CODONS 207-324 → 401 PB), ABL-C (CODONS 279-414 → 457 PB), ABL-D (CODONS 382-
517 → 453 PB). ...................................................................................................................................... 56
FIGURA 19 SEQUENCIAMENTO DE UM PACIENTE QUE FOI ENCONTRADA A ALTERAÇÃO CA - AC NA POSIÇÃO
1698 (R445L). ....................................................................................................................................... 57
FIGURA 20CURVAS DE SOBREVIDA GERAL DOS PACIENTES INSERIDOS NO ESTUDO PARA O SCREENING DE
MUTAÇÕES NO ÉXON 6, DOS PACIENTES SEM MUTAÇÕES E DE TODO O GRUPO, MOSTRANDO UM RISCO
RELATIVO IGUAL A 68 E O P < 0.001. ..................................................................................................... 58
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LISTA DE TABELAS
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1: DEFINIÇÕES DE FALHA DE TRATAMENTO E REPOSTA SUB-ÓTIMA DA LEUKEMIA NET SEGUNDO
BACCARANI ET AL, 2006. ............................................................................................................. 31 TABELA 2:SENSIBILIDADE DAS MUTAÇÕES NO DOMÍNIO DA QUINASE NO BCR-ABL AOS INIBIDORES DE
TIROSINA QUINASE DE ACORDO COM O’HARE T, EIDE CA, DEININGER M, BLOOD 2007. ................. 35 TABELA 3: CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES ANALISADOS PARA O SCREENING DE MUTAÇÃO NO EXON 6. 41 TABELA 4:CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES ANALISADOS PARA O SCREENING DE MUTAÇÃO EM TODO O
GENE BCR-ABL. ........................................................................................................................ 42 TABELA 5: SEQÜÊNCIA DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DOS ÉXONS 4 A 10 DO ALELO
MUTADO BCR-ABL PARA SCREENING DE MUTAÇÕES. ................................................................... 47 TABELA 6: PERFIL DOS PACIENTES COM LMC QUE APRESENTARAM ALGUMA ALTERAÇÃO NO PERFIL DE
SCREENING DO EXON 6 NO DHPLC. ............................................................................................. 54 TABELA 7:CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PACIENTES QUE TIVERAM PADRÃO DIFERENTE DO NORMAL NO D-
HPLC PARA SCREENING DE TODO O GENE BCR-ABL. .................................................................. 57
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LISTA DE ABREVIATURAS
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LISTA DE ABREVIATURAS
ABL: Abelson Leukemia Vírus
ACA: Anormalidades cromossômicas adicionais
ACN: Acetronila
Activation loop ou A-loop: Alça de ativação
α-INF: Alfa- interferon
Alça P ou P-loop: Alça do fosfato
AMN 107: Tasygna® ou Nilotinibe
ASO-PCR: Allele-specific oligonucleotide-polymerase chain reaction
ATP: Adenosina trifosfato
BCR: Breakpoint Cluster Region
BCR-ABL: Gene híbrido resultante da translocação do cromossomo 9 e 22
Bcr-Abl: Proteína híbrida resultante da translocação do cromossomo 9 e 22
BLASTN: Banco de dados de nucleotídeos
BLASTX: Banco de dados de proteínas
BMS: Bristol Myers Squib
BMS-354825: Sprycel® ou dasatinibe
BSA: Bovine serium albumin
C (PK5): Proteína quinase
CB: Crise blástica
cDNA: DNA complementar
CEP: Comite de ética em pesquisa
CONEP: Comitê nacional de ética em pesquisa
CSTI571: Mesilato de imatinibe
Ct: Ciclo threshold
DEPC: Dietilpirocarbonato
D-HPLC: Denaturing high performance liquid chromatography
DNA: Desoxiribonucleic acid
dNTP’s: desoxirribonucleotídeos trifosfatados
DRM: Doença residual mínima
DTT: Dithiothreitol
E: Eficiência da amplificação
EDTA: Àcido tetracético etilenediamina
ESTs: Expressed sequence tags
F: Foward ou sense
FA: Fase acelerada
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FC: Fase crônica
Fgr: Quinase da família Scr
FITC: Fluorescein
gDNA: DNA genômico
GenBank: Banco de dados de genes
GI: Número de identificação do gene
Hck: Quinase da família Scr
IBMTR: International bone marrow transplant registry
IC50: Índice de concentração inibitória da droga em 50%
IM: Mesilato de imatinibe
ITK: Inibidores de tirosina quinase
JAK: Janus quinase
KM: Kaplan-Meier
LB: Lysogeny broth
LMC: Leucemia mielóide crônica
Lyn: Quinase da família Scr
M-BCR: Major breakpoint cluster regions
m-BCR: Minor breakpoint cluster regions
mRNA: RNA mensageiro
NTC: Controles negativos
OCT-1: Organic cation transporter, member 1
OMS: Organização mundial de saúde
ORFs: Open reading frames
OS: Overall survival
pb: Pares de bases
PBS: Phosphate buffer solution
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PD: Progressão de doença
PDGF: Fator de crescimento derivado de plaquetas
Ph: Cromossomo Philadelphia
PS: Penicilina/estreptomicina
Q: Quantidade de expressão
qRT-PCR: reação em cadeia da polimerase em tempo real
R: Reverse ou anti-sense
RCC ou CCyR: Resposta citogenética completa
RCM ou MCyR: Resposta citogenética
RCP ou PCyR: Resposta citogenética parcial
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RHC ou CHR: Resposta hematológica completa
RHP ou PHR: Resposta hematológica parcial
RMC: Resposta molecular completa
RMM: Resposta molecular maior
RNA: Ribonucleic acid
RPMI: Roswell park memorial institute
SAGE: Serial analysis of gene expression
SCF: Fator de células tronco
SFB: Soro fetal bovino
SKI-606: Bosutinibe
Src-PTK: Proteína tirosina quinase da família Src
SSH: Subtractive suppression hybridization
TCLE: Termo de consentimento livre e esclarecido
TEAA: Acetato de trietilamônio
TK:tirosina quinase
Tm: Temperatura de melting
TMO: transplante de medula óssea
UA: Unidades arbitrárias
μ-BCR: micro-breakpoint cluster regions
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SUMÁRIO
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................ 24
CONSIDERAÇÕES GERAIS .................................................................................................................................... 25 FATORES PROGNÓSTICOS ................................................................................................................................... 26 ASPECTOS GENÉTICOS E MOLECULARES ................................................................................................................ 26 TERAPÊUTICAS ................................................................................................................................................. 28 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ............................................................................................................................ 31 SCREENING DE MUTAÇÕES NO GENE BCR‐ABL USANDO D‐HPLC .............................................................................. 36 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................................................. 37
OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 38
OBJETIVOS GERAIS ............................................................................................................................................ 39 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................................................... 39
PACIENTES E CONTROLES ........................................................................................................................... 40
MÉTODOS .................................................................................................................................................. 43
Avaliação Clínica ..................................................................................................................................... 43 Análise De Citogenética .......................................................................................................................... 43 Extração de DNA ..................................................................................................................................... 44 Reação em cadeia da polimerase (PCR) – Éxon 6 ................................................................................... 44 Extração de RNA ..................................................................................................................................... 44 Síntese de DNA complementar (cDNA) ................................................................................................... 45 Verificação da síntese de DNA complementar ........................................................................................ 46 Reação em cadeia da polimerase (PCR) – Éxons 4 a 10 .......................................................................... 46
PRINCÍPIO DA TÉCNICA DE D‐HPLC ............................................................................................................. 47
Análise do D‐HPLC – exon 6 .................................................................................................................... 48 D‐HPLC – exons 4 a 10 ............................................................................................................................. 49 Seqüenciamento das amostras ............................................................................................................... 50 Análise estatística ................................................................................................................................... 51
RESULTADOS .............................................................................................................................................. 52
DISCUSSÃO ................................................................................................................................................ 59
CONCLUSÃO .............................................................................................................................................. 63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................................. 65
APÊNDICES ................................................................................................................................................. 72
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INTRODUÇÃO
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INTRODUÇÃO Considerações Gerais
Em 1845 foram descritos os primeiros casos de leucemia mielóide crônica, sendo que esta
doença só ficou mais difundida a partir de 1960, por meio da descoberta do cromossomo
Philadelphia (Ph)(Sawyers 1999).
A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença clonal de células-tronco, caracterizada
pelo aumento na proliferação dos elementos mielóides em vários estágios de diferenciação. A
etiologia da doença é desconhecida na maioria dos casos (Lee, Foerster et al. 1998). O único
agente já descrito que pode ser associado ao surgimento da LMC é a radiação ionizante (Zago and
Passeto 2001).
A LMC é uma doença relativamente rara, com uma incidência média de 10 casos em um
milhão de habitantes por ano, nos países ocidentais. A freqüência aumenta com a idade, atingindo
o pico em pessoas com idade em torno de 50 anos, sendo 40% dos pacientes assintomáticos ao
diagnóstico (Sawyers 1999). Menos de 10% dos casos ocorre com idade menor ou igual a 20 anos
(Zago and Passeto 2001).
Esta doença acomete indivíduos de ambos os sexos, tendo uma leve predominância no
sexo masculino (3:2), e tem curso semelhante entre eles. Ela é responsável por menos de 5% dos
casos de leucemia na infância (Lee, Foerster et al. 1998).
Além de translocações entre o cromossomo 9 e 22, em uma porcentagem pequena dos
pacientes (5-10%) ocorrem mutações anômalas e complexas (Melo 1996). Evidências
epidemiológicas sugerem que a variação geográfica na incidência da doença reflete variações nas
exposições ambientais e no estilo de vida. Estas, por sua vez, podem interferir na expressão de
fatores genéticos (Parkin, Pisani et al. 1993). Em aproximadamente 10% a 15% dos pacientes com
LMC a porção derivada do cromossomo 9 (der[9]) adjacente da translocação breakpoint é deletada
(Cortes 2004).
Aspectos Clínicos A doença tem um prognóstico que varia de acordo com a fase em que se encontra.
Usualmente, há uma boa resposta terapêutica em pacientes na fase crônica. O Score de Sokal tem
sido utilizado ao diagnóstico para a determinação do prognóstico da doença (Cortes 2004).
O Score de Sokal considera a idade do indivíduo, o número de plaquetas, o número de
blastos e o grau de esplenomegalia. Três grupos de risco podem ser identificados a partir da
análise dessas variáveis: baixo risco, alto risco e risco intermediário (Cortes 2004).
Até alguns anos atrás as condições para o tratamento da LMC eram muito limitadas.
Entretanto o progresso científico vem permitindo mudanças nos níveis de resposta ao tratamento,
26
na qualidade de vida e na sobrevida do doente. Atualmente, as taxas anuais de mortalidade são
menores que 10% nos dois primeiros anos após o diagnóstico e vão aumentando de acordo com o
estágio da doença. Em pacientes de baixo risco o índice é de 10% nos primeiros três anos.
Pacientes de risco intermediário e alto risco apresentam de 20% a 45% de progressão ao ano. A
sobrevida média, depois de cinco anos entre os grupos de baixo, intermediário e alto risco é,
respectivamente, 76%, 55% e 25% (Cortes, Talpaz et al. 2005).
Fatores Prognósticos
Conhecida como uma doença bifásica ou trifásica (fase crônica, fase acelerada e crise
blástica) a LMC é habitualmente assintomática ou oligossintomática na fase crônica (Giles, Cortes
et al. 2004). Os sinais e sintomas mais comuns na nesta fase são: perda de peso, febre, palidez
cutânea, sudorese e esplenomegalia. A triagem para o diagnóstico pode ser feita através do
hemograma de rotina, em pacientes assintomáticos, devido ao aumento do número de leucócitos
(Zago and Passeto 2001).
A fase acelerada tem duração menor do que a fase crônica (FC) e é mais agressiva. Os
critérios aceitos para diagnóstico de fase acelerada (FA) foram propostos pelo International Bone
Marrow Transplant Registry (IBMTR)(Rowlings, Horowitz et al. 1992) e pela Organização Mundial
de Saúde (OMS) (Swerdlow HS 2008). Dentre estes fatores estão a esplenomegalia, leucocitose e
anemia sem resposta a tratamento, aumento no número de blastos e basófilos, plaquetose,
plaquetopenia, citogenética com evolução clonal, sendo que a presença de qualquer destes fatores
é suficiente para caracterizar fase acelerada. A progressão da doença para a fase terminal ou crise
blástica (CB) é caracterizada pela presença de ≥30% de blastos no sangue periférico e/ou medula
óssea (EBMT) ou ≥20% de blastos (OMS), presença de células leucêmicas de localização
extramedular (sarcoma granulocítico), infiltração no sistema nervoso central, acometimento do
baço (esplenomegalia ainda mais acentuada) e/ou fígado, além de manifestações como febre e
anorexia (Giles, Cortes et al. 2004). Geralmente, o prognóstico dos pacientes em CB é muito ruim,
tendo uma sobrevida média de 3 a 12 meses (Pasquini 2001).
Aspectos Genéticos e Moleculares
A LMC é uma doença mieloproliferativa, não hereditária, que cursa com expansão clonal dass
células progenitoras hematopoiéticas, levando à leucocitose, neutrofilia, hiperplasia mielóide,
basofilia e esplenomegalia (Zago and Passeto 2001).
Um cromossomo anormal, chamado Philadelphia (Ph), é o resultado de uma translocação
recíproca entre o cromossomo 9 e o cromossomo 22 t(9;22)(q34;q11), sendo que a maior
conseqüência dessa translocação é a fusão do gene ABL (Abelson Leukemia Vírus) com o gene
BCR (Breakpoint Cluster Region) do cromossomo 22, que usualmente justapõe os éxons 2-11
27
(chamados a2-a11) do protooncogene ABL com a parte 5’ do gene BCR. Este gene híbrido
formado pela fusão ABL e BCR produz uma proteína com alta atividade tirosina quinase. Esta
atividade determina a patogenia da LMC, devido aos domínios herdados dos proto oncogenes
parentais e por um contexto bioquímico da linhagem determinada dentro das células Ph+ (Cortes,
Talpaz et al. 2005). Ainda, a progressão da doença para uma fase de pior prognóstico pode estar
associada a uma instabilidade genômica, levando a uma predisposição a outras anormalidades
cromossômicas (Guilhot, Apperley et al. 2007).
Embora o mecanismo oncogênico exato da proteína BCR-ABL seja desconhecido, estudos in
vitro e em modelos animais mostraram que a atividade da proteína TK por si só é suficiente para
causar o desenvolvimento da LMC (Barnes and Melo 2002; Goldman and Melo 2003). Esse
processo se dá pela ativação de múltiplas vias de transdução de sinais que levam à proliferação
celular desregulada, à redução da aderência de células leucêmicas ao estroma da medula óssea e
à redução da resposta apoptótica ao estímulo mutagênico (Savage and Antman 2002; Goldman
and Melo 2003).
Na maior parte dos casos de LMC, a translocação envolve a quebra do BCR na localização
denominada M-BCR, podendo ocorrer também na localização m-BCR e μ-BCR, sendo que a
transcrição desse gene desencadeia a formação de moléculas de mRNA quimérico tendo a fusão
do éxon b2 ou b3 com o éxon a2 do ABL (Figura 1). Este rearranjo tem como produto final
proteínas de fusão citoplasmática, chamadas P190 e P210, são proteínas com atividade tirosina
quinásica de tirosina quinase, que tem capacidade de auto-ativação, ou seja, não possui
necessidade de regulação das condições fisiológicas. Ela consegue interferir na tradução de sinais
comuns do ciclo celular, como alteração do substrato, proliferação, adesão e apoptose (Faderl,
Talpaz et al. 1999; Deininger, Goldman et al. 2000).
Figura 1: Estrutura do cromossomo Philadelphia e a localização das regiões de possíveis quebras cromossômicas (Melo and Chuah 2007).
28
Terapêuticas
A história natural da LMC vem se modificando nas últimas décadas graças às novas
modalidades terapêuticas desenvolvidas (Zago and Passeto 2001). Dentre as terapias tradicionais
estão o transplante de medula óssea (TMO), os agentes citostáticos, o α-interferon (α-IFN) e mais
recentemente os inibidores da proteína tirosina quinase (Sawyers 1999; Pasquini 2001).
Até 1950, a irradiação corporal total ou esplênica era a base do tratamento para LMC. Em
1956, indicou-se o uso de derivados do arsênico (licor de Fowley), e também nessa época foi
introduzido o bussulfano. Posteriormente surgiu a hidroxiuréia como opação terapêutica.
Na década de 70, Edward Donnal Thomas sugeriu como terapêutica curativa o transplante
alogênico de medula óssea. Atualmente continua sendo o único tratamento capaz de promover
uma remissão completa da doença sendo considerado também o único tratamento curativo para
LMC, porém a indicação ao TMO tem sido reduzida devido aos seus eventos adversos (De Souza,
Vigorito et al. 2005; Sawyers and Shah 2005). Mas quando o paciente tem algumas características
clínicas essenciais, o TMO determina uma longa sobrevida e provável cura em 70% dos pacientes
[2]. Mas a disponibilidade de doador compatível é realidade para poucos (McGlave 1993; Carella,
Cunningham et al. 1997; Russell, Gratwohl et al. 1998; De Souza, Vigorito et al. 2005).
O primeiro medicamento efetivo para o tratamento da LMC foi o α-IFN, que surgiu na década
de 1980, resultando na eliminação do cromossomo Ph em várias metáfases em 35% a 55% dos
pacientes (Hughes, Kaeda et al. 2003; Cortes 2004; Palandri, Iacobucci et al. 2008), porém devido
a sua toxicidade, o uso deste medicamento foi restringido a um grupo pequeno de pacientes
(Faderl, Hochhaus et al. 2004; Hochhaus and Hughes 2004).
Em 1996 foi publicado o efeito de um inibidor seletivo das tirosina-quinases ligadas ao ABL.
Isso abriu caminho para uma intensa discussão e pesquisa relacionadas à terapia alvo para LMC
(Funke 2008).
O aperfeiçoamento de uma droga originalmente desenhada como inibidora da proteína quinase
C (PK5) para tumor gastrointestinal levou ao desenvolvimento da molécula CSTI571 (mesilato de
imatinibe), que posteriormente foi introduzido na rotina terapêutica da LMC, o que pode ser
considerado um marco no tratamento desta doença (Goldman 2005). Este é um derivado da classe
dos compostos conhecidos como 2-fenilaminopirimidinas e se mostrou um inibidor específico de
proteínas com atividade tirosina quinase: fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF,) fator
de células tronco (SCF), c-Kit, inibidor do PDGF e SCF mediador de eventos celulares (Capdeville,
Buchdunger et al. 2002). Esse composto inibe a proliferação das células da linhagem leucêmica
além de induzir essas células a apoptose.
Diversos outros medicamentos foram desenvolvidos com o objetivo inibir a atividade
desregulada da TK. A ligação dos inibidores da TK ocorre no mesmo sítio de ligação da molécula
de ATP, impedindo a transferência dos grupos fosfatos do ATP aos substratos subseqüentes,
29
bloqueando a cascata de transdução de sinais e prevenindo a ativação das vias mitogênica
dependente da quinase Bcr-Abl e anti-apoptóticas levando à morte do fenótipo BCR-ABL
(Capdeville, Buchdunger et al. 2002; Branford, Rudzki et al. 2003; Gambacorti-Passerini, Gunby et
al. 2003).
Da mesma família do mesilato de imatinibe (Glivec®), atualmente primeira linha de tratamento
da LMC, foram desenvolvidos diversos outros compostos como, por exemplo, o dasatinibe (BMS-
354825; Sprycel®) que é inibidor de duas vias (SRC e a quinase relacionada ao BCR-ABL. In vitro
é visívelmente mais potente que o imatinibe (Lombardo, Lee et al. 2004; Shah, Tran et al. 2004).
Posteriormente surgiu o nilotinibe (AMN107; Tasygna®) que é uma aminopirimidina disponível
na forma oral e desenhada para ser mais seletiva para a quinase do BCR-ABL que o imatinibe,
tendo potência aproximada de 30 vezes maior do que essa droga in vitro. È ainda efetivo em
diversas linhagens celulares mutadas que causam resistência ao MI (Weisberg, Manley et al. 2005;
Kantarjian, Giles et al. 2007).
Ainda em fase de estudos, o bosutinibe (SKI-606) é um inibidor biodisponível em forma oral
das quinases da família Src, ABL, Lyn e Fgr. Em células K562 os estudos mostraram um forte
agente antiproliferação em modelos in vitro e em camundongos (Golas, Lucas et al. 2005).
Modelos de fibroblasto mostram inibição de fosforilação de alvos de Src quinase Lyn e Hck em
concentrações baixas. A ativação da Lyn foi proposta como um possível mecanismo de resistência
ao imatinibe independente do BCR-ABL(Puttini, Coluccia et al. 2006).
Essas drogas (Figura 2) vêm mostrando-se eficazes mesmo tratando-se de indivíduos
resistentes ou intolerantes ao MI.
Figura 2: Estrutura química dos inibidores de tirosina quinase: nilotinibe, imatinibe e dasatinibe
30
A resposta aos inibidores da TK pode ser expressa em três níveis: resposta hematológica,
compreendida como a normalização na contagem das células do sangue periférico e do tamanho
do baço; a resposta citogenética, definida como proporção de células Ph+ residuais, podendo ser
completa (RCC) (RCC: 0% de metáfases Ph+) ou parcial (1-35% de metáfases Ph+). A resposta
maior (RCM) é a soma da completa e da parcial). A resposta molecular é determinada a partir da
quantificação dos transcritos BCR-ABL detectados por PCR em tempo real (REAL-TIME) podendo
ser classificada em resposta molecular completa quando o número de transcritos BCR-ABL não é
detectado ou não são quantificados por RT-PCR (≤ 0,10) (Baccarani, Saglio et al. 2006; Hughes,
Deininger et al. 2006) Figura 3.
Graças ao avanço terapêutico grande parte dos pacientes com LMC sobrevivem por período
igual ou superior a dez anos após o diagnóstico da doença usando as terapias disponíveis
atualmente (Cortes, Talpaz et al. 2005).
Figura 3 Definições de resposta ao tratamento da leucemia mielóide crônica com inibidores de tirosina kinase, mensurando a redução no número de logs dos transcritos BCR-ABL, segundo os critérios da Leukemia Net. *WBBC: contagem de células branca do sangue periférico. † Padronização da representação do baseline representado por 100% na escala
internacional; 0,1 ≅ redução de 3 logs em relação ao valor inicial de transcritos
quantificados. 1. Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors – review and recommendations for
31
“harmonizing” current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Prepublished online. March 7, 2006. DOI 10/1182/blood-2006-01-0092(Baccarani, Saglio et al. 2006; Hughes, Deininger et al. 2006)
Mecanismos de Resistência
Durante o tratamento com esses compostos pode haver o desenvolvimento de resistência,
podendo ser primária (sem resposta desde o início do tratamento) ou secundária (perda de
resposta previamente atingida). Além disso, a resposta ao tratamento pode ser definida como
ótima, sub ótima ou falha de acordo com os critérios da Leukemia Net (Baccarani, Saglio et al.
2006) (Tabela 1).
Tabela 1: Definições de falha de tratamento e reposta sub-ótima da Leukemia Net segundo Baccarani et al, 2006.
Tempo Falha Resposta sub-ótima
Diagnóstico NA NA
3 meses Sem RH/PD Menos que RHC
6 meses Menos que RHC
Ph+>95%
Menos que
RCP(Ph+>35%)
12 meses Menos que RCP
(Ph+>35%) Menos que RCC
18 meses Menos que RCC Menos que RMM
A qualquer momento
Perda RHC e/ou RCC
Mutação (↑ grau de
insensibilidade ao MI)
ACA nas cels Ph+
Perda RMM
Mutação (↓grau de
insensibilidade)
Os clones celulares resistentes apresentam a reativação da atividade quinásica e podem surgir
em qualquer fase da doença (Apperley 2007). A figura 4 mostra os fatores que podem influenciar
na resposta aos inibidores de TK, são eles: aamplificação do gene BCR-ABL, mutações de ponto
no ABL, alterações na biodisponibilidade oral ou no nível de ligação ás proteínas plasmáticas,
alteração na disponibilidade intracelular da droga, evolução clonal e persistência de células
pluripotenciais quiescentes (Branford, Rudzki et al. 2003; Hughes, Kaeda et al. 2003).
32
Figura 4 Mecanismos de resistência aos inibidores de TK segundo Apperley, JF et al, 2007 Parte I (Apperley 2007).
A biodisponibilidade da droga está relacionada ao substrato responsável pelo seu metabolismo
no fígado. As concentrações desse substrato, o citocromo p450 (CYP3A4), tem uma variabilidade
individual e o potencial para interações medicamentosas podem explicar a variabilidade da
concentração de imatinibe entre os pacientes tratados (Gardner, Burger et al. 2006)
O imatinibe está ligado a proteínas plasmáticas em até 96%, então apenas 4% da droga
administrada está disponível para captação celular. Alguns pesquisadores acreditam que o
excesso de ligação da droga com a proteína alfa 1 glicoproteína ácida poderia causar resistência
(Larghero, Leguay et al. 2003; Widmer, Decosterd et al. 2006; Widmer, Decosterd et al. 2008)
Geralmente o efluxo ativo de drogas é um mecanismo de resistência a vários quimioterápicos.
No entanto, há resultados contraditórios a cerca desse mecanismo de resistência em relação ao
imatinibe. A variabilidade de expressão do transportador catiônico orgânico OCT-1 está
relacionada aos TKI e representa um mecanismo importante de influxo de droga para o imatinibe,
mas não para o nilotinibe (Hughes 2006; White, Saunders et al. 2006; White, Saunders et al. 2007;
Hiwase, Saunders et al. 2008).
33
Quanto à hiperexpressão do BCR-ABL, ela é mais freqüente em linhagens celulares (Mahon,
Deininger et al. 2000), porém clinicamente é pouco vista. Um estudo alemão demosntrou um
número irrelevante de pacientes com hiperexpressão do oncogene (Hochhaus 2006).
A evolução clonal é definida por qualquer alteração adicional à presença do cromossomo Ph
único e está associada à evolução para fases mais avançadas da doença e também a uma pior
resposta ao tratamento com os TKI (Lahaye, Riehm et al. 2005; Jabbour, Kantarjian et al. 2007).
Já as células pluripotenciais quiescentes estão presentes em pacientes com resposta
citogenética ao imatinibe (Bhatia, Holtz et al. 2003). Tais células são tipicamente resistentes a essa
droga (Graham, Jorgensen et al. 2002). Embora algumas mutações tenham sido identificadas
nestas células, as alterações do influxo, efluxo e expressão do BCR-ABL sejam postulados como
causa de resistência dessas células, os reais mecanismos dessa resistência ainda permanecem
incertos.
As mutações de ponto estão entre os mecanismos mais comuns de reativação da atividade
quinásica, as quais foram encontradas em 35% a 90% dos pacientes com resistência ao
tratamento com MI (Hughes, Deininger et al. 2006). Até 2006 já haviam sido descritas mais de 50
mutações envolvendo substituições em trinta e uma posições de aminoácidos diferentes (Figura 5).
Figura 5 Representação esquemática do domínio ABL quinase, com sitio de contato de nucleotídeo (B), alça do fosfato (P-loop), domínio catalítico (C) e loop de ativação (A), as mutações em vermelho ocorrem com uma frequencia de 10%, as mutações em verde cerca de 2% e as mutações em preto são menos frequentes. Melo et al, 2007(Melo and Chuah 2007).
As mutações localizadas especificamente no sítio de ligação do ATP ao domínio da quinase
(P-loop ou alça P) podem impedir ou dificultar a ligação dos inibidores à proteína através da
interrupção de pontos críticos de contato ou da modificação da conformação protéica(Branford,
34
Rudzki et al. 2003). Outro grupo de mutações que faz com que a proteína quinase também
permaneça na conformação ativa está localizado na região A - loop (Faderl, Hochhaus et al. 2004).
Dentre todas as mutações descritas até o momento, particularmente a T315I, que leva a
substituição da treonina pela isoleucina no aminoácido 315 (Figura 6), têm sido estudada mais
detalhadamente por tornar a proteína mutante altamente insensível as drogas inibidoras da
proteína tirosina quinase, mesmo com o re-escalonamento de dose dos inibidores existentes para
a dose máxima (Jabbour, Kantarjian et al. 2008).
Figura 6 Estrutura molecular da primeira mutação descrita e a única insensível a todos os TKI, a T315I, por Gorre et al em 2001.
A interação com o MI é estabilizada por pontes de hidrogênio entre os resíduos Y253 e N322.
A ruptura dessas pontes promove uma configuração ativa permanente, a qual o imatinibe não pode
ligar-se (Funke 2008). São exemplos destas mutações a M244, G250, Q252, Y253 e E255.
Mutações como a M244V, Y253H/F e E255K segundo o grupo australiano estão associadas a uma
menor sobrevida dos pacientes e maiores chances de progressão de doença (Branford 2007;
Shah, Skaggs et al. 2007). A mutação F317L/I é sensível apenas ao nilotinibe e as mutações
F311L e F359V sozinhas não causam resistência, porém essas acompanham clones mutantes
altamente insensíveis (Chomel, Sorel et al. 2008). Há, ainda, algumas diferenças entre mutações
encontradas com os diferentes inibidores de TK. Em pacientes em uso de nilotinibe mutações
como a Y253H, E255K, e T315I são frequentemente encontradas, enquanto pacientes em uso de
dasatinibe apresentam mutações como V299L, T315I e F317L (O'Hare, Eide et al. 2007). Na tabela
2, encontra-se o perfil de sensibilidade dessas mutações aos diferentes inibidores de TK.
35
Tabela 2:Sensibilidade das mutações no domínio da quinase no BCR-ABL aos inibidores de tirosina quinase de acordo com O’Hare T, Eide CA, Deininger M, Blood 2007 (O'Hare, Eide et al. 2007).
IC50: É a concentração do inibidor capaz de reduzir a viabilidade celular em 50%; T: valores de IC50 retirados de Burgess MR, Skaggs
BJ, Shah NP, Lee FY, Sawyers CL. Comparative analysis of two clinically active BCR-ABL kinase inhibitors reveals the role of
conformation-specific binding in resistance. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: 3395-400; ‡: valor de IC50 retirado de Shah NP. Nicoll
JM, Nagar B, et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitors imatinib
(STI571) in chronic phase and blast crisis in chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2002; 2: 117-125; §: valor de IC50 retirado de Shah
NP, tran C, Lee FY, Chen P, Norris D, Sawyers CL. Overriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor. Science. 2004;
305:399-401. ( O’Hare T, Eide CA, Deininger MW. BCR-ABL kinase domain mutations, drug resistance, and the Road to a cure for
chronic myeloid leukemia. Blood. 2007; 110: 2242-49.
Quando ocorre uma disfunção da posição inativa da quinase necessária para a ligação dos
TKI o ABL passa a ter uma conformação ativa levando a uma resistência moderada as drogas, o
que talvez possa ser resolvido com o re-escalonamento de dose. Nesta região da alça de ativação
(A-loop) as mutações mais comuns são a E355, V379, L387 e H396 (O'Hare, Eide et al. 2007).
Entre a região que compreende os resíduos M343 e F359 frequentemente ocorre a
mutação M351T que interage com o domínio SH da quinase, que é responsável pela auto-inibição
do ABL, o que leva a conformação ativa, a qual os TKI não podem se ligar [33].
36
Figura 7 Nilotinibe (AMN) Mutações altamente sensíveis (vermelho), mutações de média sensibilidade (laranjado), mutações de baixa sensibilidade ou insensíveis (azul).
Screening De Mutações No Gene Bcr-Abl Usando D-Hplc
Dada a importância da identificação da mutação T315I e outras mutações na região da alça do
fosfato e no sítio de contato em pacientes resistentes aos medicamentos disponíveis torna-se cada
vez mais importante o desenvolvimento de métodos que sejam sensíveis e de fácil acesso a rotina
laboratorial. Atualmente o método empregado na rotina desta detecção é o de seqüenciamento e
em menor escala o ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide-polymerase chain reaction) (Jiang,
Saw et al. 2007). A técnica de seqüenciamento é uma técnica robusta, porém sua sensibilidade
entre 20% e 25% deixa a desejar em relação a outras técnicas (Jones, Kamel-Reid et al. 2009).
Enquanto que a tecnologia de ASO-PCR é extremamente sensível, mas a aplicação desta técnica
em rotina de laboratório é atualmente inviável devido ao tempo de execução e do custo dos
reagentes empregados (Pfeifer, Wassmann et al. 2007). Neste contexto, a técnica de D-HPLC
começou a ser empregada juntando as vantagens de sensibilidade, rapidez e baixo custo. Esta
técnica é um método para screening de mutações baseado na formação de heteroduplex entre os
alelos mutantes e os alelos selvagens a partir da desnaturação parcial dos produtos da reação em
cadeia da polimerase. O D-HPLC já foi utilizada para detecção de mutações em diversas doenças
tais como polipose retal e outros tipos de câncer colorretal (Hegde and Roa 2006; Chen, Liu et al.
2008; Wang, Chen et al. 2008), adrenoleucodistrofia (Ke, Wang et al. 2008), síndromes
mielodisplásicas (Wulfert, Kupper et al. 2008) e melanoma (Harland, Goldstein et al. 2008). Em
LMC já foi utilizada por diversos grupos mostrando uma alta sensibilidade (Deininger, McGreevey
et al. 2004; Soverini, Martinelli et al. 2004; Soverini, Martinelli et al. 2005; Bussolari, Candini et al.
37
2007; Pfeifer, Wassmann et al. 2007; Ernst, Erben et al. 2008) e reprodutibilidade na identificação
de alterações nas duplas fitas de material genético.
Propusemos a utilização da técnica de D-HPLC para fazer screening de mutações nos
pacientes com LMC com falha de tratamento ou resposta sub-ótima, principalmente da mutação
T315I que é responsável pela resistência aos TKI. Neste contexto, a avaliação molecular e o
rastreamento de mutações são pontos de referência importantes na avaliação da eficácia
terapêutica dos inibidores de TK disponíveis atualmente para o tratamento da LMC (Hughes,
Kaeda et al. 2003).
Justificativa
O uso da técnica de D-HPLC tem sido descrito como promissor na identificação de
mutações e polimorfismos com alta sensibilidade. A identificação de mutações pode ajudar no
direcionamento do manejo clínico do paciente. Quanto mais cedo for esta identificação, a chance
de uma resposta ao tratamento aumenta. Assim, o emprego da técnica de D-HPLC no screening
de mutações na rotina laboratorial de pacientes com LMC pode trazer grandes avanços na decisão
do tratamento adequado.
38
OBJETIVOS
39
OBJETIVOS
Objetivos Gerais
Análise de mutações e polimorfismos no gene BCR-ABL.
Objetivos Específicos
Fazer o screening do éxon 6 do gene BCR-ABL por D-HPLC e analisar a freqüência das
mutações compreendidas entre os aminoácidos 303 e 361, principalmente a mutação
T315I, em pacientes com LMC submetidos a tratamento com inibidores de tirosina kinase
como primeira ou segunda linha de tratamento, com resposta sub-ótima ou falha de
tratamento de acordo com os critérios da Leukemia Net.
Fazer o screening do gene BCR-ABL (éxons 4 a 10) para verificar a existência de
mutações no gene BCR-ABL por D-HPLC e sequenciamento com a finalidade de pesquisar
mutações ainda não descritas na literatura.
40
PACIENTES E MÉTODOS
41
PACIENTES E CONTROLES
Para o screening do éxon 6 foram selecionados 93 pacientes com LMC, de acordo com os
critérios da Leukemia Net (Baccarani, Saglio et al. 2006). Destes, 5 eram intolerantes, 67
resistentes e 21 com resposta sub-ótima (Tabela 3). Como controle negativo foi usado o sangue
periférico doadores de sangue do Hemocentro da UNICAMP.
Tabela 3: Características dos pacientes analisados para o screening de mutação no exon 6.
Dados na data da pesquisa de mutação Variáveis n=93 (%) ou (range) Gênero (masculino/feminino/%) 62/31 (67%/33%) Idade (mediana/variação) anos 48 (18-80) Status da Doença Fase Crônica 81 (87%) Fase Acelerada 04 (5%) Crise Blástica 08 (4%) Tratamento Imatinibe 68 (73%) Dasatinibe 19 (20%) Nilotinibe 06 (7%)
Resposta ao Tratamento com ITK* Intolerantes 05 (5%) Resistentes 67 (72%) Resposta sub-ótima 21 (23%) Tempo até início do tratamento com ITK** 04 (0-143) Idade diagnóstico (mediana/variação) anos 44 (05-79) Tratamento anterior Sim (α-intérferon/TMO***) 47 (51%) Não (exceto hydroxiuréia) 46 (49%) TMO prévio (alogênico/ autólogo) 03/03 (3/3%) Sokal e Hasford ao diagnóstico Baixo 21/29 (23/31%) Intermediário 30/32 (32/34%) Alto 20/09 (21/10%) Não avaliáveis 22/23 (24/25%) Dados referentes ao último dia de tratamento ou última visita Status da doença Fase Crônica 78 (84%) Fase Acelerada 01 (1%) Crise Blástica 01 (1%) Mortos 13 (14%) Causa do óbito Pós-TMO (neutropenia) 04 (4%) Progressão de doença 06 (7%) Nova neoplasia**** 03 (3%)
* Inibidores de tirosina quinase. ** Tempo em meses. *** Transplante de medula óssea. ****
Adenocarcinoma de cólon e carcinoma metastático de células escamosas.
42
Para o screening de mutações de todo o gene BCR-ABL os pacientes foram selecionados de
acordo com os mesmos critérios citados para o éxon 6. Foram estudados 37 pacientes com LMC
(Tabela 4), Como controle negativo usamos a linhagem celular HL60 que não possui a
translocação BCR-ABL.
Tabela 4:Características dos Pacientes Analisados para o screening de mutação em todo o gene BCR-ABL.
Dados na data da pesquisa de mutação Variáveis n=37 (%) ou (range) Gênero (masculino/feminino/%) 21/16 (57%/43%) Idade (mediana/variação) anos 49 (18-80) Status da Doença Fase Crônica 29 (78%) Fase Acelerada 6 (17%) Crise Blástica 2 (5%) Tratamento Imatinibe 28 (76%) Dasatinibe 7 (19%) Nilotinibe 2 (5%)
Resposta ao Tratamento com ITK* Resistentes 36 (97%) Resposta sub-ótima 1 (3%) Tempo até início do tratamento com ITK** 24 (0-143) Idade diagnóstico (mediana/variação) anos 35 (05-79) Tratamento anterior Sim (α-intérferon/TMO***) 16 (43%) Não (exceto hydroxiuréia) 20 (54%) TMO prévio (alogênico) 1 (3%) Sokal e Hasford ao diagnóstico Baixo 16/12 (43/33%) Intermediário 6/8 (17/22%) Alto 3/2 (8/5%) Não avaliáveis 12/15 (32/40%)
Dados referentes ao último dia de tratamento ou última visita Status da doença Fase Crônica 33 (88%) Fase Acelerada - (-) Crise Blástica 2 (6%) Mortos 2 (6%) Causa do óbito Pós-TMO (neutropenia) 1 (3%) Progressão de doença 1 (3%)
* Inibidores de tirosina quinase. ** Tempo em meses. *** Transplante de medula óssea.
43
MÉTODOS Avaliação Clínica
Com o propósito de caracterizar a população do estudo foram obtidos dos prontuários de
cada um dos pacientes os dados relativos à identificação, diagnóstico, terapêutica e ao estágio da
doença. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa (CEP) da faculdade de medicina
da UNICAMP, e foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki. Antes de iniciar o estudo, o
termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) foi obtido (APÊNDICE I).
Análise De Citogenética
Na análise citogenética a amostra foi diluída imediatamente após a coleta, em meio de cultura
RPMI 1640 acrescido de penicilina, heparina e soro fetal bovino (BSA). Foi feita a quantificação
das células brancas em contador automatizado de células (Cell Dyn 1600; Abbott, USA) e a
amostra dividida em três tubos cada um com cerca de 1,0x107 glóbulos brancos por tubo, sendo
mantido em estufa a 37°C “over night”. A cultura foi estimulada com demelcocine para que fossem
obtidas células em metáfase, posteriormente a amostra foi submetida a uma solução hipotônica
(KCl 0,075M) e após 20 minutos a solução fixadora (1:3 ácido acético para metanol). As bandas G
foram obtidas utilizando tampão fosfato 0,06 M pH 6,8 e tripsina 0,02 microgramas e,
posteriormente, o corante Wright, observando o número e o aspecto de metáfases. As imagens
dos cromossomos em metáfase foram capturadas por um sistema automatizado (Cytovision
version 4.4, Aplied Imaging Coorporation), que possibilita o emparelhamento e a ampliação do
tamanho dos mesmos, facilitando a identificação das anormalidades cromossômicas (Figura 8).
Figura 8 Cariótipo de um dos pacientes com LMC do sexo feminino Ph+ que foram inseridos no estudo. Todos os pacientes incluídos apresentaram anãlise citogenética positiva para o cromossomo Philadelphia.
44
Extração de DNA
O DNA genômico (gDNA) para a realização da reação em cadeia da polimerase foi extraído
com GFX™ Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare) seguindo as normas do
fabricante e a integridade do gDNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 1%. Foram
utilizados 500µL de sangue periférico colhido em tubo com EDTA.
Reação em cadeia da polimerase (PCR) – Éxon 6
Para a realização do screening a PCR foi feita utilizando os primers descritos por Irving et
al (Irving, O'Brien et al. 2004). Para a amplificação da região do éxon 6 do gene ABL entre os
aminoácidos 303 e 361 foi feita a PCR utilizando os primers exon 6 forward (5’
GACTGAGGAGCAGAGTCAGA 3’) e exon 6 anti-sense (5’ GCCAGCACTGAGGTTAGAA 3’). A
reação foi feita utilizando 1X de tampão, 2mM de MgCl2, 0,125uM de dNTPs, 0,4 uM de cada
primer e 1U de Taq DNA polimerase (Biotools) em 50 ul de reação final. A condição de reação foi
95ºC por minutos para desnaturação inicial seguido de 35 ciclos de 94ºC por 20 segundos, 56ºC
por 1 min e 72ºC por 1 min e 72ºC por 7 min (Figura 9).
Figura 9 Gel de agorose a 1%, mostrando os produtos da PCR do exon 6 do gene ABL. M é o marcador de peso molecular. B é o branco, 01 é o produto da PCR de um indivíduo controle, 02 a 05 produtos da PCR de amostras de pacientes portadores de LMC Extração de RNA
Após lise das hemácias com solução de NH4Cl e CH5NO3, as amostras de RNA foram
extraídas de leucócitos de sangue periférico total, utilizando o método de extração com o reagente
TRIzol (Gibco-BRL). Para cada mL de TRIzol, foi separada uma quantidade mínima de 5x106 de
células que foram armazenadas em freezer –80oC. Essas amostras foram retiradas do freezer e
incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente. Foi adicionado então 200uL de clorofórmio
gelado e homogeneizamos por inversão por 15 segundos e incubada por 2 minutos a temperatura
ambiente. As amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 13200rpm a 4oC. Depois da
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centrifugação, ocorre a separação das fases; a fase superior e aquosa é a que contém o RNA e
essa fase foi transferida para um novo eppendorf seco, acrescentados 500uL de isopropanol e
incubada por 10 minutos a temperatura ambiente. Novamente as amostras foram centrifugadas por
mais 10 minutos a 13200rpm a 4 oC. Vertendo o tubo o sobrenadante foi removido e adicionado
1mL de etanol 75% gelado e centrifugadas novamente por 5 minutos a 11800rpm a 4oC. O
sobrenadante foi descartado e pellet ressuspendido com água estéril DEPC.
A integridade das amostras foi verificada por eletroforese em gel desnaturante de agarose
a 1,2%. As amostras íntegras apresentaram duas subunidades ribossomais: 18S e 28S (Figura
10). Após a eletroforese, as amostras de RNA foram armazenadas em freezer - 80°C.
Figura 10 Amostra de RNA extraída pelo protocolo de Trizol. As amostras foram visualizadas em gel desnaturante 1,2%. 01- Controle, 02- Paciente.
Síntese de DNA complementar (cDNA)
A leitura do RNA total foi realizada em espectrofotômetro (NanoDrop Techonologies). As
amostras de RNA obtidas foram submetidas à síntese de DNA complementar (cDNA) utilizando-se
o kit Superscript III RTTM (Invitrogen).
Para transcrição, utilizou-se 2 μg de RNA que foram tratados com a enzima DNAseI
(Invitrogen) para remoção de DNA contaminante. O tratamento com DNAse consistiu na adição de
0,5 μl de DNAseI (1u/μl), 0,5 μl de 10x DNAseI Reaction Buffer (200mM Tris-HCl, 20 mM MgCl2,
500 mM KCl2) e água suficiente para um volume final de 10,0 μl de reação. As amostras foram
incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente e a reação bloqueada com a adição de 1,0 μl de
25 mM de EDTA com posterior incubação por 5 minutos a 65°C. Após essa etapa, iniciou-se a
síntese do cDNA complementar com a adição de 1,0 μl de 50 μM oligo (dT)20 e 1,0 μl de 10 mM
dNTP’s. As amostras foram incubadas por 5 minutos a 65°C e em seguida por 1 minutos a 4°C.
Para cada amostra, adicionamos 10,0 μl da seguinte mistura de reação: 2 μl de 10xRT buffer, 4,0
μl de 25 mM MgCl2, 2,0 μl de 0,1 M DTT, 1,0 μl de 40U/μl Rnase OUTTM e 1,0 μl de 200 U/μl
Superscript III RTTM. A reação ocorreu por 50 minutos a 50°C, seguida de 5 minutos a 85°C.
28 S
18 S
46
Verificação da síntese de DNA complementar
A verificação da síntese de cDNA foi feita através da reação de polimerase em cadeia
(PCR) para o gene da beta-actina (β-actina). As reações de PCR foram realizadas com: 5,0 μl de
10xPCR buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM KCl), 1,5 μl de 50 mM MgCl2, 1,0 μl de 10 mM dNTP’s,
1,0 μl de 10 mM de primer BAC_F (5’ – AAGAGATGGCCACGGCTGCT – 3’), 1,0μl de 10 mM de
primer BAC_R (5’ – TCGCTCCAACCGACTGCTGT – 3’), 0,5 μl de Taq DNA polimerase (5U/ μl),
1,0 μl de cDNA e 39,0 μl de água, para um volume final de 50,0 μl. O programa foi iniciado por 2
minutos à 94°C, seguido de 35 ciclos: 94°C/30 segundos, 58°C/45 segundos e 72°C/40 segundos,
sendo finalizado por 72°C/7 minutos. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose 1,5% para verificar a amplificação de um fragmento de 640 pares de base (pb) (Figura
11).
Figura 11 Gel de agarose a 1,5%, com amplificação do gene da beta actina. M, marcador de peso molecular 100 pb; nas colunas 1 a 7 são amostras de cDNA de pacientes com LMC.
Reação em cadeia da polimerase (PCR) – Éxons 4 a 10
Como descrito por Ernst et al (Ernst, Erben et al. 2008) todo o domínio ABL kinase (éxons
4 a 10) do allelo mutado BCR-ABL foi amplificado usando nested PCR. Primeiramente
amplificamos o fragmento nomeado de ABL-A usando os primers sense ABL A- b2f ou ABLA-e1f
que anelam no gene BCR em duas regiões de quebra diferentes (b2 e e1) e o primer anti-sense
ABLA-r que anela na junção do gene ABL (éxons 10 e 11). A sequencia dos primers estão
descritos na tabela 5. O tamanho do fragmento varia entre 1643 e 1814 pares de base (pb)
dependendo do transcrito BCR-ABL do paciente. Posteriormente a amplificação da seqüência
codificadora do ABL foi dividida em três fragmentos denominados ABL-B (codons 207-324 → 401
pb), ABL-C (codons 279-414 → 457 pb), ABL-D (codons 382-517 → 453 pb).
As reações de PCR foram realizadas com: 5,0 μl de 10xPCR buffer (20 mM Tris-HCl, 500
mM KCl), 2,0 μl de 50 mM MgCl2, 4,0 μl de 1,25 mM dNTP’s, 1,0 μl de 10 mM de primer sense,
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1,0μl de 10 mM de primer anti-sense, 0,3 μl de Taq DNA polimerase (5U/ μl), 1,0 μl de cDNA e
35,7 μl de água, para um volume final de 50,0 μl. Para a primeira PCR o programa foi iniciado por 5
minutos à 95°C, seguido de 35 ciclos: 95°C/40 segundos, 55°C/1 minuto e 72°C/1 minuto, sendo
finalizado por 72°C/7 minutos. A segunda PCR foi feita utilizando as mesmas quantidades e
concentrações dos reagentes descritos para a primeira PCR exceto o material do paciente que foi
utilizado o produto da primeira PCR diluído 1:5 e usado 1,0 μl e para a segunda PCR. O programa
foi iniciado por 2 minutos a 95°C, seguido de 35 ciclos: 95°C/30 segundos, 52°C/30 segundos e
72°C/2 minutos, sendo finalizado por 72°C/7 minutos. Os produtos das PCR foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 1,0% para verificar a amplificação dos fragmentos esperados.
Tabela 5: Seqüência dos primers utilizados para amplificação dos éxons 4 a 10 do alelo mutado BCR-ABL para screening de mutações.
Nome Sequência primer Concentração
ABLA-B2 F
ABLA-E1 F
5´-ACAGCATTCCGCTGACCATCAATAAG-3´
5´-ACCGCATGTTCCGGGACAAAAG-3´
100Mm
ABLA-R 5´-ATGGTCCAGAGGATCGCTCTCT-3´ 100mM
ABL-B F
ABL-B R
5´-TGGTTCATCATCATTCAACGGTGG-3´
5´-GTTGCACTCCCTCAGGTAGTC-3´
100mM
ABL-C F
ABL-C R
5´-AAGACCTTGAAGGAGGACACCAT-3´
5´-AGACGTCGGACTTGATGGAGAACT-3´
100mM
ABL-D F
ABL-D R
5´-ACCACTTGGTGAAGGTAGCTG-3´
5´-CCTGCAGCAAGGTACTCACA-3´
100mM
Princípio da Técnica de D-HPLC
Como mencionado anteriormente, esta técnica é um método para screening de mutações
baseado na formação de heteroduplex entre os alelos mutantes e os alelos selvagens a partir da
desnaturação parcial dos produtos da reação em cadeia da polimerase. Esses heteroduplex são
diferenciados dos homoduplex devido à diferença de afinidade iônica de um determinado
fragmento amplificado de DNA, pela fase sólida da cromatografia (coluna de fase reversa) (Irving,
O'Brien et al. 2004; Soverini, Martinelli et al. 2004; Soverini, Martinelli et al. 2005; Yu, Sawyer et al.
2006; Ernst, Erben et al. 2008; Wulfert, Kupper et al. 2008). O produto da PCR é aquecido a 95°C
por 5’ permitindo a desnaturação parcial do DNA, seguido de uma redução lenta de temperatura,
para que as fitas se renaturem aos poucos formando uma dupla fita sem alteração (homoduplex)
ou uma dupla fita sendo uma delas “normal” e outra alterada (heteroduplex). Após a formação dos
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“duplexes”, os fragmentos de DNA são passados por uma coluna de cromatografia líquida de fase
reversa composta por partículas de poliestireno carregadas positivamente com a passagem do
tampão TEAA (acetato de trietilamônio). A carga negativa do DNA, em razão dos seus grupos
fosfato, permite que os fragmentos fiquem aderidos na matriz da coluna através dos grupamentos
amônia do tampão TEAA. A eluição das moléculas de DNA é feita pela passagem de um solvente
orgânico, a acetronila (ACN), que ao aumentar sua concentração diminui a atração entre os
fragmentos de DNA e o TEAA. Devido ao relaxamento das ligações entre as fitas pela baixa
temperatura, os heteroduplexes permanecem mais fracamente ligados em relação aos
homoduplexes sendo eluídos primeiramente Os heteroduplexes serão detectados pelo
equipamento antes da detecção dos homoduplexes através de um detector ultravioleta a
absorbância é medida e os resultados mandados para o computador, que fornece gráficos com
picos que permitem a análise das mutações (Figura 12) e as amostras com perfil diferente do
padrão devem ser seqüenciadas ou submetidas a outras análises confirmatórias.
Figura 12 Formação dos homoduplexes e heteroduplexes a partir da desnaturação e renaturação do produto de PCR. Após a detecção pela luz UV formam-se os picos.
Análise do D-HPLC – exon 6
O produto da PCR foi analisado pelo aparelho de D-HPLC (Transgenomic WaveTM Nucleic
Acid Fragment Analysis System, Omaha, NE, USA). As condições ótimas para a análise dos
heteroduplexes foram calculadas usando o NavigatorTM software, versão 1.6.0 (TransgenomicTM,
Omaha, NE, USA) sendo 62,3ºC a temperatura ótima para análise e o time-shift 0,8.
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Figura 13 Exemplos de análise por D-HPLC. a) Padrão normal que sugere a ausência de mutação e b) Padrão alterado, que sugere a presença de mutação.
Figura 14 Exemplo do perfil cromatográfico e o resultado do seqüenciamento de uma das amostras controle e outra amostra mutada (T315I).
D-HPLC – exons 4 a 10
Os produtos das PCRs foram analisados pelo aparelho de Denaturing-HPLC (Transgenomic
WAVE® Nucleic Acid Fragment Analysis System). As condições ótimas para a análise dos
heteroduplexes foram calculadas usando o NavigatorTM software, versão 1.6.0 (TransgenomicTM,
Omaha, NE, USA). As temperaturas e time-shift ideais encontradas foram: ABL-B (59,2°C - 0,21,
50
61,2°C - 0,84 e 62,7°C – 2,1), para ABL-C (58,8°C – 0,21, 61,0°C – 0,91 e 61,7°C – 2,35) e para
ABL-D (60,1°C – 0,28 e 61,0°C – 1,19) (Figura 15).
Figura 15 Perfil de amostras de células HL-60 e pacientes usados para a padronização da técnica no gene BCR-ABL. Fragmento correspondente ao que chamamos de ABL-B, ABL-C e ABL-D.
Seqüenciamento das amostras
Após o screening para o éxon 6, somente as amostras que tiveram perfis diferentes do
controle foram submetidas ao seqüenciamento automático no aparelho MEGA BACE 1000 DNA
Analysis System (Molecular Dynamics/ Amersham - Life Science) usando primer forward
(5’GACTGAGGAGCAGAGTCAGA 3’) ou primer anti-sense (5’ GCCAGCACTGAGGTTAGAA 3’). A
seqüência encontrada foi comparada com a seqüência controle descrita no GenBank (M14752).
51
Para o screening do exons 4 ao 10 todas as amostras foram submetidas ao seqüenciamento
no mesmo seqüenciador, usando os primers sense ou anti-sense descritos anteriormente. A
seqüência encontrada foi comparada com a seqüência selvagem do gene ABL descrita no
GenBank (U07563) para confirmação dos resultados.
Análise estatística
A análise de sobrevida de todo o grupo, e separadamente do grupo com mutação e do
grupo sem mutação foi feita usando o método de Kaplan Meier (KM) para a curva de sobrevida e
modelo de regressão para análise da significância estatística de riscos proporcionais entre os
grupos. Os eventos considerados para a a contrução da curva e análise de sobrevida geral foram:
data em que a mutação foi detectada pela primeira vez, para os pacientes mutados; data da
primeira pesquisa de mutação para os pacientes não mutados; data de óbito para os pacientes que
foram a óbito; e data do último follow-up.
52
RESULTADOS
53
RESULTADOS
Para o screening do éxon 6 foram avaliados 93 pacientes com LMC, 23 amostras (25%)
mostraram um perfil de eluição no D-HPLC anormal em relação ao controle, o que sugeriu a
presença de mutação. Um desses pacientes apresentou durante a primeira análise um perfil
normal. Posteriormente (aos 3 meses de tratamento), um pequeno aumento no pico do
heteroduplex foi detectado, entretanto no sequenciamento não foi detectada nenhuma mutação.
Após 3 meses (aos 6 meses de tratamento) foi feita outra análise e o pico do heteroduplex tinha
aumentado ainda mais e foi identificada pelo sequenciamento a mutação T315I, e aos 12 meses
de tratamento o perfil do D-HPLC se mostrava característico de presença de mutação na região do
aminoácido 315 (Figura 16).
Figura 16 Perfil cromatográfico de um paciente com LMC que desenvolveu a mutação T315I durante o tratamento com mesilato de imatinibe. A) perfil da amostra na primeira análise, B) o perfil após 3 meses de tratamento, C) aos 6 meses de tratamento com perda de resposta hematológica e citogenética e D) aos 12 meses de tratamento.
O sequenciamento direto do amplicon não foi capaz de identificar mutação em 6 (~6%)
pacientes que tiveram perfil anormal no D-HPLC. Esses amplicons foram clonados usando o vetor
pjet2.1 e seqüenciados novamente. Usando esta estratégia foi possível identificar duas mutações
(M351T e C305R). O sequenciamento automático confirmou a presença de um polimorfismo,
54
T315T (1 paciente), e nove mutações de ponto, seis previamente já descritas na literatura: T315I (6
pacientes), F317L (1 paciente), V339L (1 paciente), M351T (1 paciente), E355G (1 paciente) e
F359V (4 pacientes).e três novas mutações: C305R (1 paciente), D325D (2 pacientes) and I360S
(2 pacientes) (Figura 17). Um desses pacientes apresentou duas mutações (Tabela 6).
Tabela 6: Perfil dos pacientes com LMC que apresentaram alguma alteração no perfil de screening do exon 6 no DHPLC.
Paciente Sexo Idade
(anos)
Status na data
da pesquisa
de mutação
Tratamento
Resposta
clínica ao
tratamento
Mutação Status do paciente
atualmente
1 M 47 FC Imatinibe Resistente Não
identificada Obito
2 M 67 FC Dasatinibe Resistente E355G Obito
3 M 52 FC Nilotinibe Resistente Não
identificada FC
4 M 60 CB Dasatinibe Resistente T315I Obito
5 F 45 FA Imatinibe Resistente F359V Obito
6 M 44 FC Imatinibe Resistente F359V
I360S** FC
7 M 38 FC Dasatinibe Resistente T315I FC
8 F 34 FC Imatinibe Resistente F359V FC
9 F 37 FC Dasatinibe Resistente F359V FC
10 F 45 FC Imatinibe Resistente V339L FC
11 M 41 FC Imatinibe Sub otima I360S FC
12 M 29 CB Dasatinibe Resistente T315T Obito
13* M 59 FC Imatinibe Resistente T315I FC
14 M 60 FC Imatinibe Resistente Não
identificada FC
15 M 64 FC Imatinibe Resistente M351T FC
16 F 56 CB Imatinibe Resistente T315I FC
17 M 59 FA Dasatinibe Resistente T315I Obito
18 M 33 CB Nilotinibe Resistente T315I Obito
19 M 50 CB Imatinibe Resistente F317L Dead
20 M 20 FC Imatinibe Resistente D325D** FC
21 M 69 FC Dasatinibe Resistente Não
identificada FC
22 M 55 FC Imatinibe Resistente D325D Obito
23 F 65 FC Dasatinibe Resistente C305R** FC
55
Figura 17 Novas mutações encontradas no screening do éxon 6, primeira coluna: perfil de sequenciamento normal, segunda coluna: perfil de sequenciamento alterado, terceira coluna: perfil cromatográfico alterado
Em relação às novas mutações descritas aqui achamos que era conveniente fazer um
relato de como se desenvolveu a resposta desses pacientes em relação a parte clínica: 1 - I360S:
Dois pacientes apresentavam essa mutação. Um paciente começou nilotinibe em fase acelerada e
mostrou concomitantemente a mutação F359V, que é uma mutação de resistência intermediária ao
imatinibe e nilotinibe, mas que é sensível à dasatinibe (O'Hare, Eide et al. 2007). Este paciente
teve uma resposta hematológica transitória com nilotinibe, mas perdeu esta resposta depois de
alguns meses. O tratamento foi modificado para dasatinibe, e o paciente atingiu uma resposta
hematológica completa. O outro paciente que apresentou esta mutação obteve CyCR com
imatinibe, mas no momento da coleta de amostras para análise tinha critérios de resposta sub-
ótima (impossibilidade de atingir MMR em 18 meses); 2 - D325D: Esta mutação também foi
identificada em dois pacientes. Um perdeu resposta hematológica com imatinibe e mudou a terapia
para dasatinibe, alcançando um RHC. No entanto após 6 meses de dasatinibe ocorreu progressão
hematológica. O outro paciente apresentou resistência citogenética primária, foi encaminhado para
transplante de medula óssea e morreu devido a toxicidade associada ao transplante; 3 - C305R: Esta mutação foi detectada em um paciente tratado com dasatinibe por quase dois anos. Antes do
dasatinibe, a paciente estava em fase acelerada e apresentou a mutação M244V. No momento da
detecção da mutação C305R, ela apresentava uma resposta citogenética parcial ao dasatinibe.
56
Após 3 meses, ela alcançou CCyR e, após 15 meses, perdeu resposta hematológica e
citogenética. Ela ainda está viva usando dasatinibe, e está em progressão da doença. Os
pacientes que apresentaram as novas mutações foram submetidos ao seqüenciamento de todo o
domínio da quinase BCR-ABL e nenhuma mutação adicional foi observada até agora.
A sobrevida global (OS) para todo grupo foi de 80% em uma mediana de tempo de
observação de 30 meses. OS para pacientes sem mutações foi de 87% e para os pacientes com
mutações foi de 56% em uma mediana de tempo de observação 37 e 10 meses, respectivamente
(p <0,0001, RR = 68) (Anexo IV).
No screening de todo o gene BCR-ABL (Figura 18), das 37 amostras analisadas 17 (46%)
tiveram perfil cromatográfico diferente do controle Como estávamos estabelecendo a padronização
do método, procedemos com o seqüenciamento de todas as amostras e os resultados obtidos
foram comparados com a seqüência depositada no banco de dados GenBank (U07563). Das 17
amostras com alteração do perfil cromatográfico, observamos a presença de mutação em 13
amostras (Tabela 6). Acreditamos que isso se deva a sensibilidade do método de D-HPLC que é
capaz de identificar tanto polimorfismos quanto mutações com maior eficiência que o
seqüenciamento (Jones, Kamel-Reid et al. 2009).
Figura 18 Exemplo de uma amplificação de três diferentes regiões do transcrito BCR-ABL. ABL-B (codons 207-324 → 401 pb), ABL-C (codons 279-414 → 457 pb), ABL-D (codons 382-517 → 453 pb).
Entre as 13 amostras foram encontradas 1 polimorfismo e 9 mutações diferentes. A tabela
7 mostra as mutações identificadas e o perfil dos pacientes mutados. Dentre as amostras com
padrão diferente do esperado, encontramos 3 amostras que tiveram após sequenciamento a
mesma alteração na região do aminoácido 445, uma troca de uma base guanina por uma base
timina (R445L) (Figura 19).
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Figura 19 Sequenciamento de um paciente que foi encontrada a alteração CA - AC na posição 1698 (R445L). Tabela 7:Características gerais dos pacientes que tiveram padrão diferente do normal no D-HPLC para screening de todo o gene BCR-ABL.
Paciente Sexo Tratamento Resposta Status coleta Mutação Status atual
1 F imatinibe resistente FC F359V FC
2 M nilotinibe sub-ótima FC F359V/I360S FC
3 F imatinibe resistente FC R445L/L298L FC
4 M nilotinibe sub-ótima FC K419N FC
5 M imatinibe resistente FC L298L FC
6 M imatinibe sub-ótima FC K419N FC
7 M dasatinibe resistente FA Não detectada FA
8 M imatinibe resistente FC Y353Y FC
9 F imatinibe resistente FC E255K FC
10 M imatinibe resistente FC R445L/L298L FC
11 M dasatinibe resistente CB T315I ÓBITO
12 M imatinibe resistente CB F317L ÓBITO
13 F imatinibe resistente FC F359V FC
14 M nilotinibe resistente FC M351T FC
15 F imatinibe resistente FC Não detectada FC
16 M imatinibe resistente FC Não detectada FC
17 M imatinibe resistente FC Não detectada FC
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Figura 20Curvas de sobrevida geral dos pacientes inseridos no estudo para o screening de mutações no éxon 6, dos pacientes sem mutações e de todo o grupo, mostrando um risco relativo igual a 68 e o p < 0.001.
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DISCUSSÃO
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DISCUSSÃO
Descrevemos aqui o screening de mutações no éxon 6 e de todo o gene BCR-ABL usando
a técnica de D-HPLC em uma população de pacientes resistentes aos TKI. Primeiramente
escolhemos esta região do gene, onde está localizado T315I mutação, devido à importância desta
mutação na prática clínica. Mutações neste sítio são altamente resistentes à exposição aos TKI
(Gambacorti-Passerini, Gunby et al. 2003; Funke 2008). Além disso, a identificação precoce de
mutações no gene BCR-ABL pode auxiliar na tomada de decisão para a alternativa de tratamento
dos pacientes com LMC (Irving, O'Brien et al. 2004; Soverini, Martinelli et al. 2004).
A população analisada incluiu um número de pacientes previamente tratados com
interferon e com uma longa história de LMC, com início tardio do tratamento com imatinib,
explicando a elevada taxa de falha e resposta sub-ótima. No Brasil, o imatinibe já vem sendo
usado por cerca de dez anos e o dasatinibe foi aprovado como segunda linha de tratamento para
LMC apenas em 2008.
As características diferentes do padrão de eluição indicou a troca de nucleotídeo em 25%
dos nossos pacientes submetidos ao screening do éxon 6. Para confirmar as mutações nas
amostras alteradas no D-HPLC, essas amostras foram submetidas ao sequenciamento. No caso
do screening do gene inteiro, todas as amostras foram submetidas ao sequenciamento.
Nas amostras usada na pesquisa de mutação para o éxon 6, o sequenciamento
possibilitou a identificação de 19 de 23 casos. Estas mutações estão localizadas no sítio de contato
da proteína BCR-ABL ou no domínio catalítico. As mutações mais freqüentes identificadas foram a
T315I (6 pacientes) e F359V (4 pacientes) no éxon 6 e no BCR-ABL inteiro a F359V (3 pacientes).
Os mesmos resultados foram relatados por vários grupos que utilizam a mesma abordagem (Irving,
O'Brien et al. 2004; Soverini, Martinelli et al. 2004; Ernst, Erben et al. 2008; Ernst, Hoffmann et al.
2008). No éxon 6, nove mutações foram identificadas nessas regiões, três delas foram
identificadas, ao nosso conhecimento, pela primeira vez (C305R e D325D no sítio de contato e
I360S no domínio catalítico).
Pacientes apresentando novas mutações localizadas no sítio de contato do imatinibe
(C305R e D325D) apresentaram resistência primária ou progrediram após tratamento com
dasatinibe. De fato, a maioria das mutações que conferem resistência ao dasatinibe se encontram
no sítio de contato entre o resíduo e a droga. Embora a mutação D325D não apresente qualquer
alteração de aminoácido, ambos os pacientes eram muito resistentes ao imatinibe. No sítio de
contato da proteína BCR-ABL, também detectamos um polimorfismo (T315T), que foi
recentemente relatado por Ernst et al (Ernst, Hoffmann et al. 2008). Embora este pareça ser um
achado raro, deve ser diferenciado da mutação T315I, uma vez que o perfil do D-HPLC é
semelhante nos dois casos.
61
Em relação à alteração R445L, como esta é uma mutação ainda não descrita na literatura
e foi encontrada em um número relevante de pacientes (aproximadamente 8%), precisaremos
estudar em uma população maior de pacientes e controles com a intenção de verificar se não trata
se de um polimorfismo relacionado ou não à doença.
Na C305R ocorre uma mutação que leva à troca de um resíduo de cisteína por uma
arginina. Este paciente é insensível ao Imatinibe com resposta sub ótima ao dasatinibe. A cisteína
é um aminoácido polar neutro que tem um papel fundamental na manutenção da estrutura terciária
das proteínas. Para formar ligações dissulfureto entre os grupos tiol, aumentando a estabilidade
molecular e a resistência à proteolise. Arginina é uma base polar, é um aminoácido que tem
múltiplas pontes de hidrogênio sendo ideal para tornar os grupos carregados negativamente. Por
esta razão a arginina na maioria das vezes está posicionada do lado de fora das proteínas onde
pode interagir com o ambiente polar. Talvez as trocas nestes aminoácidos podem modificar a
estrutura protéica, tornando a proteína BRC-ABL insensível ao tratamento com imatinibe.
As alterações observadas na mutação D325D aparentemente não tem importância
biológica uma vez que o mesmo aminoácido é traduzido, mas é um importante achado. A mudança
entre os resíduos da isoleucina e a serina encontrada na mutação I360S pode estar envolvida com
a estrutura das proteínas, devido o resíduo da isoleucina ter uma cadeia lateral quiral é um
aminoácido apolar, enquanto o resíduo de serina é polar.
A análise de sobrevida foi feita apenas para o grupo estudado para o éxon 6, na análise, os
pacientes que apresentavam mutações tiveram claramente um resultado pior, após a detecção da
mutação, em relação aos não mutados (Figura 20).
Em quatro casos com perfil anormal, não fomos capazes de identificar mutações após o
seqüenciamento, provavelmente devido à sensibilidade do método, que exige uma concentração
relativamente elevada de amplicons para a detecção da mutação (Baccarani, Pane et al. 2008). A
sensibilidade do D-HPLC segundo a literatura é variável entre 1% a 10%, dependendo da
seqüência e do comprimento dos fragmentos a serem analisados (Irving, O'Brien et al. 2004;
Soverini, Martinelli et al. 2004; Soverini, Martinelli et al. 2005; Ernst, Erben et al. 2008; Ernst,
Hoffmann et al. 2008). Usando a mistura de células da linhagem celular BaF3 BCR-ABL e a
linhagem celular BaF3T315I em concentrações entre 0,1% e 100%, Ernst et al. mostrou que a
sensibilidade do D-HPLC atinge 0,1%, enquanto a do seqüênciamento é de 10%. Os clones
mutantes são selecionados durante o tratamento com inibidores da TK, no início deste processo, a
relação entre células mutantes e não mutantes é reduzida. (Ernst, Erben et al. 2008).
Estamos propondo para a próxima fase do projeto um estudo para verificar a sensibilidade
deste método em nosso laboratório. Para isso realizaremos cultura de células BaF3 mutadas e não
mutadas (linhagens gentilmente cedida pelo Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health and
Science University dos Estados Unidos.) que serão analisadas por D-HPLC e seqüenciamento em
diferentes concentrações. Este experimento seguirá os moldes estabelecidos por Ernst et al, 2008.
O estabelecimento deste experimento é de fundamental importância para o nosso laboratório, uma
62
vez que existe a possibilidade da utilização deste método para detecção de mutações em
pacientes tratados no Hemocentro da UNICAMP como procedimento de rotina.
Uma interessante demonstração da sensibilidade do método D-HPLC na identificação
precoce de mutação ocorreu em um dos nossos pacientes que demonstrou na primeira análise um
perfil anormal em D-HPLC e a mutação não foi identificada por sequenciamento. Neste momento, o
paciente teve CCyR (Figura 16) e três meses depois, esse paciente perdeu a resposta citogenética
e a mutação T315I foi identificada por ambas as técnicas.
63
CONCLUSÃO
64
CONCLUSÃO
Os resultados mostraram que o DHPLC é capaz de identificar diferentes perfis
cromatográficos e com isso auxiliar na detecção de novas mutações e polimorfismos associados
ou não a leucemia mieloide crônica. Neste trabalho foram descritas três novas mutações além de
identificarmos uma outra alteração que estudaremos em uma população maior de pacientes e
controles para verificarmos se é um polimorfismo relacionado ou não relacionado a esta doença ou
se é mais uma mutação nova.
Tivemos êxito no cumprimento dos nossos objetivos, além de implantarmos a técnica na
rotina de monitoramento dos pacientes com LMC tratados no Hemocentro com inibidores de
tirosina quinase como primeira ou segunda linha de tratamento, com resposta sub-ótima ou falha
de tratamento de acordo com os critérios da Leukemia Net.
Em resumo, o D-HPLC demonstrou ser um método sensível e prático para o
acompanhamento do aparecimento de mutações no domínio da quinase, inclusive da mutação
T315I, na rotina clínica. Mutações nessa região estudada são clinicamente relevantes e podem
conferir um pior prognóstico. A detecção precoce pode ser uma ferramenta importante para
otimizar a terapêutica na LMC. Os resultados obtidos com relação às mutações no exon 6 estão
reportados no artigo que foi aceito para publicação na revista Leukemia & Lymphoma (APÊNDICE
II).
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72
APÊNDICES
73
APÊNDICE I
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Eu, _________________________________________________________________________, fui
convidado e aceito participar do estudo intitulado “Análise da Expressão Gênica Diferencial e Avaliação Laboratorial da Mutação T315I por Métodos Moleculares e Cromatográficos em Pacientes com Leucemia Mielóide Crônica Tratados Com Inibidores de Tirosino quinase”, e
autorizo à equipe médica desta instituição, sob a coordenação do Prof. Dr. Cármino Antônio de
Souza, a avaliar-me clinicamente. Estou ciente que fornecerei uma amostra de sangue (10-20ml)
ou medula óssea (05ml), e sei que esta amostra será utilizada para a avaliação laboratorial da
expressão gênica e mutações específicas. Também estou ciente que serei comunicado se houver
alteração da minha expressão gênica e/ou se for constatado que apresentei a mutação pesquisada
que leva a resistência aos inibidores de tirosino quinase. Sei que minha amostra só será utilizada
para avaliar outras alterações genéticas se houver aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de
Ciências Médicas da UNICAMP. Estou ciente de que não terei prejuízo algum em relação à
realização destes exames. Sei que posso sair do estudo a qualquer momento, e que isto não irá
prejudicar o meu tratamento na UNICAMP. Sei ainda, que meus dados pessoais serão mantidos
em sigilo pelo pesquisador e se eu tiver qualquer dúvida sobre o estudo poderei procurar a
qualquer momento o pesquisador ou o médico responsável pelo estudo. Se tiver reclamações
sobre qualquer procedimento do estudo, poderei procurar a secretaria do Comitê de Ética da
Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP Tel: 3788 7232. Eu li/ouvi o conteúdo deste termo e
recebi esclarecimentos sobre as minhas dúvidas oralmente.
------------------------------------------------- ------------------------------------------------
Paciente ou Responsável Pesquisador Responsável
------------------------------------------------- Data: ___/___/___
Médico Responsável
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