Rui Manuel Pinto

Colheita, tratamento de amostras, testes e interpretação de resultados na Covid-19

Do total de casos ativos, 96.7% encontram-se a recuperar no domicílio, 3.8% em enfermaria e 0.4% em cuidados intensivos.

“Com uma média diária de 13.670 testes, os atuais números mostram “a tendência ascendente do número de testes no mês de julho em comparação com o mês de junho”.

“A rede laboratorial passou de cerca de 20 laboratórios para 98 em julho, com o alargamento a todo o territórionacional, no público, privado, universidades e centros de investigação”,

Para o diagnóstico laboratorial de SARS-CoV-2 está indicada a colheita de produtos biológicosdo trato respiratório (superior e/ou inferior, de acordo com o contexto clínico)

Trato respiratório superior

Exsudado da nasofaringe e exsudado da orofaringe colhido com zaragatoa em meio de transporte para vírus. Osdois produtos biológicos colhidos com zaragatoa devem ser colocados no mesmo tubo contendo meio detransporte para vírus (2-3 ml) ou, em alternativa, em contexto de escassez de meio de transporte, na mesmaquantidade de soro fisiológico. Deve dar-se prioridade à colheita do exsudado da nasofaringe (ou aspiradonasofaríngeo ou lavado nasal) quando não for possível a colheita dos dois exsudados.

Trato respiratório inferior

i. Aspirado endotraqueal ou lavado bronco-alveolar, em doentes com doença respiratória grave, sobventilação mecânica invasiva.

ii. Pode ser colhida expetoração se houver tosse produtiva.

Em idade pediátrica deve colher-se um exsudado da nasofaringe (sendo por vezes mais fácil, nestas idades, a colheita deaspirado ou lavado nasal) e uma colheita de exsudado da orofaringe.

Exsudado da nasofaringe: Inserir a zaragatoa numa das narinas

paralelamente ao palato até sentir uma ligeira resistência.

Deixar a zaragatoa durante alguns segundos para absorção das

secreções. Remover lentamente com movimento de rotação.

Pode repetir a colheita na outra narina.

Exsudado da orofaringe: Inserir a zaragatoa na cavidade oral e

esfregar a parede faríngea e os pilares da orofaringe. Evitar

friccionar o palato mole ou tocar com a zaragatoa na língua

One study suggested that viral RNA levels are higher and RNA is more frequently detected in nasal specimens as compared

to oral specimens, however this finding was based on a small number of nasal swabs tested.

A COVID-19 investigation team in the US comparing 117 pairs of nasopharyngeal and oropharyngeal specimens from 12

patients simultaneously, found that 32 pairs were discordant with one test positive and the other negative: the

nasopharyngeal specimen tested positive in 66% of those pairs compared with 34% for the oropharyngeal specimen.

Another study did not show higher viral RNA levels in nasopharyngeal compared with oropharyngeal specimens.

Preliminary results from a pre-print article not yet peer-reviewed showed that the most accurate sample for the

diagnosis of SARS-CoV-2 was sputum, followed by nasal swabs and throat swabs.

A meta-analysis of saliva testing studies found 91% (95%CI = 80%-99%) sensitivity for saliva tests and 98% (95%CI 89%-

100%) sensitivity for nasopharyngeal swab tests in previously confirmed COVID-19 infected patients, with moderate

heterogeneity among studies.

Another study showed that saliva was the most appropriate sample for diagnosis of SARS-CoV-2. Saliva offers a non-

invasive specimen that can also be considered for self-sampling. In a situation where a nasopharyngeal or other above

mentioned specimen is not acceptable, saliva could be considered as an alternative specimen.

Os tubos e recipientes devem ser desinfetados exteriormente com solução de hipoclorito de sódio, na concentração original

de cloro livre a 5%, na diluição de 1/50 (1 parte de lixivia em 49 partes iguais de água) e de seguida, com álcool a 70%;

Por fim, a tampa do tubo deve ser selada com película parafilme;

Nucleic acid tests detect the presence of viral RNA. Typically, these use an amplification step based on rRT-PCR

(Amplificação de ácidos nucleicos por reação em cadeia da polymerase em tempo real, precedida de transcrição reversa).

Antigen tests detect the presence of a viral antigen, typically part of a surface protein.

Antibody tests detect the presence of antibodies generated against SARS-CoV-2. The three most used assays are enzyme-

linked immunosorbent assays (ELISA), chemoluminescence assays (CLIA) and lateral flow assays (LFA).

Virus neutralisation tests are used, which can specifically detect neutralising antibodies, but this is mainly used for assay

validation and research. Preliminary reports on ELISA assays have shown good correlation of antibody titration results

with virus-neutralising antibodies

Tipos de testes laboratoriais quanto ao componente biológico detetado

Componentes do vírus

Anticorpos anti-SARS-CoV-2:

SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE (analítica ≠ clínica):

Conhecer a sensibilidade e especificidade do ensaio/teste pode ajudar na

interpretação apropriada quando se utiliza um teste de laboratório para auxiliar

o estabelecimento de diagnóstico.

Sensibilidade Clínica: fracção daqueles indivíduos com uma doença específica

que o ensaio confirma

= 100 x PV/(PV + FN)

Especificidade Clínica: fracção daqueles indivíduos sem uma doença

específica que o ensaio confirma

= 100 x NV/(NV + FP)

A alteração do Limite de Decisão Clínica afecta a sensibilidade e a especificidade

“Dado um resultado positivo, em quantos casos um utente tem a doença? E dado um

resultado negativo, qual é a probabilidade de o utente não ter a doença?

O valor preditivo do teste positivo e do teste negativo respondem a estas questões.

O valor preditivo de um teste combina a prevalência da doença com os testes de

sensibilidade e especificidade.

Valor preditivo do teste positivo = 100 x PV/ (PV + FP)

Valor preditivo do teste negativo = 100 x VN/ (VN + FN)

A large number of commercial detection assays for SARS-CoV-2 RNA or antigen and serological assays for SARS-CoV-2 specific

antibodies are being placed on the market or are potentially exportable to EU countries with CE-IVD marking (Directive

98/79/EC).

However, information on their clinical performance is still limited and further scientific validation of their diagnostic accuracy,

i.e. clinical sensitivity and specificity, is a priority.

The Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) (https://www.finddx.org/covid-19/pipeline), WHO Collaborating Centre

for Laboratory Strengthening and Diagnostic Technology Evaluation, has received over 600 manufacturers’ submissions for

IVDs, and has been performing independent clinical evaluations in a few FIND collaborating hospitals on a subset of them.

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL: COVID-19

O diagnóstico laboratorial de referência do SARS-CoV-2 é realizado através de testes de amplificação de ácidos nucleicos,como a reação em cadeia da polimerase em tempo real, precedida de transcrição reversa (rRT-PCR)

O tratamento dos produtos biológicos e a inativação do RNA viral deve ser realizado em laboratório de biossegurança denível 2 (BSL2) e utilizando uma câmara de fluxo laminar de classe II.

Os testes de rRT-PCR para a deteção do SARS-CoV-2 disponíveis podem incluir como alvo os genes quecodificam para a nucleoproteína (N), o invólucro (E), a espícula (S), a RNA dependente RNA polimerase(RdRp).

Um caso de COVID-19 considera-se confirmadolaboratorialmente perante um teste que apresente:

Resultado de rRT-PCR para SARS-CoV-2 positivo para pelomenos dois alvos distintos do genoma, dos quais pelomenos um específico para SARS-CoV-2 (que distinga dosoutros coronavírus, incluindo o SARS-CoV-1).

Se surgir um caso com um resultado de inconclusivo oucom um valor de ciclo de amplificação do rRT-PCRsuperior a 35, recomenda-se a repetição do teste e/ouda colheita do produto biológico.

Para além dos controlos internos, sugere-se, sempre quepossível, a co-amplificação e deteção de DNA humanono produto biológico. A co-deteção pressupõe que oRNA viral poderá ser detetado, se presente no momentoda colheita.

Termociclador RT-PCR “rápido”

Programas de AEQ

PNAEQ - INSA

Dependendo da gravidade da doença e de fatores intrínsecos à pessoa infetada (por exemplo: fatores genéticos,resposta do sistema imunitário, comorbilidades, idade, etc.), a excreção e deteção do RNA viral pode ser mais oumenos prolongada.

A probabilidade de um resultado positivo varia com o tipo de amostra biológica, a qualidade da colheita e a dinâmicada carga viral, ou seja, da quantidade de RNA viral presente numa determinada localização anatómica e em cada fasee gravidade da doença. Os estudos publicados até à data, mostram que a probabilidade de um teste positivodecresce com o número de dias após o início dos sintomas.

Adicionalmente, é relevante ter em consideração que a evidência atual mostra que o RNA de SARS-CoV-2 pode seridentificado 1-2 dias antes do início dos sintomas, podendo persistir, nos casos moderados, até 8-12 dias depois doinício da doença (embora existam casos reportados de deteção de RNA após o 28.º dia de infeção). Nos casos graves,a dinâmica da carga viral, no que se refere ao período de excreção até a clearance viral, pode estar alterada e sermais prolongada comparativamente com o que acontece nos casos moderados.

Os testes de deteção de antigénio, por princípio, têm umasensibilidade menor do que os testes moleculares (rRT-PCR), particularmente quando a carga viral é mais baixa.

A fase em que com maior probabilidade é possíveldetetar um antigénio viral num indivíduo infetado,utilizando um teste rápido de deteção de antigénio, éaquela em que a carga viral é tipicamente mais elevada.

Ensaio ImunoEnzimático

Electroquimioluminescência

Os testes serológicos, automatizados e rápidos, detetam a presença de anticorpos IgA, IgM e IgG para o SARS-CoV-2.Sendo testes de deteção da resposta imunológica, não estão recomendados para o diagnóstico de novos casos de COVID-19. De facto, a resposta imunológica na infeção por SARS-CoV-2 é detetada a partir da segunda semana de infeção, ouseja, cerca de 8 a 10 dias após o início dos sintomas. Não obstante, alguns estudos mostraram a identificação de IgM apartir do quinto dia após o início da doença.

A seroconversão da IgM e IgG parece ocorrer entre a terceira e quarta semana depois do início da infeção. Depois disso,os títulos de IgM diminuem, comparativamente com a IgG que pode persistir para além das sete semanas após a infeçãopor SARS-CoV-217,18 (Anexo III).

Até à data, a evidência disponível não permite inferir sobre a natureza e duração dos anticorpos produzidos comoresposta à infeção por SARS-CoV-2, em indivíduos sintomáticos ou assintomáticos, e se esses anticorpos conferemimunidade de longa duração.

O resultado dos testes de deteção de anticorpos quando interpretados isoladamente não exclui a possibilidade dapessoa estar infetada. Apesar da sua limitada utilidade clínica, estes testes podem ser utilizados em estudosepidemiológicos populacionais (de seroprevalência) e de investigação.

SINAVElab - Notificação laboratorial obrigatória de doenças transmissíveis(resultados obtidos por rRT-PCR: Negativos e Positivos)

A Portaria nº 22/2016 de 10 de fevereiro, tornou obrigatória a partir de 1 de janeiro de 2017, a notificação laboratorial dos casos de doenças transmissíveis de notificação obrigatória (Doenças de Declaração Obrigatória), através do Sistema Nacional de Vigilância Epidemiológica) SINAVE. Os laboratórios do setor público e privado, passam a integrar a rede de vigilância de saúde pública, destinada a identificar precocemente casos e surtos de doenças transmissíveis, suscetíveis de constituir uma emergência em saúde pública.

Situações particulares – Responsabilidade pela notificação laboratorial

Nas situações particulares, em que mais que um laboratório intervém na realização de análises laboratoriais dedoenças transmissíveis de notificação obrigatória num mesmo caso de doença, a responsabilidade pela notificaçãolaboratorial é do laboratório responsável pela comunicação do resultado laboratorial ao doente/médico assistente,salvo se existir protocolo escrito que determine outro procedimento alternativo.