CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DE …repositorio.unb.br/bitstream/10482/3379/1/2007_CintiaAlvesdeMatos... · 3.1.2.4 Análise do CG-EM no tempo de retenção 49,36

Cntia Alves de Matos Silva

CONTRIBUIO AO ESTUDO QUMICO E

BIOLGICO DE Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.)

Baehni (Sapotaceae)

Universidade de Braslia Braslia

2007

Dissertao apresentada Faculdade de Cincias da Sade da Universidade de Braslia, como requisito parcial para a obteno do grau de Mestre em Cincias da Sade.


CONTRIBUIO AO ESTUDO QUMICO E

BIOLGICO DE Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.)

Baehni (Sapotaceae)

Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de Ps-graduao da

Faculdade de Cincias da Sade da Universidade de Braslia, como requisito

parcial para a obteno do grau de Mestre em Cincias da Sade.

Universidade de Braslia Braslia

2007

CURSO DE PS-GRADUAO EM CINCIAS DA SADE FACULDADE DE CINCIAS DA SADE

UNIVERSIDADE DE BRASLIA

Termo de Aprovao

CONTRIBUIO AO ESTUDO QUMICO E BIOLGICO DE

Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni (Sapotaceae)


Dissertao aprovada pelos membros da Banca Examinadora constituda pelos

professores:

___________________________________________________ Dra. Dmaris Silveira (Orientadora)

Faculdade de Cincias da Sade da Universidade de Braslia

___________________________________________________ Dra. Maria Luclia dos Santos

Instituto de Qumica da Universidade de Braslia

___________________________________________________ Dr. Carlos Frederico de Souza Castro

Curso de Qumica da Universidade Catlica de Braslia

___________________________________________________ Dra. Ins Sabioni Resck

Instituto de Qumica da Universidade de Braslia

Braslia, 05 de junho de 2007

.

O trabalho descrito nesta dissertao

foi realizado sob orientao da Professora

Dmaris Silveira.

Dedico este trabalho aos meus

pais, aos meus irmos e ao meu noivo

por tudo o que eles representam na

minha vida.

preciso reviver o sonho e a certeza de que tudo vai mudar. necessrio abrir os olhos e perceber

que as coisas boas esto dentro de ns: onde os sentimentos no precisam de motivos,

nem os desejos de razo. O importante aproveitar o momento e aprender sua durao.

(Gabriel Garcia Mrquez)

AGRADECIMENTOS

Foram longos momentos de desafios e provaes, porm momentos de intenso

aprendizado e de prazer. Pude compartilhar esses momentos com vrias pessoas e para

algumas delas apresento meus agradecimentos e carinho:

Aos meus pais Antnio Alves da Silva e Madalena Alves de Matos Silva, por

todo amor, por todos ensinamentos, por toda dedicao, por estarem comigo sempre,

por serem a minha base e minha fora em todos os momentos da minha vida.

Aos meus irmos, Hugo e Igor pelos momentos de alegria, compreenso, apoio e

por todos os momentos que foram compartilhados em famlia.

Meu agradecimento e respeito Professora Dmaris Silveira, pela excelente

orientao e por todos os momentos de aprendizado que passamos juntas.

Ao meu noivo Wendel Ribeiro, pelo seu companheirismo, por sua amizade

intensa e verdadeira, por todos os momentos, difceis ou no, em que passamos juntos

durante esse desafio e por tudo o que ele representa na minha vida.

Aos meus eternos amigos Karine Figueiredo e Jonatas Gomes, que nunca

mediram esforos para me ajudar, me acolher e me ouvir. Por tudo o que vivemos

juntos desde a graduao at hoje, amigos verdadeiros que quero pra sempre em minha

vida.

Ao meu grande amigo e Professor Carlos Frederico de Souza Castro, que me

ajudou a dar o primeiro passo para que esse sonho virasse realidade. Pela amizade e

compreenso, por seus ensinamentos e por todos os momentos que eu precisei e que ele

sempre me ajudou.

Aos meus amigos que conquistei nessa caminhada: Andressa, Anelise, Letcia,

Ceclia, Jaqueline, Rilva, Jlia, Cristina Simeoni, Tatiane e todos os outros que conheci

durante esse estgio da minha vida e que me deram apoio e alegria.

minha amiga Marta Soares que foi o meu apoio psicolgico nesse momento

to importante da minha vida.

Aos professores da ps-graduao: Luiz Simeoni, Ins Resck, Maria Lucilia

Santos e Damaris Silveira por todo apoio, amizade e dedicao.

Aos funcionrios que de alguma forma contriburam para a realizao deste

projeto, com destaque para Carlos Antnio Ribeiro (tcnico de laboratrio) que em

diversos momentos me socorreu em meus experimentos e para Edigrs Alves

(Secretria da Ps-graduao) pela constante ajuda administrativa.

Aos meus colegas de ps-graduao, Ismael e Ivelone por vrios momentos que

passamos juntos e que compartilhamos aprendizados e experincias.

E principalmente a Deus, por me capacitar, me dar foras, ser o meu refgio, por

me dar sade, pela minha famlia e por ter me possibilitado conhecer pessoas to

incrveis que estaro pra sempre em meu corao.

Muito Obrigado a todos.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Aos meus pais por tudo o que representam na minha vida, minha famlia e ao

meu noivo.

Universidade de Braslia (UnB).

Faculdade de Cincias da Sade e Coordenao da Ps-graduao.

Ao CNPq, FINEP, FINATEC e CAPES pelo suporte financeiro.

professora Maria Luclia dos Santos, Instituto de Qumica (UnB), cuja

orientao foi essencial para a concluso deste trabalho.

professora Ins Sabioni Resck, Instituto de Qumica, pelas anlises

espectromtricas.

Aos Professores Carlos Frederico, Luiz Kanzaki, Luiz Simeoni e aos colegas, Ana

Lcia, Amabel pelos ensaios biolgicos.

Cludia pelas anlises de espectrometria de massas.

Ao professor Jos Elias de Paula, Instituto de biologia, pela coleta e identificao

da espcie.

Aos alunos de PIBIC e estgio: Ricardo de Oliveira, Viviane Lima, Sofia Feres,

Carolina Perdigo, Juliana Camilo e Sthephanie que contriburam diretamente

para a realizao deste trabalho.

Aos Professores Luiz Alberto Simeoni e Francisco de Assis da Rocha Neves, do

Laboratrio de Farmacologia Molecular (FARMOL/UnB), por permitir a

utilizao do laboratrio.

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS i

LISTA DE TABELAS iii

LISTA DE FLUXOGRAMA v

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS vi

RESUMO ix

ABSTRACT x

CAPTULO 1: INTRODUO 1

1.2 Constituintes qumicos e atividades biolgicas do gnero Pouteria 10

1.3 Compostos isoprnicos de esqueleto C30 e seus derivados: ocorrncia e

atividade biolgica 17

RELEVNCIA E OBJETIVOS 28

CAPTULO 2: MATERIAIS E MTODOS 30

2.1 MTODOS GERAIS 31

2.1.1 Cromatografia em Camada Delgada 31

2.1.1.1 Fase estacionria 31

2.1.1.2 Eluentes 31

2.1.1.3 Reveladores 31

2.1.2 Cromatografia em Coluna 33

2.1.2.1 Cromatografia lquida 33

2.1.2.2 Cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas 33

2.1.3 Anlises Espectromtricas 34

2.1.3.1 Espectrometria no Infravermelho 34

2.1.3.2 Ressonncia Magntica Nuclear 34

2.1.4 Testes biolgicos 34

2.1.4.1 Toxicidade em larvas de Artemia salina 34

2.1.4.2 Atividade fotoprotetora 35

2.1.4.3 Atividade Antioxidante 35

2.1.4.3.1 Mtodo de Varredura pelo Perxido de Hidrognio 35

2.1.4.3.2 Atividade seqestradora do radical DPPH 36

2.1.4.4 Atividade antimicrobiana 37

2.1.4.4.1 Atividade antibacteriana 37

2.1.4.4.1.1 Mtodo de difuso em gar 37

2.1.4.4.2 Atividade antifngica 38

2.1.4.4.2.1 Mtodo de difuso em gar 38

2.1.4.5 Teste de inibio de proliferao celular 39

2.1.4.5.1 Ensaio de proliferao celular MTT 39

2.2 PARTE EXPERIMENTAL 41

2.2.1 Descrio botnica 41

2.2.2 Obteno do material botnico 41

2.2.3 Obteno dos extratos brutos 41

2.2.3.1 Extrato hexnico (EH) e extrato etanlico (EE) 41

2.2.3.2 Extrato aquoso (EA) 41

2.2.4 Isolamento e identificao de constituintes qumicos das folhas de

Pouteria gardnerii 43

2.2.4.1 Fitoqumica do extrato hexnico de Pouteria gardnerii (EH) 43

2.2.4.1.1 Elaborao da frao hexnica EHH 43

2.2.4.1.1.1 Estudo farmacognstico da frao hexnica EHH 44

2.2.4.1.2 Elaborao da frao Hexano: AcOEt 1:1 (EHHA) 45

2.2.4.1.2.1 Estudo farmacognstico da frao Hex: AcOEt (1:1) EHHA 46

2.2.4.2 Fitoqumica do extrato etanlico (EE) das folhas de P. gardnerii 47

2.2.4.2.1 Elaborao da frao Hex: AcOEt 1:1EEHA 48

2.2.4.2.1.1 Estudo farmacognstico da frao EEHA 49

2.2.4.2.2. Partio trifsica do extrato etanlico (EE) de folhas de Pouteria

gardnerii 49

2.2.4.2.2.1 Elaborao da frao MeCN:CHCl3 (ETMC): Primeira Coluna 50

2.2.4.2.2.2 Elaborao da frao MeCN:CHCl3 (ETMC) : Segunda Coluna 51

CAPTULO 3: RESULTADOS E DISCUSSO 53

3.1 Identificao de substncias presentes no extrato hexnico 54

3.1.1 Mistura de hidrocarbonetos (PG01) 54

3.1.2 Mistura de triterpenos e steres graxos (PG02) 57

3.1.2.1 Anlise do CG-EM no tempo de reteno 48,89 min 61




3.1.2.5 Anlise do CG-EM no tempo de reteno 50,45 min e 52,77 min 67

3.2 Identificao de substncias presentes no extrato etanlico 75

3.2.1 Mistura de steres de cadeia longa (PG3) 79

3.2.2 acetato de -amirina (PG4) 78

3.2.3 Mistura de lcoois de cadeia longa (PG5) 78

3.2.4 Mistura de triterpenos (PG6) 80

CAPTULO 4: ATIVIDADE BIOLGICA DOS TRITERPENOS

PRESENTES NAS FOLHAS DE Pouteria gardnerii 85

CAPTULO 5: ENSAIOS BIOLGICOS 106

5 Avaliao da atividade biolgica de Pouteria gardnerii 107

5.1 Atividade citotxica 107

5.1.1 Modelo da toxicidade em larvas de Artemia salina 107

5.1.2. Teste de inibio de proliferao celular 109

5.2 Atividade fotoprotetora 111

5.3 Atividade Antioxidante 113

5.3.1 Mtodo de Varredura pelo Perxido de Hidrognio 114

5.3.2 Mtodo do seqestro do radical livre DPPH 115

5.4 Atividade antimicrobiana 116

5.4.1 Mtodo do disco 116

5.4.1.1 Atividade antibacteriana 117

5.4.1.2 Atividade antifngica 118

CAPTULO 6: DADOS ESPECTROMTRICOS 119

6.1 Mistura de hidrocarbonetos (PG1) 120

6.2 Mistura de triterpenos: -e -amirina, acetatos de -amirina e lupela

(PG2) 120

6.3 Mistura de steres de cadeia longa (PG3) 121

6.4 Acetato de -amirina (PG4) 122

6.5 Mistura de lcoois de cadeia longa (PG5) 122

6.6 Mistura de triterpenos: cido urslico e cido oleanlico (PG6) 122

CAPTULO 7: CONCLUSES E PERSPECTIVAS 124

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 127

ANEXO I 159

ANEXO II 161

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1.1: Esquema da rota biossinttica para formao dos terpenides 18

FIGURA 1.2: Formao do esqualeno por meio do acoplamento cauda-cauda

de duas unidades de pirofosfato de farnesila 19

FIGURA 1.3: Esquema da ciclizao do esqualeno 21

FIGURA 1.4: Ciclizao do 2,3-xido de esqualeno e alguns exemplos de

triterpenos e saponinas de plantas 23

FIGURA 1.5: Exemplo de ciclizao do ction damarenil para a formao de

alguns triterpenos pentacclicos 24

FIGURA 1.6: Exemplo de ciclizao do ction protosteril para a formao de

alguns triterpenos pentacclicos 24

FIGURA 1.7: Exemplo de ciclizao do esqualeno e do xido de esqualeno

pela enzima tetraimanolsintase 25

FIGURA 1.8: Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni. 27

FIGURA 3.1: Espectro na regio do Infravermelho de PG1 (KBr, cm-1) 55

FIGURA 3.2: Espectro de RMN de 1H de PG1 (300 MHz, CDCl3) 55

FIGURA 3.3: Espectro de RMN de 1H de PG1 Expanso da regio

entre 0,5- 1,0 (300 MHz, CDCl3) 56

FIGURA 3.4: Espectro de RMN de 13C de PG1 ( 75 MHz, CDCl3) 56


FIGURA 3.6: Cromatograma obtido por cromatografia gasosa acoplada

espectrometria de massa de PG02 (IE, 70 eV). 60

FIGURA 3.7: Espectro de massas correspondente (IE, 70eV) ao TR =48,89min. 61

FIGURA 3.8: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR =49,19min. 62

FIGURA 3.9: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR =50,26min. 63

FIGURA 3.10: Comparao entre os espectros de massas dos derivados de

ursanos e devivados de oleanos. 64

FIGURA 3.11: Fragmentao caracterstica de triterpenos pentacclicos com

dupla ligao na posio C12, via Retro-Diels-Alder (RDA) 65

FIGURA 3.12: Proposta de fragmentao de -amirina (srie ursano) por

mecanismo envolvendo reao Retro-Diels-Alder (RDA) 65

FIGURA 3.13: Proposta de fragmentao de -amirina (srie oleano) por


FIGURA 3.14: Espectro de massas correspondente (IE, 70eV) ao TR=49,36min 67

FIGURA 3.15: Proposta de fragmentao do germanicol (srie oleano) por


FIGURA 3.15: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR =50,26min 68

FIGURA 3.16: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR =50,45min 68

FIGURA 3.17: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR=52,77min. 68

FIGURA 3.18: Proposta de fragmentao de acetato de lupela (srie lupano)

por mecanismo envolvendo clivagem sigma e rearranjos 69

FIGURA 3.19: Espectro de RMN de 1H de PG2 Expanso da regio entre

4,0- 5,5 (300 MHz, CDCl3) 71

FIGURA 3.20: Espectro de RMN de 1H de PG2 Expanso da regio entre

0,8- 2,4 (300 MHz, CDCl3) 71

FIGURA 3.21: Espectro de RMN de 13C de PG2 (75 MHz, CDCl3) 72


FIGURA 3.23: Espectro de RMN de 1H de PG3 (300MHz, CDCl3) 76

FIGURA 3.24: Espectro de RMN de 1H de PG3 - Expanso da regio entre

1,0 4,5 (300MHz, CDCl3) 77

FIGURA 3.25: Espectro de RMN de 13C de PG3 ( 75 MHz, CDCl3) 77

FIGURA 3.26.: Espectro na regio do Infravermelho de PG5. (KBr, cm-1) 78

FIGURA 3.27: Espectro de RMN de 1H de PG5 (300 MHZ, CDCl3) 79

FIGURA 3.28: Espectros de RMN de 13C de PG5 ( 75 MHz, CDCl3) 80


FIGURA 3.30: Espectro de RMN de 1H de PG6 (300 MHZ, CDCl3) 82

FIGURA 3.31: Espectro de RMN de 1H de PG6 - Expanso da regio entre

2,4 - 5,6 (300MHz, CDCl3). 82

FIGURA 3.32: Espectros de RMN de 13C de PG6 ( 75MHz, CDCl3) 83

FIGURA 5.1: Efeito dos extratos aquoso e etanlico de folhas de Pouteria

gardnerii clulas CALU 109

FIGURA 5.2: Efeito dos extratos aquoso e etanlico de folhas de Pouteria

gardnerii em clulas A427 110

FIGURA 5.3: Absorbncia mdia na faixa de 290-320 nm (UVB) de PABA

em diferentes concentraes 112

FIGURA 5.4: Comparao entre a absorbncia, na faixa de comprimento de

onda de 200 a 400 nm, dos extratos aquoso e etanlico de folhas de P.

gardinerii e PABA 113

LISTA DE TABELAS

TABELA 2.1: Fraes obtidas na elaborao da frao hexnica (EHH) do

extrato hexnico (EH) das folhas de Pouteria gardnerii 44

TABELA 2.2: Estudo farmacognstico da frao hexnica (EHH). 44

TABELA 2.3: Fraes obtidas na elaborao da frao Hex:AcOEt (EHHA)

do extrato hexnico (EH) das folhas de Pouteria gardnerii 46

TABELA 2.4: Estudo farmacognstico da frao Hex:ACOEt (EHHA) 47

TABELA 2.5: Fraes obtidas na elaborao da frao Hex:AcOEt (EEHA)

do extrato etanlico (EE) das folhas de Pouteria gardnerii 48

TABELA 2.6: Estudo farmacognstico da frao Hex:AcOEt (EEHA) 49

TABELA 2.7: Fraes obtidas na elaborao da frao MeCN:CHCl3

(ETMC1) do extrato etanlico (EE) das folhas Pouteria gardnerii 51

TABELA 2.8: Fraes obtidas na elaborao da frao MeCN:CHCl3

(ETMC2) do extrato etanlico (EE) das folhas Pouteria gardnerii 52

TABELA 3.1: Dados da cromatografia em fase gasosa acoplada

espectrometria de massas de PG2 59

TABELA 3.2: Fragmentaes mais relevantes em alguns triterpenos. 69

TABELA 3.3: Atribuio dos deslocamentos qumicos (, CDCl3, 75MHz)

dos carbonos de PG2, em comparao com dados da literatura (,

CDCl3, 75MHz) (SOLICHIN, 1980; MAHATO & KUNDU, 1994). 73

TABELA 3.4: Atribuio dos deslocamentos qumicos (, CDCl3, 75MHz)

dos carbonos de PG2, em comparao com dados da literatura (,

CDCl3, 75MHz) 74

TABELA 3.5: Deslocamentos qumicos (, CDCl3, 75MHz) dos carbonos de

PG6, em comparao com dados da literatura (, CDCl3, 75MHz) 84

TABELA 4.1: Espcies vegetais dos quais os triterpenos - e - amirina,

acetato de lupela, cidos urslico e oleanlico foram isolados 99

TABELA 5.1 Avaliao citotxica frente s larvas de Artemia salina. 108

TABELA 5.2 Atividade Antioxidante, pelo mtodo de varredura pelo

perxido de hidrognio, dos extratos etanlico e aquoso de Pouteria

gardnerii. 115

TABELA 5.3 Atividade antioxidante pelo mtodo do seqestro do radical

livre DPPH de extratos brutos de Pouteria gardnerii 116

TABELA 5.4: Atividade antibacteriana de folhas de Pouteria gardnerii 117

LISTA DE FLUXOGRAMAS

FLUXOGRAMA 2.1: Obteno do extrato hexnico (EH) e etanlico (EE)

de folhas de Pouteria gardnerii 42

FLUXOGRAMA 2.2: Obteno do extrato aquoso bruto (EA) de folhas de

Pouteria gardnerii 42

FLUXOGRAMA 2.3: Fracionamento do extrato hexnico bruto (EH) das

folhas de Pouteria gardnerii 43

FLUXOGRAMA 2.4: Fracionamento do extrato etanlico bruto (EE) de


FLUXOGRAMA 2.5: Partio trifsica do extrato etanlico bruto (EE) de


LISTA DE ABREVIATURAS E ACRNIMOS

AAS cido acetil saliclico

AcOEt Acetato de Etila

ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

APT Approach Proton Test

ATCC American type culture collection

BHT Butil hidroxi toluento

CC Cromatografia em Coluna

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CCP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

CE50 Concentrao Efetiva Mediana

CG-EM Cromatografia gasosa acoplado ao espectrmetro de massas

CIM Concentrao Inibitria Mnima

CL 50 Concentrao Letal Mediana

cm Centmetro

d dupleto

dd dupleto duplo

DL 50 Dose mnima letal para 50% dos indivduos

DMSO Dimetilsulfxido

DOU Dirio Oficial da Unio

DPPH 2,2-difenil-1-picrilidrazila

EA Extrato aquoso

EE Extrato Etanlico

EEA Frao acetato de etila do extrato etanlico

EEAM Frao acetato de etilametanol (11) do extrato etanlico

EEH Frao hexnica do extrato etanlico

EEHA Frao hexanoacetato de etila (11) do extrato etanlico

EEM Frao metanlica do extrato etanlico

EH Extrato Hexnico

EHA Frao acetato de etila do extrato hexnico

EHAM Frao acetato de etilametanol (11) do extrato hexnico

EHH Frao hexnica do extrato hexnico

EHHA Frao hexanoacetato de etila (11) do extrato hexnico

EHM Frao metanlica do extrato hexnico

ER Estrogen receptor (Receptor de estrognio)

ERO Espcie Reativa de Oxignio

ETMC Frao acetonitrilaclorofrmio do extrato etanlico

EtOH Etanol

EUA Estados Unidos da Amrica

eV eletronVolt

FDA Food and Drug Administration

FE Fase estacionria

FM Fase Mvel

Glc Glicose

Hex Hexano

HFA Hospital das Foras Armadas

HIV Human immunodeficiency vrus

Hz Hertz

IE Impacto eletrnico

INCA Instituto Nacional do Cncer

i.p Intraperitoneal

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento de 1H

m/z relao massa/carga

MeCN Acetonitrila

MeOH Metanol

MHz MegaHertz

min. minuto

mL Mililitro

mRNA cido ribonuclico mensageiro

MTT brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio]

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

NIST National Institute of Standards and Technology

nm Nanmetro

NSCLC Non-small cell lung cncer/ Clulas de Cncer no Pequenas

OD Densidade ptica

ODC Ornitinadecarboxilase

OMS Organizao Mundial de Sade

P&D Pesquisa e Desenvolvimento

PABA cido p-aminobenzico

PEG Polietilenoglicol

PGC Pouteria gardnerii

PN Produtos Naturais

p.o per oral

ppm Partes por milho

QPN Qumica de Produtos Naturais

RDA Retro-Diels-Alder

RDC Resoluo de Diretoria Colegiada

RMN Ressonncia Magntica Nuclear

RMN 13C Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono

RMN 1H Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio

s Simpleto

TMS Tetrametilsilano

tR Tempo de reteno

UANL Universidad Autonoma de Nueva Leon

UCDB Universidade Catlica Dom Bosco

UFC Unidades formadoras de Colnias

UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul

UFSC Universidade Federal de Santa Catarina

USP Universidade de So Paulo

UV Ultravioleta

Deslocamento qumico

s.c. Subcutnea

TPA Tetradecanoilforbol

g Micrograma

RESUMO

A presente dissertao descreve o estudo qumico e a atividade biolgica das

folhas de Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni, espcie pertencente famlia

Sapotaceae, comum no bioma do Cerrado do Distrito Federal e conhecida popularmente

como frutinha-de-veado, cabrito, sapotinha, leiteiro-da-folha-mida, aguai-guac ou

marmelinho.

Do extrato hexnico foram obtidos uma mistura de hidrocarbonetos e uma

mistura de -e -amirina, acetatos de -amirina e de lupela. Do extrato etanlico foram

obtidos: uma mistura de steres de cadeia longa, acetato de -amirina, mistura de

lcoois de cadeia longa e uma mistura dos cidos urslico e oleanlico.

Os extratos e fraes de P. gardnerii foram submetidos a ensaios para avaliar

sua atividade biolgica. Em teste de citotoxicidade, utilizando como modelo a

toxicidade s larvas de Artemia salina, o extrato aquoso (DL50 = 491,64 ppm), a frao

acetato de etila do extrato hexnico (DL50 = 528,28 ppm) e a frao Hex:AcOEt (1:1)

do extrato etanlico (DL50 = 320,48 ppm) apresentaram atividade. Esse resultado foi

corroborado por ensaio, no qual os extratos etanlico e aquoso inibiram a atividade

mitocondrial das clulas de cncer pulmonar no pequenas (NSCLC) da linhagem

CALU (2 mg/mL). O extrato etanlico tambm diminuiu a viabilidade celular de outra

linhagem, a A427.

No teste da atividade fotoprotetora, o extrato etanlico apresentou absoro da

radiao ultravioleta na faixa de UVB e UVA, nas concentraes de 50 mg/mL, 150

mg/mL e 300 mg/mL sendo esta ltima sendo mais evidenciada.

No teste da atividade antioxidante pelo mtodo de varredura do perxido de

hidrognio, o extrato etanlico (CE50 = 44.88 g/mL) e o extrato aquoso (CE50= 28,39

g/mL) apresentaram uma atividade antioxidante superior quela apresentada pelo

controle positivo (cido ascrbico, CE50 = 84,87 g/mL).

Por fim, no teste de atividade antibacteriana, utilizando a tcnica das

microdiluies, o extrato aquoso apresentou atividade contra Staphylococcus aureus.

a primeira vez que essa espcie investigada quanto sua composio

qumica e sua atividade biolgica. E o primeiro relato da presena de cido oleanico

no gnero Pouteria.

Palavras-chave: Pouteria gardnerii; plantas medicinais; Cerrado; triterpenos

ABSTRACT

The present dissertation describes the chemical study and the biological

activities of leaves of Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni, Sapotaceae, usually

found at biome Cerrado around Distrito Federal and popularly called frutinha-de-veado,

cabrito, sapotinha, leiteiro-da-folha-mida, aguai-guac or marmelinho.

From the hexane crude extract were isolated mixtures of hydrocarbons and a

mixture of - and -amyrin, -amyrin acetate and lupeol acetate. From the ethanol

crude extract were obtained a mixture of fatty esters, -amyrin acetate, mixture of

alcohols, as well as a mixture of ursolic and oleanolic acids.

Extracts and fractions of P. gardnerii were evaluated for biological activities.

Crude aqueous extract and fractions of ethanol extract presented cytotoxicity on BST

model. This result was corroborated by another assay in which the ethanol and aqueous

extract inhibited the mitochondrial activity of non-small cell lung cancer (NSCLC) of

the CALU (2mg/mL) cell lines. The ethanol extract also diminished the cell viability of

another cell lines, A427.

On a model assay to evaluate photo protection activity, the ethanol extract

showed dose dependent absorption of the ultraviolet radiation in the UVB and UVA

range with 50 mg/mL, 150 mg/mL and 300 mg/mL concentracions, respectively. In

addition, ethanol extract as well as aqueous extract were able to scavenging hydrogen

peroxide free radicals in a higher degree than ascorbic acid.

Finally, the ethanol extract from leaves of P. gardnerii presented activity against

Staphylococcus aureus.

As far we know it is the first time that the chemistry and biological activity of

Pouteria gardnerii are investigated. In addition, it is the first report about the

occurrence of oleanolic acid in the Pouteria genus.

Keywords: Pouteria gardnerii; medicinal plants; Cerrado; triterpenes

Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 1 ______________________________________________________________________

CAPTULO I CAPTULO I CAPTULO I CAPTULO I ---- INTRODUO INTRODUO INTRODUO INTRODUO


1. Introduo

A evoluo do homem, entre outras coisas, tem sido acompanhada por um

valioso conhecimento sobre as plantas. Nos primrdios, as civilizaes transmitiam aos

seus descendentes um discernimento emprico que ia desde as plantas que podiam ser

comestveis at aquelas que apresentavam toxicidade ou mesmo um potencial curativo.

Tal informao no incio foi passada oralmente para as geraes posteriores e, depois

com o surgimento da escrita, foi armazenada em papiros ou escrituras (CUNHA, 2007).

As evidncias da utilizao de plantas medicinais, tanto no Ocidente quanto no

Oriente, remontam a cerca de 60.000 anos.

Um dos primeiros documentos escritos que se tem

informao, refere-se farmacopia do imperador chins Shen

Nung. Escrita por volta dos anos 2730-3000 a.C, que descreve

o uso medicinal de vrias espcies tais como a efedra, (Ephedra

sinica Stapf, ou Ma Huang, pela medicina chinesa), que tem

como composto ativo o alcalide efedrina (1) e conhecida por

promover perda de peso, aumentar energia, tratar problemas

respiratrios e como antitussgeno. (BRIAN et. al., 2003).

O papiro de Ebers, decifrado em 1873 pelo egiptlogo alemo Georg Ebers,

representa o primeiro tratado mdico egpcio conhecido e foi escrito em torno de 1500

a.C.. Parte de seu texto se destina a tratamento de doenas e indicaes sobre os

medicamentos a serem empregados para tal (GOSSEL-WILLIAMS et al., 2006).

Uma das mais importantes contribuies para o conhecimento atual sobre

medicina natural partiu de Hipcrates, que nasceu na ilha de Cs e viveu at a segunda

metade do sculo V a.C. (RIBEIRO, 2003). Ele considerado como o pai da

medicina, graas s suas pesquisas e a uma vasta obra composta por 53 livros que

foram reunidos em Alexandria por Baccheio no sculo III a.C., denominados Corpus

Hippocraticum. Esta obra considerada a mais clara e completa da antiguidade j que

faz referncia no s a plantas medicinais, mas, tambm as bases das cincias mdicas

em sua totalidade (DIAS, 2007).

Por volta de 1800, os qumicos e os mdicos que estudavam plantas medicinais,

cujos recursos experimentais eram extremamente limitados, se dedicaram

especialmente, a isolar e determinar a estrutura de compostos ativos de plantas

OHN

1


conhecidas e experimentadas pelo uso popular ao longo do tempo, e geralmente,

incorporadas nas farmacopias da poca. (YUNES & CALIXTO, 2001).

Apesar disso. alguns frmacos potentes, foram descobertos e muitos deles ainda

so usados na teraputica atual. Apenas para citar alguns exemplos, pode ser

mencionada a Atropa belladona L., espcie conhecida desde o incio do sculo XVI,

mas acredita-se que seu uso com finalidades teraputicas iniciou-se muito antes

(YUNES & CALIXTO, 2001). Um dos seus constituintes ativos foi determinado como

sendo o alcalide atropina (2) isolado pela primeira vez por Mein em 1831. e seus

efeitos foram estudados principalmente durante a segunda metade do sculo XIX

(CANAES, 2006).

N

N

MeO

NH

H

H

HMeO

OMe

H

R R3a OMe emetina3b OH cefaelina

O Hyoscyamus niger L., conhecido popularmente como meimendro, j era

utilizado pelos povos antigos. A espcie era empregada contra dores do trato

gastrintestinal na antiga Babilnia e figura no papiro de Ebers. Foi utilizado na

Inglaterra, na Idade Mdia e depois de um perodo de esquecimento, no sculo XVIII a

espcie foi reintroduzida na London Pharmacopia, de 1809 (SIMES et al., 2000).

A Cephaelis ipecacuanha A. Richard, descrita por G. Le Pois em sua obra De

Medicina Brasiliensis em 1648, foi introduzida na Europa em 1672, sendo que desta

espcie foram isolados os alcalides emetina (3a) e cefaelina (3b) (YUNES &

CALIXTO, 2001). A espcie utilizada desde o sculo XVII como emtico e

expectorante (ATSUKO et al., 1999).

Por fim, pode ser salientado o caso da Salix alba L., cujas cascas foram usadas

durante milnios na Europa, sia e frica para combater dor e febre, mas que somente

em 1763 foi estudada cientificamente pelo reverendo E. Stone, da Inglaterra, que

N

OO

OH

2


publicou seu trabalho de observao clnica, mostrando o efeito analgsico das cascas

dessa planta (YUNES & CALIXTO, 2001).

A substncia ativa e bastante conhecida desta espcie a salicilina (4) isolada

pela primeira em 1829 pelo farmacutico francs H. Leurox. Em 1838 o qumico

italiano Raffaele Piria obteve o cido saliclico (5) semi-sinttico, atravs da hidrlise

oxidativa da salicilina e, posteriormente, Kolbe e Dresden em 1859, sintetizaram os

salicilatos. E em 1897, incentivado pelo caso de seu pai que sofria de reumatismo

crnico e no tolerava o efeito colateral dos salicilatos, o qumico alemo Felix Hofman

concluiu a sntese do cido acetilsalicilico (AAS) (6), um composto de carter menos

cido e que ainda hoje o analgsico mais consumido e vendido no mundo

(MENEGATTI et al., 2001).

Assim, na busca por substncias ativas em plantas, um dos principais aspectos a

serem observados consiste nas informaes oriundas da medicina popular. A seleo de

espcies vegetais para pesquisa, baseada na alegao de um dado efeito teraputico em

humanos, pode se constituir num valioso atalho para a descoberta de novos frmacos, j

que seu uso tradicional pode ser encarado como uma pr-triagem quanto utilidade

teraputica humana, mesmo que posteriormente atravs das pesquisas essa atividade no

seja comprovada (ELIZABETSKY, 2000).

Diversos registros da OMS (Organizao Mundial de Sade) revelam que,

aproximadamente 80% da populao mundial faz uso de algum tipo de planta com

finalidade teraputica. Dentro dessa porcentagem, no mnimo 30% dessas pessoas

utilizam plantas medicinais por indicao mdica (CAMPOS et al., 2005).

A OMS estima que as vendas totais de ervas medicinais alcanaram a cifra de

US$ 400 milhes no Brasil em 2001 (SOYAMA, 2007). Estima-se que 40% dos

medicamentos disponveis na teraputica atual foram desenvolvidos a partir de modelos

ou diretamente de fontes naturais, sendo as plantas responsveis por 25% desse total

(CALIXTO, 2003; SOYAMA, 2007). Somente no perodo entre 1983 e 1994, dos 520

OH

O OOH

OH

OH

OH

(4)

OH

COOH

(5)

O

COOH

O

(6)


novos frmacos aprovados pela agncia americana de controle de medicamentos e

alimentos (FDA), 220 (39%) foram desenvolvidos a partir de produtos naturais

(CRAGG et al., 1997; SHU et al., 1998). E ainda, quando se fala de cncer ou doenas

infecciosas, entre 60% e 75% dos medicamentos disponveis so de origem natural

(NEWMAN et al., 2003)

Porm muito ainda est para ser pesquisado. Das 365.000 espcies catalogadas,

apenas 1.100 foram estudadas em suas propriedades medicinais (FERREIRA, 2006) e o

Brasil, que possui cerca de 30% de toda a flora mundial conhecida, tem pouco mais que

1% dessas estudadas qumica e/ou farmacologicamente. (YUNES & CALIXTO, 2001).

O Brasil poderia contribuir para o desenvolvimento de novos medicamentos

oriundos de espcies dos seus vrios biomas. Porm, entre 2003 e 2004, por exemplo,

foram desmatados 26.130 km2 de floresta na Amaznia Brasileira, que hoje representa

5% do espao terrestre da Amrica Latina (AMAZNIA, 2007). Com isso, vrias

espcies desapareceram sem que o homem tenha sequer sido capaz de conhecer toda a

sua magnificncia, principalmente a relacionada s caractersticas medicinais.

Por outro lado, existem problemas que dificultam o aproveitamento de produtos

naturais para o desenvolvimento de novos medicamentos, como por exemplo, a grande

complexidade das molculas naturais isoladas, que s vezes dificulta sua utilizao

como modelo para sntese; o tempo necessrio para a descoberta de molculas lderes,

que usualmente longo; freqentemente, molculas j conhecidas de pouco interesse,

so isoladas de fontes naturais; e, por fim, a relutncia de muitos qumicos, especialistas

em sntese, em trabalhar com produtos naturais (CALIXTO, 2003).

Alm disso, no Brasil, as pesquisas com plantas ainda esto muito inseridas no

contexto de Universidades e Institutos de Pesquisa. Mesmo assim, j existem vrios

grupos nacionais envolvidos com a busca de princpios bioativos de plantas

(MONTANARI & BOLJANI, 2001).

A pesquisa por novas entidades qumicas bioativas pelos laboratrios de

pesquisa industriais tem adotado novas tcnicas, como o uso da qumica combinatria

para se obter maior nmero de substncias com atividades farmacolgicas em um menor

tempo. Essa tcnica teve seu tempo ureo na indstria farmacutica na dcada de 90

(MULLIN, 2007), quando foram sintetizadas e avaliadas farmacologicamente milhares

de compostos, e alguns estimam que milhes, como uma forma de obteno de novos

frmacos.


A idia de que a avaliao rpida de um grande nmero de candidatos a

frmacos seria mais fcil e mais eficiente que o processo clssico e usualmente

demorado de obteno e teste de compostos um a um envolveu o investimento de

grande capital e de recurso humano especializado. Entretanto, o uso da qumica

combinatria mostrou-se desapontador, pois alm da produo de uma grande

quantidade de fragmentos sem qualquer utilidade, a constatao de que nem sempre tais

compostos projetados eram compatveis com sistemas biolgicos levou a poucos

resultados tangveis (BORMAN, 2006).

Uma estratgia para busca de novos frmacos chamada Diversity-oriented

synthesis DOS foi desenvolvida para tentar resolver o problema da

biocompatibilidade. uma tcnica para criar um banco de compostos de estrutura

semelhante a produtos naturais compartilhado entre diversos centros de pesquisa. Uma

vez identificado o prottipo, este ser melhorado e posteriormente submetido a

ensaios clnicos (BORMAN, 2006) .

A introduo de novas tecnologias tornou a qumica medicinal mais ampla em

sua concepo, ampliando seu carter interdisciplinar (HILEMAN, 2006). Em uma

viso moderna, a qumica medicinal dedica-se compreenso das razes moleculares da

ao dos frmacos, da relao entre estrutura qumica e atividade farmacolgica dos

mesmos, considerando fatores farmacodinmicos e farmacocinticos que se traduzam

em propriedades farmacoterapeuticamente teis e, portanto, representem um novo

composto-prottipo, candidato efetivo a novo frmaco (VIEGAS et al., 2006)

Assim, apesar dos avanos tecnolgicos observados nesse perodo para a

pesquisa de novas entidades qumicas, a quantidade de novos frmacos lanados no

mercado no tem aumentado proporcionalmente. Efetivamente, a indstria farmacutica

que pesquisa novos frmacos afirma que o montante gasto em pesquisa e

desenvolvimento no setor, em 2004, atingiu valores de 33 bilhes de dlares

americanos, representando um crescimento real nos investimentos feitos, ano a ano, no

correspondendo, entretanto, um aumento proporcional nas descobertas inovadoras.

(VIEGAS et al., 2006).

Define-se como fitofrmaco a substncia isolada de extratos de plantas

(FERREIRA, 2006) como a rutina (7) extensamente encontrada na natureza e a

pilocarpina (8), extrada das folhas do jaborandi (Pilocarpus pennatifolius), e utilizada

para o tratamento do glaucoma (SIMES et al., 2000). A ANVISA (Agncia Nacional

de Vigilncia Sanitria), por sua vez, define fitofrmaco como princpio ativo, que


corresponde a uma substncia ou grupo dessas, quimicamente caracterizadas, cuja ao

farmacolgica conhecida e responsvel, total ou parcialmente, pelos efeitos

teraputicos do produto fitoterpico.

E o medicamento fitoterpico, tambm segundo a ANVISA, caracteriza-se pelo

emprego exclusivo de matrias-primas vegetais ativas, cuja eficcia e riscos de seu uso

sejam conhecidos, assim como a reprodutibilidade e constncia de sua qualidade.

O

OH

OH

O

Oram-gli

OH

OH

7

O

NCH3

N

O

8

O desenvolvimento de fitoterpicos inclui vrias etapas e um processo

interdisciplinar, multidisciplinar e interinstitucional. As reas de conhecimento

envolvidas vo desde a botnica, a etnobotncia, agronomia, ecologia, qumica,

fitoqumica, farmacologia, toxicologia, biotecnologia at a tecnologia farmacutica

(TOLEDO et al., 2003)

A pesquisa tem incio no levantamento bibliogrfico em literatura cientfica e

catlogos internacionais nas reas especficas do referido conhecimento, seguindo em

paralelo a pesquisa etnobotncia, que pode ser definida como a disciplina que abrange

do estudo e conceituaes desenvolvidas por qualquer sociedade a respeito do mundo

vegetal engloba a maneira como um grupo social classifica as plantas (MACIEL et

al.,2002).

Uma outra abordagem de seleo de uma espcie a ser utilizada como medicinal

a pesquisa quimiotaxonmica, onde o aspecto morfolgico pode revelar a presena de

determinados grupos qumicos que tenham atividade farmacolgica (SHORT, 2007).

Por fim, a busca de novas espcies farmacologicamente teis pode se dar de

forma aleatria, onde amostras das espcies presentes em determinada rea geogrfica

so coletadas e avaliadas qumica e biologicamente.

Os estudos fitoqumicos compreendem as etapas de isolamento, elucidao

estrutural e identificao dos constituintes mais importantes da planta, principalmente


de substncias originrias do metabolismo secundrio responsveis, ou no, pela ao

biolgica (MACIEL et al.,2002).

A avaliao da atividade biolgica constitui a prxima etapa para o

desenvolvimento de um medicamento fitoterpico. Essa etapa inclui a avaliao

farmacolgica e toxicolgica da substncia isolada. O conhecimento dos aspectos de

atividade biolgica do vegetal requisito essencial para a transformao da planta

medicinal em produto fitoterpico.

Vrios fatores devem ser considerados por ocasio da seleo do modelo

biolgico adequado ao estudo de uma determinada planta. Alguns desses parmetros

devem ser analisados criteriosamente antes de fazer tal escolha, como por exemplo, a

seletividade e a reprodutibilidade do teste; ou a quantidade de material vegetal

disponvel para a realizao do estudo, que pode ser um fator limitante quando se trata

de compostos puros (YUNES & CALIXTO, 2001). Por exemplo, para serem obtidos 50

mg de um composto puro, encontrado em um percentual de rendimento de 0,001 %,

necessria a utilizao de 5 Kg de planta seca, em mdia; e para a obteno de 1 Kg de

planta seca so necessrios at 10 Kg de planta fresca (GOTTLIEB et al., 1997).

Quanto aos testes biolgicos, a escolha do modelo deve levar em considerao o

alvo a ser atingido no estudo e as informaes etnofarmacolgicas (YUNES &

CALIXTO, 2001).

Os testes clnicos constituem uma das ltimas etapas antes da produo de um

medicamento fitoterpico. Nessa etapa verificada a validade da proposta de ao

farmacolgica em organismos humanos (ELIZABETSKY, 2000).

A ANVISA disponibiliza uma lista com 34 plantas para as quais so

dispensveis comprovaes adicionais de eficcia e segurana, no ato de protocolo do

registro do medicamento fitoterpico, devido existncia de dados clnicos e

etnofarmacolgicos satisfatrios que validam o emprego destas plantas (ANVISA,

2004).

Como exemplo, a espcie Peumus boldus Molina, conhecido popularmente

como boldo, usada no tratamento de distrbios hepticos e gastrointestinais. O

princpio ativo responsvel por essa ao farmacolgica a boldina (9) (FERREIRA,

2006).

O Allium sativum L., mais conhecido como alho e utilizado como tempero na

culinria, tem como princpio ativo a alina (10). Suas aes teraputicas conhecidas


so, coadjuvante no tratamento da hiperlipidemia e hipertenso arterial leve, e

preveno da arteriosclerose (FERREIRA, 2006).

Como um ltimo exemplo, pode ser citado o confrei (Symphytum officinale L.),

cujo princpio ativo, a alantona (11), responsvel pela conhecida ao cicatrizante da

planta (FERREIRA, 2006).

N

OH

OH

MeO

MeO

CH39

O

S

NH2

OH

O

10

N

N

O

ONH

NH2O

11

Dessa forma, a busca de produtos naturais bioativos de origem vegetal ainda se

constitui uma via interessante sob o ponto de vista cientfico, tecnolgico e econmico.

A famlia Sapotaceae possui aproximadamente 75 gneros e 800 espcies.

Alguns gneros conhecidos so: Butyrospermum, Chrysophyllum, Madhuca, Manilkara,

Mimusops, Pouteria (Lucuma) e Sideroxylon (WATSON & DALLWITZ , 1992).

Poucas referncias quanto s atividades farmacolgicas ou aos metablitos

secundrios do gnero Pouteria (Sapotaceae) so encontradas, apesar de vrias espcies

produzirem frutos comestveis, como por exemplo, P. caimito (abiu), P. macrocarpa

(cutito), P. macrophyla (caimo), P. sapota (sapota)

Uma classe de substncias muito comum na famlia Sapotaceae so os

triterpenos para os quais vrias atividades biolgicas so relatadas, tais como

antiinflamatria, anti-helmntica, antitumoral e estrognica, inibio enzimtica (-

glicosidase, transcriptase reversa do HIV). Desta forma, considerando as atividades

biolgicas que espcies do gnero Pouteria presentes no bioma Cerrado podem

apresentar, o estudo dessas espcies torna-se relevante para incremento do arsenal

teraputico.


Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni (FIGURA 1.8, pgina 27) foi

selecionada a partir do projeto Estudo qumico e atividades biolgicas de espcies do

gnero Pouteria, atualmente desenvolvido na Faculdade de Cincias da Sade, por

pesquisadores do grupo Desenvolvimento e Controle de Qualidade de Frmacos e

Medicamentos. Essa espcie conhecida popularmente por frutinha-de-veado, cabrito,

sapotinha, leiteiro-da-folha-mida, aguai-guac ou marmelinho (COLHO, 2006;

MESQUITA et al.,2005; CENTURION et al., 1996). Relatos encontrados na literatura

mostram que a espcie em questo, foi testada apenas contra as formas amastigota do

Trypanosoma cruzi e contra as larvas de Aedes aegypti, porm no apresentou atividade

(COLHO, 2006 e MESQUITA et al.,2005). Entretanto, no foi encontrado relato

quanto sua composio micromolecular.

Como outras espcies do gnero apresentam atividades biolgicas relevantes,

torna-se interessante buscar informaes sobre P. gardnerii.

1.2 Constituintes qumicos e atividades biolgicas do gnero Pouteria

No planalto central brasileiro encontra-se parte do bioma cerrado, considerado o

segundo maior do Brasil, com uma flora vegetal estimada em, aproximadamente, sete

mil espcies (VILA VERDE et al., 2003). A utilizao popular de plantas medicinais

faz parte da tradio e costume das comunidades que vivem nessa regio. No entanto, as

plantas utilizadas na medicina popular pelos habitantes locais no tm ainda despertado

de forma significativa, o interesse da comunidade cientfica, se comparadas com aquelas

das demais regies, o que pode ser observado a partir da falta de dados disponveis

sobre as caractersticas biolgicas de plantas medicinais do Cerrado, que possibilitem a

sua utilizao sustentvel (LOPEZ et al., 2005).

Espcies do gnero Pouteria Sapotaceae, so encontradas nesse bioma e

embora corresponda a 435 ou mais espcies, a informao quanto fitoqumica e

quanto atividade biolgica correspondentes a este txon relativamente limitada

(CHE et al., 1980).

Estudos fitoqumicos realizados com o extrato metanlico das ramas de P. torta

mostraram a presena de triterpenos como acetato de -amirina (12b), acetato de -

amirina (12c), cido betulnico (13) e cido urslico (14) (CHE et al., 1980). Dos

extratos hexnico e diclorometilnico de flores e frutos foram isolados cidos graxos,


poliisoprenides, triglicerdeos, hidrocarbonetos normais e ramificados, esterides e

triterpenos penta- e tetracclicos (DAVID, 1993).

RO

R2R1

R R1 R212a H Me H -amirina12b Ac Me H12c H H Me -amirina 12d Ac H Me

COOH

OH

13

OH

COOH

14

RO

R 15a H lupeol 15b Ac

Ainda do extrato hexnico das folhas desta planta foram isolados

hidrocarbonetos, lcoois de cadeia longa e acetato de lupela (15b), e da frao

acetonitrila:clorofrmio, do extrato etanlico bruto, foram obtidas misturas de

triterpenos contendo - e -friedelinol (16a e 16b) e - e -amirina (12a e 12c), alm

do cido 12,13-dihidropomlico (17) (LOPEZ et al., 2005). E da frao aquosa do

extrato etanlico desta planta foi obtido o flavonide miricitrina (18) (SILVA et al.,

2006).


OH

16a 3 OH -friedelinol 16b 3 OH -friedelinol

OH

COOH

OH

17

OOH

OH O

Oram

OH

OH

OH

18

OH

OH

19

Pouterina, uma protena semelhante lecitina, foi extrada de sementes de P.

torta e apresentou atividade antifngica contra Fusarium oxysporum, Colletotrichum

lindemuthianum e Saccharomyces cerevisiae. Apresentou ainda atividade inseticida

contra larvas de Callosobruchus maculatus F., uma praga de gros. Essa protena

tambm mostrou capacidade de aglutinao de eritrcitos humanos, de coelhos e de

ratos (BOLETI et al., 2007).

A pesquisa fitoqumica do extrato benznico da fruta de Pouteria caimito

revelou a presena de - amirina (12a), lupeol (15a), eritrodiol (19), e o damarendiol II

(20); e das cascas, taraxerol (21a) e seu acetato (21b), taraxenona (22) e -sitosterol

(23) (PELLICCIARI et al., 1972). E do extrato hexnico desta planta foi extrado o

triterpeno pentacclico espinasterol (24) (FRANA et al., 2006), tambm presente nas

folhas de P. venosa (MONTENEGRO et al., 2006).


OH

20

RO

R 21a H taraxasterol 21b Ac

O

22 OH

23

OH24

Do crtex de Pouteria tomentosa (Roxb.) Baehni foi obtido o acetato de -

amirina (12d) (CHE et al., 1980). As folhas de Pouteria amygdalicarpa, P.

campechiana, P. subrotata e P. torta apresentaram compostos cianognicos diversos

(THOMSEN & BRIMER, 1997)

O estudo do leo voltil responsvel pelo aroma dos frutos de P. sapota revelou

a presena de 24 compostos, dos quais benzaldedo (25), hexanal (26) e cido palmtico

(27) esto em maior concentrao (PINO et al, 2006). A amndoa dessa espcie


forneceu cidos graxos dos quais os mais abundantes foram os cidos palmtico (27),

esterico (28), olico (29) e linolico (30) (SOLIS-FUENTES & DURAN-DE-BAZA,

2003).

CHO

25

CHO

26

CH3-(CH2)14-COOH

27

CH3-(CH2)16-COOH

28

CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH

29

CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH

30

A anlise do leo concentrado dos frutos de P. pariry, apresentou como

componente mais abundante o butanoato de metila (31); em P. caimito, cido palmtico

(27), acetato de hexadecila (32), -copaeno, (33) foram os mais abundantes (MAIA et

al., 2003). No leo das folhas de P. splendens foram identificados 34 compostos dos

quais cidos graxos foram os mais abundantes (SOTES et al., 2006).

CH3-(CH2)2COOCH3

31

CH3-COO-(CH2)5CH3

32 33

De Pouteria campechiana, P. sapota e P. viridis foram identificados cido e

miricitrina (18), glico (34), galocatequina (35a), catequina (35b), epicatequina (35c),

galatocatequina (35d), e dihidromiricetina (36), responsveis pela atividade

antioxidante in vitro apresentada por seus extratos (MA et al., 2004;

MAHATTANATAWEE et al., 2006).

COOH

OH OH

OH

34


O

OH

OH

R2

OH

OH

R1

R1 R235a OH -OH galocatequina35b H -OH catequina35c H -OH epicatequina35d H -O-galato

De extratos de Pouteria venosa foram isolados cido urslico (14); taraxerol

(21a) e os cidos mirintico (37a) e 19,23-diidroxiurslico (37b), sendo que esses dois

ltimos foram ativos frente ao radical DPPH. Os extratos clorofrmico das folhas,

diclorometnico da casca do caule e hexano:acetato de etila do caule, apresentaram

resultados positivos em ensaios larvicida e/ou antiradicalar (MONTENEGRO et al.,

2006).

Em estudos preliminares, os extratos de P. torta, P. ramiflora e P. gardnerii

apresentaram atividades de inibio de -amilase em saliva humana (ALBUQUERQUE

et al., 2002). O extrato etanlico de P. ramiflora apresentou atividade antiinflamatria e

antinociceptiva in vivo (NUNES, 2004; FONTES JUNIOR, 2004; CHAGAS et al.,

2003). Pouteria torta e P. ramiflora apresentaram atividade antimicrobiana (ALVES et

al., 2000; RAMALHO et al., 2004).

O extrato bruto etanlico de P. caimito, extratos brutos etanlico e aquoso de P.

torta e o extrato bruto etanlico de P. ramiflora apresentam atividade antioxidante

(CASTRO et al., 2006).

A frao aquosa do extrato etanlico das folhas de P. ramiflora apresentou

toxicidade a larvas de Artemia salina (RAMALHO et al., 2004). Alm disso, o extrato

aquoso bruto de P. torta tambm apresentou toxicidade a larvas de Artemia salina

(LOPEZ, 2005).

Os extratos metanlico, acetnico e aquoso de galhos de P. cambodiana

apresentaram atividade imunomoduladora in vitro. Os extratos etanlico e aquoso

apresentaram atividade antioxidante que parece ser devida presena de cido 3,4-

diidroxibenzico (38) (MANOSROI et al., 2005; MANOSROI et al., 2006)

O

OH

OH

OHOH

OH

OH

O

36


COOH

OH

OH

38

Os extratos hexnico e etanlico de folhas de P. torta e P. ramiflora foram

testados quanto a atividade agonista ou antagonista de receptores nucleares e o extrato

hexnico de Pouteria torta inibiu a ao do estrognio nos seus receptores

(FRANZOTTI et al., 2004). Os extratos hexnico e etanlico de P. torta apresentaram

atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e os extratos hexnico,

etanlico e aquoso desta mesma espcie foram ativos contra Pseudomonas aeruginosa.

Alm disso, o extrato aquoso apresentou atividade contra Escherichia coli (LOPEZ,

2005). Os extratos etanlicos de folhas de P. grandiflora e P. psamophila foram

inativos contra E. coli, S. aureus e Candida albicans. Pouteria grandiflora apresentou

atividade discreta contra Cladosporium sphaerospermum, P. psamophila e C.

cladosporioides (AGRIPINO et al., 2004).

Em estudos preliminares, os extratos aquoso e etanlico de folhas de P. torta, P.

caimito e P. ramiflora apresentaram atividade fotoprotetora contra os raios UVA e UVB

(FALEIROS et al., 2006).

1.3 Compostos isoprnicos de esqueleto C30 e seus derivados: ocorrncia e

atividade biolgica

Os terpenos compem diversas estruturas comumente encontradas na natureza e

so originados da via acetato-malonato, a partir do encadeamento cabea-cauda de

unidades isoprnicas (39) (DEWICK, 2001 e OLIVEIRA et al., 2003).

COOH

R2

R

R1

R3

R R1 R2 R337a -OH -OH OH OH cido mirintico37b -OH H OH OH


39

OPP

40

OPP

41

O isopreno considerado um dos blocos de construo para os isoprenides.

As unidades bioqumicamente ativas do isoprenos so conhecidas como pirosfosfato de

dimetilalila - DMAPP (40) e pirofosfato de isopentenila - IPP (41) (DEWICK, 2001).

Os terpenos apresentam funes variadas nos vegetais e so de acordo com o

nmero de unidades de isopreno (Cn) encadeadas: hemiterpenos (C5), monoterpenos

(C10) sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25) triterpenos (C30) e

tetraterpenos (C40).

Os monoterpenos so constituintes dos leos volteis, atuando na atrao de

polinizadores. Os sesquiterpenos, em geral, apresentam funes protetoras contra

fungos e bactrias, enquanto muitos diterpenides do origem aos hormnios de

crescimento vegetal. Os triterpenides e seus derivados apresentam uma gama de

funes, como de proteo contra herbvoros, alguns so antimitticos e outros atuam

na germinao das sementes e na inibio do crescimento da raiz (OLIVEIRA et al.,

2003).

Alguns derivados C30 so de especial importncia, como por exemplo, o

colesterol (42), os hormnios sexuais estradiol (43) e testosterona (44) as vitaminas A

(45), D (46) e E (47). Biossinteticamente, estes metablitos so formados de uma forma

diferente daquela como cresce a maioria das cadeias isoprenides. Eles derivam da

unio cauda-cauda de duas unidades de pirofosfato de farnesila, formando o esqualeno

(FIGURA 1.2), que foi originalmente isolado do leo do fgado de tubaro (Squalus sp)

(DEWICK, 2001)


FIGURA 1.1. Esquema da rota biossinttica para a formao dos terpenides

(DEWICK, 2001)..

C30

C40

O

OH OH

OH

cido mevalnico

O

OH

OH

OP

5-fosfato-1-desoxi-D-Xilulose

OPPPirofosfato de Isopentenila(IPP) (C5)

OPP Pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) (C5)

Hemiterpenos (C5)

C10 Pirofosfato de geranila

Monoterpenos (C10) Iridides

IPP

IPP

IPP

C25 Pirofosfato de geranilfarnesila

Sesterpenos (C25)

Triterpenos (C30)

Esterides (C18 C30)

Tetraterpenos (C40) Carotenides

C15 Pirofosfato de farnesila

Sesquiterpenos (C15)

x 2

C20 Pirofosfato de geranilgeranila

Diterpenos (C20)

x 2

cido Mevalnico 5-fosfato-1-desoxi-D-xilulose

DMAPP IPP


Esqualeno

FIGURA 1.2: Formao do esqualeno por meio do acoplamento cauda-cauda de

duas unidades de pirofostato de farnesila.

H

H

P PO X - E n z

H H

X - En z

P P O

H PPO

H

Pirofostato de farnesila


OH

42

OH

OH

43

OH

O

44

OH

45

O

OH

4747

Neste grupo esto includos os esterides, que possuem esqueleto C27-C29, no

sendo, portanto verdadeiros triterpenos. No entanto, todos derivam do mesmo precursor

- o esqualeno - que possui 30 tomos de carbono, pelo que se prefere manter esta

classificao. O esqualeno pode adotar vrias conformaes (pseudo-cadeira ou barco),

das quais resultam diferentes estruturas cclicas, o que explica a diversidade de

metablitos conhecidos (FCT/UNL, 2007).

A ciclizao do esqualeno est esquematizada na FIGURA 1.3. Praticamente

todos os triterpenides cclicos derivam do ction protosterila, e so organizados em

famlias de acordo com as estruturas formadas.

OH46


Os triterpenos constituem talvez o grupo mais importante dos terpenides. So

conhecidos pelo menos 200 esqueletos diferentes desses compostos, advindos de

produtos naturais ou de reaes enzimticas caractersticas da ciclizao do esqualeno

ou do seu xido. Os triterpenos e outros compostos oriundos da mesma rota, incluindo

os esterides e as saponinas, so bem caracterizados quanto a suas atividades biolgicas

(XU et al., 2004).

Os grupos de triterpenos mais importantes so: esqualenos (linear); lanostanos

(48); damaranos (tetranortriterpenides e quassinides) (49); lupanos (50); oleanos (51);

ursanos (52) e hopanos (53) (LOPES, 2007 e DEWICK, 2001)

OOH

H

HH

OHH

H

OHH

H

H

H+

+

Ction Protosteril

Animaisfungos

Plantas

+

LanosterolCicloartenol

FIGURA 1.3: Esquema da ciclizao do esqualeno (LOPES, 2007).

Esqualeno

2,3 xido de esqualeno


48 49

50 51

52 53

Os caminhos biossintticos que conduzem formao dos esterides e

triterpenos so completamente idnticos at a formao do 2,3-oxiesqualeno (FIGURA

1.4). A partir da a rota torna-se diversificada em sua etapa de ciclizao. A diversidade

estrutural dos triterpenos gerada nesta etapa e catalizada pelas enzimas

triterpenossintase e pode-se dizer que a diversidade dessas sintases reflete a diversidade

de espcies de plantas (FIGURA 1.4) (SHYBUYA et al., 1999)


Os triterpenos pentacclicos derivam do epxido de esqualeno num arranjo

cadeira- cadeira-cadeira-barco, seguido de uma condensao. Esses tipos de compostos

so muito comuns e facilmente encontrados em vegetais. A estrutura policclica pode ter

cinco anis de seis membros (oleanos e ursanos) ou quatro anis de seis membros e um

de cinco membros (lupano) (MENDES, 2004).

Os compostos pentacclicos copreendem a classe mais numerosa de produtos

derivados do xido de esqualeno, que so catalizados pela enzima

oxidoesqualenosintase. A variedade estrutural desses compostos revelada pelos

diversos modos de ciclizao do oxido de esqualeno. Tanto o ction protosteril, quando

o ctio damarenil, por exemplo, podem se submeter expanso e ciclizao do quinto

anel (FIGURA 1.5 e 1.6, pgina 24). Variar a posio e o ataque facial para esta

ciclizao geram vrios ctions isomricos, que se rearranjam para dar formar a

numerosos produtos (XU et al., 2004).

Plantas ricas em triterpenides so usadas em chs e infuses desde os

primrdios da humanidade devido aos seus efeitos curativos. As plantas que os contm

so conhecidas tradicionalmente por possuir propriedades antiinflamatrias e protetoras

do sistema vascular, alm de atividades antialrgica, analgsica e antipirtica, que foram

comprovadas ao longo da metade do sculo XX (LOPES, 2007)

OH O

OHOH OH GlcA-GlcA-O

O

HOOC

OH

OH

OGlcOH

OGlcOH

OH

H

OH

H

Taraxasterol(3S)-2,3-Oxido de esqualeno

Lupeol-amirina -amirina

GlicirrizinaGlicirriza Glabra

28-COOH - cido oleanlico

Dammarenediol IIGinsenosdeo

Panax Ginseng

Cicloartenol -sitosterol

Outros esqueletos de Triterpeno

FIGURA 1.4 - Ciclizao do 2,3-xido de esqualeno e alguns exemplos de

triterpenos e saponinas de plantas (SHYBUYA, et al., 1999)


FIGURA 1.5: Exemplo de ciclizao do ction damarenil para a formao de

alguns triterpenos pentacclicos (XU et al., 2004).

FIGURA 1.6: Exemplo de ciclizao do ction protosteril para a formao de

alguns triterpenos pentacclicos (XU et al., 2004).

importante notar que as estruturas atribudas ciclizao do xido de

esqualeno, podem alternativamente derivar do esqualeno seguido pela oxidao em C3;

inversamente aqueles atribudos aos produtos da ciclizao do esqualeno poderiam vir

da reduo do grupo 3-hidroxil aps a ciclizao. Alm disso, possvel que uma

enzima aceite mltiplos substratos. O xido de esqualeno mais protonado que o

Ction bacarenil OH

H

H

H Ction damarenil

13

18

17

14

16

+20

21

23

25

26

27

Expanso do anel

OH

H

H

H

13

1817

15 16

+

- H+

Ciclizao 18

OH

H

OH

H

OH

H

+

.1318

17

15 16

1929

30

24

25 26

27

28

23

. - H+13 18

17

15 16

1929

30

24

25 26

27

28

23

13 1817

15 16

1929

30

24

25 26

27

28

23hancolupenol

hancokinol

Ction germanicil

OH

H

H

H

OHH

H H

OHH

OHH

H

OH

Expanso do anel

20

21

Ciclizao - Formao do anel E

+17

17+

29

30

28.- H+

1317

15 1629

30

24

25 26

27

23

.13

17

15 16

24

25

27

23

. 2930

Ction arborinil boehmerol isoarborinol

+

Ction protosterill

13

14

17

2021

23


esqualeno, e a esqualenosintase evolui ao protonado grupo funcional olefnico, que

menos bsico do que o grupo epxi. Conseqentemente, as esqualenosintases, podem

protonar com freqncia e ciclizar o xido de esqualeno tambm. Por exemplo, alm da

ciclizao normal do substrato do esqualeno para o tetraimanol, a trataimanolsintase

pode converter o 2,3-xido de esqualeno em 3,21-gamaceranediol (FIGURA 1.7) (XU

et al., 2004).

H

H

OH

OH

H

OH

OH

Tetraimanolsintase

. .

. .

Esqualeno

2,3-xido de esqualeno

Tetraimanolsintase

Tetraimanol

3,21-gamaceranediol

FIGURA 1.7: Exemplo da ciclizao do esqualeno e do xido de esqualeno pela

enzima tetraimanolsintase (XU et al., 2004).

Alguns triterpenos do tipo oleano, por exemplo, -amirina (12c), eritrodiol (19),

cido oleanlico (54), hederagenina (55), apresentam alguma atividade biolgica, tais

como antitumoral (MOREIRA et al., 2003, MENDES, 2004), nematicida (FERRAZ &

FREITAS, 2007), antiinflamatria, (CUNHA et al., 2003) e antinociceptiva (LIMA,

2005).

COOH

OH54

COOH

OHOH

55


Fazem parte do grupo dos ursanos: -amirina (12a), cido urslico (14), cido

tormntico (56), uvaol (57a), faradiol (57b), amidiol (57c) (MENDES, 2004), etc.; e

algumas das atividades biolgicas atribudas a esses compostos que podem ser citadas

so: antimicrobiana (KATO et al., 2006; LOPES, 2007), antiinflamatria, antitumoral

(ES SAADY et al., 1995; LOPES, 2007), antiendematognica (ZITTERL-EGLSSER et

al., 1997) e citotoxidade (UKIYA et al., 2002).

COOH

OH

OH

56

R

OH

57

57a 12,3-OH,28CH2OH uvaol57b 16OH,20,28-CH3 faradiol57c 13-H, 16-OH, 28-CH3, 20-30 amidiol

Na famlia dos lupanos encontram-se os triterpenos: cido betulnico (13), lupeol

(15a), betulina (57a) e calenduladiol (58b) (LOPES, 2007), etc., dos quais foram

identificadas atividades biolgicas tais como antiinflamatria, anticancergena,

antibitica, e antimalrica (FREIRE et al., 2004; YASUKAWA et al., 1996; LOPES,

2007).

R1

R

58a 3-OH,28CH2OH betulina58b 13-H, 16-OH, 28-CH3 calenduladiol


FIGURA 1.8: Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni: (1) rvore; (2) folhas; (3)

frutos; (4) caule. (FONTE: LORENZI, H. rvores Brasileiras: Manual de Identificao

e Cultivo de Plantas Arbreas Nativas do Brasil. vol. 2, 2 ed., 2002).

(1) (2)

(3) (4)

RELEVNCIA E OBJETIVOSRELEVNCIA E OBJETIVOSRELEVNCIA E OBJETIVOSRELEVNCIA E OBJETIVOS

Relevncia e Objetivos 29 ______________________________________________________________________

Considerando que:

Existe uma necessidade de conhecimento das caractersticas qumicas e

atividades biolgicas de espcies vegetais brasileiras.

Muitas espcies brasileiras so utilizadas como medicinais pela populao, sem

que haja comprovao das atividades farmacolgicas preconizadas ou estudos de

sua composio qumica.

Pouco se sabe da qumica e das atividades biolgicas da espcie Pouteria

gardnerii.

Os seguintes objetivos so propostos:

Objetivo Geral

Determinar a composio molecular de extratos das folhas de Pouteria gardnerii

- Sapotaceae.

Objetivos Especficos

Realizar o estudo fitoqumico dos extratos hexnico e etanlico de folhas de

Pouteria gardnerii.

Avaliar as possveis atividades biolgicas apresentadas pelos extratos brutos

hexnico, etanlico e aquoso, e fraes destes.

CAPTULO 2 MATERIAIS E

MTODOS

Captulo 2: Materiais e Mtodos 31 ______________________________________________________________________

2.1. MTODOS GERAIS

2.1.1- Cromatografia em camada delgada (CCD)

2.1.1.1- Fase Estacionria (FE):

- Placas de slica gel 60G (Merck), preparadas em suporte de vidro, com 0,25 mm de

espessura (analtica) ativadas a 105 C;

- Placas de slica gel 60G (Merck) preparadas em suporte de vidro, com 0,50 mm de

espessura (preparativa) ativadas a 105 C.

- Placas de slica gel 0,2 mm Kieselgel 60 ALUGRAM SIL G. (MACHEREY-

NAGEL).

2.1.1.2. - Eluentes (FM):

FM1: Hexano

FM2: Hexano:AcOEt (9:1)

FM3: Hexano:AcOEt (8:2)

FM4: CCl4:AcOEt (14:1)

FM5: Etanol

2.1.1.3 Reveladores (WAGNER et al., 1984)

R1 - Soluo cida de anisaldedo

Reagente para deteco de esterides, prostaglandinas, carboidratos, fenis,

glicosdeos, sapogeninas, terpenos de modo geral (leos essenciais), antibiticos,

micotoxinas.

Mecanismo: o mecanismo de reao com esterides ainda no bem elucidado. Vrias

reaes no-quantitativas correm simultaneamente. Ctions ciclopentenila tm sido

sugeridos como intermedirios que condensam com o anisaldedo para fornecer os

compostos corados. Provavelmente compostos do tipo trifenilmetano tambm sejam

formados com os compostos aromticos.

Soluo A: soluo de anisaldedo em cido actico a 2%

Soluo B: soluo etanlica de H2SO4 a 20%


A cromatoplaca foi borrifada com soluo A e, em seguida, soluo B e foi

ento levada estufa por cerca de 10 min a 100C. Revelador geral.

R2 Reagente de Dragendorff

Soluo A: nitrato bsico de bismuto (1,7 g) foi dissolvido em 100 mL soluo de cido

actico:gua (1:4)

Soluo B: soluo aquosa de iodeto de potssio a 40%

Para borrifao da placa cromatogrfica foi preparada uma soluo composta de

5,0 mL de A; 5,0 mL de B; 20 mL de cido actico e 70,0 mL de gua. Deteco de

alcalides e peptdeos, pelo surgimento de mancha amarelo-alaranjada, imediatamente

aps a borrifao.

R3 Reagente NP/PEG

Soluo A: soluo metanlica de difenilboriloxietilamina a 2%

Soluo B: soluo etanlica de polietilenoglicol 400 a 5 %

A cromatoplaca foi borrifada com soluo A e, em seguida com soluo B e

observada sob luz ultravioleta. Deteco de flavonides e outras substncias fenlicas

pela intensificao da fluorescncia.

R4 Reagente de Verde de Bromocresol

Verde de bromocresol (0,100 g) foi dissolvido em 100 mL de metanol e

alcalinizado com soluo 1 mol/L de NaOH at que a soluo apresentasse cor azul

intenso. Deteco de cidos carboxlicos pelo surgimento de cor amarela sobre fundo

azul, imediatamente aps a borrifao.

R5 Radiao ultravioleta

A placa foi analisada sob luz ultravioleta (= 365 nm). Deteco de substncias

contendo grupos cromforos.


2.1.2 Cromatografia em coluna (CC)

2.1.2.1 Cromatografia lquida

A slica (Slica gel 60 A (70-230 mesh) Merck) foi suspendida com o solvente

utilizado inicialmente como fase mvel (usualmente, hexano) e empacotada em coluna

de vidro at total decantao da slica. A amostra foi incorporada com quantidade

suficiente de slica e solvente e ento foi aplicada no topo da coluna, sendo

posteriormente procedida a eluio, com gradiente em ordem crescente de polaridade.

2.1.2.2 Cromatografia Gasosa acoplada Espectrometria de Massas (CG-EM)

Equipamento: CG: Cromatgrafo Varian, modelo Star 3400

CG-EM: Cromatgrafo Thermo Finnigan modelo TRACE GC

acoplado a a espectrmetro de massas Thermo Finnigan modelo Polaris Q (IE, 70eV).

Banco de dados: Catlogo de espectro de massas NIST - National Institute of

Standards and Technology.

Mtodo:

Coluna: HP5MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 um (5% difenil, 95% dimetilpolisiloxano) -

marca Hewlett Packard

Injetor: 250C, modo splitless

Injeo: 2 L de amostra 1 mg/mL em clorofrmio

Hlio: 0,6 mL/min modo fluxo constante

Forno (2 rampas): 60C 1min, 40C/min at 140C, 4C/min at 300C em 10min

Linha de Transferncia: 280C

Espectrmetro de Massa: Fonte de ons: 250C;

Tempo de incio: 5min;

Polaridade: positivo;

Modo de scan: full scan;

Intervalo de massa: 50-600.


2.1.3 - Anlises Espectromtricas

2.1.3.1 Espectrometria no Infravermelho (IV)

Os espectros foram obtidos no espectrofotmetro Bomem Hartmann & Braun

MB 100 (Alemanha), com valores expressos em cm-1. As amostras foram analisadas

em pastilhas preparadas com brometo de potssio (KBr) (Instituto de Qumica IQ

UnB).

2.1.3.2 Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)

Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram registrados no espectrmetro Varian

Mercury Plus (300MHz, 7,04T, E.U.A), utilizando sondas de deteco ATB e SW de 5

mm de dimetro interno. Os deslocamentos qumicos () foram expressos em ppm e os

solventes deuterados foram CDCl3 e MeOD4, com TMS (tetrametilsilano) como

referncia interna (Instituto de Qumica IQ UnB).

2.1.4 Testes biolgicos

2.1.4.1 Toxicidade em larvas de Artemia salina (MEYER et al., 1982).

- Preparao da soluo salina: Uma soluo de sal marinho (36 g/L) foi

preparada e ajustada, com uma soluo 0,1 M de NaOH, at pH 8-9. Essa soluo foi

utilizada para a ecloso dos ovos de A. salina e para o preparo das diluies dos extratos

hexnico, etanlico e aquoso da Pouteria gardnerii.

- Ecloso dos ovos: Os ovos de A. salina foram postos em soluo salina aquosa

com aerao constante e expostos luz diurna por 48 horas para eclodir.

- Preparao das diluies seriadas: Os extratos foram solubilizados em 0,2

mL de DMSO e o volume foi completado para 20 mL com a soluo salina (1000 ppm).

Desta soluo foram preparadas diluies (500, 250 e 125 ppm) em triplicata. Em cada

tubo foram adicionadas 10 larvas de A. salina.

- Controle positivo: Uma amostra de 2,00 mg dicromato de potssio foi

submetida a condies da amostra a ser analisada.

- Controle negativo: Tubos contendo 0,2 mL de DMSO e 10 larvas de A.

salina, nas mesmas condies da amostra a ser analisada.


- Bioensaio: Os tubos foram mantidos iluminados e, aps de 24 horas, as larvas

sobreviventes foram contadas. O clculo da DL50 foi feito utilizando o programa

PROBITOS (MEYER et al., 1982).

2.1.4.2 Atividade fotoprotetora (SOUZA et al., 2005).

O teste foi realizado no laboratrio de Farmacologia Molecular da Faculdade de

Cincias da Sade da Universidade de Braslia pela equipe do Prof. Luiz Alberto

Simeoni.

Preparo da amostra: a amostra e o controle positivo foram dissolvidos em

mistura etanol:gua (1:1) nas seguintes concentraes: 50, 150 e 300 g/mL.

Controles positivos: cido p-aminobenzico (PABA) Merck; naringina Sigma.

Controle negativo: soluo etanol:gua (1:1).

A atividade fotoprotetora foi avaliada in vitro por meio da medida da

absorbncia das solues na regio do ultravioleta (200 a 400 nm), utilizando

espectrofotmetro Shimadzu (UV1601) e cubetas de quartzo com caminho ptico de 1

cm.

2.1.4.3 Atividade Antioxidante

2.1.4.3.1 Mtodo de Varredura pelo Perxido de Hidrognio (RUCH et al., 1989)

Este experimento foi realizado no laboratrio de Anlise Instrumental e

Laboratrio de Testes Biolgicos da Universidade Catlica Dom Bosco (UCDB), em

Campo Grande MS, pela equipe da Profa. Ana Lcia Alves de Arruda.

O Mtodo de Varredura pelo Perxido de Hidrognio baseia-se na investigao

da habilidade das amostras testadas seqestrarem os radicais livres de perxido de

hidrognio. Elevada habilidade em seqestrar o perxido de hidrognio est relacionada

presena de antioxidantes, nas amostras capazes de reagir com radicais livres

(RAYMUNDO et al, 2004).

Reagentes e solues:

Reagente: Soluo de perxido de hidrognio em que foi preparada em tampo fosfato

0,1 M pH 7,4 (40 mM).

Tampo fosfato: Soluo A: KH2PO4 (dihidrogenofosfato de potssio) 0,1 mol/L


Soluo B: NaOH (Hidrxido de sdio) 0,2 mol/L

Colocar em um balo volumtrico 50 mL da soluo A e 2,8 mL da soluo B,

completar o volume para 100 mL. Ajustar o pH para 7,4 com HCl ou NaOH

As amostras foram solubilizadas em MeOH, de forma a serem obtidas

diferentes concentraes (250, 125, 50, 25, 10 e 5 g/mL). A cada amostra foram

adicionados 3,4 mL de tampo fosfato 0.1 M pH 7.4 e 0,6 mL de soluo de perxido

de hidrognio 40 mM.

Foi utilizado como padro o cido ascrbico nas mesmas condies das

amostras. As amostras foram incubadas por 10 minutos e foi feita a leitura a 230 nm em

espectrofotmetro Aqua Mate UV/Visvel (Thermo Spectronic AQA095109)

2.1.4.3.2. Atividade seqestradora do radical DPPH (YILDIRIM et al., 2001 e

HUANG et al., 2005).

Este experimento foi realizado no laboratrio do curso de Qumica da

Universidade Catlica de Braslia Braslia/DF, pela equipe do Prof. Carlos Frederico

de Souza Castro.

O mesmo se baseia na capacidade dos agentes antioxidantes presentes na

amostra em seqestrar o radical estvel DPPH. A elevada habilidade da amostra em

retirar o radical estvel do DPPH est relacionada com a atividade antioxidante da

amostra (DUARTE-ALMEIDA, 2007).

Preparo das Solues: Reagente: Foram dissolvidos 2,5 mg de 2,2-difenil-1-

picrilidrazila (DPPH) em 25 mL de etanol. A soluo foi mantida em frasco mbar

(soluo estoque).

Amostra: Foram dissolvidos 0,002 g da amostra em 10 mL de etanol.

Controle positivo: Foram dissolvidos 0,002 g de butilhidroxitolueno (BHT) em

10 mL de etanol.

Controle negativo (branco): etanol.

Da amostra, preparada conforme descrito acima, foram tomados 4 mL,

distribudos em 2 bqueres, um para o ensaio e outro para o controle negativo.

soluo inicial restante, foram adicionados 4 mL de etanol, para a obteno de uma


soluo com 60% da concentrao da soluo original. O procedimento foi repetido por

mais seis vezes, para obteno de sete solues com diluies sucessivas em

concentraes decrescentes (200 a 10 ppm).

Para cada amostra do ensaio, foi adicionado 1 mL de soluo de DPPH. Para

cada controle negativo, foi adicionado 1 mL de etanol, de modo a manter a mesma

concentrao do extrato bruto na amostra e no controle negativo.

Aps a adio da soluo de DPPH, as solues foram mantidas em repouso por

30 min. A atividade antioxidante foi avaliada in vitro por meio da medida da

absorbncia das solues em 517 nm, utilizando um colormetro da Micronal, modelo

B-542. A porcentagem do DPPH final foi calculada pela seguinte Equao (1):

A concentrao de DPPH (% DPPH restante) proporcional concentrao de

substncia antioxidante presente na amostra, sendo que a concentrao de extrato que

causa uma diminuio para a metade da concentrao inicial de DPPH (50%) definida

como Concentrao Efetiva 50 (CE50), e a concentrao de extrato que causa uma

diminuio de 99% da concentrao inicial do DPPH definida como Concentrao

Efetiva 99 (CE99).

A CE50 e CE99 so calculadas por interpolao do grfico de regresso linear

obtido para os valores de %DPPH restante para cada concentrao.

2.1.4.4 Atividade antimicrobiana

2.1.4.4.1 Atividade antibacteriana

2.1.4.4.1.1. Mtodo de difuso em gar (NCCLS, 2003a):

Este experimento foi realizado no laboratrio do Hospital das Foras Armadas

(HFA), por Amabel Fernandes Correia

- Microrganismos: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli -

ATCC 25922 e Staphylococcus aureus - ATCC 29213

=

controle

amostracontroleteres Abs

AbsAbsDPPH 100% tan

Equao (1)


- Inculo bacteriano inicial: igual a 1,8 x 107 unidades formadoras de

colnias/mL (UFC/mL). Quando analisado por espectrometria no comprimento de onda

de 600nm, forneceu uma leitura de densidade ptica (OD) igual a 0,5 (controle).

- Concentraes da amostra: entre 1400 g/mL a 500 g/mL.

- Meio de cultura:

-Agar Mller Hinton (Earle)

- Bioensaio: Discos de papel de filtro de seis milmetros de dimetro,

previamente autoclavados, foram impregnados com 20 L de uma soluo da amostra,

preparada em solvente adequado completa solubilizao (hexano, etanol ou gua),

para obteno de uma concentrao final de 100 mg/mL. Os discos impregnados foram

inseridos no meio de cultura contendo suspenses dos microrganismos supracitados.

As placas foram incubadas a 37C ( 1C) por 24 horas (para as bactrias).

Depois da inoculao, havendo zona de inibio ao redor do disco, esta foi medida.

Todas as determinaes foram feitas em triplicata. Foi realizada uma leitura em

espectrofotmetro a 600 nm. Foram consideradas ativas as amostras que apresentaram

OD


Meio de Cultura: gar Sabouraud (VETEC).

Bioensaio: Discos de papel de filtro de seis milmetros de dimetro, previamente

autoclavados, foram impregnados com 20 L de uma soluo da amostra, preparada em

solvente adequado completa solubilizao (hexano, metanol, etanol ou gua), para

obteno de uma concentrao final de 100 mg/mL. Os discos impregnados foram

inseridos no meio de cultura contendo suspenses dos microrganismos supra-citados.

As placas foram incubadas a 37C ( 1C) por 24 horas (para as bactrias) e

28C por 48 horas (para leveduras). Depois da inoculao, havendo zona de inibio ao

redor do disco, que foi medida. Todas as determinaes foram feitas em triplicata.

Controles:

-positivo: discos comerciais de nistatina e anfotericina B (ambos da marca CECOM).

-negativo: solvente.

2.1.4.5 - Teste de inibio de proliferao celular

2.1.4.5.1 - Ensaio de proliferao celular MTT (JADA et al., 2007 e CULIOL et al.,

2004).

Este teste foi realizado no Laboratorio de Imunologia e Virologia da Faculdade

de Cincias Biolgicas da Universidad Autonoma de Nueva Leon (UANL), Mxico,

pela equipe do Prof. Pablo Zapata Benavides.

O princpio deste mtodo consiste na absoro do sal MTT {brometo de [3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio]} (Sigma) pelas clulas sendo reduzido no

interior da mitocndria a um produto chamado Formazan. Este produto acumulado

dentro da clula e extrado atravs da adio de um solvente apropriado.

Linhagem celular: clulas de cncer pulmonar (NSCLC - non-small cell lung

cncer) das linhagens CALU e A427, ambas ATCC (American Type Culture

Collection).

Reagente: brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio], marca

Sigma.

Meio: Meio Mnimo Essencial (Eagle) com 2 mM de L-glutamina e Soluo

Salina balanceada (Eargle) ajustada para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sdio e 10 %

de Soro Fetal.Bovino.


Bioensaio: Em placas de cultivo de 96 poos, foram colocadas 3000 clulas por

poo e aps 24 horas, as clulas que j estavam aderidas foram tratadas com o extrato

metanlico das amostras em quatro concentraes diferentes (0,25 mg/mL, 5 mg/mL, 1

mg/mL, e 2 mg/mL).

Aps 24 horas foi realizado o ensaio de proliferao celular com MTT {brometo

de 2,5-difenil-3-(4,5-dimetiltiazo-2-ila)

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CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO QUÍMICO E BIOLÓGICO DE …repositorio.unb.br/bitstream/10482/3379/1/2007_CintiaAlvesdeMatos... · 3.1.2.4 Análise do CG-EM no tempo de retenção 49,36