INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZONIA – INPA

Programa de Pós Graduação em Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva – PPG-GCBEv

FRANCISCO CARLOS DE SOUZA VALENTIM

Manaus - Amazonas

2011

CITOTAXONOMIA DE ARRAIAS DE ÁGUA DOCE

(MYLIOBATIFORMES, POTAMOTRYGONIDAE) DA BACIA

AMAZÔNICA CENTRAL

ii

FRANCISCO CARLOS DE SOUZA VALENTIM

Orientadora: Eliana Feldberg, Dra.

Manaus - Amazonas

2011

CITOTAXONOMIA DE ARRAIAS DE ÁGUA DOCE

(MYLIOBATIFORMES, POTAMOTRYGONIDAE) DA BACIA

AMAZÔNICA CENTRAL

Tese apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Genética Conservação e

Biologia Evolutiva – PPG-GCBEv como parte

dos requisitos para obtenção do título de

Doutor em Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva.

iii

Ficha Catalográfica

Sinopse: São apresentados estudos citogenéticos de sete espécies e dois citótipos em dois gêneros de arraias de água doce da Amazônia Central. Os estudos envolveram as técnicas clássicas de citogenética, como número diploide, a morfologia do cromossomo, número e localização das regiões organizadoras do nucléolo e detecção da heterocromatina constitutiva. Diferenças intra e interespecíficas foram detectadas e os dados indicam que fusões e/ou fissões, inversões e translocações foram os principais rearranjos que ocorreram na diversificação deste grupo de peixes na água doce. Palavras-chave: Chondrichthyes, Potamotrygonidae, Evolução cromossômica, rearranjos, Sistema sexual XX/X0, Sistema sexual XX/XY.

V155 Valentim, Francisco Carlos de Souza Citotaxonomia de arraias de água doce (Myliobatiformes, Potamotrygonidae) da bacia Amazônica Central / Francisco Carlos de Souza Valentim. --- Manaus : [s.n.], 2011. viii, 91 f. : il. color. Dissertação (mestrado) -- INPA, Manaus, 2011 Orientador : Eliana Feldberg Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Arraias. 2. Chondrichthyes. 3. Potamotrygonidae. 4. Citogenética. 5.Cromossomos sexuais. I. Título.

CDD 19. ed. 597.350415

iv

À minha querida Mãe Carlita e irmã Valdenira de Souza Valentim in memoriam

v

A realização deste projeto foi possível devido: Ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do INPA.

Ao Laboratório de Genética Animal do INPA, Coordenação de Pesquisas em Biologia

Aquática (CPBA), onde grande parte da atividade laboratorial foi realizada, com o

financiamento do Projeto Caracterização Genética (cromossomos, proteínas e DNA) de

vertebrados amazônicos (INPA/MCT - PRJ 12.01).

À Fundação de Amparo à Pesquisa (FAPEAM), pelo auxílio ao projeto PIPIT – Processo 1749/08, Edital N.009/2007.

À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)/Fundação

de Amparo à Pesquisa (FAPEAM), pela concessão da bolsa durante a realização deste

trabalho.

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela sua infinita bondade, pela ajuda espiritual nos momentos

alegres e tristes desta etapa de minha vida.

Ao meu pai, senhor Sebastião Valentim, pela dedicação à minha vida pessoal,

estudantil e profissional.

À minha esposa Izabele dos Santos Valentim, pela paciência e amor dedicado a

mim durante esta jornada.

Aos meus irmãos: Silvia, Genival, Sinval, Nelson, Silvio, Silvana, Neide, Zilvani e

Sebastião pelos incentivos desta longa jornada.

Aos meus filhos Fabíola Cristina e Carlos Valentim Jr. que em muitos momentos

dessa jornada estive distante de vocês, mas que nunca deixei de amá-los.

À minha orientadora Doutora Eliana Feldberg pela orientação nesta tese,

paciência, compreensão, ensinamentos e pela ajuda Acadêmico-Profissional.

Ao Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto pelos incentivos, atenção, colaboração didática,

críticas e sugestões nesta tese.

Ao Dr. Luis Antonio Carlos Bertollo pelas sugestões, correções e incentivo nesta

tese.

A Dra. Maria Lúcia Góes Araújo por ter contribuído fortemente no processo de

identificação, nas coletas e obtenção do meu material de pesquisa.

Ao Dr. Jansen Alfredo Sampaio Zuanon, pelas sugestões, incentivo e colaboração

didática desta tese.

Ao Dr. Ricardo de Souza Rosa pela ajuda na classificação do material desta tese e

pelos comentários feitos acerca do status dos Elasmobrânquios que muito enriqueceram

meus conhecimentos.

vii

Ao Dr. Wallice Paxiuba Duncan pelas criticas, comentários e fornecimento de

material didático desta tese.

À Dra. Celeste Mutuko Nakayama pelo incentivo, motivação a minha pessoa no

decorrer desta tese.

Ao Dr. Richard Vogt pela colaboração na coleta do material desta tese.

Ao Dr. Ailton Saturnino pelas críticas e sugestões feitas ao meu projeto, além de

incentivo durante a execução do meu projeto.

Ao casal, MSc. Carlos Schineider e Dra. Maria Claudia Gross, pela ajuda nas

práticas laboratoriais, formatação, correções, pelas sugestões, críticas e incentivo neste

trabalho.

Ao amigo Adriano, pela ajuda nas coletas de arraias desta tese.

Ao Agente ambiental Henrique Anatole do IBAMA, pelas informações prestadas e

incentivos nesta tese.

A ex-coordenadora do PPG-GCBEV, Dra. Vera Scarpassa e da secretária

Alessandra pelos incentivos, apoio e amizade.

Aos meus AMIGOS e colegas de laboratório, Arlisson, Eliane, Denise, Paola, Leila,

Rodrigo, Carlos Eduardo, Natalia, Leandra, Heidi, Maelin.

Aos PIBICanos, em especial ao Masseo pela ajuda laboratorial e na formatação

das figuras e tabelas desta tese e aos demais: Poli, Brenda e Érica pelas sugestões, além

das brincadeiras nos momentos de descontração desta difícil jornada.

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA/CPBA pelo apoio na

concessão de material e laboratorial desta tese.

Ao IBAMA pelo apoio na liberação para captura do material deste trabalho.

viii

À Secretaria Municipal de Educação de Manaus – SEMED, pelo apoio e liberação

do quadro funcional para fazer esta tese.

À Secretaria de Estado de Educação e Desporto pela colaboração no que diz

respeito à minha liberação do quadro funcional para dedicar-me a esta tese.

Aos pescadores em especial ao Carlos Sotero, Luizinho, Negrão e Chico Louro (in

memorian), pela busca incansável do material desta pesquisa, pela paciência e

descontração nos momentos de solidão das coletas.

À comunidade Daraquá no município de Barcelos, em particular ao Sr. Bebé e

Pinheiro, pela acolhida durante as excursões.

Ao técnico Arlindo Nascimento Batista ajuda nas coletas e no laboratório, pela

amizade, ajuda e esforço incansável dedicado a esta tese.

Enfim, a todos que de alguma forma direta e indireta contribuíram para a realização desta tese.

ix

Resumo

A família Potamotrygonidae, ordem Myliobatiformes abriga todas as

espécies de arraias de água doce neotropical. Pouco ainda se conhece a

respeito deste grupo de peixes, por exemplo, o número de espécies é incerto,

alguns nomes ainda são duvidosos, como ocorreu sua diversificação em

água doce, qual o grupo irmão marinho. Estudos citogenéticos são ainda

incipientes nesta família. Com o objetivo de ampliar o conhecimento neste

grupo de peixes, de grande interesse na aquariofília e com indicativos de

sobrepesca, foram analisadas, citogeneticamente, sete espécies nominais:

Plesiotrygon iwamae (2n=74, NF=120), Potamotrygon sp. C (cururu)

(2n=67♂/68♀, NF=104/106), com sistema de determinação do sexo XX/X0,

Potamotrygon scobina (2n=66, NF=102), Potamotrygon cf. scobina (2n=66,

NF=101), ambas com provável sistema de determinação de sexo XX/XY,

Potamotrygon constellata (2n=66, NF=110), Potamotrygon leopoldi (2n=64,

NF=102), Potamotrygon orbignyi (2n=66, NF=106), confirmando a presença

do sistema XX/XY e Potamotrygon motoro de diferentes localidades da bacia

amazônica central. Entre os espécimes de Potamotrygon sp. foi identificado

um exemplar fêmea distinto, que apresentou o mesmo número diploide

(2n=68) de Potamotrygon sp. C, mas com morfologia e fórmula cariotípica

diferenciadas podendo, portanto, representar mais uma espécie a ser

reconhecida e descrita neste táxon, provisoriamente denominada

Potamotrygon sp. C1. Entretanto, a ocorrência do sistema XX/XO pode, por

ora, ser caracterizado apenas em Potamotrygon sp. C. Todas as espécies

têm regiões organizadoras de nucléolo múltiplas, com número variando de 4

a 8, as quais porém, nem sempre estiveram todas ativas. Estas regiões

encontram-se preferencialmente localizadas na região terminal dos braços

longos dos cromossomos, exceto um par presente em P. constellata que se

localizou nos braços curtos. A heterocromatina constitutiva, encontra-se

localizada na região centromérica de todos os cromossomos do

complemento, em todas as espécies. Rearranjos cromossômicos,

principalmente os do tipo fusão e/ou fissão, inversões e translocações, foram

mecanismos determinantes da evolução cariotípica das arraias de água doce,

podendo estar implicados nos processos de especiação desse grupo.

x

Abstract

The family Potamotrygonidae in the order Myliobatiformes comprises all the

Neotropical freshwater ray species. The knowledge about this fish group is

limited, for example, the species number is uncertain, some species names

are questionable, there is no information about how their diversification in

freshwater happened, and there are no studies about their real marine sister

group. Cytogenetic studies in this family are incipients. With the objective of

widen the knowledge about this fish group, that arouses interests in aquarium,

and are indicated as an overfishing group, were analyzed, cytogenetically,

seven nominal species and two cytotypes: Plesiotrygon iwamae (2n=74,

FN=120), Potamotrygon sp. C (cururu) (2n=67♂/68♀, FN=104/106), with a

sex determination system XX/X0, Potamotrygon sp. C1 female (2n=68,

FN=108), Potamotrygon scobina (2n=66, FN=102), Potamotrygon cf. scobina

(2n=66, FN=101), both with a probable sex determination system XX/XY,

Potamotrygon constellata (2n=66, FN=110), Potamotrygon leopoldi (2n=64,

FN=102), Potamotrygon orbignyi (2n=66, FN=106), with a confirmed XX/XY

system and Potamotrygon motoro from differents localities of the central

Amazon basin. Among the specimens of Potamotrygon sp. identified a distinct

female specimen, which showed the same diploid number (2n=68) of

Potamotrygon sp. C, but with different morphology and karyotype formula.

Therefore, it may represent another species to be recognized and described

this taxon, provisionally named Potamotrygon sp. C1. However, the

occurrence of the system XX/XO may for now be characterized only in

Potamotrygon sp. C. All the species presented multiple nucleolar organizer

regions (NORs), although those regions were not always active, and the silver

nitrate stains number ranged from four to eight, in most of the metaphases

they were localized in the terminal position of the long arms, except in one

pair in P. constellata that was localized in the short arm. The constitutive

heterochromatin is located, in the centromeric regions of all the complement

chromosomes, in all the species. Chromosomal rearrangements, specially

fusions or fissions, inversions and translocations, were indispensable

mechanisms of karyotype evolution in the freshwater stingrays, and may be

involved in the speciation processes of this group.

xi

Sumário

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1

1.1. A ictiofauna neotropical e amazônica ................................................... 1

1.2 Breve história adaptativa das arraias de água doce ............................. 2

1.3 A família Potamotrygonidae e a importância das Arraias na Amazônia ........................................................................................................ 3

1.4 A Citogenética de peixes com ênfase em Arraias ................................ 6

1.5 OBJETIVOS .............................................................................................. 8 1.5.1 Objetivo geral ............................................................................................................8 1.5.2 Objetivos específicos ................................................................................................8

2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 9

2.1 Material ..................................................................................................... 9

2.2 Métodos ................................................................................................ 112 2.2.1 Indução da atividade mitótica ................................................................................ 12 2.2.2 Obtenção dos cromossomos mitóticos .................................................................. 12 2.2.3 Obtenção de cromossomos meióticos de machos ................................................ 14 2.2.4 Caracterização das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) ...................... 14 2.2.5. Detecção da Heterocromatina Constitutiva (Banda C) ......................................... 15 2.2.6. Processamento dos Dados Cariotípicos ............................................................... 15

3. Resultados e Discussão .......................................................................... 17

3.1. Artigo 1: Um sistema raro de determinação cromossômica do sexo em arraia de água doce (Potamotrygon sp.) do rio Negro, AM ................ 18

3.1.1. Resumo ................................................................................................................. 19 3.1.2. Introdução ............................................................................................................. 20 3.1.4. Resultados ............................................................................................................ 23 3.1.5. Discussão ............................................................................................................. 29

3.2. Artigo 2: Mecanismos de evolução cromossômica em arraias de água doce (Myliobatiformes, Potamotrygonidae)......................................34

3.2.1. Resumo ................................................................................................................. 35 3.2.2. Introdução ............................................................................................................. 36 3.2.3. Material e Métodos ............................................................................................... 37 3.2.4. Resultados ............................................................................................................ 38 3.2.5. Discussão ......................................................................................................................... 50

4. Conclusão geral ....................................................................................... 61

5. Referências Bibliográficas ...................................................................... 62

xii

Lista de Figuras

Figura 1. Espécies de arraias estudadas no presente trabalho .................... 11

Figura 2. a) Exemplar macho de Potamotrygon sp. C (diâmetro do

disco=19cm); b) Exemplar fêmea de Potamotrygon sp. C (diâmetro do disco=

17,5cm); c) Exemplar fêmea de Potamotrygon sp. C1 (diâmetro do disco

8cm). .............................................................................................................. 21

Figura 3. Locais de coleta de Potamotrygon sp. C e C1 no médio rio Negro.

....................................................................................................................... 22

Figura 4. Cariótipo de Potamotrygon sp. C macho. a) coloração com Giemsa;

b) pares nucleolares (em destaque) evidenciando as AgRONs; c) núcleo

interfásico evidenciando sete sítios (RONs) destacados pela Prata; d) regiões

de heterocromatina constitutiva evidenciadas pelo bandamento C.

m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico, a=acrocêntrico..25

Figura 5. Cariótipo de Potamotrygon sp. C fêmea. a) coloração com Giemsa;

b) pares nucleolares (em destaque) evidenciando as AgRONs; c) núcleo

interfásico evidenciando oito sítios (RONs) destacados pela Prata; d) regiões

de heterocromatina constitutiva evidenciadas pelo bandamento C.

m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico, a=acrocêntrico..26

Figura 6. Cariótipo de Potamotrygon sp. C1 fêmea em: a) coloração com

Giemsa; b) pares nucleolares (em destaque) evidenciando as AgRONs; c)

regiões de heterocromatina constitutiva evidenciadas pelo bandamento

m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico, a=acrocêntrico..27

Figura 7. Meiose de machos de Potamotrygon sp. C: a) metáfase

espermatogonial em coloração convencional, com 2n=67 cromossomos; b)

leptóteno evidenciando um bloco heteropicnótico na borda nuclear (possível

cromossomo sexual); c) diacinese com bandamento C, evidenciando bandas

positivas nos centrômeros dos bivalentes e do univalente (cromossomo X);

d) metáfase II com 33 cromossomos; e) metáfase II com 34 cromossomos; f)

metáfase II com bandamento C, evidenciando bandas positivas nos

centrômeros dos 34 cromossomos.................................................................28

Figura 8. Cariótipo de Plesiotrygon iwamae: a) em coloração convencional

com Giemsa; b) impregnado com AgNO3; c) Banda C. ................................. 39

xiii

Figura 9. Cariótipos em coloração com Giemsa: a) Potamotrygon scobina

(macho); b) Potamotrygon cf. scobina (macho); c) Potamotrygon constellata;

d) Potamotrygon leopoldi. .............................................................................. 42

Figura 10. Cariótipos com impregnação por nitrato de Prata: a) Potamotrygon

scobina (macho); b) Potamotrygon cf. scobina (macho); c) Potamotrygon

constellata; d) Potamotrygon leopoldi. ........................................................... 43

Figura 11. Cariótipos com Bandeamento C: a) Potamotrygon scobina

(macho); b) Potamotrygon cf. scobina (macho); c) Potamotrygon constellata;

d) Potamotrygon leopoldi. .............................................................................. 44

Figura 12. Cariótipos de Potamotrygon orbignyi corados com Giemsa: a)

macho; b) fêmea; c) Cromossomos portadores das Ag-RONS; banda C: d)

macho; e) fêmea. ........................................................................................... 46

Figura 13. Cariótipos de Potamotrygon motoro, de diferentes localidades,

corados com Giemsa: a) Médio rio Negro, região de Barcelos; b) do rio

Jauaperi, médio rio Negro; c) do lago do Catalão, baixo rio Negro; c) do lago

Janauacá, rio Solimões. ................................................................................. 48

Figura 14. Cariótipos de Potamotrygon motoro, de diferentes localidades,

com bandeamento C: a) Médio rio Negro, região de Barcelos; b) do rio

Jauaperi, médio rio Negro; c) do lago do catalão, baixo rio Negro; c) do lago

Janauacá, rio Solimões. ................................................................................. 49

Figura 15. Números diploides sobrepostos à árvore filogenética da ordem

Myliobatiformes proposta por Carvalho et al. (2004)......................................53

xiv

Lista de Tabelas

Tabela 1 Lista das espécies e número de indivíduos de arraias analisadas por

local de coleta, no presente trabalho. Entre parênteses o número de

indivíduos com resultados. ............................................................................ 10

Tabela 2. Dados Citogenéticos das arraias de água doce (Potamotrygonidae)

descritos na literatura e presente trabalho. .................................................... 58

Tabela 3. Compilação dos dados cariotípicos das arraias marinhas

(n=número haplóide; 2n=número diploide; FC=fórmula cromossômica;

NF=número fundamental; CS=cromossomos sexuais; RON=região

organizadora do nucléolo; HC=heterocromatina constitutiva) ........................ 59

1

1. INTRODUÇÃO

Os ecossistemas aquáticos da bacia amazônica podem ser

considerados como “berço” para milhões de espécies animais, vegetais e

microorganismos. A riqueza de sedimentos ao longo do rio Amazonas e de

seus afluentes promove fartura alimentar e diversidade de ambientes, tais

como lagos, igapós, igarapés, enseadas, etc., proporcionando um complexo

faunístico dinâmico. A dificuldade de exploração é um aliado dessa grande

biodiversidade pois cada espécie, além de apresentar suas próprias

peculiaridades, é favorecida por fenômenos naturais como enchentes e

vazantes, que lhes permitem até certo ponto manterem-se restritas a uma

determinada área ou apresentarem uma ampla área de movimentação,

possibilitando o fluxo gênico.

Nas últimas décadas, a exploração que se estabeleceu na região pelo

homem tem sido desastrosa para inúmeras espécies. Como exemplo,

podemos citar, entre os peixes, o pirarucu (Arapaima gigas) e o tambaqui

(Colossoma macropomum) e, entre os mamíferos aquáticos, o peixe-boi da

Amazônia (Trichechus inunguis), os quais passaram para condição de

espécies ameaçadas de extinção. Nesse sentido, os estudos de identificação,

ecologia, conservação e monitoramento de espécies têm contribuído para a

exploração racional da fauna e flora nesta região. A criação de reservas

ecologicamente sustentáveis, assim como a extração de espécies naturais

por meio de cota, são promissores no sentido de evitar o impacto ambiental

para muitas dessas espécies.

1.1. A ictiofauna neotropical e amazônica

A região biogeográfica neotropical se estende do México ao extremo

sul da América do Sul, entre as coordenadas 30º N e pouco mais de 50º S; e,

30º a 120º W. Esta região apresenta grande diversidade de ambientes

ecológicos, o que permitiu processos de irradiação e especiação, tornando-a

uma das regiões mais ricas em espécies. Isto é particularmente verdadeiro

para os peixes de água doce, que podem chegar a 8.000 espécies (Schaefer

1998; Lowe-McConnell 1999; Reis et al. 2003).

2

A bacia amazônica é considerada a maior, mais rica e também a mais

diversificada em espécies de peixes de água doce, podendo alcançar até

5.000 espécies (Santos e Ferreira 1999). É formada pelo rio Amazonas e

seus afluentes, constituindo sub-bacias. Estas, juntamente com inúmeros

igarapés, formam um complexo sistema caracterizado por águas claras,

pretas e brancas. Sua extensão é de aproximadamente sete milhões de

quilômetros quadrados (Sioli 1990; Lowe-McConnell 1999). Para Santos e

Ferreira (1999), os sistemas aquáticos amazônicos favorecem a especiação,

além de fornecer condições ideais para o desenvolvimento da diversidade

ictiológica.

Na região amazônica, os peixes representam um dos recursos naturais

mais abundantes e são utilizados como a principal fonte alimentar pela

população. Além disso, movimentam consideravelmente a economia regional,

tanto na forma de pescado semi-industrializado como na comercialização de

espécies ornamentais (Santos et al. 1991; Araújo 1999; Chao 1995; 2001).

As espécies da ictiofauna amazônica estão agrupadas em 54 famílias

constituídas basicamente por grupos recentes, sendo 43% Characiformes,

39% Silurioidei, 3% Gymnotoidei (revisado por Santos e Ferreira 1999). Há

também representantes da classe Chondrychthyes, sendo uma família de

arraias (Potamotrygonidae), uma família de tubarões (Carcharhinidae) e uma

família de peixes-serra (Pristidae) (Fink e Fink 1978; Rosa 1985; Charvet-

Almeida 2001; Carvalho e McEachran 2003; Nelson 2006).

1.2 Breve história adaptativa das arraias de água doce

As arraias de água doce tiveram sua origem a partir de um ancestral

marinho (Lovejoy et al. 1998; Lovejoy et al. 2006). Uma hipótese provável é a

de “incursão marinha”, ou seja, esse ancestral teria entrado em ambientes

dulcícolas durante os eventos geológicos de separação dos continentes

americano e africano e deslocamento da placa sulamericana para oeste

chocando-se com a placa Nazca, fenômeno que promoveu o soerguimento

da cordilheira andina. Carvalho et al. (2004) postulam que este evento

ocorreu durante o fim do Cretáceo ou entre o fim do Paleoceno e início do

Eoceno, enquanto que outros autores consideram esta ocorrência no

3

Mioceno. Eventos associados a alterações no nível do mar em toda a costa

do Pacífico e Atlântico, promoveram grandes incursões marinhas em vários

locais da bacia amazônica, principalmente na região do Caribe (Lovejoy

1996; Lovejoy et al. 2006). As incursões criaram imensos lagos salinos

recheados de inúmeras espécies marinhas, dentre elas alguns

representantes atuais como as arraias, corvinas, peixe agulha e botos

(Lovejoy et al. 2006; Hoorn 2006). Com o passar dos anos, a salinidade foi

diminuindo gradativamente pela deposição do sal no fundo dos lagos e, deste

modo, formaram-se ambientes salobros e, posteriormente, ambientes

dulcícolas (Lovejoy et al. 2006). Confinadas nestes ambientes, as espécies

marinhas, que resistiram a tais mudanças ambientais, passaram por

adaptações e modificações severas o que as tornaram aptas à vida em água

doce. Exemplos destas adaptações podem ser observados nas arraias de

água doce, como a baixa concentração de uréia nos fluidos corporais e a

intolerância à salinidade (Thorson et al. 1967; Duncan et al. 2010). Uma vez

bem adaptadas à água doce, as arraias não encontraram barreiras dentro do

ambiente amazônico e isso fez com que esses peixes divergissem dentro da

bacia. Segundo Toffoli et al. (2008), a irradiação adaptativa foi o principal

evento evolutivo para a diversidade das arraias dentro dos ambientes de

água doce.

1.3 A família Potamotrygonidae e a importância das arraias na Amazônia

As arraias de água doce possuem a seguinte classificação, segundo

Rosa (1985), Mould (1997) e Carvalho et al. (2003): Classe Chondrichthyes,

Subclasse Elasmobranchii, Ordem Myliobatiformes (08 famílias).

Potamotrygonidae é a única família de arraias de água doce, com quatro

gêneros válidos.

Esse grupo foi originado das arraias marinhas, porém ainda não há um

consenso de qual grupo marinho seria esse ancestral. Resolver o táxon irmão

dos potamotrygonideos tem importantes implicações para a compreensão da

história evolutiva da invasão de myliobatoides em habitats de água doce.

Urobatis (Brooks et al. 1981; Dunn et al. 2003), Himantura (Lovejoy, 1996;

Lovejoy et al. 1998; Lovejoy et al. 2006; McEachran et al. 1996),

Urotrygon+Urobatis Carvalho et al. (2004) e Urolophus (Rosa et al. 2010),

4

têm sido propostos como candidatos para o taxon irmão de

potamotrygonideos. Segundo Lovejoy et al. (1998; 2006) esse grupo teria

sido confinado nos primórdios do Mioceno, acerca de 10-20 milhões de anos,

durante incursões marinhas ocorridas na costa do Pacífico. Aparentemente,

estas teriam sido as únicas espécies marinhas que ficaram presas e isoladas

em ambientes de água doce e confinadas pelos eventos neogênicos.

Os quatro gêneros que compõem a família Potamotrygonidae são:

Paratrygon Duméril 1865 (monoespecífico), Plesiotrygon Rosa, Castello e

Thorson 1987 (duas espécies), Heliotrygon Carvalho e Lovejoy 2011 (duas

espécies) e Potamotrygon Garman 1877 com cerca de 20 espécies válidas

(Rosa 1985; Rosa et al. 1987; Ishihara e Taniuchi 1995; Compagno 1999;

Charvet-Almeida et al. 2002; Carvalho et al. 2003; Carvalho e Lovejoy 2011;

Carvalho e Ragno 2011; Carvalho et al. 2011; da Silva e Carvalho 2011a; b).

Segundo Carvalho e Lovejoy (2011), Heliotrygon (novo gênero) é

grupo irmão de Paratrygon e juntos formam um clado irmão dos outros dois

gêneros.

Segundo Carvalho et al. (2003) os principais problemas relacionados à

identificação deste grupo de peixes se devem aos critérios utilizados, os

quais envolvem, principalmente o padrão de coloração dorsal. Tal critério tem

promovido vários problemas taxômicos, uma vez que as arraias apresentam

policromatismo. Embora não esteja ainda esclarecido, o policromatismo pode

ser atribuído aos diferentes tipos de água em que esses peixes se

encontram. Como exemplo, pode-se citar Potamotrygon motoro e P. orbignyi,

de águas brancas ou pretas da bacia amazônica (Almeida et al. 2002;

Almeida 2003; Charvet-Almeida et al. 2002; Charvet-Almeida e Almeida

2003). Ainda, segundo Carvalho et al. (2003), os critérios merísticos e

morfométricos utilizados na separação de espécies também são limitados

favorecendo as dúvidas por esta forma de identificação.

A bacia amazônica, quando comparada a outras regiões neotropicais,

desponta com a maior diversidade em número de espécies de arraias de

água doce (Rosa 1985; Compagno e CooK 1995; Mould 1997; da Silva e

Carvalho 2011 a; b; Carvalho et al. 2011). Algumas espécies têm ampla

distribuição geográfica, ocorrendo praticamente em toda a calha do rio

Amazonas como, por exemplo, as espécies Potamotrygon motoro e

5

Potamotrygon orbignyi. Outras são endêmicas, por exemplo, Potamotrygon

sp. C e Potamotrygon schroederi no médio rio Negro e Potamotrygon leopoldi

no Xingu (Araújo et al. 2004; Carvalho et al. 2003). Entretanto, as

amostragens têm se restringido às áreas de exportação de peixes

ornamentais como médio rio Negro (município de Barcelos), rio Tocantins e

rio Xingu, permanecendo muitas áreas ainda não amostradas.

As arraias de água doce são distintas das marinhas, por apresentarem

além de especializações morfológicas e fisiológicas, a pélvis com um

processo anteromediano bem desenvolvido (Garman 1877; 1913; Ribeiro

1907; 1923; Bigelow e Schroeder 1953; Thorson e Watson 1975; Carvalho et

al. 2003) e baixa concentração de uréia no sangue e fluidos corporais

(Thorson et al. 1967; Brooks et al. 1981; Thorson e Lacy 1982; Thorson et al.

1983; Wood et al. 2002; Martin 2004; Duncan et al. 2010). São caracterizadas

pelo corpo discóide, prolongado por uma cauda em forma de chicote e

armada de “ferrão”. A reprodução é sexuada com fecundação interna e

descrita como matrotrófica vivípara, com o desenvolvimento de trofonemata

para a nutrição do embrião (Thorson et al. 1983) e os filhotes são expelidos

para a água antes de completarem seu estágio de maturação (Rosa 1985;

Araújo 1998). Vivem em fundo arenoso ou lamacento e às vezes com o corpo

parcialmente encoberto. Alimentam-se de pequenos peixes, crustáceos, lodo

e insetos (Santos et al. 1984; Araújo 1998).

Na região amazônica, as arraias possuem pouca importância alimentar

e sua captura se dá principalmente para fins de exportação como peixes

ornamentais. Nas últimas décadas a exportação desses peixes tem

movimentado um mercado cada vez maior. O interesse dos aquaristas e a

situação econômica dos países importadores determinam a demanda das

espécies e dirigem o esforço de pesca no Amazonas (Araújo 1999; Duncan et

al. 2010). O estado do Amazonas exporta cerca de 10.000 unidades de

arraias anualmente (Araújo 2001; Duncan et al. 2010). As espécies

comercializadas legalmente são: P. motoro, P. orbignyi, Potamotrygon sp. C

(cururu) e P. schroederi (Portaria Nº 22, de 27 de Abril de 2011 do Ministério

da Pesca e Aquicultura), no entanto pelo fato de existir muitos problemas

6

quanto à classificação taxônomica é possível que espécies similares e/ou

mesmo espécies crípticas também possam estar sendo comercializadas.

1.4 A Citogenética de peixes com ênfase em arraias

As técnicas citogenéticas têm evoluído muito desde o início de sua

aplicação, mostrando-se cada vez mais resolutivas, sendo ótimas

ferramentas nos estudos taxonômicos, inferindo sobre a história evolutiva e

correlações de similaridades dos organismos quando em simpatria ou

alopatria (Ojima et al. 1976; Futuyma 2002). Os métodos e técnicas de

marcações cromossômicas específicas, aprimoradas recentemente permitem

um melhor conhecimento do número, tamanho e morfologia dos

cromossomos, assim como, a estrutura, organização molecular e

comportamento durante a divisão celular (Kasahara 2009). No entanto, as

técnicas denominadas convencionais de coloração, bandamento C e

detecção das regiões organizadoras do nucléolo (RONs) por nitrato de prata

(AgRONs) ainda continuam sendo bastante utilizadas em estudos genéticos,

pela sua facilidade, baixo custo e por apresentarem resultados significativos

(Kasahara 2009).

Em peixes, a citotaxonomia e a citosistemática têm corroborado a

identificação, distribuição geográfica e relação evolutiva entre os grupos

naturais, uma vez que muitas espécies e/ou complexos de espécies possuem

diferenciação cariotípica que não se refletem morfologicamente (Almeida-

Toledo 1998; Nakayama et al. 2001; Oliveira et al. 2002; Centofante et al.

2002a).

Com relação à citogenética dos Elasmobranchii, em especial das

arraias, os dados existentes, em sua maioria, referem-se a espécies

marinhas e ainda são incipientes. Stingo e Rocco (2001) revisaram os

estudos citogenéticos em seláquios (Chondrichthyes) e verificaram que para

a superordem Batoidea já existem dados cromossômicos para 64 espécies

distribuídas em 23 gêneros, 16 famílias e cinco ordens. O número

cromossômico variou de 2n=28 em Narcine brasiliensis até 2n=104 em Raja

meerdervoortii com uma predominância de cromossomos metacêntricos na

primeira espécie e acrocêntricos e microcromossomos na segunda. Estes

7

autores mostraram que os estudos citogenéticos estão restritos, em sua

maioria, ao número diploide, número fundamental (NF), fórmula cariotípica e

tamanho do genoma.

Análises de RONs, heterocromatina constitutiva e enzimas de restrição

foram relatadas para cinco espécies de peixes cartilaginosos. A

heterocromatina foi localizada em regiões diferentes, ou seja, centromérica

em Raja asteria e principalmente telomérica em Scyliorhinus stellaris

(tubarão). Em duas espécies do gênero Torpedo (T. marmorata e T. ocellata),

blocos heterocromáticos foram localizados em posições diferentes, ou seja,

pericentroméricos nos cromossomos meta/submetacêntricos de T. ocellata e

digeridas por diferentes enzimas de restrição; centromérica nos telocêntricos

de T. marmorata e não digeridos pelas enzimas de restrição. Essa diferença

na distribuição da heterocromatina pode estar relacionada com a morfologia

dos diferentes cromossomos, e sugere envolvimento das sequências

altamente repetitivas nos rearranjos robertsonianos (Stingo et al. 1995; Stingo

e Rocco 2001). A localização das AgRONs nas espécies marinhas T.

marmorata e T. ocellata foi observada na região terminal de um único par de

cromossomos em ambas as espécies (Stingo e Rocco 2001).

Técnicas citomoleculares também são relatadas no estudo das arraias

marinhas como a coloração pelo fluorocromo DAPI, o uso de enzimas de

restrição e, mais recentemente, a hibridização in situ fluorescente (FISH).

Estas técnicas têm-se mostrado informativas na separação de espécies e

também no entendimento da carioevolução das arraias marinhas (Rocco et

al. 2002b; 2005; 2007).

Em arraias de água doce, os estudos cromossômicos são ainda mais

incipientes, com dados reportados apenas para as espécies Potamotrygon

motoro, P. orbignyi, e Paratrygon aiereba da bacia Amazônica (Valentim et al.

2006) e para Potamotrygon aff. motoro e P. falkineri da bacia do Paraná

superior (Cruz et al. 2011). Os autores observaram diferenças cariotípicas

tanto intra como interespecíficas, no que diz respeito ao número e fórmula

cromossômica, número e posição das regiões organizadoras do nucléolo

(RONs). Entretanto, similaridades foram observadas quanto à quantidade e

localização da heterocromatina constitutiva pois, em todas as espécies, esta

8

se mostrou em pequena quantidade e restrita ao centrômero (Cruz et al.

2011). Apesar das diferenças no número diploide, houve similaridade no

número de braços (NF) entre as espécies estudadas por Valentim et al.

(2006), conservando-se igual a 106 nas três espécies analisadas. Entretanto,

vários questionamentos são ainda frequentes para as arraias de água doce.

Qual é o grupo irmão marinho dos potamotrygonideos? Será apenas um

grupo-irmão? Quais seriam os caminhos evolutivos que levaram à

especiação e diversidade destes peixes na água doce?

Assim sendo, o presente estudo enfocou a caracterização

cromossômica de espécies de arraias de água doce da bacia amazônica

central, com o propósito de contribuir para o conhecimento da evolução

cariotípica desse grupo e dos processos associados a esta historia evolutiva.

1.5 Objetivos

1.5.1 Objetivo geral

Caracterizar, citogeneticamente, espécies de arraias da família

Potamotrygonidae que ocorrem na bacia amazônica central.

1.5.2 Objetivos específicos

Determinar os prováveis rearranjos cromossômicos ocorridos ao longo

do processo de especiação das arraias da família Potamotrygonidae.

Verificar a tendência da evolução cariotípica para as arraias de água

doce.

Verificar a diferenciação de cromossomos sexuais no processo

evolutivo deste grupo.

9

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material

As espécies de arraias analisadas no presente trabalho, com seus

respectivos locais de coleta, estão relacionadas na Tabela 1 e Figura 1. As

coletas foram feitas ao longo do rio Negro, região do encontro das águas

(confluência dos rios Negro e Solimões), tributários e rio Xingu, região de

Altamira, PA.

Os animais foram capturados com equipamentos específicos:

malhadeiras de fundo, puçá, rapiché e espinhel, em alguns casos com

zagaia. Os peixes maiores (40 cm de largura de disco) foram capturados com

espinhel, sendo que cada continha de 80 a 120 anzóis, espaçados um do

outro de 3 a 5 m. Os animais foram processados em laboratórios montados

em barco, acampamentos, flutuantes ou trazidos para o Laboratório de

Genética Animal do INPA. Em todos os casos, os animais foram aclimatados

por um período de 12 a 24 horas e posteriormente foram submetidos à

indução da atividade mitótica, anestesiados utilizando Eugenol e sacrificados

para a retirada dos órgãos desejados. Cada exemplar foi numerado, fixado

em formol a 10% por pelo menos 24 horas, lavados em água corrente e

acondicionados em álcool 70%, para posterior depósito na Coleção de Peixes

do INPA. A identificação das espécies foi confirmada pelo Dr. Ricardo Rosa,

Sistemata especialista em Elasmobrachii.

10

Tabela 1 Lista das espécies e número de indivíduos de arraias analisadas por local de coleta, no presente trabalho. Entre parênteses o número de indivíduos com resultados.

Espécie Número de Indivíduos

Total

Localidade de Coleta Coordenadas

♀ ♂

Plesiotrygon iwamae 1 (1) 5 (3) 6 (4) Janaucá/ Solimões 3º17’41,57”S e 60º20’31,34”W Potamotrygon motoro 2 (2) 8 (5) 10 (7) Catalão/ baixo rio Negro 3º11’59,15”S e 59º53’59,03”W P. motoro 2 (1) 3 (2) 5 (3) Janauacá/ Rio Solimões 3º22’03,66”S e 60º13’33,76”W

P. motoro 3 (2) 2 (1) 5 (3) Barcelos/ médio Rio negro 0º27’05,39”S e 62º54’37,99”W P. motoro - 6 (4) 6 (4) Rio Joaperi/ médio rio Negro 1º23’32,84”S e 61º38”56,43”W Potamotrygon orbignyi 1 (1) 1 (0) 2 (1) Rio Branco/ médio rio Negro 1º23’45,98”S e 61º50’39,95”W P. orbignyi - 2 (1) 2 (1) Ilha da Marchantaria/ Solimões 3º11’9,80”S e 59º51’42,41”W P. orbignyi - 1 (1) 1 (1) Altamira/ Rio Xingú 3º20’29,69”S e 52º01’36,40”W Potamotrygon sp. (cururu) 5 (4) 6 (5) 11 (9) Rio Itú/ médio rio Negro 0º27’05,39S e 62º46’28,78”W Potamotrygon sp.1 (cururu) 1 (1) - 1 (1) rio Itu/ médio rio Negro 0º51’57,12”S e 62º46’24,63”W Potamotrygon scobina - 3 (3) 3 (3) Janauacá/ Solimões 3º17’41,57”S e 60º20’31,34”W Potamotrygon cf. scobina 1 (1)- 1 (1) Janauacá/ Solimões 3º17’41.57”S e 60º20’31,34”W

Potamotrygon constellata 2 (2) - 2 (2) Janauacá/ Solimões 3º17’41,57”S e 60º20’31,34”W

Potamotrygon leopoldi 4 (3) 3 (2) 7 (5) Altamira/ Rio Xingú 3º20’29,69”S e 52º01’36,40”W

11

Figura 1. Espécies de arraias estudadas no presente trabalho.

12

2.2 Métodos

2.2.1 Indução da atividade mitótica

Para a indução da atividade mitótica nas arraias foi utilizada a técnica

descrita por Oliveira et al. (1988) que consistiu em preparar uma solução de

fermento biológico (0,5g de fermento, 0,5g de açúcar e 20mL de água destilada),

deixar em estufa por alguns minutos para ocorrer a quebra de dormência do

fungo e em seguida injetou-se, intraperitonialmente no animal, na proporção de

1mL/100g de peso do animal nos indivíduos jovens e subadultos. Nos indivíduos

adultos com peso acima de 2 Kg aplicou-se 20 mL da solução. Outro indutor

também utilizado foi o Munolan (Cloridrato de lisozima), que é um antígeno

bacteriano e fúngico, que tem o mesmo principio, ou seja, induzir a atividade

mitótica. Para isso dissolveram-se dois comprimidos em 10 mL de água

destilada e procedeu-se da mesma forma como realizado com o fermento

biológico, inclusive injetado na mesma proporção. O peixe foi mantido em

aquário bem aerado por 24h, os jovens e 48h os adultos.

2.2.2 Obtenção dos cromossomos mitóticos

Decorridas as 24-48 horas após o peixe ter recebido a injeção de solução

de fermento biológico ou Munolan, foi aplicado uma injeção intraperitoneal da

solução de colchicina 0,025%. Nesta solução, a quantidade aplicada também

variou em função do peso do animal, nos animais jovens e subadultos a

proporção foi de 1 mL/100g de peso vivo por 1h e nos adultos acima de 1kg foi

aplicado 1ml para cada quilograma de peso por um período de 3 a 4 horas.

Transcorrido o tempo de colchicinização, o peixe foi colocado em uma solução

anestésica contendo Eugenol diluído em álcool a 1% e depois diluído em água a

10%. Para obtenção dos cromossomos em metáfase, empregou-se a técnica air

drying descrita por Bertollo et al. (1978), que consistiu na retirada dos órgãos

desejados (Baço e Brânquias). O baço e a brânquia foram divulsionados em

10mL de solução hipotônica de cloreto de potássio (KCl 0,075M) e mantido em

estufa a 37 ºC por 30 minutos. Esta suspensão celular foi então transferida para

13

um tubo de centrífuga, centrifugada por 10 minutos a 900rpm e o sobrenadante

descartado. Em seguida foi adicionado 10 mL de fixador Carnoy (Metanol+ácido

acético - 3:1) e o material foi ressuspendido e centrifugado novamente por 10

minutos. Este processo foi repetido três vezes. Após a última centrifugação e

eliminação do sobrenadante foi adicionado fixador suficiente para se obtiver uma

suspensão celular não muito concentrada (± 1,5 mL) e então mantida em freezer

(-10º C).

Em razão de muitos indivíduos capturados serem grandes com peso

acima de 1kg, foi utilizada também a técnica de cultura de células descrita por

Barreto Netto et al. (2007), que utiliza meio RPMI 1640 da CULTILAB. Este meio

é uma solução nutritiva que permite a manutenção da célula por um período

aproximado de 12h. A técnica consistiu em divulsionar o baço ou brânquia em

10ml do meio, colocando em seguida em tubos de centrifuga e colocando em

freezer por um período de 12h. Após esse período procedeu-se a hipotonização

e fixação como descrita anteriormente.

Foram feitos testes utilizando a cultura de linfócitos em meio de cultura

completo para cariótipo da CULTILAB, adaptado de Fenocchio e Bertollo (1988).

Nesta técnica foi coletado sangue por pulsão cardíaca e aplicada no meio de

cultura em câmara estéril e deixada em estufa a 37º C por um período de 48 a

72 horas. Após esse período foi colocado na cultura, contendo o sangue, 0,5mL

de colchicina 0,016% e mantido na estufa por 1h. Em seguida o meio contendo o

sangue foi retirado da estufa e transferido para um tubo de centrifuga e

centrifugado por 10 minutos. Passado este tempo, o sobrenadante foi

descartado e acrescentaram-se 10 mL de solução hipotônica, ressuspendendo o

material e levado à estufa 37 ºC, por 45 minutos. Após esse tempo, procederam-

se os passos da fixação como descrito anteriormente. A vantagem desta técnica

é que o animal é mantido vivo, para uma possível repetição da técnica, podendo

inclusive devolvê-lo ao seu ambiente natural. Entretanto, nem sempre há um

bom crescimento das células.

14

Para análise do material em microscópio óptico foram pingadas de 2 a 3

gotas da suspensão celular sobre lâminas limpas e secas, colocadas sobre o

vapor de um banho-maria a 60o C. As lâminas foram secas ao ar, coradas com

Giemsa diluído a 5% em tampão fosfato 0,06M, pH 6,8, por 10 minutos e

lavadas em água destilada e secas ao ar.

2.2.3 Obtenção de cromossomos meióticos de machos

Para estudo dos cromossomos meióticos em suas diferentes fases foram

utilizadas células gonadais masculinas empregando-se a técnica descrita por

Bertollo et al. (1978) e modificada por Gross et al. (2009). Os testículos foram

retirados, seccionados em fragmentos bem pequenos e colocados em solução

hipotônica de KCl a 0,075M por 30 minutos. Em seguida, o material foi

transferido para uma cubeta contendo fixador Carnoy 3:1 (Metanol: ácido

acético), por 20 minutos. Após este período o fixador foi substituído e este

processo de fixação foi repetido por mais duas vezes. Em seguida, o material foi

guardado em freezer (-10 ºC), em tubos tipo “eppendorf”, com fixador Carnoy

para ser processado posteriormente. A preparação do material para análise

consistiu em retirar os fragmentos do fixador e secar em papel de filtro. Pedaços

bem pequenos foram colocados sobre uma lâmina limpa e macerados em 1mL

de ácido acético 50%, com o auxílio de um bastão de vidro. Em seguida, a

lâmina foi colocada sobre uma placa aquecedora a 40 ºC para secar.

Posteriormente, a lâmina foi corada com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e

pH 6,8 por 10 minutos, lavada em água destilada e seca diretamente ao ar.

2.2.4 Caracterização das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)

Para a detecção das RONs utilizou-se a técnica descrita por Howell e

Black (1980), que consiste na utilização de duas soluções:

Solução A: solução coloidal reveladora: 1g de gelatina muito bem dissolvida em

50 mL de água destilada, acrescida de 0,5ml de ácido fórmico.

Solução B: solução de nitrato de prata: 1g de AgNO3 dissolvido em 2 mL de

água destilada.

15

A lâmina com a preparação cromossômica foi hidrolisada por 3 minutos

em HCl 1N a 60 oC, lavada em água destilada e seca ao ar. Em seguida,

colocou-se sobre a lâmina uma gota da solução A e duas gotas da solução B,

cobrindo-a com lamínula. A lâmina foi colocada em câmara úmida e levada ao

banho-maria a 60o C até alcançar uma tonalidade marrom dourada. Em seguida

foi lavada em água destilada e secar ao ar.

2.2.5. Detecção da Heterocromatina Constitutiva (Banda C)

Para a detecção da heterocromatina constitutiva (banda C) utilizou-se a

técnica descrita por Sumner (1972), na qual as lâminas preparadas com a

suspensão celular foram hidrolisadas em HCl 0,2N, em temperatura ambiente,

por 10-15 minutos; lavadas em água destilada e seca para em seguida serem

incubadas por três minutos em solução de hidróxido de bário 5%, a 46 º C. Esta

lâmina foi então passada em HCl 0,2N para retirada do excesso de hidróxido de

bário e lavadas em água destilada. Após secas foram incubadas em solução

salina 2XSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 6,8) a 60 º C,

por 60 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida foram

coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M, pH 6,8 por 10 minutos.

2.2.6. Processamento dos Dados Cariotípicos

A análise e contagem dos cromossomos foram feitas em microscópio

óptico, estabelecendo o número diploide modal para cada indivíduo de cada

espécie, com a contagem de cerca de 30 metáfases. As melhores metáfases

foram fotografadas em microscópio óptico Zeiss Axiostar Plus, utilizando uma

máquina fotográfica digital Sony Cyber-shot DSC W7 e editadas no programa

Adobe Photoshop CS4. A média do comprimento total dos cromossomos e da

razão entre os braços cromossômicos (q/p) foram calculadas, com auxílio do

programa livre Image J. Os cromossomos homólogos foram emparelhados em

ordem decrescente de tamanho e separados em grupos de acordo com a

nomenclatura proposta por Levan et al. (1964) e classificados em metacêntricos

(RB de 1,0 a 1,70), submetacêntricos (RB de 1,71 a 3,0), subtelocêntricos (RB

16

de 3,01 a 7,00) e acrocêntricos (RB>7,0), (RB=BM/Bm). Para se determinar o

número fundamental (NF) que é o número de braços cromossômicos do

cariótipo, foram considerados os cromossomos metacêntricos, submetacêntricos

e subtelocêntricos como tendo dois braços e os acrocêntricos como tendo um só

braço. Uma comparação dos cariótipos de todos os exemplares foi feita,

verificando a existência ou não de mecanismo de cromossomos sexuais, de

polimorfismo e de variabilidade cromossômica.

Para as espécies que tiveram indícios de mecanismos cromossômicos

sexuais foram feitas análises dos cromossomos meióticos. Neste caso, foram

observados o pareamento dos homólogos, a contagem do número haploide (n) e

fotografadas diferentes fases da divisão meiótica, em busca de evidências do

tipo de heteromorfismo sexual.

17

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos com a análise citogenética das arraias de água

doce e a discussão destes dados são apresentados na forma de dois capítulos,

sendo que cada um corresponde a uma intenção de publicação científica como

segue:

3.1 Capítulo 1:

Um sistema raro de determinação cromossômica do sexo em arraia de água

doce (Potamotrygon sp.) do rio Negro, AM.

3.2 Capítulo 2:

Mecanismos de evolução cromossômica em arraias de água doce

(Myliobatiformes, Potamotrygonidae)

18

3.1. Artigo 1:

Um sistema raro de determinação cromossômica do sexo em

arraia de água doce (Potamotrygon sp.) do rio Negro, AM.

19

3.1. Artigo 1: Um sistema raro de determinação cromossômica do sexo em

arraia de água doce (Potamotrygon sp.) do rio Negro, AM

3.1.1. Resumo

Foi realizada uma análise citogenética comparativa em arraias do gênero Potamotrygon sp., presentes no rio Negro, bacia amazônica, as quais ainda não apresentam taxonomia definida (Potamotrygon sp. C). Foram investigados os cromossomos mitóticos e meióticos, utilizando análises cromossômicas convencionais, além do bandamento C e das regiões organizadoras de nucléolos. Duas formas cariótipicas distintas puderam ser evidenciadas entre os espécimes da população estudada, uma delas correspondente aos espécimes de Potamotrygon sp. C e a outra correspondente a um tipo morfológico também diferenciado, provisoriamente denominado de Potamotrygon sp. C1. Potamotrygon sp. C apresentou número cromossômico distinto entre os sexos 2n=67/2n=68 e NF=104/106 nos machos e fêmeas, respectivamente. No cariótipo dos machos observou-se a ausência de um cromossomo grande equivalente ao par número dois do complemento das fêmeas. Na meiose do macho constatou-se a presença de células metafásicas I com 33 bivalentes mais um univalente de tamanho grande, além de células em metáfase II com n=33 e n=34 cromossomos, representando características concordantes com a presença de um sistema simples de determinação sexual do tipo XX/X0. Potamotrygon sp. C1 também apresentou 2n=68 cromossomos, mas diferindo quanto a estrutura do cariótipo. A inexistência de exemplares machos na amostra estudada impossibilitou verificar a ocorrência de um sistema de cromossomos sexuais, a exemplo daquele presente em Potamotrygon sp. C. As RONs são múltiplas, porém com localizações distintas em Potamotrygon sp. C e Potamotrygon sp. C1. O padrão de bandamento C mostrou uma distribuição similar da heterocromatina constitutiva para Potamotrygon sp. C e C1, com bandas localizadas apenas na região centromérica dos cromossomos. Nossos dados destacam a presença de um sistema de determinação de sexo de ocorrência rara entre os peixes, assim como caracteres citotaxonômicos importantes para o reconhecimento e a distribuição das arraias do gênero Potamotrygon na bacia amazônica.

20

3.1.2. Introdução

A grande maioria dos peixes não possui cromossomos sexuais

diferenciados. Entretanto, este é um grupo de vertebrados que apresenta cerca

de oito sistemas de determinação cromossômica sexual já descrito, simples e

múltiplos (Oliveira et al. 2009). Porém, mecanismos de cromossomos sexuais

em peixes podem estar subestimados, uma vez que existem sistemas que ainda

não estão cromossomicamente diferenciados, só sendo detectados com

técnicas de bandeamentos cromossômicos ou moleculares (Harvey et al. 2002;

Centofante et al. 2003).

Dentro dos sistemas simples de determinação cromossômica sexual pode

ocorrer uma grande diversidade quanto à forma e tamanho dos cromossomos

sexuais, desde muito pequenos, próximos a microcromossomos, até grandes,

próximos aos maiores pares do complemento (Centofante et al. 2003; Oliveira et

al. 2009).

Em arraias marinhas da ordem Rinobatiformes foram relatados dois casos

de cromossomos sexuais. Em Rhinobatus hynnicephalus (Kikuno e Ojima 1987)

o macho tem 59 e a fêmea 60 cromossomos. Em Rhinobatus schlegelii

(Asahida e Ida 1995), o macho tem 63 e a fêmea 64 cromossomos. Embora os

autores façam apenas a descrição numérica dos cromossomos, sem apresentar

e discutir os possíveis sistemas de cromossomos sexuais presentes é possível

que esta diferença de número diploide entre machos e fêmeas caracterize um

sistema de cromossomos sexuais múltiplo, que poderia ser do tipo X1X1X2X2/

X1X2Y, como o encontrado por Cruz et al. (2011) em arraias de água doce do rio

Paraná. Entretanto, não se pode também descartar, a priori, a presença de um

sistema do tipo XX/X0.

No presente estudo foi analisada a estrutura cariotípica de espécimes de

arraia de água doce do gênero Potamotrygon ainda sem taxonomia definida. Foi

descrito um sistema raro de cromossomos sexuais em Potamotrygon sp. C, na

qual o macho tem um cromossomo a menos que a fêmea. Foi também

identificada uma estrutura cariotípica distinta em Potamotrygon sp. C1,

21

correspondente a uma forma morfologicamente diferenciada de Potamotrygon

sp. C.

3.1.3. Material e Métodos

Análise citogenética foi feita em 19 machos e 27 fêmeas de Potamotrygon

sp. C (conforme denominação provisória de Araujo 1998), espécie conhecida

como cururu (Figura 2). Os espécimes foram coletados no igarapé Itu, baixo e

alto (0º27’05,39S e 62º46’28,78”W; 0º51’57,12”S e 62º46’24,63”W), igarapé

Zamula (0º51’53,98”S e 62º46’32,94”W), afluentes do médio rio Negro, próximos

à cidade de Barcelos, Amazonas (Figura 3). Indivíduos adultos (disco de 40 cm

ou mais) foram capturados com espinhel e indivíduos jovens com rapiché. Os

exemplares foram identificados pelo professor Dr.Ricardo Rosa (UFPB).

Figura 2. a) Exemplar macho de Potamotrygon sp. C (diâmetro do disco=19cm); b) Exemplar fêmea de Potamotrygon sp. C (diâmetro do disco= 17,5cm); c) Exemplar fêmea de Potamotrygon sp. C1 (diâmetro do disco 8cm).

22

Figura 3. Locais de coleta de Potamotrygon sp. C e C1 no médio rio Negro.

Os exemplares receberam uma injeção com fermento biológico para

indução mitótica conforme Oliveira et al. (1988). Cromossomos mitóticos foram

obtidos do baço pela técnica de air drying descrita por Bertollo et al. (1978) e

adaptada para arraias com as seguintes modificações: a concentração da

colchicina foi 0,025% na proporção de 1ml/100g de peso do animal por três

horas e a hipotonização durou 45 minutos a 37 ºC. Cromossomos meióticos

foram obtidos de células gonadais dos machos pela técnica descrita para peixes

por Bertollo et al. (1978) e modificada por Gross et al. (2009).

A região organizadora do nucléolo (RON) foi detectada por nitrato de

Prata segundo Howell e Black (1980) e o bandamento C, para localização da

heterocromatina constitutiva, foi feito utilizando hidróxido de Bário de acordo

com Sumner (1972).

Os cromossomos foram identificados pelo critério de proporção de braços

proposto por Levan et al. (1964), onde os cromossomos metacêntricos (m),

submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) foram considerados como tendo

dois braços e os acrocêntricos (a) como tendo um braço. A interpretação das

fases da meiose seguiu John (1990).

23

3.1.4. Resultados

O número diploide encontrado para todos os espécimes fêmeas foi 2n=68

e para todos os espécimes machos foi 2n=67 cromossomos. Na maioria dos

indivíduos, os quais correspondem à Potamotrygon sp. C (conforme

denominação de Araújo 1998), a fórmula cariotípica correspondente foi

19m+8sm+10st+30a, NF=104 para os machos e 20m+8sm+10st+30a, NF=106

para as fêmeas. Nos machos, o par número dois não apresentou homólogo,

enquanto que nas fêmeas este mesmo par está presente em dose dupla, o que

caracteriza um sistema de cromossomos sexuais XX/X0 (Figuras 4a e 5a).

Entretanto um espécime fêmea, morfologicamente diferenciado, embora

apresentando o mesmo número diploide (2n=68), evidenciou fórmula cariotípica

também divergente, com 22m+10sm+8st+28a, NF=108 o qual foi

provisoriamente denominado Potamotrygon sp. C1 (Figura 6a).

Em Potamotrygon sp. C, as Ag-RONs foram evidenciadas nos machos na

região terminal dos braços longos de seis cromossomos, correspondendo aos

dois homólogos do par 8, ao único representante do par 2 (cromossomo X) e

apenas a um homólogo dos pares 18, 23 e 30 (Figura 4b). Nos núcleos

interfásicos foram visualizados sete sítios destacados pela prata (Figura 4c). Nas

fêmeas foram observadas nos mesmos cromossomos dos machos, diferindo

apenas por apresentar os dois homólogos do par número dois (cromossomos X)

apresentando RONs, totalizando assim oito sítios de AgRONs no complemento

cariotípico (Figura 5b e c). Em Potamotrygon sp. C1 as RONs foram

evidenciadas na região terminal dos braços longos dos pares 2 e 8 e em apenas

um dos homólogos do par 30, assim como no braço curto de um dos homólogos

do par 18 (Figura 6b).

A heterocromatina constitutiva foi evidenciada na região centromérica de

todos os cromossomos, com um padrão de bandas bastante semelhantes em

Potamotrygon sp. C e C1 (Fig. 4d, 5d, 6c).

Na meiose dos machos de Potamotrygon sp. C, as metáfases

espermatogoniais apresentaram 2n=67 cromossomos, confirmando o número

diploide encontrado nas células mitóticas. Em leptóteno foi visualizado um bloco

24

heteropicnótico mais destacado na borda do núcleo, o qual pode estar

relacionado ao cromossomo sexual. Na segunda divisão meiótica foram

constatadas metáfases com 33 e 34 cromossomos, conforme esperado a partir

de espermatogônias com 67 cromossomos. Foram evidenciadas bandas C

positivas nos centrômeros dos bivalentes e do univalente das células em

diplóteno/diacinese, assim como nos centrômeros de todos os cromossomos

das células em metáfase II. Em nenhuma das fases foi detectada qualquer figura

de pareamento sugerindo a presença de um trivalente (Figura 7).

25

Figura 4 – Cariótipo de Potamotrygon sp. C macho. a) coloração com Giemsa; b) pares nucleolares (em destaque) evidenciando as AgRONs; c) núcleo interfásico evidenciando sete sítios (RONs) destacados pela Prata; d) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciadas pelo bandamento C. m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico, a=acrocêntrico.

26

Figura 5 – Cariótipo de Potamotrygon sp. C fêmea. a) coloração com Giemsa; b) pares nucleolares (em destaque) evidenciando as AgRONs; c) núcleo interfásico evidenciando oito sítios (RONs) destacados pela Prata; d) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciadas pelo bandamento C. m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico, a=acrocêntrico

27

Figura 6 – Cariótipo de Potamotrygon sp. C1 fêmea em: a) coloração com Giemsa; b) pares nucleolares (em destaque) evidenciando as AgRONs; c) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciadas pelo bandamento m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico, a=acrocêntrico.

28

Figura 7. Meiose de machos de Potamotrygon sp. C: a) metáfase espermatogonial em coloração convencional, com 2n=67 cromossomos; b) leptóteno evidenciando um bloco heteropicnótico na borda nuclear (possível cromossomo sexual); c) diacinese com bandamento C, evidenciando bandas positivas nos centrômeros dos bivalentes e do univalente (cromossomo X); d) metáfase II com 33 cromossomos; e) metáfase II com 34 cromossomos; f) metáfase II com bandamento C, evidenciando bandas positivas nos centrômeros dos 34 cromossomos.

29

3.1.5. Discussão

Os espécimes de Potamotrygon ora analisados ainda se encontram em

fase de descrição. Araújo (1998) identificou provisoriamente a espécie da região

do presente estudo como Potamotrygon sp. C. Entretanto, nossos dados

mostraram a ocorrência simpátrica de uma segunda forma morfológica, distinta

de Potamotrygon sp. C, a qual foi denominada Potamotrygon sp. C1. Este

exemplar, embora apresentando o mesmo número diploide (2n=68), também se

diferenciou pela sua fórmula cariotípica, podendo representar mais uma espécie

de Potamotrygon a ser reconhecida e descrita na bacia amazônica. Por ora, a

ocorrência de um sistema XX/XO pode ser caracterizado apenas em

Potamotrygon sp. C, considerando que não foram coletados e examinados

espécimes machos de Potamotrygon sp. C1.

Em peixes, cerca de 10% das espécies citogeneticamente estudadas têm

cromossomos sexuais morfologicamente diferenciados, sendo descritos oito

sistemas cromossômicos distintos de determinação do sexo, abrangendo

sistemas simples (Feldberg et al. 1987; Andreata et al. 1993; Galetti Jr. et al.

1995; Bertollo et al. 2000; Centofante et al. 2002b; Rosa et al. 2006) e sistemas

múltiplos (Bertollo et al. 2000; Centofante et al. 2006; de Oliveira et al. 2009;

Cruz et al. 2011). Dentre eles, o sistema XX/XO, é de ocorrência rara entre os

peixes. Neste sistema o macho é o sexo heterogamético com um cromossomo a

menos que a fêmea, no qual o cromossomo Y foi eliminado, provavelmente por

não ter nenhuma função gênica ligada a ele (Chen 1969; Devlin e Nagahama

2002).

Três casos XX/X0 foram relatados por Chen (1969) em peixes marinhos.

Sternoptyx diaphana (2n=35 macho e 2n=36 fêmea), Lampanuyctus riterri

(2n=47 macho e 2n=48 fêmea) e Parvilux ingens (2n=49 macho e 2n=50 fêmea),

sendo que nas três espécies o cromossomo X é um dos maiores do

complemento, apresentando-se como univalente na meiose do macho. Entre os

peixes de água doce neotropical, o único caso deste sistema já descrito é o de

30

Ancistrus n. sp. 1 (Loricariidae, Ancistrini) com 2n= 39 (machos) e 2n=40

(fêmeas) (Alves et al. 2006).

Em Potamotrygon sp. C, os dados obtidos evidenciaram um cromossomo

a menos nos machos em comparação com as fêmeas, devido à presença de um

sistema XX/X0. De fato, foi constatado que o cromossomo ímpar no cariótipo

dos machos apresenta-se constituindo um par de homólogos no cariótipo das

fêmeas (par 2), assim como um univalente na meiose masculina, caracterizando

portanto um sistema sexual do tipo XX/XO. Apesar de ser relativamente raro

entre os peixes, este sistema é bastante frequente em alguns outros grupos de

organismos como os insetos, especialmente em odonatas, ortópteros,

hemípteros e heterópteros (Ramos 2009).

A priori, a presença de um cromossomo a mais em um dos sexos pode

ser também indicativo de cromossomos sexuais múltiplos do tipo

X1X1X2X2/X1X2Y, onde são verificados três cromossomos sem homologia entre si

no cariótipo dos machos e ausência de um desses cromossomos no cariótipo

das fêmeas, assim como a ocorrência de um trivalente na meiose dos machos

(Chen 1968; Bertollo et al. 2000; Centofante et al. 2006; Cruz et al. 2011). Entre

os peixes neotropicais são encontrados vários exemplos deste sistema (Bertollo

et al. 1997; Bertollo e Mestriner 1998; Almeida-Toledo et al. 2000a; b; Silva e

Margarido 2005; entre outros). Entre as arraias de água doce também já foram

descritos cromossomos sexuais múltiplos do tipo X1X1X2X2/X1X2Y para duas

espécies do alto rio Paraná (Potamotrygon aff. motoro e P. falkneri) (Cruz et al.

2011). Entretanto, um sistema de cromossomos sexuais múltiplos

X1X1X2X2/X1X2Y pôde ser descartado em Potamotrygon sp. C, considerando que

as condições acima mencionadas que caracterizam este sistema não foram

encontradas esta espécie.

Nokalla e Nokalla (1983) sugeriram que a origem do sistema XX/X0 ente

insetos poderia teria sido a partir de um sistema XX/XY, com a perda do

cromossomo Y. Chen (1968) também sugeriu que o sistema XX/X0, encontrado

nas três espécies de peixes por ele investigadas, teria se originado de um

sistema XX/XY pela deleção do Y, o qual poderia ser um cromossomo muito

31

pequeno ou mesmo um microcromossomo. Nesse caso, o cromossomo Y já

teria atingido um estágio avançado de degeneração, de sorte que poderia ser

realmente eliminado da população sem maiores implicações, dando origem a um

sistema XX/XO (ou ZZ/ZO) (Devlin e Nagahama 2002).

Sistemas XX/XY podem ser de fato encontrados no grupo das arraias.

Assim, em arraias marinhas já foram relatados cromossomos XY em Dasyatis

sabina (Donahue 1974; Kirpichnikov 1981), Dasyatis say, Platyrhinoidis triseriata

e Rhinobatus productus, (Maddock e Schwartz 1996) (Tabela 3). Entre as

espécies de Potamotrygon, a ocorrência de um sistema XX/XY está sendo por

nós descrita em P. orbignyi, assim como provavelmente também em P. scobina

(Valentim et al., em preparação), de sorte que não pode ser descartada a origem

de um sistema XO a partir de um sistema XY pré-existente neste grupo.

De uma maneira geral, a diferenciação de cromossomos sexuais entre os

peixes neotropicais parece ocorrer como um evento independente entre os

diferentes grupos (Almeida-Toledo e Foresti 2001). Vários autores apontam para

uma íntima correlação entre heterocromatinização e diferenciação dos

cromossomos sexuais simples, particularmente no sistema ZZ/ZW (Schmid et al.

2002; Vicente et al. 2003; Steinemann e Steinemann 2005; Hobza et al. 2006;

Marchal et al. 2006; Matsubara et al. 2006; Vicari et al. 2008; Wang et al. 2009;

Cioffi e Bertollo 2010; Cioffi et al. 2010). Entretanto, embora esta correlação

pode ser de fato encontrada em diversos casos analisados, ela não é universal.

Assim em três espécies do gênero Ancistrus (Loricariidae), cromossomos

sexuais já bem caracterizados morfologicamente, não apresentaram nenhum

sinal de aumento da heterocromatina, indicando que esta diferenciação deve ter

ocorrido por meio de rearranjos cromossômicos (de Oliveira et al. (2006).

Segundo Beçak e Beçak (1969) a diferenciação de cromossomos relacionados a

rearranjos estruturais, resulta em um processo de prevenção das recombinações

meióticas, o qual seria o primeiro passo para a diferenciação dos cromossomos

sexuais.

No caso de Potamotrygon sp. C, na qual a heterocromatina está presente

apenas na região centromérica de todos os cromossomos, a diferenciação

32

cromossômica sexual também não teve nenhuma relação com heterocromatina,

pois o que se observa nos prováveis cromossomos sexuais são blocos

heterocromáticos apenas na região centromérica e ao invés de um Y

heterocromático, o que ocorreu foi sua perda.

Cromossomos sexuais originados a partir de rearranjos estruturais em

peixes já foram registrados em Eigenmania sp. (Almeida-Toledo et al. 1984) e

em algumas populações de Hoplias malabaricus (Bertollo et al. 1997), os quais

estão fortemente associados à origem de sistemas múltiplos (Moreira-Filho et al.

1980).

A ocorrência de RONs em cromossomos sexuais não é comumente

encontrada entre os peixes, embora esta já tenha sido descrita em algumas

espécies. Reed e Phillips (1997) estudaram um caso interessante de

polimorfismo da região organizadora do nucléolo dos prováveis cromossomos

sexuais de Salvelinus alpinus, onde o lócus de DNAr mostrou variação em

número, tamanho e posição. Fundulus diafano é outra espécie em que os

cromossomos X e Y carregam RONs (Howell e Black 1979). Em Hoplias

malabaricus foram observados sítios de RONs localizados em posição distal no

braço longo do cromossomo X, os quais se apresentaram sempre ativos (Born e

Bertollo 2000). A presença de RONs ativas em ambos os cromossomos X em H.

malabaricus mostra que os genes de RNAr não estão sujeitos a um mecanismo

de inativação, fato também observado em outros vertebrados, como no anfíbio

Gastrotheca riobambae (Schmid et al. 1983). Porém, um dos casos mais

interessantes de RONs em cromossomos sexuais é relatado em Triportheus

(Characidae), onde ocorre um sistema ZZ/ZW, em todas as espécies já

estudadas, com o cromossomo W apresentando genes ribossomais (Artoni e

Bertollo 2002). É possível que a presença de sítios de DNAr em cromossomos

sexuais tenha também alguma implicação na segregação desses cromossomos

durante a meiose. Entre os invertebrados, como Drosophila e muitas espécies

de Coleópteros, nos quais não ocorre a formação do complexo sinaptonêmico

entre os cromossomos X e Y, a sinapse é assegurada pela associação entre o

DNAr presente nestes cromossomos, permitindo uma segregação regular

33

durante a gametogênese (Irick 1994; Ren et al. 1997). Stitou et al. (1997)

também descreveram RONs latentes em cromossomos sexuais do roedor

Lemniscomys, sugerindo algum papel para o DNAr durante o processo de

sinapse dos cromossomos X e Y.

Concluindo, o presente estudo evidenciou dois aspectos relevantes na

citogenética de peixes, ou seja, um sistema cromossômico de determinação de

sexo XX/X0, de ocorrência rara entre os peixes neotropicais, bem como dados

citotaxonômicos indicando a presença de uma possível nova espécie,

Potamotrygon sp. C1, a ser reconhecida na bacia amazônica. O sistema X0

caracterizado em Potamotrygon sp. C apresenta-se como um caráter derivado

entre as arraias uma vez que Plesiotrygon iwamae, considerado grupo irmão de

Potamotrygon (Carvalho et al 2003; Carvalho e Lovejoy 2011) não evidencia

cromossomos sexuais diferenciados. Assim sendo, as espécies de

Potamotrygon oferecem uma oportunidade excelente para o estudo dos

cromossomos sexuais entre os peixes, visto que quatro situações distintas já

foram relatadas para este grupo, ou seja, (1) cromossomos sexuais

indiferenciados; (2) cromossomos sexuais simples do tipo XX/XY (Valentim et

al., em preparação); (3) cromossomos sexuais XX/X0 (presente estudo) e,

cromossomos sexuais múltiplos (Cruz et al. 2011). Sem dúvida, os dados ora

apresentados são relevantes para embasar investigações subsequentes sobre

os processos envolvidos na diferenciação desses cromossomos, bem como na

diversificação dos diferentes sistemas até então detectados entre as espécies de

Potamotrygon.

34

3.2. Artigo 2:

Mecanismos de evolução cromossômica em arraias de água

doce (Myliobatiformes, Potamotrygonidae)

35

3.2. Artigo 2: Mecanismos de evolução cromossômica em arraias de água doce

(Myliobatiformes, Potamotrygonidae)

3.2.1. Resumo

Nos estudos da diversidade dos peixes amazônicos a citogenética clássica

ainda tem sido uma ferramenta bastante valiosa no entendimento dos diferentes

táxons e na relação das diversas populações, tanto pelo seu baixo custo como

pelos resultados fornecidos. Na família Potamotrygonidae, os estudos

citogenéticos são ainda incipientes, porém têm mostrado ser uma ferramenta

importante no entendimento da diversificação e evolução desses peixes. No

presente trabalho foram estudadas seis espécies nominais e um citótipo de

potamotrigonídeo da bacia amazônica: Plesiotrygon iwamae (2n=74 e NF=120),

Potamotrygon scobina (2n=66 e NF=104), P. cf. scobina (2n=66 e NF=107), P.

constellata (2n=66 e NF=110), P. leopoldi (2n=64 e NF=102), P. orbignyi (2n=66

e NF=106) e P. motoro de diferentes localidades (2n=66 e NF=106). As RONs

são múltiplas em todas elas, porém diferem em número e posição entre si. A

heterocromatina constitutiva está localizada apenas na região centromérica de

todos os cromossomos, em todas as espécies. Sistema de determinação

cromossômico sexual do tipo XX/XY foi observado em P. orbignyi, estando

provavelmente também presente em P. scobina e P. cf. scobina, dependendo

ainda de confirmação. Embora os dados disponíveis ainda não sejam suficientes

para traçar o caminho da evolução cariotípica entre as arraias de água doce, fica

evidente que alguns tipos de rearranjos cromossômicos, como fusões e/ou

fissões, além de inversões e translocações, tiveram um papel significativo na

diferenciação cromossômica deste grupo de peixes.

36

3.2.2. Introdução

A citogenética de peixes vem ganhando cada vez mais adeptos,

principalmente com a utilização das técnicas moleculares, entretanto, muitos

táxons ainda não têm nem mesmo o seu número diploide conhecido. Em se

falando de Amazônia, onde muitas espécies ainda não foram nem descritas,

esta escassez é ainda maior. Segundo revisão de Santos e Ferreira (1999), o

número de espécies de peixes estimado para a bacia amazônica varia entre

1500 e 5000 e até 1992 apenas 211 espécies nominais tinham seu número

haloide/diploide conhecido (Porto et al. 1992).

Entre os grupos de peixes com maior escassez em dados citogenéticos

estão os Elasmobranquios (Rocco et al. 2005). Segundo Stingo e Rocco (2001),

Rocco et al. (2005), das 1100 espécies marinhas apenas 63 (5,73%) têm o

cariótipo conhecido e o que se observa é uma enorme variabilidade cariotípica,

não havendo um número cromossômico modal e nem uma fórmula cariotípica

predominante. Considerando apenas arraias marinhas, o número de espécies

que tem seu cariótipo determinado é apenas 37 (3,36%) e a mesma

variabilidade cariotípica é observada (Tabela 3). Com relação às arraias de água

doce, das vinte espécies válidas apenas cinco têm seu cariótipo conhecido

(Valentim et al. 2006 e Cruz et al. 2011).

A falta de um plano de manejo adequado, a crescente exploração

no comércio de peixes ornamentais, aliados às características biológicas, como

baixa fecundidade, crescimento lento, maturidade sexual tardia, tornam as

arraias de água doce, o principal elasmobrânquio dulcícola, vulnerável à

extinção (Araújo et al. 2004; Charvet-Almeida et al. 2005; Duncan et al. 2010).

Para muitos pesquisadores isso é preocupante uma vez que, pouco se conhece

a respeito desses peixes, ou seja, a classificação taxonômica e a história

evolutiva do grupo ainda apresentam vários problemas, com grandes lacunas a

respeito do seu grupo irmão marinho e como ocorreu sua diversificação na água

doce (Carvalho et al. 2003; Lovejoy et al. 2006; Toffoli et al 2008; Rosa et al.

2010 e Carvalho e Lovejoy 2011).

37

Em Elasmobrânquios de água doce, os estudos citogenéticos tiveram seu

início com espécies de arraias da bacia amazônica (Valentim et al. 2006). Neste

estudo foram descritos os cariótipos de três espécies (Paratrygon aiereba,

Potamotrygon motoro, fêmeas de Potamotrygon orbignyi) e dois números

diploides (2n=90 e 2n=66) foram encontrados, mas um mesmo número

fundamental. Cruz et al (2011) apresentaram os cariótipos de mais duas

espécies (Potamotrygon aff. motoro e Potamotrygon falkneri), da bacia do alto

Paraná e ambas com 2n=66 cromossomos.

No presente trabalho, as coletas foram ampliadas na bacia amazônica e

análises citogenéticas foram realizadas em Plesiotrygon iwamae e em mais seis

espécies de Potamotrygon.

3.2.3. Material e Métodos

Na Tabela I estão descritas as espécies e seus respectivos números de

indivíduos analisados cariotipicamente, locais de coleta e coordenadas. Na

figura 1 estão as fotos das espécies estudadas. A indução mitótica foi feita com

fermento biológico conforme Oliveira et al. (1988). Cromossomos mitóticos foram

obtidos pela técnica air drying descrita por Bertollo et al. (1978) e adaptada para

arraias por Valentim et al. (2006).

As regiões organizadoras do nucléolo (RONs) foram detectadas por

nitrato de Prata (AgRONs), segundo Howell e Black (1980) e o bandamento C,

para localização da heterocromatina constitutiva, foi feito utilizando hidróxido de

Bário de acordo com Sumner (1972).

Os cariótipos foram montados, separando os cromossomos em

metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos

conforme critério proposto por Levan et al. (1964). Para a determinação do

número fundamental ou número de braços cromossômicos (NF), os

cromossomos metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st)

foram considerados com dois braços e os acrocêntricos (a) com apenas um

braço.

38

3.2.4. Resultados

Plesiotrygon iwamae tem o número diploide igual a 74 cromossomos,

para machos e fêmeas, sendo 26m+8sm+12st+28a e NF=120 (Figura 8a). Esta

espécie tem um sistema múltiplo de RONs, com até cinco sitios, os quais foram

detectados na região terminal dos braços longos dos pares 1 e 6 e em um

homólogo do par 29 (Figura 8b). Blocos de heterocromatina constitutiva foram

detectados na região centromérica da maioria dos cromossomos, sendo alguns

mais pálidos (Figura 1c). Nos pares 1 e 6, os blocos heterocromáticos foram

também evidenciados na região terminal dos braços longos, coincidentes com

as RONs (Figura 8c).

39

Figura 8 Cariótipo de Plesiotrygon iwamae: a) coloração convencional com Giemsa; b) coloração com AgNO3; c) bandamento C.

40

Machos de Potamotrygon scobina e de P. cf. scobina têm o número

diploide igual a 66 cromossomos, mas com cariótipos e fórmulas cariotípicas

distintas, 19m+7sm+12st+28a e NF=104, 21m+8sm+12st+25a e NF=107,

respectivamente (Figura 9a, b). As duas espécies apresentam dois

cromossomos sem homologia, um metacêntrico grande e um submetacêntrico

pequeno. Todos os indivíduos analisados foram machos, o que não permite

concluir sobre a ocorrência de um sistema de cromossomos sexuais nestas

espécies, uma vez que não foi possível uma análise comparativa com os

cariótipos das fêmeas. A priori, é posssível que um sistema cromossômico de

determinação do sexo do tipo XX/XY possa estar presente nestas duas

espécies.

Ambas as espécies apresentaram RONs múltiplas nem sempre ativas,

localizadas na região, terminal dos braços longos dos cromossomos. Entretanto,

como as fórmulas cromossômicas são diferentes, os pares portadores de RONs

também são diferentes, correspondendo aos cromossomos 2, 6, 26 e 33 em P.

scobina e 5, 8, 24 e 33 e P. cf. scobina (Figura 10a, b). A heterocromatina

constitutiva foi evidenciada na região centromérica da maioria dos cromossomos

nas duas espécies, porém em P. scobina o cromossomo número um, sem seu

homólogo, apresentou um bloco maior de heterocromatina na região do

centrômero, o qual se expande para as regiões proximais de ambos os braços

(Figura 11a, b).

Fêmeas de P. constellata têm o número diploide igual a 66 cromossomos,

sendo 22m+8sm+14st+22a e NF=110 (Figura 9c). As RONs são múltiplas, com

até oito marcações localizadas na região terminal dos braços longos dos pares

2, 5 e 32 e na região terminal dos braços curtos do par 22 (Figura 10 c). A

heterocromatina foi evidenciada na região centromérica de todos os

cromossomos (Figura 11c).

Potamotrygon leopoldi tem o número diploide igual a 64 cromossomos

para machos e fêmeas, sendo 24m+4sm+10st+26a com NF=102 (Figura 9d). As

RONs são múltiplas, com até seis marcações localizadas nos braços longos dos

pares 3 e 7 e em um dos homólogos dos pares 23 e 32 (Figura 10d). A

41

heterocromatina constitutiva foi evidenciada na região centromérica da maioria

dos cromossomos (Figura 11d).

42

Figura 9. Cariótipos em coloração Giemsa: a) Potamotrygon scobina (macho); b)

P. cf. scobina (macho); c) P. constellata; d) P. leopoldi.

43

Figura 10. Cariótipos com coloração pelo nitrato de Prata: a) P. scobina (macho); b) P. cf. scobina (macho); c) P. constellata; d) P. leopoldi.

44

Figura 11. Cariótipos com Bandeamento C: a) Potamotrygon scobina (macho); b) P. cf. scobina (macho); c) P. constellata; d) P. leopoldi.

45

P. orbignyi tem número diploide igual a 66 cromossomos para fêmeas

(Valentim et al. 2006) e machos (presente trabalho), sendo 22m+10sm+8st+26a

e NF=106. Com os dados agora obtidos pode-se verificar que os machos têm

dois cromossomos submetacêntricos sem homologia, sendo um de tamanho

médio e o outro pequeno, sendo que este heteromorfismo se encontra ausente

nas fêmeas. Assim sendo, esta falta de homologia em um par de cromossomos

apenas nos machos sugere um sistema de cromossomos sexuais do tipo XX/XY

(figura 12a, b). Um sistema de RONs múltipla também ocorre nesta espécie,

com até oito sítios localizados na região terminal dos braços longos dos pares 2,

8 e 30 e em um dos homólogos dos pares 3 e 12 (Figura 12c). A

heterocromatina constitutiva foi evidenciada na região centromérica de todos os

cromossomos (Figuras 12d, e), exceto para os machos, onde o cromossomo Y

parece ser todo heterocromático (Figura 12d).

46

Figura 12. Cariótipos de Potamotrygon orbignyi corados com Giemsa: a) macho; b) fêmea; c) cromossomos portadores das Ag-RONS; d) bandamento C em machos; e) bandamento C em fêmea.

47

Para P. motoro, a espécie de mais ampla distribuição, foi feito um estudo

comparativo entre indivíduos de diferentes localidades ao longo do rio Negro e

do rio Solimões, próximo à cidade de Manaus, AM (Tabela 1). Todos os

indivíduos apresentaram 2n=66 cromossomos, sendo 18m+12sm+10st e 26a e

NF=106, sem heteromorfismo cromossômico sexual (Figura 13). A

heterocromatina constitutiva foi evidenciada na região centromérica de todos os

cromossomos, sem diferenciação entre as localidades, exceto para a amostra do

rio Jauaperi que além destas marcações apresentaram o par 11 com blocos

heterocromáticos na região terminal dos braços longos (Figura 14).

48

Figura 13. Cariótipos de Potamotrygon motoro, de diferentes localidades, corados com Giemsa: a) Médio rio Negro, região de Barcelos; b) do rio Jauaperi, médio rio Negro; c) do lago do Catalão, baixo rio Negro; c) do lago Janauacá, rio Solimões.

49

Figura 14. Cariótipos de P. motoro, de diferentes localidades, com bandeamento C: a) Médio rio Negro, região de Barcelos; b) rio Jauaperi, médio rio Negro; c) lago Catalão, baixo rio Negro; c) lago Janauacá, rio Solimões.

50

3.2.5. Discussão

3.2.5.1. A macroevolução cariotípica dos potamotrigonídeos

Potamotrygonidae é o único grupo de arraias que se irradiou em ambiente

dulcícola (Lovejoy 1996; Toffoli et al. 2008). Hoje, quatro gêneros são

considerados válidos: Paratrygon Duméril, 1865, Potamotrygon Garman, 1877,

Plesiotrygon Rosa, Castello e Thorson, 1987 e Heliotrygon Carvalho e Lovejoy,

2011 (Rosa et al. 1987; Carvalho et al. 2003; Carvalho e Lovejoy 2011). O

gênero Paratrygon é monoespecífico, enquanto Heliotrygon e Plesiotrygon

possuem duas espécies válidas cada um (Carvalho e Lovejoy, 2011; Carvalho e

Ragno 2011) e Potamotrygon tem aproximadamente 20 espécies válidas

(Carvalho et al. 2003; Rosa et al. 2008).

Os potamotrigonídeos, como todos os Chondrichthyes, estão entre os

vertebrados menos investigados do ponto de vista citotaxonômico, havendo, até

o momento apenas dois estudos publicados sobre esse grupo. Valentim et al.

(2006) determinaram o número diploide de Paratrygon aiereba (2n=90),

Potamotrygon motoro (2n=66) e P. orbignyi (fêmeas 2n=66) da bacia do rio

Negro-AM. Enquanto que Paratrygon aiereba apresentou número alto de

cromossomos acrocêntricos (4m+2sm+10st+74a), as espécies de Potamotrygon

apresentaram redução deste número com aumento dos cromossomos com dois

braços, principalmente meta- e submetacêntricos (18m+12sm+10st+26a e

22m+10sm+8st+26a, respectivamente). Entretanto, as três espécies

apresentaram semelhanças no número fundamental (NF=106), sugerindo que na

evolução cromossômica dessas arraias de água doce teria ocorrido redução do

número diploide. Cruz et al. (2011) analisaram o cariótipo de duas espécies do

alto rio Paraná, Potamotrygon aff. motoro e P. falkneri, ambas com 2n=66

cromossomos e com um sistema de cromossomos sexuais múltiplos do tipo

X1X1X2X2/X1X2Y.

Conforme a proposição filogenética mais recente, baseada em análises

morfológicas e moleculares (gene Citocromo b), a árvore mais parcimoniosa

51

revelou que Heliotrygon e Paratrygon formam um clado, o qual é o grupo irmão

do clado que inclui Plesiotrygon e as espécies de Potamotrygon (Carvalho e

Lovejoy 2011). Os dados moleculares obtidos sugerem que Potamotrygon é

parafilético e que Plesiotrygon estaria inserido em Potamotrygon, corroborando

os achados de Toffoli et al. (2008).

Assim, associando os caracteres cromossômicos obtidos no presente

estudo com os dados filogenéticos de Carvalho e Lovejoy (2011), verifica-se que

ainda não existem informações sobre qualquer uma das duas espécies do

gênero Heliotrygon. Entretanto, para os demais gêneros, os dados ora obtidos

evidenciam diferenciações cromossômicas entre Paratrygon aiereba (2n=90),

Plesiotrygon iwamae (2n=74) e as espécies de Potamotrygon (2n=64 a 68).

Adicionalmente, se considerarmos também o número fundamental ou de braços

(NF), há fortes indicativos dos possíveis rearranjos cromossômicos ocorridos.

Assim, verifica-se que no clado formado por Plesiotrygon iwamae (NF=120) e as

espécies de Potamotrygon (NF=101-122), os rearranjos robertsonianos

(fusões/fissões cêntricas) destacam-se como eventos primordiais na

diferenciação cariotípica deste clado, além de possíveis inversões pericêntricas.

De fato, comparando os dados cariotípicos de Paratrygon aiereba (2n=90;

NF=106), espécie que pertence ao clado irmão de Plesiotrygon e Potamotrygon,

verifica-se que enquanto houve uma redução significativa no número

cromossômico, o número de braços não apresentou variação tão acentuada,

mantendo valores próximos entre os dois clados.

Cariotipicamente as espécies dos três gêneros aqui analisados

apresentam-se bem distintas em relação ao número e fórmula cromossômica.

Quando comparamos os cariótipos de Paratrygon aiereba (2n=90;

4m+2sm+10st+74a) com Plesiotrygon iwamae (2n=74; 26m+8sm+12st+28a)

observa-se uma redução acentuada associada a pelo menos 20 cromossomos

acrocêntricos. A comparação destas duas espécies com todas as espécies de

Potamotrygon, indica uma redução ainda maior (2n= 90 2n=74 2n=64-68).

Os dados disponíveis até o momento indicam que as espécies de

Potamotrygon podem ser agrupadas em três grandes grupos, a saber, com

52

2n=64, 2n=66 e 2n=68. Contudo, há derivações internas associadas com

heteromorfismos cromossômicos sexuais. Entretanto, este agrupamento é ainda

preliminar, considerando que das 20 espécies válidas de Potamotrygon apenas

1/3 já foi cariotipada. Nos casos em que as espécies foram identificadas sob o

mesmo status taxonômico, os cariótipos indicam tratar-se de espécies distintas,

como é o caso de P. scobina e P. cf. scobina, Potamotrygon sp. C e

Potamotrygon sp. C1 (capítulo 1), P. motoro e P. aff. motoro (Tabela 2).

Rocco et al. (2007) observaram que as espécies basais de raias marinhas

têm um número cromossômico elevado, acima de 90, com predominância de

cromossomos com um braço e presença de microcromossomos, como ocorre

em Raja asterias, que tem 2n=98 cromossomos. Contrariamente as espécies

derivadas, como Myliobatis aquila tem número diploide mais baixo e um

progressivo aumento no número de cromossomos com dois braços. Neste caso,

também foi sugerido que rearranjos cromossômicos robertsonianos do tipo fusão

seguidos de inversões seriam os principais mecanismos envolvidos na evolução

cariotípica das raias marinhas.

Com a inclusão dos dados citogenéticos das arraias de água doce e a

comparação de todos esses dados com os Rajiformes e Myliobatiformes (Tabela

3) verifica-se que ainda não existem dados conclusivos para se inferir sobre a

tendência evolutiva cromossômica das arraias de água doce, visto a ausência de

informações cariotípicas sobre as espécies de Heliotrygon. Porém, as evidências

apontam para a redução do número de cromossomos, considerando também

que os representantes das outras famílias de Myliobatiformes possuem na sua

grande maioria números diploides baixos (Figura 15).

53

Figura 15. Números diploides sobrepostos à árvore filogenética da ordem

Myliobatiformes proposta por Carvalho et al. (2004).

54

Convém destacar que ainda não existe consenso sobre o grupo irmão de

Potamotrygonidae (Urotrygonidae ou Dasyatidae?) e nem mesmo das relações

dentro dos clados. Com base em dados moleculares e parasitológicos, Marques

et al. (2003) propõem que Himantura é o parente mais próximo de

Potamotrygonidae. Lovejoy et al. (2006) compartilha desta opinião e que as

espécies envolvidas seriam H. pacifica e H. schmardae da costa do Pacífico com

representantes também no Atlântico. Entretanto, até o momento nenhuma

espécie de Himantura foi cariotipada. Segundo Toffoli et al. (2008), dentro da

bacia amazônica os potamotrigonídeos teriam se diversificado por irradiação

adaptativa, invadindo outras bacias hidrográficas como aconteceu recentemente

na bacia do Paraná Paraguai (Rosa et al. 2008).

Estudos recentes descreveram um novo gênero, Heliotrygon (Carvalho e

Lovejoy 2011). Com a descrição deste quarto gênero uma nova filogenia foi

proposta, onde Paratrygon e Heliotygon seriam táxons irmãos e juntos

formariam o grupo irmão de Plesiotrygon e Potamotrygon (Rosa et al. 2010;

Carvalho e Lovejoy 2011).

Claramente as arraias ainda possuem várias indefinições taxonômicas e

sistemáticas, requerendo esforços integrados para a solução deste problema.

Neste contexto, estudos taxonômicos com um maior número de caracteres

diagnósticos associados a marcadores genéticos (moleculares e citogenéticos),

deverão propiciar avanços no conhecimento deste importante grupo de peixes.

De fato, os caracteres cromossômicos correspondem a uma boa ferramenta

para auxiliar na classificação e delimitar o status taxonômico desses peixes, uma

vez que até o momento, todas as espécies de arraias de água doce são

portadoras de um cariótipo espécie-específico (Tabela 2).

3.2.5.2. Cromossomos sexuais de potamotrigonídeos

Um caráter cromossômico de extrema importância num estudo

citotaxonômico em peixes é a presença de cromossomos sexuais diferenciados

entre machos e fêmeas, uma vez que a grande maioria dos peixes não os

apresenta. Entre as arraias marinhas, vários casos de cromossomos sexuais

55

heteromórficos foram descritos (Tabela 3). Entretanto, entre as arraias de água

doce, esta característica só foi constatada entre espécies do gênero

Potamotrygon, enquanto que espécies dos demais gêneros, como Paratrygon

aiereba e Plesiotrygon iwamae não têm cromossomos sexuais diferenciados.

Assim sendo, este é um caráter apomórfico para Potamotrygon, onde já foram

encontrados três tipos de sistemas, a saber, (a) um sistema simples XX/XY em

P. orbignyi e possivelmente também em P. scobina e P. cf. scobina (a ser

confirmado), b) um sistema simples XX/X0 em Potamotrygon sp. C (Valentim et

al., em preparação) e c) um sistema múltiplo X1X1X2X2/X1X2Y em P. aff. motoro e

P. falkneri (Cruz et al. 2011).

A diferenciação de cromossomos sexuais principalmente nos sistemas

simples, pode ocorrer a partir de rearranjos cromossômicos, que atuam na

redução da recombinação entre os cromossomos rearranjados. Entre os peixes,

é também frequente o processo de heterocromatinização na diferenciação dos

cromossomos sexuais. Entretanto, no caso específico das arraias do gênero

Potamotrygon não há evidências de que a diferenciação dos cromossomos

sexuais tenha ocorrido por perda ou ganho de heterocromatina. Assim,

rearranjos cromossômicos, ou mesmo deleções de segmentos ou de

cromossomos inteiros, podem estar associados aos processos de diferenciação

dos sistemas detectados neste grupo. Em Potamotrygon dos nove táxons,

citogeneticamente analisados, seis têm cromossomos sexuais e em todos os

machos é o sexo heterogamético. Portanto, tanto o sistema XX/X0 como o

sistema múltiplo X1X1X2X2/X1X2Y podem ter se diferenciado a partir de um

sistema ancestral XX/XY. É também possível que este sistema ancestral possa

se encontrar ainda indiferenciado, em estado nascente, como já constatado em

outros grupos de peixes (Cioffi e Bertollo 2010; Cioffi et al 2011). Um aspecto

interessante é que as espécies portadoras de cromossomos sexuais simples são

encontradas na bacia amazônica (P. scobina, P. cf. scobina, P. orbignyi,

Potamotrygon sp. C), enquanto que as espécies com sistemas de cromossomos

sexuais múltiplos ocorrem na bacia do alto rio Paraná: P. aff. motoro e P.

falkneri. Entretanto, a espécie classificada como P. motoro, que ocorre na região

56

amazônica, não apresentou heterogametia em nenhum dos locais onde foi

coletada, o que leva a questionamentos sobre a real identidade desta espécie

nessas duas bacias.

3.2.5.3. O padrão da heterocromatina constitutiva e das regiões

organizadoras de nucléolo em potamotrígonideos

As arraias, tanto as marinhas como as de água doce, as quais tiveram

seu padrão de banda C analisado, têm evidenciado a presença de

heterocromatina apenas na região centromérica de todos os cromossomos do

complemento (Stingo et al. 1995; Valentim et al. 2006; Rocco et al. 2002b; 2005;

2007; Cruz et al. 2011) o que foi também constatado no presente estudo com as

cinco espécies e as diferentes populações analisadas. Em P. motoro apenas os

indivíduos do rio Jauaperi (médio rio Negro) apresentaram um par

cromossômico com blocos terminais nos braços longos. Por sua vez, os

cromossomos sexuais de P. scobina, P. cf. scobina e P. orbignyi, também não

apresentam segmentos heterocromáticos conspícuos, como ocorre em diversas

outras espécies de peixes neotropicais (Born e Bertollo 2000; Almeida-Toledo e

Foresti 2001). O mesmo também foi destacado por Cruz et al. (2011), em

relação aos cromossomos sexuais múltiplos descritos para duas espécies de

Potamotrygon da bacia do alto rio Paraná. Deste modo, pouca heterocromatina,

e com localização preferencialmente centromérica, parece ser um caráter

plesiomórfico para as arraias.

Todas as espécies de arraias de água doce até agora analisadas

apresentam RONs múltiplas, localizadas na região terminal dos braços longos,

com duas exceções em Potamotrygon constellata e Potamotrygon sp. C1, que

apresentam um dos pares cromossômicos com sítios de RONs localizados nos

braços curtos. Entretanto, o número de RONs consideradas ativas (AgRONs)

pode ser variável, observando-se quatro sítios em Paratrygon aiereba (Valentim

et al. 2006), até seis em Plesiotrygon iwamae e até oito nas espécies de

Potamotrygon. Contrariamente, RONs simples foram encontradas em várias

espécies de arraias marinhas (Stingo et al. 1995).

57

Em algumas famílias de peixes a RON pode ser considerado um

excelente marcador, como em Curimatidae (Feldberg et al. 1993) e Anostomidae

(Galetti Jr. et al. 1984). Entretanto, para alguns outros grupos este caráter não

tem se mostrado informativo para a citotaxonomia, onde as RONs são simples e

homeólogas, para todas as espécies do táxon ou são múltiplas e com variações

no número.

Deste modo, Potamotrygonidae é uma família de peixes que abriga

espécies com grande diversidade cariotípica, com número diploide variando de

66 a 90 cromossomos e número de braços variando de 102 a 122, o que indica

que rearranjos cromossômicos, principalmente fusões ou fissões cêntricas,

estão estreitamente associados à sua evolução cariotípica. Entretanto,

rearranjos do tipo inversões pericêntricas e/ou translocações podem ter

participado deste processo, contribuindo para a diversidade cariotípica

constatada entre as espécies dessa família. Esses rearranjos também explicam

a variabilidade das regiões organizadoras do nucléolo e presença de

mecanismos de determinação sexual, uma vez que a diferenciação

cromossômica sexual não foi por heterocromatinização e nem por adição de

heterocromatina. Ainda, os diferentes sistemas de cromossomos sexuais,

simples ou múltiplos representam caracteres derivados na evolução

cromossômica deste grupo e estes só foram evidenciados no gênero

Potamotrygon.

.

58

Tabela 2. Dados citogenéticos das arraias de água doce (Potamotrygonidae) descritos na literatura e no presente estudo.

FC= Fórmula cromossômica; 2n=número diploide; NF=número fundamental T=Terminal; p=braço curto; q=braço longo

Espécie FC 2n NF Nº de RON Posição das RONs

Cromos. sexual referências

Paratrygon aiereba 4m+2sm+10st+74a 90♂/♀ 106 2 a 4 T/pq - Valentim et al. 2006

Plesiotrygon iwamae 26m+8sm+12st+28a 74♂/♀ 120 5 a 6 T/q - Presente trabalho

Potamotrygon orbignyi 22m+10sm+8st+26a 66♂/♀ 106 6 a 8 T/q -XY Valentim et al. 2006; Presente trabalho

Potamotrygon constellata 22m+8sm+14st+22a 66♀ 110 8 T/pq - Presente trabalho

Potamotrygon leopoldi 24m+4sm+10st+26a 64♂/♀ 102 4 a 6 T/q - Presente trabalho

Potamotrygon scobina 19m+7sm+12st+28a 66♂ 104 6 a 8 T/q - Presente trabalho

Potamotrygon cf. scobina 21m+8sm+12st+25a 66♂ 107 6 a 8 T/q Presente trabalho

Potamotrygon sp. C(cururu) 19m+8sm+10st+30a/20m+8sm+10st+30a

67♂/68♀ 104/106 7 a 8 T/q X0 Presente trabalho

Potamotrygon sp. C1 22m+10sm+8st+28a 68♀ 108 8 T/q Presente trabalho

Potamotrygon motoro 18m+12sm+10st+26a 66♂/♀ 106 6 a 8 T/q - Valentim et al. 2006

Potamotrygon aff. motoro de Ilha Solteira

21m+9sm+19st+16a/ 22m+8sm+20st+16a

65♂/66♀ 114/116 8 T/pq X1X1X2X2/X1X2Y Cruz et al. 2011

Potamotrygon aff. motoro de Porto Rico

20m+10sm+25st+10a/ 22m+10sm+26st+10a

65♂/66♀ 120/122 10 T/pq X1X1X2X2/X1X2Y Cruz et al. 2011

Potamotrygon falkneri de Ilha Solteira

20m+9sm+14st+22a/ 20m+10sm+14st+22a

65♂/66♀ 108/110 10 T/q X1X1X2X2/X1X2Y Cruz et al. 2011

Potamotrygon falkneri de Porto Rico

20m+9sm+18st+18a/ 20m+10sm+18st+18a

65♂/66♀ 112/114 8 T/q X1X1X2X2/X1X2Y Cruz et al. 2011

59

Tabela 3. Compilação dos dados cariotípicos das arraias marinhas (n=número haploide; 2n=número diploide; FC=fórmula cromossômica; NF=número fundamental; CS=cromossomos sexuais; RON=região organizadora do nucléolo; HC=heterocromatina constitutiva)

Espécie

n

2n

FC

NF

CS

RON

HC

Referência

Ordem/Família

Rhinobatiformes

Rhinobatidae

Rhinobatos productus 92 44m/sm+48t 136 XY Schwartz e Maddock 1986; Maddock e Schwartz 1996

Rhinobatos hynnicephalus M 59 50m/sm+9t 109 ND Kikuno e Ojima 1987

Rhinobatos hynnicephalus F 60 51m/sm+9t 111 ND Kikuno e Ojima 1987

Rhinobatos schlegelii M 63 54m/sm+9t 117 ND Asahida e Ida 1995

Rhinobatos schlegelii F 64 55m/sm+9t 119 ND Asahida e Ida 1995

Platyrhinidae

Platyrhinoidis triseriata 64 32m/sm+32t 96 XY Schwartz e Maddock 1986; Maddock e Schwartz 1996

Torpediniformes

Narcinidae

Narcine brasiliensis 28 28m/SM 56 Donahue 1974

Narkidae

Narke japonica 54 28m/sm+26t 82 Ida et al. 1985

Torpedinidae

Torpedo californica 82 4m/sm+78st/a 86 Ida et al. 1985

Torpedo marmorata 86 86st-a 86 Stingo 1979

Torpedo marmorata 86 86st-a 86 m/p/t Centr. Stingo et al. 1995

Torpedo ocellata 66 12m/sm+54t 78 Stingo 1976

Torpedo ocellata 66 12m/sm+54t 78 Centr. Stingo e Capriglione 1986

Torpedo ocellata 66 12m/sm+54t 78 m/p/t. Centr. Stingo et al. 1995

Torpedo tokionis 86 86ª 86 Asahida e Ida 1990

Rajiformes

Rajidae

Amblyraja (Raja) radiata 49 98 6m/sm+ 92t 104 Nygre et al. 1971

Dipturus (Raja) batis 98 6m/sm+92ª 104 Nygre e Jahnke 1972

Raja eglantéria 58 30m/sm+28t 88 Schwartz e Maddock 1986

Raja clavata 49 98 6m/sm+92t 104 Stingo 1979; Nygre e Jahnke 1972

Raja(Akamejei) meerdervoortii 104 0m/sm+104t 104 Makino 1937

Raja asterias 98 6m/sm+92t 104 Olmo et al. 1982

Raja asterias 98 6m/sm+92t 104 m/p/t Centr Rocco et al. 2002a

Raja montagui 48 9m/sm+8st+31t 104 m/p/tc Rocco et al. 2002b

Raja polystigma 96 18m/sm+16st+62a 114 Centr Rocco et al. 2007

60

Continuação da tabela 3.

Espécie

n

2n

FC.

NF

CS

RON

HC

Referência

Ordem/ Família

Myliobatiformes

Urolophidae

Urolophus aurantiacus 52 44m/sm+8t Asahida et al. 1987

Urotrygonidae

Urobatis (Urolophus) halleri 72 20m/sm+52t 92 Schwartz e Maddock 1986

Dasyatidae

Dasyatis ajakei 72 34m/sm+38t 106 Asahida et al. 1987

Dasyatis ajakei 42 84 20m/sm+64t 104 Nogusa 1960

Dasyatis americana 78 69m/sm+9t 87 Asahida et al. 1993

Dasyatis kuhlii 64 Asahida et al. 1993

Dasyatis matsubari 64 40m/sm+24t 104 Asahida et al. 1990

Dasyatis Sabina 68 28m/sm+40t 96 XY Donahue 1974; Kirpichnikov 1981

Dasyatis sayi 68 34m/sm+34t 102 XY Donahue 1974; Maddock e Schwartz 1996

Dasyatis violácea 58 46m/sm+12t 104 Hinegardner 1976

Dasyatis violácea 58 30m/sm+28t 88 Olmo et al. 1982

Taeniura lymma 64 38m/sm+26/a 102 m/p Cent. Rocco et al. 2002a; Rocco et al. 2005

Gymnuridae

Gymnura micrura 56 44m/sm+12t 100

Gymnura japônica 56 32m/sm+24t 88 Asahida e Ida unpublished

Myliobatidae

Myliobatis freminvillei 52 50m/sm+2t 102 Schwartz e Maddock 1986

Myliobatis californica 52 50m/sm+2t 102 Schwartz e Maddock 1986

Myliobatis Áquila 52 32m/sm+20t 84 Stingo e Capriglione 1986

Myliobatis tobijei 54 40m/sm+14t 94 Asahida et al. 1987

Rhinopteridae

Rhinoptera bonasus 64 42m/sm+22t Schwartz e Maddock, 1986

Mobulidae

Mobula japônica 66 38m/sm+28t 104 Asahida et al. 1993.

61

4. CONCLUSÕES GERAIS

Com base nos resultados obtidos no presente estudo pode se concluir

que:

1) Potamotrygonidae abriga espécies com grande diversidade

cariotípica, com número diploide variando de 66 a 90 cromossomos e número

de braços variando de 102 a 122.

2) Rearranjos cromossômicos, principalmente fusões ou fissões

cêntricas, estão estreitamente associados à evolução cariotípica da família

Potamotrygonidae. Entretanto, rearranjos do tipo inversões pericêntricas e/ou

translocações também ocorreram, contribuindo para a diversidade cariotípica

constatada entre as espécies dessa família.

3) Inversões pericêntricas e translocações ocorreram na diversificação

cariotípica de Potamotrygonidae, o que explica a variabilidade das regiões

organizadoras do nucléolo e presença de mecanismos de determinação

sexual.

4) Diferentes sistemas de cromossomos sexuais, simples ou múltiplos,

ocorrem entre as espécies de Potamotrygon, representando caracteres

derivados na evolução cromossômica deste grupo.

5) Diferentemente do que se constata em diversos outros grupos de

peixes neotropicais, a diferenciação cromossômica sexual nas arraias não se

deu por processos de heterocromatinização cromossômica, visto que nos

sistemas simples ora estudados (XX/XY e XX/X0), assim como nos sistemas

múltiplos já descritos, a heterocromatina encontra-se restrita à região

centromérica dos cromossomos.

6) Cariótipos distintos foram detectados entre as espécies de

Potamotrygon ora analisadas, a exemplo de Potamotrygon sp. C e

Potamotrygon sp. C1, representando possíveis novas espécies a serem

reconhecidas e descritas para esse grupo.

62

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Almeida-Toledo, L.F.; Foresti, F.; Daniel, M.F.Z.; Toledo-Filho, S.A. 1984.

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Gymnotiformes). Genetica, 64: 165-169.

Almeida-Toledo, L.F. 1998. Cytogenetic markers in Neotropical freshwater

fishes, p. 583-588. In: Malabarba, L.R.; Reis, R.E.; Vari, R.P.; Lucena,

R.P.; Lucena, Z.M.S.; Lucena, C.A.S (Eds). Phylogeny and classification

of Neotropical fishes. Editora da Pontifícia Universidade Católica, Porto

Alegre, Brasil.

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