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CLONAGEM E EXPRESSÃO EM Escherichia coli DA PROTEÍNA
MATURA E DA PORÇÃO N-TERMINAL DA TOXINA-1 DA SÍNDROME
DO CHOQUE TÓXICO,TSST-1, DE Staphylococcus aureus DE
ORIGEM BUBALINA
FABIANO COSTA SANTILIANO
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
SETEMBRO - 2007
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CLONAGEM E EXPRESSÃO EM Escherichia coli DA PROTEÍNA
MATURA E DA PORÇÃO N-TERMINAL DA TOXINA-1 DA SÍNDROME
DO CHOQUE TÓXICO,TSST-1, DE Staphylococcus aureus DE
ORIGEM BUBALINA
FABIANO COSTA SANTILIANO
Tese apresentada ao Centro de Biociências
e Biotecnologia, da Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como
parte das exigências para a obtenção do
título de mestre em Biociências e
Biotecnologia – Área de concentração:
Biologia Molecular e Biotecnologia.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
SETEMBRO - 2007
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CLONAGEM E EXPRESSÃO EM Escherichia coli DA PROTEÍNA
MATURA E DA PORÇÃO N-TERMINAL DA TOXINA-1 DA SÍNDROME
DO CHOQUE TÓXICO,TSST-1, DE Staphylococcus aureus DE
ORIGEM BUBALINA
Fabiano Costa Santiliano
Tese apresentada ao Centro de Biociências
e Biotecnologia, da Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como
parte das exigências para a obtenção do
título de mestre em Biociências e
Biotecnologia – Área de concentração:
Biologia Molecular e Biotecnologia.
Aprovada em 28 de setembro de 2007
Comissão examinadora:
___________________________________________________________________________ Profa. Regina Célia de Souza Campos Fernandes (Doutora em Parasitologia) – UFRJ
___________________________________________________________________________
Prof. Olney Vieira da Motta (Doutor em Biociências e Biotecnologia) – UENF ___________________________________________________________________ Prof. Milton Masahiko Kanashiro (Doutor em Biociências e Biotecnologia) – UENF ___________________________________________________________________ Prof. Enrique Medina-Acosta (Doutor em Parasitologia Médica e Molecular) – UENF
(Orientador)
4
Agradecimentos
Primeiro a Deus, pela minha vida e por todas as maravilhas que me concedes
a cada dia.
Ao professor Enrique Medina-Acosta pela grande oportunidade, pela atenção,
dedicação, pelo grande exemplo profissional e humano que representas e pela
amizade. Pessoas como você, deixam um rastro de admiração por onde passam.
Obrigado por Tudo!
Aos Doutores Milton Kanashiro, Regina Célia Fernandes e Olney Vieira da
Motta, pelos ensinamentos e por aceitarem fazer parte da minha banca de defesa de
dissertação. Ao Dr. André Oliveira pela atenção e pelo excelente trabalho durante a
revisão deste trabalho. Obrigado!
Ao professor e amigo Victor Flores, pela amizade, pelos ensinamentos, pelas
conversas, pela preocupação com a minha saúde.
Ao professor Gonçalo e seus alunos por disponibilizarem o termociclador e
em especial à Valéria pelo grande auxílio.
Aos amigos Filipe Brum, Gabriela Gesualdi, Lívia Amaral, Eduardo Leal,
Polyana, Débora Paim, Antônio, Jonilda, Bruno Moussalem, Marcelle Uhl, Heitor,
Giseli, Raul, David, Sílvio, Saulo, Maisena, Leandro Matos (Léo), Franz entre outros,
pelos momentos de alegria, festa, favores, zoeira, fofoca, braseirinho. Em especial,
Cristina, Esther, Anna Rosa, Tadeu, minha aluna Stella e à querida Zila, que além de
compartilharem todos estes momentos foram extremamente importantes, estando
disponíveis em todos os momentos e por me agüentarem cada dia pedindo alguma
coisa. MUITO OBRIGADO MESMO!
À minha família, meus pais, meu irmão que sempre acreditaram, me
apoiaram, estando presentes em todos os momentos da minha vida. À minha avó
querida que infelizmente não vai poder festejar ao meu lado mais esta conquista,
mas que lá do céu continua olhando por mim. Amo Vocês!
E por último, a pessoa mais importante, que preenche a minha vida de amor,
carinho, paz, alegria, felicidade e sabedoria. Bethânia minha linda, saiba que cada
passo dado é pensando em nós dois, nos nossos planos. Tudo o que tenho de mais
importante devo a ti. Obrigado por ter suportado todas as fases pelas quais passei
durante estes 2 anos, principalmente o mau humor e por ter ajudado a superar cada
uma delas. TE AMO PARA TODO O SEMPRE!!!
5
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS...................................................................................................I
LISTA DE ABREVIATURAS.............................. .........................................................III
RESUMO.....................................................................................................................V
ABSTRACT........................................... .....................................................................VI
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................01
1.1. Staphylococcus aureus....................................................................................02
1.2. Resposta Imune...............................................................................................03
1.3. Fatores de Virulência.......................................................................................04
1.3.1. Componentes de Superfície..................................................................05
1.3.1.1. Moléculas de adesão...............................................................05
1.3.1.2. Cápsula....................................................................................05
1.3.1.3. Proteína A................................................................................05
1.3.1.4. Ácido teicóico...........................................................................05
1.3.2. Enzimas.................................................................................................06
1.3.2.1. Coagulase................................................................................06
1.3.2.2. Catalase...................................................................................06
1.3.2.3. Hialuronidase...........................................................................06
1.3.2.4. Lípase......................................................................................06
1.3.2.5. Nuclease..................................................................................06
1.3.2.6. Β-lactamase.............................................................................06
1.3.2.7. Hemolisinas..............................................................................06
1.3.2.8. Leucocidina..............................................................................06
1.3.3. Toxinas..................................................................................................06
1.3.3.1. Toxinas Esfoliativas.................................................................06
1.3.3.2. Enterotoxinas...........................................................................07
6
1.3.3.3. TSST-1.....................................................................................07
1.4. Toxinas Estafilocócicas....................................................................................07
1.5. Enterotoxinas...................................................................................................08
1.6. TSST-1.............................................................................................................11
1.7. Síndrome do Choque Tóxico...........................................................................12
1.8. Superantígenos................................................................................................14
1.9. Patogênese da Síndrome do Choque Tóxico..................................................17
1.10. Estrutura de TSST-1 e produção de vacinas...................................................18
1.11. Mastite.............................................................................................................23
1.12. Métodos de Detecção de Toxinas Estafilocócicas..........................................25
2. JUSTIFICATIVA.................................. ............................................................30
3. OBJETIVOS...................................... ..............................................................32
3.1. Objetivo Geral..................................................................................................33
3.2. Objetivos Específicos.......................................................................................33
4. MATERIAIS E MÉTODOS............................ ...................................................34
Estratégia Metodológica.............................................................................................35
4.1. Material Biológico.............................................................................................37
4.1.1. Cepas de S. aureus e condições de cultivo.....................................................37
4.2. Obtenção e preparo dos fragmentos tst e N-tst...............................................37
4.2.1. Desenho dos iniciadores.................................................................................37
4.2.2. Extração de DNA cromossômico de S. aureus...............................................37
4.2.3. Amplificação das regiões codificantes para TSST-1 e N-TSST-1 pela PCR...38
4.2.4. Purificação dos fragmentos amplificados a partir de géis de agarose............38
4.2.5. Quantificação das amostras de DNA...............................................................38
7
4.3. Clonagem no vetor pGEM-T easy...................................................................39
4.3.1. Preparo de células BL21(DE3) pLysS, DH5-α e M15 (pREP4) competentes.39
4.3.2. Clonagem dos fragmentos tst e N-tst no vetor pGEM-T easy.........................39
4.4. Subclonagens no sistema pQE.......................................................................40
4.4.1. Preparo dos fragmentos tst e N-tst e vetores pQE..........................................40
4.4.2. Ligação dos fragmentos tst e N-tst e transformação.......................................41
4.5. Expressão das proteínas His-TSST-1 e His-N-TSST-1...................................41
4.6. Análise da expressão das proteínas His-TSST-1 e His-N-TSST-1.................43
4.6.1. Preparo das amostras......................................................................................43
4.6.2. Eletroforese......................................................................................................43
4.6.3. western blotting................................................................................................43
4.6.4. Padronização da indução protéica..................................................................44
5. RESULTADOS..................................... ...........................................................45
5.1. Amplificação da região codificadora para TSST-1..........................................46
5.2. Ligação do amplicom ao vetor de clonagem...................................................48
5.3. Análise dos clones positivos para a construção pGEM/tst pela PCR..............48
5.4. Preparo do inserto e do vetor pQE-30 para clonagem....................................50
5.5. Ligação do inserto tst ao vetor pQE-30...........................................................51
5.6. Análise dos clones positivos para a construção pQE-30/tst pela PCR e
digestão......................................................................................................................51
5.7. Expressão da proteína recombinante His-TSST-1..........................................53
5.8. Detecção da proteína His-TSST-1 por western blotting..................................54
5.9. Transformação de E. coli cepas DH5-α e BL21(DE3)pLysS com a construção
pQE-30/tst..................................................................................................................56
5.10. Ligação do amplicom N-tst ao vetor de clonagem...........................................59
8
5.11. Análise dos clones pGEM/N-tst pela PCR e digestão.....................................59
5.12. Ligação do inserto N-tst ao vetor de expressão pQE-30.................................60
5. 13. Análise dos clones pQE-30/N-tst pela PCR e digestão...................................61
5. 14. Expressão da proteína recombinante His-N-TSST-1......................................62
6. DISCUSSÃO....................................................................................................63
7. CONCLUSÕES................................................................................................68
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................... ..........................................70
9
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fatores de virulência expressos por Staphylococcus aureus.....................05 Figura 2: Esquema de ativação de células T por antígenos e superantígenos.........16 Figura 3: Patofisiologia da Síndrome do Choque Tóxico...........................................18 Figura 4: Esquema representativo da estratégia metodológica utilizada...................36 Figura 5: Esquema representativo do vetor de expressão pQE-30 (Qiagem)...........40 Figura 6: Esquema representativo da seqüência da proteína His-TSST-1................42 Figura 7: Esquema representativo da seqüência da proteína His-NH2-TSST-1........42 Figura 8: Extração de DNA cromossômico................................................................46 Figura 9: Condições de amplificação da PCR............................................................47 Figura 10: Amplificação de TSST-1 pela PCR...........................................................47 Figura 11: Confirmação da construção pGEM/tst pela PCR......................................49 Figura 12: Confirmação da construção pGEM/tst por digestão..................................49 Figura 13: Preparo do inserto e vetor pQE-30...........................................................50 Figura 14: Confirmação da construção pQE-30/tst pela PCR....................................52 Figura 15: Confirmação da construção pQE-30/tst por digestão...............................52 Figura 16. Expressão de His-TSST-1.........................................................................53 Figura 17. Imunodetecção de His-TSST-1 utilizando anti-TSST-1............................55 Figura 18: Imunodetecção de His-TSST-1 utilizando anti-His…………………….......55 Figura 19. Confirmação da construção pQE-30/tst em diferentes cepas de E. coli pela PCR....................................................................................................................57 Figura 20. Expressão de His-TSST-1 por diferentes cepas de E. coli.......................58 Figura 21: Imunodetecção de His-TSST-1.................................................................58 Figura 22: Confirmação da construção pGEM/N-tst pela PCR..................................59 Figura 23: Confirmação da construção pGEM/N-tst por digestão..............................60 Figura 24: Confirmação da construção pQE-30/N-tst pela PCR................................61
10
Figura 25: Confirmação da construção pQE-30/N-tst por digestão............................61 Figura 26: Expressão da proteína His-N-TSST-1.......................................................62
11
LISTA DE ABREVIATURAS
APC – Célula Apresentadora de Antígenos
ATP – Adenosina Trifosfato
BHI – Infusão cérebro coração
DAB – 3’3’ Diaminobenzidina tetraidrocloreto
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
D. O. – Densidade óptica
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA – Ensaio imunoabsorvente de ligação enzimática
ET-A – Toxina Epidermolítica A
ET-B – Toxina Epidermolítica B
Fc – Fração cristalizável
His -TSST-1 – Proteína TSST-1 expressa em Escherichia coli cepa M15 (pREP4)
como proteína de fusão com 6 histidinas na extremidade amino terminal
His-N -TSST-1 – Proteína correspondente à porção amino-terminal da toxina TSST-1
expressa em E. coli cepa M15 (pREP4) como proteína de fusão com 6 histidinas na
extremidade amino terminal
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
IFN-γ – Interferon γ
IgG – Imunoglobulina G
IL – Interleucina
IPTG – Isopropil β D-galactosídeo
KDa – Kilo Dalton
LB – Meio Luria-Bertani
LPS – Lipopolissacarídeo
MAb – Anticorpo monoclonal
MHC – Complexo de Histocompatibilidade Principal
Pb – pares de base
PBS – Tampão fosfato salino
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
PEC – Exotoxina pirogênica C
RPLA – Reversed Passive Latex Agglutination
SAg – Superantígeno
12
SCT – Síndrome do Choque Tóxico
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
SE – Enterotoxina
TCR – Receptor de Células T
TNF-α – Fator de necrose tumoral-α
TSST-1 – Toxina-1 da Síndrome do Choque Tóxico
13
RESUMO
A Toxina-1 da Síndrome do Choque Tóxico (TSST-1) produzida por Staphylococcus
aureus está associada a grande parte dos casos de síndrome de choque tóxico não
menstrual e em todos os casos de síndrome de choque tóxico menstrual, além de
ser produzida por diversos isolados provenientes de animais apresentando mastite.
As metodologias de detecção de TSST-1 são baseadas em procedimentos
imunológicos tais como ELISA, imunodifusão e western blotting, e por utilização da
PCR utilizando seqüências específicas para o gene tst. A produção da proteína
TSST-1 recombinante seria de extrema importância para o desenvolvimento de
métodos rápidos, de baixo custo e eficientes para a detecção da toxina em diversos
quadros clínicos, de importância médica e veterinária, associados à infecção por S.
aureus. Este trabalho teve como objetivo expressar em E. coli a proteína TSST-1
recombinante de S. aureus de origem bubalina e sua porção N-terminal (N-TSST-1)
utilizando o vetor de expressão pQE-30. As regiões codificantes para TSST-1 e N-
TSST-1 foram amplificadas utilizando a técnica da PCR. Os amplicons TSST-1
gerados foram clonados no vetor de clonagem pGEM-T easy, digeridos com
enzimas de restrição e subclonadas no vetor de expressão pQE-30. As construções
recombinantes foram utilizadas para transformar diferentes cepas de E. coli. Dos
processos de clonagem, foram obtidos dois clones, um resultante da construção
pQE-30/tst e outro resultante da construção pQE-30/N-tst. A presença dos
fragmentos gênicos correspondentes a TSST-1 foi confirmada por meio da PCR e
digestão. Ambos os clones apresentaram nível de expressão basal que foi
confirmado por meio de western blotting, utilizando anticorpo policlonal anti-TSST-1
e anticorpo monoclonal anti-hexâmero de histidina.
Palavras chave: Staphylococcus aureus, TSST-1, Síndrome do Choque Tóxico
14
ABSTRACT
Toxic Shock Syndrome Toxin -1 (TSST-1) is associated the great part of the cases of
toxic shock syndrome, beyond being produced by diverse isolates from animals
presenting mastitis. The recombinant protein production of TSST-1 would be of
extreme importance for the development, cheap and efficient methods for the
detection of TSST-1 in several clinical cases associates to the infection for
Staphylococcus aureus. This aim of this work is to produce the recombinant protein
TSST-1 and policlonal antibodies anti-tst for immunobiological applications. Cepas of
Staphylococcus aureus of bubalin origin, TSST-1 producers had been grown in
middle BHI and the chromosomic DNA was extracted by the TELT method. . The
region coder for TSST-1 was amplified through the technique of PCR using specific
starters and cloned in the vector pGEM-T easy. The recombinant obtained
constructions had been digested with enzymes of restriction Kpn I and Hind III for
attainment of amplicon tsst-1 of 700 pb with the compatible extremities for linking
with the expression vector pQE-30. It was obtained one clone proceeding from the
transformation of E. coli with the construction pQE-30/tst. The expression of the
recombinant protein was confirmed by Western blotting.
KEY WORDS: Staphylococcus aureus, TSST-1, Toxic Shock Syndrome
15
1. INTRODUÇÃO
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus são bactérias Gram-positivas pertencentes à família
Micrococcaceae, que inclui quatro gêneros: Planococcus, Micrococcus,
Stomatococcus e Staphylococcus. São imóveis, não esporulantes, anaeróbicas
facultativas, que crescem por respiração aeróbica ou por fermentação produzindo
principalmente ácido lático. São coagulase-positivos e são diferenciados do gênero
Streptococcus por serem catalase-positivos. Consistem em células esféricas com
cerca de 1 µm de diâmetro que normalmente se agregam em cachos de uva
formando colônias de coloração amarelo-ouro. Crescem em meios com
concentrações de cloreto de sódio acima de 10%, em temperaturas entre 10°C e
45°C (ótima 30°C-37°C) e valores de pH entre 4,2 e 9,3 (pH ótimo 7,0-7,5). A parede
celular é resistente a lisozima (Issa e Thompson, 2001).
As cepas podem ser classificadas dentro de diferentes biótipos de acordo
com a sua origem humana ou animal, sendo reconhecidos seis biotipos: humana,
humana não hemolítica, aviária, bovina, ovina e não específica baseada em
características bioquímicas (Issa e Thompson, 2001).
Normalmente estão associadas à colonização assintomática da pele,
orofaringe e tratos gastrointestinal e urogenital. No entanto, se as barreiras das
mucosas forem rompidas ou ocorrer deficiência no sistema imunológico do
hospedeiro, estes microrganismos podem causar elevada morbidade e mortalidade
em humanos e outros animais (Bachert et al., 2002), originando desde lesões
superficiais na pele como bolhas, abscessos, acnes e furúnculos até doenças de
maior gravidade como pneumonia, osteomielite, endocardite, miocardite, meningite,
infecções do trato urinário (Archer, 1998).
A transmissão de S. aureus é frequentemente feita através de contato direto
com um indivíduo infectado, embora possa ocorrer também por contato com
aerossóis. Vários fatores que predispõem o hospedeiro a aumentar a
susceptibilidade à infecção por S. aureus têm sido identificados (Issa e Thompson,
2001). Estes incluem: injúria na pele ou membrana das mucosas, função leucocitária
anormal, infecções virais (por exemplo, influenza), anormalidades metabólicas (por
exemplo, diabetes mellitus e uremia), má nutrição e velhice (Bachert et al., 2002).
17
Pessoas com risco de infecções incluem recém-nascidos, vítimas de traumas,
pacientes queimados e usuários de drogas (Dinges et al., 2000).
Também constituem a principal causa de infecções hospitalares,
contaminações de instrumentos cirúrgicos e infecções associadas a procedimentos
médicos, além de doenças provocadas por contaminação alimentar devido à
liberação de enterotoxinas nos alimentos (Kotb, 1995) e da síndrome do choque
tóxico por liberação de superantígenos na corrente sangüínea (McCormick et al.,
2001).
A ocorrência de S. aureus em humanos e animais é de grande preocupação
médica e veterinária pelo fato de, em muitos casos, a bactéria apresentar resistência
a certos antibióticos. A resistência de S. aureus a antibióticos não é um fenômeno
novo. Por volta de 1940, a maioria dos casos relatados em diversos hospitais era de
cepas resistentes à penicilina (Gould, 2005). Em 1981, 5% dos S. aureus eram
resistentes à meticicilina. Uma década depois este percentual aumentou para 38% e
as estimativas de 2000 são de mais de 50% dos isolados resistentes a meticilina
(Gould, 2005). Diversos são os meios pelos quais as bactérias podem adquirir
resistência, estes podem ocorrer pela aquisição de genes de resistência
extracromossômicos por conjugação e transposição, e através de mutações nos
genes cromossomais, seguido por seleção de cepas resistentes (Hiramatsu et al.,
2001).
1.2. Reposta Imune
A resposta fagocítica de leucócitos polimorfonucleares é a primeira linha de
defesa inata do organismo contra a invasão por S. aureus e é um determinante
crítico na resposta das infecções estafilocócicas (Foster, 2005).
O nível de anticorpos é baixo demais para desenvolver uma resposta
protetora e o hospedeiro não é capaz de responder eficientemente à re-infecção
com uma resposta secundária satisfatória devido à depleção de células B e T
(Foster, 2005).
Quando as barreiras físicas do corpo, representadas pela pele e superfícies
mucosas, são rompidas pelo S. aureus, o microrganismo é confrontado com o
sistema imune do hospedeiro representado pela imunidade inata e adquirida (Foster,
2005).
18
A infecção da pele estimula uma forte resposta inflamatória envolvendo a
migração de neutrófilos e macrófagos para o local da infecção. Estas células são
aptas a internalizar e matar o organismo invasor com a ajuda de anticorpos e
componentes do sistema complemento, presentes no soro do hospedeiro
(Rooijakkers et al., 2005).
As moléculas do complemento agem como quimiocinas para os fagócitos e
promovem a opsonização da bactéria aumentando a eficiência da fagocitose.
Após o estágio inicial, o microrganismo e seus produtos, captados pelos
fagócitos e células apresentadoras de antígenos (APCs), são transportados aos
linfonodos onde as células B são estimuladas a se diferenciar e secretar anticorpos
que neutralizam as toxinas e potencializam o processo fagocítico (Foster, 2005).
Com o decorrer de sua evolução, S. aureus desenvolveu diversos fatores de
virulência que atuam como mecanismos de evasão, garantindo proteção contra a
resposta imune do hospedeiro (Balaban e Rasooly, 2000). Estes mecanismos são
diversificados e incluem a inibição da quimiotaxia dos neutrófilos (Fedtke et al.,
2004); produção de toxinas que atuam na membrana de leucócitos promovendo a
sua lise (Lowy, 1998); síntese de proteína A e microcápsula, que garantem a
resistência à fagocitose (Archer, 1998); e, produtos carotenóides e algumas enzimas
que neutralizam os mecanismos de morte dos fagossomos caso a bactéria seja
internalizada (Iwatsuki et al., 2006).
1.3. Fatores de virulência
Cepas de S. aureus expressam uma variedade de fatores de virulência
(Figura 1) que podem ser agrupados segundo seus mecanismos patogênicos como
proteínas que facilitam sua habilidade de colonizar e persistir no hospedeiro
(Balaban e Rasooly, 2000). Estas proteínas, freqüentemente com propriedades
enzimáticas ou citotóxicas, incluem várias hemolisinas ativas na membrana,
nucleases, proteases, leucocidinas, lípases e colagenases. Coletivamente estas
exoproteínas promovem a adesão bacteriana ou fornecem os nutrientes necessários
ao desenvolvimento bacteriano (Lowy, 1998; Iwatsuki et al., 2006).
19
Figura 1. Fatores de virulência expressos por S. aureus (Adaptado Lowy, 1998).
1.3.1. Componentes de superfície : promovem a colonização dos tecidos do
hospedeiro.
1.3.1.1. Moléculas de adesão: consistem em proteínas de superfície que promovem
a adesão íntima de S. aureus a proteínas presentes nas células endoteliais e
membrana basal do hospedeiro, destacando-se as proteínas ligantes de
fibrinogênio, fibronectina, laminina, colágeno e vitronectina (Lowy, 1998);
1.3.1.2. Cápsula: muitas cepas apresentam uma estrutura denominada
microcápsula formada por polissacarídeos que inibem o processo fagocítico (Archer,
1998).
1.3.1.3. Proteína A: consiste numa proteína de superfície que se liga a moléculas de
IgG através de sua porção Fc, interferindo assim na opsonização e conseqüente
fagocitose da bactéria (Archer, 1998).
1.3.1.4. Ácidos teicóicos: são importantes componentes na parede celular de S.
aureus e atuam na aderência às superfícies mucosas (Fournier e Philpott, 2005).
1.3.2. Enzimas
20
1.3.2.1. Coagulase: é a mais conhecida, em virtude de sua presença caracterizar a
espécie. As cepas de S. aureus possuem duas formas de coagulase: ligada
(também denominada fator de aglutinação – “clumping factor”) e coagulase livre. A
coagulase ligada à parede celular pode converter diretamente fibrinogênio em fibrina
insolúvel e causar o agrupamento das bactérias. A coagulase livre reage com a pró-
trombina formando a estafilotrombina, que por sua vez, catalisa a conversão do
fibrinogênio em fibrina insolúvel. O papel da coagulase na patogenia da doença é
especulativo, mas tanto a coagulase livre quanto a ligada podem recobrir as células
bacterianas com fibrina e torná-las resistentes à fagocitose (Iwatsuki et al., 2006).
1.3.2.2. Catalase: catalisa a conversão do peróxido de hidrogênio em água e
oxigênio. A catalase protege os organismos do peróxido de hidrogênio tóxico que se
acumula durante o metabolismo bacteriano e no interior de células fagocitárias, após
a fagocitose do mesmo.
1.3.2.3. Hialuronidase: hidrolisa o ácido hialurônico, um componente da matriz
intercelular do tecido conjuntivo.
1.3.2.4. Lipase: hidrolisa lipídios, o que é essencial para a sobrevivência dos
estafilococos nas regiões sebáceas do corpo.
1.3.2.5. Nuclease: hidrolisa o DNA livre.
1.3.2.6. β-lactamase: hidrolisa o anel β-lactâmico das penicilinas, também
conhecida como penicilinase.
1.3.2.7. Hemolisinas: são toxinas que causam danos à membrana da célula
eucariótica. Nesta categoria são incluídas as toxinas citolíticas α, β, γ e δ (Iwatsuki et
al., 2006).
1.3.2.8. Leucocidina: exerce um efeito tóxico direto sobre as membranas celulares
dos leucócitos polimorfonucleares humanos causando desgranulação do citoplasma
(Iwatsuki et al., 2006).
1.3.3. Toxinas
1.3.3.1. Toxinas esfoliativas: As esfoliatinas ou toxinas epidermolíticas são
produzidas por determinadas cepas de S. aureus e consistem em duas proteínas,
denominadas ET-A e ET-B. Essas proteínas apresentam atividade proteolítica,
clivando a epiderme, sendo responsáveis pelos sintomas da doença conhecida
como Síndrome da Pele Escaldada (Lina et al., 1997).
21
1.3.3.2. Enterotoxinas: proteínas secretadas por certas cepas de S. aureus e que
atuam como superantígenos, promovendo superativação de células T e excessiva
liberação de citocinas. Estão associadas a episódios de intoxicação alimentar e à
Síndrome do Choque Tóxico (Balaban e Rasooly, 2000).
1.3.3.3. TSST-1: toxina isolada de pacientes com Síndrome do Choque Tóxico
(SCT). Também é um superantígeno e está fortemente associada a casos de
choque tóxico menstrual (McCormick et al., 2001).
1.4. Toxinas Estafilocócicas
Toxinas são comumente substâncias, de origem protéica, produzidas por
alguns microrganismos e que contribuem para sua patogenicidade. São
classificadas em exotoxinas e endotoxinas (Koneman et al., 2001). As exotoxinas
são proteínas ou enzimas produzidas no interior de algumas bactérias Gram-
positivas, decorrentes da multiplicação e metabolismo, dos microrganismos.
Classicamente são agrupadas em três tipos, de acordo com seu modo de ação:
citotoxinas, que destroem as células do hospedeiro ou afetam suas funções;
neurotoxinas, que interferem com a transmissão normal de impulsos nervosos; e
enterotoxinas, que afetam as células que revestem o trato gastrintestinal (Koneman
et al., 2001).
As endotoxinas correspondem à porção externa da parede celular
(lipopolissacarídeos) das bactérias Gram-negativas, que são liberadas após a morte
bacteriana ou mesmo a lise da parede celular (Koneman et al., 2001).
Os estafilococos são conhecidos pela produção de potentes toxinas (Marrack
e Kappler, 1990), que uma vez introduzidas no hospedeiro induzem uma variedade
de conseqüências biológicas (Dinges et al., 2000), atuando em três diferentes vias:
como enterotoxinas, induzindo efeitos eméticos e diarréia em humanos e outros
primatas; como exotoxinas implicadas na síndrome do choque tóxico; e como
superantígenos gerando uma forte estimulação de células T Vβ específicas (Choi et
al., 1991), seguida por anergia e apoptose destas células, resultando em
imunossupressão (Rellahan et al., 1990). Estas podem ter importante função em
diversas patogenias devido à capacidade de estimular tanto células
imunomoduladoras quanto pro inflamatórias efetoras (Kotb, 1998).
22
1.5. Enterotoxinas
As enterotoxinas são proteínas monoméricas de massa molecular variando de
22-30 kDa, não glicosiladas, e de longa vida média, que são secretadas e
acumuladas durante a fase exponencial do crescimento in vivo e in vitro das
diferentes cepas de S. aureus enterotoxigênicas (Balaban e Rasooly, 2000). São
ricas em lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico e tirosina (Proft e Fraser, 2003).
Possuem uma ligação dissulfídica em sua conformação que provavelmente estaria
envolvida na atividade emética (Marrack e Kappler, 1990). São altamente estáveis,
resistem a muitas enzimas proteolíticas como pepsina e tripsina explicando sua
atividade no sistema digestivo, e são altamente resistentes ao calor (Le Loir et al.,
2003). Essas proteínas, também conhecidas como toxinas pirogênicas, em
quantidades na ordem de microgramas (3,5 - 150 µg, dependendo da sensibilidade
da espécie e do indivíduo) estão relacionadas a episódios de intoxicações
alimentares (Bunning et al., 1997; Balaban e Rasooly, 2000; Schlievert et al., 2000)
após a ingestão de alimento contaminado, afetando cerca de 1,2 milhões de
pessoas anualmente, resultando numa perda econômica de cerca de 1,5 bilhões de
dólares (Giletto e Fyffe, 1998). Em temperaturas inferiores a 60°C, muitas cepas
produzem enterotoxinas, que uma vez entrando no intestino do hospedeiro, têm a
habilidade de cruzar a parede intestinal e ganhar acesso ao sistema imune (Shupp
et al, 2002). Após 4 h de ingestão, estas toxinas interagem com vários alvos
celulares desencadeando reações biológicas e fisiológicas que conduzem às
manifestações clínicas características da intoxicação: náuseas, dores abdominais,
diarréia e vômito (Balaban e Rasooly, 2000; Dinges et al., 2000). Os sintomas
geralmente desaparecem 24 h após a infecção, porém, óbitos entre neonatos e
idosos não são raros (Medina-Acosta et al., 2005).
S. aureus estão presentes em 30% da população mundial. Este alto
percentual pode ser um fator de prevalência de contaminação em alimentos.
Condições de higiene inadequadas, temperatura ideal e condições impróprias
durante a fabricação, são implicadas como a etiologia primária dos casos de
contaminação alimentar (Le Loir et al., 2003).
As enterotoxinas exibem semelhanças tanto nas suas múltiplas atividades
biológicas quanto nas suas seqüências peptídicas (Balaban e Rasooly, 2000).
Distinguem-se, todavia, umas das outras, pela presença de epítopos específicos.
23
Assim sendo, as diferentes cepas enterotoxigênicas podem expressar toxinas
antigenicamente distintas com atividades biológicas similares.
S. aureus secreta diversas enterotoxinas (SEs) com múltiplos sorotipos (SEA,
SEB, SEC1-3, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ) (Balaban e Rasooly, 2000; Dinges et
al., 2000) os recentemente descobertos SEK, SEL, SEM (Revisado por Medina-
Acosta et al., 2005), SEN, SEO, SEQ, SER e SET (Letertre et al., 2003; Omoe et al.,
2003; Freiras et al., 2004).
A seqüência primária de cada sorotipo já foi determinada e/ou deduzida a
partir tanto de proteínas purificadas quanto dos respectivos genes (Dinges et al.,
2000). O grau de semelhança antigênico é paralelo ao grau de homologia dos
genes. As enterotoxinas se caracterizam ainda pela presença de uma seqüência
peptídica especial, um epítopo altamente conservado, que corresponde à seqüência
sinal utilizada na passagem das enterotoxinas através do epitélio intestinal via
transcitose (Hamad et al., 1997; Shupp et al., 2002).
Apresentam similaridades estruturais, funcionais e na seqüência e são
filogeneticamente relacionadas (Balaban e Rasooly, 2000). Os genes para estas
toxinas são levados por plasmídeos, bacteriófagos, ou por elementos genéticos
heterólogos, conhecidos como ilhas de patogenicidade. Vojtov et al. (2002)
demonstraram que SEB assim como TSST-1 é um regulador global negativo da
transcrição de genes de exoproteínas, e que age via sistema agr. Os genes que
codificam para as SEs possuem diferentes suportes genéticos, muitos dos quais são
elementos genéticos móveis. sea é carregado por uma família de fagos temperados,
seb é cromossômico em alguns isolados e encontrado em plasmídeos em outros,
sec bovino é regulado por genes localizados em ilhas de patogenicidade (Fitzgerald
et al., 2001). O principal sistema regulador que controla a expressão de fatores de
virulência em S. aureus é o agr (gene regulador acessório) que age em combinação
com o sar (regulador acessório estafilocócico), mas nem todos os genes de SEs são
controlados pelo sistema agr (Kuroda et al., 2001).
Embora as toxinas pirogênicas estejam envolvidas em diferentes patologias,
elas exibem semelhanças nas suas atividades biológicas de superantigenicidade e
enterotoxigenicidade (Le Loir et al., 2003). Harris et al. (1993) propuseram que existe
uma relação entre a atividade superantigênica e enterotoxigênica das toxinas, e na
maioria dos casos, a perda da atividade superantigênica resulta na perda de
enterotoxigenicidade. Porém, foi demonstrado que essas duas atividades estão
24
localizadas em domínios separados da molécula. Isso quer dizer que, o fato de a
proteína ser superantigênica não significa que ela seja enterotoxigênica.
A superantigenicidade está relacionada com a capacidade da proteína
estimular inespecificamente a proliferação de células T (Proft e Fraser, 2003),
enquanto que a enterotoxigenicidade e o efeito emético estão relacionados com a
estimulação do sistema nervoso central, após atuação da toxina sobre os receptores
neurais no intestino (Le Loir et al., 2003).
Os efeitos eméticos mais comuns são: náuseas, vômitos, dores abdominais,
prostação e diarréias. Os primeiros acontecem de duas a seis horas após a atuação
da toxina sobre os receptores neurais no intestino. O último ocorre devido ao
aumento do peristaltismo intestinal e perda de líquido pelo organismo (Balaban e
Rasooly, 2000). As regiões dos domínios central e C-terminal das enterotoxinas
parecem ser responsáveis por causarem tais efeitos. A região do domínio B parece
atuar na produção de atividade emética (Dinges et al., 2000). Em SEB como em
outras enterotoxinas, este segmento forma uma ponte dissulfídica aberta, como
TSST-1 não tem resíduos de cisteína, não pode formar pontes dissulfídicas, o que
explicaria a ausência de atividade emética em TSST-1 (Prasad et al., 1993). Dentre
os superantígenos, somente as SEs possuem atividade emética (Dinges et al.,
2000).
Como as duas atividades das SEs estão interligadas ainda é pouco
conhecido. O mecanismo responsável pela resposta emética poderia ser mediado
pelo sistema imune na qual a estimulação de células T está associada à elevada
produção de citocinas (Proft e Fraser, 2003). Os sintomas de contaminação
alimentar podem ser mimetizados pela administração de IL-2 exógena (Johnson et
al.,1992). Acredita-se que a atividade emética possa facilitar a transcitose,
permitindo a sua entrada na corrente sangüínea e interação com as células T
levando à atividade superantigênica (Hamad et al., 1997; Balaban e Rasooly, 2000).
Anticorpos contra uma seqüência peptídica conservada em SEB relacionada
à transcitose inibiriam a passagem de SEB, SEA e TSST-1 pela parede do epitélio, o
que reduziria ou eliminaria o contato da toxina com o sistema imune evitando os
efeitos mais sérios associados aos superantígenos (Shupp et al., 2002).
1.6. TSST-1
25
Na década de 80, dois grupos de pesquisadores independentemente
caracterizaram uma proteína secretada por S. aureus e altamente associada a casos
de síndrome do choque tóxico menstrual. Bergdoll et al. (1981) descreveram uma
toxina denominada enterotoxina F (SEF). Esta possuía pequena massa molecular,
era estável em condições ácidas e apresentava como atividade biológica a
capacidade de causar vômito seguido por injeção intragástrica em macacos.
Schlievert et al. (1981) purificaram de um meio de cultura com cepas de S. aureus
provenientes de pacientes com síndrome do choque tóxico (SCT), uma proteína com
massa molecular de 22 kDa, a qual denominou exotoxina pirogênica C (PEC). Este
material era detectado com base na sua pirogenicidade em coelhos e na habilidade
de aumentar a susceptibilidade, em animais inoculados, ao choque letal causado por
endotoxinas.
As toxinas foram purificadas independentemente e ao serem comparados os
padrões de aminoácidos e a reatividade imunológica cruzada percebeu-se que SEF
e PEC migram como uma única banda protéica em gel bidimensional, têm
aparentemente os mesmos pontos isoelétricos e têm a mesma massa molecular
(Todd, 1988), evidências que demonstraram que as mesmas são idênticas
bioquímica e imunologicamente, se tratando portanto, da mesma proteína, a qual é
atualmente conhecida como TSST-1 (Toxina 1 da Síndrome do Choque Tóxico)
(Bonventre et al., 1983; Cohen et al., 1983).
TSST-1 é uma proteína de cadeia única de 22 kDa, não glicosilada e sem
pontes dissulfídicas. É sintetizada com um peptídeo sinal de 40 aminoácidos na
região amino-terminal que é removido, sendo secretada como uma proteína madura
de 194 aminoácidos (Gampfer et al., 2002). São extremamente resistentes a
proteases, sendo estáveis a temperaturas superiores a 60°C, resistindo a faixas de
pH que variam entre 2.5 a 11. Não apresentam muitas seqüências de homologia
com outros superantígenos (Dinges et al., 2000).
TSST-1 é expressa constitutivamente por certas cepas de S. aureus, e está
associada à doença conhecida como síndrome de choque tóxico.
1.7. Síndrome do Choque Tóxico
A Síndrome do Choque Tóxico (SCT) foi primeiramente descrita por Todd et
al. (1978) ao estudarem um grupo de sete crianças com idades entre 8 e 17 anos
26
que apresentavam febre alta, hiperemia mucosa, confusão mental, dores
abdominais, diarréia e choque com falha múltipla dos órgãos. Descamações na pele
das mãos e plantas dos pés eram observadas durante a convalescência. S. aureus
foram isolados de cinco destas crianças e acreditava-se que uma nova toxina
estafilocócica fosse a responsável pelos sintomas em virtude da ausência de
bacteremia detectável nestes pacientes (Ganem, 1981).
Em 1980, Shrock observou uma síndrome similar em mulheres em período de
menstruação e postulou que seria causado por herpes. No mesmo ano outro
trabalho confirmou a associação de SCT com menstruação, S. aureus, e uso de
tampões de alta absorção. Casos não menstruais de SCT eram reportados antes de
1980 e estavam associados a uma variedade de procedimentos cirúrgicos
(rinoplastia, procedimentos pós-parto) e condições médicas como pneumonia,
influenza e infecção (Issa e Thompson, 2001).
SCT tornou-se um problema de saúde pública em 1979 quando um aumento
dramático no número de casos ocorreu. O pico de incidência foi de janeiro a outubro
de 1980. A maioria dos casos (90-95%) era de mulheres brancas e jovens, 95%
eram associadas com menstruação. 99% das mulheres com SCT menstrual
utilizavam tampões absorventes (Reiss, 2000). TSST-1 foi a primeira toxina
identificada como associada à síndrome e é aceita como a causa de 100% dos
casos de SCT menstrual (McCormick et al., 2001).
Quatros fatores podem estar associados à SCT menstrual: (a) colonização
vaginal com cepas de S. aureus toxigênicas; (b) produção de TSST-1; (c)
penetração através do epitélio de uma concentração suficiente de TSST-1 capaz de
causar doença; e (d) ausência de títulos suficientes de anticorpos neutralizantes
anti-TSST-1.
SCT menstrual é freqüentemente relacionada ao uso de tampões de alta
absorção que criariam as condições apropriadas (Lee Woong et al., 1990) ao
desenvolvimento de S. aureus residentes na vagina e a conseqüente produção de
TSST-1 (Schlievert, 1993). Para que haja produção de toxina em níveis ótimos, é
necessária grande quantidade de proteína, baixo nível de glicose, temperatura entre
37°C e 40°C, pH na faixa de 6.5 a 8.0, O 2 e cátions divalentes. Exceto as duas
últimas, todas as demais condições estão presentes na vagina durante a
menstruação. O tampão atuaria introduzindo O2 no meio anaeróbico da vagina (Ross
e Onderdonk, 2000), além de ligar quantidade suficiente de Mg++ suficiente para
27
alterar a cinética de crescimento intravaginal das cepas produtoras de TSST-1 (Kass
et al., 1987, Dinges et al., 2000).
TSST-1 está associada à totalidade dos casos de choque tóxico menstrual,
provavelmente devido à sua habilidade única de atravessar a parede mucosa
vaginal (Dinges et al., 2000; McCormick et al., 2001). Algumas células epiteliais
apresentam receptores para TSST-1, que poderiam estar envolvidos na endocitose,
transcitose (Shupp et al., 2002) de TSST-1 pelo epitélio vaginal (Peterson et al.,
2005). A presença de S. aureus produtoras de TSST-1 geram uma resposta
inflamatória local como resultado de sua interação com as células epiteliais. Há
produção e secreção de uma grande quantidade de citocinas como TNF-α e IL-1 que
levam ao aumento da permeabilidade na parede mucosa, devido à hipotensão,
facilitando a penetração de TSST-1 (Peterson et al., 2005). Dados in vitro mostram o
influxo de linfócitos através do epitélio durante a infecção com S. aureus o que é
consistente com a ativação de uma resposta imune inata (Davis et al., 2003). A ação
das citocinas aliada aos fatores de virulência secretados por S. aureus ocasionam
mudanças nas características do tecido vaginal, como descamações, perda de
células de superfície e separação do epitélio da lâmina basal o que facilitaria ainda
mais a penetração da toxina (Peterson et al., 2005).
Se TSST-1 tem a capacidade de atravessar o epitélio, ela poderia ser
neutralizada por anticorpos presentes no soro do indivíduo. No entanto, a ausência
ou diminuição drástica nos títulos de anticorpos protetores anti-TSST-1 parece ser
um importante fator de risco para o desenvolvimento da SCT. A maioria das pessoas
tem um nível de anticorpos protetores contra TSST-1, mas aqueles que não
possuem estes anticorpos e são colonizados ou infectados com uma cepa produtora
de toxina podem vir a apresentar os sintomas típicos da doença (Reiss, 2000). Isto
ajudaria a explicar o fato de que a maioria das pessoas expostas a cepas virulentas
não manifestam a doença, além da baixa incidência dos casos de SCT menstrual.
(Parsonnet et al., 2005).
A SCT não-menstrual normalmente está associada com a presença de TSST-
1 (50% dos casos), SEC (3%) e SEB (47%) (Crass e Bergdoll, 1986; Dinges et al.,
2000). Diversas categorias deste tipo de SCT têm sido descritas. Estas incluem SCT
pós-cirúrgica; associada com influenza; síndrome de descamação eritematosa
recalcitrante (SDER), e SCT associada ao uso de barreiras contraceptivas (Dinges et
al., 2000; McCormick et al., 2001).
28
SCT associada ao vírus influenza parece resultar de superinfecção do epitélio
do trato respiratório danificado pelo vírus por S. aureus, sendo altamente fatal em
crianças. SDER é uma doença fatal que acomete pacientes contaminados pelo vírus
HIV. SCT associado ao uso de diafragma tem um mecanismo similar a SCT
associado a tampões. Mais raramente SCT não-menstrual pode estar associada ao
parto, lesões ou infecções na pele, e à presença de corpos estranhos incluindo
dispositivos intrauterinos e pacientes submetidos à rinoplastia, ou infecções nasais
(McCormick et al., 2001). Crianças queimadas também são susceptíveis à doença já
que S. aureus freqüentemente coloniza as áreas queimadas (Khojasteh et al., 2007).
TSST-1 tem sido encontrada nos rins de 18% das crianças que tiveram
síndrome da morte súbita (Moscovis et al., 2004) e cepas produtoras da toxina foram
encontradas em 60-70% dos casos associados à síndrome de Kawasaki (Proft e
Fraser, 2003; Malhotra et al., 2004), uma vasculite multi-sistêmica aguda tipicamente
vista em crianças com menos de 4 anos de idade e que apresenta muitos aspectos
semelhantes a SCT (Earhart et al., 1998). Pode contribuir na patogênese de
doenças autoimunes por ativação de células T específicas contra antígenos
próprios. Estes poderiam quebrar a tolerância ou suprimir os clones de células T
autoreativos e induzir a um estado de autoimunidade (McCormick et al., 2001; Proft
e Fraser, 2003).
Diversos sintomas têm sido associados à contaminação por TSST-1 como
febre, hipotensão, diarréia, falha múltipla dos órgãos, ativação alterada de linfócitos,
imunossupressão e aumento de susceptibilidade do hospedeiro à ação de
endotoxinas (Kotb, 1995). Muitas destas propriedades são atribuídas a uma única
característica, a superantigenicidade.
1.8. Superantígenos
Superantígenos (SAgs) constituem uma família de proteínas microbianas
funcionalmente relacionadas que são produzidas por certas bactérias e vírus
(Marrack e Kappler, 1990). São potentes estimuladores do sistema imune e têm um
papel importante em um número de doenças humanas (Kotb, 1998). Como proteínas
associadas à membrana ou secretadas, os SAgs interagem com células imunes de
uma maneira distinta, transgredindo as regras normais de processamento e
29
apresentação de antígenos ativando um grande número de células a liberarem altos
níveis de citocinas inflamatórias (Marrack e Kappler, 1990).
A habilidade dos SAgs para disparar uma poderosa resposta imune é
atribuída à maneira não convencional pela qual eles interagem com as células do
sistema imune. Na resposta imune celular, o evento primário é o reconhecimento do
antígeno pelo receptor de célula T (TCR) ligado à membrana. Antígenos
convencionais são usualmente internalizados pelas células apresentadoras de
antígeno (APCs) e processados em compartimentos especiais gerando pequenos
peptídeos que são complexados a moléculas do Complexo de Histocompatibilidade
Principal (MHC) de classes I e II expressos na superfície das APCs. Os complexos
peptídeo-MHC são reconhecidos por células T maduras que expressam o receptor
heterodimérico αβ. Cada cadeia α e β tem domínios variáveis e constantes. Cinco
regiões variáveis do receptor Vβ, Dβ, Jβ, Vα e Jα criam o sítio de ligação do
antígeno ao TCR. Este tipo de reconhecimento é um evento chave na definição da
especificidade de reconhecimento de antígenos pelo TCR, de forma que um dado
antígeno pode ser reconhecido por tão pouco quanto 0,01 a 0,1% da população de
células T (Issa e Thompson, 2001). Superantígenos, no entanto, têm a capacidade
de interagir com TCR de maneira não específica, através de interação com a porção
Vβ do TCR (Choi et al., 1991) e ligação cruzada entre este receptor e as moléculas
de MHC de classe II na superfície das APCs (McCormick et al., 2003) (Figura 2),
formando um complexo trimolecular que atua como potente ativador podendo
estimular de 5 a 30% da população de células T (Issa e Thompson, 2001; Baker e
Acharya, 2004).
Nem todas as moléculas de MHC, no entanto, seriam capazes de ligar e
apresentar todos os diferentes tipos de toxinas superantigênicas. TSST-1, por
exemplo, liga-se preferencialmente a moléculas de HLA-DRα1 (Bordignon et al.,
1992), sendo esta ligação favorecida pela presença de determinadas seqüências
presentes nas cadeias α e β da molécula de MHC de classe II (Figura 2) (Braunstein
et al., 1992).
30
Figura 2: Esquema de ativação de células T por antígenos e superantígenos.
(Adaptado de Braunstein et al., 1992)
A ação dos superantígenos induz a produção e liberação de níveis elevados
de IL-12 (Takahashi et al., 1995). Normalmente a IL-12 atua localmente, mas a
produção em excesso faz com que esta atinja a corrente sangüínea, gerando uma
série de sintomas que incluem náusea, vômito, indisposição e febre. A grande
estimulação da proliferação de células T e produção de IL-1 (Parsonnet et al.,
1985a; See et al., 1992) também gera um aumento na produção de IL-10, IFN-γ e
TNF-α, (Takahashi et al., 1995).
Vários fatores podem afetar a resposta dos SAgs e influenciar sua atividade
biológica, como o modo pelo qual eles interagem com moléculas de MHC e se são
capazes de realizar ligação cruzada com estes receptores. Contribuem também a
forma de atuação dos SAgs em diferentes hospedeiros e tecidos. O haplotipo de
MHC II do hospedeiro pode ter um papel principal na regulação da resposta imune e
pode controlar a severidade da resposta inflamatória sistêmica disparada por
patógenos produtores de SAg (Kotb, 1998).
A apresentação seletiva de SAgs por diferentes APCs residindo em diferente
tecidos podem ter importante implicação biológica. A introdução de SAgs dentro de
31
diferentes tecidos ou órgãos pode gerar diferentes efeitos dependendo da APC
residente e do arranjo de ligação dos peptídeos. Por exemplo, o aumento
significativo da associação de TSST-1 em comparação com outras SEs com SCT
menstrual pode estar relacionado aos efeitos seletivos deste SAg sobre o tecido
vaginal (Peterson et al., 2005).
TSST-1 é conhecida por possuir múltiplos efeitos biológicos relacionados à
hipotensão e à sensibilidade capilar que consistem no principal componente da
patofisiologia da SCT (Reiss, 2000). Atua como superantígeno causando hipotensão
e dano capilar por indução de grande quantidade de citocinas. Quando combinada
com endotoxina, produz febre e aumenta a mortalidade em coelhos (Gampfer et al.,
2002). A capacidade de aumentar a letalidade do choque endotóxico pode resultar
de hipersensibilidade ou habilidade de bloquear a clearance de endotoxinas pelo
fígado (Fujikawa et al., 1986), o que pode contribuir para a fraqueza capilar e
promover o aumento da secreção de TNF-α, um potente mediador biológico do
choque (Dinges et al., 2000; Earhart et al., 1998). É capaz de se ligar e penetrar em
células epiteliais, células mononucleares e endotélio dos vasos sangüíneos
humanos provocando a morte, ativação ou hipersensibilidade destas células à
endotoxinas (Dinges et al., 2000).
1.9. Patogênese da Síndrome do Choque Tóxico
A evidência de que muitos pacientes com SCT têm infecção em certos locais
específicos com S. aureus, e que muitos pacientes carregam cepas de S. aureus
produtoras de TSST-1 na cavidade nasal e têm altos níveis de anticorpos para a
toxina sem terem apresentado um histórico de doença sugere que muitas cepas
produtoras de TSST-1 possam crescer in vivo sob condições especiais que podem
expressar seu potencial tóxico (Issa e Thompson, 2001). A causa exata da SCT em
alguns casos individuais pode variar dependendo do estado imunológico do
indivíduo, do organismo, ou condições de crescimento in vivo. Desta forma ausência
ou outros focos infecciosos podem garantir a estas cepas propriedades que
possibilitariam a potencial expressão da toxina (McCormick et al., 2001).
A patogênese de SCT requer exposição de um indivíduo não-imune a cepas
de S. aureus produtoras de TSST-1. Para atingir a produção ótima, muitas destas
cepas cresceriam sob condições que promovem a expressão da toxina (Lee Wong e
32
Bergdoll, 1990; Ross e Onderdonk, 2000). Estas condições são melhor encontradas
em infecções em certos tipos de tecidos ou na vagina durante a menstruação e na
presença de um corpo estranho inserido no canal vaginal como por exemplo um
tampão absorvente ou barreira contraceptiva. Uma situação similar ocorre após uma
cirurgia nasal. Sob estas condições, os organismos produzem uma ou mais toxinas
que são sistemicamente distribuídas, agindo diretamente ou via mediadores
ativados, sobre a integridade capilar (Dinges et al., 2000). Isto resulta em uma lesão
não inflamatória que causa uma gama de sintomas típicos de SCT (Figura 3).
Figura 3: Patofisiologia da Síndrome do Choque Tóxico. Adaptado de Dinges et al.,
2000)
1.10. Estrutura de TSST-1 e produção de vacinas
Estudos da estrutura terciária de TSST-1 em comparação com SEA, SEB e
SEC revelam apenas 20 a 30% de identidade na seqüência primária (Murray et al.,
1996; McCormick et al., 2001). A estrutura de TSST-1 consiste em dois domínios: o
Presentes
Menstruação + corpos estranhos infecção focal, bacteremia
Produção de toxina ativa
Anticorpos pré-existentes
Síndrome do Choque Tóxico
Sem doença
Ausentes
Nasofaringe, vagina
Produção de toxina inativa ou em baixo nível
Desenvolvimento de anticorpos
Sem doença
Exposição à cepa de TSS
Colonização ou infecção
Condições de crescimento favoráveis
Presentes Ausentes
pH neutro CO2
Aeróbico Proteína
33
domínio A compreendendo os resíduos 1 a 17 e 90 a 194, e o domínio B constituído
pelos resíduos 18 a 89. O domínio A é composto por uma região α-hélice central
(resíduos 125 a 140) organizadas junto a cinco folhas β (Papageorgiou et al., 1996).
Acima desta α-hélice central está a α-hélice amino-terminal e nas laterais estão dois
loops no qual TSST-1 se estende até o ápice da α hélice central. O domínio B possui
5 folhas β organizadas dentro de uma estrutura semelhante a um barril
(Papageorgiou et al., 1996).
A análise estrutural da toxina permite identificar regiões específicas da
molécula, como sítios de ligação ao TCR e às moléculas de MHC de classe II além
de regiões associadas aos diferentes efeitos biológicos da toxina como
superantigenicidade, mitogenicidade e letalidade (Dinges et al., 2000).
Mutagênese nos locais críticos de ligação nas moléculas de MHC de classe II
e do receptor TCR consiste num dos esforços centrais no desenvolvimento de novas
estratégias para a produção de vacinas. Diversos trabalhos têm relatado
experimentos deste tipo, descrevendo as atividades biológicas e toxicidade de
TSST-1 através da análise de toxinas recombinantes (Bonventre et al., 1995; Hu et
al., 1998; Papageorgiou et al., 1996; Ulrich et al., 1998; Gampfer et al., 2002; Hu et
al., 2003).
Moléculas mutantes mostram-se menos tóxicas como documentado in vitro
por diminuição em sua capacidade mitogênica e de liberar citocinas além de reduzir
a mortalidade em animais de laboratório (Bonventre et al., 1995; Cullen et al., 1995;
Murray et al., 1996). Modelos murinos mostraram-se altamente resistentes aos
efeitos letais dos superantígenos, tolerando altas doses de toxinas (mais de 4 mg
por animal) ou infusão contínua de 500 µg sem desenvolver os sintomas
característicos de SCT (Hale e Swietnicki, 2006). Coelhos são mais sensíveis a
SAgs e as características da doença são mais semelhantes à doença humana. Co-
administração de LPS aumenta a susceptibilidade a SAgs em até 1000 vezes
(Gampfer et al., 2002).
A maioria dos trabalhos envolve a utilização do mutante H135A que possui
alteração no resíduo de histidina na posição 135 para um resíduo de alanina. Este
mutante retém a habilidade superantigênica (Murray et al., 1996), mas não é letal em
modelos animais. Mutações de ponto nos resíduos 135 e 141 de TSST-1 resultam
em uma diminuição substancial da atividade mitogênica (Blanco et al., 1990).
Quando His-135 era mudada para Ala (H135A), ocorria mais de 90% de redução na
34
atividade mitogênica e a toxina não era letal quando testada em coelhos (Bonventre
et al., 1993), demonstrando que as atividades superantigênicas e toxicidade
estariam situadas em domínios diferentes da molécula (Harris et al., 1993; Wahlsten
e Ramakrishnan, 1998).
Análises destas moléculas mostraram que mutações no resíduo de His 135
afetam negativamente a ligação de TSST-1 ao TCR (Cullen et al., 1995; Drynda et
al., 1995). Análise da estrutura tridimensional do mutante H135A, comparando com
a estrutura de TSST-1 nativa, por meio de cristalografia de raios-X, demonstrou que
esta modificação causa perturbações na região vizinha à hélice α1 por desfazer a
interação entre as hélices. Desta forma o efeito da ligação do TCR ao resíduo H135
poderia ser mediado totalmente ou em parte pela região da hélice α1 (Papageorgiou
et al., 1996).
Bonventre et al. (1993) correlacionaram a atividade in vitro do mutante H135A
e outras toxinas mutantes com sua toxicidade in vivo para coelhos. Esta mutação
além de eliminar o potencial mitogênico da toxina também inibe o potencial letal da
toxina em coelhos. A toxina mutante exibe espectro de emissão de fluorescência
comparável à proteína TSST-1 nativa, é reconhecida normalmente pelo anticorpo
monoclonal MAb 8-5-7 (Bonventre et al., 1988), e competitivamente inibe TSST-1
em ensaio linfoproliferativo sugerindo que a toxina mutante é conformacionalmente
intacta (Bonventre et al., 1993).
Alguns trabalhos têm mostrado que a imunização com TSST-1 mutante
H135A induz alto título de anticorpos e protegem animais contra o desafio letal com
TSST-1 recombinante potencializado por LPS (Bonventre et al., 1995; Stiles et al.,
1995; Gampfer et al., 2002). Há estreita especificidade de anticorpos policlonais
gerados em resposta a imunização com TSST-1 recombinante ou TSST-1 nativa
(Gampfer et al., 2002). Os anticorpos com estas especificidades estão presentes em
altos títulos, possuem atividade neutralizante e são protetores, sugerindo, que esta
região constitui um importante epítopo protetor de TSST-1 (Gampfer et al., 2002).
Mutações em outras regiões de TSST-1, e produção de moléculas duplo-
mutantes foram descritas por vários grupos de pesquisadores, e também se
mostraram efetivas em alterar as características de superantigenicidade e letalidade
da toxina (Hurley et al., 1995; Earhart et al., 1998; Gampfer et al., 2002).
Mudanças de aminoácidos na posição 31 prejudicam a interação com MHC
de classe II (Hurley et al., 1995; Kum et al., 1996). A detoxificação de TSST-1
35
utilizando formaldeído e a construção de um duplo mutante com modificação de
aminoácidos nas posições 31 e 135 combinam redução na capacidade de ligação a
moléculas de MHC e TCR (Gampfer et al., 2002). Mutações no resíduo H135 afetam
o potencial de ativação de células T por TSST-1 mais do que a mutação no resíduo
G31R. No duplo mutante a atividade superantigênica era ainda menor. A
detoxificação de TSST-1 por formaldeído gera complexos oligoméricos e diméricos
reduzindo a superantigenicidade em 4 vezes, sendo que os epítopos antigênicos da
molécula permanecem, conforme comprovado por reconhecimento por anticorpos
específicos, além disso há diminuição na produção de IL-8 e TNF-α.
O mutante Q139K (Earhart et al., 1998), apresentou redução nas atividades
de superantigenicidade e letalidade. Q139K é incapaz de estimular a produção de
IL-2 em hibridomas de células T murinas e não induz a proliferação de leucócitos do
sangue periférico humano. Outros mutantes, como T128A e I140T têm efeitos
marginais sobre as atividades. I140T tem reduzida habilidade para estimular células
murinas a produzir IL-2 enquanto que a ligação a MHC ou a resposta de leucócitos
não era reduzida sem redução de letalidade (Hurley et al., 1995). Como estes
mutantes não apresentam mudança conformacional substancial, é sugerido que as
duas atividades são moduladas por mudanças na característica da superfície
exposta próximo ao topo do domínio A de TSST-1 (Earhart et al., 1998).
Resíduos de histidina são conhecidos por estar envolvidos em sítios ativos de
diversas proteínas. A modificação de seis resíduos de histidina em SEA resulta em
redução na atividade emética causada pela toxina sem alterar significativamente sua
imunogenicidade (Stelma e Bergdoll, 1982). A modificação de resíduos de histidina
em TSST-1 não gera mudança conformacional da toxina e reduz a mitogenicidade
em 50%, provavelmente por afetar resíduos próximos ao sítio ativo. A modificação
nos resíduos de tirosina gera mudança conformacional da toxina reduzindo a
capacidade mitogênica em até 85% (Kokan-Moore, 1989).
Segundo o trabalho de Wahlsten e Ramakrishnan, (1998), o domínio N-
terminal de TSST-1 não induz proliferação e interfere na atividade estimuladora de
TSST-1 enquanto que o domínio C-terminal não liga MCH de classe II e induz
proliferação. Estes dados são importantes terapeuticamente. Um mutante não
estimulatório com capacidade de se ligar a MHC pode ser utilizado como
antagonista para TSST-1 durante a fase aguda da SCT. Um mutante mitogênico que
não se liga a MHC pode ser artificialmente ancorado sobre células tumorais para
36
especificamente direcionar uma resposta antitumoral com mínima toxicidade contra
as células com MCH de classe II normais.
Os mutantes [Y51A,Y52A], H74A e [Y80A,H82A] não demonstraram nenhuma
alteração nas atividades biológicas de letalidade e superantigenicidade (Prasad et
al., 1993), sugerindo que o topo do domínio B não está envolvido na letalidade e
mitogenicidade (Prasad et al., 1993). Os mutantes Y115A, [H141A,Y144A] reduzem
a superatigenicidade e não se ligam a anticorpos neutralizantes de SAgs. A redução
na ordem de 50% pode ser explicada por uma pequena mudança conformacional. O
terminal carboxil da hélice B e resíduos no topo do domínio A formam uma superfície
que é crítica pra a superantigenicidade. O fato que Y115A exibe ligação alterada a
anticorpos neutralizantes sugere que a superfície de reconhecimento dos anticorpos
está situada no topo do domínio A (Prasad et al., 1993).
Diferenças no domínio C-terminal (T69, Y80, E132, e I140) são responsáveis
pela discrepância na atividade mitogênica. Murray et al. (1994) produziu o mutante
E132A para testar a importância da presença de carga negativa no resíduo 132 para
a mitogenicidade e o mutante E132D para testar a importância da posição da carga
negativa no resíduo 132. E132K e I140T foram feitos para testar a contribuição
destas substituições na ação de TSST-O. Os resultados demonstram claramente
que resíduos na região E132-H141 contribuem para a propriedade da
mitogenicidade. A presença e a posição precisa de cargas negativas no resíduo 132
são importantes para a atividade estimuladora máxima. Resíduos na região N-
terminal (T69 e outros) também podem contribuir (Deresiewicz et al., 1994).
Um pequeno número de mutantes influencia a atividade letal. TSST-O (que
difere de TSST-1 em 7 resíduos de aminoácidos dos 194 totais) em contínua injeção
por longo tempo não leva a SCT em modelos de coelhos nem potencializa o choque
endotóxico (Lee et al., 1992), sendo fracamente mitogênica.
Quando o resíduo de lisina da posição 132 da variante TSST-O, era mudada
para glutamato como ocorria em TSST-1 (Murray et al., 1994), a variante tornava-se
letal, no entanto a atividade superantigênica aumentava em apenas 10% mostrando
que este resíduo seria importante para a letalidade. Análises do mutante Q136A
mostraram que este apresenta um aumento de 60% na atividade superantigênica
como comprovada pela presença de esplenomegalia e não possuía atividade letal.
Estes dados sugerem que outros mecanismos, tais como liberação de citocinas na
ausência de proliferação de células T, aumento de endotoxinas, ou efeitos diretos de
37
TSST-1 sobre as células endoteliais são importantes na letalidade (Murray et al.,
1996). A atividade deste mutante é de especial importância, pois este tem aplicação
prática como agente terapêutico em tratamentos de diversos tumores.
O mutante de histidina 141 apresenta redução substancial na atividade
mitogênica e retém a característica de ligação ao anticorpo. Duplo mutante 141.144
perde virtualmente toda sua atividade mitogênica, o que sugere que a tirosina 144
participa em um local crítico em comum para a atividade mitogênica para linfócitos
murinos e na neutralização pelo anticorpo. Como foi demonstrado que este anticorpo
protege coelhos contra a atividade letal de TSST-1 (Blanco et al., 1990), é provável
que estes resíduos sejam críticos para a atividade de TSST-1 in vivo.
Diversos trabalhos têm relatado o desenvolvimento de vacinas toxóides que
oferecem proteção contra os efeitos imunobiológicos dos superantígenos através de
neutralização por anticorpos (Gampfer et al., 2002; Hu et al., 2003; Chun Cui et al.,
2005). Estes toxóides não são biologicamente tóxicos em modelos animais de SCT,
e não são superantigênicos quando testados em camundongos, esplenócitos de
coelho e células mononucleares do sangue periférico humano (Chun Cui et al.,
2005). Gampfer et al. (2002) demonstrou que vacinação com TSST-1 não
superantigênico induz resposta de anticorpos contra a toxina e protegem contra o
desafio com doses letais de SAg potencializadas por LPS. Os resultados mostram
que a vacina desenvolvida é altamente efetiva em induzir anticorpos específicos,
neutralizar a superantigenicidade, diminuir o crescimento bacteriano nos órgãos,
além de inibir a produção de IFN-γ e proteger os animais contra sepse letal e SCT.
Camundongos multivacinados com uma mistura de toxinas recombinantes
são totalmente protegidos contra um ou múltiplos desafios com toxinas indicando a
não ocorrência de interferência entre as vacinas multivalentes. A imunização com
um SAg induz reação cruzada de anticorpos protetores contra múltiplos SAgs e a
vacina multivalente aumenta o titulo destes anticorpos produzidos (Bavari et al.,
1999).
1.11. Mastite
Considerada uma doença multifatorial de grande importância para a pecuária
de leite, a mastite acarreta sérios prejuízos econômicos decorrentes da diminuição
da secreção láctea, ou da perda total desta capacidade, além de representar
38
importante problema de Saúde Pública (Jones e Wieneke, 1998). O leite proveniente
de fêmeas infectadas apresenta modificação em sua composição, alterando
conseqüentemente suas características organolépticas, físicas, químicas e
microbiológicas (Jones et al., 1984). Sob o ponto de vista econômico, a mastite é a
mais importante enfermidade do gado leiteiro, apresentando alta prevalência em
todo o mundo, acometendo não só os bovinos, como também os caprinos, ovinos e
bubalinos (Sa et al., 2004; Ferreira et al., 2007). Agravando o problema, a
enfermidade se apresenta também sob a forma subclínica, sendo esta mais
prejudicial pela ausência de sinais ou sintomas. As perdas na produção de leite
atribuídas à mastite subclínica alcançam de 10 a 26% do total de produção, de
acordo com grau de intensidade do processo inflamatório, da prevalência da doença,
da patogenicidade do agente infeccioso e do estágio de lactação (Akineden et al.,
2001).
Atualmente S. aureus é considerado o principal organismo patogênico, mais
freqüente isolado especialmente de mastite subclínica contagiosa (Castro et al.,
1992; Contreras et al., 1999). A doença é extremamente difícil de ser controlada
apenas por tratamento. O sucesso no controle é conseguido por prevenção de
novos focos infecciosos (Jones e Wieneke, 1998). A infecção por S. aureus pode se
espalhar para outros animais através das mãos e roupas do ordenhador, aparelhos
utilizados na ordenha ou através de insetos, caracterizando seu aspecto contagioso.
A bactéria ao penetrar no canal da teta produz toxinas que destroem a membrana
das células, gerando inflamação e recrutamento de leucócitos para o foco infeccioso
que podem diretamente danificar os tecidos produtores de leite (Freiras et al., 2004).
O patógeno estabelece microabscessos no interior da glândula, que os protegem do
sistema imune do animal e do tratamento terapêutico (Ferens et al., 1998).
TSST-1 e enterotoxinas freqüentemente têm sido detectadas em diversos
isolados de leite provenientes de gado bovino e bubalino apresentando mastite
(Takeuchi et al., 1998; Akineden et al., 2001), resultando em grandes perdas
econômicas para os produtores além de colocarem os consumidores em alto risco,
através de intoxicações (Balaban e Rasooly, 2000). Dentre estas, têm maior
relevância nos casos de mastite bovina, as linhagens de S. aureus que apresentam
os genes para as toxinas SEC e TSST-1, pois estas são as cepas associadas com
severos casos de mastite clínica ou casos que não respondem à terapia com
antibióticos (Zschöck et al., 2004).
39
SEC produz uma resposta inflamatória de maior intensidade nas glândulas
mamárias do que TSST-1 (Kuroishi et al., 2003), sendo encontrada em maior
concentração na fase de mastite aguda. Nesta fase, o titulo de anticorpos anti-TSST-
1 eram mais altos do que os de anti-SEC. Estes anticorpos neutralizariam a resposta
inflamatória na glândula mamária.
A associação dos genes sec e tst em linhagens de S. aureus isoladas de
casos de mastite também foi observada na Alemanha havendo, segundo alguns
trabalhos, uma variação geográfica de linhagens de S. aureus enterotoxigênicos
(Salasia et al., 2004; Larsen et al., 2002).
Alguns autores relataram que isolados de S. aureus provenientes de
secreções de glândula mamária de animais com mastite produziam
predominantemente SEC e TSST-1 (Takeuchi et al., 1998; Kuroishi et al., 2003).
Na Alemanha há relato de predominância dos genes recentemente descritos
para SEG, SEI e SEJ em isolados de gado com mastite bovina ao lado de SEC,
SED e TSST-1 (Akineden et al., 2001). Na Espanha, o predomínio é de cepas
secretando SEB e TSST-1 juntamente com SEC (Fueyo et al., 2005). Cardoso et al.,
1999 estudando animais com mastite bovina no Brasil relataram a predominância de
SED e TSST-1. Esta variação poderia ser causada por diferenças entre as cepas e
fontes de S. aureus (Kenny et al., 1993). Recentemente no Brasil isolou-se S. aureus
secretor de SEC e TSST-1 em búfalas apresentando mastite subclínica (Ferreira et
al., 2007).
1.12. Métodos de Detecção de Toxinas Estafilocócica s
Métodos convencionais para a detecção de toxinas produzidas por cepas de
S. aureus são baseados em procedimentos imunológicos avaliando a presença das
toxinas no sobrenadante de cultura suspeita de contaminação bacteriana, em
extratos alimentares contaminados ou em pacientes. Estes métodos são sempre
dependentes de quantidades detectáveis de toxinas. Grande parte destas técnicas
envolve a utilização do método de ELISA (Parsonnet et al., 1985b; Rosten et al.,
1987; Fey et al., 1988; Miwa et al., 1994; Hayakawa et al., 2000), além de
imunodifusão (Bonventre et al., 1983; Cohen et al., 1983; Reeves et al., 1984, Kenny
et al., 1993), RPLA (Igarashi et al., 1986; Takeuchi et al., 1998; Kuroishi et al., 2003;
Zschöck et al., 2004), entre outras.
40
O método de ELISA consiste num dos procedimentos mais amplamente
utilizados para a detecção de toxinas de S. aureus, em virtude de ser um método
rápido, sensível e que permite analisar um grande volume de amostras
simultaneamente, além de não ser necessária a utilização de materiais radioativos
como na técnica de radioimunoensaio. Apresenta algumas limitações ao uso como a
necessidade de equipamentos especiais para a visualização dos resultados, é
relativamente caro para a análise de um pequeno número de amostras e alguns de
seus componentes podem reagir inapropriadamente de acordo com a composição
da amostra utilizada.
Parsonnet et al. (1985b) relataram a utilização de um ensaio de ELISA
competitivo de baixo custo, com reprodutibilidade e eficaz na detecção e
quantificação de TSST -1, determinando concentrações de toxina entre 0,03 a 0,5
µg/ml.
No trabalho de Rosten et al. (1987), foi desenvolvido um ensaio sensível e
específico de ELISA não competitivo capaz de detectar concentrações de 0,5 a 16
ng/ml de TSST-1, não havendo detecção cruzada entre outras enterotoxinas como
SEA-SEE. O ensaio foi adaptado para um screening rápido de isolados de S. aureus
produtores de TSST-1 em sobrenadantes de cultura in vitro e para a detecção de
TSST-1 em lavados vaginais de pacientes com SCT.
Outro método baseado em ELISA não competitivo permite a detecção de até
30 pg/ml de TSST-1 no soro de pacientes com STC ou apresentando sintomatologia
relacionada de forma rápida e específica (Miwa et al., 1994).
Toxinas isoladas de pacientes apresentando sintomas de choque tóxico,
também podem ser detectadas por meio de focalização isoelétrica e
radioimunoensaio. Esta metodologia mostrou-se altamente sensível, mas não muito
específica na diferenciação das diferentes toxinas relacionadas à síndrome (Cohen
et al., 1983).
Orden et al. (1992) descreveram uma técnica de imunoblotting combinada
com um sistema de eletroforese semiautomatizada para a detecção de enterotoxinas
em extratos alimentares. Consiste num teste rápido e as proteínas são detectadas
com base na reação com anticorpos específicos e na determinação da massa
molecular evitando-se assim o surgimento de resultados falso-positivos gerados pela
interferência da proteína A e de outras proteínas contaminantes.
41
SEA pode ser detectada em amostras de alimentos utilizando western blotting
(Rasooly e Rasooly, 1998). Este método seria muito vantajoso para este tipo de
amostra. Alimentos aquecidos podem apresentar agregação de proteínas que
devem ser solubilizadas em gel contendo SDS o que desnaturaria o anticorpo,
sendo ineficaz em testes de ELISA onde os anticorpos são aplicados diretamente
sobre a proteína. Reações cruzadas podem ser identificadas, pois é possível
visualizar o tamanho da proteína que é reconhecida pelo anticorpo utilizado. O teste
de ELISA é muito utilizado por ser simples, sensível, rápido e disponível em vários
kits comerciais, mas possui algumas limitações: não reage bem em amostras de
alimentos aquecidos durante o processamento, podendo gerar resultado falso-
negativo; dependendo do tipo de alimento, reações cruzadas podem acontecer
gerando um resultado falso-positivo; e, peróxidos presentes naturalmente em certos
alimentos podem reagir com os cromógenos presentes no ensaio de ELISA (Rasooly
e Rasooly, 1998).
O método de RPLA tem sido utilizado na detecção de toxinas de S. aureus
(Igarashi et al., 1986), mostrando-se como um método simples e sensível para a
detecção de TSST-1. Não é necessário o uso de equipamentos especiais para
visualização dos resultados que são prontamente visíveis através da aglutinação das
partículas de látex sensibilizadas quando na presença do antígeno alvo e utilizam
quantidades mínimas de anticorpo para a sensibilização das partículas. Entretanto,
esta técnica não é indicada quando há necessidade de se processar um grande
número de amostras.
Para detectar a produção de TSST-1 por cepas de S. aureus, partículas de
látex eram sensibilizadas com anticorpos específicos anti-TSST-1 (Igarashi et al.,
1986). A quantidade mínima de TSST-1 detectada era de aproximadamente 1.0
ng/ml. Dos 41 isolados de pacientes com SCT, 23 eram positivos para a produção
de TSST-1, enquanto somente 20 cepas eram positivas por imunodifusão. O método
foi utilizado para examinar cepas isoladas de infecções estafilocócicas, fezes de
indivíduos saudáveis, alimentos contaminados e de alimentos no mercado.
Outra tecnologia empregada foi baseada na modificação de um kit comercial
de RPLA para permitir a detecção de anticorpos anti-TSST-1 em amostras de soro
de pacientes (Khojasteh et al., 2003). TSST-1 pode ser facilmente detectada por
RPLA, mas não há kits disponíveis comercialmente para a detecção de anticorpos
contra esta toxina. O método denominado CAIA (ensaio de inibição de aglutinação
42
competitiva) poderia ser utilizado para identificar indivíduos sem anticorpos
protetores e, portanto com alto risco de desenvolver SCT. O método também
poderia auxiliar num melhor diagnóstico dos estágios iniciais da SCT e prevenir a
confusão do diagnóstico com outras doenças.
Diversos trabalhos têm relatado a utilização da técnica da PCR na detecção
de TSST-1 e outras toxinas estafilocócicas, utilizando seqüências específicas para o
gene codificante (Johnson et al., 1991), ou através de sistemas de PCR multiplex
(Becker et al., 1998; Schmitz et al., 1998; Løvseth et al., 2004). Estes sistemas
permitiriam a detecção rápida e específica de diferentes genes codificadores de
exotoxinas, entre elas TSST-1 produzidas por S. aureus em cultura. Esta técnica
serviria somente para identificar cepas portadoras dos genes para toxina e
independe da expressão e secreção da toxina, onde seriam mais úteis os métodos
imunológicos.
Mehrotra et al. (2000) descreveram um protocolo de diagnóstico baseado em
multiplex PCR capaz de detectar genes para enterotoxinas (SEA-SEE), toxinas
esfoliativas (ET-A e ET-B), TSST-1 e o gene de resistência a meticilina mecA,
extraídos de isolados de S. aureus humanos. O teste detectaria 10 genes de uma só
vez, utilizando apenas duas reações. O uso deste multiplex geraria informações
importantes requeridas para o desenvolvimento de terapia apropriada e controle da
infecção durante as manifestações de S. aureus.
Reações do tipo multiplex são amplamente empregadas para amostras
provenientes de animais infectados por S. aureus. Diversos trabalhos descrevem a
detecção de genes para enterotoxinas e TSST-1 em isolados de bovinos
apresentando mastite (Zschöck et al., 2000; Katsuda et al., 2005; Zschöck et al.,
2005).
A técnica de hibridização de DNA emprega seqüências específicas de
nucleotídeos para detectar e diferenciar cepas contendo genes para toxinas como
SEA, SEB, SEC e TSST-1 (Neill et al., 1990). Outro método consiste em dois
multiplex PCR-EIA para amplificação e hibridização de genes para enterotoxinas,
TSST-1 e toxinas esfoliativas (Becker et al., 1998).
Alguns destes procedimentos poderiam ser utilizados na identificação de
novos genes associados às enterotoxinas produzidas por S. aureus, através da
detecção simultânea de um grande número de genes, incluindo genes recentemente
descritos (Monday e Bohach, 1999), ou através de um sistema que inclua na mesma
43
reação, primers específicos para cada uma das toxinas e um primer universal, o que
facilitaria o screening de cepas produtoras de toxinas ainda não descritas (Sharma
et al., 2000).
44
2. JUSTIFICATIVA
45
2. JUSTIFICATIVA
A toxina TSST-1 produzida por S. aureus está associada a grande parte dos
casos de síndrome de choque tóxico não-menstrual e em todos os casos de
síndrome de choque tóxico menstrual, além de estar presente em diversos isolados
provenientes de animais apresentando mastite subclínica.
A aplicação de técnicas de biologia molecular tem gerado avanços no
conhecimento da patogenia das doenças provocadas por S. aureus. Genes
codificando fatores de virulência têm sido clonados e seqüenciados e muitas
proteínas recombinantes correspondentes a estes fatores têm sido purificadas. Com
estas proteínas, os sintomas da doença humana podem ser reproduzidos em
modelos animais, levando ao entendimento de seu mecanismo de ação e
direcionando os estudos que visam à criação de estratégias para o desenvolvimento
de métodos de diagnóstico, vacinas e componentes utilizados na terapia da doença.
A produção de proteína TSST-1 recombinante seria de extrema importância
para o desenvolvimento de métodos rápidos, de baixo custo e eficientes para a
detecção da toxina em diversos quadros clínicos associados à infecção por S.
aureus, no controle na indústria de alimentos e bebidas, em casos de infecções
hospitalares e amostras de leite de rebanhos suspeitos de infecção estafilocócica.
46
3. OBJETIVOS
47
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Clonagem e expressão da proteína TSST-1 recombinante e da porção amino-
terminal de TSST-1 (N-TSST-1) de Staphylococcus aureus de origem bubalina em E.
coli.
3.2. Objetivos Específicos
a. Amplificação das seqüências codificadoras para TSST-1 e da região N-terminal
de TSST-1 de Staphylococcus aureus por meio da técnica da PCR.
b. Clonagem das seqüências amplificadas em vetor de clonagem pGEM-T easy
c. Subclonagem utilizando o sistema de expressão pQE
d. Expressão das proteínas TSST-1 e N-TSST-1 recombinantes em E. coli
48
4. MATERIAIS E MÉTODOS
49
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Estratégia Metodológica
S. aureus de origem bubalina produtoras de TSST-1, foram crescidas em
meio BHI, o cultivo foi centrifugado e o DNA cromossômico extraído pelo método de
TELT (Medina-Acosta e Cross, 1993). A seqüência para TSST-1 e para o domínio
amino-terminal de TSST-1 (N-TSST-1) foram amplificadas por meio da técnica da
PCR e clonadas no vetor de clonagem comercial pGEM-T easy. As construções
recombinantes obtidas, pGEM/tst e pGEM/N-tst foram respectivamente digeridas
com as enzimas de restrição Kpn I e Hind III, e Bam HI e Hind III para obtenção das
seqüências tst e N-tst com as extremidades compatíveis para ligação com o vetor de
expressão pQE-30, simultaneamente preparado para obtenção de suas
extremidades digeridas com as mesmas enzimas. Tanto o vetor como as
seqüências, ambos com as extremidades digeridas, foram purificados e ligados em
condições e concentrações apropriadas. As construções recombinantes pQE-30/tst
e pQE-30/N-tst foram utilizadas para transformar cepas laboratoriais de E. coli. A
validação dos processos de clonagem e transformação ocorreu por análise pela
PCR e digestão com as enzimas de restrição. As cepas de E. coli transformadas
foram preparadas para expressão e posterior purificação das proteínas
recombinante em coluna de Ni-NTA-Agarose (Figura 4).
50
Figura 4: Esquema representativo da estratégia metodológica utilizada.
51
4.1. Material biológico
4.1.1. Cepas de S. aureus e condições de cultivo
Cepas 5-B, 44-B, 48-B, 85-B, 117-B, 118-B, 184-B e 188-B de
Staphylococcus aureus produtoras de TSST-1 de origem bubalina foram obtidas da
bacterioteca do Laboratório de Sanidade Animal do CCTA/UENF e gentilmente
cedidas pelo Prof. Dr. Olney Vieira da Motta. As bactérias foram cultivadas em meio
BHI por 16 h a 37°C sob agitação de 250 rpm.
4.2. Obtenção e preparo dos fragmentos tst e N-tst
4.2.2. Desenho dos iniciadores
Os iniciadores específicos para TSST-1 foram desenhados de acordo com
pesquisa de seqüências disponíveis no banco de seqüências do Genbank (número
de acesso: BA000017) 5’ – CGG GGT ACC CCG ATG AAT AAA AAA TTA CTA ATG
– 3’ e 5’ – CCC AAG CTT GGG TTA ATT AAT TTC TGC TTC TATA – 3’. As regiões
sublinhadas correspondem aos sítios alvos para as enzimas de restrição Kpn I e
Hind III, engenheiradas para facilitar a clonagem direcionada. O produto da
amplificação esperado é de 700 pb de acordo com pesquisa no banco de dados (nº
acesso: BA000017). Para a construção dos iniciadores específicos para a região
amino-terminal de TSST-1 (N-TSST-1) foram utilizadas as seqüências 5’ – CGC
CGC GGA TCC GCG ATG AAT AAA AAA TTA CTA ATG – 3’ e 5’ – CGC CCC AAG
CTT GGG TTA TTC GCT AGT ATG TTG GCT – 3’. As regiões sublinhadas
correspondem aos sítios alvos para as enzimas de restrição Bam HI e Hind III. O
produto de amplificação esperado é de 370 pb.
4.2.3. Extração de DNA cromossômico de S. aureus
S. aureus das cepas 48-B, 118-B e 188-B foram crescidas de acordo com o
descrito no item 4.1.1. O cultivo foi centrifugado e o DNA cromossômico foi extraído
pelo método de TELT (Medina-Acosta e Cross, 1993).
52
Para os experimentos da PCR foi utilizado como molde, o DNA da cepa 48-B,
por se tratar de uma cepa potencialmente produtora da toxina TSST-1, e pela maior
quantidade e qualidade do DNA extraído.
4.2.3. Amplificação das regiões codificantes para TSST-1 e N-TSST-1 pela PCR
Inicialmente foi realizado um teste para determinar a concentração ideal de
MgCl2 a ser utilizada na reação, sendo que, para um volume final de 50 µL de
reação, foram utilizados 10-20 ng de DNA molde, 25 pmol de cada par de iniciador,
mistura de deoxinucleotídeos na concentração final de 0,2 mM (Biotools), 1U da
polimerase (Biotools) diluídos em tampão da própria enzima 1X concentrado, e as
concentrações de 1,5 mM, 2 mM e 2,5 mM de MgCl2. As condições de amplificação
foram 94ºC, 5 min (1 ciclo); 94ºC, 1 min, 42ºC, 1 min, 72ºC, 1 min (30 ciclos); 72ºC,
15 min (1 ciclo), para tst, e 94ºC, 5 min (1 ciclo); 94ºC, 1 min, 57ºC, 1 min, 72ºC, 1
min (30 ciclos); 72ºC, 15 min (1 ciclo), para N-tst.
A condição ótima de amplificação foi padronizada e repetida para todas as
reações posteriores. Um controle negativo foi feito pela substituição do volume do
DNA molde por igual volume de água.
O produto da amplificação foi visualizado através de eletroforese em gel de
agarose 0,8 % corado com brometo de etídeo.
4.2.4. Purificação dos fragmentos amplificados a p artir de géis de agarose
As seqüências amplificadas (tst e N-tst) foram retiradas do gel de agarose
0,8%, tratado com brometo de etídio, com a utilização do Kit de extração de DNA
Concert Rapid Gel Extraction System, (GIBCO BRL, Life Technologies), de acordo
com as instruções fornecidas pelo fabricante.
4.2.5. Quantificação das amostras de DNA
As amostras de DNA a serem quantificadas foram aplicadas em gel de
agarose 0,8% tratado com brometo de etídeo, juntamente com um marcador de
concentração conhecida e, por estimativa da intensidade do sinal gerado, a
concentração do DNA foi estimada.
53
4.3. Clonagem no vetor pGEM-T easy
O sistema de clonagem pGEM-T easy são designados para a clonagem de
produtos obtidos diretamente da PCR. Neste sistema as colônias transformadas com
as construções positivas crescem com coloração branca, enquanto as negativas
crescem com coloração azul. A coloração branca se dá quando o gene para a β-
galactosidase é interrompido pelo inserto que possui a seqüência gênica de
interesse. A β-galactosidase expressa pela colônia negativa cliva o substrato
cromogênico X-gal presente no meio de cultura, tornando-as azuladas.
4.3.1. Preparo de células BL21(DE3) pLysS, DH5- α e M15 (pREP4) competentes
As células foram cultivadas separadamente em erlenmeyers contendo 50 mL
de meio LB até D. O. 600nm= 0,5 - 0,7 e centrifugadas a 4ºC a 2.060 x g durante 5
min; o sobrenadante foi descartado e o sedimento de células dissolvido em 25 mL
de 50 mM CaCl2 gelado, misturado gentilmente, e colocado em gelo durante 20 min.
Essa mistura foi centrifugada a 4ºC a 2.060 x g durante 5 minutos e o sedimento
dissolvido em 3,5 mL de 50 mM CaCl2/15% glicerol. Foram feitas alíquotas de 100
µL, congeladas em nitrogênio líquido e estocadas a 70ºC negativos.
4.3.2. Clonagem dos fragmentos tst e N-tst no vetor pGEM-T easy
O DNA referente aos amplicons purificados foram diretamente ligados,
utilizando 0,1U T4 ligase (Promega), ao vetor de clonagem pGEM-T easy
(Promega). Os produtos da ligação foram utilizados para transformar E. coli cepa
DH5-α (Invitrogen) e os transformantes foram selecionados em meio LB sólido
contendo ampicilina (100 µg/mL), 0,5 mM IPTG e X- gal (80 µg/mL). As colônias
brancas foram selecionadas e crescidas em meio LB líquido por 16h contendo
ampicilina (100 µg/mL). Os DNAs plasmidiais das bactérias foram extraídos pelo
método TENS (Sambrook e Russel, 2001) e utilizados para análise dos clones
positivos por meio da PCR e digestão enzimática e visualização em gel de agarose,
dos fragmentos de 700 pb e 370 pb liberados.
54
4.4. Subclonagens no sistema de expressão pQE
O sistema de expressão pQE (Qiagen) é composto por 3 vetores
denominados pQE-30, pQE-31 e pQE-32, que são utilizados para a expressão e
purificação de proteínas recombinantes fusionadas com 6 histidinas consecutivas
(Figura 5). Os vetores possuem o gene bla que confere resistência ao beta-
lactâmico ampicilina e para corrigir possíveis alterações que podem ocorrer no
quadro de leitura em função da clonagem, pQE-30, pQE-31 e pQE-32,
respectivamente, são sintetisados contendo nenhum, dois e um nucleotídeo
adicional (Figura 5). As proteínas recombinantes são produzidas em E. coli cepa
M15 (pREP4) e purificadas através de cromatografia de afinidade por meio de
colunas contendo agarose ligada a níquel.
Figura 5: Esquema representativo do sistema de expressão pQE (Qiagen)
4.4.1. Preparo dos fragmentos tst e N-tst e vetores pQE
As reações de digestão em maior quantidade dos DNAs plasmideais e
vetores pQE com as enzimas de restrição foram executadas de acordo com as
instruções do fabricante. O DNA do clone pGEM/tst foi digerido com a enzima Kpn I,
seguido de precipitação com acetato de sódio 3 M pH 5.2, e digestão com Hind III. O
DNA correspondente à construção pGEM/N-tst foi primeiramente digerido com Bam
HI e após precipitação, foi digerido com a enzima Hind III. As reações foram
*
55
realizadas para volumes finais de 20 µL, com duração de 2 h, na temperatura de
37°C.
As amostras resultantes da digestão foram aplicadas em gel de agarose 0,8%,
corado com brometo de etídeo e purificadas de acordo com o item 4.2.4.
4.4.2. Ligação dos fragmentos tst e N-tst e transformação
Os amplicons tst e N-tst purificados, de 700 pb e 370 pb, respectivamente,
foram ligados ao vetor de expressão pQE-30 linearizado com as enzimas de
restrição correspondentes a cada amplicon. A ligação foi feita nas proporções 1:1,
1:2 e 1:3 vetor: inserto, utilizando 0,1U de enzima ligase (Promega, EUA) em
tampão próprio 1X concentrado, contendo ATP. O volume da reação foi de 20 µL e a
incubação ocorreu por 16 h a 4°C. E. coli M15 (pREP4) competentes foram
transformadas por choque térmico (3 minutos a 42 ºC, 15 minutos a 0 ºC), com a
construção originada da ligação da região codificante amplificada com o vetor de
expressão (Sambrook e Russel, 2001). O plasmídeo pREP4 contém o gene nptll que
confere resistência ao antibiótico canamicina, e contém o gene lac Iq, que codifica
um repressor da expressão do operador lac, presente no vetor de expressão pQE-
30. Bactérias co-tranformadas com o vetor de expressão recombinante e pREP4
foram selecionadas em meio LB contendo ampicilina (100 µg/mL) e canamicina (25
µg/mL). O DNA plasmideal das colônias obtidas na transformação com as
construções pQE-30/tst e pQE-30/N-tst foram extraídos pelo método TENS
(Sambrook e Russel, 2001) e digerido com as enzimas de restrição correpondentes,
seguido de reação da PCR para a confirmação da clonagem.
4.5. Expressão das proteínas His-TSST-1 e His-N-TS ST-1
Os clones pQE-30/tst e pQE-30/N-tst em M15 (pREP4), confirmados por
digestão e PCR, foram testados para indução das respectivas proteínas
recombinantes. Colônias isoladas foram utilizadas como pré-inóculo, cultivadas em
tubo Falcon contendo 5 mL de meio LB líquido com ampicilina (100 µg/mL) e
canamicina (25 µg/mL), a 37ºC durante 16 h, sob agitação constante de 250 rpm.
Novos inóculos foram feitos a partir desta cultura na diluição 1:20 e crescidos até
D.O.600nm = 0,6. A expressão dos transgenes é induzida pela adição de 1,0 mM de
56
IPTG, indutor sintético que reprime lac Iq. Assim, a expressão de Iac é liberada
permitindo a transcrição dos transgenes inseridos no pQE-30.
As proteínas recombinantes expressas foram denominadas His-TSST-1 e His-
N-TSST-1. A proteína His-TSST-1 consiste de 251 aminoácidos sendo que 234 são
correspondentes à seqüência para TSST-1 e mais 17 aminoácidos extras para
facilitar a purificação em coluna de afinidade, apresentando massa molecular de
aproximadamente 28 KDa (Figura 6). A proteína His-N-TSST-1 é formada por 136
aminoácidos sendo 123 correspondentes à seqüência N-TSST-1 e 13 aminoácidos
extras, tendo aproximadamente 14 KDa (Figura 7).
Figura 6: Esquema representativo da seqüência da proteína His-TSST-1
Figura 7: Esquema representativo da seqüência da proteína His-N-TSST-1
N ATG AGA GGA TCG 6XHis GGA TCC NNN 370pb (N-TSST-1)
13 aminoácidos de fusão
Bam HI
N ATG AGA GGA TCG 6XHis GGT ACC NNN 700pb (TSST-1)
Kpn I
17 aminoácidos de fusão
*
*
57
4.6. Análise da expressão das proteínas His-TSST-1 e His-N-TSST-1
4.6.1. Preparo das amostras
Após 3 h de indução com IPTG, 1 mL de cada cultivo foi retirado e
centrifugado a 12000 rpm por 5 min. Os sobrenadantes foram descartados e os
sedimentos de células ressuspendidos em 50 µL de água e adicionado 50 µL de
tampão de lise desnaturante. Foram aplicados 20 µL de cada amostra em gel
desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 15% para visualização da proteína
His-TSST-1 de aproximadamente 28 kDa e da proteína His-N-TSST-1 com
aproximadamente 14 kDa. Para a visualização das bandas foi utilizada coloração
com azul de Coomassie.
Foi utilizado o marcador de massa molecular Low Range com massa variando
de 14,4 a 97 KDa.
4.6.2. Eletroforese
A eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS foi empregada de
acordo com o método descrito por Laemmli (1970), constituído de: gel separador
(15% acrilamida/bisacrilamida) com 1 mm de espessura, gel de concentração (4%
acrilamida/bisacrilamida) e como tampão de corrida Tris-glicina contendo SDS. As
corridas eletroforéticas foram realizadas no sistema descontínuo (MINI PROTEAN II,
BioRad Laboratories), usando uma fonte de tensão BIO RAD POWER PAC 3000.
4.6.3. Western blotting
Para detecção das proteínas His-TSST-1 e His-N-TSST-1 foi utilizada a
técnica de western blotting segundo metodologia descrita (Towbin et al., 1979). As
proteínas recombinantes foram fracionadas por SDS-PAGE (Laemmli, 1970) e
eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose de 0,22 µm (Bio-Rad
Laboratories, Richmond, EUA). As membranas foram bloqueadas com 1% de leite
em pó desnatado diluído em tampão TST-20 por 16 h a 4 ºC. Foram utilizados o
anticorpo monoclonal anti-His e o policlonal anti-TSST-1 produzidos em coelho e
diluídos em TST-20 com 0,3 % de leite em pó desnatado, a 1:5000. As membranas
58
foram incubadas com os anticorpos diluídos durante 4 h. Os reagentes para
detecção dos anticorpos imobilizados foram proteína A conjugada a peroxidase
(Amersham Pharmacia Biotech, EUA), na diluição 1:5000 em TST-20 com 0,3% de
leite em pó desnatado. O tempo de incubação foi de 2 h. Entre cada etapa as
membranas foram lavadas 3 vezes com TST-20. As membranas foram reveladas
pela adição de uma solução do cromógeno diaminobenzidina (DAB) (Sigma-Aldrich,
EUA). A reação foi parada por lavagem em água destilada.
4.6.4. Padronização das condições de indução protéi ca
Na tentativa de aumentar o nível de expressão protéica algumas condições
utilizadas durante o processo de indução foram alteradas. O meio de cultivo LB foi
substituído pelo meio TB. A temperatura durante o período de indução foi testada
mantendo-se três diferentes cultivos separadamente em agitadores ajustados com
as temperaturas de 30°C, 37°C e 40°C. Foi testado t ambém a influência da
concentração do indutor IPTG no processo, variando-as de 0,5 mM até 1 mM.
As amostras obtidas foram analisadas em gel de poliacrilamida 15 % corado
com azul de Coomassie.
59
5. RESULTADOS
60
5. RESULTADOS
5. 1. Amplificação da região codificadora para TSST -1
O DNA cromossômico extraído das cepas bubalinas 48-B, 118-B e 188-B de
Staphylococcus aureus produtoras de TSST-1 com o método de TELT (Medina,
1993), foi visualizado em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo
(Figura 8). Para amplificação da região codificante para TSST-1 foi selecionado o
DNA proveniente da cepa 48-B. Foram utilizadas três concentrações de MgCl2 para
amplificação. O produto da amplificação foi de aproximadamente 700 pb em todos
os casos, e a condição que resultou numa melhor amplificação foi a de 2,5 mM de
MgCl2 (Figura 9). A reação de amplificação foi realizada em grande quantidade na
concentração de 2,5 mM de MgCl2 sendo o amplicon obtido (Figura 10) utilizado
para clonagem com o vetor pGEM-T easy (Kit Promega).
Figura 8: Extração de DNA cromossômico. Visualização eletroforética dos
produtos da extração de DNA cromossômico de diferentes cepas de S. aureus
obtidos pelo método de TELT em gel de agarose 0,8%. 1: DNA da cepa 118-B; 2:
DNA da cepa 48-B e 3: DNA da cepa 188-B; M: marcador de massa molecular λ
Hind. Figura negativa do gel corado com brometo de etídeo.
61
Figura 9: Visualização eletroforética dos produtos de amplificação alvo-específica
obtidos pela PCR utilizando diferentes concentrações de magnésio em gel de
agarose 0,8%. 1: controle negativo (água); 2: 2,5 mM de MgCl2; 3: 2 mM de MgCl2;
4: 1,5 mM de MgCl2; M: marcador de massa molecular 100pb. A seta indica a
posição relativa do amplicom com cerca de 700 pb. Figura negativa do gel corado
com brometo de etídeo.
Figura 10: Visualização eletroforética dos produtos de amplificação alvo-específica
obtidos pela PCR utilizando 2,5 mM de MgCl2 em gel de agarose 0,8%. 1-5: produto
da amplificação em grande quantidade de amplicom tst para ligação ao vetor de
clonagem; 6: controle negativo (água); M: marcador de massa molecular 100pb. A
seta indica a posição relativa do amplicom com cerca de 700 pb. Figura negativa do
gel corado com brometo de etídeo.
62
5. 2. Ligação do amplicom ao vetor de clonagem
Foi realizada a ligação do amplicom ao vetor pGEM-T easy. Células DH5-α
competentes foram transformadas com o produto da ligação e plaqueadas em meio
LB sólido contendo ampicilina 100 µg/mL, IPTG 80 µg/ml e X-gal 16 mM para
selecionar as colônias brancas. As colônias selecionadas foram crescidas em 5 mL
de meio LB líquido contendo ampicilina 100 µg/mL por 16 h, sendo o DNA extraído
pelo método de TENS. Do processo de clonagem foram obtidos oito possíveis
clones pGEM/tst.
5. 3. Análise dos clones positivos para a construçã o pGEM/ tst pela PCR
Dos oito possíveis clones pGEM/tst, três mostraram-se positivos para a
seqüência tst após análise pela PCR (Figura 11). Foi realizada uma digestão, com
as enzimas de restrição Kpn I e Hind III, do DNA do clone pGEM/tst1 para liberação
do inserto tst com extremidades coesivas, pronto para ser ligado ao vetor de
expressão pQE-30, previamente digerido com as mesmas enzimas. As amostras
provenientes da digestão foram aplicadas em gel de agarose 0,8% sendo possível
visualizar a banda de 700 pb correspondente ao inserto (Figura 12).
63
Figura 11: Confirmação da construção pGEM/ tst pela PCR. Visualização
eletroforética dos produtos obtidos pela PCR dos clones positivos contendo a
construção pGEM/tst em gel de agarose 0,8% corado corado com brometo de
etídeo. 1: clone pGEM/tst1 ; 2: clone pGEM/tst2; 3: clone pGEM/tst3 ; 4: controle
negativo (água); M: marcador de massa molecular λ Hind. A seta indica a posição
relativa da seqüência tst com cerca de 700 pb.
Figura 12: Confirmação da construção pGEM/ tst1 por digestão. Visualização
eletroforética dos produtos de digestão da construção pGEM/tst1 com as enzimas de
restrição Kpn I e Hind III em gel de agarose 0,8%. 1: pGEM/tst1 não digerido ; 2:
pGEM/tst1 digerido evidenciando o fragmento tst de 700 pb; M: marcador de massa
molecular λ Hind. A seta indica o fragmento tst com cerca de 700 pb.
64
5. 4. Preparo do inserto tst e do vetor pQE-30 para clonagem
O protocolo de digestão do DNA do clone pGEM/tst foi repetido várias vezes
com o intuito de se obter grande quantidade de inserto. Todas as amostras foram
aplicadas em gel de agarose 0,8% de onde as bandas correspondentes foram
purificadas utilizando kit da Qiagem.
O DNA plasmideal de células DH5-α transformadas com o vetor pQE-30 foi
extraído pelo método de TENS e digerido com as enzimas Kpn I e Hind III. Após a
digestão as amostras foram precipitadas utilizando acetato de sódio 3 M pH 5,2 e
etanol. Dois géis de agarose 0,8% foram feitos para a visualização do vetor pQE-30
digerido (Figura 13) e do inserto e vetor linearizado purificado (Figura 13).
Figura 13: Preparo do inserto e do vetor pQE-30. Visualização eletroforética dos
produtos da preparação do inserto tst e do vetor pQE-30 para clonagem, em gel de
agarose 0,8 % corado com brometo de etídeo. A. 1: vetor pQE-30 não digerido ; 2:
pQE-30 linearizado após digestão com Kpn I e Hind III; M: marcador de massa
molecular 1 kb; B. 1-2: inserto tst purificado via kit; 3: vetor pQE-30 linearizado e
precipitado. A seta superior indica o vetor pQE-30 linearizado e purificado; a seta
inferior indica o inserto tst purificado com cerca de 700 pb.
65
5. 5. Ligação do inserto tst ao vetor pQE-30
Após a digestão, o inserto extraído do gel via Kit, e o vetor pQE-30 precipitado
tiveram sua concentração estimada em torno de 10 ng/µL e 50 ng/µL,
respectivamente. As reações de ligação vetor: inserto foram feitas nas proporções:
1:1, 1:2 e 1:3, sendo a concentração do vetor sempre de 50 ng/µL. Foi realizada
uma reação de auto-ligação como controle da clonagem.
E. coli da cepa M15 (pREP4) foram transformadas por choque térmico, com o
produto de cada ligação, plaqueadas em meio LB contendo ampicilina (100 µg/mL) e
canamicina (25 µg /mL) e crescidas por 16 h a 37ºC.
Do processo de transformação foram obtidas 45 colônias transformadas
selecionadas por dupla resistência aos antibióticos ampicilina e canamicina.
5. 6. Análise dos clones positivos para a construçã o pQE-30/ tst pela PCR e
digestão
O DNA dos 45 possíveis clones foi extraído pelo método de TENS, sendo
selecionado um clone positivo para a presença da construção pQE-30/tst. A
validação do clone foi feita pela PCR (Figura 14), e por digestão do DNA com as
enzimas Kpn I e Hind III, seguido por visualização do fragmento tst em gel de
agarose 0,8% (Figura 15).
66
Figura 14: Confirmação da construção pQE-30/ tst pela PCR . Visualização
eletroforética dos produtos de amplificação alvo-específica da seqüência tst obtidos
pela PCR da construção pQE-30/tst em gel de agarose 0,8%. 1: controle positivo da
PCR; 2: clone pQE-30/tst; 3: controle negativo (água). A seta indica a seqüência
amplificada tst com cerca de 700 pb. Figura negativa do gel corado com brometo de
etídeo.
Figura 15: Confirmação da construção pQE-30/ tst por digestão. Visualização
eletroforética dos produtos de digestão da construção pQE-30/tst com as enzimas de
restrição Kpn I e Hind III em gel de agarose 0,8. 1: pQE-30/tst digerido ; 2: pQE-30/tst
não digerido; M: marcador de massa molecular 200 pb. A seta indica o fragmento tst
com cerca de 700 pb. Figura negativa do gel corado com brometo de etídeo.
67
5. 7. Expressão da proteína recombinante His-TSST-1
O clone pQE-30/tst foi crescido em meio LB na presença de ampicilina (100
µg/mL) e canamicina (25 µg/mL), incubado por 16 h a 37ºC e submetido a protocolo
para expressão da proteína recombinante utilizando IPTG. Para a visualização da
indução, amostras de lisado de cultura do clone pQE-30/tst obtidas após 3 h de
indução, utilizando as concentrações de 0,5 e 1 mM de IPTG, foram submetidas a
eletroforese em gel de poliacrilamida 15% corado com azul de Coomassie. Como
observado na figura 16, não foi possível visualizar a indução da proteína
recombinante em gel de poliacrilamida (Figura 16).
Figura 16. Expressão de His-TSST-1. Visualização eletroforética dos produtos da
indução da proteína His-TSST-1 pelo clone pQE-30/tst em gel de poliacrilamida 15
% em condições desnaturantes corado com azul de Coomassie. 1: lisado da cultura
do clone pQE-30/tst não induzida; 2: lisado da cultura do clone pQE-30/tst induzida
com 0,5 mM de IPTG; 3: lisado da cultura do clone pQE-30/tst induzida com 1 mM
de IPTG; 4: SEC recombinante; M: marcador de massa molecular Low Range.
68
5. 8. Detecção da proteína His-TSST-1 por western blotting
Diante da impossibilidade de se visualizar a indução da proteína
recombinante His-TSST-1 em géis de poliacrilamida, optou-se pela detecção da
expressão da proteína recombinante por meio de western blotting. Para a detecção
foram utilizados: anticorpo policlonal anti-TSST-1 e anticorpo monoclonal específico
para o hexâmero de histidina, presente na proteína His-TSST-1. Amostras de
sobrenadantes de culturas de S. aureus e da proteína SEC recombinante (Uhl et al.,
2003) foram utilizadas como controles para o teste.
Após revelação das membranas foi possível visualizar a expressão induzida
da proteína His-TSST-1 com cerca de 30 kDa, conforme comparado com a padrão
de massa molecular da proteína SEC recombinante (Figuras 17 e 18)
69
Figura 17. Imunodetecção de His-TSST-1 utilizando a nti-TSST-1. Visualização
dos produtos da expressão da proteína His-TSST-1 pelo clone contendo a
construção pQE-30/tst por western blotting utilizando anticorpo policlonal anti-TSST-
1. 1: controle positivo sobrenadante de cultura de S. aureus 48-B; 2: controle
negativo SEC recombinante; 3: sobrenadante de cultura do clone pQE-30/tst; 4:
lisado da cultura do clone pQE-30/tst não induzida; 5: lisado da cultura do clone
pQE-30/tst induzida com 1 mM de IPTG. A seta indica a proteína His-TSST-1.
Figura 18: Imunodetecção de His-TSST-1 utilizando a nti-His. Visualização dos
produtos da expressão da proteína His-TSST-1 pelo clone contendo a construção
pQE-30/tst por western blotting utilizando anticorpo monoclonal anti-His. 1: controle
positivo SEC recombinante; 2: sobrenadante de cultura de S. aureus 48-B; 3: lisado
da cultura do clone pQE-30/tst não induzida; 4: lisado da cultura do clone pQE-30/tst
induzida com 1 mM de IPTG. A seta indica a proteína His-TSST-1.
70
5. 9. Transformação de E. coli cepas DH5-α e BL21(DE3)pLysS com a
construção pQE-30/ tst
O DNA do clone pQE-30/tst em E. coli M15 (pREP4) foi extraído pelo método
de TENS e submetido à digestão com as enzimas Kpn I e Hind III afim de liberar o
fragmento tst. Este fragmento foi ligado a um novo vetor pQE-30 previamente
digerido com as mesmas enzimas e cepas de E. coli DH5-α e BL21(DE3)pLysS
foram transformadas com a construção resultante.
As bactérias transformadas foram plaqueadas em meio LB contendo apenas
ampicilina (100 µg/mL), para a cepa DH5-α, que não possui plasmídeo que confira
resistência, e na presença de ampicilina e cloranfenicol (34 µg/mL), para
BL21(DE3)pLysS, que possui o plasmídeo pLysS que lhe confere resistência ao
antibiótico cloranfenicol. O DNA de cada uma das colônias produzidas foi extraído
por TENS e a presença da seqüência tst foi confirmada pela PCR (Figura 19).
Os clones resultantes da transformação das cepas E. coli DH5-α e
BL21(DE3)pLysS foram crescidos em meio LB contendo os antibióticos apropriados
e submetidos a protocolo de indução protéica utilizando 1 mM de IPTG por 3 h a
37°C.
Os lisados das culturas resultantes foram analisados através de SDS-PAGE
não sendo possível visualizar a banda correspondente à proteína recombinante em
nenhuma das amostras induzidas de cada uma das diferentes cepas (Figura 20).
Por meio de western blotting, utilizando anticorpo monoclonal contra o
hexâmero de histina, foi possível detectar a expressão induzida da proteína His-
TSST-1 no lisado das culturas das cepas DH5-α e BL21(DE3)pLysS transformadas.
O lisado da indução do clone pQE-30/tst em M15 (pREP4) foi utilizado como
controle positivo (Figura 21).
71
Figura 19. Confirmação da construção pQE-30/ tst em diferentes cepas de E.
coli pela PCR. Visualização eletroforética dos produtos de amplificação alvo-
específica da seqüência tst obtidos em diferentes cepas de E. coli transformadas
com a construção pQE-30/tst. Gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo.
1: BL21(DE3)pLysS; 2: DH5-α; 3: M15 (pREP4); 4: controle negativo (água); M:
marcador de massa molecular λ Hind. A seta indica a seqüência tst amplificada com
cerca de 700 pb.
72
Figura 20. Expressão da proteína His-TSST-1 por dif erentes cepas de E. coli.
Visualização dos produtos da indução da proteína His-TSST-1 por diferentes cepas
de E. coli transformadas com a construção pQE-30/tst em gel de poliacrilamida 15 %
em condições desnaturantes corado com azul de Coomassie. 1: lisado da cultura de
E. coli M15 (pREP4) transformada; 2: lisado da cultura de E. coli DH5-α
transformada; 3: lisado da cultura E. coli BL21(DE3)pLysS transformada; 4: SEC
recombinante.
Figura 21: Imunodetecção de His-TSST-1. Visualização dos produtos da
expressão da proteína His-TSST-1 por diferentes cepas de E. coli transformadas
com a construção pQE-30/tst através de western blotting utilizando anticorpo
monoclonal anti-His. 1: lisado da cultura de E. coli M15 (pREP4) transformada; 2:
lisado da cultura de E. coli DH5-α transformada; 3: lisado da cultura E. coli
BL21(DE3)pLysS transformada; 4: controle positivo SEC recombinante. A seta indica
a proteína His-TSST-1.
73
5. 10. Ligação do amplicom N- tst ao vetor de clonagem
O DNA cromossômico da cepa 48-B, extraído pelo método de TELT (Medina,
1993), foi utilizado para amplificação da região codificadora para a porção amino-
terminal de TSST-1 (N-TSST-1). O produto da amplificação foi de 370 pb sendo o
fragmento obtido utilizado para clonagem no vetor pGEM-T easy.
Células DH5-α competentes foram transformadas com o produto da ligação e
plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina 100 µg/mL, IPTG 80 µg/ml e X-
gal 16 mM para selecionar as colônias brancas. As colônias selecionadas foram
crescidas em 5 mL de meio LB líquido contendo ampicilina 100 µg/mL por 16 h,
sendo o DNA extraído pelo método de TENS. Do processo de clonagem foram
obtidos cinco possíveis clones pGEM/N-tst.
Dos cinco possíveis clones pGEM/N-tst, três mostraram-se positivos para o
inserto N-tst após validação pela PCR (Figura 22). O DNA dos três clones pGEM/N-
tst foi submetido ao protocolo de digestão, com as enzimas de restrição Bam HI e
Hind III, para liberação do inserto, conforme visualizado em gel de agarose 0,8%
(Figura 23).
5. 11. Análise dos clones pGEM/N- tst pela PCR e digestão
Figura 22: Confirmação da construção pGEM/N- tst pela PCR. Visualização
eletroforética dos produtos de amplificação alvo-específica de 370 pb obtidos pela
PCR dos clones pGEM/N-tst. Gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo.
1: controle negativo (água); 2-6: possíveis clones pGEM/N-tst; 3,5,6: clones
pGEM/N-tst; M: marcador de massa molecular 100 pb. A seta indica a posição
relativa da seqüência N-tst amplificada com 370 pb.
74
Figura 23: Confirmação da construção pGEM/N- tst por digestão. Visualização
eletroforética dos produtos de digestão da construção pGEM/N-tst com as enzimas
de restrição Bam HI e Hind III. Gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo.
1: clone pGEM/N-tst não digerido ; 2: pGEM/N-tst digerido; M: marcador de massa
molecular 1kb. A seta indica a posição do inserto N-tst de 370 pb.
5. 12. Ligação do inserto N-tst ao vetor de expressão pQE-30
O inserto N-tst obtido após digestão em grande quantidade do clone pGEM/N-
tst1, foi purificado via kit e ligado ao vetor de expressão pQE-30, previamente
digerido com Bam HI e Hind III e precipitado, de acordo com o descrito para o
inserto tst. Células M15 (pREP4) foram transformadas por choque térmico com o
produto da ligação, plaqueadas em meio LB contendo ampicilina e canamicina, e as
colônias positivas para a construção pQE-30/N-tst foram selecionadas por serem
resistentes à presença de ambos os antibióticos.
Foram selecionadas 10 possíveis clones, que tiveram os seus DNAs
extraídos por TENS (dados não mostrados), com os quais foram realizadas uma
PCR e uma digestão para confirmação dos clones. Três clones foram confirmados
por apresentarem o inserto N-tst conforme visualizado em gel de agarose 0,8%
corado com brometo de etídeo após reação da PCR (Figura 24).
A figura 25 confirma a presença do inserto N-tst de 370 pb liberado por ambos
os clones após digestão com Bam HI e Hind III.
75
5. 13. Análise dos clones pQE-30/N- tst pela PCR e digestão
Figura 24: Confirmação da construção pQE-30/N- tst pela PCR. Visualização
eletroforética dos produtos de amplificação alvo-específica de 370 pb obtidos pela
PCR da construção pQE-30/N-tst. Gel de agarose 0,8% corado com brometo de
etídeo. 1-3: clone pQE-30/N-tst; 4: controle negativo (água); M: marcador de massa
molecular 100 pb. A seta indica a posição relativa da seqüência N-tst com 370 pb.
Figura 25: Confirmação da construção pQE-30/N- tst por digestão. Visualização
eletroforética dos produtos de digestão da construção pQE-30/N-tst com as enzimas
de restrição Bam HI e Hind III. Gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo.
1-3: pQE-30/N-tst digerido; M: marcador de massa molecular 200 pb. A seta indica a
posição do fragmento N-tst com cerca de 370 pb.
76
5.14. Expressão da proteína His- N-TSST-1
Os clones positivos foram cultivados e submetidos a protocolo de indução da
expressão da proteína His-N-TSST-1 seguindo as mesmas condições padronizadas
para a expressão da proteína His-TSST-1. Conforme análise do gel de poliacrilamida
(Figura 26) é possível observar a presença de uma pequena banda protéica na
posição correspondente a 14 KDa, que seria o tamanho esperado da proteína His-N-
TSST-1, provavelmente de vido à maior quantidade de amostra aplicada nesta raia,
já que após outras tentativas de se expressar a proteína para análise, esta banda
não foi observada.
Para a confirmação e detecção da proteína foi realizado um western blotting
utilizando anticorpo monoclonal anti-His, conforme descrito para His-TSST-1. Foi
confirmada a expressão induzida da proteína His-N-TSST-1, sendo mantidos os
baixos níveis de expressão anteriormente descritos. Os demais clones obtidos
também foram testados sendo mantidos os resultados anteriormente observados
(dados não mostrados).
Figura 26: Expressão de His-N-TSST-1. Visualização eletroforéticados produtos da
expressão da proteína His-N-TSST-1 recombinante pelos clones pQE-30/N-tst. SDS-
PAGE 15 % corado com azul de Coomassie. 2 e 4: lisados das culturas dos clones
pQE-30/N-tst não induzidas; 1 e 3: lisados das culturas dos clones pQE-30/N-tst
induzidas com 1 mM de IPTG. A seta indica a posição relativa da proteína His-N-
TSST-1.
77
6. DISCUSSÃO
78
6. DISCUSSÃO
TSST-1 produzida por S. aureus está associada a grande parte dos casos de
síndrome de choque tóxico não-menstrual e em todos os casos de síndrome de
choque tóxico menstrual, além de ser produzida por diversos isolados provenientes
de animais apresentando mastite. Esta toxina faz parte de uma família de proteínas
microbianas funcionalmente relacionadas conhecidas como superantígenos, que
atuam através da ativação do sistema imunológico de forma não específica (Dinges
et al., 2000; Phillips, 2002), levando indivíduos acometidos ao quadro de choque
tóxico. O quadro clínico de choque tóxico se caracteriza por febre acima de 38,9ºC,
descamação da pele, hipotensão, e alterações dos sistemas gastrointestinal,
muscular, mucoso, renal, hepático, hematológico e nervoso central (Monday e
Bohach, 1999).
A ativação do sistema imune por superantígenos envolve a ligação não
específica da proteína às moléculas de MHC II nas APCs e os TCRs das células T.
As interações entre essas moléculas resultam na ativação de até 25% dos linfócitos
T (Kappler et al., 1994) e conseqüente excesso na produção de citocinas
proinflamatórias.
A produção de proteínas recombinantes tem se constituído num dos métodos
mais utilizados no diagnóstico e imunoprofilaxia de infecções causadas por S.
aureus. Diversos trabalhos têm demonstrado a produção da toxina TSST-1 através
de mutagênese (Bonventre et al., 1993; Prasad et al., 1993; Gampfer et al., 2002)
que conservaria a porção imunogênica da proteína excluíndo a região responsável
pelas atividades mitogênica e letal.
Este trabalho teve como objetivo expressar a proteína TSST-1 recombinante
e sua porção N-terminal que seria utilizada para a detecção de TSST-1 em amostras
de pacientes e de animais infectados.
A partir dos processos de clonagem foi gerado um clone em E. coli M15
(pREP4) contendo a construção pQE-30/tst conforme confirmado pela PCR e por
digestão com enzimas de restrição que evidenciaram a presença da seqüência com
cerca de 700 pb correspondente a tst.
As análises do produto da indução do gene tst deste clone por meio de
western blotting revelaram a expressão induzida da proteína His-TSST-1. O baixo
nível de expressão contrasta com os resultados obtidos por Gampfer et al. (2002), e
79
pelo nosso grupo de pesquisa, no qual os níveis de expressão de proteínas
recombinantes como Bfpa (Flores, 2001), EspA (Amaral, 2007), e SEC (Uhl, 2003)
utilizando o sistema pQE-30 mostraram-se satisfatórios, sendo possível obtenção
das diferentes proteínas de fusão com alto grau de pureza. Para explicar esta
distorção, algumas hipóteses foram testadas: (a) instabilidade da construção,
podendo resultar na perda do inserto ou até mesmo do plasmídeo; (b) padronização
das condições de indução; (c) incompatibilidade entre a construção gênica e a cepa
de E. coli utilizada; (d) erro no quadro de leitura do gene durante a transcrição da
proteína.
Como os clones foram mantidos na presença de ambos antibióticos e a
construção pQE-30/tst foi re-extraída do clone selecionado, a primeira alternativa
poderia ser descartada. Sendo assim o processo de clonagem foi realizado por mais
três vezes sendo selecionados novos transformantes que foram submetidos ao
protocolo de indução estabelecido, permanecendo os níveis de expressão
anteriormente observados.
Para aumentar o nível de expressão protéica, foi realizada a padronização
das condições de indução através da alteração de algumas variáveis de cultivo
como, meio utilizado, temperatura e concentração de IPTG. Inicialmente o meio LB
utilizado convencionalmente no cultivo, foi substituído por meio TB, que conforme
testes realizados pelo grupo mostrou ser mais eficiente na expressão de proteínas
recombinantes utilizando o sistema pQE-30. Posteriormente a expressão foi
analisada nas temperaturas de 30°C, 37°C e 40°C, se ndo também alteradas as
concentrações de IPTG que variaram de 0,5 mM até 1 mM. No entanto, nenhuma
mudança significativa ocorreu no nível de expressão da proteína His-TSST-1.
Uma hipótese a ser testada seria a possibilidade de incompatibilidade
genética da construção pQE-30/tst com a cepa de E. coli utilizada. Diante disso,
novas construções pQE-30/tst foram geradas e para a transformação foram
utilizadas as cepas E. coli DH5-α e E. coli BL21(DE3)pLysS. Os clones foram
confirmados através da PCR e digestão e a expressão induzida da proteína His-
TSST-1 ocorreu em baixo nível sendo possível detectar a proteína apenas por
western blotting.
Para verificar se o baixo nível de expressão estaria relacionado
intrinsicamente à seqüência gênica utilizada, foram realizadas clonagens utilizando
os vetores pQE-31 e pQE-32 para verificar se ao mudar o padrão de leitura do gene,
80
outras proteínas seriam expressas em níveis mais altos. Esta hipótese também foi
descartada já que nenhuma mudança significativa ocorreu nos níveis de expressão.
Na literatura existem alguns relatos de cepas de Staphylococcus aureus
isoladas de bovinos e bubalinos que apesar de portarem o gene tst, não produzem a
toxina. Inicialmente nossos experimentos de clonagem foram realizados utilizando o
gene tst amplificado do DNA da cepa bubalina denominada 48-B, cedida pelo
Laboratório de Sanidade Animal, LSA/CCTA/UENF. A fim de testar esta
possibilidade extraímos o DNA das cepas de Staphylococcus aureus bubalinas 44-B,
117-B, 118-B, 184-B e 188-B e as seqüências correspondentes ao gene tst e N-tst
foram amplificadas pela PCR. Novas construções foram geradas e para as
transformações foram utilizadas E. coli M15 (pREP4). Deste processo foi gerado um
clone originário do gene amplificado do DNA de cada uma das cepas, exceto para a
cepa 44-B. A análise dos produtos de indução do gene tst dos clones por western
blotting revelaram baixo nível de expressão.
Descartamos também a hipótese de a proteína estar sendo tóxica para as
bactérias utilizadas já que o sistema pQE-30 prevê que a proteína recombinante só
seja expressa na presença do indutor IPTG.
A análise estrutural da toxina TSST-1 permite identificar regiões específicas
da molécula, como sítios de ligação ao TCR e às moléculas de MHC de classe II
além de regiões associadas aos diferentes efeitos biológicos da toxina como
superantigenicidade, mitogenicidade e letalidade (Dinges et al., 2000). O uso da
porção N-terminal de TSST-1 para utilização como reagente de captura e/ou
imunógeno seria mais vantajoso, já que esta região é altamente imunogênica
(Murray et al., 1996; Gampfer et al., 2002) e a proteína recombinante produzida não
apresenta as propriedades mitogênica e letal, características associadas à porção C-
terminal (Drynda et al., 1995).
Para a expressão da porção N-terminal da proteína TSST-1, o clone gerado
portando a construção pQE-30/N-tst em E. coli M15 (pREP4) foi submetido à
condições de indução semelhantes às realizadas com os clones pQE-30/tst. Uma
pequena banda protéica correspondente à proteína His-N-TSST-1 foi visualizada em
gel de acrilamida, não sendo todavia detectada a sua presença em ensaios de
indução realizados posteriormente. A expressão também em nível basal da proteína
foi confirmada através de western blotting conforme ocorrido com o clone pQE-
30/tst.
81
A análise dos resultados mostra que o sistema de expressão utilizando o
vetor pQE-30 não se mostra eficiente para a expressão em escala da toxina TSST-1
e da sua porção N-terminal .
Os baixos níveis de expressão não permitiram a produção da proteína já que
nossa proposta seria a produção da toxina utilizando um sistema fácil e rápido e de
baixo custo que compensasse a sua utilização em kits de diagnóstico e/ou como
imunógenos e imunoprofiláticos.
82
7. CONCLUSÕES
83
7. CONCLUSÕES
As proteínas His-TSST-1 e His-N-TSST-1 foram expressas de forma induzida em
níveis detectáveis apenas por western blotting.
Visando a produção de TSST-1 N-TSST-1 como reagente de captura e/ou
imunógeno, o sistema pQE não é recomendado.
84
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
85
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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