COMUNICAÇÕES LIVRES

Congresso de Ciências Veterinárias [Proceedings of the Veterinary Sciences Congress, 2002], SPCV, Oeiras, 10-12 Out.

COMUNICAÇÕES LIVRES Segurança Alimentar pp. 491 - 532

136. Listeria monocytogenes - Estudo da influência de alguns parâmetros e o seu controlo em queijaria

[Listeria monocytogenes - The study of the influence of some parameters and its control in cheese making] - Matos, J.E.; Dapkevicius, L.M.; Santos, S.C.

491

137. Campylobacter jejuni e Campylobacter coli - Perigo microbiológico associado à carne de aves [Campylobacter jejuni and Campylobacter coli, an important foodborne hazard associated with poultry] - Gomes, C.; Santos, A.

493

138. Prevenção dos perigos microbiológicos ligados às carnes picadas [Prevention of microbiological hazards concerning minced meat] - Gomes, C.; Espinha, A.

495

139. Produtos de pesca provenientes de países terceiros – Avaliação dos perigos microbiológicos [Microbiological hazards in fish products from third countries] - Gomes, C.; Loja, F.

497

140. Influência de alguns factores na qualidade microbiológica de carne de javali [Influence of some factors in the microbiological quality of wild boar meat] - Veloso, G.; Correia, H.

499

141. Serótipos de Escherichia coli e de Salmonella isolados e a sua evolução nos últimos anos (1995 - 2001) [Escherichia coli and Salmonella serotypes isolated and its evolution in the last years (1995 - 2001)] - Temudo, P.; Vieira, R.

501

142. Comportamento de estirpes de Escherichia coli isoladas de frangos [Behavior of Escherichia coli strains isolated from chicken] - Costa, D.; Poeta, P.; Rodrigues, J.

503

143. Detecção directa e contagem de E. coli em bivalves por "Fluorescent In Situ Hybridization" [Direct detection and enumeration of E. coli in Shellfish by Fluorescent In Situ Hybridization] - Oliveira, M.; Bernardo, F.

505

144. Quantificação de aminoácidos livres em presuntos de cura rápida por cromatografia gasosa [Quantification of free amino acids in short ripening dry-cured hams by gas chromatography] - Alfaia, C.M.P.M.; Quaresma, M.A.G.; Xavier, A.F.A.; Partidário, A.M.C.; Mimoso, M.J.C.; Prates, J.A.M.

507

145. Análise de risco em segurança alimentar - resíduos de produtos veterinários [Risk assessment in food safety - residues of VMP] - Fontes, E.M.

509

146. Modelos biológicos de avaliação de risco de xenobióticos em produtos animais processados [Biologic models of risk assessment in processed animal products] - Moreira, A.; Fontes, E.M.

511

147. O sistema nacional de farmacovigilância e toxicologia veterinária [The national system for pharmacovigilance and veterinary toxicology] - Ramos da Costa, H.

513

148. Actividades de biotransformação em culturas de hepatócitos. Aplicação a estudos farmaco-toxicológicos [Biotransformation activities in hepatocyte cultures. Aplication to pharmaco-toxicological studies] - São Braz, B.; Fontes, E.M.; Jorge Silva, A.

515

149. Agonistas beta-adrenérgicos – uso e abuso [Beta-adrenergic agonists - use and misuse] - Cruz, C.; Barbosa, J.

517

150. Anti-parasitários – medicamentos de utilização veterinária sujeitos a controle no âmbito do plano nacional de controle de resíduos [Antiparasitic agents – veterinary drugs included on national residues control plan] - Ferreira, M.L.; Vacas de Carvalho, S.; Cruz, C.

519

151. Análise de resíduos de Nitrofuranos em tecidos edíveis de animais por LC-MS/MS [Residues analysis of nitrofurans in muscle of animal origin by LC-MS/MS] - Barbosa, J.; Ferreira, M.L.

521

152. Detecção e confirmação da presença de corticosteroides em urina de animais utilizados na alimentação humana por LC-MS/MS [Detection and confirmation of corticosteroids in urine samples of animal origin by LC-MS/MS] - Barbosa, J.; Vacas de Carvalho, S.

523

153. Detecção de resíduos de fenilbutazona em amostras de músculo por HPLC/DAD [Residue detection of phenylbutazone in muscle samples by HPLC/DAD] - Barbosa, J.; Cruz, C.

525


- 490 -

154. Detecção e confirmação da presença de resíduos de gestagénios em gordura de origem animal por GC-MS [Detection and confirmation of gestagens residues in fat samples by GC-MS] - Barbosa, J.; Carvalho, I.; Franco, M.

527

155. Resíduos de substâncias antibacterianas em carne de suíno [Antibacterial residues in swine meat] - Neves, E.G.; Fontes, E.M.

529

156. Desenvolvimento de um modelo para determinação de custos de produção nas indústrias de transformação de carne [Development of a model to determine the costs of production in the meat transformation industries] - Matos, T.J.S.; Barreto, A.S.F.H.; Bernardo, F.M.A.

531


- 491 -

Segurança Alimentar

Listeria monocytogenes - Estudo da influência de alguns parâmetros e o seu controlo em queijaria

José Estevam Matos, Lurdes Maria Dapkevicius, Susana Cristina dos Santos

Departamento de Ciências Agrárias, Universidade dos Açores, Angra do Heroísmo

Até 1980 a Listeria monocytogenes era relacionada fundamentalmente com casos de doença animal, situação esta que tem vindo a ser alterada visto que esta bactéria tem sido incriminada em casos de doença em humanos. São principalmente os alimentos que surgem como veículos de contágio, designadamente os queijos.

Os objectivos deste trabalho consistiram no estudo do comportamento da L. monocytogenes relativamente às condições e factores do meio relevantes em queijaria.

Os resultados obtidos permitem concluir que, sempre que as contaminações no queijo se devam a um número muito elevado de bactérias, nenhum dos métodos de controlo estudados poderá garantir, só por si, a sua inocuidade.

A pasteurização revelou ser eficaz apenas quando nível de contaminação do leite foi baixo. No que diz respeito à embalagem sob vácuo este não foi, por si só, um método eficaz de controlo. Quanto à concentração de sal e o pH a bactéria apresentou uma maior aptidão para se multiplicar na presença de algum de sal (NaCl) e sempre que o pH se manteve na zona neutra. Contudo, em meio ácido, e com concentração de sal superior a 1%, a bactéria não cresceu.

No caso dos queijos não maturados, com pouco sal, ou com um período de cura curto, só a pasteurização poderá garantir a sua inocuidade; devendo garantir-se, sempre, uma boa higiene de produção do leite e o controlo adequado das mamites; uma vez que, ficou demonstrado, quando o número de listerias foi muito elevado, nem mesmo a pasteurização pode garantir a sua completa eliminação.


- 492 -

Listeria monocytogenes - The study of the influence of some parameters and its control in cheese making

José Estevam Matos, Lurdes Maria Dapkevicius, Susana Cristina dos Santos

Departamento de Ciências Agrárias, Universidade dos Açores, Angra do Heroísmo

Until 1980 L. monocytogenes was recognized as a bacterium that caused illness in farm animals. More recently, it has been identified as the cause of listeriosis in humans. The greatest threat of listeriosis is from ready-to-eat products namely cheeses.

The objective of this study was to investigate the behaviour of L. monocytogenes submitted to the environmental conditions usual in cheese making.

The results allow to conclude that, wherever the cheese contamination was due to a heavy number of listeria, no one of the methods studied, by its one, was sufficient to guarantee the safety of the cheese.

Pasteurisation was efficient only when the level of contamination was low. Packaging under vacuum was not, alone, an efficient mean of control. In relation to the pH and the salt concentration, bacteria showed better growing in presence of salt (NaCL) and whenever the pH was kept within the neutral zone. However, in acid environment, and with salt concentrations above 1%, listeria was not able to grow.

In the case of non-maturated cheeses, with low salt content, or with short periods of maturation, only pasteurisation will allow safety. A good hygiene of milk production, and a good control of mastitis, should be guaranteed at all times. It was demonstrated that a heavy number of listeria was not eliminated by pasteurisation.


- 493 -


Campylobacter jejuni e Campylobacter coli - Perigo microbiológico associado à carne de aves

[Campylobacter jejuni and Campylobacter coli, an important foodborne hazard associated with poultry]

C. Gomes, A. Santos

Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV), Estrada de Benfica, 701. 1549-011 Lisboa

A segurança alimentar está relacionada com perigos associados à carne de aves, ovos e outros produtos de origem avícola que fazem parte da alimentação do Homem, os quais podem ser introduzidos durante a produção, transporte, armazenamento, distribuição ou processamento desses produtos.

As aves podem albergar no tracto intestinal diferentes agentes patogénicos responsáveis por toxinfecções alimentares, nomeadamente o Campylobacter jejuni, o qual tem sido referenciado, nos últimos anos, como uma das causas mais comum de toxinfecção alimentar associada à carne de aves.

Estudos efectuados em todo o mundo, indicam que as aves e em especial os frangos são um importante reservatório de Campylobacter jejuni sendo os produtos alimentares deles derivados veículos da infecção humana. De acordo com Tauxe (1992), a maioria das infecções são esporádicas e estão associadas ao consumo ou ao manuseamento de carne de aves. A comparação entre estirpes isoladas do Homem e dos frangos revelou resultados similares em muitos estudos.

Neste estudo, foi avaliada a prevalência de Campylobacter jejuni/ Campylobacter coli em frangos, a nível da produção e do matadouro de uma determinada região de Portugal, bem como a resistência das estirpes isoladas relativamente a 11 agentes antimicrobianos.

Os resultados indicaram uma incidência elevada da infecção por Campylobacter nas aves a nível da produção. Isolou-se Campylobacter em 105 das 133 amostras de zaragatoas cloacais colhidas semanalmente durante as últimas 4 semanas, tendo-se observado uma taxa de isolamento de 100% a partir da 3ª semana de vida. A espécie predominante foi o Campylobacter jejuni. A nível do matadouro, isolou-se Campylobacter de todas as zaragatoas cloacais colhidas após o escaldão e a refrigeração, sendo também aqui o Campylobacter jejuni a espécie dominante.

A maioria das estirpes isoladas foram sensíveis à estreptomicina e tetraciclina, mas resistentes ao ácido nalidixico, provavelmente devido ao uso abusivo de quinolonas a nível da produção. O uso indiscriminado de agentes antimicrobianos na industria avícola, pode conduzir ao desenvolvimento de estirpes resistentes, com sérias consequências para a saúde animal e humana.

A prevenção ou a redução deste tipo de perigos, associado à carne de aves, só pode ser conseguido através da implementação de códigos de boas práticas, especialmente ao nível da produção.


- 494 -


- 495 -


Prevenção dos perigos microbiológicos ligados às carnes picadas [Prevention of microbiological hazards concerning minced meat]

C. Gomes1 e A. Espinha2 1Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV), Estrada de Benfica, 701, 1549-011

Lisboa; 2Direcção de serviços de Higiene Pública Veterinária da Direcção Geral de Veterinária.

The microbiological hazards concerning meat and minced meat consumption are associated with the presence of pathogenic agents in these products. Worldwide, has occured foodborne diseases outbreaks with high costs for the consumers, associated with this pathogenic agents. The organisms more often isolated in foodborne diseases, concerning meat products, namely minced meat, are Salmonella, Campylobacter and enterotoxin-producing Staphylococcus. Concerning E. coli O157:H7, the interest has increased after publishing the high mortality rates in USA and UK outbreaks, related with uncooked hamburguers consumption.

The mentioned bacteria come from intestinal tract and skin of slaughtered animals, and the slaughtering process in use cannot be enough to prevent or remove these contaminants from the carcasses. If the hygienic conditions are not appropriate, the foodproducts, namely minced meat, can be a risk for human health.

The european policy has been oriented in order to ensure the implementation of food control systems at the chain production, by food business operator,. The competent Authorities should verify the correct application of this control.

The results presented in this study are based on the laboratory support given to Direcção Geral de Veterinária in bovine and swine minced meat, sampled in 30 processing plants, to verify the control systems implemented and to estimate the risk assessment.

Technical colaboration of P. Alves, J. Barahona, A. Sousa, A. Moita and other personal of the “Serviço de Microbiologia Alimentar”


- 496 -


- 497 -


Produtos de pesca provenientes de países terceiros – Avaliação dos perigos microbiológicos

[Microbiological hazards in fish products from third countries]

C. Gomes e F. Loja

Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV), Estrada de Benfica, 701. 1549-011 Lisboa

Fishery products are widely consumed by being rich in protein and considered an healthier alternative to meat consumption.

Portugal is one of the main entrance points of fish products (shellfish, crustacean and fish) from the third countries to be spent nationally and in other european countries.

The number of products getting in Portugal through the Board Inspection Post (BIF) has been increasing in last years. For this reason, is priority their control by sanitary inspection means, aiming prevention of consumer hazards caused by foodborne agents such as Salmonella, Vibrio cholerae ou Vibrio parahaemolyticus.

In a study performed on 656 samples of frozen fish products sampled by Lisbon’s BIF from January 1996 to March 1999, an high percentage of Salmonella and Vibrio negative samples were found and was deduced that these two organisms could happen less in fishery products.

These results were considered not much representative from the examined lots, because only one sample per lot was laboratory examined. According to NP4129 and to judge results, 5 subunits per lot had to be tested.

Now, we present the results from the year 2000 to 2001, from the sampling scheme of 5 subunits implemented by BIF, giving a chance of more reliable data.


- 498 -


- 499 -

Segurança alimentar

Influência de alguns factores na qualidade microbiológica de carne de javali

Gabriela Veloso 1 e Hermínio Correia 2

1 Faculdade de Medicina Veterinária. Rua Prof. Cid dos Santos, Pólo Universitário, Alto da Ajuda, 1300-477 – Lisboa, Portugal. <[email protected]>; 2 Direcção Regional de Agricultura da Beira

Interior, Castelo Branco.

A comercialização da carne de javali (Sus scrofa) é mais uma das formas de rentabilizar a caça. O nosso trabalho foi desenvolvido numa coutada portuguesa onde o sistema de caça ao javali utilizado foi a montaria. Neste estudo pretendemos avaliar o efeito da temperatura ambiente, do intervalo de tempo entre o abate e a evisceração e da zona corporal atingida pelo projéctil sobre o teor total de microrganismos aeróbios, e verificar se havia correlação entre o pH da carcaça e aqueles teores.

Após a evisceração e de cada animal colheram-se 43 amostras da superfície da cavidade abdominal (100 cm2) com zaragatoas de gaze e 43 amostras de músculo (10 gr.) da zona atingida pela bala por excisão, num total de 86 amostras.

Os mais elevados teores médios de microrganismos foram obtidos na superfície da cavidade abdominal, no intervalo de temperatura ambiente de 16-30 ºC (5,97 log UFC/cm2), no intervalo de tempo de 3-6 horas (5,88 log UFC/cm2) e quando o tiro foi abdominal (6,51 log UFC/cm2). Os teores microbianos obtidos na zona atingida pela bala foram sempre inferiores aos da cavidade abdominal, em qualquer das circunstâncias. Houve uma correlação directa entre os teores microbianos na superfície da cavidade abdominal e o pH da carcaça (r=0,666, η=46, H0: p<0.05).

Os resultados sugerem que a temperatura ambiente elevada, a evisceração tardia e o tiro abdominal contribuem não só para a passagem de microrganismos para a superfície cavidade abdominal como para o seu desenvolvimento, do que resulta menor capacidade de conservação da carne de javali.


- 500 -

Influence of some factors in the microbiological quality of wild boar meat

Gabriela Veloso1 and Hermínio Correia 2

1 Faculdade de Medicina Veterinária. Rua Prof. Cid dos Santos, Pólo Universitário, Alto da Ajuda, 1300-477 – Lisboa, Portugal. <[email protected]>; 2 Direcção Regional de Agricultura da Beira

Interior, Castelo Branco.

Trading of wild boar (Sus scrofa) meat is a way to profit from hunting. Our study was carried out in an hunting enterprise. The aim of our work was to evaluate the influence of environmental temperature, time interval between death and evisceration and body area wounded by the bullet on total aerobic microorganisms counts, and check if there was correlation between carcass pH and those microorganisms counts.

After evisceration and from each animal, gauze swabs were taken (area of 100 cm2) from the inner abdominal surface (n=43) and 10 gr. were taken from the muscle (n=43) area wounded by the bullet.

Total aerobic microorganisms counts were found to be highest in the inner abdominal surface, when the environmental temperature was between 16 - 30 ºC (5,97 log cfu/cm2), when the time interval between death and evisceration was 3-6 hours (5,88 log cfu/cm2) and when the body area wounded by the bullet was the abdomen (6,51 log cfu/cm2). Total aerobic microorganisms counts obtained in muscle area wounded by the bullet were lower than that obtained in the inner abdominal surface, in all occasions. There was a direct correlation between total aerobic microorganisms counts in the inner abdominal surface and the pH of the carcass (r=0,666, η=43, H0:p<0,05).

These results suggest that microorganisms may spread from gut to the inner abdominal surface and develop when the environmental temperature is high, the evisceration is delayed and the shot is abdominal, which can be responsible for the reduction of wild boar meat shelf life.


- 501 -


Serótipos de Escherichia coli e de Salmonella isolados e a sua evolução nos últimos anos (1995 - 2001)

Temudo, P. e Vieira, R..

Departamento de Bacteriologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV), Estrada de Benfica, 701, 1549-011 Lisboa, Portugal

No Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV), o Sector de Enterobactérias do Departamento de Bacteriologia é responsável pela identificação e caracterização serológica e genotípica dos isolados de Salmonella e de Escherichia coli (E. coli). As estirpes de Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium isoladas são fagotipificados. A pesquisa de factores de virulência, nomeadamente adesinas, enterotoxinas citotónicas (LT e STa) e citotoxina (VT) de E. coli, abrange estirpes provenientes de suínos, bovinos, ovinos e caprinos.

E. coli enteropatogénico para os animais domésticos tem sido classificado em duas categorias: enterotoxigénica (ETEC) e verotoxigénica (VTEC). As estirpes ETEC sintetizam a toxina termolábil (LT) e/ou as termoestáveis STa e STb, e causam diarreia em vitelos, carneiros e leitões. As estirpes VTEC podem produzir diferentes tipos de verotoxinas, algumas delas semelhantes à Shiga-toxina sintetizada pela Shigella dysenteriae tipo 1: VT1 e VT2 são reconhecidas como causa da colite hemorrágica (HC) e do sindroma urémico-hemolítico (HUS) no homem, que contrai a infecção através do consumo de alimentos contaminados. A VT2v é responsável pela doença dos edemas nos suínos. Os isolados de Salmonella e E.coli enteropatogénicas são submetidos a um estudo de resistência aos agentes antimicrobianos.

O objectivo deste estudo é a divulgação dos dados laboratoriais disponíveis, evidenciando os serótipos mais comumente encontrados e a sua evolução nos últimos anos. As aves são a espécie animal responsável pela maioria dos isolamentos de Salmonella. Os serótipos mais frequentemente encontrados nos últimos anos, quer de origem animal, quer de origem alimentar, são por ordem decrescente de frequência, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium e a variante monofásica Salmonella 4,5 : i : - . Outros serótipos, nomeadamente Salmonella Hadar, Salmonella Derby, Salmonella Infantis e Salmonella Anatum, apresentam uma frequência inferior.

Nos suínos, E. coli O149: F4ac continua a ser o serótipo mais frequentemente isolado que, por estar associado às enterotoxinas LT e STa, é um dos principal agentes bacterianos responsáveis pelas diarreias que ocorrem nos leitões após o desmame. Nos ruminantes, embora em número reduzido, são isoladas estirpes patogénicas atípicas, produtoras de VT e STa nos vitelos e de VT nos ovinos.


- 502 -

Escherichia coli and Salmonella serotypes isolated and its evolution in the last years (1995 - 2001)

Temudo, P. e Vieira, R..

Departamento de Bacteriologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV), Estrada de Benfica, 701, 1549-011 Lisboa, Portugal

The Enterobacteria Service at LNIV Bacteriology Department is responsible for the identification, serological and genetical characterisation of Salmonella and Escherichia coli (E. coli) solates. Serotyping and the investigation of virulence factors, namely adesins, cytotonic enterotoxins (LT e Sta) and cytotoxin (VT) in E.coli strains, have been performed in clinical material from pigs, cattle, sheep and goats. Serotyping is performed on Salmonella strains of animal and food origin, as well as phagetyping on Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium serovars.

Toxigenic E. coli which cause infections in domestic animals have been classified into two categories: enterotoxigenic (ETEC) and verotoxigenic (VTEC). The ETEC strains synthesize thermolabile (LT) and/or thermostable (STa and STb) enterotoxins, and cause diarrhea in calves, lambs and piglets. The VTEC strains may produce different types of verotoxins some of them similar to Shiga-toxin synthesized by Shigella dysenteriae type 1: VT1 and VT2 are recognized as a cause of hemorrhagic colitis (HC) and the hemolytic-uremic syndrome (HUS) in humans, who contract infection following the consumption of contaminated foodstuffs. VT2v is responsible for the edema disease in pigs. Antimicrobial resistance patterns are done on Salmonella and E.coli enterotoxinogenic strains.

The aim of this study is to communicate the available laboratory data, showing the most common serotypes/serovars isolated and its evolution during the last years. The most part of Salmonella isolates are from poultry origin. The most frequently found, either from animal or foodstuff origins are Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and the monophasic variant Salmonella 4,5 : i : -. Other serotypes, namely Salmonella Hadar, Salmonella Derby, Salmonella Infantis e Salmonella Anatum, are also isolated.

E. coli O149: F4ac is the most frequently serotype isolated from pigs and it is found associated to enterotoxins LT and STa. Therefore it is one of the most important bacteria responsible for after weaning diarrhea in pigs. Atypical enteropathogenic E. coli strains have also been isolated from ruminants. They synthesize either thermostable enterotoxin (STa) or verotoxin (VT) in calves and VT in lambs.


- 503 -


Comportamento de estirpes de Escherichia coli isoladas de frangos

Costa, D.; Poeta, P. e Rodrigues, J.

ICETA-UTAD, Departamento de Higiene e Sanidade, Quinta de Prados, 5000-911 Vila Real

A resistência das bactérias aos antibióticos tem vindo a aumentar. Neste trabalho estudou-se o perfil de resistência a vários antibióticos em bactérias isoladas de frango embalado para comercialização.

Foram isoladas e identificadas 80 estirpes de Escherichia coli pelo teste IMVEC e sistema de galerias API 20E. As estripes foram submetidas ao teste de sensibilidade aos antibióticos, pelo método de difusão em meio sólido, de acordo com as normas do National Committee for Clinical Laboratory Standards. Os antibióticos ensaiados foram: ciprofloxacina (CIP 5µg), enrofloxacina (ENR 5µg), ácido nalidíxico (NA 30µg), tetraciclina (TE 30µg), cloranfenicol (C 30µg), gentamicina (CN 10µg), estreptomicina (S 10µg), neomicina (N 10µg), cefalotina (KF 30µg), flumequina (KF 50µg), ampicilina (AMP 10µg), furazolidona (FR 50µg), cotrimoxazol (SxT 25µg) e espiramicina (SP 100µg).

Os antibióticos aos quais se verificou resistência num maior número de estirpes foram TE (com 86,3% de estirpes resistentes), S (78,8%), NA (77,5%), SxT (72,5%), UB (63,7%), CIP (55,0%), AMP (56,2) e SP (47,5%). Por outro lado, um número reduzido de estirpes foi resistente a FR (2,5%) e CN (7,5%). A percentagem de resistência para KF, N, C e ENR foi 18,8%, 27,5%, 28,7% e 35,0%, respectivamente. É de notar que as percentagens de resistência obtidas para sete dos catorze antibióticos utilizados são superiores a 50% e só para dois deles se obteve percentagens inferiores a 10%.

Estes resultados indicam que a resistência adquirida tem vindo a aumentar significativamente o que pressupõe a necessidade de implementação de sistemas de vigilância integrados, no nosso país.


- 504 -

Behavior of Escherichia coli strains isolated from chicken

Costa, D.; Poeta, P. and Rodrigues, J.

ICETA-UTAD, Departamento de Higiene e Sanidade, Quinta de Prados, 5000-911 Vila Real

Bacterial resistance to antibiotics is increasing. In this work we have studied the profile resistance to several antibiotics in bacteria isolated from packed chicken for commercialization.

Eighty Escherichia coli strains were collected, isolated and identified using the IMVEC test and the API 20E system. They were submitted to the antibiotic susceptibility test by the disc diffusion method according to the National Committee for Clinical Laboratory Standards. The antibiotics used were: ciprofloxacin (CIP 5µg), enrofloxacin (ENR 5µg), nalidixic acid (NA 30µg), tetracycline (TE 30µg), chloramphenicol (C 30µg), gentamycin (CN 10µg), streptomycin (S 10µg), neomycin (N 10µg), cephalothin (KF 30µg), flumequine (KF 50µg), ampicillin (AMP 10µg), furazolidone (FR 50µg), sulphamethoxazole/ trimethoprim (SxT 25µg) and spiramycin (SP 100µg).

We found out that the antibiotics to which the strains showed more resistance were TE (with 86,3% of the resistant strains), S (78,8%), NA (77,5%), SxT (72,5%), UB (63,7%), CIP (55,0%), AMP (56,2%) and SP (47,5%). On the other hand a few strains was resistant to FR (2,5%) and CN (7,5%). The percentage of resistance to KF, N, C and ENR was 18,8%, 27,5%, 28,7% and 35,0, respectively. It is notable that the percentages of resistance to seven of the fourteen antibiotics used were superior to 50% and only for two of them percentages lower than 10% were obtained.

These results indicate that the adquired resistance has been raising and that it is necessary to implement an integrated surveillance system in our country.


- 505 -


Detecção directa e contagem de E. coli em bivalves por “Fluorescent In Situ Hybridization”

Oliveira, M. and Bernardo, F.

CIISA – Laboratório de Inspecção Sanitária, Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal

E. coli faz parte da flora intestinal comensal de humanos e animais, mas existem várias estirpes patogénicas. Quando este microrganismo é isolado a partir de amostras de água, carne de vaca, aves, vegetais, leite e derivados, é considerado indicador de contaminação fecal. Os sintomas de colibacilose podem ir desde disenteria ligeira a colite hemorrágica grave. Todos os indivíduos são susceptíveis a este microrganismo, mas as crianças e idosos são mais afectados; a taxa de mortalidade nestes grupos pode atingir os 50%.

Apesar de existirem vários métodos para a detecção desde microrganismo em alimentos, os métodos convencionais apenas fornecem resultados positivos após 3 dias. É crucial desenvolver métodos rápidos que permitam a detecção deste patogénico, encontrando-se já disponíveis técnicas como kits comerciais e PCR.

Através de uma sonda oligonucleotídica de 24-mer descrita por Regnault et al. (2000), desenvolveu-se um método rápido para a detecção directa de E. coli em bivalves, baseado em “Fluorescent In Situ Hybridization”. O protocolo foi testado em 98 estirpes de E. coli isoladas a partir de amostras de alimentos, e aplicado à detecção directa e contagem deste microrganismo em 4 espécies de bivalves: Crassostrea spp., Littorina littorea, Sccrobicularia plana e Spisula solida.

Os resultados mostram que este protocolo pode ser optimizado para a detecção rápida e directa e para a contagem deste patogénico em amostras de alimentos e ambientais, permitindo resultados positivos em aproximadamente 5 horas, com um custo de 0.45 a 3.0 € (dependendo do número de amostras analisadas simultaneamente).


- 506 -

Direct detection and enumeration of E. coli in Shellfish by Fluorescent In Situ Hybridization

Oliveira, M. and Bernardo, F.

CIISA – Laboratório de Inspecção Sanitária, Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal

E. coli is part of the normal intestinal flora of humans and animals, but there are several strains capable of causing illness. When this microorganism is isolated from water, beef, poultry, vegetables, milk and dairy products, is considered as an indicator of faecal contamination. Symptoms of colibacilosis may varie from a mild diarrhea to a severe hemorrhagic colitis. All people are susceptible to this microorganism, but infants and the elderly are more affected; mortality rate in these groups can be as high as 50%.

Although there are many methods for the detection of this microorganism in food, using conventional methods positive results can only be obtained after 3 days. It is crucial to develop rapid methods allowing the detection of this pathogen, being already available techniques as commercial kits and PCR.

Using a 24-mer oligonucleotide probe described by Regnault et al. (2000), a rapid method for the direct detection of E. coli in shellfish, based on Fluorescent In Situ Hybridization, was developed. The protocol was first tested against 98 E. coli strains isolated from food samples, and then applied to the direct detection and enumeration of the microorganism in 4 species of shellfish: Crassostrea spp., Littorina littorea, Sccrobicularia plana and Spisula solida.

Results show that this protocol can be optimized for the rapid and direct detection and enumeration of this pathogen in food and environmental samples, allowing positive results in approximately 5 hours, with a consumable cost of 0.45 to 3.0 € (depending on the number of simultaneously processed samples).


- 507 -


Quantificação de aminoácidos livres em presuntos de cura rápida por cromatografia gasosa

Cristina M. P. Mateus Alfaia1, Mário A. Gonçalves Quaresma1, Ana F. Assunção Xavier2, Ana M.

Carvalho Partidário2, Maria J. Costa Mimoso2 e José A. Mestre Prates1

1 Faculdade de Medicina Veterinária - CIISA, Rua Professor Cid dos Santos, Pólo Universitário do

Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal; 2 INETI, Estrada do Paço do Lumiar, nº22, 1649-038 Lisboa, Portugal.

O presunto é um produto cárneo salgado produzido por processos tecnológicos com tempos de maturação diversos, usualmente classificados em cura rápida (4-6 meses) e cura lenta (≥ 12 meses). Durante o processo de cura, o presunto sofre várias modificações bioquímicas, a maioria das quais devida a proteólise catalisada por peptidases (EC 3.4), que continuam activas mesmo após vários meses de processamento do presunto. Os aminoácidos livres e os pequenos péptidos, resultantes da hidrólise das proteínas miofibrilares e sarcoplasmáticas, podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento do flavor e de outras propriedades organolépticas dos presuntos. O objectivo deste trabalho consiste na caracterização do perfil dos vinte aminoácidos livres (Xaa) padrão em presuntos de cura rápida, obtidos a partir de linhas industriais de porcos brancos. Para além disso, pretende-se também avaliar o efeito da extensão do período de maturação dos presuntos (até aos 12 meses) sobre os teores de aminoácidos livres. Os teores médios de Xaa nos presuntos de cura rápida variaram entre 14,8±1,01 e 115,2±0,98 mg/100 g. O Xaa não-essencial aromático Tyr foi o que apresentou o teor mais baixo e o Xaa essencial não-polar Val o que apresentou o teor mais elevado. O prolongamento do período de cura rápida do presunto dos 5-6 para os 12 meses não modificou significativamente (H0: p<0,05) o teor de nenhum dos Xaa analisados.

Conclui-se que o presunto de cura rápida parece ser um presunto com propriedades organolépticas bem desenvolvidas e que a extensão do período de cura não parece melhorar as suas características sensoriais.

Financiado pelo projecto CIISA/2002/52.CARNE-BIOACTIVOS.


- 508 -

Quantification of free amino acids in short ripening dry-cured hams by gas chromatography

Cristina M. P. Mateus Alfaia1, Mário A. Gonçalves Quaresma1, Ana F. Assunção Xavier2, Ana M.

Carvalho Partidário2, Maria J. Costa Mimoso2 and José A. Mestre Prates1

1 Faculdade de Medicina Veterinária - CIISA, Rua Professor Cid dos Santos, Pólo Universitário do

Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal; 2 INETI, Estrada do Paço do Lumiar, nº22, 1649-038 Lisboa, Portugal.

Dry-cured ham is a salted meat product, produced by several technological processes and with different times of processing, usually classified in short ripening (4-6 months) and long ripening (≥ 12 months). During the ripening process, the dry-cured ham undergo several biochemical changes, most of them due to proteolysis induced by peptidases (EC 3.4), which are still active after several months of processing. Free amino acids and other compounds, which are generated from proteins and peptides by fragmentation of sarcoplasmatic and myofibrillar proteins, may play an important role in the development of flavour and other organoleptical properties of dry-cured hams. The aim of this work was to characterise the profile of the standard twenty free amino acids (Xaa) in short ripening dry-cured hams, obtained from industrial breeds of white pigs. Additionally, the effect of the extension of the ripening period (till 12 months) upon free amino acids contents was also evaluated. The mean contents of Xaa in dry-cured hams of short curing process varied between 14.8±1.01 and 115.2±0.98 mg/100 g. The nonessential aromatic Tyr was the Xaa with the lower content and the essential nonpolar Val was the Xaa with higher value. The extension of the short ripening period of dry-cured hams from 5-6 till 12 months didn't change significantly (H0: p<0.05) the contents of any of the Xaa analysed.

It is concluded that the short ripening dry-cured ham seems to be a dry-cured ham with well developed organoleptical properties and that the extension of the ripening period doesn't appear to improve its sensorial characteristics.

Supported by project CIISA/2002/52.CARNE-BIOACTIVOS.


- 509 -


Análise de risco em segurança alimentar - resíduos de produtos veterinários

E Marques Fontes

Núcleo de Farmacologia e Toxicologia - Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária. Rua Prof. Cid dos Santos. Polo Universitário

da Ajuda. 1300-477 Lisboa, Portugal. <[email protected]>

O uso de substâncias farmacologica e/ou toxicologicamente activas como produtos veterinários em animais de produção alimentar tem sido considerado pela comunidade internacional como um perigo potencial para o consumidor. A caracterização dos produtos veterinários a nível dos regulamentos da UE engloba produtos farmacológicos, imunológicos e biocidas (incluindo pesticidas).

Vários organismos (FAO, WHO, EMEA) desenvolveram programas específicos de análise de risco, especialmente dedicados à avaliação e previsão do impacto negativo em populações humanas. O CCRVDF (Codex Committee for Residues of Veterinary Drugs in Food) é o organismo internacional que tem desenvolvido os maiores esforços na harmonização de critérios e resultados.

Actualmente, a metodologia usada para desenvolver a análise de risco é baseada em vários critérios que divergem entre os três principais participantes do VICH. A UE, a nível da Comissão, está a discutir a harmonização interna, aplicável à nova Comunidade, em futuras directivas. A metodologia desenvolvida tem em atenção, para além dos produtos veterinários, os medicamentos humanos que podem ser utilizados ao abrigo da cascata.

A avaliação do impacto destes produtos na qualidade dos alimentos de origem animal e vegetal é discutida pelo autor, baseada na sua experiência pessoal como perito naqueles organismos, tendo em especial atenção a população alvo Europeia e a diversidade de cabazes alimentares.


- 510 -

Risk assessment in food safety - residues of VMP

E Marques Fontes

Núcleo de Farmacologia e Toxicologia - Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária. Rua Prof. Cid dos Santos. Polo Universitário

da Ajuda. 1300-477 Lisboa, Portugal. <[email protected]>

The use of pharmacological and/or toxicological active substances as veterinary medicinal products (VMP) in food producing animals has been regarded in the international scientific community as a potential hazard to the consumer. The characterisation of VMP in the EU regulations merges pharmacological products, immunological products and biocides (including pesticides).

Several bodies (FAO, WHO, EMEA) have developed specific risk analysis programmes, specially dedicated to the evaluation and prediction of the negative impact in the human populations. The CCRVDF (Codex Committee for Residues of Veterinary Drugs in Food) is the international body that is making the major effort in the harmonisation of criteria and results.

Nowadays, the methods to develop risk assessment are based on several criteria that diverge among the three major participants of the VICH. The EU, at the Commission level, is discussing the internal harmonisation, applicable in the new Community in the future directives. The methodology developed is having into account, not only VMP, but also medicinal products from the human side that can be used under the umbrella of the cascade.

The evaluation of the impact of these products in the quality of food from animal and vegetal origin will be discussed by the author, based on his personal experience as expert in those bodies, taking in particular account the target European population and the diversity of the food baskets.


- 511 -


Modelos biológicos de avaliação de risco de xenobióticos em produtos animais processados

Moreira, A.; Fontes, E.M.

Núcleo de Farmacologia e Toxicologia - Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, R. Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário,

Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal. <[email protected]>

A qualidade e a segurança dos produtos de origem animal utilizados na alimentação humana são avaliadas sob várias vertentes, sendo uma delas a presença de resíduos de xenobióticos. Esta presença é avaliada nos tecidos edíveis, antes da realização dos processamentos culinário e/ou tecnológico que originarão o produto alimentar final.

Existem diversos estudos que apontam para a redução dos resíduos de alguns xenobióticos, quando os tecidos edíveis são processados, não havendo, no entanto, estudos que permitam relacionar as alterações quantitativas / qualitativas com alterações da sua toxicidade.

Na tentativa de colmatar a falta de informação entre os dados descritos na área da química analítica e os efeitos reais em sistemas biológicos, foi desenvolvido um modelo em mamífero (Ratus norvegicus), testando xenobióticos em dois tipos de processamentos usuais (cocção por ebulição e microondas).

As substâncias activas dos medicamentos de uso veterinário são dos xenobióticos passíveis de estarem presentes nos alimentos, os que menor risco apresentam para o consumidor, devido às rigorosas metodologias conservativas do estabelecimento das concentrações de segurança. De igual modo não é previsível que as possíveis alterações qualitativas, devido às manipulações conduzam a toxicidade aguda. No entanto, esta perspectiva não é aplicável à ingestão diária a longo prazo, nem a outros xenobióticos, de exposição crónica, que podem estar presentes nos alimentos, como por exemplo, os contaminantes ambientais, com a sua ubiquidade e ausência de limitações.

Através da modelização laboratorial, por nós desenvolvida em ivermectina, concluimos que as manipulações tecnológicas e/ou culinárias podem alterar o potencial tóxico dos xenobióticos, abrindo novas perspectivas aos actuais sistemas de avaliação de risco.


- 512 -

Biologic models of risk assessment in processed animal products

Moreira, A.; Fontes, E.M.

Núcleo de Farmacologia e Toxicologia - Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, R. Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário,

Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal. <[email protected]>

Quality and safety of food products of animal origin, are evaluated on several areas, one of them is the presence of xenobiotic residues. Nowdays this presence is assessed before domestic and/or technologic processing.

There are several studies poiting to a reduction of residues of some xenobiotics after processing, nevertheless there aren't any that allow relating the quantitative / qualitative alterations with alterations in toxicity.

In the atemp to go through the lack of information between the chemical analitical data and biological sistems effects, it was developped a mammal model (Ratus norvegicus), testing xenobiotics with two types of usual processings (boiling and microwaving).

The active substances of the veterinary medicinal products represent less risk to the consumer within the general xenobiotics group, due to the conservatives methodologies used in the safety assessment. In the same perspective it is not previsible that possible qualitative alterations, due to processing, leed to acute toxicity. Nevertheless, this perspective is not aplicable to a long term diary ingestion, neither to other xenobiotics of chronic exposure, like environmental contaminants that are ubiquous and with no maximum level established.

Throught laboratorial modelization, which we have developed with ivermectin, we can conclude that processing could change the toxic potential of xenobiotics, open new perspectives to the actual assessment systems.


- 513 -


O sistema nacional de farmacovigilância e toxicologia veterinária

Henrique Ramos da Costa

Direcção Geral de Veterinária, Lisboa

Os medicamentos veterinários não imunológicos ou imunológicos, os produtos de uso

veterinário, bem como os biocidas de uso veterinário, antes de serem introduzidos no mercado, são avaliados segundo critérios de qualidade, eficácia e segurança, de modo a garantir a sua inocuidade em relação ao animal, ao homem e ao meio ambiente em geral. No entanto, alguns efeitos nocivos e involuntários consecutivos à sua administração não se manifestam no decorrer dos ensaios farmacológicos, toxicológicos e clínicos por limitações relevantes, tais como:

a) poderem não ter em conta alguns grupos de alto risco, designadamente recém-nascidos, imunodeprimidos e fêmeas gestantes.

b) os estudos realizados serem limitados quer temporalmente, quer na sua dimensão estatística.

c) durante os ensaios clínicos não serem tidas em conta algumas interacções resultantes da exposição simultânea de vários medicamentos ou produtos na população alvo.

Assim, impõe-se que durante a sua comercialização se continue a detectar, registar e estudar a informação relativa a reacções adversas. O Sistema Nacional de Farmacovigilância e Toxicologia Veterinária compreende:

a) a recolha de informação respeitante à ocorrência de reacções adversas;

b) a análise destes dados;

c) e a proposta de acções de carácter regulamentar sempre que esta avaliação o imponha. Poderão tratar-se de alterações no resumo das características do produto, na rotulagem ou na literatura – posologia, modo de emprego, indicações, contra-indicações, etc.-, de modificação do estatuto de prescrição, distribuição ou administração ou até da suspensão ou retirada do produto do mercado.

A recente transposição da Directiva 2000/37/CE, de 5 de Junho, veio alargar o âmbito da farmacovigilância às falhas de eficácia, à recolha de informação de reacções adversas devidas a uso extra-indicações e à investigação da validade do intervalo de segurança e de potenciais problemas ambientais. Num sistema de farmacovigilância, os clínicos são os agentes de observação preferenciais que têm a capacidade para detectar os sinais das respostas biológicas ocorridas nos animais após a administração dos produtos em causa ou, eventualmente, de medicamentos humanos. Por isso, procura-se sensibilizar os clínicos veterinários para este domínio, de modo a aumentar a sua contribuição com o envio de notificações de reacções adversas. De modo a facilitar o trabalho destes, é feita uma breve revisão sobre o que se deve notificar e sobre qual a informação a enviar, bem como sobre o modo de transmitir.

Finalmente, também é referida a criação de uma Comissão de farmacovigilância e toxicologia veterinária, no âmbito da Direcção-Geral de Veterinária.


- 514 -

The national system for pharmacovigilance and veterinary toxicology

Henrique Ramos da Costa

Direcção Geral de Veterinária, Lisboa

The veterinary non-immunological medicinal products, the veterinary immunological medicinal products, the products for veterinary use, as the veterinary biocides, before being marketed, are evaluated under quality, efficacy, safety criterions, in order to assure their innocuity to the animal, the human and to the environment. Nevertheless, some noxious and involuntary effects consecutive to its administration are not evident during the pharmacological, toxicological and clinical trials due to relevant constraints, such as:

a) the studies don’t take into consideration some high-risk groups, particularly newly borns, immunocompromised and pregnants;

b) the studies are limited in time and in statistical dimension;

c) during the clinical trials some interactions resulting from simultaneously exposure of the target population to other medicinal products are not taken into account.

Thus, it is necessary to continue to detect, to record, and to assess the information related to adverse reactions that occur after the marketing authorisation. The aim of the national system for pharmacovigilance and veterinary toxicology is to:

a) collect information on adverse drug reactions;

b) evaluate this data;

c) propose regulatory decisions whenever needed. This could be by means of variations of the summary of product characteristics, labels or leaflet – posology, method of administration, indications, contra-indications, etc. – modification of the proposed dispensing/classification, distribution or administration or, if necessary, the suspension or withdrawal of the marketing authorization.

The recent Directive 2000/37/CE, 5th June, transposition enlarged the scope of pharmacovigilance to issues as lack of efficacy, collection of information on adverse reactions due to of-label use, investigation of the validity of the withdrawal period and on potential environmental problems. In a pharmacovigilance system, the practitioners are the principal observers whom have the capacity to detect the biological response signals occurred in the animals after the administration of these products or, eventually, after the administration of human medicinal products. Thus, we try to make then sensitive to this issue aiming to get their contribution by sending adverse reaction reports. In order to facilitate their job, a brief revision on what should be notified, what kind of information should be sent as well as how to do it, is given.

Finally is also alluded the implementation of the pharmacovigilance and veterinary toxicological committee of the Direcção-Geral de Veterinária.


- 515 -


Actividades de biotransformação em culturas de hepatócitos. Aplicação a estudos farmaco-toxicológicos

São Braz, B.*, Fontes, E. M. e Jorge Silva, A.

Núcleo de Farmacologia e Toxicologia - Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário

Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal. * < [email protected]>

Os estudos farmaco-toxicológicos realizados in vivo têm vindo a ser utilizados para avaliação de xenobióticos nomeadamente fármacos, pesticidas e contaminantes ambientais. Contudo e por questões éticas, económicas e cientificas muitos destes estudos têm vindo a ser substituidos por estudos in vitro, tendo em atenção que estes podem ser usados como estudos de rastreio e de correlação in vitro/in vivo.

Muitos dos estudos farmaco-toxicológicos estão relacionados com a capacidade de biotransformação que o animal possui e que pode modular a eficácia (no caso de fármacos) e a toxicidade de xenobióticos, contudo a maior parte destes estudos são realizados em animais sãos e não em condições patológicas. O orgão mais importante na biotransformação é o fígado, a partir do qual podemos obter culturas de hepatócitos - componente celular responsável por essa actividade.

Tendo em atenção estes pressupostos, o nosso estudo incidiu na avaliação da capacidade de biotransformação de culturas de hepatócitos submetidas a condições patológicas.

As culturas de hepatócitos de rato, foram submetidas à acção da galactosamina (substância hepatotóxica). Foram determinadas a citotoxicidade (pelos testes de LDH e MTT) e actividade de enzimas da fase I (EROD; PROD e ECOD) e da fase II (UDP - glucoroniltransferase) e comparadas com culturas de hepatócitos não submetidas à acção da substância hepatotóxica (controlos).

Os resultados mostram diferenças entre as condições "saudável" e "patologica", pelo que pensamos que este modelo pode ser utilizado em estudos relacionados com as actividades de biotransformação.


- 516 -

Biotransformation activities in hepatocyte cultures. Aplication to pharmaco-toxicological studies

São Braz, B.*, Fontes, E. M. and Jorge Silva, A.

Núcleo de Farmacologia e Toxicologia - Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário

Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal. * < [email protected]>

In vivo pharmaco-toxicological studies have been performed to evaluate many xenobiotics, like drugs, pesticides and environmental contaminants. However, many in vivo studies have been replaced by in vitro studies for ethical, economic and scientific reasons, taking in account that, in vitro studies, can be used as screnning studies, and in in vitro / in vivo correlations.

Many pharmaco-toxicological studies are concerned with biotransformation capacities of the animal that cans modulate efficacy (case of drugs) and toxicity of xenobiotics; but almost all of the studies have been performed in healthy animals not in pathological conditions. The most important organ for biotransformation is the liver and from it we can obtain cultures of hepatocytes - the cellular component responsible for these activities.

Taking in account conditions stated above, we try to study biontransformation activities of hepatocyte cell cultures submitted to pathological conditons.

Rat cell cultures have been submited to galactosamine (hepatotoxic drug) and then, citotoxicity (by LDH and MTT tests) and enzimatic activities of phase I (EROD, PROD and ECOD) and phase II (UDP-glucoronyltransferase) were determinated and compared with cell cultures without drug (controls).

Results show differences between conditions "healthy" and "pathologic", and we believe that this model can be used in further studies concerning biotransformation activities.


- 517 -


Agonistas beta-adrenérgicos – uso e abuso [Beta-adrenergic agonists - use and misuse]

Clara Cruz e Jorge Barbosa

[email protected]; [email protected]

Serviço de Bioquímica e Resíduos, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Estrada de Benfica, 701, 1549-011, Lisboa

Resumo A detecção de resíduos de agonistas beta-adrenérgicos, em produtos de origem animal, tem

sido uma realidade nos últimos anos em Portugal. Entre os produtos de utilização proibida, os beta-agonistas têm sido os mais encontrados no controle analítico.

Os utilizadores de drogas proibidas em produção animal têm certamente a convicção que o consumidor não é afectado, a curto prazo, pela ingestão de produtos edíveis contaminados pelas mesmas. No entanto os casos de intoxicação alimentar aguda, devidamente identificados, provocados pelo consumo de carne proveniente de animais aos quais foram administrados beta-agonistas têm sido uma constante. Além destes, outros certamente terão havido, não detectados. Salvo melhor opinião, este grupo de compostos químicos de utilização proibida é o único com capacidade para induzir intoxicações alimentares agudas.

Num passado não muito longínquo o composto detectado era quase que exclusivamente o clembuterol. Nos últimos dois anos a situação tem vindo a alterar-se e a utilização, quer de mistura de várias moléculas, quer das chamadas “new designed drugs” tornou-se frequente. A identificação de novos compostos torna-se mais problemática por as suas estruturas químicas serem facilmente manipuláveis em laboratórios artesanais.

Summary Beta-adrenergic agonists (beta-agonists) are, among the illegal drugs, the most commonly

found in livestock animals in Portugal.

In our country, the users are certainly not aware of the immediate risks and danger associated to the misuse of these compounds. This is the only explanation for the acute human intoxications reported after eating meat contaminated with beta-agonists.

A few years ago the most found compound was clembuterol. Nowadays other molecules have been detected; among them the new designed drugs, which are very difficult to identify, because they can be easily produced “home made”.


- 518 -


- 519 -

Segurança alimentar

Anti-parasitários – medicamentos de utilização veterinária sujeitos a controle no âmbito do plano nacional de controle de resíduos

Maria da Luz Ferreira, Susana Vacas de Carvalho, Clara Cruz

Serviço de Bioquímica e Resíduos, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária

<[email protected]>

A presença de parasitas num sistema de produção intensivo de carne e leite é uma das limitações mais importantes para um aproveitamento eficiente daqueles recursos nutricionais, causando prejuízos económicos que, em algumas circunstâncias, determinam a viabilidade do sistema. Assim, os anti-parasitários são utilizados para tratamentos terapêuticos e profilácticos nas explorações.

Uma Boa Prática Veterinária exige uma correcta utilização do composto pelo respeito de intervalos de segurança, isto é, o tempo que decorre após a última administração do medicamento e o abate ou ordenha. Este intervalo de segurança que depende da substância em causa e da espécie animal à qual foi administrada, vai permitir a excreção do composto por forma a que as concentrações presentes nas matrizes edíveis não sejam prejudiciais ao consumidor.

A análise laboratorial de controlo para a pesquisa de anti-parasitários incide nos compostos mais utilizados, pertencentes aos grupos das avermectinas, dos benzimidazois e dos tetra-hidro-imidazois. A legislação em vigor indica quais os Limites Máximos de Resíduo (LMR) para cada um dos compostos, em cada uma das matrizes e espécies consideradas, sendo uma análise positiva aquela que demonstrar não só a presença do composto mas também uma concentração que exceda o respectivo LMR.

A metodologia que envolve a detecção, identificação e quantificação dos anti-parasitários, constitui um enorme desafio analítico, pela grande variedade de moléculas a pesquisar, tipo de matrizes biológicas complexas e pelo rigor que se exige a uma análise quantitativa.


- 520 -

Antiparasitic agents – veterinary drugs included on national residues control plan

Maria da Luz Ferreira, Susana Vacas de Carvalho, Clara Cruz

Serviço de Bioquímica e Resíduos, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária

<[email protected]>

Antiparasites are used in therapeutic and prophylactic quantities in meat and milk intensive productions.

Good Veterinary Practice demands a correct utilisation of the compounds, considering security periods (time between the last day of treatment and slaughtering or milking). These periods depending on the substances used and the animal species, will eliminate the compound to levels that will not damage the consumers.

Lab analyses include compounds most used by practitioners, belonging to avermectins, benzimidazoles and tetra-hydro-imidazoles groups. The Maximums Limits of Residues (MLR) for each compound, matrix and animal specie was established, so a positive analysis shows not only the presence of the compound but also a concentration exceeding the MLR.

The methodology used includes detection, identification and quantification and establishes an enormous analytical challenge because of the variability of molecules, complexes biological matrixes and the demanding criterias required by a quantitative analyse.


- 521 -


Análise de resíduos de Nitrofuranos em tecidos edíveis de animais por LC-MS/MS [Residues analysis of nitrofurans in muscle of animal origin by LC-

MS/MS]

Jorge Barbosa*, Maria da Luz Ferreira

Serviço de Bioquímica e Resíduos, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Estrada de Benfica 701 1549-011 Lisboa. * <[email protected]>

Resumo A administração de nitrofuranos na produção de animais para consumo humano é proibida

na União Europeia. Recentemente foi detectada a presença de resíduos destas substâncias em produtos alimentares importados para o espaço comunitário provenientes de países Asiáticos e da América do Sul.

A análise de resíduos destes compostos em tecidos edíveis de animais impõe a detecção dos respectivos produtos de metabolização e não dos compostos originais, uma vez que estes sofrem rápida biodegradação.

Dada a estrutura molecular dos compostos alvo, nomeadamente a 3-amino-2-oxazolidona (AOZ), 5-metilmorfino-3-amino-2-oxazolidona (AMOZ), 1-aminohidantoina (AHD) e a semicarbazida (SEM), e a sensibilidade exigida, torna-se necessária a utilização de LC-MS/MS para a sua detecção.

Neste trabalho, apresentam-se os resultados obtidos pela análise destes compostos após extração a partir de tecidos, derivatização com nitrobenzaldeído, separação em HPLC e detecção por LC-MS/MS no modo MRM.

Summary The EU banned the veterinary use of nitrofurans in animals farming for human

consumption. Recently, findings of nitrofurans residues were reported in alimentary products imported from Asian and South American countries.

The residue control of these compounds requires the analysis of their metabolites rather than the parent substances due to their intense biodegradation.

Due to their molecular structure and required sensitivity the detection of target compounds, namely 3-amino-2-oxazolidone (AOZ), 5-methylmorphino-3-amino-2-oxazolidone (AMOZ), 1-aminohydantoin (AOZ) and semicarbazide (SEM) must be performed with the use of LC-MS/MS.

Results are presented for the determination of the compounds after extraction from tissue samples, nitrobenzaldehyde derivatization, HPLC separation and tandem MS detection in MRM mode.


- 522 -


- 523 -


Detecção e confirmação da presença de corticosteroides em urina de animais utilizados na alimentação humana por LC-MS/MS

Jorge Barbosa*, Susana Vacas de Carvalho

Serviço de Bioquímica e Resíduos, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária,

Estrada de Benfica 701 1549-011 Lisboa. * [email protected]

Os corticosteroides são compostos muito utilizados em medicina humana e em veterinária. Nos animais são também utilizados como promotores de crescimento, sendo este tipo de administração considerada ilegal na União Europeia.

O controlo da sua utilização exige o emprego de meios analíticos de elevada especificidade e sensibilidade.

A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC/MS) demonstra possuir a especificidade exigida, mas a sua utilização na análise de corticosteroides após extração a partir de matrizes complexas, não possibilita atingir os níveis de sensibilidade adequados, dada a termo-instabilidade demonstrada pelos derivados destes compostos.

A aplicação de cromatografia líquida (HPLC) demonstra ser a técnica mais adequada para a separação destes compostos. No entanto, a detecção por UV não consegue atingir os níveis de especificidade e sensibilidades adequados, de acordo com os critérios definidos no documento SANCO 1085/2000. A introdução da espectrometria de massa como detector para a cromatografia líquida, veio possibilitar ultrapassar estas dificuldades.

O método analítico desenvolvido que utiliza a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS) permite detectar e confirmar a presença de corticosteroides em urina proveniente de animais utilizados para consumo humano, cumprindo os critérios impostos pela União Europeia.


- 524 -

Detection and confirmation of corticosteroids in urine samples of animal origin by LC-MS/MS

Jorge Barbosa*, Susana Vacas de Carvalho

Serviço de Bioquímica e Resíduos, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária,

Estrada de Benfica 701 1549-011 Lisboa. * [email protected]

Corticosteroids are widely used in human and veterinary medicine. These compounds are also used as growth promoters, but this practice is illegal within the EU. The control of these substances requires high specificity and sensitivity analytical means.

Gas chromatography couple to mass spectrometry (GC-MS) demonstrates the required specificity, but on analyze of sample extracts from complex matrices lacks the required sensitivity due to thermo degradation of corticosteroids derivatives.

The application of HPLC for corticosteroids separation seems to be the best choice rather than gas chromatography, but the level of sensitivity and specificity of UV detectors don’t reach the criteria defined in EU SANCO 1085/2000. The introduction of mass spectrometry as HPLC detector demonstrates enough power to solve these problems.

The developed analytical methods presented uses LC-MS/MS for the detection and confirmation of corticosteroids extracted from urine samples of animal origin accordingly the EU criteria.


- 525 -


Detecção de resíduos de fenilbutazona em amostras de músculo por HPLC/DAD [Residue detection of phenylbutazone in muscle samples by HPLC/DAD]

Jorge Barbosa*, Clara Cruz


Resumo A fenilbutazona é uma pirazolona que pertence ao grupo dos compostos anti-inflamatórios

não esteroides (AINE´s). Este composto é considerado dopante nas modalidades desportivas equestres, estando a sua administração não autorizada a animais utilizados para consumo humano nos países da União Europeia.

Dada a sua forte ligação com as proteínas e a instabilidade demonstrada por oxidação pelo calor e pelo oxigênio, a extracção deste composto a partir de matrizes biológicas como o músculo ou o leite, revela ser bastante problemática uma vez que os níveis de recuperação extrativa apresentam um grau de variabilidade não conforme com os critérios de validação que são exigidos para a análise de resíduos.

O procedimento analítico aplicado em amostras de músculo, que utiliza uma extração a pH 9.5 com dimetilformamida, purificação e concentração em coluna de fase sólida e separação e detecção por HPLC-UV, permite a detecção de resíduos de fenilbutazona com a sensibilidade desejada e com um grau de reprodutibilidade adequado.

Summary Phenylbutazone is a pyrazolone belonging to the group of non-steroidal anti-inflammatory

drugs (NSAID´s). This compound is considered as doping agent in equestrian sport modalities and is a non-authorized substance in animals farming within EU.

Due to its strong binding to proteins and easily oxidized by heat and oxygen, the extraction of this compound from biological samples is very problematic. The recovery is affected by a high degree of variability non-conforming with the required criteria for this kind of analysis.

The analytical procedure presented, uses an extraction at pH 9.5 with dimethylformamide, purification and concentration by means of liquid-solid extraction, separation and detection with HPLC/UV. This procedure demonstrates enough sensitivity and reproducibility to the analytical needs of phenylbutazone screening from tissue samples.


- 526 -


- 527 -


Detecção e confirmação da presença de resíduos de gestagénios em gordura de origem animal por GC-MS [Detection and confirmation of gestagens residues in

fat samples by GC-MS]

Jorge Barbosa*, Isabel Carvalho


Resumo Os gestagénios sintéticos possuem efeito anabolisante e são capazes de estimular a produção

endógena de outros esteroides anabolisantes, tais como o estradiol. A administração destes compostos a animais para consumo humano está proibida no espaço comunitário. De entre os gestagénicos sintéticos existentes no mercado, os mais utilizados como promotores de crescimento são a medroxiprogesterona, o melengestrol, o megestrol e a clormadinona.

Dado o seu caracter lipofílico, estes compostos depositam-se nos tecidos lipídicos, sendo a gordura peri-renal a amostra biológica mais adequada para a sua pesquisa.

Dada a complexidade deste tipo de amostra, o método desenvolvido utiliza duas extracções líquido-sólido, uma desengorduração do extracto com n-hexano e uma extracção líquido-líquido com éter terbutilmetílico. O extracto obtido é derivatizado com anidrido heptaflurobutírico (HFBA) e analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) no modo de monitorização selectiva de iões (SIM).

Apresentam-se os resultados obtidos em amostras de gordura provenientes de várias espécies animais.

Summary Synthetic gestagens have anabolic side effects and they are able to stimulate the endogenous

production of other anabolic steroids like estradiol. The administration of these compounds to farming animals is forbidden in the EU. Among the synthetic gestagens in the market, the most used as growth promoters are medroxiprogesterone, melengestrol, megestrol and choromadinone.

Due to their lipophilic characteristics, kidney fat is considered as the target tissue for the tracing of this group of compounds. This kind of sample is very problematic due to is complexity. The extraction method requires the use of two liquid-solid extractions, removal of fat with n-hexane, and a liquid-liquid extraction with ter-butylmethylether. The obtained extract is derivatised with heptafluorobutyric anhydride and analyzed by GC-MS in SIM mode.

Results are presented for the determination of the compounds in kidney fat from some animal species.


- 528 -


- 529 -


Resíduos de substâncias antibacterianas em carne de suíno [Antibacterial residues in swine meat]

Eduarda Gomes Neves1, Eduardo Marques Fontes2

1Direcção Regional de Agricultura de Entre-Douro e Minho; Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar - Universidade do Porto; 2Faculdade de Medicina Veterinária – Universidade

Técnica de Lisboa Resumo

O objectivo deste trabalho é a pesquisa de resíduos de substâncias antibacterianas em tecido muscular de suínos, abatidos em matadouros do Entre-Douro e Minho entre Outubro de 1999 e Janeiro de 2000.O tamanho amostral (n=203) foi obtido com base nos totais de abate de suínos nacionais nesta região no ano de 1998 e na prevalência esperada de 5%, tendo sido colhidas amostras em 15 matadouros. As amostras foram colhidas duma forma aleatória e referiam-se a suínos provenientes de 13 distritos nacionais. A pesquisa foi realizada no Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV) Delegação do Porto, entre Janeiro e Abril de 2000, utilizando as técnicas validadas oficialmente para as amostras do Plano Nacional de Pesquisa de Resíduos (PNPR): Teste das Quatro Placas, Bioensaio e Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), respectivamente, técnicas de rastreio e de identificação e quantificação. Obtiveram-se resultados positivos em três amostras, uma delas contendo resíduos de duas substâncias diferentes (amostra 1- Penicilina G 42.6 ìg/Kg; amostra 2 – Sulfisoxazol 73 ìg/Kg; amostra 3 – Sulfametazina 14600 ìg/Kg + Doxiciclina 49 ìg/Kg). Os resultados devem ser avaliados tendo em conta as especificidades da suinicultura nacional. Summary

The aim of this work is the detection and identification of antibacterial residues in swine muscular tissue of slaughterhouses from Entre-douro e Minho during October 1999 through January 2000. The sample size (n=203) was built with numbers of total slaughtered swines in Entre-Douro e Minho in 1998 and the expected prevalence of 5%. The samples were collected in 15 slaughterhouses with a random selection and the swine were from 13 different regions of Portugal. The analyses were carried out at Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV) Delegação do Porto, during January through April 2000, with the reference analytical methods which are used in the national plan of residues research (PNPR). The methods of screening and post-screening were the Four Plates Test and the Bioassay and the identification and quantification method was High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). Three samples had positive results, one of it with two different analytes (sample 1- Penicillin G 42.6 ìg/Kg; sample 2 – Sulphisoxazole 73 ìg/Kg; sample 3 – Sulphamethazine 14600 ìg/Kg + Doxycycline 49 ìg/Kg). The results must be assessed looking at the conditions of swine production in Portugal.


- 530 -


- 531 -


Desenvolvimento de um modelo para determinação de custos de produção nas indústrias de transformação de carne

Matos, T.J.S.1; Barreto, A.S.F.H.2; Bernardo, F.M.A.2

1 Escola Superior Agrária de Santarém, Quinta do Galinheiro, 2000 Santarém, Portugal. 2 Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa, R. Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário, Alto

da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal.

A indústria de transformação de carne, devido à especificidade das tecnologias utilizadas e às margens de comercialização cada vez menores, apresenta algumas particularidades que justificam a construção de um modelo adequado à determinação dos custos de produção ou dos custos industriais dos produtos cárneos que fabrica.

O objectivo é apresentar um modelo para aplicação prática na determinação destes custos em produtos cárneos transformados considerando a tecnologia de fabrico e as operações prévias aplicadas às matérias primas, como é exemplo a estiva de uma peça de carne para transformação.

Questões do seguinte tipo: como se distribuem os custos por cada um dos produtos fabricados pela indústria e, por conseguinte, quais foram os seus custos unitários? e, quais os resultados com que cada produto contribuiu para o resultado do exercício? merecem particular atenção, uma vez que só com esta informação é possível determinar as margens dos preços de venda, efectuar a majoração das existências finais e controlar os custos de produção. Só desta forma se pode estabelecer o nível de rentabilidade dos processos e dos produtos ou fundamentar as decisões correctivas nos casos deficitários e promover a competitividade no mercado global.

Com este intuito recorreu-se à contabilidade industrial, que é a parte da contabilidade analítica que trata do apuramento e análise dos custos de produção ou custos industriais (Pereira e Franco, 1994; Rocha e Rúbio, 1999). São apresentados dois modelos para determinação de custos de produção diferenciados em função das respectivas tecnologias de fabrico (fumados e cozidos). Apresenta-se também uma metodologia para cálculo de uma estiva tipo.

Os cálculos basearam-se em dados reais obtidos numa indústria de transformação de carne em plena laboração.

Bibliografia

Pereira, C.C.; Franco, V.S. 1994. Contabilidade analítica. 6ª edição. Editora Reis dos Livros, Lda., Lisboa, Portugal; pp-841.

Rocha, A.; Rúbio, J.B.; 1999. Princípios de contabilidade analítica. Vislis Editores, Lda. Lisboa. pp-636.

Palavras-chave: Custos de produção ou custos industriais, Produtos cárneos, Indústria de transformação de carne, Estiva tipo, Contabilidade industrial, Tecnologia.


- 532 -

Development of a model to determine the costs of production in the meat transformation industries

Matos, T.J.S.1; Barreto, A.S.F.H.2; Bernardo, F.M.A.2

1 Escola Superior Agrária de Santarém, Quinta do Galinheiro, 2000 Santarém, Portugal. 2 Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa, R. Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário, Alto

da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal.

The meat transformation industries, due to the specific technologies used and the smaller commercialization margins, have some characteristics that justify a construction of an adequate model, determined by the costs of production, or the industrial costs of the meat product’s that are made.

The objective is to present a model for practical application in the determination of these costs of production, taking in consideration the manufacturing technology and the previous raw material processing, for example, the dissection of a piece of meat, and calculation of yield, for transformation.

Questions like: 1. How to distribute the costs of each product made by the industries and, there for which were there unitary costs?; 2.Which were the results with which each product contributed to the final accounting results?; deserve special attention, because only with this information will it be possible to determine the sales margin of prices at consumer level, make an increase in value at final accounting and control of the production costs. Only this way will it be possible to determine the level of profitability of the processes and products, or sustain the rectification decisions in case of imperfection and promote competitiveness in a global market.

With this in mind a turn to industrial accounting was necessary, which is the analytical part of accounting that investigates and analyses the production or industrial costs. (Pereira e Franco,1994; Rocha e Rúbio, 1999). Two models are introduced to determine the costs of differential production according to manufacturing processes (smoked and boiled). A methodical procedure is also introduced to determine a standard dissection or carving procedure.

These calculations are based on real data achieved in a meat company, under commercial conditions.

Bibliography

Pereira, C.C.; Franco, V.S. 1994. Contabilidade analítica. 6ª edição. Editora Reis dos Livros, Lda., Lisboa, Portugal; pp-841.

Rocha, A.; Rúbio, J.B.; 1999. Princípios de contabilidade analítica. Vislis Editores, Lda. Lisboa. pp-636.

Key words: Costs of production or industrial costs, Meat products, Meat transformation industry, Standard dissection procedure, Industrial accounting, Technology.

Documents

COMUNICAÇÕES LIVRES