Upload
vuongthuan
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Clonagem
Produzir cópias de uma molécula de DNA
Criação de uma molécula recombinante e sua propagação
Definições• Clonar : fazer cópias idênticas
• Isolamento de uma célula a partir de uma população maior, permitindo então sua reprodução de forma assexuada, para gerar muitas células geneticamente idênticas;
• Tecnologia de DNA recombinante: o uso de procedimentos de manipulação de DNA para produzir múltiplas cópias de um simples gene ou de um segmento de DNA;
Fazer uma molécula de DNA recombinante
Para quê?
Produção de um
produto de interesse
Ex. insulina
Outras aplicações:
Estudar genes do
desenvolvimento,
genes relacionados a
doenças...etc.
Fazer uma molécula de DNA recombinante
Para quê?
Transgênicos
Planta de tabaco
produzindo luciferina
Aplicações da
tecnologia do DNA
recombinante
Animal transgênico produzindo
proteína de interesse no leite
(Ativador de Plasminogênio
tecidual)
Clonagem
1. Criação de uma molécula recombinante (vetor de propagação +
gene/DNA de interesse)
2. Inserção do vetor recombinante em uma célula hospedeira
3. Seleção das células recombinantes
Plasmídio - molécula de DNA extracromossômica circular que se replica dentro dacélula bacteriana
limite de clonagem: 100 to 10.000 pares de bases
Vetores de clonagem
Cosmídio - molécula de DNA extracromossômica circular que possuicaracterísticas de plasmídeos e de fagos
limite de clonagem: 35-50 kb
Vetores de clonagem
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) - cromossomo artificial baseado emplasmídeos bacterianos
limite de clonagem: 75-300 kb
Vetores de clonagem
YAC (Yeast Artificial Chromosome) - cromossomo artificial que contém telômeros,origem de replicação, centrômero e um marcador para sua identificação em célulasde levedura
limite de clonagem: 100-1000 kb
Vetores de clonagem
Inserção de vetores recombinantes em uma células hospedeiras
Transformação - a célula hospedeira é tornada competente para o vetor de
clonagem ser introduzido
Transfecção - quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a
célula hospedeira pode ser transfectada para inserir a molécula
recombinante
Microprojéteis - partículas cobertas com DNA são projetadas contra uma
célula e penetram em sua membrana
Eletroporação - a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que
pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por
onde o DNA pode ser inserido
DNA (produto de
digestão ou PCR)
Plasmídeo
(pBS, pUC, pGEM)
Ligação - a molécula de DNA purificado é ligada a um vetor de clonagem
(plasmídeo, fago, cosmídeo, BAC, YAC)
Transformação - o DNA inserido no plasmídio é introduzido dentro de uma
célula hospedeira apropriada (bactérias competentes)
Célula bacteriana
Plasmídeo
Cromossomobacteriano
Isolamento dosplasmídeos recombinantes
DNA (produto de
digestão ou PCR)
Plasmídios como vetores de clonagem
Bactérias competentes + vetores recombinantes submetidos a um choque térmico
(estimula a inserção do plasmídeo na bactéria competente hospedeira)
recombinant plasmidE.coli host cell
transformed cell
Plasmídios como vetores de clonagem
Confirmação da transformação
• Crescimento em meio seletivo contendo
antibiótico
• Análise de restrição de DNA plasmidial
• PCR direto da colônia
• Hibridização com uma sonda específica
• Sequenciamento do DNA plasmidial
overnight growth
white colonies
vector + insert
blue colonies
vector
ampicilin-resistance colonies
Seleção das células recombinantes: presença de inserto no plasmídio
Construção de bibliotecas de DNA
• DNA genômico
– pode ser adquirida comercialmente ou de outros
laboratórios
– gera um número muito grande de clones (fragmentos
randomicos) ~800.000
– restrição parcial - fragmentos muito largos são difíceis
de serem clonados ou amplificados por PCR
– bibliotecas subgenômicas
– vetores fago lambda, YAC, BAC
Construção de bibliotecas de cDNA
• Isolamento da fração de RNAm de um certo
tecido em uma determinada condição
• Conversão a cDNA pela ação da
transcriptase reversa
• Clonagem em vetor apropriado
• Propagação em bactéria
• Seleção dos clones de interesse (screening)
Isolando o DNA de interesse
• A partir de uma biblioteca genômica
• A partir de uma biblioteca de cDNA
– seleção direta
– PCR - primers
Seleção dos clones de interesse
“Screening”
• Imunológico: detecção da proteína expressa
• sonda de DNA: informações incompletas ou
obtidas a partir de bancos de DNA
– oligonucleotidio
– produto de PCR
– clone incompleto
Sondas de DNA
• Produto de PCR
• oligonucleotídio sintético
• fragmento de restrição de DNA
• clone de cDNA
• sonda de RNA a partir de transcrição in vitro
• São utilizadas em:
• screening de bibliotecas
• southern blotting
• northern blotting
• dot blotting
Desenho de sondas a partir da sequência
de aminoácidos de uma proteína
N-Gly - Leu - Pro - Trp - Glu - Asp - Met - Trp -Phe - Val - Arg-C
GGA TTA CCA TGG GAA GAC ATG TGG TTC GTA AGA
GGC TTG CCC GAG GAT TTT GTC AGG
GGT CTA CCT GTT CGA
GGG CTC CCG GTG CGC
CTT CGT
CTG CGGRegião de degeneração mínima
Sonda sintética TGG GAA GAC ATG TGG TTC GT
G T T
Seleção de uma biblioteca
• Hibridização com sondas de oligonucleotídios
marcadas
– A sequência do DNA de interesse hibridiza a uma
sonda marcada. Influência de Tm
• Seleção com anticorpos
– Expressão de uma proteína que pode ser
reconhecida por um anticorpo
Seleção de uma biblioteca
• DNA genômico: cerca de 500.000 clones
precisam ser analisados para se localizar
uma sequência gênica.
• cDNA: se for feita de um tecido que
expressa fortemente aquele gene, as chances
de encontrar o clone correto são maiores.
– 1 em 20 até 100.000 poli(A)+ RNA
Seleção de uma biblioteca
• Amplificação da biblioteca na célula
hospedeira
• Transferência para uma membrana de
nitrocelulose
• Desnaturação e neutralização. Cross-linking
• Hibridização. Lavagens para retirada da
sonda não ligada
• Revelação e isolamento dos clones