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Alterações Renais Precoces em Modelo de Aterosclerose em
Coelhos: Análise dos Glicosaminoglicanos e Características
Histopatológicas.
Ana Helena Airão Santa Rosa
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Maio de 2008
Livros Grátis
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Alterações Renais Precoces em Modelo de Aterosclerose em Coelhos: Análise dos Glicosaminoglicanos e Características Histopatológicas.
Ana Helena Airão Santa Rosa
Orientadores: Prof. Dr. Maurilo Leite Júnior
Prof. Dr. Lúcio Ronaldo Cardoso
Profa. Dra. Inah Maria Drummond Pecly
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Medicina, Área de Concentração: Clínica Médica.
Banca Examinadora:
____________________________________________
Prof.Dr. Alvimar Gonçalves Delgado
____________________________________________
Prof. Dr. Jorge Reis Almeida
____________________________________________
Prof. Dr. Eduardo Rocha
Rio de Janeiro
Maio de 2008
ii
Trabalho Realizado no Laboratório de Tecido Conjuntivo (Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho-HUCFF), Laboratório Multidisciplinar de
Pesquisas Professor José Ananias Figueira da Silva (HUCFF) e Laboratório
de Patologia Celular e Histologia (CCS).
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Maio de 2008
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Santa Rosa, Ana Helena Airão
Alterações renais precoces em modelo de aterosclerose em coelhos: análise dos glicosaminoglicanos e características histopatológicas / Ana Helena Airão Santa Rosa – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2008.
xii, 52 f. : il. ; 31 cm
Orientadores: Maurilo Leite Júnior, Lúcio Ronaldo Cardoso e Inah Maria Drummond Pecly
Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Clínica Médica, 2008.
Referências bibliográficas: f. 47-52
1. Rim - patologia. 2. Aterosclerose – complicações. 3. Hipercolesterolemia - complicações. 4. Hipercolesterolemia – metabolismo. 5. Glicosaminoglicanas - química. 6. Modelos animais de doenças. 7. Coelhos. 8. Clínica médica - Tese. I. Leite Júnior, Maurilo. II. Cardoso, Lúcio Ronaldo. III. Pecly, Inah Maria Drummond. IV. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Clínica Médica. V. Título.
iv
Dedicatória
A Sophia, amada filha, perfume, luz e cor da minha vida.
Ao Walter, amor meu, por todas as qualidades que me impulsionaram até aqui.
A Valdete, mãe e amiga nota dez, que sempre esteve ao meu lado, fosse ele qual fosse.
v
Agradecimentos
A Deus, “Criador do céu e da Terra, causa primária de todas as
coisas”, por representar a Esperança, a Força Mágica e a Centelha de Luz
que, de algum modo, me habitam.
Às forças genéticas, espirituais e ambientais resultantes da união
de Carlos Untururá de Almeida Airão e Valdete Airão, meus queridos pais.
Graças a vocês, Eu Sou.
Ao meu marido e companheiro Walter Santa Rosa, pelo seu amor.
A minha filha Sophia pelo imenso carinho no seu olhar, nos seus
gestos, dando-me força e mostrando a simplicidade da vida.
Aos companheiros do laboratório do professor Mourão,
especialmente Inah Pecly e Nelson Miller de M. Filho, pela abnegada
colaboração e inesgotável paciência diante da aluna incauta.
A Cesônia e ao Alison por terem sido fundamentais no preparo das
lâminas, com paciência e persistência sempre.
Aos amigos Mônica Vianna e Victor Augusto Marins Gomes pela
força e pelo companheirismo. A Mônica, especialmente, pela completa
doação de si mesma.
vi
À Professora Doutora Ana Tovar pelas solicitude, paciência e
gentileza.
À Professora Doutora Christina Maeda Takyia pelos conhecimentos
histopatológicos, fundamentais para a conclusão deste trabalho, e pelo
exemplo de dedicação.
Aos caríssimos orientadores, Professores Doutores Lúcio Ronaldo
Cardoso, Maurilo Leite Júnior e Inah Pecly pelo crédito e pela força.
Um agradecimento especial ao Professor Lúcio Ronaldo Cardoso
pela confiança, pela força e por me ensinar o “caminho das pedras”. Um pai
não teria feito diferente. Muitíssimo obrigada!
vii
Sumário
Resumo------------------------------------------------------------------------------------------------ix
Abstract-------------------------------------------------------------------------------------------------x
I-Introdução-------------------------------------------------------------------------------------------1
II-Objetivos-------------------------------------------------------------------------------------------18
III-Materiais e Métodos
1-Protocolo do Estudo----------------------------------------------------------------------------19
2-Análise Histológica------------------------------------------------------------------------------20
2.1-Estudo Morfológico---------------------------------------------------------------------------20
2.2-Dados Histomorfométricos------------------------------------------------------------------21
3-Análise Bioquímica------------------------------------------------------------------------------22
3.1-Extração e Análise Quantitativa dos Glicosaminoglicanos--------------------------22
3.2-Eletroforese em Gel de Agarose-----------------------------------------------------------23
3.3-Cromatografia de Troca Iônica-------------------------------------------------------------23
3.4-Determinação de Hidroxiprolina------------------------------------------------------------24
IV-Análise Estatística------------------------------------------------------------------------------24
V-Resultados
1-Dados Clínicos e Laboratoriais----------------------------------------------------------------25
2-Análise Histológica--------------------------------------------------------------------------------27
3-Análise Bioquímica-------------------------------------------------------------------------------33
VI-Discussão-----------------------------------------------------------------------------------------40
VII-Conclusão----------------------------------------------------------------------------------------46
Referência Bibliográfica---------------------------------------------------------------------------47
viii
Lista de Figuras
Figura 1-Início da Aterosclerose-------------------------------------------------------------------5
Figura 2-Progressão da Aterosclerose-----------------------------------------------------------6
Figura 3-Complicação Trombótica da Aterosclerose-----------------------------------------7
Figura 4-Principais Unidades Constituintes dos Glicosaminoglicanos
dos Vertebrados---------------------------------------------------------------------------------------12
Figura 5-Aspectos histomorfológicol de animais do grupo controle----------------------28
Figura 6-Aspectos histomorfológicos de animais do grupo hipercolesterolêmico----29
Figura7-Outros aspectos histomorfológicos de animais do grupo hipercolesterolêmico---------------------------------------------------------------------------------30
Figura 8-Aspectos morfológicos de animais do grupo hipercolesterolêmico----------31
Figura 9-Gel de agarose dos glicosaminoglicanos-------------------------------------------34
ix
Lista de Gráficos
Gráfico 1-Celularidade glomerular de animais dos grupos controle e hipercolesterolêmico---------------------------------------------------------------------------------32
Gráfico 2-Quantificação dos GAGs no rim de coelhos controle e
hipercolesterolêmicos--------------------------------------------------------------------------------33
Gráfico 3-Cromatografia de troca iônica em Mono Q (FPLC) dos GAGs extraídos de
rins de coelhos, mostrando as curvas obtidas do grupo controle e do grupo
submetido à dieta hipercolesterolêmica---------------------------------------------------------37
Gráfico 4- Conteúdo de hidroxiprolina nos rins de coelhos dos grupos normal e
hipercolesterolêmico---------------------------------------------------------------------------------39
Lista deTabelas
Tabela 1- Parâmetros laboratoriais e pesos dos coelhos controle e submetidos à
dieta hipercolesterolêmica, à admissão e após oito semanas----------------------------26
Tabela 2- Composição dos GAGs sulfatados nos grupos controle e
hipercolesterolêmico---------------------------------------------------------------------------------35
Tabela 3- Composição média das sub-populações de GAGs ao final do estudo,
expressos em ng/mg de tecido seco de rim----------------------------------------------------38
x
Abreviações
CS Condroitim sulfato
CPC Cloreto de cetilpiridina
EROS Espécies Reativas de Oxigênio
FPLC “Fast protein liquid chromatography”
GAG Glicosaminoglicano
HE Hematoxilina-eosina
HS Heparam sulfato
HCl Ácido clorídrico
LDL Lipoproteína de baixa densidade
MMP Metaloproteinases
MEC Matriz Extra Celular
NaCl Cloreto de sódio
PCNA “Proliferation cellular nuclear antigen”
PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
PAS Ácido Periódico de Schiff
xi
Resumo
A aterosclerose é altamente prevalente na população, mantendo
forte correlação com a hipercolesterolemia. Assim como as artérias, o rim é
um dos órgãos alvo da hipercolesterolemia, com alterações estruturais
características. O objetivo deste estudo foi o de analisar a composição e a
concentração de glicosaminoglicanos no tecido renal, bem como as
alterações glomerulares em um modelo de aterosclerose em coelhos. Para
este propósito foram utilizados 12 coelhos “New Zealand” machos e adultos,
mantidos num regime de oito semanas de dieta padrão (n=6) ou
hipercolesterolêmica (n=6). Foram monitorados o peso de cada animal e os
níveis séricos de colesterol total, triglicerídeos, glicose, uréia e creatinina,
antes e após oito semanas. Após a oitava semana, seis animais de cada
grupo foram sacrificados. Um dos rins foi fixado e enviado para análise
histológica e o outro processado para extração e quantificação dos
glicosaminoglicanos renais. Os achados histológicos descritivos foram
obtidos por microscopia óptica utilizando-se as colorações hematoxilina-
eosina, PAS e Sirius red. A celularidade glomerular foi avaliada por método
histomorfométrico. Os glicosaminoglicanos foram extraídos e o conteúdo de
ácido hexurônico quantificado pelo método de Carbazol. As proporções
relativas dos glicosaminoglicanos sulfatados foram estimadas por análise
densitométrica das bandas metacromáticas em gel de agarose. A
quantificação de glicosaminoglicanos sulfatados e não-sulfatados foi feita
pela cromatografia de troca iônica. Foi avaliado o conteúdo de colágeno pela
dosagem de hidroxiprolina no tecido renal. Esta mensuração utilizou o
método de Stegemann e Stalder modificado. As alterações histológicas no
grupo tratado com dieta hiperlipemiante foram a diminuição do espaço
urinário, discreto alargamento intersticial por infiltrado mononuclear
inflamatório e expansão da cápsula de Bowman. Houve significativa redução
dos GAGs totais no grupo hipercolesterolêmico e o percentual dos
sulfatados foi menor neste grupo. No entanto, a proporção entre as sub-
populações de GAGs sulfatados manteve-se constante. Não houve
diferença entre os dois grupos em relação ao conteúdo total de colágeno
renal.
xii
Abstract
Atherosclerosis is highly prevalent in general population, with strong
correlation with hypercholesterolemia. As for the arteries, kidney is one of the
target organs of hypercholesterolemia. This study was performed to analyze
composition and concentration of kidney glycosaminoglycans as well as
observed glomerular alterations in a model of atherosclerosis in rabbits. For
this purpose 12 New Zealand male and adult rabbits were kept for eight
weeks on a regimen of regular (n=6) or fat diet (n=6). Body weight was
measured and blood samples were taken for serum cholesterol, triglycerides,
glucose, urea and creatinine before and after eight weeks. After this period,
six animals of each group were sacrificed. One kidney was fixed and sent to
histological analysis and the other processed for glycosaminoglycans
extraction and quantification. Descriptive histological findings were obtained
by optic microscopy using hematoxilin-eosin, PAS and Sirius red. Glomerular
cellularity was evaluated by hystomorphometry. Glycosaminoglycans were
extracted and the amount of hexuronic acid quantified by Carbazol’s method.
Relative proportions of sulfated glycosaminoglycans were estimated by
densitometric analysis of the metachromatic bands in agarose gel.
Quantification of sulfated and unsulfated glycosaminoglycans were done by
exchange ionic chromatography. Colagen amount was evaluated by
measuring hydroxiproline concentration in renal tessue. Histological changes
in fat diet group were reduction in urinary space, slight interstitial
enlargement due to mononuclear infiltration, and expansion of Bowman’s
capsule. Results showed significant reduction of total amount of GAGs in
hypercholesterolemic group and the percentage of sulfated GAGs were
lower in this group. Nevertheless, there was a constant proportion between
the sub-populations of sulfated GAGs. In addition, there was no difference in
kidney content of collagen in both groups.
1
I- INTRODUÇÃO
1-Aterosclerose:
Estudos epidemiológicos indicam que a prevalência da
aterosclerose está aumentando em todo o mundo 1. Segundo dados da
Rede Interagencial de Informações para a Saúde (RIPSA), a taxa de
mortalidade específica por doenças isquêmicas do coração foi 55,81% em
2004, nas regiões metropolitanas. Só no sudeste, 65,32% dos óbitos foram
causados por doenças do aparelho circulatório, 58,17% na região sul e
27,18% na região norte, também em 2004.
1.1-Aspectos Gerais:
A doença cardiovascular constitui um dos maiores problemas de
saúde nos países ocidentais. Doença isquêmica do coração, insuficiência
cardíaca congestiva, morte súbita, doença arterial periférica e acidente
vascular cerebral são conseqüências de lesões oclusivas ateroscleróticas de
cujo espectro fisiopatológico representam as alterações mais terminais.
A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica das artérias
elásticas e das artérias musculares de médio e grande calibres 2.
Caracteriza-se por formação de placas fibrogordurosas a partir da camada
mais interna da artéria - a camada íntima - localizada imediatamente em
região subendotelial. Elas são o resultado do acúmulo de lipoproteínas de
baixa densidade (LDL) no espaço subendotelial, seguido de diapedese de
leucócitos, macrófagos e formação de “foam cells” (células espumosas),
proliferação de células musculares lisas e produção de tecido conjuntivo,
2
figuras 1 e 2. As “foam cells” são resultantes do acúmulo de ésteres de
colesterol no citoplasma dos macrófagos. Seymour Glagov demonstrou que
a artéria pode se remodelar à medida que a placa progride, de modo a
acomodá-la, mantendo a luz arterial mas aumentando seu diâmetro externo
3. Nesta fase de alargamento arterial compensatório, ocorre a remodelação
arterial e, posteriormente, formação de aneurismas. Durante esta
aterogênese, novos vasos se formam na íntima, a maioria proveniente dos
vasa vasorum que se originam da camada adventícia 4. No entanto, podem
ser encontradas no endotélio arterial mínimas lesões resultantes,
freqüentemente, de um distúrbio no padrão do fluxo sangüíneo nos pontos
de dobraduras e em bifurcações próximas da árvore arterial. Tais lesões são
assintomáticas e consideradas fisiológicas. Chamadas estrias gordurosas,
podem involuir espontaneamente ou progredir para as lesões mais
complexas.
O Comitê da Associação Americana do Coração em Lesões
Vasculares estabeleceu uma classificação para as lesões ateroscleróticas
em humanos, correlacionando o tipo de alteração histológica (do tipo I ao
tipo VI) com as síndromes clínicas correspondentes 5. Contudo, tal
classificação não implica linearidade na progressão das placas 6.
As placas mais maduras desenvolvem uma capa fibrosa composta
de matriz extracelular (MEC) contendo colágeno e elastina. Sob a capa
fibrosa, uma estrutura lipídica se forma, contendo macrófagos, “debris”
celulares e lipídios extracelulares. Nas lesões avançadas, mediadores pró-
inflamatórios potencializam a apoptose celular. Os macrófagos e outras
células ativadas na lesão secretam proteinases que degradam
3
macromoléculas da MEC, degradando a capa fibrosa. Elastase degrada
elastina, necessária para migração das células na lesão, e ocorre
remodelamento arterial.
Há anos, patologistas vêm estudando as mudanças nas paredes
vasculares de seres humanos para compreender a origem e a evolução das
placas. Com base nos conhecimentos adquiridos, foram desenvolvidos
modelos animais que permitiram estudar a patogênese destas lesões. Um
cientista russo chamado Alexander Ignatowski mostrou que era possível
desenvolver aterosclerose experimental em coelhos adicionando leite e
gema de ovo à dieta normal do animal 7. Pouco tempo depois, em 1913, N.
Anitschkov e Chalatov reproduziram o modelo acrescentando colesterol puro
à dieta de coelho 8. A associação entre colesterol e aterosclerose parecia
apontar para a causalidade. No entanto, muitos indivíduos que sofrem de
infarto agudo do miocárdio têm níveis séricos de colesterol de acordo com o
Programa Nacional de Educação do Colesterol, ou até abaixo, preconizado
em 200 mg/dl para o colesterol total e 130 mg/dl para LDL 9. Portanto, se é
verdade que a hipercolesterolemia é fator de risco para o desenvolvimento
de lesões ateroscleróticas, não se pode afirmar que todo indivíduo que cursa
com a doença aterosclerótica é um hipercolesterolêmico. Ainda há
controvérsias a respeito dos mecanismos pelos quais concentrações
elevadas de LDL desencadeiam aterosclerose e suas complicações 10.
Atualmente há evidência suficiente para se afirmar que a
aterosclerose é uma doença inflamatória, na qual mecanismos imunológicos
interagem com fatores metabólicos de risco para iniciar, perpetuar e ativar
lesões na árvore arterial 11. O balanço entre atividade inflamatória e
4
antiinflamatória controla a progressão da aterosclerose, processo este
influenciado pelos fatores metabólicos que, por sua vez, contribuem para a
deposição de lipídeos na artéria. De fato, dados clínicos e laboratoriais
sugerem que a infiltração e a retenção de LDL na camada íntima arterial
inicia uma resposta inflamatória na parede daquele vaso 12 13. Além disso, o
tecido adiposo de pacientes com síndrome metabólica e obesidade produz
citocinas inflamatórias, particularmente fator de necrose tumoral e
interleucina-6 14 15. As “adipocinas”- citocinas do tecido adiposo, incluindo
leptina, adiponectina e resistina- também podem influenciar resposta
inflamatória no organismo 14. Finalmente, moléculas geradas pela
peroxidação lipídica na doença aterosclerótica são capazes de induzir
reações protetoras bem como inflamatórias, por exemplo ligando-se a
receptores nucleares que controlam genes inflamatórios 12.
5
Figura 1-Início da aterosclerose: Desenho de um corte
longitudinal de uma artéria muscular com a clássica estrutura trilaminar. A
camada íntima arterial é composta por camada única de células endoteliais
sobrepostas à matriz subendotelial, onde residem células musculares lisas
esparsas. Adjacente à íntima, dela separada pela lâmina elástica interna,
encontra-se a túnica média, composta de múltiplas camadas de células
musculares lisas. A adventícia, camada mais externa do vaso, separada da
média pela lâmina elástica externa, não se encontra representada. Quando
o endotélio se torna inflamado, expressa moléculas de adesão que se ligam
a sítios específicos nos leucócitos. Selectinas medeiam a interação dos
leucócitos com o endotélio inflamado e as integrinas promovem firme
adesão. As quimocinas expressas no ateroma promovem um estímulo
quimiotático que favorece a diapedese e a migração dos leucócitos para
dentro da camada íntima, onde se alojam e dividem 16.
6
Figura 2-Progressão da aterosclerose: Linfócitos T unem-se
aos macrófagos na íntima durante esta fase. Estas células, bem como as
células da parede dos vasos sangüíneos locais, secretam citocinas e fatores
de crescimento que promovem a migração e a proliferação de células
musculares lisas. As células musculares lisas da camada média expressam
enzimas especializadas que degradam a elastina e o colágeno em resposta
aos estímulos inflamatórios. Esta degradação da matriz extracelular arterial
permite a penetração das células musculares lisas pela lâmina elástica e
matriz colagenosa da placa em crescimento16.
7
Figura 3-Complicação Trombótica da Aterosclerose:
Mediadores inflamatórios podem inibir a síntese de colágeno e promover a
expressão de colagenases pelas “foam cells” na íntima. Esta alteração
diminui o conteúdo de colágeno na capa fibrosa, tornando-a frágil, bastante
suscetível à ruptura. Paralelamente, a expressão do fator tissular pró-
coagulante é estimulada pelos linfócitos T e outros tipos celulares presentes
na lesão. Assim, quando se rompe a cápsula fibrosa, como ilustrado acima,
o fator tissular induzido pela sinalização inflamatória desencadeia a
formação do trombo, causador de complicações agudas da aterosclerose.
Clinicamente, este evento pode se traduzir em uma síndrome coronariana
aguda 16.
8
1.2- Aterosclerose e o Rim
“Examine me, O Lord, and proue me; try my reines and my heart’’.
Esta frase da Bíblia poderia nos fazer supor que a idéia de relacionar
rins e sistema cardiovascular remonta da era pré-cristã. Na ocasião, no
entanto, os rins, como o coração, eram vistos como sítios da alma ou
consciência 17, tornando pouco provável que a relação entre coração e
insuficiência renal já fosse apreciada.
A elevada proporção de óbitos por doença coronariana em pacientes
submetidos à hemodiálise foi primeiramente mostrada por Lindner e col. em
1974 18 sugerindo, portanto, uma relação entre a patologia renal e a
cardiovascular. Na época, pensava-se que a elevada prevalência dos
clássicos fatores de risco cardiovascular fosse a única explicação para a
referida associação.
Hoje, sabe-se que a aterosclerose está freqüentemente associada à
doença renal 19 ou sua disfunção 20, e que há fatores patogênicos
específicos da doença renal que aceleram a aterogênese, tanto na uremia
quanto em estágios precoces da insuficiência renal 21.
9
A principal causa de morbidade e mortalidade nos pacientes com
insuficiência renal crônica em estágio avançado é a doença aterosclerótica.
Os fatores de risco tradicionais para a aterosclerose incluem diabetes,
hipertensão arterial, dislipidemia, obesidade, tabagismo, idade avançada e
história familiar. Dentre estes, a obesidade tem papel de destaque,
porquanto sua crescente prevalência vem expor o indivíduo obeso à co-
morbidades a ela relacionadas.
A obesidade é um fator de risco para perda progressiva de função
renal em nefropatas e em obesos sem outras patologias. Remontam da
década de 1970 estudos epidemiológicos correlacionando positivamente
peso corporal e pressão arterial 22 23. O ganho de peso eleva a pressão
arterial em humanos bem como em animais de experimentação, da mesma
forma que a redução do peso leva a pressão sanguínea a níveis
correspondentemente mais baixos 24-26. A obesidade pode levar à
hipertensão por aumentar a reabsorção tubular de sódio, impedir a
natriurese pressórica, induzir expansão de volume e promover a
compressão dos rins por tecido gorduroso. Além disto, diabetes e alterações
lipídicas são características freqüentes na obesidade, levando à
aterosclerose que representa um dano a mais na função renal.
Paralelamente, a hipercolesterolemia é um fator reconhecido de risco
cardiovascular que, não só acompanha como agrava a doença renal, esteja
ela em estágio precoce ou avançado 27. A maior parte dos lipídios
depositados nas lesões ateroscleróticas é derivada das LDL. Elas penetram
na íntima vascular através do endotélio lesado ou disfuncional. Em modelos
10
animais, as alterações no metabolismo lipídico e em suas ações levam à
ativação e infiltração renal por macrófagos, resultando em dano túbulo-
intersticial e injúria celular.
Sendo assim, obesidade e/ou dislipidemia podem gerar transtornos
renais, tanto do ponto de vista funcional quanto estrutural, não diretamente
relacionados ao processo de aterosclerose 27 28. Tais alterações constituem
um espectro que vai desde glomerulomegalia com ou sem
glomeruloesclerose segmentar ou focal, à nefropatia diabética,
nefrocarcinoma e nefrolitíase 29. O primeiro sinal de comprometimento renal
é microalbuminúria ou proteinúria franca, em particular na presença de
hipertensão 29.
Henegar e cols. mostraram mudanças glomerulares no que diz
respeito ao tamanho, tão precocemente quanto sete semanas após dieta
rica em gorduras 30. Estas alterações traduziram-se em expansão da
cápsula de Bowman, proliferação celular, espessamento da membrana
basal tubular e glomerular e aumento da matriz mesangial. Ou seja, a maior
parte destas alterações ocorre na substância geleificada que preenche o
espaço extracelular nos tecidos dos animais multicelulares, mantendo
unidas as células de um tecido e fornecendo uma via porosa para difusão de
nutrientes e de oxigênio para as células individuais. Falamos, portanto, da
substância fundamental ou matriz extracelular.
A matriz extracelular é composta por proteínas fibrosas
interconectadas, tais como colágeno, elastina, fibronectina e laminina, além
de uma rede de heteropolissacarídeos, os glicosaminoglicanos (GAGs).
11
2-GLICOSAMINOGLICANOS:
2.1 Aspectos Gerais:
O estudo dos GAGs teve início no começo do século XX com a
investigação do condroitim sulfato (CS) de cartilagens e preparações de
heparina. No período de 1930 a 1950, houve grandes avanços no estudo da
estrutura química dos polissacarídeos, especialmente com a descrição das
estruturas do ácido hialurônico (AH), dermatam sulfato (DS) e diferentes
formas isoméricas do CS. Esses polissacarídeos foram chamados
inicialmente de mucopolissacarídeos e, depois, receberam a denominação
de glicosaminoglicanos. Os GAGs são uma família de polímeros lineares
compostos por unidades dissacarídicas repetitivas. Um dos
monossacarídeos que compõem os dissacarídeos é sempre a N-
acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina; o outro, na maioria dos casos,
é um ácido hexurônico, podendo ser ácido D-glucurônico ou ácido L-
idurônico31 ou então uma galactose. Os glicosaminoglicanos diferem entre si
quanto ao grau e posição de sulfatação, assim como quanto ao tipo de
ligação glicosídica. Portanto, de acordo com o tipo de unidade dissacarídica,
os glicosaminoglicanos podem ser divididos em vários grupos 32(figura 4).
12
Adaptado de Júnior JEG, 2006. Ref32.
Condroitim sulfato(CS)
Figura 4: Principais unidades constituintes dos glicosaminoglicanos dos vertebrados.
Condroitim sulfato (CS) Dermatam sulfato (DS)
Heparam sulfato (HS) Ácido Hialurônico (AH)
Heparina (HP) Queratam sulfato (QS)
13
Os GAGs são componentes essenciais da matriz extracelular,
podendo ser encontrados na superfície celular e em grânulos intracelulares.
Com exceção do AH, todos os outros GAGs são sintetizados como
proteoglicanos33. Nestas macromoléculas, as cadeias de
glicosaminoglicanos encontram-se ligadas covalentemente a um esqueleto
protéico. Os proteoglicanos estão presentes em todos os tecidos animais e
são produzidos pela maioria dos tipos celulares.
Os principais GAGs encontrados nos mamíferos são o condroitim
sulfato, o dermatam sulfato, queratam sulfato, heparam sulfato, heparina e
ácido hialurônico. Apresentam diferenças entre si quanto à composição
química, grau de sulfatação e peso molecular.
O CS e o DS apresentam dissacarídeos formados por resíduos de N-
acetilgalactosamina e ácido hexurônico. Por definição, o condroitim sulfato
contém ácido glucurônico como o único ácido hexurônico componente; por
outro lado, qualquer glucosaminoglicano com quantidades detectáveis de
ácido idurônico é considerado DS 34.
A heparina e o HS compartilham a mesma estrutura básica,
composta por resíduos de N-acetilglucosamina e ácido urônico. A distinção
entre eles se dá pelo grau de sulfatação e concentração de resíduos
glucosamina N-sulfatados. Desta forma, a heparina apresenta mais de 80%
dos seus resíduos de glucosamina N-sulfatados e um alto grau de
sulfatação, enquanto o HS possui maior proporção de resíduos de
glucosamina N-sulfatados e menor grau de sulfatação.
14
O AH é um polissacarídeo tipicamente encontrado em tecido
conjuntivo de vertebrados e é praticamente certo que a maioria das células
destes animais sintetisam ácido hialurônico em algum momento de sua
história natural 31. É o único glicosaminoglicano não-sulfatado, apresentando
maior simplicidade na sua composição estrutural, sendo um polímero
constituído por unidades alternadas de N-acetilglucosamina e ácido
glucurônico 35. A característica que mais o distingüe é sua visco-elasticidade
em estado hidratado, propriedade que varia segundo as circunstâncias. O
hialuronato é um componente fundamental da MEC, sendo o
glicosaminoglicano que mais contribui para suas propriedades estruturais e
funcionais em várias regiões como líquido sinovial, medula renal e partes do
intestino e outros tecidos moles 31.
Finalmente, o queratam sulfato possui uma estrutura dissacarídica
formada por N-acetilglucosamina e D-galactose, ao invés de um ácido
hexurônico.
15
2.2 Glicosaminoglicanos e o Rim:
A presença e a distribuição dos diferentes tipos de GAGs nos rins de
variadas espécies animais tem sido motivo de estudo por muitos
investigadores. Em cachorros, Castor e Greene 36 demonstraram que HS
era o GAG de maior concentração no córtex, enquanto que o AH
predominava na medula. Kresse e Grossman 37, por outro lado, relataram
ser o DS o glicosaminoglicano em maior concentração no córtex de
cachorro, rato e porco, enquanto Dicker e Franklin 38 demonstraram apenas
a presença de condroitin sulfato e AH em iguais quantidades no córtex e na
medula de cachorros, porcos e ovelhas. Constantopoulos e Dekaban 39 e
Berenson e Dalferes 40 41 avaliaram a população de GAGs nos rins de
humanos, observando maior concentração de GAGs na medula, sendo o AH
e o HS os principais componentes.
Em rins de coelhos o AH encontra-se na faixa de 93 a 113 µg/g de
tecido renal, 250 µg/g na papila e apenas 4 µg/g na córtex renal 31. Sabe-se
que o AH é o GAG de maior concentração na medula renal 31 predominando
na medula interna 42. No córtex renal, DS e HS preponderam, estando este
em maior quantidade 43.
O heparam encontra-se em maior concentração na membrana basal
glomerular 44 (lâmina basal das células endoteliais). Porém, em disfunções
da barreira de filtração glomerular que caracterizam algumas situações
patológicas, como Diabetes Mellitus e Síndrome nefrótica congênita,
apresenta-se em quantidade reduzida 45. Assim, as alterações de
concentração do heparam na MBG foram implicadas na albuminúria como
Figura 4- Principais Unidades Constituintes dos Glicosaminoglicanos dos
Vrtebrados
Figura 4- Principais Unidades Constituintes dos GAGs de Vertebrados
16
um marcador de filtração sangüínea anormal e subseqüente progressão de
doença renal 46. Mas este conceito vem sendo revisto 47-50.
2.3-Glicosaminoglicanos, Aterosclerose e Rim
A dislipidemia freqüentemente acompanha e agrava a doença renal
avançada 27, sendo a hipercolesterolemia um fator de risco para
aterosclerose precoce, levando à disfunção renal, inflamação e fibrose,
parcialmente mediadas por aumento do estresse oxidativo 51 52. A
repercussão renal da hiperlipidemia, associada ou não à obesidade,
evidencia-se nas alterações glomerulares com expansão mesangial e
esclerose glomerular 53. O estresse oxidativo contribui para o dano renal
nesta situação aumentando a geração de espécies reativas de oxigênio
(EROS) e as moléculas de LDL oxidadas. Observa-se aumento de LDL-
oxidada circulante em animais hipercolesterolêmicos 54 e aumento da
expressão dos receptores específicos para LDL oxidada 52.
A hipercolesterolemia modula as vias envolvidas no processo de
remodelação tissular, incluindo síntese, deposição e remoção de MEC.
Neste contexto, as metaloproteinases (MMP) de matriz, que têm papel de
preservar o rim danificado, são produzidas em menor quantidade. Como
conseqüência, há uma tendência à fibrose nos rins de animais
hipercolesterolêmicos. Por outro lado, o dano renal pode ser prevenido ou
revertido controlando a dislipidemia e normalizando a dieta 54.
Trabalhos realizados em coelhos fêmea sob dieta rica em gorduras
mostraram aspectos interessantes na composição de glicosaminoglicanos,
com ênfase nas alterações de ácido hialurônico na medula renal 30,
17
mostrando maior concentração de AH na medula interna dos coelhos
obesos quando comparados aos coelhos magros.
Rins de porcos submetidos à dieta rica em gorduras por seis
semanas mostraram acúmulo de células inflamatórias CD-3+ e ED-1+, mais
evidentes no córtex. Também aumento de fibrose cortical perivascular e
tubulointersticial, porém não glomeruloesclerose 54.
Este estudo visa investigar as alterações renais precoces em
animais dislipidêmicos, utilizando um modelo de hipercolesterolemia em
coelhos. Nosso objetivo é analisar a composição e a concentração de
glicosaminoglicanos no tecido renal, bem como as alterações glomerulares
observadas após oito semanas de dieta rica em gorduras.
18
II-OBJETIVOS:
1-OBJETIVO GERAL:
Avaliar as alterações histológicas e bioquímicas iniciais associadas
ao estado de hipercolesterolemia em coelhos.
2-OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
2.1-Caracterizar histologicamente o rim dos coelhos submetidos à
dieta rica em gordura.
2.2-Caracterizar bioquimicamente a população de glicosaminoglicanos
em tecido renal de coelhos submetidos à dieta hipercolesterolêmica e
normal por oito semanas.
2.2.1-Quantificar o conteúdo total de GAGs.
2.2.2-Quantificar, em cada grupo, o conteúdo de GAGs sulfatados e
não-sulfatados.
2.2.3-Avaliar, em cada grupo, a densidade das populações de
GAGs encontradas.
2.2.4-Comparar o conteúdo de colágeno presente nos rins dos dois
grupos.
19
III-MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os procedimentos que envolveram a manipulação animal
foram executados em consonância com as normas do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (1991).
1-PROTOCOLO DO ESTUDO
Doze coelhos da raça New Zeland, machos, brancos, pesando entre
2,5 e 2,9Kg, foram mantidos em gaiolas regulares por oito semanas e
tratados de acordo com o seguinte protocolo: (1) Dieta normal, consistindo
de ração para coelhos (n=6); (2) dieta hipercolesterolêmica (n=6),
consistindo de preparação contendo 2700g de dieta regular para coelho;
150g de óleo de soja; 150g de banha; 25g de colesterol (Vetec Química Fina
Ltda., Duque de Caxias, RJ), ambas oferecidas ad libitum.
Foram monitorados no tempo zero (início da dieta) e após oito
semanas o peso do animal e os níveis séricos de colesterol total,
triglicerídeos, glicose, uréia e creatinina. Por motivos técnicos, o sangue
colhido de um dos animais não pôde ser aproveitado.
Seis animais de cada grupo foram sacrificados ao final das oito
semanas, após anestesia com pentobarbital (200 mg IV) pela veia marginal
da orelha. A cavidade abdominal foi aberta e, após exposição dos rins, estes
foram retirados. Um dos rins foi imerso em acetona (10 v) para análise dos
glicosaminoglicanos e dosagem de hidroxiprolina; o outro foi destinado à
análise histológica.
20
2-Análise Histológica
2.1-Estudo Morfológico
O rim foi cortado longitudinalmente em duas metades. Cada uma
delas, após corte transversal, foi imersa em solução fixadora – solução de
Gendre - por seis horas e, em seguida, imersa em formaldeído a 10%
tamponado, por mais 16 horas. Os fragmentos de rim foram desidratados
em soluções crescentes de etanol e clarificados em xilol. Após, foram
embebidos e emblocados em parafina, sendo posteriormente submetidos à
microtomia (6 µm de espessura). As secções de rim foram coradas pela
hematoxilina-eosina (HE), pela técnica do PAS (ácido periódico-reativo de
Schiff) e pelo Sirius red modificado para microscopia confocal 55. A
avaliação morfológica consistiu de um estudo descritivo levando-se em
consideração modificações da arquitetura renal, em particular da estrutura
glomerular (tamanho, celularidade, espessura das alças capilares e
alargamento do eixo mesangial), da presença de glomérulos escleróticos, do
interstício renal (alargamento, presença de inflamação e fibrose) e dos
vasos arteriais e arteriolares (espessamento da parede por proliferação da
camada muscular ou esclerose intimal). As lâminas foram avaliadas por
dois observadores.
21
2.2-Dados Histomorfométricos
Para o estudo histomorfométrico foram capturadas imagens dos
cortes histológicos do rim dos animais corados pela HE através de câmara
fotográfica digital Evolution VF (Media Cybernetics, Silver Spring, USA)
acoplada a um microscópio óptico Eclipse E800 (Nikon, Japan) e a um
computador. As quantificações foram feitas nas imagens obtidas (20048 x
1536 pixels) usando o sistema de análise de imagens IMAGE PROPLUS
4.5.1 (Media Cybernetics).
2.2.1-Celularidade Glomerular
As imagens histológicas foram capturadas usando a lente objetiva
com aumento de 40x sendo capturadas imagens aleatórias de campos
contendo glomérulos, num total de 20 campos por animal. Foram contados
todos os núcleos das células existentes no tufo glomerular. O resultado foi
expresso como a média de células/ glomérulo/ animal.
22
3-Análise Bioquímica
3.1-Extração e Análise Quantitativa dos Glicosaminoglicanos
Os fragmentos de rim imersos em acetona foram mantidos por 24 h a
4°C. Após este período foram secos em ar ambiente, pesados e hidratados
por 24 h a 4°C em tampão de digestão (acetato de sódio 100 mM, cisteína
5mM, EDTA bissódico 5mM, pH 5,0). Depois deste período foi adicionada
papaína (quantidade) (10% do peso seco do rim) e o material incubado por
mais 24 h a 60° C em banho-maria e em constante movimento. A mistura de
incubação foi centrifugada por 20 min (3.500 rpm em uma centrífuga clínica
modelo LS-II) e o sobrenadante foi precipitado com etanol e mantido a 4°C
por 24 h. Após este período, o material foi novamente centrifugado e o
precipitado dissolvido em uma solução de DNAse 5mg/ml de PBS com Mg
por mais 24h a 37°C. Uma nova centrifugação foi realizada e o
sobrenadante precipitado com cloreto de cetilpiridina (CPC) 10%, mantido
em temperatura ambiente. Após pelo menos 24 h o resultante de todo o
procedimento descrito foi centrifugado mais uma vez e o precipitado lavado
com CPC 0,05%, sendo posteriormente dissolvido com uma solução de
NaCl 2M : etanol absoluto. Após 24 horas, o precipitado foi lavado com
etanol 80% por duas vezes, e em seguida, com etanol absoluto. Os
polissacarídeos obtidos foram, então, secos a vácuo e dissolvidos em água
destilada para posterior dosagem do conteúdo de ácido hexurônico através
da reação de carbazol 56.
23
3.2 -Eletroforese em Gel de Agarose
Alíquotas dos polissacarídeos foram aplicadas em gel de agarose a
0,5% em tampão 1,3 diaminopropano:acetato de sódio 50mM (pH 9,0), que
foi submetido a uma corrida em cuba horizontal a 100 V por 1 h 57. Ao final,
os polissacarídeos foram precipitados com Cetavlon 0,1% e corados com
azul de toluidina 0,1% e ácido acético:etanol:água (0,1:5;5v/v). As
proporções relativas dos glicosaminoglicanos foram estimadas por análise
densitométrica das bandas metacromáticas utilizando um densitômetro (Bio-
Rad, USA).
3.3-Cromatografia de Troca Iônica
As amostras dos glicosaminoglicanos obtidos dos rins foram
aplicadas a uma coluna Mono Q (HR 5/5; Amersham Biosciences, Inc.),
acoplada a um sistema FPLC e equilibrada com tampão Tris HCl (pH 8,0).
Foram eluídas no mesmo tampão, em um gradiente linear de NaCl 0-2,0 M,
com um fluxo de 0,5 ml/min. Frações de 0,5 ml foram coletadas e analisadas
por metacromasia 58 e dosagem de ácido hexurônico.
24
3.4-Determinação de Hidroxiprolina
A quantidade de hidroxiprolina no tecido renal foi mensurada pelo
m´todo de Stegemann e Stalder modificado59.
As amostras imersas em acetona, após secagem, foram submetidas
a uma hidrólise ácida e, em seguida, incubadas com cloramina e uma
solução de ácido perclórico e aldeído. Em seguida, as amostras foram lidas
com absorbância 570 nm.
IV-ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados são apresentados como Média ± DP ( DPX ), Mediana
seguida do valor mínimo e do valor máximo (MED [Min-Max]) ou
porcentagem,conforme necessário em tabelas e gráficos. Para análise foram
usados os testes t de Student pareado e não pareado (testes paramétricos),
o teste de Mann Whitney e o de Wilcoxon (testes não paramétricos) e teste
X². Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente
significativo.
25
V-RESULTADOS
1-Dados Clínicos e Laboratoriais
A tabela 1 mostra os parâmetros laboratoriais e pesos obtidos à
admissão e após oito semanas de dieta, respectivamente, nos grupos
estudados.
Observa-se que as diferenças encontradas em relação aos valores
de triglicerídeos, glicose, uréia e creatinina não se mostraram de
significância estatística, tanto no tempo zero quantos ao final da oitava
semana (término da avaliação).
O peso dos animais também foi um parâmetro cuja variação não
apresentou significado estatístico ao compararmos o grupo de coelhos
normais com o grupo submetido à dieta hiperlipemiante.
Os únicos dados estatisticamente relevantes encontrados em nossa
avaliação foram os do colesterol plasmático e da glicemia. Não houve
diferença entre os grupos no tempo zero. Após oito semanas, o grupo com
dieta hipercolesterolêmica apresentou significante diferença destes
parâmetros em relação ao tempo zero e, também, ao grupo controle.
26
Tabela1-Parâmetros laboratoriais e pesos dos coelhos controle e submetidos à dieta hipercolesterolêmica, à admissão e após oito semanas. Os valores representam média ± desvio padrão.
NS: não significativo. Os valores de p (teste T pareado) referem-se aos valores pré vs pós dieta.
Variáveis Grupos Pré dieta Pós dieta Valor de P
Peso (g)
Controle(n=5)
HC (n=6)
1883 ± 366
2240 ± 392
2493 ± 450
2755 ± 607
NS
NS
Colesterol
(mg/dl)
Controle(n=5)
HC (n=6)
79,2 ± 27,0
84,6 ± 46,6
60,5 ± 24,7
1406,6 ± 1025,2*
NS
0,02
Triglicerídeos
(mg/dl)
Controle(n=5)
HC (n=6)
49 ± 24,3
119,0 ± 122,0
75,5 ± 12,0
524,0 ± 551,0
NS
NS
Glicose (mg/dl)
Normal (n=5)
HC (n=6)
102,0 ± 19,7
106,6 ± 24,3
128,5 ± 21,9
202,8 ± 80,8*
NS
0,03
Uréia (mg/dl)
Normal (n=5)
HC (n=6)
42,0 ± 18,4
30,4 ± 10,6
49,5 ± 12,0
33,8 ± 9,0
NS
NS
Creatinina
(mg/dl)
Normal (n=5)
HC (n=6)
1,0 ± 0,2
0,7 ± 0,4
1,1 ± 0,1
1,2 ± 0,1
NS
NS
27
2-Análise Histológica
2.1-Estudo Morfológico (descritivo)
Os rins dos coelhos do grupo controle apresentavam as arquiteturas
cortical e medular preservadas (figura 5/1 e 5/2). Na coloração pelo PAS não
foram observadas nem alterações do eixo mesangial nem das membranas
basais dos capilares glomerulares ou tubulares (dados não mostrados). As
arteríolas existentes apresentavam paredes finas (figura 5/3). A coloração
pelo Sirius red evidenciou colágeno, corado em vermelho, localizado ao
redor dos túbulos e cápsula de Bowman (figura 5/4).
Os rins dos animais tratados com dieta hipercolesterolêmica
exibiram, igualmente, preservação das arquiteturas cortical e medular
(figuras 6/5, 6/7 e figura 7/9), quando comparados aos do grupo controle.
Por vezes, os glomérulos apresentaram alargamento do eixo-mesangial
(figura 6/6) ou aumento do espaço urinário (figura 6/7). Não houve
modificação da celularidade glomerular ou da espessura das alças capilares
(figura 6/5 e 6/8). O interstício se mostrou discretamente alargado por
edema e com leve infiltrado inflamatório mononuclear (macrófagos), de
distribuição multifocal (figura 7/9). Na região peri-hilar notaram-se focos de
infiltrado linfocitário (figura 7/10). Os túbulos se mostraram discretamente
tumefeitos (figura 7/10 e 7/11). O padrão de deposição de colágeno foi
semelhante ao normal, exceto em raras zonas perivasculares (figura 7/12).
As artetríolas se mostraram levemente espessadas em virtude da
28
proliferação da camada muscular (figura 6/8 e figura 5/11 e figura 8/13).
Notou-se moderada esclerose intimal em artéria de médio calibre (figura
8/14).
Figura 5. Aspectos histomorfológicos de animais do grupo
controle.1)Aspecto da cortical de animal do grupo controle.
HE. Aumento x 400.2) Aspecto da medular de animal do grupo controle .HE.
Aumento x 200. 3) Veia e artéria de pequeno calibre de animal do grupo
controle. HE. Aumento x 400. 4) Trama de colágeno (seta) na cortical de
animal do grupo controle. Sirius red. Aumento x 400.
1 4
1 2
3 4
29
Figura 6. Aspectos histomorfológicos de animais do grupo
hipercolesterolêmico. 5) Aspecto da cortical de animal submetido à dieta
hipercolesterolêmica. HE. Aumento x 400. 6) Discreto aumento do eixo
mesangial em animal do grupo hipercolesterolêmico. PAS. Aumento x 200.
7) Glomérulo isquêmico em rim de animal hipercolesterolêmico. HE.
Aumento x100. 8) Discreto espessamento de arteríola em animal
hipercolesterolêmico. HE. Aumento x 400.
30
Figura 7. Outros aspectos histomorfológicos de animais do grupo
hipercolesterolêmico. 9) Aspecto da medular de animal
hipercolesterolêmico. HE Aumento.x400. 10) Infiltrado inflamatório no
interstício renal de animal hipercolesterolêmico.HE. Aumento x 200. 11)
Espessamento da arteríola em animal hipercolesterolêmico. HE. Aumento x
400. 12) Coloração para colágeno evidenciando fibras espessas em eixo
peri-vascular. Sirius red .Aumento x 400.
9 10
11 12
31
Figura 8. Aspectos morfológicos vasculares de animais
hipercolesterolêmicos. 13) Arteríola com parede espessada às
custas de proliferação da camada muscular em animal
hipercolesterolêmico. HE. Aumento x 400. 14) Parede de artéria de
médio calibre no hilo renal apresentando esclerose intimal. PAS.
Aumento x 100.
32
2.2-Dados Histomorfométricos
2.2.2-Celularidade Glomerular
Não houve diferença estatisticamente significativa em relação à
celularidade glomerular quando comparados o grupo controle e o grupo
hipercolesterolêmico, como se evidencia no gráfico 1.
Gráfico 1: Celularidade glomerular dos rins dos coelhos controle e
hipercolesterolêmicos, representada como mediana, valor mínimo e valor
máximo.
Controle Hipercolesterolemia
0 1 2 3
Célu
las/g
lom
éru
lo
0
20
40
60
80
100
p = 0,73
33
3-Análise Bioquímica
3.1-Extração e Dosagem de GAG Total:
Após extração e dosagem da população de GAGs dos rins
estudados, observou-se que o conteúdo total de GAG após as oito semanas
de observação foi de 210[143-266] ng/mg de tecido e 744,5[423-1067]
ng/mg de tecido, respectivamente no grupo submetido à dieta
hipercolesterolêmica e no grupo controle. A diferença entre ambos se
mostrou estatisticamente significativa (p=0,016 vs grupo controle).
Gráfico 2: Quantificação dos GAGs no rim de coelhos controle e
hipercolesterolêmicos. Resultados expressos como mediana, valores
máximo e mínimo (ng de ácido hexurônico/ mg peso seco).
GAG Total
Controle Hipercolesterolêmico
0 1 2 3
ng H
ex.
Ac./
mg
te
c.s
eco
0
200
400
600
800
1000
1200
p= 0,016 vs grupo normal.
34
3.2-Eletroforese em Gel de Agarose/ Análise Densitométrica:
O material de GAGs obtidos dos rins de coelhos foi avaliado quanto
ao peso molecular a partir de corrida em gel de agarose com o objetivo de
confirmar a natureza dos GAGs presentes em nosso material. Assim, foram
feitas eletroforeses de diversas amostras. Inicialmente aplicamos a amostra
submetida a nenhum tratamento enzimático. Em seguida, tratamento com
ácido nitroso, que digere HS, e com condroitinase ABC, que degrada CS e
DS. O experimento confirmou que os GAGs avaliados se tratavam
realmente de HS, CS e HS, como se observa na figura 9.
1) 2)
Figura 9.Gel de agarose dos glicosaminoglicanos. 1)Animais
do grupo controle. 2) Animais do grupo hipercolesterolemia.
35
A tabela nos mostra que, ao final do estudo, não houve diferença
significativa entre as sub-populações de GAGs sulfatados intra grupos.
Tabela 2: Composição dos GAGs sulfatados ao final do estudo.
Controle
(%)
Hipercolesterolêmico
(%)
Heparan
Sulfato
49,06 ± 3.91¹ 51,6 ± 3,8
CS+ DS 50.3 ± 3.7 48.2 ± 3.4
Valor de p NS NS
¹= Média±Desvio Padrão.
36
3.3-Cromatografia de Troca Iônica:
Foram aplicados a uma coluna Mono Q um pool de material (GAG
total) obtido de coelhos controle e outro de hipercolesterolêmicos. Os
resultados obtidos, que podem ser observados no gráfico 3, revelam,
basicamente, dois picos de eluição em ambos os grupos.
Notamos que a população de ácido hialurônico (primeiro pico mais
bem observado) eluiu na mesma concentração de sal nos dois grupos. O
segundo pico, no entanto, se dá em concentrações maiores e distintas para
os dois grupos. Esta é a população de GAGs com maior densidade de carga
negativa, portanto GAGs sulfatados. Assim, quando comparamos as duas
curvas, notamos um claro predomínio de GAGs sulfatados.
37
Gráfico 3: Cromatografia de troca iônica em Mono Q (FPLC) dos
GAGs extraídos de rins de coelhos, mostrando as curvas obtidas do grupo
controle e do grupo submetido à dieta hipercolesterolêmica.
20 40 60 80 100
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Abs
525 n
m
Hipercolesterolêmico Controle
Rim coelho – pool
Hipercolesterolêmico e Controle
Conce
ntr
ação
de
NaC
l
(m
ola
r)
38
Tabela 3: Composição média das sub-populações de GAGs ao final do
estudo, expressos em ng/mg de tecido seco de rim.
A tabela mostra os valores encontrados de GAGs totais, GAGs
sulfatados e GAGs não sulfatados nos dois grupos estudados. Pode-se
observar que os valores dos GAGs totais estão significativamente
diminuídos no grupo hipercolesterolêmico (p<0,05, teste T), e que o valor
relativo dos GAGs sulfatados se revelou bem menor no grupo que recebeu a
dieta hiperlipêmica (p<0,01, X²).
Controle
Hipercolesterolêmico
sulfatados 670 167,79
não sulfatados 74,5 42,21
total 744,5 210
39
3.4-Avaliação do Conteúdo de Colágeno pela Quantificação de
Hidroxiprolina:
O conteúdo de colágeno, avaliado pela dosagem de hidroxiprolina em
µg/mg de tecido seco de rim, foi de 1,483±0,59 para o grupo controle e de
1,570±0,42 para o grupo hipercolesterolêmico. Tais resultados, comparados
os dois grupos em estudo, não se mostraram com diferença estatisticamente
significativa, como se verifica no gráfico 4.
Gráfico 4: Conteúdo de hidroxiprolina nos rins de coelhos dos grupos
normal e hipercolesterolêmico.
Hidroxiprolina
Controle Hipercolesterolemia
1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
H
O-P
ro(µ
g)/
Pes
o s
eco(m
g)
Hidroxiprolina
Controle Hipercolesterolemia
40
VI-DISCUSSÃO
A íntima relação entre GAG, aterosclerose e rim tem norteado as
pesquisas ao longo dos últimos anos. A aterosclerose é doença inflamatória
crônica que acomete a camada íntima arterial. No homem está associada a
outros estados de perturbação da saúde com os quais estabelece ora uma
relação de causa, ora de efeito. A importância de não somente reconhecer a
existência mas, acima de tudo, conhecer as alterações que esta entidade
clínica provoca na homeostase do organismo, tem implicação na morbidade
e na mortalidade da população. Procuramos investigar, em um modelo de
aterosclerose em coelho, como a hipercolesterolemia modifica a composição
dos GAGs e a histologia do tecido renal, assim interferindo no processo
aterogênico.
Foi observado que, apesar de os nossos animais terem recebido
uma dieta hipercolesterolêmica ad libitum e terem se apresentado com peso
corporal maior do que o inicial ao final das oito semanas, tal variação não
foi significativa. Portanto, embora nossos animais devam ser chamados de
não obesos, contam com os efeitos da dieta à qual foram submetidos, uma
vez que desenvolveram significativa hipercolesterolemia.
Sabe-se que coelhos alimentados com dieta rica em colesterol
desenvolvem rapidamente (três a seis semanas) lesões arteriais que
compartilham características semelhantes às placas de gordura encontradas
nos seres humanos 60. Em nosso estudo, a análise histológica dos rins não
41
encontrou modificações grosseiras na estrutura das artérias e arteríolas,
apenas algumas áreas de espessamento arteriolar. Igualmente, as artérias
renais não apresentavam placas ateromatosas no momento do sacrifício do
coelho embora houvesse lesões na aorta dos animais (dados não
apresentados).
Os GAGs subendoteliais são sabidamente responsáveis pela
retenção de LDL na camada íntima arterial , sendo este um passo
fundamental no estágio inicial da aterosclerose 13. Além disto, a quantidade
e a composição dos GAGs podem sofrer alterações à medida em que as
lesões ateroscleróticas se desenvolvem 61. Em 2007, Tovar e cols. 62
demonstraram que coelhos alimentados com dieta hiperlipemiante por 8
semanas surpreendentemente apresentavam menor interação das
moléculas de LDL com os GAGs extraídos de suas aortas. Embora o
conteúdo e a composição destas moléculas não tenha se mostrado diferente
entre o grupo hipercolesterolêmico e o normal, foi observada a ocorrência de
cadeias de GAGs de tamanho reduzido, o que poderia explicar a menor
interação 62. A literatura nos mostra que a distribuição renal dos GAGs tem
sido estudada ao longo de décadas, sobretudo em modelos experimentais.
Já é consenso que o ácido hialurônico predomina na medula renal 63,
sobretudo na medula interna 42, e que o heparan sulfato está presente em
maior quantidade na membrana basal glomerular 44 64-68. Em nosso trabalho,
verificamos redução significativa no conteúdo total de GAGs extraídos dos
rins dos coelhos do grupo hipercolesterolêmico. Esta redução foi às custas
dos GAGs sulfatados, como se pode ver pela observação do gráfico 3. Note-
se que os GAGs sulfatados experimentaram redução uniforme nos dois
grupos, ou seja, não houve predomínio entre as subpopulações (HS e CS e
42
DS), como se verifica na tabela 2. Em trabalho com ratos diabéticos,
Karasawa encontrou aumento transitório no CS na MBG enquanto o HS
diminuiu em 10 meses de diabetes. Por outro lado, estudos utilizando
técnicas bioquímicas para quantificar o conteúdo de GAGs de rins humanos
obtidos em necrópsia demonstraram que a MBG de pacientes diabéticos
continha menos GAG que a dos rins dos não-diabéticos 69. Como os nossos
coelhos hipercolesterolêmicos desenvolveram elevação significativa da
glicemia, podendo ser classificados como diabéticos, poderiam estar
exibindo alterações bioquímicas compatíveis com esta condição. Mas seria
a redução de GAGs sulfatados na MBG, associada ao estado de
hiperglicemia, suficiente para explicar uma redução tão intensa nos GAGs
totais? Achamos que não. Sem dúvida, as alterações matabólicas impostas
pela dieta hiperlipêmica foram responsáveis ou por uma redução na síntese
de GAGs sulfatados ou por sua maior destruição. Um aspecto interessante
de ser estudado é como se comporta a biodisponibilidade das enzimas
envolvidas na biossíntese dos GAGs arteriais nos coelhos alimentados com
dieta hipercolesterolêmica. Por outro lado, enzimas relacionadas com o
processo de degradação das glicosaminoglicanas, como a hialuronidase,
podem apresentar atividade exacerbada nos rins dos animais
hiperlipêmicos, uma vez que eles possuem menor quantidade de GAGs. As
alterações ateroscleróticas, por sua vez, não nos parecem capazes de
justificar a redução maciça no conteúdo total dos glicosaminoglicanos nem
tampouco a desproporção entre os GAGs sulfatados e não sulfatados pois,
como já mencionado, não se verificaram alterações arteriolares que
pudessem corroborar este achado nem houve esclerose e fibrose
glomerulares significativas.
43
Em doenças como Diabetes Mellitus ou em situações de
hipercolesterolemia está estabelecida a presença de albuminúria, com
trabalhos demonstrando redução de heparan sulfato na matriz intersticial e
na membrana basal glomerular 45 70 nestas situações. Esta redução na
concentração de heparan sulfato na membrana basal foi associada à
fisiopatologia da albuminúria do Diabetes Mellitus e de outras
glomerulopatias caracterizadas por proteinúria como, por exemplo, a
Síndrome Nefrótica Congênita 45 70 71, na medida em que atuam nas
propriedades de seletividade por carga da parede capilar glomerular. Mais
recentemente, no entanto, dados têm demonstrado que as alterações no
heparam sulfato, tanto em sua estrutura como em sua quantidade, podem
não ser um fator na gênese da proteinúria 48 49. Tal fato pode ser importante
mas não foi estudado por nós, já que desenvolvemos um modelo
primariamnete de hipercolesterolemia, tentando correlacionar com a
histologia, não avaliando proteinúria e nem a excreção urinária dos GAGs.
Modelos animais têm demonstrado claramente a relação causal
entre dislipidemia e injúria glomerular que podem levar à
glomeruloesclerose72-75. Henegar demonstrou que a principal característica
glomerular de cães obesos submetidos a 7-9 semanas de dieta
hiperlipemiante foi um aumento marcante no espaço de Bowman 30. Da
mesma forma, encontramos em nosso trabalho aumento do tamanho
glomerular (mais às custas da expansão da cápsula de Bowman que do
aumento celular glomerular, como visto no gráfico 1). Já no trabalho de
Henagar foi observado um aumento na proliferação das células
glomerulares por método de imuno-histoquímica para detecção de antígeno
nuclear de proliferação celular (PCNA), aumento de matriz mesangial,
44
espessamento da membrana basal glomerular e expressão aumentada do
fator β transformador do crescimento (TGF-β) 30. Em nosso trabalho, não
observamos diferença estatisticamente significativa entre o número de
células glomerulares nos grupos estudados mas observamos discreto
alargamento do interstício renal por edema e infiltrado mononuclear leve
(macrófagos), além de túbulos discretamente tumefeitos. Estas alterações
guardam semelhanças entre si mas não se podem comparar nossos
resultados com o trabalho mencionado anteriormente pela diferença das
técnicas empregadas.
Assim, a partir de um modelo de aterosclerose em coelho, pudemos
observar evidente associação entre hipercolesterolemia e a intensa redução
dos GAGs totais do tecido renal. Este achado bioquímico ocorreu em curto
espaço de tempo, em paralelo à discretas alterações histológicas. A
hiperglicemia, por sua vez, embora ausente em outros modelos animais de
hipercolesterolemia que, igualmente, apresentaram as mesmas alterações
histológicas aqui descritas, merece ser considerada. Desta forma, não
podemos afirmar que não tenha havido participação dessa altaração
metabólica para os achados bioquímicos. Afinal, embora o modelo tenha
sido primariamente de aterosclerose com o desenvolvimento subseqüente
de hipercolesterolemia, o achado de hiperglicemia significativa associado
indica que nosso modelo se assemelha a um de síndrome metabólica.
Finalmente, o achado de que a hipercolesterolemia promove menor
interação entre GAG de aorta e LDL colesterol, associado à conclusão de
que o meio hipercolesterolêmico reduz os GAGs presentes no rim, apontam
para a necessidade de verificar a interação de GAG renal e LDL. Será que
45
as cadeias de GAG renal estão diminuídas em tamanho? Será que a sua
capacidade de ligação com LDL está reduzida? Será que o tempo de
exposição à dieta hiperlipêmica alteraria o estado dessa interação? E, ainda,
uma intervenção dietética reverteria esta interação? São questões a serem
respondidas com base em achados de trabalhos subseqüentes.
46
VII- CONCLUSÃO
Este estudo avaliou as alterações renais precoces em coelhos
submetidos à dieta hiperlipemiante por oito semanas, tendo observado no
grupo de estudo uma redução acentuada no conteúdo total de
glocosaminoglicanos, principalmente à custa dos sulfatados. As alterações
histológicas induzidas pela dieta foram discretas e caracterizaram-se por
diminuição do espaço urinário, discreto alargamento intersticial por infiltrado
mononuclear inflamatório e expansão da cápsula de Bowman, sem
anormalidades do conteúdo renal de colágeno.
47
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