Conceitos de cromatografia a gás

Minicursos CRQ-IV - 2010

Conceitos de cromatografia a gás

Conselho Regional de Química IV Região (SP) – Apoio: Caixa Econômica Federal

CURSO DE CROMATOGRAFIA A GÁSAYRTON ARGENTON

Prof. Ayrton Argenton: Químico formado pela USP. Pesquisador Sênior pelaREPUSA – Petrobrás, Chefe do Centro de Pesquisa da Oxiteno, Chefe dePesquisas e Laboratório da CGS Instrumentação Ltda. Ministrou treinamentostécnicos para centenas de empresas brasileiras. Mais de 20 anos de experiênciae especialização em treinamento de Cromatografia a Líquido e a Gás em Inds.Químicas, Farmacêuticas, Alimentícias, Destilarias e Usinas de Açúcar e Álcool eEmpresas relacionadas. Atualmente aplica Treinamentos e Consultoria pelo CEPCURSOS – Centro de Educação Profissional – www.cepcursos.com




Nas indústrias químicas, farmacêuticas,alimentos, cosméticos, refinarias depetróleo, petroquímicas, laboratórios deanálises clínicas e ambiental, forense entreoutras, frequentemente é necessárioseparar, isolar, purificar, identificar equantificar os componentes de misturasmuitas vezes bastante complexas.




SEPARAÇÃO• Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com diferentes composições.• É obtida por meios físicos embora reações químicas podem ser envolvidas no processo.• Os métodos físico - químicos de separação são baseados na utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem separadas.

Exemplos:

TIPO DE SEPARAÇÃO PROPRIEDADE FÍSICA

Destilação fracionada Diferença de ponto de ebulição(diferença na pressão de vapor)

Extração com solvente Diferença na constante de distribuição (partição) dos componentes em dois

solventes imiscíveis entre si.

Cromatografia Diferença de afinidade das substâncias por um material ativo ou adsorvente(FE)




VISÃO GERAL DE CROMATOGRAFIA

O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversosconstituintes de uma mistura de substâncias seja para identificação,quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.

Tal separação se dá através da migração da amostra através de uma faseestacionária por intermédio de um fluido (fase móvel).

Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, oscomponentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam maislentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da faseestacionária.

O equilíbrio de distribuição dos componentes entre as duas fasesdetermina a velocidade com a qual cada componente migra através dosistema.




COLUNA CROMATOGRÁFICA

CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL





CROMATOGRAMA

FLUXO

TEMPO

SIN

AL




Amostra gasosa ou liquida volatilizada é introduzida na corrente do gás de arraste que a leva sobre a FE numa coluna.Os constituintes se distribuem entre FE e FM, movendo-se a porção que está na fase vapor com o gás de arraste. Podem ser separados e saem da coluna em tempos diferentes característicos da coluna e das condições experimentais (vazão da FM, T).Ao sair da coluna, os constituintes, separados, passam por um dispositivo onde são detectados, emitindo um sinal elétrico que é registrado, constituindo o que se denomina cromatograma.

CROMATOGRAFIA A GÁS




IMPORTÂNCIA DA CROMATOGRAFIA

• Velocidade - Cromatografos convencionais Cromatografos com sistema para Fast CGMódulo para EZ Flash acoplado a CG convencional

• Poder de resolução – Capacidade de separar adequadamente os constituintes da amostra.

• Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 – 10-15g)

• Simplicidade da técnica




EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS




EXEMPLOS DE CROMATOGRAMAS




CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

CROMATOGRAFIA

PLANAR EM COLUNA

LÍQUIDO

LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA

GÁS FLUIDOSUPERCRÍTICO LÍQUIDO

LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA SÓLIDO FASE LIGADA LÍQUIDO SÓLIDO FASE LIGADA

FASEMÓVEL

FASEESTACIONÁRIA

TÉCNICA




COMPARATIVO HPLC / CG

Fator CG HPLC

Requisitos da amostra•amostra ou derivado volátil

•estável termicamente na temperatura de trabalho

•amostra solúvel na fase móvel

Tipo de Amostra•gases, líquidos e sólidos

•baixo peso molecular

•líquidos e sólidos•iônicos ou covalentes

•baixo e alto peso molecular

Tempo de análise relativo •em geral mais rápidas que HPLC •em geral mais lentas que CG

Pratos teóricos por coluna (Eficiência da coluna) •até 300000 •até 30000

Capacidade preparativa •pobre •boa

Sensibilidade •10-12 g (DIC / DCE)•10-9 g (UV)

•10-15 g (coulométrico)




SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

Em função da fase estacionária utilizada em cromatografia a gás os seguintesMecanismos são os responsáveis pelas interações entre analito e fase estacionária:

• Adsorção

• Partição




SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICAADSORÇÃO

A fase estacionária é um sólido contendo grupos (sítios ativos) que podem adsorver certassubstâncias. Ex. Peneira Molecular, Polímeros Porosos, Colunas PLOT

Na adsorção tem-se o seguinte equilíbrio:

Compostos com diferentes constantes de adsorção são separados.

Kads = [na FE] adsorvido [desorvido na FM]

FM FE





PARTIÇÃO

A fase estacionária é um líquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte sólido oudepositado ou quimicamente ligado à de um tubo capilar de silica fundida(CG)

As moléculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionárialigada e a fase móvel líquida(HPLC) ou fase móvel gasosa(CG) de acordo com sua afinidaderelativa:

Compostos com diferentes constantes de partição são separados.

Kpart = [dissolvido na FE]

[dissolvido na FM]





PARTIÇÃO

FM FE

A FM carrega as moléculas nela dissolvidas. Para reestabelecer o equilíbrio,moléculas na FE passam para a FM e são arrastadas. Tem-se um equilíbriodinâmico em cada segmento da coluna. Como a FM está em contínuo movimento,esta acaba retirando todas as moléculas da coluna.




PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

Uma série de parâmetros cromatográficos são importantes para serem utilizados naidentificação dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatográfico eauxiliar na optimização do processo de separação.

Os parâmetros cromatográficos a serem discutidos são:

• Tempo de retenção• Fator de retenção• Fator de separação• Número de pratos• Resolução





TEMPO DE RETENÇÃO

Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO, tr, de uma substância ao tempodecorrido desde o instante em que a amostra foi introduzida até o instante do máximo dopico. (onde to é o tempo de retenção de um composto não retido na fase estacionária)

Na análise cromatográfica, mantido constantes a vazão da fase móvel e a temperatura dacoluna, o tempo de retenção de cada componente é constante, desde que a FE não soframodificação.





A partir da figura acima, definimos os seguintes parâmetros cromatográficos de acordo com as equações abaixo:

Parâmetro Cromatográfico Definição

Fator de retenção k = t’r / to

Fator de separação = t’r2 / t’r1

Número de pratos N = 16 ( tr / Wb )2

Resolução Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)





FATOR DE RETENÇÃO (ou FATOR CAPACIDADE)

k = t’r / to

t’r= tr-toOnde:

t’r é o tempo de retenção corrigidoto é o tempo de retenção de um composto não retido

Relação entre o tempo de permanência de cada substância na fase

estacionária e o tempo de permanência na fase móvel.





FATOR DE SEPARAÇÃO

= k2 / k1 = t’r2 / t’r1

Relação entre os fatores de retenção de dois picos adjacentes. Por definição é sempre um número maior que a unidade.





NÚMERO DE PRATOS DA COLUNAN = 16 ( tr / Wb )2

Número indicativo da performance da coluna. É a medida da largura do pico em

relação ao seu tempo de retenção. É o parâmetro que mais precisamente define

a qualidade de um sistema cromatográfico.

Outra medida da eficiência da coluna é dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um prato teórico.

onde L = comprimento da colunaN = número de pratos

H = LN





RESOLUÇÃORs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)

Fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar duas substâncias.




PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSRESOLUÇÃO

Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)

Fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar duas substâncias.




A introdução da amostra na coluna leva menos de 1 segundo. Como o equilíbrio entre FE e FM émuito rápido, a largura dos picos também deveria ser aproximadamente 1 segundo. Entretanto,isso não ocorre devido a processos de transporte de massa que altera a velocidade das moléculasde um mesmo composto dentro da coluna. Estatisticamente algumas moléculas viajam maisrapidamente e outras mais lentamente que a média das moléculas, atingindo o detector em temposdiferentes. Consequentemente, o pico registrado é alargado.

Um tratamento teórico do comportamento das moléculas na coluna foi desenvolvido por VanDeemter.

H = A + (B/u) + (C*u)

A Equação de Van Deemter mostra a relação da “Altura Equivalente de Um Prato Teórico” - HETPou simplesmente H, com a velocidade linear da fase móvel, u. Segundo Van Deemter, algunsfatores contribuem para o alargamento de um pico dentro de uma coluna cromatográfica:• Caminhos preferenciais = difusão de Eddy = parâmetro A• Difusão longitudinal = parâmetro B• Resitência a transferência de massa = parâmetro C

EFICIÊNCIA DA COLUNA




Caminhos preferenciais, termo A da Equação de Van Deemter.Refere-se aos diferentes caminhos percorridos pelo soluto dentro da coluna em função

de irregularidades no empacotamento e na forma das partículas da fase estacionária. Este termotambém é conhecido como Difusão de Eddy.

• Difusão longitudinal, termo B da Equação de Van Deemter.Refere-se à difusão molecular do soluto na fase móvel. Quanto maior a difusão maior o

alargamento da banda do pico, logo, menos eficiente a coluna.

• Resistência à transferência de massa, termo C da Equação de Van Deemter.É sem dúvida o termo que mais exerce influência no alargamento dos picos e refere-se

à movimentação da amostra entre as fases móvel e estacionária. Como já descrito anteriormente,há um equilíbrio na transferência do soluto da fase móvel para a fase estacionária. Neste processo,as moléculas que estão mais próximas à fase estacionária interagem mais rapidamente.

Como a fase móvel mantém seu movimento, as moléculas de soluto mais distantes dafase estacionária são arrastadas pela fase móvel por um pequeno período de tempo, pequeno,porém suficiente para alargar o pico. Esta contribuição para o alargamento do pico é diretamenteproporcional ao tempo de retenção e isso ajuda a explicar a razão de os últimos picos docromatograma serem mais largos que os iniciais. Com o aumento da velocidade linear da fasemóvel aumenta-se o alargamento do pico.

EFICIÊNCIA DA COLUNA







SCAN FIG 2.14 – PAG. 9 -




INSTRUMENTAÇÃO

CROMATÓGRAFOA GÁS




CIOLA - 2 - CROMATÓGRAFOS

CROMATÓGRAFO




•Escolha do gás de arraste•Influência na eficiência da coluna, tempo de análise e sensibilidade do detector.•Disponibilidade, custo e segurança de operação•Helio, nitrogênio, hidrogênio, argônio •Natureza do gás de arraste – equação de Van Deemter•Difusão do soluto na fase gasosa.

FASE MÓVEL – GÁS DE ARRASTE




FASE MOVEL – GÁS DE ARRASTE

• A escolha da fase movel – gás de arraste – depende do tipo de detector que está sendo usado e do tipo de coluna, empacotada ou capilar.

•• No caso de análises com colunas capilares, normalmente necessita-se um gas

auxiliar (make up) para o detector, para obter sensibilidade otimizada.Coluna capilar – d.I.<0.32mm - HIDROGENIO - IDEAL

Hélio – aceitável Nitrogênio – menos aceitável

coluna megabore- d.I. 0.53mm – NITROGÊNIO – IDEAL HÉLIO – PODE SER USADO

Hidrogênio – não recomendado

Coluna empacotada: normalmente nitrogenio ou helio, mas no caso de detector de condutividade termica, hidrogenio ou helio são os mais recomendados.

Pureza dos gases: ideal é 99.9995% ou melhor, principalmente para detector de captura de eletrons.




- A injeção deve ser feita de modo que se obtenha uma “banda” única e estreita para se ter picos ideais.- Falhas na injeção podem causar assimetria dos picos- Quantidade de amostra não deve ultrapassar a capacidade da coluna, determinada pela quantidade de FE.- Quantidade injetada influi na eficiência da coluna - quanto menor, maior é a eficiência.- Quando se tem picos assimétricos, o volume injetado afeta o tR - Amostras líquidas são em geral vaporizadas no injetor(vaporizador) e arrastadas pela FM para a coluna.- Temp. vaporizador 20 – 30 ºC > PE do composto menos volátil da amostra.- Vaporização instantânea - flash vaporization injection- Injeção a frio direto na coluna - Cool on column injection

INJETOR E SISTEMAS DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA

AMOSTRA LIQUIDA




VÁLVULAS DE AMOSTRAÇÃO PARA GASES




INJETOR CAPILAR




INJETOR CAPILARCONFIGURAÇÃO COM SPLIT

ESQUEMA DE INJETOR – ANÁLISE COM SPLIT(DIVISOR DE FLUXO)




INJETOR CAPILARCONFIGURAÇÃO SPLITLESS

ESQUEMA DE INJETOR – ANÁLISE SPLITLESS (SEM DIVISOR)




OUTRAS TÉCNICAS DE INJEÇÃO

• Análise de compostos voláteis em baixas concentrações em matrizes sólidas ou líquidasou no ar atmosférico são em geral efetuadas por técnicas específicas:

• Head space – purge e trap – desorção• Head space(espaço confinante)• Componentes em amostras altamente diluidas e tão voláteis que exibem alta pressão de

vapor sôbre a matriz da amostra sólida ou líquida pode ser seletivamente introduzidasnuma coluna cg por transferência de vapor da amostra coletada do head space(espaçovazio sôbre a amostra) de um vial(frasco) fechado contendo a amostra aquecida .

• Purge e trap• A amostra colocada num tubo é borbulhada para arrastar os voláteis para um

adsorvente(tenax, carvão ativo…). Os componentes adsorvidos são liberados poraquecimento rápido e arrastados pelo gás de arraste são introduzidos no cromatógrafo.

• Desorçãoum dispositivo colocado numa pessoa, succiona o ar de um ambiente para um adsorvente específico, por um tempo definido, levado ao laboratório e desorvidotérmicamente ou extraido com um solvente e injetado no cromatógrafo. Outro procedimento é a adsorção dos vapores do ar ambiental para um “botton”, e no laboratório extraído com solvente e injetado no cromatógrafo.




A coluna é a essência do sistema cromatográfico, pois é nela que ocorrerá a separação dos componentes da amostra.Fase estacionária (suporte sólido e fase líquida)Tubo (material, comprimento e diâmetro)Colunas empacotadas e capilares

COLUNA/FORNO DA COLUNA

Parâmetro Empacotada Capilar

Diâmetro interno (mm) 1 – 4 0.1 – 0.75

Comprimento (m) 1 – 5 5 - 100

Pratos teórico por metro 2400 3000

Espessura do filme líquido (micra) 5 – 10 0.1 – 5

Granulometria das partículas (mesh)

80 – 100 -

Vazão média (ml/min) 20 – 60 1 – 10

Volume de amostra líquida (l) 0.2 – 5 0.001 – 0.5




Colunas Empacotadas (Packed Columns)Vidro, aço inox – 1 a 3m – d.i. 1 a 4 mmCGS e CGLEscolha da FE - similar dissolve similar

Colunas CapilaresD.I. 0.1 - 0,75 mm – 5 a 100 mSílica fundida, vidro, aço inox.Coluna tubular aberta com parede revestida (WCOT)Coluna com suporte recoberto (SCOT)Coluna com FE imobilizada ou quimicamente ligada às paredes do tubo –wall bond open tubular (WBOT)Coluna capilar(megabore) com camada porosa(PLOT)Colunas Capilares – aumento do numero de pratos teóricos e diminuição do alargamento das “bandas” portanto melhor resolução.

TIPOS DE COLUNA




Controlador de temperatura – variação 0,1ºCAnalises isotérmicas

•Amostras com PE elevado não eluem•Primeiros picos: agudos, pouco resolvidos•Posteriores: baixos, largos, muito resolvidos

FORNO DAS COLUNAS




Analises com Programação de Temperatura

•Determinação das condições de analise, inclusive isotérmicas•Tempo de analise reduzido•Limite de detecção e precisão da medida do pico são melhorados•Velocidade de injeção não precisa ser tão rápida•Transformações químicas dos componentes instáveis são minimizadas

FORNO DAS COLUNAS




• Compostos analisados numa coluna CGL/CGS são monitorados pelo detector• Sinal de saída é proporcional à quantidade do composto analisado que está eluindo e éregistrado como um traço contínuo (cromatograma).• Área de pico – medida manual ou eletronicamenteDesempenho dos detectores • Resposta – magnitude do sinal elétrico/massa do composto• Sensibilidade – Limite de Detecção – S = 2 ou 3 x N (N = ruido)• Limite de Determinação – 10 x N• Linearidade do detector .

DETECTORES

O




TIPOS DE DETECTORES

Detector Sensibilidade para compostos indicados no

caso de detectores seletivos

Faixa LinearSinal gerado é proporcional

linearmente com a conc.

DCT(TCD) 10-7 g mL-1 103 – 104

DIC(FID) 10-12 g (C)s-1 107

DCE(ECD) 10-16 moles mL-1 (lindano) 103 – 104

DTI (DNP) 10-14 g(N) s-1 (azobenzeno)10-15 g(P) s-1 (tributilfosfato)

103 – 105

DFC(FPD) 10-10 g(S) s-1 (tiofeno)10-12 g(P) s-1 (tributilfosfato)

103

105




• Principio: corpo aquecido perde calor com velocidade que depende da condutividade térmica do(s) gás(es) que o envolvem.• Detector: 4 filamentos de W aquecidos pela passagem de corrente elétrica e colocados na corrente do gás de arraste, num arranjo de Ponte Wheatstone e suportados num bloco metálico.

DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA




DCT - CIRCUITO ESQUEMÁTICO




SCAN TABELA 6.2 PAG.41




DCT- INFLUÊNCIA DA CORRENTE

Re . .sposta K R I T TF

g s

gf b

g

2 1

K = CONSTANTE DO DETECTORK = CONSTANTE DO DETECTOR R = RESISTÊNCIA DOS FILAMENTOSR = RESISTÊNCIA DOS FILAMENTOS I = CORRENTE DE ALIMENTAÇÃOI = CORRENTE DE ALIMENTAÇÃO Tb, Tf TEMPERATURAS DO BLOCO E DO FILAMENTOTb, Tf TEMPERATURAS DO BLOCO E DO FILAMENTO CONDUTIVIDADES TÉRMICAS DO GÁS DE ARRASTE ECONDUTIVIDADES TÉRMICAS DO GÁS DE ARRASTE E

SUBSTÂNCIASUBSTÂNCIA




• Gás de Arraste: corrente 10-14 amp; com composto orgânico, queima, gera radicais livres → algunssão ionizados → 10-12 a 10-6 A → amplificada → cromatograma Princípio: condutividade elétrica numgás é proporcional à quantidade de partículas carregadas presentes. H2 + O2 (ar) + gás de arraste:queimanum bico (jet). Ionização na chama é obtida aplicando um potencial > 200V.

DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA - DIC – FID

Não responde (ou apresenta reposta muito baixa) a: nitrogênio, óxidos de nitrogênio, monóxido edióxido de carbono, sulfeto de carbono, gás sulfídrico, dióxido de enxofre e água, tetracloreto decarbono. Isso é útil para uso como solvente – H2O, CS2, CCl4.Alta sensibilidade: 10-12 g/seg – análise de traçosEstável – Alta faixa de linearidade 10-6 a 10-7

Moléculas com O e halogênio diminuem a sensibilidade




DETECTOR DE IONIZACÃO DE CHAMA• A estrutura química, tipo de grupo func ional. Geometria e esqueleto de carbono e pm

influem na sensibilidade de geração de sinal.• A resposta é reduzida para compostos polares que contém heteroátomos como grupos

funcionais. Átomos de carbono ligados a heteroátomos são ionizados com muitomenos probabilidade ou não são ionizados e não contribuem para a intensidade do sinal do detector.

• Para análise quantitativa é importante que o fator de resposta seja determinado• Outros fatores que influem na resposta: fluxo dos gases de queima – h2 e ar, e gás de

arraste; geometria do sistema de eletrodo do detector, voltagementre os eletrodos.




Princípio: elétrons gerados por ionização do gás por uma fonte radioativa (Ni63 ou tritio) são capturados por alguns tipos de compostos, diminuindo a corrente que é registrada.Raios β emitidos pela fonte ioniza o N2 gerando elétrons: β + N2 → N2* + eˉÉ gerada uma corrente constante registrada como linha de base.Compostos eletronegativos captam elétrons diminuindo a corrente.A queda de corrente é proporcional à quantidade do composto eletro-aceptor que passa pelo detector.Gás Arraste: Nitrogênio ou Argônio a 5%CH4 - 30-40ml/min. no detector.

DETECTOR DE CAPTURA DE ELÉTRONS

Sensibilidade – Seletividade do DCEMuito sensível: 10-12 a 10-14 g de

substâncias com afinidade por elétronsHalogenados, nitrilas,

organometalicos → agrotóxicos.




DETECTOR DE CAPTURA DE ELÉTRONS







• Principio: fonte alcalina (pastilha de cerâmica com sal de Cs ou Rb) polarizada e coletor semelhante ao DIC. Interação dos vapores do metal alcalino com os compostos orgânicos de N ou P → íons negativos • Sensibilidade: N ~10-13

g/seg e P ~10-14 g/seg.; desprezível para orgânicos contendo C, H e O.

DETECTOR DE NITROGÊNIO E FÓSFORO (DNP-NPD)DETECTOR DE IONIZAÇÃO TERMOIÔNICO (DIT - TID)DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA ALCALINA




• Princípio: compostos são queimados em chama de O2 e H2 Compostos orgânicos de S e P ou outros elementos emitem luz de diversos comprimentos de onda. S e P emitem grande intensidade na região de 394 e 526 nm respectivamente → altamente sensível para S e P. A luz emitida é detectada usando fotomultiplicadora e com filtro apropriado, detecta-se só os elementos de interesse.• Fluxo de gás de arraste + auxiliar: pelo menos 20ml/min.• Fluxo de H2: 200 – 210ml/min. AR: 120 – 160ml/min

DETECTOR FOTOMÉTRICO DE CHAMA (DFC-FPD)

Sensibilidade:P → HPO* → luz a 526nm → 4x10-14 g/sS → S2* → luz a 394nm → 2x10-13 g/s




DETECTOR FOTOMÉTRICO DE CHAMA (DFC-FPD)




DETECTORES - CIOLA65

DETECTORES FID - FPD




• Princípio compostos são ionizados numa câmara contendo lâmpada ultra-violeta.

• R+h → R* + e-

• Sensibilidade:similar a DIC, porém aumenta para compostos que absorvem na região ultra-violeta, como p.ex. aromáticos.

• Responde à concentração; portanto a resposta diminui com aumento da vazão de gás de arraste + auxiliar. Normalmente gás de arraste a 20ml/min e auxiliar só com arraste menor que 10ml/min.

DETECTOR DE FOTOIONIZAÇÃO (DFI – PID)




DETECTOR DE FOTOIONIZAÇÃO (DFI – PID)

Utilizando lâmpadas de diferentes energias: 9,5; 10,2 ou 11,7 e V, as respostas dos primeiros membros de uma série homóloga se alteram.Assim os compostos com baixa S em DIC tem alta S em DFC: ex. dicloroetano, formaldeido.




GÁS DE ARRASTE E GÁS AUXILIAR

DETECTOR ARRASTE AUXILIAR ALTERNATIVAFID HIDROGÊNIO

HÉLIONITROGÊNIO

NITROGÊNIONITROGÊNIONITROGÊNIO

HÉLIOHÉLIOHÉLIO

NPD HIDROGÊNIOHÉLIO

NITROGÊNIO

HÉLIOHÉLIOHÉLIO

ECD HIDROGÊNIOHÉLIO

NITROGÊNIOARGÔNIO/CH4

ARGÔNIO/CH4ARGÔNIO/CH4NITROGÊNIO

ARGÔNIO/CH4

NITROGÊNIONITROGÊNIO

ARGÔNIO/CH4NITROGÊNIO

TCD HIDROGÊNIOHÉLIO

NITROGÊNIO

MESMO DO GÁSDE ARRASTE

FPD HIDROGÊNIOHÉLIO

NITROGÊNIO


HÉLIOHÉLIOHÉLIO

PID HIDROGÊNIOHÉLIO

NITROGÊNIO


HÉLIOHÉLIOHÉLIO




DETECTOR DE ESPECTROMETRIA DE MASSACG/MS

• O espectrômetro de massa baseia-se na ionização do analito efluente da coluna por meio de uma fonte de energia -70ev ou outro valor ajustável, num sistema a alto vácuo.

• O analito perde 1 eletron resultando numa molécula carregada positivamente, consideradacomo ion molecular.

• Devido a instabilidade dessa molécula, ela se fragmenta em várias partículas menores, características de sua estrutura.

• Essas partículas são detectadas, constituindo o espectro de massa.• A técnica de ionização utilizada é a de impacto de elétrons (ie).• Os sistemas cg/ms possuem bibliotecas com espectros de massas de vários compostos. • O espectro de massa de um determinado pico é comparado com os da biblioteca. Através da

similaridade dos espectros, o sistema indica a provável estrutura do composto com um certonível de probabilidade.

• Bibliotecas nist/epa/nih : ~75.000 espectros• Wiley: ~229.000 espectros• Pflegar/maurer/weber drogas e metabolitos: ~1400 espectros• Pesticidas: ~205 espectros• Pirólise: ~100 especros de polímeros• Flavors & fragancias: ~1200 espectros




DETECTOR DE ESPECTRÔMETRO DE MASSA (CG/MS)




DETECTOR DE ESPECTRÔMETRO DE MASSA (CG/MS)




DETECTORES - CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES

• Quando 1 analito separado na coluna,chega no detector, é gerado um sinal cujo valor é muito pequeno.

• Para possibilitar a detecção do pico, é necessário ampliar esse sinal, que é obido através de um sistema eletrônico – amplificador – que amplifica o sinal permitindo detectar o pico.

• Os amplificadores possuem um sinal máximo de saída, em geral 1v, podendo variar, de acordo com configuração do fabricante.

• A amplificação pode ser ajustada. A sensibilidade máxima do detector é obtida com a maior amplificação.

• Cada fabricante de CG possui um sistema de atenuação do amplificador (range do amplificador).

• Consideremos que o range selecionado dá a maior amplificação – sinal máximo 1v por exemplo.

• Ao injetar uma amostra, se um determinado analito gerar um sinal maior que 1v, a área calculada não é real, pois não se conhece o valor de sinal que foi gerado. Diz-se que o pico “estoura”. No software, observa-se um traço reto na escala de 1v.

• Se for preciso quantificar esse composto, é necessário que o pico de um sinal dentro da escala (no caso < 1v, o que é conseguido injetando menos amostra ou alterando o range para um valor menor.




AQUISIÇÃO DE DADOS

Atualmente utilizam-se softwares que permitem:

• Registrar e processar os dados do cromatograma;

• Efetuar as curvas de calibração;

• Controlar o sistema cromatográfico;

• Reprocessar os cromatogramas por ajuste dos parâmetros de

integração otimizados (width – threshold – tangente – vale, etc.);

• Selecionar a frequência de amostragem (x hz)) de modo a se ter

pelo menos 20 a 30 medidas por pico;

• Realizar os cálculos para verificar o “system suitability test”




SELEÇÃO DA COLUNA / FASES ESTACIONÁRIAS

A coluna é o coração do sistema cromatográfico e determina a eficiência e seletividade que pode ser alcançada na separação.

Colunas Empacotadas

• CGL – CGS• Tubo da Coluna• Inerte – estável termicamente – flexível• Vidro, aço inox, cobre teflon• Vidro – lavado com acido, e DMCS – tolueno – metanol – seca, com a finalidade de eliminar grupos SiOH do vidro que são adsorventes.




SELEÇÃO DA COLUNA / FASES ESTACIONÁRIAS

Colunas Capilares – Open Tubular Columns

• A fase liquida é revestida como um filme sobre a parede da coluna, portanto não contem suporte – wall coated open tubular (WCOT), ou é ligada quimicamente ao tubo de silica fundida• Vantagem: baixa contra pressão devido a suporte na coluna empacotadas ->-> mais longas para mesma queda de pressão.• Estreitas – para minimizar efeitos de transferência de massa na fase gasosa• TUBO: aço inox → vidro → silica fundida• Sílica fundida: poucas impurezas, resistentes, flexíveis.• Fases liquidas quimicamente ligadas à superfície, aumentaram a estabilidade das colunas, com diminuição do “sangramento” e arraste da FE por solventes das amostras, e superfície do tubo desativada. Podem ser lavadas para remover impurezas retidas.




SELEÇÃO DA COLUNA EM CGS

Seleção da Coluna em CGSFE: sólido poroso acondicionado num tubo.Separação: adsorção seletiva dos componentes da amostra nas partículas do sólido – peneiras moleculares, carvão – sílica gel – alumina –polímeros porosos.Peneiras moleculares 5A e 13X.







POLÍMEROS POROSOS – PORAPAK – CHROMOSORB 100




SELEÇÃO DA COLUNA EM CGL (PARTIÇÃO)

A separação é conseguida graças a diferença dos coeficientes de partição entre FE e FM dos constituintes da amostra analisada.

COLUNAS EMPACOTADAS E CAPILARESCOLUNAS EMPACOTADAS

SUPORTEFunçãoCaracterísticas:

Área especifica• Estrutura porosa adequada –• Tamanho de partícula uniforme: 80-100, 100-120 mesh• Inércia • Resistência mecânica elevadaPrincipais suportes utilizados em GGLDiatomitas – Chromosorb – Johns-Manville e outros







scan equivalencia de suportes – tabela 5.4 pag.27




SELEÇÃO DA COLUNA EM CGL (PARTIÇÃO)FASE LÍQUIDA

FL – componente mais importante da CGL – interações dos constituintes da amostra com a FL que permitirá obter separação.Características:

• Efetuar separação desejada• Não ser volátil na temperatura de operação• Estável termicamente em ampla faixa de T• Inércia química• Capacidade de dissolver os componentes da amostra• Fácil disponibilidade e baixo custoForça de Interação FL – Compostos:A solubilidade diferencial dos componentes da amostra é que governa a separação. Ela depende das forças coesivas de Van der Waals entre o soluto e a fase estacionária . Determinam a volatilidade relativa dos solutos, dos coeficientes da partição.




COLUNAS CAPILARES – OPEN TUBULAR COLUMNSA fase líquida é revestida como um filme sôbre a parede da coluna, portanto não contém suporte – wall coated open tubular(WCOT).

Vantagem: baixa contra pressão devido a não ter suporte como nas colunas empacotadas, e portanto pode-se ter colunas mais compridas e em consequência maior eficiência.

São estreitas – para minimizar efeitos de transferência de massa na fase gasosa.

Tubo: aço – vidro - sílica fundida.

Fases líquidas quimicamente ligadas à superfície (bonded phase), aumentam a estabilidade das colunas, com diminuição do “sangramento” e arraste da FE por solventes das amostras.

Superfície do tubo de sílica fundida desativada.




FASES LÍQUIDAS EM CGL

• Muitas das fase estacionarias liquidas são praticamente o mesmo material, produzido por diferentes fabricantes ou fornecedores, com nome ou código diferente.• Podem ser agrupadas em um número limitado de tipos com propriedades e estruturas similares → numero limitado de fases usadas para colunas capilares e empacotadas.• Classificação genérica: polares, não polares e fases especiais.

Fases Não Polares: não contem grupos que formem pontes de hidrogênio ou interação dipolo permanente - dipolo permanente.• Eluição de acordo com PE ou volatilidade relativa, nas condições de análise.

Fases Polares: contém grupos funcionais polares, tais como halogênio, hidroxila, nitrila, carbonila ou Ester. Os compostos contendo grupos polares interagirão mais fortemente que os não polares




FASES ESTACIONÁRIAS

• A grande maioria das FE de colunas capilares são constituidas de polisiloxanes (siliconas) com diferentes grupos ligados à sua estrutura que lhes proporcionam as diferentes características de interação com os componentes analisados.

• Além das polisiloxanes, são utilizadas também ,como fases estacionárias em colunas capilares, polímeros com grupos poliéteres (glicóis) e poliéteres modificados (glicóis modificados), e algumas outras com estruturas especiais para análise de compostos com isomeria óptica, são as fases quirais.

• As polisiloxanes são constituidas basicamente de grupos metila, fenila, ciano-propil, trifluoropropil, ligados ao esqueleto da silicona.

• A grande maioria das fases estacionárias atualmente utilizadas são quimicamente ligadas à superfície do tubo de silica fundida, o que lhe proporciona maior estabilidade térmica e a solventes, o que permitem que sejam lavadas para remoção de impurezas .

• Cada fabricante de colunas capilares atribui um código específico para suas colunas, as quais possuem características similares.




FASE ESTACIONÁRIAPOLI(DIMETILSILOXANE)

• Metilsilicona não polar. Fase ligada• Quimicamente compatível com água e outros

solventes. Pode ser lavada.

• Faixa de temperatura: -60c a 320c• NÚMERO DE MCREYNOLDS: x’- y’- z’- u’- s’ = 4 –

58 – 43 – 56 – 38• Aplicações típicas: hidrocarbonetos, gasolina,

solventes, alcóois, fame, ac.Graxos,alimentos, flavorizantes, fragâncias.

• Fases comerciais similares: ciola 1, db1, hp1, at1, fi53, cpsil5cb, optima1, ov1, ov101, zb1, 007-1, rtx1, bp1, spb1.

• Fase equivalente a cg-usp – g1




ANÁLISE DE ESTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRAXOS EM COLUNA NÃO POLAR - METILSILOXANE




ANÁLISE DE SOLVENTES DE EMBALAGENSCOLUNA TIPO POLIDIMETILSILOXANE




FASE ESTACIONÁRIAPOLI(5%DIFENIL- 95%DIMETILSILOXANE)

• Não polar – fase ligada.• Quimicamente compatível com agua e

outros solventes. Pode ser lavada.• Faixa de temperatura: -60c a 320c• NÚMERO DE MCREYNOLDS: x’- y’- z’-

u’- s’ = 19 – 74 – 64 – 93 - 62• Aplicações típicas: hidrocarbonetos,

gasolina, solventes, pesticidas, alimentos, fame, fenois, alcaloides aromáticos, drogas de abuso, flavorizantes, fragâncias.

• Fases comerciais similares: ciola 5, db5, hp5, at5, fi54, cpsil8cb, optima5, ov5, zb5, 007-5, rtx5, bp5, spb5..

• Fase equivalente a cg-usp – g27




ANÁLISE DE PESTICIDAS ORGANOCLORADOS EM COLUNA5%FENIL-95%METILISILOXANE




FASE ESTACIONÁRIAPOLI(14%CIANOPROPILFENIL-86%DIMETILSILOXANE)

• Polaridade intermediária. Fase ligada.• Grupo ciano torna a fase mais susceptível

a danificação por oxigênio e umidade do que outras fases de silicona. Pode ser lavada.

• Faixa de temperatura: subambiente a 280c

• NÚMERO DE MCREYNOLDS: x’- y’- z’- u’-s’ = 67 – 170 – 153 – 228 - 171

• Aplicações típicas: pesticidas, semi-voláteis, esteroides, ac.ORGÂNICOS, ALCOOIS, pahs, pcbs, AROCLOR, TRANQUILIZANTS.

• Fases comerciais similares: ciola1701, db1701, hp1701, fn210, cpsil19cb, optima1701, ov1701, 007-1701, rtx1701, bp10, spb1701.




FASE ESTACIONÁRIAPOLI(6%CIANOPROPILFENIL-94%DIMETILSILOXANE)

• Fase polaridade média. Fase ligada.• Fase desenvolvida para análises de

compostos organo-voláteis, halogenados, não halogenados e aromáticos pela técnica de purge & trap como contaminantes em ar, água potável, e efluentes e solos. Fase indicada para atender os vários requisitos dos métodos epa 502.2, 524.2, 601, 602, 624, 5041, 8010, 8020, 8260. Pode ser lavada..

• Faixa de temperatura: subambiente a 250c.

• Fases comerciais similares: db624, hp-voc, hp624, at624,rtxvoláteis, spb624, cpsil13cb, vocol

• Fase equivalente a cg-usp – g43 • A coluna tipo 624 é adequada para

análise de impurezas em alcool etílico




ALCOOL – ANÁLISE EM COLUNA TIPO 624POLI(6%CIANOPROPILFENIL-94%DIMETILSILOXANE)




COLUNA DESENVOLVIDA PARA ANÁLISE DE HALOGENADOS, NÃO HALOGENADOS E AROMÁTICOS VOLÁTEIS POR PURGE E TRAP




ANÁLISE DE ORGANOVOLÁTEIS




FASE ESTACIONÁRIA POLI-70%CIANOPROPILSILOXANE/SILFENILENO

• Polar. Fase ligada.• Fase estacionária desenvolvida pela sge com

grupo aromático silfenileno incorporado no esqueleto da siloxane, que permite operar a 260c isotermicamente e até 290c por programação de temperatura.

• Faixa de temperatura: 50 a 260c• Aplicação típica: anaálise de fame cis-trans.• Obs: a sge desenvolveu também fase com

90% ao invés de 70%cianopropilsiloxane/silfenileno, utilizada também para fame cis-trans, com retenção um pouco diferente.

• Fase comercial: bpx70 e bpx90.




ANÁLISE DE ESTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRAXOSCOLUNA POLI-70%CIANOPROPILSILOXANE/SILFENILENO




FASE ESTACIONÁRIAPOLIETILENOGLICOL(CARBOWAX 20M)

• Fase polar. Fase lquimicamente compatível com água e outros solventes, porém solven e metanol e água devem ser vaporizados no injetor antes de alcançar a

Coluna, portanto evite usar com injeção on-column. Pode ser lavada.

• Faixa de temperatura: 35 a 280c• NÚMERO DE MCREYNOLDS: x’- y’- z’-

u’- s’- : 305 – 551 – 360 – 562 – 484• Aplicações típicas: alcóois,

aromáticos(btex), glicois, fame, ac.Graxos, fenois, flavorizantes, fragâncias.

• Fases comerciais similares: ciola-wax, ]db-wax, hp-wax, hp-innowax, at-wax, cp-wax-52cb, permabond -cw20m, carbowax 20m, zb-wax, 007-cw, stabilwax, bp20, supelcowax 10, rtxwax, pe-wax.

•




ANÁLISE DE SOLVENTES COMPARATIVO DE COLUNA POLAR E NÃO POLAR




ANÁLISE DE FRAGÂNCIAS EM COLUNA POLIETILENOGLICOL




FASE ESTACIONÁRIAPOLIETILENOGLICOL MODIFICADO COM ÁCIDO NITROTEREFTÁLICO

• Fase polar. Fase ligada.• Quimicamente compatível com água e outros

solventes. Porém solventes como água e metanol devem ser vaporizados no injetor antes de alcançar a coluna, portanto evite uso com injeção on-column. Pode ser lavada.

• Faixa de temperatura: 60 a 200c• NÚMERO DE REYNOLDS: x’- y’- z’- u’- z’- : 311-

572 – 374 – 572 – 520• Aplicações típicas: alcoois, glicois, solventes,

fames, ácidos graxos livres(ideal).• Fases comerciais similares: ciola ffap, db-ffap,

hp-ffap, at-1000, cp-wax-58cb, peeermabond ffap, ov351, 007-ffap, stabilwax-da, bp21, nukol

• Fase cg-usp – g25.




ANÁLISE DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES EM COLUNA DE POLIETILENOGLICOL MODIFICADO COM ÁCIDO NITROTEREFTÁLICO




OUTRAS FASES ESTACIONÁRIAS COM ESTRUTURA DE SILOXANE

• Além das fases estacionarias mencionadas nos slides anteriores, várias outras são disponíveis.

• Destaca-se as fases com estruturas similares às citadas, porém com a designação fe-ms, produzidas com tratamento térmico especial para serem utilizadas em cg-ms. Para aumentar a estabilidade incorpora-se o grupo fenila entre átomos de silicio.

• Fases comerciais base metilsilicona similares: ciola1-ms, hp1-ms, db1-ms, cpsil-5cb-ms, optima-1-ms, mdm-1

• FASES COMERCIAIS BASE 5%FENIL95%METILSILICONA: CIOLA5-MS, HP5-MS, cpsil-8cb-ms, OPTIMA 5-MS, MDM-5

• Outras fases baseadas em polimetilsiloxane foram desenvolvidas especialmente para análises de larga faixa de ebulição de hidrocarbonetos e usada para pna,pona e piona. A literatura fornece dados de índice de retenção de kovats de mais de 400 analitos, o que permite identifica-los.

• Exemplos de fases comerciais similares: tr50.2PONA, db-petro100, cpsil-pona, rtx1-pona, BP1-PONA. Petrocol dh50.2.

• Outras fases base metilsilicona: petrocol dh150, petrocol dh, petrocol-dh-octil(esta permite separação na linha de base entre benzeno/1metilciclopenteno e tolueno/2,3,3 trimetilpentano.




ANÁLISE DE GASOLINA EM COLUNA PETROCOL DH




FASES ESTACIONÁRIASCOLUNAS PLOT

Colunas plot refere-se às colunas com fase estacionária sólida porosa, dentro de tubo de sílica fundida com diâmetro interno de 0.53mm( widebore).Plot (porous layer open tubular) – camada porosa em tubo aberto.As colunas plot foram desenvolvidas para substituir colunas empacotadas com fases estacionárias sólidas, com o objetivo de proporcionar maior número de pratos da coluna e consequentemente melhor resolução dos analitos.Por serem tubos abertos pode-se preparar colunas com maior comprimento: 15, 30. 50m SÃO OS MAIS UTILIZADOS.Exemplo de colunas plot:

1 - peneira molecular 5a para análise de gases: h2, o2, n2, ch4, coFASES COMERCIAIS SIMILARES: G5 molesieve, molesieve 5A, PLT5A, rt-msieve13x,

molsieve5aplot, hp-plot-molesieve, cp-molesieve 5A, mt-sieve5a, mxt-msieve 5A.2 – alumina – separa hidrocarbonetos leves: c1-c4 saturados e insaturados(exemplo glp) além de c5-

c10.Fases comerciais similares: gs-alumina, rt-alumina plot, alumina plot, al2o3/kcl,al2o3/na2so4.3 – alumina/kcl e alumina/na2so4 – polaridade menor que alumina.Fases comerciais similares: gs-alumina/kcl, cp-alumina/kcl, hp_plot al2o3, rt-alumina, valcoplot

al2o3/kcl, valcoplot al2o3/na2so4.




ANÁLISE DE HIDROCARBONETOS C1-C5 EM COLUNA PLOT




FASES ESTACIONÁRIASCOLUNAS PLOT

• Outros tipos de colunas plot utilizam polímeros porosos derivados de estireno-divinilbenzeno e outros compostos , usadas como alternativa das colunas empacotadas tipo porapks E hayeseps.

• Exemplo de colunas plot de polímeros porosos:• Base divinilbenzeno: GS-Q, PoraPLOT Q, PoraPLOT Q_HT, Rt-QPLOT, SupelQ PLOT,

HP-Q PLOT.A empresa Vici produz várias colunas plot baseadas nos polímeros porosos hayesep, com diferentes estruturas e diversas aplicações;Valco PLOT HAYESEP A: BASE DIVINILBENZENO/ETILENOGLICOLDIMETRACRILATO.ValcoPLOT HAYESEP B: BASE DIVINILBENZENO/POLIETILENODIIMINAValcoPLOT HAYESEP C: BASE DIVINILBENZENO/ACRILONITRILAValcoPLOT HAYESEP D: BASE DIVINILBENZENO DE ALTA PUREZAValcoPLOT HAYESEP N: BASE DIVINILBENZENO/ETILENOGLICOLMETACRILATOValcoPLOT HAYESEP P: BASE DIVINILBENZENO/ESTIRENOValcoPLOT HAYESEP Q: BASE DIVINILBENZENOValcoPLOT HAYESEP R: BASE DIVINILBENZENO/N-VINIL-2 PIROLIDINONAValcoPLOT HAYESEP S: BASE DIVINILBENZENO/4-VINIL-PIRIDINAAPLICAÇ/ÒES E CROMATOGRAMAS: www.vvici.com/columns/vp.php




ANÁLISE DE HIDROCARBONETOS C1-C5 EM COLUNA PLOT




CONDICIONAMENTO DAS COLUNAS

• Cada fase estacionária tem uma temperatura máxima de operação, acima da qual a sua pressão de vapor é suficientemente elevada para o gás de arraste carregá-la (sangramento), alterando portanto as características da coluna. Não operar a coluna acima dessa temperatura.

• Uma coluna nova pode ter oligômeros e/ou solvente residual e portanto é necessário condicioná-la para evitar deslocamento da linha de base.

• Para efetuar o condicionamento é recomendado instalar a coluna no injetor e não instalar no detector:

• AJUSTAR FLUXO DE GÁS DE ARRASTE (N2 OU he). Mantendo-o por cerca de 15 minutos a temperatura ambiente, para eliminar ar da coluna.

• Ajustar a temperatura do forno a ~50c e aumentar a temperatura gradativamente( ~10c/min) até ~20c abaixo da temperatura máxima e mante-la no mínimo 8 horas, no caso de uso de detector de captura de eletrons é necessário maior tempo de condicionamento. Resfriar o forno,e conectar a coluna no detector.




RECOMENDAÇÕES OPERACIONAIS

• Procedimento para iniciar operação do cromatógrafo:

• Primeiramente alinhar os gases para o cromatografo e ajustar os fluxos de trabalho.

• Manter o forno à temperatura ambiente por ~15 minutos e só então aquecer, para evitar que oxigênio do ar danifique a coluna.

• Para desligar o cromatografo, reduzir a temperatura do forno próximo da ambiente e só então fechar os gases e desligar o cromatógrafo

• Na retirada de uma coluna do forno( sempre a temperatura próxima da ambiente), certificar-se que as válvulas de h2 estejam fechadas.

• Na instalação da coluna, certificar-se que não há vazamento nas conexões do injetor e do detector.

• Quando necessário, recondicionar a coluna conforme o procedimento do condicionamento ou lavar (quando permitido) com solvente conveniente..

.




A análise qualitativa em CROMATOGRAFIA tem por objetivo aidentificação dos analitos de interesse.

Existem dois casos a serem considerados para análisequalitativa:

• Análise Qualitativa em controle de qualidade

• Análise Qualitativa em identificações não rotineiras

ANÁLISE QUALITATIVA




Análise Qualitativa em Controlede qualidadeÉ normalmente efetuada através dacomparação do tempo de retenção ouretenção relativa dos analitos deinteresse com esses parâmetros depadrões. Tais análises são realizadascom metodologias já estabelecidas.É fundamental o controle emonitoramento das condiçõesanalíticas para evitar conclusõeserrôneas.

ANÁLISE QUALITATIVA




ANÁLISE QUALITATIVAAnálise Qualitativa em identificações não rotineiras

Quando o objetivo é identificar compostos de presença possível em uma amostra, oucaracterização de contaminantes em uma amostra, o analista depara-se com uma situaçãocomplexa.Um rastreamento da amostra é muito útil, para auxiliar a identificação de compostos emanálise não rotineira.É necessário obter-se condições de detecção específica de cada componente. Isso podeocorrer de duas maneiras:

1.) com a separação dos compostos na coluna para técnicas de detecção não seletivas2.) através de uma condição de detecção exclusiva para o componente em questãomesmo que outros componentes eluam com mesmo tempo de retenção – detecçãoseletiva. Usando detectores que respondem especificamente a determinadoscompostos, tais como: ECD, PID, NPD, PFD.

Para esse tipo de análise,frequentemente é necessário o uso de diferentes tipos dedetectores; o detector de espectrometria de massa acoplado ao cromatografo é muitorecomendado, pois pode definir a estrutura do composto e portanto identificá-lo.




ANÁLISE QUALITATIVAIDENTIFICAÇÃO ATRAVÉS DO ÍNDICE DE RETENÇÃO DE KOVATS

O Índice de Retenção de Kovats é um parametro muito recomendado para identificar compostos num cromatograma.

A determinação do IR é feita injetando-se padrões de vários compostos, juntamente com normais parafinas e determinando os valores pela equação:

IR = 100n + 100 x (log tr i – log tr n/log tr n+1 – log tr n), para condições isotérmicas e IR = 100n + 100 x (tri – trn/trn+1 – trn) , por programação de temperatura

Onde n é o número de C da parafina que elui antes do composto e n+1 é o número de C da parafina que elui após o composto.

Existem muitos dados de ir publicados na literatura, para diferentes compostos: hidrocarbonetos (+ de 400), solventes, fragâncias, etc.

Injetando-se a amostra junto com n-parafinas, determina-se os índices de retenção dos compostos da amostra que comparados com dados da literatura é possível identifica-los.




ANÁLISE QUANTITATIVADuas metodologias:Métodos por normalizaçãoMétodos absolutos

MÉTODOS POR NORMALIZAÇÃO

Assume-se que todos os componentes da amostra eluem da coluna e são detectáveis

Existem dois procedimentos:

• Normalização de área (% em área)

• Normalização utilizando-se a área corrigida




ANÁLISE QUANTITATIVA

Métodos por normalização

Normalização de área (% em área)

Ai = área do composto iAi = somatória das áreas de todos componentes

Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional à suaconcentração e que mesma concentração de diferentes compostos resulte emáreas iguais (o que dificilmente ocorre).

100% xA

A

i

ii





Métodos por normalização

Normalização com área corrigida

onde Fi= Ci/Ai do componente i na mistura padrão

Ai = área do composto iFi = fator de resposta do componente iAiFi = somatória das áreas de todos componentes multiplicadas pelos respectivosfatores de resposta

É necessário conhecer todos os componentes da amostra para determinação dosfatores de resposta de cada componente

100% xxFA

xFA

ii

iii





Métodos absolutos

Utiliza-se métodos absolutos quando:

• O objetivo da análise é quantificar um ou alguns dos componentes da amostra.

• Ao utilizar detectores específicos ou seletivos que detectam somente os componentesde interesse

• Existência de compostos na amostra que não são eluídos nas condições de análiseou não são detectados e que não haja interesse de quantificá-los.

• Quantificação de componentes em baixa concentração.

• Existem dois procedimentos:•Padronização externa•Padronização interna




ANÁLISE QUANTITATIVAMétodos absolutos - Padronização externa

1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturaspadrões injetando-se um determinado volume.2. Posteriormente, injeta-se o mesmo volume da amostra e obtem-se a concentração doanalito através da curva de calibração.

Nesta técnica, se o volume injetado não for exatamente o mesmo ou se houver alteração dealgum parâmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo,variação da intensidade de luz do UV-VIS ou alteração na FM, as áreas dos picos poderãoser maiores ou menores daquelas obtidas na calibração e consequentemente os resultadosserão incorretos.

Ai

Ci





Métodos absolutos - Padronização interna

Para minimizar os problemas da padronização externa, a amostra e a misturapadrão são modificadas pela adição de um composto considerado comopadrão interno. O padrão interno deve ter as seguintes características:

1. Não estar presente na amostra original, ser estável e não reativa.2. Pico separado dos componentes da amostra3. Eluir próximo dos componentes de interesse4. Detecção semelhante dos picos de interesse5. Concentração que produza área similar aos picos analisados6. Pureza elevada ou conhecida (possíveis impurezas não devem eluir com os

picos de interesse).




Métodos absolutos - Padronização interna

1. Determina-se a curva de calibração de cada componente através da análise de misturaspadrões contendo o padrão interno. Nessa curva de calibração utiliza-se a relação entre áreado componente i e área do padrão interno em função das relações de suas concentrações.2. Posteriormente, injeta-se a amostra contendo padrão interno (preferencialmente namesma concentração utilizada na calibração) e obtem-se a concentração do analito atravésda curva de calibração.

Se o volume de amostra injetado for diferente do utilizado na calibração, ou se algumparâmetro analítico for alterado resultando em áreas diferentes daquelas esperadas nascondições de calibração, a relação de área entre analito e padrão interno não será afetada.

Ai / Api

Ci / Cpi




COMO ESCOLHER UMA COLUNA CAPILAR• A seleção da coluna é baseada em cinco fatores principais: tipo de amostra, tipo de

fase estacionária, diâmetro da coluna(id), espessura do filme de fase estacionária(df) (os quais estão interelacionados), e comprimento da coluna(L).

• AMOSTRA E FASE ESTACIONÁRIA• A fase estacionária é um filme polimérico cobrindo a parede interna da coluna

capilar. Diferenças nas propriedades químicas e físicas dos compostos orgânicos injetados e suas interações com a fase estacionária, são a base para o processo de separação.

• Interações entre os componentes da amostra e a fase estacionária variam em função das propriedades dos compostos analisados. Quando a ENERGIA DE INTERAÇÃO ANALITO-FASE difere significadamente para dois compostos, um é retido mais tempo que o outro.

• Mudando as características químicas da fase polimérica, altera suas propriedades físicas. Dois compostos que não são separados(co-eluem) numa fase estacionária particular podem ser separadas em outra fase de polaridade diferente, se a diferença de interação analito-fase for significativa.Esta é a razão da disponibilidade de uma variedade de fases de colunas capilares – cada fase fornece uma combinação de interações específicas para cada classe de analitos.




COMO ESCOLHER UMA COLUNA CAPILARTIPO DE FASE• POLARIDADE DA FASE – A escolha da fase estacionária é normalmente o item mais importante

na seleção de uma coluna. A caracteristica mais importante é a polaridade da fase, pois ela dita a seletividade, ou seja a habilidade da coluna separar os componentes da amostra.A seleção da fase é baseada no princípio químico geral que SIMILAR DISSOLVE SIMILAR. Uma coluna não polar é melhor para analises de compostos não polares. Colunas polares separam mais efetivamente compostos polares.

• MOLÉCULAS NÃO POLARES – Geralmente compostas só de átomos de carbono e hidrogênio, com simples ligações carbono-carbono, tais como os hidrocarbonetos parafínicos. Estes são bem separados por colunas capilares não polares. As interações entre compostos não polares e fase não polar é do tipo dispersiva, na qual a ordem de eluição é baseada nos pontos de ebulição.

• MOLÉCULAS POLARES – Compostas principalmente de átomos de carbono e hidrogênio, contendo um ou mais átomos de bromo, cloro, fluor, nitrogênio, oxigênio, fosforo ou enxofre. Compostos polares tipicamente analisados por coluna capilar incluem: alcoois, aminas, ácidos carboxílicos, diois, esteres, eteres, cetonas, bifenil policlorados(PCBs) e tiois.

• MOLÉCULAS POLARIZÁVEIS – Compostas de carbono e hidrogênio, contendo uma ou mais dupla ou tripla ligação, tais como olefinas e hidrocarbonetos aromáticos.

• Compostos polares e polarizáveis são geralmente separados em coluna de polaridade intermediária e polar. Além das interações dispersivas entre as moléculas polares e fases polares incluem interações dipolo e ácido-base. As separações são determinadas pelas diferenças dos efeitos globais destas interações.




COMO ESCOLHER UMA COLUNA CAPILARDIÂMETRO INTERNO DA COLUNA – ID• Os diâmetros internos das colunas capilares comerciais disponíveis permitem

balancear dois fatores: eficiência(N) e capacidade da amostra(quantidade de qualquer componente ser aplicado na coluna sem causar sobrecarga na coluna e portanto pico assimétrico.

• Colunas com ID 0.20, 0.25 e 0.32mm permitem maior resolução (maior eficiência), enquanto as “wide bore” (mega-bore) 0.53 e 0.75mm, maior capacidade de amostra. A natureza dos componentes da amostra e da FE afetam a capacidade da amostra: fases não polares tem maior capacidade de amostra para analitos não polares; fases polares tem maior capacidade de amostra para analitos polares.

• Outro fator a considerar é o tipo de detector, assim por exemplo detector de espectrometria de massa(CG/MS) não aceita os fluxos de gás de arraste elevado de colunas mais largas que 0.20 e 0.25mm.

• Para compostos que eluem muito próximos(ex.. Isomeros), usar colunas de ID 0.20 ou 0.25mm que dão maior resolução. Estas colunas requerem equipamento com dispositivo de splitting e controlador de fluxo que controla confiavelmente o fluxo de gás de arraste a baixas vazões.Para amostra em concentração elevada ou com larga faixa de concentração colunas com 0.53 e 0.75mm são melhores.




COMO ESCOLHER UMA COLUNA CAPILAR

ESPESSURA DO FILME DA FASE ESTACIONÁRIA - df• Quanto maior df, maior é a largura do pico – reduz a eficiência da coluna – devido a

maior dificuldade de transferência de massa(Equação de Van Deemter – H) e aumenta os tempos de retenção dos analitos e reduz a interação com a parede do tubo.

• Aumentando df, aumenta a capacidade máxima da amostra e a temperatura na qual um componente eluirá da coluna. Aumento da espessura do filme reduz a temperatura máxima limite da coluna devido ao maior “sangramento”da FE.

• Em geral colunas com filme fino – thin film -(0.10 a 0.25µm) são usados para análises com pontos de ebulição elevados. Os compostos eluem a temperaturas menores e com tempos de retenção mais curtos.

• Filmes mais grossos - thicker films-(1 a 5µm) são mais adequados para analitos com baixo ponto de ebulição(ex. Organo-voláteis e gases) Colunas com filmes espessos aumentam a retenção de compostos altamente voláteis, eliminando portanto a necessidade de criogenia no forno das colunas. Além disso possuem maior capacidade de amostra, reduzindo sobrecarga – overloading – (picos que alargam e dão caudas frontais para componentes em concentração elevada.




COMO ESCOLHER UMA COLUNA CAPILAR

COMPRIMENTO DA COLUNA – L• COLUNA MAIOR OFERECE MAIOR RESOLUÇÃO QUE COLUNA MENOR.• Porém há um limite prático para aumentar o comprimento da coluna: em análises

isotérmicas, numa coluna de 60m a resolução aumenta 40% em relação a uma coluna de 30m – a resolução (R) aumenta de acôrdo com a raiz quadrada de L, mas dobra o tempo de análise e aumenta a pressão requerida para mover a amostra através da coluna. Uma coluna de 60m custa mais do que uma de 30m.

• Em geral coluna de 30m dá o melhor balanço entre resolução e tempo de análise.• Usar coluna de15m para análises de “screening” ou para amostras simples cujos

componentes são de natureza química diferente.• Usar coluna de 60m quando as amostras são complexas ou voláteis com

componentes eluindo muito próximos, ou quando usar programação de temperatura para minimizar o aumento do tempo de análise.

• Para analisar essas amostras difíceis, uma coluna de 30m com espessura de filme grosso em geral é tão útil quanto uma de 60m.

• Em certos casos especiais é necessário colunas de 100 – 150m, por exemplo componentes de petróleo e esteres metílicos de ácidos graxos.




SELEÇÃO INICIAL DE COLUNA CAPILARReferências: Supelco – The Reporter Vol. 18.2 e 18.5

A forma mais simples para selecionar coluna capilar inclui: consultar colegascromatografistas, pesquisar a literatura de aplicações e/ou os Serviços Técnicos de fornecedores de colunas.O passo mais importante para o desenvolvimento de um novo método é conhecer o máximopossível da amostra, tais como:• Origem da amostra• Componentes e matriz da amostra• Número de compostos esperados• Ponto de Ebulição dos compostos• Faixa de ebulição da amostra• Grupos funcionais nos compostos• Concentração esperada dos compostos• Estabilidade térmica e química dos compostosConsiderar se que todos os compostos devem ser identificados e quantificados, o quedeterminará a necessidade de separação total ou parcial de todos os compostos e se seránecessário usar CG/MS e também o tempo de análise.Essas informações orientarão como selecionar a coluna.




SELEÇÃO INICIAL DE COLUNA CAPILAR

• Recomenda-se como primeiro passo, injetar a amostra numa coluna não polar, como polimetilsiloxane(DB1 ou similar) ou Poli 5%fenil – 95%metilsiloxane(DB5 ou similar)

• Utilizar coluna com 30m x 0.25mm x 0.25µm. Colunas de 0.25mm oferecem bom compromisso entre capacidade de amostra, eficiência de separação e tempo de análise.

• Condições iniciais dos testes:• Gás de arraste: Helio – velocidade linear – 25cm/seg – Pressão constante• Tcol: 50C – 10Cmin – até 300C – manter 10 min.• Split: 100:1 - Vol.inj: 1µL• Tdet(FID): 340C• Avalie se os resultados são aceitáveis: atingiram os objetivos? – separaram o

número de compostos esperados? – Os picos são simétricos? – O tempo de análise é aceitável?

• Se os resultados não forem satisfatórios, dependendo da irregularidade observada: reinstalar a coluna, ajustar condições analiticas diferentes, selecionar coluna com FE de diferente polaridade, injetar menos material.




SELEÇÃO INICIAL DE COLUNA CAPILAR




TROUBLESHOOTINGPROBLEMAS CROMATOGRÁFICOS E SOLUÇÕES

• A tarefa real para corrigir um problema com o sistema cromatográfico é identificar a causa, sem gastar tempo.

• Manuais dos equipamentos e informações de fornecedores de colunas e acessórios de cg, oferecem procedimentos sistemáticos para avaliar a causa do problema e sugestões de como soluciona-lo.(Ex. Bulletin 853b da supelco,catálogo da j& wScientific, e outros)

• Problemas mais comuns: picos fantasmas, ruido excessivo da linha de base,instabilidade da linha de bases, picos com cauda, picos divididos(split), deslocamento dos tempos de retenção, mudança da forma do pico, perda de resolução.

• As fontes de roblemas em cg são devidas às 5 fontes seguintes: o operador, a amostra, a coluna, os sistemas elétricos do instrumento e o sistema de fluxo de gases do sistema.




TROUBLESHOOTING

Áreas e itens a serem checados:

• 1- Gases – pressões, velocidade linear, fluxo(no detector, split e purga do septo).

• 2- Temperaturas – coluna, injetor, detector, linhas de transferência.• 3- Parâmetros do sistema – tempo de ativação da purga, atenuação e

range do detctor, range de massa injetada,etc.• 4- Linhas dos gases e traps – limpeza, vazamentos, expiração dos traps.• 5- Consumíveis do injetor – septos, liners, o’rings, anilhas.• 6- Integridade da amostra – concentração, degradação, solvente,

estocagem.• 7- Seringas – técnica de manuseio, vazamentos, limpeza, agulhas com

rebarbas.• 8 – Sistema de dados – ajustes e conexões.




TROUBLESHOOTING

• Picos fantasmas: contaminação do sistema é o mais provável – se os picos são de largura similar aos dos componentes da amostra(retenção similar), os contaminantes estão sendo introduzidos ao mesmo tempo que a amostra. Podem estar presentes no injetor, ou na própria amostra, devido a impurezas no solvente, vials, tampas e seringas.Injetando branco do solvente e amostra pode ajudar a encontrar as

possíveis fontes dos contaminantes.

• Se os picos fantasmas são mais largos do que os da amostra, deveriam estar na coluna antes de efetuar a injeção. Aumente a temperatura da programação ou o tempo para eliminar esses componentes e minimizar ou eliminar o problema. Alternativamente utilize a técnica de backflush.




REFERÊNCIAS PARA CONSULTA

Fundamentos da Cromatografia a Gás – REMOLO CIOLA-, ed. Edgard Blucher -

Bulletin 792, Packed Column - Troubleshooting guide, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

Bulletin 853B, Capillary GC - Troubleshooting guide, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

Bulletin 879, CG and HPLC Phases and packings for US Pharmacopoeia methods, http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.html

THE REPORTER – 18,2, 18.5, 18.11 E 19.9 – SITE DA SUPELCO –

Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, número 3, junho 1998, Validação de métodos cromatográficos, pág. 12

PERIÓDICOS: Journal of Chromatography – Journal of chromatographic Science – Chromatographia etc.




Fontes de internetFornecedores de equipamentos – colunas e acessórios de CG e HPLC

www.chem.agilent.comwww.alltech.web www.dionex.comwww.esind.comwww.gls.co.jpwww.hamiltoncompany.comwww.macherey-nagel.comwww.mac-mod.comwww.merck.dewww.microlc.comwww.microsolvtech.com/

www.phenomenex.comwww.instruments.perkinelmer.comwww.polymerlabs.comwww.restekcorp.com/hwww.sigmaaldrich.com/Brands/Supelcowww.thermo.comwww.tosoh.com/www.varianinc.comwww.vydac.com/www.waters.comwww.zirchrom.com/




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