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JOYCE DE CASSIA ROSA DE JESUS
Contribuição do inflamassoma NLRP3 para a inflamação em dois depósitos de tecido adiposo de pacientes com caquexia
associada ao câncer
São Paulo
2021
JOYCE DE CASSIA ROSA DE JESUS
Contribuição do inflamassoma NLRP3 para a inflamação em dois depósitos de tecido adiposo de pacientes com caquexia
associada ao câncer
São Paulo
2021
Este exemplar corresponde à versão final original da Tese,
apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo para a obtenção do título de Doutora em
Ciências.
A versão original encontra-se disponível tanto na Biblioteca
da Unidade que aloja o Programa, quanto na Biblioteca
Digital de Teses e Dissertações da USP (BDTD).
Programa de Clínica Cirúrgica
Orientador: Prof. Dr. José Pinhata Otoch
"Now I remember that the real world was wide, and that a varied field of hopes and fears, of sensations and excitements, awaited those who had the courage to go forth into its expanse, to seek real knowledge of life amidst its perils."
Charlotte Brontë, in Jane Eyre
Agradecimentos
Ao final dessa jornada incrível, nossa! Não consigo encontrar palavras para
expressar tudo o que sinto, mas vou tentar...
Agradeço a Deus, por me guiar durante a minha caminhada, cheia de obstáculos,
mas bela de uma forma inesperada.
À minha mãe, Iride, por acreditar que eu teria um futuro brilhante. Por me
incentivar do jeito que era possível, dentro das nossas limitações. Às minhas
irmãs (Juliana, Talita e Priscila), irmão (Samuel) e sobrinhos (Gabriela, Sophia,
Davi, João, Nicollas, Arthur e Maria Victoria). Nick, obrigada por me considerar
um talento da família! À minha tia Cida, companheira e testemunha da minha
luta diária, o meu amor e admiração.
Aos meus avós, pelo amor incondicional. Por fazerem aflorar em mim o desejo
de cuidar e melhorar o meu entorno. Onde quer que estejam, vocês têm o meu
amor eterno.
Ao Emídio Matos, pessoa incrível que me recebeu de braços abertos e me
ensinou tanto. Aos alunos e alunas do laboratório Metabolismo e Câncer, meu
profundo agradecimento por tudo!
Ao Professor José Cesar Rosa Neto e seus alunos do Laboratório de
Imunometabolismo, Edson, Loreana, Luana, Alexandre e Tiego, muito obrigada
por toda a ajuda e todos os ensinamentos que me deram!
Às minhas amigas que o laboratório me presenteou, Ariene (muito mais que uma
amiga, minha irmã de outra mãe), Raquel (com seus abraços quentinhos), Bruna
(e sua risada gostosa), Paula (sempre com uma palavra de carinho), Katrin (e
seu alto astral e por sempre estar disposta a ajudar). Agradeço imensamente
também ao Ruan Macêdo, pelas discussões sempre pertinentes e pelo apoio!
Aos médicos, por ajudarem em tudo o que era necessário para que este projeto
pudesse ser realizado. Aos Dr. Paulo Sérgio Alcântara, Flavio Tokeshi, Linda
Ferreira, Cornelius Mitteldorf, Fang Chia, Fernanda Bellotti, Louise Galantini,
Luís Henrique Nucci... enfim, a todos e todas, e são muitos, corro o risco de
esquecer alguém, e não queria cometer essa injustiça... Pela excelência em
Medicina, por discutirem e sempre compartilharem seus conhecimentos comigo,
a cada um, meu mais profundo respeito e gratidão!
Aos pacientes, pela confiança, por compartilharem comigo as suas histórias.
Pelo choro, risadas, apreensões, dúvidas, amizade, conversas, mimos... foi uma
honra conhecer cada um de vocês. Cada dia de ambulatório era extremamente
especial por causa de vocês.
À Eliane Monico Gazetto, todo o agradecimento do mundo seria pouco. Você
sempre fez de tudo para que as coisas ficassem mais fáceis para mim. Pelo
acolhimento, pelas conversas, por tudo, enfim! Você é maravilhosa!
À minha orientadora, Profa. Dra. Marília Seelaender, por ter aberto muitas portas
para mim. O momento em que me recebeu foi muito especial, pois eu não
esperava fazer doutorado e você tornou isso possível. Pelos seus ensinamentos,
por trocar experiências comigo, por me ouvir e entender. Meu eterno
agradecimento por tudo, minha admiração e respeito pela mulher cientista
maravilhosa e brilhante que você é!
Ao meu orientador, Prof. Dr. José Pinhata Otoch, obrigada por tudo. Pelo
exemplo de ser humano e de profissional que é para todos à sua volta. Pela sua
imensa paciência comigo, pelo cuidado, por me estender a mão sempre que
precisei, por puxar minha orelha quando era necessário. Foi um privilégio ser
sua aluna!
À CAPES, pelo apoio financeiro, tão crucial para que eu pudesse chegar até
aqui.
Dedico aos que me fizeram crescer como ser humano e profissional. Dedico à minha mãe, Iride, e aos meus avós Antônio Francisco e Maria Rosa (in memoriam), amores da minha vida. Dedico aos pacientes, grandes professores, que nos auxiliam a fazer pesquisa, no afã de aliviar as dores, mesmo que não sejam as suas próprias.
NORMALIZAÇÃO ADOTADA
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta
publicação:
Referências: adaptado de International Commitee of Medical Journals Editors
(Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria
F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria
Vilhena. 3ª. ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed
in Index Medicus.
Sumário
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 18
2. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 20
3. OBJETIVOS .............................................................................................................. 21
3.1. Gerais ................................................................................................................. 21 3.2. Específicos ......................................................................................................... 21
4. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 22
4.1 Panorama geral da doença de base, câncer colorretal ....................................... 22 4.2 Câncer e Inflamação ........................................................................................... 23 4.3 Caquexia associada ao câncer ........................................................................... 24 4.4 Tecido adiposo .................................................................................................... 27 4.5 Inflamação do tecido adiposo - contribuição para a caquexia ............................. 29 4.6 Os Receptores de Reconhecimento de Padrões e os inflamassomas ............... 31 4.7 Inflamassoma NLRP3 .......................................................................................... 33 4.8 Elementos do inflamassoma e mecanismos de ativação .................................... 35 4.9 Funções no processamento e liberação de citocinas .......................................... 37 4.10 Inflamassoma versus câncer ............................................................................. 39
5. MÉTODOS ................................................................................................................ 42
5.1 Aprovação ética ................................................................................................... 42 5.2 Recrutamento de pacientes ................................................................................. 42 5.3 Critérios de inclusão ............................................................................................ 42 5.4 Critérios de exclusão ........................................................................................... 43 5.5 Critérios diagnósticos da caquexia ...................................................................... 43 5.6 Coleta de sangue ................................................................................................ 46 5.7 Obtenção de tecido adiposo ................................................................................ 47
5.7.1 Processamento das amostras (lipectomia) ................................................... 47
5.7.2 Cultivo celular ............................................................................................... 47
5.8 Experimentos ....................................................................................................... 48
5.8.1 Análises bioquímicas .................................................................................... 48
5.8.2 Análise da expressão gênica ........................................................................ 49
5.8.3 Quantificação da concentração de proteínas do meio de cultura ................. 52
5.9 Análise estatística ................................................................................................ 53
6. RESULTADOS ......................................................................................................... 54
6.1 Voluntários recrutados e divisão em grupos ....................................................... 54 6.2 Características clínicas dos pacientes ................................................................ 55 6.3 Parâmetros bioquímicos utilizados no diagnóstico de caquexia ......................... 61 6.4 Análise da Expressão Gênica dos Tecidos Adiposos Subcutâneo e Peritumoral e
conteúdo proteico do Subcutâneo ............................................................................. 62
7. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 68
7.1 Achados clínicos .................................................................................................. 68 7.2 Análise da expressão gênica e conteúdo proteico .............................................. 71
CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................... 74
ANEXOS ....................................................................................................................... 75
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 95
Lista de Abreviaturas e Siglas CCR Câncer coloretal CEA Antígeno carcinoembriogênico NLRP3 Família NLR, Proteína contendo domínio pirina 3 (do inglês, NLR
Family, Pyrin domain containing Protein 3) IL-1b Interleucina-1 beta (do inglês, Interleukin-1 beta) IL-18 Interleucina-18 (do inglês, Interleukin-18) INCA Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva CAC Caquexia associada ao câncer (em inglês, cancer cachexia) TA Tecido adiposo TG Triacilglicerol TASC Tecido adiposo subcutâneo TAV Tecido adiposo visceral TNF-a Fator de necrose tumoral alfa (do inglês, Tumor necrosis factor
alpha) IL-6 Interleucina-6 (do inglês, Interleukin-6) IL-10 Interleucina-10 (do inglês, Interleukin-10) FVE Fração vascular estromal RNA Ácido ribonucleico RNAm RNA mensageiro PCR Proteína C reativa HDL Lipoproteína de alta densidade PRR Receptor de reconhecimento de padrão (do inglês, Pattern
recognition receptor) PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos (do inglês,
Pathogen-associated molecular patterns) DAMPs padrões moleculares associados a danos (do inglês, Damage-
associated molecular patterns) TLR Toll-Like receptor (receptor tipo Toll) CLR Receptor lectina tipo C (do inglês, C-type lectin receptor) RLR Receptor semelhante ao gene I induzido por ácido retinóico (do
inglês, RIG (Retinoic acid-inducible gene) -I-like receptor) ALR Receptor tipo Ausente em Melanoma (do inglês, AIM2 (Absent in
melanoma) - like receptor) NLR Receptor semelhante a domínio de ligação a nucleotídeo e
oligomerização (do inglês, NOD (Nucleotide-binding, and oligomerization domain) - like receptor))
NLRP (ou NALP) Família NLR, Proteína contendo domínio pirina ou Proteína contendo domínios NACHT, LRR e PYD (do inglês, NLR Family, Pyrin domain containing Protein ou NACHT, LRR and PYD domains-containing protein)
NF-κB Fator Nuclear kappa B (do inglês, Nuclear Factor kappa B) CAPS Síndrome Periódica Associada à Criopirina (do inglês, Cryopyrin
Associated Periodic Syndrome) FCAS Síndrome Familial Autoinflamatória a Frio (do inglês, Familial
Cold Auto-inflammatory Syndrome) MWS Síndrome Muckle-Wells (do inglês, Muckle-Wells Syndrome) NOMID/CINCA Doença inflamatória multissistêmica de início neonatal/ síndrome
neurológica cutânea e articular infantil crônica (do inglês, Neonatal-onset multisystem inflammation disease/ chronic infantile neurological cutaneous and articular syndrome)
DNA Ácido desoxirribonucleico ATP Trifosfato de adenosina
TLR4 Receptor tipo Toll 4 IL-1R1 Receptor de Interleucina-1 tipo 1 TNFR1 Receptor do fator de necrose tumoral 1 TNFR2 Receptor do fator de necrose tumoral 2 ICE Enzima conversora de IL-1β (do inglês, IL-1β converting enzyme) ASC Proteína semelhante a uma mancha associada à apoptose
contendo um CARD (do inglês, Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)
KDa Quilodálton IFN-g Interferon gama células Th1 Células T auxiliadoras tipo 1 células Th2 Células T auxiliadoras tipo 2 CEP Comissão de Ética em Pesquisa TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido EORTC-QLQ-C30 Questionário de Qualidade de Vida - 30 Itens Básicos (European
Organization for Research and Treatment of Cancer Quality of Life Questionnaire Core 30 Items)
FAACT-A/CS Avaliação funcional da terapia de anorexia/caquexia (Functional Assessment of Anorexia/Cachexia Therapy – The European Society for Clinical Nutrition and Metabolism)
IMC Índice de massa corporal DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida DII Doenças inflamatórias do intestino CTL Grupo Controle WSC Câncer e peso estável (do inglês, Weight-stable Cancer) CC Câncer e caquexia (do inglês, Cancer Cachexia) LDL Lipoproteína de baixa densidade LPS Lipopolissacarídeo cDNA DNA complementar qPCR-RT Reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real TNM Tumor – Linfonodo – Metástase UICC Union for International Cancer Control GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase IL-1ra Antagonista do receptor de IL-1 IL-1a Interleucina-1 alfa
Lista de Símbolos D Delta (variação) % Por cento/percentual = Igual a < Menor que > Maior que ± Mais ou menos
Lista de Figuras 1. Estágios da caquexia ............................................................................. 26 2. Critérios diagnósticos da caquexia ......................................................... 27 3. Esquema simplificado da via do inflamassoma NLRP3 ......................... 35 4. Ferramenta utilizada para a classificação dos pacientes ....................... 44 5. Caracterização dos grupos .................................................................... 46 6. Esquema dos poços de cultura, com e sem estímulo por LPS por 24h 48 7A. Idade média em anos .......................................................................... 55 7B. Sexo ..................................................................................................... 55 8A. Altura em m .......................................................................................... 56 8B. Índice de massa corporal (IMC), em Kg/m2 ......................................... 56 9. Variação (Δ) de peso em função do tempo ............................................ 56 10. Comorbidades relatadas ...................................................................... 57 11. Lateralidade do cólon ........................................................................... 57 12A. Localização anatômica do tumor ....................................................... 58 12B. Estadiamento tumoral, segundo o TNM ............................................ 58 13A. Escala de Saúde Global QLQ-C30 .................................................... 58 13B. Escala Funcional QLQ-C30 ............................................................... 58 13C. Escala de Sintomas QLQ-C30 ........................................................... 58 14. Pontuação anoréxica ............................................................................ 59 15A. Escala de Karnofsky .......................................................................... 59 15B. Zubrod Performance Status ............................................................... 59 16. Avaliação de Ansiedade e Depressão ................................................. 60 17A-E. Níveis lipídicos e de glicose séricos, em mg/dL ............................. 61 18A. Níveis séricos de hemoglobina (Hb), em g/dL ................................... 62 18B. Níveis séricos de PCR, em mg/L ....................................................... 62 18C. Níveis séricos de albumina, em g/dL ................................................. 62 19. Razão PCR/Albumina (mg/g) ............................................................... 62 20A-D. Receptores envolvidos na ativação do inflamassoma ................... 63 21A-F. Indução da expressão de NLRP3 através da via NF-kB ................ 65 22A-I. Ativação de citocinas mediada por caspase-1 ................................ 67
Lista de Tabelas 1. Substâncias ativadoras de NLRP3 .......................................................... 34 1. Sequências dos Primers utilizados .......................................................... 51
Resumo
Jesus JCR. Contribuição do inflamassoma NLRP3 para a inflamação em dois depósitos de tecido adiposo de pacientes com caquexia associada ao câncer [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2021. A caquexia é uma síndrome metabólica que acompanha algumas doenças crônicas, como o câncer. Embora seja mais profundamente estudada hoje, continua sendo um enigma tanto clínico quanto científico. Os pacientes apresentam modificações metabólicas, imunológicas e inflamação sistêmica contínua, sendo o aspecto mais evidente e preocupante a perda de massa corporal, decorrente da atrofia dos tecidos adiposo e muscular. A via intracelular do inflamassoma NLRP3 induz inflamação e está envolvida em diversas doenças. Sabendo que a inflamação crônica está associada a vários tipos de câncer e que o inflamassoma NLRP3 induz a maturação das citocinas IL-1b e IL-18, nossa hipótese foi de que a via do inflamassoma NLRP3 poderia estar envolvida na inflamação do tecido adiposo na caquexia associada ao câncer. Este projeto objetivou investigar se a via do inflamassoma NLRP3 está ativada nos depósitos de tecido adiposo subcutâneo e peritumoral e a sua possível contribuição para a inflamação existente na caquexia oncológica. Foram recrutados pacientes que seriam submetidos à cirurgia para correção de hérnias da parede abdominal, colecistectomias e proctoplexia abdominal (controles (CTL), n=8) e pacientes com câncer colorretal (WSC, n=10 e CC, n=10). As coletas de amostras de tecido adiposo ocorreram durante a cirurgia, foram processadas e colocadas em meio de cultura celular por 24h, na presença ou não de lipopolissacarídeo. O sobrenadante foi coletado para quantificação de proteínas por imunoensaio e o tecido, congelado, para extração de RNA e quantificação por reação em cadeia de polimerase. Baseado nos parâmetros bioquímicos e em respostas a questionários, os pacientes foram classificados em Controle, Câncer sem caquexia e Câncer com caquexia. No grupo CC, alguns genes tiveram expressão diminuída no TASC e aumentada no TAPT (TLR4, Caspase-1) ou aumentada no TASC e diminuída no TAPT (NF-𝜅B p50, NF-𝜅B p65, IL-1β); outros genes, como o CD36, apresentaram menor expressão, enquanto a expressão do RNAm de NLRP3 e IL-18 foi maior, em ambos os tecidos. Os níveis de proteína basal de caspase-1 no sobrenadante da cultura de TASC foram maiores em WSC e CC quando comparados ao grupo CTL, enquanto o conteúdo proteico basal de IL-1β e IL-18 no sobrenadante de TASC estavam diminuídos nos grupos WSC e CC. Demonstramos aqui, pela primeira vez, que há diferenças significativas na expressão de componentes desta via em tecidos adiposos de pacientes com caquexia associada ao câncer colorretal. Dessa forma, a via aparece como potencial alvo terapêutico. Descritores: Neoplasias; Caquexia/complicações; Gordura Subcutânea Abdominal; Tecido Adiposo Intra-abdominal; Inflamação; Inflamassoma NLRP3.
Abstract
Jesus JCR. Contribution of NLRP3 inflammasome adipose tissue inflammation in patients with cancer cachexia [Thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2021. Cachexia is a complex, highly debilitating metabolic syndrome that accompanies some chronic diseases, such as cancer. Patients show profound metabolic and immunological changes and continuous systemic inflammation, while the most evident and worrying aspect is weight loss due to the atrophy of the adipose and muscle tissues. The intracellular pathway NLRP3 inflammasome induces inflammatory processes and induces the maturation of the cytokines IL-1b and IL-18. We hypothesized that the NLRP3 inflammasome pathway could be involved in the inflammation of adipose tissue in cancer cachexia. This project aimed to investigate whether the NLRP3 inflammasome pathway was activated in the subcutaneous and peritumoral adipose tissues of cancer patients. Patients who underwent surgery to correct hernias of the abdominal wall, cholecystectomies, and abdominal proctoplexy (controls) were recruited, as well as patients with colorectal cancer. Samples of subcutaneous and peritumoral adipose tissue were collected during the surgery. The samples were processed and incubated for 24 hours, with medium with and without lipopolysaccharide. The supernatant was collected for protein quantification by immunoassays and the tissue was frozen for extraction of RNA and quantification by polymerase chain reaction. Based on biochemical parameters and on the responses to questionnaires, patients were classified into Control, Weight-Stable Cancer, and Cancer Cachexia. In the CC group, some genes had decreased expression in ScAT and increased in PtAT (TLR4, Caspase-1) or increased in ScAT and decreased in PtAT (NF-𝜅B p50, NF-𝜅B p65, IL-1β); other genes, such as CD36, showed lower expression, while NLRP3 and IL-18 mRNA expression were higher in both tissues. Caspase-1 basal protein levels in the ScAT culture supernatant were higher in WSC and CC when compared to the CTL group. Basal ScAT explant culture IL-1β and IL-18 protein content in ScAT supernatant were decreased in the WSC and CC group. We demonstrate here, for the first time, that there are significant differences in the expression of components of this pathway in the adipose tissues of patients with cachexia associated with colorectal cancer. These findings may pave the way for future treatment strategies aimed at modulating this pathway. Keywords: Neoplasms; Cachexia/complications; Subcutaneous fat abdominal; Intra-abdominal Fat; Inflammation; NLRP3 Inflammasome.
18
1. INTRODUÇÃO
Como tantas outras doenças crônicas, o câncer pode estar associado a
várias síndromes. As chamadas síndromes paraneoplásicas cursam com ou são
consequência do câncer e podem afetar a função de muitos órgãos (1,2). A
caquexia associada ao câncer (CAC) é uma síndrome paraneoplásica
multifatorial, altamente debilitante e potencialmente letal, que pode comprometer
a resposta terapêutica e a qualidade de vida dos pacientes. A sua etiologia é
complexa e ainda não totalmente esclarecida, mas acredita-se que CAC resulte
da interação entre citocinas do hospedeiro e fatores secretados pelo tumor,
culminando em inflamação sistêmica crônica. A inflamação sistêmica é uma
característica distintiva da caquexia associada ao câncer. A inflamação contínua
e sistêmica estimula o gasto energético exacerbado na CAC, através da
secreção de citocinas pelo tumor e pelos tecidos do hospedeiro em resposta ao
tumor, causando a perda tanto de músculo, quanto de tecido adiposo (2–7).
Considerado multiórgão e multitarefas, o tecido adiposo tem um papel
importante na função endócrina e metabólica. Pensava-se que o tecido adiposo
não desempenhava funções fisiológicas fundamentais, funcionando apenas
como isolante térmico e reservatório de energia; na verdade, entretanto, é um
órgão endócrino, complexo e ativo, responsável pela secreção de esteroides
precursores de hormônios, citocinas e adipocinas, com funções na regulação de
armazenamento de gordura, metabolismo energético, ingestão alimentar,
sensibilidade à insulina e na imunidade e inflamação (8–14).
Sob a influência da inflamação sistêmica crônica observada na caquexia
associada ao câncer, o metabolismo e a função do tecido adiposo subcutâneo
são prejudicados, o que se traduz em mudanças morfológicas e moleculares (15).
Estudos mostram que o tecido adiposo subcutâneo é o primeiro a ser afetado
pela CAC, mas pouco se sabe acerca dos mecanismos inflamatórios que
ocasionam a depleção da massa adiposa(15–18).
Os inflamassomas, como o NLRP3, são potentes indutores de citocinas
pró-inflamatórias, através da sinalização de fatores de transcrição como o NF-
κB (19–22). O inflamassoma NLRP3 tem recebido crescente atenção porque está
19
implicado na patogênese de diversas doenças inflamatórias, como resistência à
insulina (característica da diabetes tipo 2), obesidade e gota e, recentemente,
evidenciou-se seu papel importante para o desenvolvimento do câncer(22–25). Um
estudo em nosso laboratório demonstrou, pela primeira vez, que a via
inflamassoma pode estar envolvida na inflamação do tecido adiposo na CAC em
um modelo murino de caquexia (26). Este achado inédito nos intrigou e motivou
ao desenvolvimento do presente estudo, com o intuito de analisar se este mesmo
mecanismo também estaria presente na caquexia oncológica em pacientes com
tumor colorretal.
20
2. JUSTIFICATIVA
Tendo em vista que os mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento
da caquexia associada ao câncer ainda não estão completamente elucidados e
devido à inflamação sistêmica sustentada ser um denominador comum de
muitas consequências clínicas e metabólicas da caquexia associada ao câncer,
este estudo se propôs a investigar a via do inflamassoma NLRP3 no tecido
adiposo subcutâneo e peritumoral e a sua contribuição para a caquexia
oncológica em humanos.
21
3. OBJETIVOS
3.1. Gerais
Investigar se a via do inflamassoma NLRP3 está ativada nos tecidos
adiposos subcutâneo e peritumoral e a sua possível contribuição na inflamação
local e sistêmica presente na caquexia associada ao câncer.
3.2. Específicos
1. Analisar a expressão gênica de componentes da via do inflamassoma
nos tecidos adiposos subcutâneo e peritumoral (mesentérico);
2. Avaliar indiretamente a ativação do inflamassoma, através da
quantificação de caspase-1 e das citocinas IL-1b e IL-18 no
sobrenadante de meio de cultura celular.
22
4. REVISÃO DE LITERATURA
4.1 Panorama geral da doença de base, câncer colorretal
O câncer está entre as quatro principais causas de morte prematura no
mundo. O risco de adoecer e morrer por câncer relaciona-se ao envelhecimento,
ao crescimento populacional e a alterações na distribuição e influência dos
fatores de risco. No Brasil, observa-se a mudança no perfil epidemiológico do
câncer, com redução do número de casos de tumores associados a infecções,
como os de cavidade oral e colo do útero, e aumento dos tipos que são mais
comuns em países desenvolvidos, como o câncer colorretal (CCR). A estimativa
mundial mais recente aponta para a ocorrência de 1 milhão de casos novos de
câncer colorretal, representando o terceiro tipo de tumor mais frequente. No
Brasil, a estimativa aponta que, para cada ano do triênio 2020-2022, serão 41
mil novos casos, sendo o segundo tipo mais incidente entre homens e
mulheres(27).
Cerca de 60% dos casos de câncer colorretal são esporádicos, sem
qualquer relação com fatores genéticos herdados ou histórico familiar. As altas
taxas de mortalidade podem ser atribuídas ao diagnóstico em estadios mais
avançados. Nestes casos, geralmente os fatores de risco são ambientais
(obesidade, tabagismo, consumo excessivo de álcool, dietas pobres em vegetais
e frutas, inatividade física) e hereditários (histórico familiar e síndromes
hereditárias polipoides e não-polipoides) (28). As prevenções primária e terciária
consistem na cessação do hábito de fumar, dietas saudáveis e exercícios físicos
regulares. A secundária, na realização de colonoscopia e pesquisa de sangue
oculto nas fezes, principalmente em pessoas com alto risco (29).
Os sintomas podem incluir sangramento retal evidente ou não, mudança
nos hábitos intestinais, anemia, dor abdominal ou perda de massa corporal
inexplicável e não intencional. Alto conteúdo plasmático do marcador tumoral
carcinoembriogênico (CEA) ao diagnóstico indica um pior prognóstico; se sua
concentração não retorna ao normal no período pós-operatório pode ser sinal de
doença residual (29,30). O estadiamento é realizado através de anatomia
patológica (subtipagem, acúmulo de anormalidades, invasão linfática, perineural
23
e venosa), estadiamento TNM (classificação Tumor-Linfonodo-Metástase),
determinação de valores de marcadores tumorais por imunohistoquímica e
avaliação de instabilidade de microssatélites (29).
4.2 Câncer e Inflamação
Enquanto as células normais obedecem a um rígido controle dos
processos de divisão, as células neoplásicas adquirem capacidades que as
habilitam a suprimir tais vias de sinalização que controlam a homeostase, a
sobrevivência e a morte celular, e, assim, conseguem escapar à vigilância do
sistema imunológico e usá-lo em seu próprio benefício para crescer, progredir,
evoluir e, eventualmente, até se espalhar (31).
O sistema imunológico desempenha papéis essenciais na defesa do
hospedeiro e manutenção da homeostase; divide-se em sistemas inato,
adaptativo e complemento. O sistema imune inato é composto por fagócitos
(neutrófilos, monócitos/macrófagos e células dendríticas), mastócitos,
eosinófilos, basófilos, células matadoras naturais e células matadoras naturais
T; estas células constituem a primeira linha de defesa contra patógenos e
tumores e são responsáveis por ativar o sistema imune adaptativo (linfócitos T e
B) através da apresentação de antígenos e promoção da inflamação (32).
Paradoxalmente, o sistema imunológico pode atuar tanto eliminando células pré-
malignas e malignas (ação anti-tumorigênica), quanto promovendo o
crescimento tumoral (ação pró-tumorigênica). Tumores podem ficar dormentes
por anos devido ao equilíbrio entre crescimento tumoral e a destruição dessas
células pelo sistema imunológico (33).
A inflamação aguda, uma resposta imunológica inata à infecção e ao dano
tecidual, é caracterizada pela presença de fagócitos mononucleares; é um
processo fortemente controlado. Sua função é reconhecer, destruir e eliminar
agentes estranhos, assim como favorecer o reparo tecidual, restabelecendo a
homeostase (34); porém, caso a inflamação aguda não seja solucionada, se torna
crônica, caracterizada pelo recrutamento de leucócitos (principalmente fagócitos
polimorfonucleares) ao sítio inflamatório (35,36).
24
A persistência de sítios de inflamação crônica, onde há injúria tecidual
repetida, é a causa de doenças como artrite reumatóide, colite ulcerativa, doença
de Crohn e aterosclerose (37). A associação entre inflamação e câncer não é
nova: foi Rudolf Virchow, em 1863, quem primeiro observou a infiltração de
leucócitos no tecido neoplásico e estabeleceu essa ligação (1). Na verdade, a
inflamação crônica é considerada atualmente como uma das marcas distintivas
do câncer (31). Comparada a feridas que nunca cicatrizam (38), a formação de
muitos tumores também está associada a locais de inflamação crônica. Em
outras palavras, a inflamação atua em todos os estágios da carcinogênese, e o
tumor, por sua vez, pode iniciar, manter e subverter a inflamação em seu próprio
benefício (39).
4.3 Caquexia associada ao câncer
Acrescenta-se a caquexia ao cenário acima descrito. A caquexia é uma
complexa síndrome metabólica que acompanha diversas doenças crônicas,
como por exemplo, síndrome da imunodeficiência adquirida, doença pulmonar
obstrutiva crônica, insuficiência cardíaca crônica, entre outras, mas o seu estudo
é mais aprofundado no câncer (1,2,6,40).
A palavra caquexia deriva do grego “kakós” e “hexis” e significa “má
condição”, aludindo ao mau estado geral de saúde característico do paciente
com esta síndrome (4,41,42). A encarnação dessa doença é a figura de um paciente
profundamente emaciado, praticamente só “pele e osso”, conforme dito
popular(3). É conhecida há milênios, e Hipócrates (460–370 A. C.) fez uma
descrição muito vívida da caquexia quando escreveu que “a carne é consumida
e torna-se água... o abdome se enche de água, os pés e as pernas incham, os
ombros, as clavículas, o peito e as coxas desaparecem... essa doença é fatal”(43).
Até muito recentemente, a caquexia era considerada apenas um epifenômeno
do câncer (2,41).
A caquexia associada ao câncer caracteriza-se pela heterogeneidade de
manifestações clínicas, que variam de paciente para paciente (5) e vale ressaltar
que nem todos apresentam o espectro completo de sintomas (41). Os órgãos mais
afetados pela caquexia associada ao câncer são músculo esquelético, coração,
25
fígado, cérebro, tecido adiposo e sistema imunológico (2). O sinal/sintoma mais
aparente da caquexia é a progressiva, involuntária e rápida perda ponderal, pela
depleção de massa muscular esquelética e de tecido adiposo, a despeito de
ingestão alimentar adequada (5). Outros sinais e sintomas são: anorexia (perda
de apetite); anemia; náuseas; saciedade precoce; astenia (perda de força
muscular); fadiga; disgeusia (alterações no paladar) e distúrbios olfativos.
Profundas alterações no metabolismo de proteínas, carboidratos e lipídios, má
absorção intestinal, imunossupressão e inflamação sistêmica crônica de baixo
grau, também podem ser observadas na caquexia associada ao câncer (5,44).
Além de todos esses aspectos que impactam a saúde e a qualidade de
vida dos pacientes com caquexia associada ao câncer, não podemos nos
esquecer dos aspectos psicossociais dessa doença: em razão da abrupta perda
de massa corporal, os pacientes relatam uma imagem corporal alterada, que tem
efeito direto sobre o emocional, na atividade física, nas relações interpessoais e
na vida em sociedade (41).
Devido à ausência de definição diagnóstica que caracterizasse a CAC e
que auxiliasse os clínicos na sua detecção e tratamento precoce, Fearon
colaboradores, em um consenso internacional, a definiram como “uma síndrome
multifatorial caracterizada pela perda contínua de massa muscular (com ou sem
perda de massa adiposa), que não pode ser completamente revertida por
suporte nutricional e conduz ao comprometimento funcional progressivo. A
fisiopatologia é caracterizada pelo balanço proteico e energético negativo,
guiada por uma variável combinação de ingestão alimentar reduzida e
metabolismo anormal” (45).
Por estar associada a várias doenças crônicas, podemos considerar a
caquexia como um problema de saúde pública, pois ela preenche todos os
requisitos necessários: é frequente ou sua frequência é crescente na população;
aumenta morbidade e mortalidade, causa incapacidade e afeta a qualidade de
vida; está associada a condições econômicas desfavoráveis; aumenta os custos
de saúde; e carece de estratégias públicas de saúde efetivas (46).
A prevalência global da caquexia pode ser estimada em torno de 6,6
milhões de pessoas, provocando a morte de 1,5 a 2 milhões de pessoas por ano,
26
mas os dados epidemiológicos, principalmente em países muito pobres, são
escassos (47).
Seu aparecimento se correlaciona com um prognóstico desfavorável, uma
vez que reduz a tolerância aos tratamentos quimio/radioterápico e cirúrgico, a
resposta terapêutica, a capacidade funcional, a qualidade de vida e aumenta a
morbimortalidade (6,48).
A caquexia associada ao câncer foi dividida em três estágios, dependendo
da gravidade do quadro, em pré-caquexia, caquexia e caquexia refratária, como
esquematizado na Figura 1, com risco de progressão dependendo de fatores
como presença de inflamação sistêmica, baixa ingestão alimentar e falta de
resposta à terapia anticâncer (45,49).
Figura 1. Estágios da caquexia (segundo Fearon et al, 2011)(45).
Por vezes, a caquexia pode ser confundida com outras condições, como
desnutrição extrema, má absorção, hipertireoidismo, desidratação, sarcopenia
ou lipoatrofia associada à terapia antirretroviral. Por isso, a caquexia só pode ser
diagnosticada quando há perda de massa corporal involuntária ou baixo índice
de massa corporal (IMC < 20 kg/m2), e a presença de pelo menos 3 de das
seguintes 5 condições: diminuição da força muscular; fadiga; anorexia; baixo
índice de massa magra e bioquímica anormal – critérios propostos por Evans e
colaboradores em 2008, que permitem a inclusão dos pacientes em um dos três
estágios da caquexia, conforme sumarizado na Figura 2 (50,51).
27
Figura 2. Critérios diagnósticos da caquexia (traduzido de Evans et al, 2008)(51).
A caquexia associada ao câncer surge como uma resposta pró-
inflamatória à presença do tumor (7,52). Tan et al. (2011) propuseram 5 domínios
nos quais a inflamação cumpre um papel primordial na CAC: inflamação
sistêmica (produção de citocinas e proteínas de fase aguda); controle do
equilíbrio energético central (aumento do gasto energético em repouso em
alguns tipos de câncer); controle do metabolismo e função do músculo
esquelético (aumento da degradação ou diminuição da síntese proteica ou uma
combinação dos dois fenômenos); controle do metabolismo e função do tecido
adiposo (aumento da lipólise, diminuição da lipogênese, diminuição da
diferenciação de novos adipócitos); e modulação do apetite (anorexia,
depressão, alterações olfativas e gustativas) (52).
Então, a inflamação crônica contínua desempenha uma função importante
no início e manutenção da caquexia associada ao câncer, e atualmente é vista
como um denominador comum de muitas consequências clínicas e metabólicas
e também um importante preditor de prognóstico (53).
4.4 Tecido adiposo
O tecido adiposo tem origem embrionária na mesoderme (54). Do ponto de
vista histológico, pode ser dividido em duas partes: uma, composta
principalmente por adipócitos maduros e a outra, a fração vascular estromal
(FVE), que compreende células-tronco mesenquimais, pré-adipócitos, músculo
liso associado a vasos sanguíneos, células endoteliais, pericitos, fibroblastos e
células imunes infiltradas, como neutrófilos, monócitos/macrófagos, linfócitos T
e B, células dendríticas, mastócitos e células matadoras naturais (10–13,55). A
28
composição celular do tecido adiposo varia quanto ao depósito e ao estado
fisiológico ou patológico (56); também é adaptável e regida por estímulos como
dieta e massa corporal (13,14).
A função primária do tecido adiposo é o armazenamento de energia sob
a forma de triacilgliceróis, que são disponibilizados para outros tecidos em
períodos de escassez de energia (os adipócitos são as únicas células
especializadas nessa função) (57).
O tecido adiposo é classificado em branco e marrom (58). A presença de
cada um dos tipos de tecido adiposo varia de espécie para espécie, quanto ao
estágio de desenvolvimento e localização anatômica (59); diferem também quanto
à cor, tamanho e morfologia celular, funções biológicas e expressão gênica(54,60).
O tecido adiposo é diretamente controlado pelo sistema nervoso autônomo (58).
O tecido adiposo branco supre energia ao organismo durante o jejum,
fornece proteção mecânica e isolamento térmico, além de secretar substâncias
com as mais variadas funções biológicas. O adipócito branco apresenta uma
única gotícula lipídica, que preenche quase todo o citoplasma (61). O tecido
adiposo branco é inervado por fibras parassimpáticas, que modulam efeitos
anabólicos (lipogênese) nos adipócitos, promovendo a captação de ácidos
graxos mediada por insulina (58). Esse é o tecido mais abundante no organismo,
subdividido em depósitos subcutâneo e visceral; a distribuição varia conforme o
sexo e a idade (56,58,60). O tecido adiposo subcutâneo (TASC) localiza-se contínuo
à pele, no abdome e nas regiões femoral e glútea; há também depósitos intra e
perimusculares (59). O tecido adiposo visceral (TAV) é dividido em omental,
mesentérico, retroperitoneal e pericárdico e também circunda os rins e as
gônadas (60), geralmente considerado mais ativo e sensível à lipólise induzida por
catecolaminas, contribuindo mais do que o TASC para os níveis circulantes de
ácidos graxos livres; o TAV também exibe um número maior de macrófagos
infiltrantes do que o TASC (8,9,62,63). Diferentemente do TASC, cuja drenagem
venosa é sistêmica, o sangue do TAV drena diretamente para o fígado através
da veia porta, contribuindo com ácidos graxos livres, citocinas e adipocinas e
ativando a produção hepática de mediadores inflamatórios, como a Proteína C-
Reativa (64,65).
29
Até recentemente, pensava-se que o tecido adiposo branco era quase que
inerte, funcionando apenas como isolante térmico e reservatório de energia(57,66).
A descoberta da leptina em 1994 em camundongos elevou o tecido adiposo ao
status de maior órgão endócrino do organismo (59). Atualmente, é considerado
um órgão complexo e muito ativo, com funções endócrinas, metabólicas e
reguladoras do sistema imunológico (57,66).
Sob a vigência de inflamação sistêmica crônica observada na caquexia
associada ao câncer, como citado anteriormente, o metabolismo e a função do
tecido adiposo subcutâneo são prejudicados, o que se traduz em mudanças
morfológicas (redução do tamanho do adipócito, remodelamento da matriz
extracelular, fibrose, infiltração de macrófagos) e moleculares (aumento da
lipólise, expressão modificada de genes relacionados ao remodelamento da
matriz e à inflamação) (15,67).
4.5 Inflamação do tecido adiposo - contribuição para a caquexia
O tecido adiposo atua no cruzamento entre metabolismo e sistema
imunológico: por ser um órgão endócrino, é capaz de regular o sistema imune e
de ser regulado por ele e a sinalização entre esses dois compartimentos tem um
equilíbrio delicado (11,14,68,69). O tecido adiposo compartilha funções com o
sistema imune, como produção e liberação de mediadores inflamatórios e
ativação do sistema complemento (70). Esse tecido é caracterizado por hospedar
quase todos os tipos de células imunes associados (principalmente macrófagos),
que têm funções na organização celular, remoção de detritos e de adipócitos
mortos e na manutenção da homeostase (10). Os macrófagos são as principais
células da FVE do tecido adiposo e estão implicados na promoção da
inflamação(66).
Mudanças rápidas ou extremas na composição de gordura corporal
provocam uma resposta do sistema imunológico, ativando a inflamação (10,58,71).
Nesse caso, a inflamação disparada não é a clássica (inflamação aguda),
caracterizada pelos seus 5 sinais cardeais (dor, rubor, calor, tumor e perda de
função) (70,72), mas sim o que se chama atualmente de metainflamação,
parainflamação ou, mais comumente, inflamação crônica subclínica ou de baixo
30
grau, intermediária entre o estado homeostático basal e a inflamação
clássica(70,73–75); como exemplos, podemos citar a obesidade e a caquexia.
A obesidade resulta do desequilíbrio entre ingestão calórica aumentada e
gasto energético reduzido; caracteriza-se pela hipertrofia e hiperplasia do tecido
adiposo e resistência à ação da insulina e está envolvida no desenvolvimento de
outras doenças, como diabetes tipo II, doenças cardiovasculares e alguns tipos
de câncer (58,71,76). O elo entre tecido adiposo e inflamação foi estabelecido
quando descreveu-se que o tecido adiposo de camundongos obesos expressava
o RNA mensageiro para a citocina inflamatória TNF-α (tumor necrosis factor
alpha, fator de necrose tumoral alfa) (77), descoberta que confirmou a função do
tecido adiposo no desenvolvimento da resistência à insulina e estabeleceu o
dogma de que a obesidade é uma condição crônica de inflamação de baixo
grau(58,71), que pode ser monitorada através de marcadores celulares
sanguíneos (como leucócitos totais, monócitos, etc.), mediadores inflamatórios
(citocinas, como TNF-α, interleucina 6 (IL-6) e interleucina 1 (IL-1), quimiocinas
e proteínas de fase aguda (proteína C reativa, fibrinogênio) (78).
Situada no extremo oposto do espectro energético, a caquexia apresenta
uma característica comum à obesidade: a inflamação sistêmica crônica de baixo
grau (16). O desenvolvimento e manutenção da caquexia associada ao câncer
ocorre porque também há um desequilíbrio energético, com ingestão calórica
diminuída e gasto energético aumentado, mesmo em repouso, combinados com
metabolismo anormal (17).
O paciente com caquexia associada ao câncer experimenta várias
disfunções metabólicas, como por exemplo: alterações no metabolismo lipídico
(hiperlipidemia, níveis circulantes reduzidos de HDL (High Density Lipoprotein;
Lipoproteína de alta densidade) e aumentados de LDL (Low Density Lipoprotein;
proteína de baixa densidade)); alterações no metabolismo de carboidratos, com
tolerância à glicose prejudicada, resistência à insulina, aumento da
gliconeogênese de aminoácidos e lactato (utilização de ciclos fúteis de consumo
de energia, como o Ciclo de Cori); e alterações no metabolismo proteico
(aumento da degradação e diminuição da síntese de proteínas) (7).
Sob circunstâncias fisiológicas normais, o tecido adiposo secreta
inúmeras substâncias que regulam processos biológicos; mas, sob um estado
31
inflamatório, o crescente influxo de células do sistema imune amplia ainda mais
essa resposta inflamatória. O microambiente tumoral, que tem células imunes
infiltradas, também secreta sua cota de citocinas, contribuindo para esse ciclo
vicioso (18,57,62,66). A inflamação crônica é uma das marcas do câncer e da
caquexia, e o tecido adiposo é considerado uma vítima e, ao mesmo tempo, um
contribuinte para a inflamação sistêmica crônica por colaborar, de forma direta,
na liberação de fatores inflamatórios (79–81), principalmente da “tríade
inflamatória” de citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-1β) (76).
A perda de tecido adiposo subcutâneo é considerada como um fator
prognóstico ruim, e Ebadi e colaboradores demonstraram que pacientes com
câncer com adiposidade subcutânea menor apresentaram maior risco de
mortalidade (65). Durante a progressão da caquexia associada ao câncer, o tecido
adiposo branco subcutâneo é um dos primeiros a ser afetado (61,82), mas pouco
se sabe acerca dos mecanismos inflamatórios que ocasionam a depleção da
massa adiposa, porque a maioria dos estudos sobre a CAC se concentra na
perda de massa musculoesquelética (83).
Analisando o tecido adiposo visceral peritumoral, Neto e outros (84)
detectaram níveis maiores das proteínas NF-𝜅B e TNF-𝛂 nesse tecido em
pacientes caquéticos, o que pode contribuir para o desenvolvimento da caquexia
e progressão tumoral.
Neves e colaboradores demonstraram, pela primeira vez, que a via do
inflamassoma pode estar envolvida na inflamação do tecido adiposo presente na
CAC em um modelo murino de caquexia associada ao câncer (26). Estudos tem
revelado que o inflamassoma NLRP3 está envolvido na patogênese de diversas
doenças inflamatórias e também no câncer (23,25,85), como melanoma e tumores
gástrico e colorretal (23).
4.6 Os Receptores de Reconhecimento de Padrões e os inflamassomas
O sistema imune inato sempre foi visto como a primeira linha de defesa
dos organismos, que remonta talvez ao primeiro vertebrado ancestral (86) e é
ativado por estresse, patógenos e danos teciduais por meio de receptores de
reconhecimento de padrões (PRRs, pattern recognition receptors) (20,87), através
32
dos quais ocorre a distinção entre o próprio (hospedeiro) e o não-próprio (micro-
organismos e dano tecidual). A literatura recente sugere que o sistema imune
inato funciona como um sistema que detecta sinais de perigo, como patógenos
ou sinais celulares de estresse, sem, no entanto, responder às moléculas
normais do hospedeiro, antígenos da dieta e microbiota intestinal (88). Esses
PRRs reconhecem padrões associados a patógenos (PAMPs, Pathogen-
associated molecular patterns) ou a danos (DAMPs, Damage-associated
molecular patterns), expressos na membrana plasmática ou endossômica ou no
citoplasma de células imunes (p. ex., macrófagos e neutrófilos) e de outros tipos
celulares. PAMPs são fatores produzidos por micro-organismos (por exemplo,
RNA dupla fita, lipídios, carboidratos e proteínas, etc.) e DAMPs são moléculas
produzidas ou liberadas por células do hospedeiro mortas ou danificadas (89,90).
Os PRRs estão envolvidos na ativação de vias de transdução de sinais de
genes que coordenam as respostas imunológicas. Existem 5 tipos de PRRs: 1)
Receptores tipo Toll (TLR, Toll-Like receptors), proteínas transmembrana que
reconhecem ligantes extracelulares ou presentes em endossomos; esta família
de receptores foram os primeiros PRRs identificados; 2) Receptor de Lectina
Tipo C (CLR, C-type lectin receptor), receptores associados à membrana que
reconhecem peptídeos e polissacarídeos; 3) RLR (RIG (Retinoic acid-inducible
gene)-I-like receptor), helicases que detectam vírus; 4) ALR (AIM2 (Absent in
melanoma)-like receptor), receptores citoplasmáticos que se ligam a DNA dupla
fita; 5) NLR (NOD (Nucleotide-binding, and oligomerization domain)-like
receptor), proteínas intracitoplasmáticas. O reconhecimento de ligantes pelos
PRRs induz a alterações conformacionais dos domínios dos receptores,
iniciando uma cascata de sinalização que dispara a resposta imunológica, com
consequente produção citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e outras
moléculas. Em humanos, a família de receptores NLR é composta por 22
membros, que são classificados em subfamílias dependendo do domínio efetor
N-terminal, e expressos principalmente em células imunes, mas também podem
ser encontrados em células não imunes, com funções de reconhecer sinais de
perigo, ativar vias inflamatórias para combatê-los, o que induz a produção de
citocinas e de quimiocinas e a formação do inflamassoma (22,89–94).
33
A palavra inflamassoma é formada pela união da palavra inflamação –
refletindo a função – e do sufixo grego -soma (corpo), utilizado na biologia para
indicar complexos moleculares. O termo inflamassoma foi criado por Tschopp e
colaboradores em 2002 para descrever complexos multiproteicos, capazes
reconhecer diversos sinais de perigo exógenos e endógenos, que ativam
resposta imune inata, inflamação ou dano tecidual ou morte celular induzida por
inflamação. Sua montagem ativa caspase-1, o que, consequentemente, estimula
a maturação das citocinas IL-1β e IL-18 (19,21,87).
Por formarem complexos multiproteicos, uma subfamília de receptores
NLRs se destaca, os NLRPs (também chamados de NALP). Esta subfamília é
constituída por 14 membros (NLRP1-14) descritos em humanos, mas apenas
NLRP1, NLRP3, NLRP6, NLRP7 e NLRP12 podem se associar a outras
proteínas para formar os seus respectivos inflamassomas; as outras proteínas
parecem exercer funções sobre a reprodução (87,91,94). Tipicamente, as proteínas
da família NLR apresentam um domínio de repetição rica em leucina C-terminal
(envolvido no reconhecimento de padrões moleculares), um domínio central
(responsável pela ligação entre as proteínas e pela ativação das NLRs) e um
efetor N-terminal, que faz a interação proteína-proteína com moléculas
adaptadoras. A ativação de uma proteína NLR culmina na transcrição de genes
através da via do fator nuclear kappa B (NF-κB, Nuclear Factor kappa B) e na
produção e secreção de citocinas (95).
4.7 Inflamassoma NLRP3
NLRP3 (NLR Family, Pyrin domain containing Protein 3), também
conhecida como criopirina ou NALP3 (20), induz inflamação e piroptose (morte
celular dependente da ativação de caspases inflamatórias), em resposta a vários
sinais de perigo(23,96).
O inflamassoma NLRP3 é ativado por diversos DAMPs e PAMPs,
conforme listado na Tabela 1 (25,85,87,89,97), mas estudiosos da área acreditam que
é mais provável que o inflamassoma NLRP3 responda a um evento celular
comum disparado por esses ativadores. Muitos mecanismos já foram propostos
(liberação de DNA mitocondrial, disfunção mitocondrial, produção de espécies
34
reativas de oxigênio, desestabilização lisossomal, mudanças na concentração
intracelular de cálcio, formação de poros na membrana, efluxo de potássio), mas
ainda não se chegou a esse tal evento celular comum (21).
Tabela 2. Substâncias ativadoras de NLRP3 (Schroder & Tschopp, 2010) (88).
O inflamassoma NLRP3 é o mais estudado, desde que mutações de
ganho de função no gene nlrp3 foram implicadas com síndromes
autoinflamatórias, conhecidas em conjunto como CAPS (Síndromes Periódicas
associadas à Criopirina), de caráter autossômico dominante e gravidade
crescente: a síndrome autoinflamatória familiar associada ao frio (Familial Cold
Auto-inflammatory Syndrome, FCAS), a síndrome de Muckle-Wells (MWS) e a
doença inflamatória multissistêmica de início neonatal (Neonatal-onset
multisystem inflammation disease, NOMID – também conhecida como CINCA,
chronic infantile neurological cutaneous and articular syndrome – síndrome
neurológica cutânea e articular crônica infantil). Todas essas síndromes
apresentam sintomas em comum: febres recorrentes, lesões semelhantes à
urticaria, dores articulares e ausência de autoanticorpos e células T antígeno-
especificas, pela ativação aberrante do inflamassoma NLRP3 (24).
Ativadores de NLRP3 PAMPs
Vírus Influenza Adenovírus Vírus Sendai Vírus da encefalomiocardite Candida albicans Saccharomices cerevisae Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Neisseria gonorhoeae Toxinas bacterianas formadoras de poros
DAMPs ATP extracelular Hialuronana Peptídeo β amiloide Glicose extracelular elevada Cristais de urato monossódico Cristais de ácido úrico Cristais de colesterol Irritantes da pele: cloreto de trinitrofenil, trinitroclorobenzeno, dinitrofluorobenzeno Compostos da imidazoquilina Irritantes ambientais: sílica, asbesto Adjuvante de vacinas alum (hidróxido de alumínio)
35
4.8 Elementos do inflamassoma e mecanismos de ativação
Os mecanismos exatos de montagem do inflamassoma NLRP3 ainda não
foram completamente desvendados, mas sabe-se que a sua ativação requer ao
menos 2 sinais. O primeiro estímulo inclui sinalização de receptores (como
ligantes para TLRs (Toll like receptors, receptores tipo Toll), principalmente
TLR4, mas também para NLRs, IL-1R1, TNFR1 e TNFR2) que culmina na
ativação da via NF-κB, essencial para induzir a transcrição de IL-1β e NLRP3 no
núcleo (20,98). O segundo sinal de ativação de NLRP3 é dado por diversos
agonistas (Tabela 1), com a consequente montagem do inflamassoma e ativação
de caspase-1 (Figura 3) (20,98).
Figura 3. Esquema simplificado da via do inflamassoma NLRP3.
O TLR4 é o principal sensor e receptor transmembrana para
lipopolissacarídeo (LPS) provenientes de microrganismos (99,100). O LPS é um
elemento constituinte da membrana externa de bactérias Gram negativas (101). O
36
TLR4 também pode ser ativado por ácidos graxos saturados(25) e sua
estimulação leva a ativação de fatores de transcrição como NF-𝜅B(100).
Por sua vez, NF-𝜅B é uma família de cinco subunidades de fatores
transcricionais, que são ativados por via canônica (que atua na inflamação) e
não-canônica (que regula diversas funções imunológicas), respondendo a
diferentes tipos de receptores e seus ligantes. Controlam a expressão de
diversos genes envolvidos na inflamação, imunidade, sobrevivência celular,
proliferação e diferenciação. NF-𝜅B funcional é formado por dímeros (homo ou
heterodímeros), que, dependendo dos componentes, funcionam como
repressores ou ativadores da transcrição gênica; os dímeros de NF-𝜅B mais
abundantes são p65-p50 (22,82,100,102–105).
As caspases (cysteine-aspartic acid proteases) são proteases cuja função
mais conhecida é a regulação da apoptose; mas há membros dessa família de
proteínas que são conhecidas como caspases inflamatórias pelo seu
envolvimento no processamento e ativação de citocinas, como a caspase-1. A
caspase-1, também conhecida como ICE (IL-1β converting enzyme), é
sintetizada como um zimógeno (precursor inativo) (106,107) e sua ativação
depende do seu recrutamento ao inflamassoma. A formação desse complexo
multiproteico ocorre após a detecção de sinais de perigo exógenos ou
endógenos pelo NLR (97,108). O inflamassoma NLRP3 ativo consiste na interação
da proteína NLRP3, da proteína adaptadora ASC (também conhecida como
PYCARD) e da pró-proteína caspase-1 (85). O recrutamento da pró-caspase-1 ao
inflamassoma desencadeia a sua clivagem, transformando-a em caspase-1, sua
forma ativa. A ativação da caspase-1 é um pré-requisito para a clivagem de pró-
IL-1β e pró-IL-18, levando à maturação dessas citocinas, convertendo-as em
suas formas biologicamente ativas (19,25,87,97).
A via não-canônica do inflamassoma NLRP3 requer a participação das
caspases-4/5 para sua ativação. Essas caspases inflamatórias detectam LPS de
bactérias Gram negativas (p. ex., Escherichia coli, Vibrio cholerae, etc.) no
citoplasma e promovem a ativação do inflamassoma NLRP3 e,
consequentemente, a ativação e secreção de IL-1β e IL-18 (109).
Neste contexto de ativação do inflamassoma NLRP3, vale a pena
destacar a participação da proteína CD36 (também conhecido como translocase
37
de ácido graxo) neste processo. A CD36 não faz parte diretamente da via do
inflamassoma NLRP3, mas é uma molécula importante na sua sinalização,
através da interação com TLR4 (110). A CD36 é uma glicoproteína integral de
membrana, que está expressa na maioria das células, principalmente daquelas
envolvidas na homeostase da glicose, como por exemplo, adipócitos e células
do músculo esquelético, facilitando a captação de ácidos graxos de cadeia longa
e de lipoproteínas aniônicas ou oxidadas (111,112). Pode estar presente no soro
(forma solúvel), em endossomos, no retículo endoplasmático e na
mitocôndria(112). CD36 exerce funções na homeostase lipídica, angiogênese,
resposta imunológica e metástase, entre outras (112). Ao se analisar
camundongos knock-out para o gene CD36, observou-se níveis séricos elevados
de colesterol total, ácidos graxos livres e triacilglicerol e glicose mais baixa,
quando comparados aos animais do tipo selvagem, revelando a função de CD36
no metabolismo de lipídios (113). Em um outro estudo, a internalização de LDL
oxidada mediada por CD36 em macrófagos de camundongos levou à ruptura da
membrana e ativação do inflamassoma NLRP3(110). Em humanos, polimorfismos
no gene foram associados à síndrome metabólica e obesidade (111).
4.9 Funções no processamento e liberação de citocinas
Assim, conforme discutido anteriormente, além de estar envolvido na
maturação de citocinas, o inflamassoma NLRP3 regula um tipo de morte celular
inflamatória chamada piroptose, que pode ser capase-1 dependente ou
independente e é caracterizada pelo aumento da célula (inchaço), lise e
liberação do conteúdo citoplasmático (114).
A ativação e montagem dos componentes do inflamassoma leva à
ativação da caspase-1 e processamento das citocinas IL-1β e IL-18. As citocinas
são os mediadores solúveis da resposta imune, principalmente da
inflamação(115). Onze membros da superfamília IL-1 foram identificados e há 4
membros bem estudados: três agonistas, IL-1α, IL-1β e IL-18, e um antagonista,
IL-1ra (específico para IL-1α e β), que são codificados por genes localizados no
braço longo do cromossomo 2 (os genes para IL-18 e seu antagonista estão
localizados no cromossomo 11) (108,116–118). Todos os membros estão envolvidos
38
na imunidade inata; alguns são sintetizados como proteínas precursoras que
necessitam serem processadas por proteases para se tornarem biologicamente
ativas. Outra característica importante dessa família de proteínas é que, com
exceção de IL-1ra, todos as outras não possuem sequência sinal (leaderless
cytokines) e, por isso, não são secretadas pela via de secreção clássica de
proteínas (via Retículo endoplasmático – Complexo de Golgi). O mecanismo
exato de secreção ainda não foi desvendado, e muitos modelos para isso foram
propostos, como secreção via vesículas (lisossomos secretórios, microvesículas
ou exossomos) (119).
A citocina IL-1β é secretada por células hematopoiéticas, principalmente
monócitos e macrófagos teciduais, células dendríticas da pele, micróglia e outros
tipos celulares como uma pró-proteína em resposta à ativação de TLR,
componentes do sistema complemento ou outras citocinas (como TNF-α e IL-6).
Conhecida inicialmente como fator ativador de linfócitos, foi descrita em 1974
como um pirógeno endógeno (indutor de febre, que resulta da ação de IL-1β no
hipotálamo anterior); é a mais potente citocina pró-inflamatória (19,118,120–122),
regulando respostas a infecção, dano ou desafio imunológico, provocando febre,
ativando linfócitos e promovendo a migração de leucócitos aos sítios de infecção
ou dano (123). IL-1β induz a transcrição de fatores de transcrição, como NF-κB(118),
sendo considerado um importante mediador de muitas doenças
inflamatórias(89,97,118). A síntese de IL-1β é realizada em 2 etapas: a primeira
etapa consiste na transcrição de um precursor inativo de IL-1β (pró-IL-1β), com
peso molecular de 31 quilodáltons (KDa) (90,108,116,120). Na segunda etapa ocorre
o processamento de pró-IL-1β pela caspase-1, presente no inflamassoma,
tornando-se a proteína funcional de 17 KDa (116,120).
A citocina IL-18, descrita primeiramente como um fator indutor de
interferon gama (IFN-γ), é estruturalmente relacionada com IL-1β. Assim como
IL-1β, IL-18 também é transcrita como um precursor inativo de 24 KDa em
monócitos/macrófagos e requer processamento por caspase-1. Medeia a
interação entre fagócitos, células apresentadoras de antígenos e linfócitos e
também induz a secreção de IFN-γ (120,124) por células T ativadas e células
Matadoras naturais na presença de IL-12, contribuindo para a polarização de
39
células Th1 (células T helper, ou auxiliadoras); promove a secreção de citocinas
(IL-4, IL-5 e IL-10) por células T auxiliadoras tipo 2 (123).
IL-1β e IL-18 têm sido implicadas em vários tipos de câncer – a expressão
de IL-1β no estômago levaria a inflamação e tumorigênese, enquanto diminuição
na expressão de IL-18 resultaria em perda da integridade da barreira intestinal,
invasão de bactérias comensais e início de inflamação crônica no intestino (125).
4.10 Inflamassoma versus câncer
Como qualquer membro do sistema imunológico, quer seja inato ou
adaptativo, o inflamassoma e seus componentes comportam-se como agentes
duplos, atacando e protegendo, ou seja, induzem a inflamação e são essenciais
para manter a homeostase tecidual. Suas funções ainda não são totalmente
compreendidas, a maioria das evidências vem de estudos com modelos
experimentais e há muitas contradições a serem esclarecidas. Algumas dessas
discrepâncias podem existir devido a diferenças metodológicas e nas variáveis
analisadas.
Entre os sensores de perigo intracelulares, o inflamassoma NLRP3 é o
mais versátil deles, pois é capaz de detectar uma miríade de sinais. Estudos
experimentais em animais tem ligado a ativação do inflamassoma NLRP3 a
doenças inflamatórias intestinais (126,127). Em animais knock-out para o gene IL-
10, a ausência dessa molécula levou à ativação ininterrupta do inflamassoma,
devido ao constante estímulo de microrganismos, causando colite crônica (127).
Animais knock-out para o gene nlrp3 exibiram uma maior perda de massa
corporal (128). A sinalização do inflamassoma no câncer depende de uma
combinação de fatores genéticos e ambientais que podem afetar a expressão
gênica e os mecanismos pós-transcricionais (129). A síntese de ácidos graxos
podem promover as etapas iniciais da ativação do inflamassoma, através da
transcrição dos genes nlrp3 e il-1b (101). Estudos sobre polimorfismos de
nucleotídeo único no gene nlrp3 demonstraram suscetibilidade à doença de
Crohn, fator de risco para câncer colorretal (CCR) (129), sugerindo que uma
resposta imune inata defeituosa prejudica a remoção de antígenos e patógenos,
levando ao desenvolvimento da doença (130). Altos níveis de expressão de
40
NLRP3 se correlacionou com tumores avançados, ocorrência de metástases,
invasão vascular e linfonodal em pacientes com CCR(131).
Animais deficientes nos genes nlrp3 e caspase-1 apresentavam forte
resposta inflamatória e destruição da barreira epitelial, com consequente
displasia, tumorigênese e maior carga tumoral no colón (132,133). Animais nulos
para o gene caspase-1 em modelo de colite crônica apresentaram perda de
massa corporal superior a 20% da massa inicial, drástico encurtamento do cólon
e sinais de injúria epitelial mais severas do que os animais-controle, indicando
que a caspase-1 é necessária para a regeneração e reparo tecidual após
dano(134).
Concentração elevada das citocinas IL-1β e IL-18 é observada em
pacientes com doença de Crohn (135). A expressão desregulada de IL-1β foi
associada à inflamação da mucosa intestinal em pacientes com doenças
inflamatórias intestinais (DII), in vitro e em modelos animais, por ser capaz de
promover a transição epitelial-mesenquimal em células intestinais (126,136), com
perda de expressão de e-caderina, contribuindo, assim, para a invasão,
crescimento e capacidade de metatastizar células tumorais (136). Pacientes
com tumores estadio II que apresentaram polimorfismos para o gene IL-1β
tinham maior risco de recidiva de CCR (137).
A citocina IL-18 é expressa constitutivamente em alguns tecidos, como no
intestino, onde assegura a produção da barreira intestinal e a manutenção de
uma microbiota saudável (101). Expressão gênica e circulante de IL-18 aumentam
em cânceres gastrintestinais, com dupla atividade no CCR: em estágios iniciais,
promove a proteção por reparo tecidual, pela regulação negativa da proteína de
ligação a IL-22 (IL-22BP); IL-22BP controla a atividade biológica de IL-22, que
protege as células intestinas de danos durante a inflamação; e posteriormente,
IL-18 atua estimulando o crescimento tumoral e invasão celular (126,138).
Todos estes estudos em conjunto sugerem que uma sinalização
apropriada do inflamassoma NLRP3 contribui para a homeostase intestinal (25).
À luz destes achados, observando a contribuição do tecido adiposo em
diversos processos biológicos, principalmente para a inflamação existente na
caquexia associada ao câncer (CAC) e tendo em vista o importante papel que a
via do inflamassoma NLRP3 exerceu no modelo animal de CAC, interessou-nos
41
investigar e compreender melhor a ação da via do inflamassoma NLRP3 em dois
depósitos de tecido adiposo de pacientes com tumores colorretais com caquexia
oncológica.
42
5. MÉTODOS
5.1 Aprovação ética
Este projeto de pesquisa foi aprovado pelas Comissões de Ética em
Pesquisa (CEP), de acordo com a Declaração de Helsinki e registrado na base
virtual de registro de pesquisas envolvendo seres humanos (Plataforma Brasil):
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CEP-FM/USP – CAAE
no. 54503716.1.0000.0065 e parecer consubstanciado no. 1.587.210 - Anexo 1),
do Hospital Universitário da USP (CEP-HU/USP – CAAE no.
54503716.1.3001.0076 e parecer consubstanciado no. 1.595.719 - Anexo 2) e
do Instituto de Ciências Biomédicas (CEP-ICB/USP – CAAE no.
54503716.1.3002.5467 e parecer consubstanciado no. 1.686.559 - Anexo 3).
Todos os voluntários da pesquisa assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE – Anexo 4) previamente às cirurgias a que seriam
submetidos.
5.2 Recrutamento de pacientes
Os voluntários foram convidados a participar da pesquisa por médicos
especialistas em cirurgia oncológica no ambulatório da Clínica Cirúrgica do
Hospital Universitário da USP (HU-USP).
Após a leitura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE –
Anexo 4) e de sua assinatura, as medidas antropométricas dos pacientes foram
aferidas (peso e altura).
5.3 Critérios de inclusão
Os critérios de inclusão foram: ambos os sexos, com idade entre 18-85
anos, sem distinção de classe social e etnia, com diagnóstico de tumor maligno
no intestino com indicação à cirurgia, ou com indicação cirúrgica para correção
de hérnias da parede abdominal (umbilical e inguinal), colecistectomias
43
videolaparoscópicas e proctoplexia abdominal, e boa vontade em participar do
estudo.
O diagnóstico do câncer ou hérnias/colecistectomias/proctoplexia
abdominal foi realizado pelo médico cirurgião responsável, através da realização
exames físicos, laboratoriais, endoscópico e de imagens (Tomografia
Computadorizada e/ou Ressonância Magnética).
5.4 Critérios de exclusão
Os critérios de exclusão utilizados foram: ter recebido antibioticoterapia
no intervalo que antecedeu a cirurgia; ter feito terapia anti-inflamatória contínua;
ter feito tratamento quimio e radioterápico no último ano ou no momento do
projeto; ter feito uso crônico de corticoides; ter recebido transfusão sanguínea no
período próximo às coletas. As patologias de exclusão foram: baixo peso
extremo ou obesidade (IMC <18 e >30 kg/m², respectivamente); diabetes
descompensada; insuficiência cardíaca crônica; insuficiência ou falência
hepática ou renal; doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); síndrome da
imunodeficiência adquirida (SIDA); doenças inflamatórias do intestino (DII);
hepatites; doença de Chagas; doenças da tireoide não controladas; distúrbios
autoimunes.
5.5 Critérios diagnósticos da caquexia
Para o diagnóstico da caquexia, foram adotados os critérios propostos por
Evans et al (2008) (51):
- Variação na massa corporal – perda ponderal involuntária nos últimos 6 a 12
meses (maior ou igual a 5% da massa corporal inicial), ou
- Índice de massa corporal (IMC) menor que 20 kg/m² para pacientes com menos
de 65 anos e menor que 22 kg/m² para pacientes com idade igual ou maior que
65 anos e pelo menos mais 3 dos seguintes critérios:
§ Diminuição da força muscular;
§ Fadiga;
44
§ Anorexia;
§ Baixo índice de massa corporal livre de gordura;
§ Parâmetros bioquímicos alterados:
§ Evidência de inflamação (concentração plasmática de Proteína C
Reativa (PCR) >5 mg/l);
§ Anemia (Hb <12 g/dl);
§ Concentração sérica de albumina < 3,5 g/dl.
Para classificação dos pacientes, utilizamos uma Planilha Excel® (Figura
4), elaborada pelo Dr. Rodolfo Gonzalez Camargo a partir dos critérios propostos
por Evans e outros (51):
Figura 4. Ferramenta utilizada para a classificação dos pacientes.
Os pacientes foram entrevistados no dia anterior à cirurgia. Foram
utilizados questionários EORTC-QLQ-C30 (European Organisation for Research
and Treatment of Cancer – Quality of Life Questionnaire Core 30), FAACT-A/CS
(Functional Assessment of Anorexia/Cachexia Therapy – The European Society
for Clinical Nutrition and Metabolism), e as escalas de Karnofsky e de Zubrod
(ECOG) e a Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão (Anexos 5 – 8). O
questionário EORTC-QLQ-C30 é um instrumento utilizado para avaliar o impacto
da doença e o comprometimento causado nas atividades diárias do paciente com
45
câncer. Este questionário possui 30 itens, subdivididos em: escalas funcionais
(física, cognitiva, emocional, social e desempenho de tarefas diárias), escalas de
sintomas (fadiga, dor, náuseas e vômitos), escala de qualidade de vida e saúde
global e outras questões que avaliam sintomas comumente relatados por
pacientes com câncer (dispneia, anorexia, insônia, constipação e diarreia), além
de uma escala de avaliação do impacto financeiro do tratamento e da doença. O
questionário FAACT-A/CS utiliza escalas que que avaliam o grau de anorexia; o
resultado é a média das respostas. As escalas de Karnofsky e de Zubrod avaliam
a capacidade funcional; a escala de Karnofsky possui níveis crescentes de
atividade e independência, com valores variando de 0 a 100 e a de Zubrod tem
escores de 0 (paciente completamente ativo) a 4 (paciente preso ao leito). A
Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão é utilizada para identificar sintomas
em ambiente hospitalar.
Após utilização dessas ferramentas para classificação, os pacientes foram
divididos nos seguintes grupos (Figura 5):
§ CTL (Controle): grupo de pacientes submetidos à cirurgia para retirada de
hérnias da parede abdominal (umbilical e inguinal) ou submetidos à
colecistectomias;
§ WSC (do inglês Weight stable Cancer): grupo de pacientes com câncer
colorretal sem caquexia; e
§ CC (do inglês Cancer Cachexia): grupo de pacientes com câncer
colorretal com caquexia.
46
Figura 5. Caracterização dos grupos.
O índice de massa corporal (IMC) foi obtido dividindo-se a massa pela
estatura ao quadrado. A variação (D) de massa corporal foi obtida pela subtração
entre peso no momento da inclusão no projeto e o peso anterior, em
quilogramas.
O estadiamento, realizado por médicos patologistas, avalia o grau de
disseminação tumoral. Os diferentes estadios refletem a taxa de crescimento, a
extensão da doença e a relação com o hospedeiro e são determinados segundo
o sistema TNM (Tumor – Linfonodo – Metástase), preconizado pela UICC (Union
for International Cancer Control) e pelo Instituto Nacional do Câncer José Alencar
Gomes da Silva (INCA).
5.6 Coleta de sangue
Foram coletados aproximadamente 8 mL de sangue, previamente à
cirurgia, por um profissional habilitado (enfermeiro ou anestesiologista), em dois
tubos diferentes: um tubo com anticoagulante (BD Vacutainer® EDTA), para
separação do plasma sanguíneo; e um tubo seco (BD Vacutainer® SST® II
Advance), para obtenção do soro. O sangue foi centrifugado a 3000 rpm por 15
minutos a 4ºC. O soro e o plasma foram acondicionados em microtubos e
estocados a -80ºC para análise posterior.
47
5.7 Obtenção de tecido adiposo
Os pacientes foram submetidos à cirurgia, durante a qual ocorreram as
coletas de amostras de tecido. A participação no projeto de pesquisa não
provocou nenhuma modificação na conduta do procedimento cirúrgico e não
acrescentou nenhum incômodo aos pacientes.
Durante o procedimento cirúrgico, os pacientes foram mantidos em
decúbito dorsal sobre a mesa cirúrgica; os sinais vitais eram acompanhados por
um médico anestesiologista, que também aplicou anestesia geral ou peridural,
dependendo da indicação para cada paciente. Foi realizada incisão na pele e
retirado um fragmento de aproximadamente 1g tecido adiposo subcutâneo
(TASC) pelo cirurgião com o auxílio de bisturi e pinça, com tempo total entre
coleta e armazenamento inferior a 5 minutos. Já o tecido adiposo peritumoral
(TAPT) era retirado da peça cirúrgica (tumor), assim que liberada pelo cirurgião,
do tecido adiposo mesentérico (aproximadamente 1g) imediatamente próximo
ao tumor. Ainda no centro cirúrgico, os fragmentos colocados em tubo contendo
PBS (solução fosfato salina) e imediatamente acondicionados em gelo comum,
para posterior transporte ao laboratório.
5.7.1 Processamento das amostras (lipectomia)
O processamento dos tecidos adiposos subcutâneo e peritumoral foram
realizados como descrito por Hauner e colaboradores (139). As amostras foram
mantidas a 4°C em PBS estéril, com pH a 7.4, e imediatamente transferidas ao
laboratório. As amostras foram lavadas várias vezes em PBS até remover todo
o sangue. O material fibroso e vasos sanguíneos visíveis foram dissecados e
descartados. O tecido remanescente foi dividido em 2; os fragmentos eram então
pesados em balança de precisão e posteriormente cortados em pedaços
pequenos (10-20 mg).
5.7.2 Cultivo celular
48
Os explantes de tecido adiposo (subcutâneo e peritumoral, quando
disponível) foram distribuídos em placas de cultura de 12 poços, com
aproximadamente 500 mg por poço e incubados em DMEM (Dulbecco’s Modified
Eagle Medium) contendo 10% soro fetal bovino (SFB), suplementado ou não
com lipopolissacarídeo (LPS, de Escherichia coli sorotipo O55:B55, SIGMA®,
número do produto L2880) (1 µg/ml), em atmosfera umidificada de 10% de CO2
a 37°C por 24h (140,141). O poço sem estímulo recebia 500 µl de DMEM, e o poço
com estímulo recebia 490 µl de DMEM e 10 µl de LPS.
Figura 6. Esquema dos poços de cultura contendo os tecidos, com e sem estímulo por LPS por 24h.
Após incubação por 24 horas, o meio de cultura foi coletado para
quantificação de IL-1β, IL-18 e caspase-1, e os explantes foram lavados com
DMEM e congelados a -80°C até a extração de RNA.
5.8 Experimentos
5.8.1 Análises bioquímicas
As concentrações séricas de glicose (Glicose HK liquiform, referência do
produto 133), triglicérides (Triglicérides liquiform, ref. prod. 87), colesterol total,
lipoproteína de alta densidade (HDLc, HDL LE, ref. prod. 98), lipoproteína de
baixa densidade (LDLc, LDL liquiform, ref. prod.), albumina (Albumina, ref. prod.
49
19), proteína C Reativa (PCR Ultra Turbiquest Plus, ref. prod. 335) e
hemoglobina no sangue total foram quantificadas utilizando-se os kits comerciais
da empresa Labtest Diagnóstica no equipamento LabMax 240 (Labtest
Diagnóstica). Estas análises foram realizadas no Laboratório da Professora Dra.
Silvia Cozzolino, sob a supervisão dos técnicos José Alexandre Pimentel e Ivanir
Santana de Oliveira Pires, no Departamento de Alimentos e Nutrição
Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF/USP).
5.8.2 Análise da expressão gênica
- Extração do RNA total e quantificação
O RNA total do TASC foi extraído a partir de alíquotas de
aproximadamente 300 mg de tecido congelado, utilizando 1 ml do reagente
Trizol™ (Invitrogen). Para a homogeneização da amostra com o reagente,
utilizamos homogeneizador elétrico tipo Polytron (Uniscience do Brasil) na
velocidade máxima, por cerca 90 segundos. A velocidade elevada foi utilizada
para dissociar e romper as células. Entre a homogeneização de diferentes
amostras, o homogeneizador foi lavado com álcool 70% e água ultrapura.
Durante todo o processo de homogeneização, os tubos contendo as amostras
foram mantidos no gelo, no intuito de reduzir a atividade de enzimas proteolíticas.
Em seguida, foram realizadas lavagens sequenciais com álcoois (clorofórmio,
isopropanol e etanol) e centrifugações das amostras para extração e
precipitação do RNA. O precipitado (pellet) foi diluído em 20 µl de água livre de
RNase (água DEPC inativa).
As concentrações de RNA foram determinadas medindo-se a absorbância
em comprimentos de onda de 260nm/280nm no espectrofotômetro Synergy
H1Multi-mode Reader (Thermo Fischer Scientific). O RNA total extraído foi
armazenado em freezer a -80ºC para síntese de DNA complementar (cDNA) e
posterior análise por reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real
(qPCR-RT).
- Reação de transcrição reversa (síntese de DNA complementar)
50
As amostras de RNA total foram submetidas à reação de transcrição
reversa, na qual as amostras de RNA total foram transcritas para cDNA (DNA
complementar) em um termociclador (Veriti™ 60-well Thermal Cycler, Thermo
Fisher Scientific). Para a síntese do cDNA, foram utilizados, na reação, 2 μg de
RNA total de cada amostra, utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse
Transcription (Applied Biosystems) num volume final de 20 μl. A transcrição
reversa foi efetuada em um ciclo único, cujas etapas foram: I) 10 minutos a 25
°C; II) 120 minutos a 37 °C; III) 5 segundos a 85ºC; e IV) finalização da reação a
4°C. As amostras de cDNA obtidas foram estocadas em freezer a -20°C, até a
realização do experimento.
- Desenho e teste de eficiência dos primers
Os primers contendo a sequência do gene de interesse foram desenhados
a partir de sequências gênicas depositadas no banco de dados Genbank (Tabela
2), utilizando o software PerlPrimer (SourceForge.Net). As sequências foram
manufaturadas separadamente (Life Technologies, Brasil). Para testar a
eficiência dos primers, utilizamos diferentes primers de genes-controle (genes
RPL27, 18S, HPRT1, PPIA e GAPDH) e concentrações (100, 200, 400 e 800
nanomolar). Para escolher a melhor concentração de amostras, fizemos uma
mistura de diferentes amostras e testamos em curvas seriadas de diluição (5x,
10x, 20x, 40x e 80x diluídas). Para a realização do ensaio de eficiência,
utilizamos técnica de reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo
real (qPCR-RT) usando SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)
como marcador de fluorescência no equipamento QuantStudio™ 12K Flex Real
Time PCR (Life Technologies), utilizando os primers listados na Tabela 2. Foram
utilizados 2 µl da mistura de diferentes amostras de cDNA e 5 µl de SYBR®
Green, completando com água livre de RNase (DEPC inativa) e os primers para
um volume final de 10 µl. Cada ponto da curva de diluição foi feita em duplicata.
Como controle negativo (branco), foram usados poços com o mix da reação
(SYBR®, primers e água DEPC inativa) mas sem o cDNA. O gene-controle que
apresentou melhor eficiência para as amostras foi o GAPDH.
51
Tabela 3. Sequências dos Primers utilizados.
TLR4: gene Toll-like receptor 4; CD36: gene Cluster of Differentiation 36; NF-𝜅B p50: gene Nuclear Factor kB, p50 subunit; NF-𝜅B p65: gene Nuclear Factor kB, p65 subunit; NLRP3 = NLR, Family pyrin domain containing 3; IL-1b = gene Interleucina-1 beta; IL-18 = gene Interleucina-18; GAPDH = gene Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
- Reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR-RT)
Para amplificação e quantificação do material genético, utilizou-se a reação
em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR-RT) usando SYBR®
Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) como marcador de fluorescência
no equipamento QuantStudio™ 12K Flex Real Time PCR (Life Technologies),
que se baseia na detecção em tempo real de produtos da PCR medidos por
fluorescência, utilizando os primers listados na Tabela 3. Foram utilizados 2 µl
de cDNA de cada amostra e 5 µl de SYBR® Green, completando com água livre
de RNase (DEPC inativa) e os primers para um volume final de 10 µl. A reação
ocorreu em condições de ciclagem pré-determinadas, sendo duas etapas, a
primeira de 50ºC por 2 minutos e 95ºC por 10 minutos e a segunda com a
amplificação que ocorreu em 55 ciclos: desnaturação a 95ºC por 15 segundos,
anelamento a 63ºC por 60 segundos, e extensão a 72ºC por 2 minutos. Cada
amostra foi feita em duplicata. Como controle negativo (branco) para a reação
de PCR, foram usados poços com o mix da reação (SYBR®, primers e água
DEPC inativa), mas sem o cDNA. A expressão gênica foi normalizada pelo gene
controle GAPDH (Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase).
Gene (espécie) Sequência 5’®3’ TLR4, RNAm NM_138554.4 Homo sapiens
Forward primer: TTT ATC CAG GTG TGA AAT CCA G Reverse primer: AGA TGC TAG ATT TGT CTC CAC AG
CD36, RNAm NM_000072.3 Homo sapiens
Forward primer: GGA AGA ACA AAT CTA TAC ACA GGG Reverse primer: GAT TAA TGG TAC AGA TGC AGC CT
NF-𝜅B p50, RNAm NM_003998.3 Homo sapiens
Forward primer: ACA CTT AGC AAT CAT CCA CC Reverse primer: AAT CCT CCA CCA CAT CTT CC
NF-𝜅B p65, RNAm NM_021975.3 Homo sapiens
Forward primer: ATA CCA CCA AGA CCC ACC C Reverse primer: GCC TCA TAG AAG CCA TCC
NLRP3, RNAm NM_004895.4 Homo sapiens
Forward primer: CAT TGA GAA CTG TCA TCG GG Reverse primer: GCT GTT CAC CAA TCC ATG AG
Caspase-1, RNAm NM_033292.3 Homo sapiens
Forward primer: TGC TTC GGA CAT GAC TAC AG Reverse primer: GTT TCT TCC CAC AAA TGC CT
IL-1β, RNAm NM_000576.2 Homo sapiens
Forward primer: ACA GAT GAA GTG CTC CTT CC Reverse primer: ATC TTC CTC AGC TTG TCC A
IL-18, RNAm NM_001562.3 Homo sapiens
Forward primer: CCT GGA ATC AGA TTA CTT TGG C Reverse primer: GGG TGC ATT ATC TCT ACA GTC
GAPDH, RNAm NM_002046.6 Homo sapiens
Forward primer: CCT CTG ACT TCA ACA GCG AC Reverse primer: CGT TGT CAT ACC AGG AAA TGA G
52
Os dados foram expressos como um limiar do ciclo (CT, do inglês Cycle
threshold), que representa uma linha de base de detecção de fluorescência,
correspondente à fase exponencial. Para análise da expressão gênica através
da qPCR-RT, utilizamos o método 2-ΔΔCT, descrito por Livak e Schimittgen (142).
Inicialmente, calculou-se o ∆CT (ou limiar do ciclo) de cada amostra, subtraindo-
se os valores de CT do gene controle (GAPDH) dos valores de CT do gene alvo.
Para o cálculo do ∆∆CT, utilizou-se a fórmula [∆CT (amostra normalizadora) –
∆CT (amostra alvo)]. Determinado o ∆∆CT, aplicamos a fórmula 2-ΔΔCT, resultando
no valor da variação de expressão do gene alvo em relação ao gene controle.
5.8.3 Quantificação da concentração de proteínas do meio de cultura
Após 24h em cultivo, como descrito anteriormente, o meio de cultura foi
coletado, acondicionado em microtubo e armazenado em freezer -80 ºC.
A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Bradford
(Bradford Protein Assay, Bio-Rad Laboratories), que consiste na interação entre
o corante Coomassie brilliant blue e as macromoléculas das proteínas, que
contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. Na reação, a
interação entre a proteína e o corante provoca o deslocamento do equilíbrio do
corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em comprimento de onda
de 595 nm (Bradford, 1976). A leitura foi feita em microplaca no
espectrofotômetro Synergy H1 Multi-Mode Reader (Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, MA, USA).
- ELISA
O ensaio de ELISA foi utilizado para a análise quantitativa de proteínas no
sobrenadante de cultura de células. Este ensaio emprega um anticorpo
específico para a proteína alvo revestido em uma placa de 96 poços. Os padrões
e as amostras foram pipetados nos poços e a proteína presente na amostra foi
ligada aos poços pelo anticorpo imobilizado. Os poços foram lavados e
adicionado anticorpo anti-proteína biotinilado. Depois de lavar o anticorpo
53
biotinilado não ligado, a estreptavidina conjugada com Horseradish peroxidase
(HRP) foi pipetada nos poços. Os poços foram lavados novamente, uma solução
de substrato tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada aos poços e a cor se
desenvolveu em proporção à quantidade de proteína ligada. A solução de parada
mudou a cor de azul para amarelo e a intensidade da cor foi medida em 450 nm.
Os kits utilizados para esses ensaios foram Human Caspase-1
SimpleStep ELISA® Kit (Abcam, Cat. No. ab219633), ELISA Max™ Deluxe Set
Human IL-1β (Biolegend®, Cat. No. 437004) e RayBio® Human IL-18 ELISA Kit
(RayBiotech, Cat. No. ELH-IL18).
5.9 Análise estatística
Os resultados foram primeiramente submetidos a testes de normalidade
e de homogeneidade. As comparações entre os grupos foram avaliadas pelo
teste de Mann-Whitney, pela análise de variância de um fator (1-way ANOVA),
para dados com distribuição normal, ou pelo teste de Kruskal-Wallis, para dados
com distribuição assimétrica. Para avaliar a dispersão de variáveis nominais, foi
utilizado o teste Qui quadrado (X2). Para múltiplas comparações, o teste 2-way
ANOVA foi utilizado. O pós-teste de diferença mínima de Fisher (LSD) foi
aplicado. Valores discrepantes (outliers) foram identificados através do método
Rout e retirados das análises.
Para todas as análises, adotou-se o nível de significância p<0,05,
utilizando-se o software estatístico Prism® versão 8.0 (GraphPad Software, Inc.).
Os dados foram expressos como média ± erro-padrão ou mediana e intervalo de
quartis [primeiro quartil; terceiro quartil].
54
6. RESULTADOS
6.1 Voluntários recrutados e divisão em grupos
Vinte e oito voluntários foram recrutados ao estudo (grupos: Controle n=8;
WSC n=10; CC n=10).
Depois da cirurgia, com base nos dados e questionários de cada um dos
voluntários, foram classificados e distribuídos em três grupos. O grupo CTL
(Controle, n=8) foi composto por voluntários submetidos a cirurgias para
correção de hérnias da parede abdominal (umbilical e inguinal, 1 e 3 voluntários,
respectivamente), colecistectomias videolaparoscópicas (3 voluntários) e
proctoplexia abdominal (1 voluntária). Destes, os cirurgiões coletaram o tecido
adiposo subcutâneo evidenciado pelo corte cirúrgico.
O grupo WSC (do inglês, Weight Stable Cancer, n=10) eram voluntários
com câncer (colorretal) sem caquexia, ou seja, não perderam peso ou a perda
de peso foi inferior a 5% da massa corporal, em 12 meses ou menos. Destes,
foram coletados o tecido adiposo subcutâneo e o tecido adiposo peritumoral
(imediatamente adjacente ao tumor, ou seja, o tecido adiposo mesentérico) da
peça cirúrgica. Este tecido era coletado pelo cirurgião responsável, antes que a
peça fosse encaminhada para a anatomia patológica.
O grupo CC (do inglês, Cancer Cachexia, n=10) eram voluntários com
câncer (colorretal) com diagnóstico de caquexia, isto é, perda de massa corporal
igual ou superior a 5%, em 12 meses ou menos (ou IMC inferior a 20 Kg/m2) e
presença de pelo menos 3 dos 5 das condições características da caquexia
(diminuição da força muscular; fadiga; anorexia, baixo índice de massa magra e
bioquímica anormal). Deste grupo também foram coletados os tecidos adiposos
subcutâneo e peritumoral.
Não foi possível obter o tecido adiposo peritumoral de 2 pacientes porque
o tumor não foi retirado (os pacientes apresentaram metástases locais, mudando
a conduta terapêutica no intra-operatório). Um destes, classificados como CC,
veio a óbito 6 meses após a cirurgia (verificado em prontuário em
novembro/2019).
55
6.2 Características clínicas dos pacientes
A média de idade dos voluntários foi igual entre os grupos (Figura 7A). O
grupo Controle foi constituído por um maior número de homens do que mulheres,
enquanto nos grupos WSC e CC houve maior presença de mulheres; não foi
observada diferença estatística desses parâmetros entre os grupos (Figura 7B).
Figura 7A - Idade média em anos. Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste 1-way ANOVA (p > 0.05). Figura 7B - Sexo. Dados expressos como percentual; os números inscritos dentro da barra indicam o n total de indivíduos; teste Qui quadrado (p > 0.05). (CTL n=8; WSC n=10; CC n=10). F: sexo feminino; M: sexo masculino.
A estatura, em metros, obtida com estadiômetro, foi menor entre os
voluntários do grupo CC, em relação ao grupo CTL (Figura 8A). O índice de
massa corporal (IMC, expresso em Kg/m2), teve média superior a 20 Kg/m2,
(acima do que preconiza Evans e colaboradores (51) para o diagnóstico de
caquexia) e não houve diferença entre os grupos em relação a este parâmetro
(Figura 8B).
CTL WSC CC0
20
40
60
80
Idad
e (a
nos)
F M0
2
4
6
8
10
9 16 43 5
Sexo
CTLWSCCC
A B
56
Figura 8A - Altura em metros. Figura 8B - Índice de massa corporal (IMC), em Kg/m2. Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste 1-way ANOVA. CTL n=8; WSC n=10; CC n=10. *: diferença estatística significativa entre CC/WSC e CTL (p<0.05).
Ao avaliarmos a variação de massa corporal dos voluntários, comparando
o peso habitual (num período de 6 a 12 meses antes do diagnóstico) e o peso
aferido no momento da inclusão no estudo, verificamos que a amplitude de
variação de peso foi maior no grupo CC, embora sem diferença estatística
significativa (Figura 9).
Figura 9 - Variação (Δ) de peso em função do tempo. Regressão linear (CC p=0.07). CTL n=8; WSC n=10; CC n=10.
As comorbidades relatadas no momento do recrutamento pelos
voluntários estão listadas na figura 10.
CTL WSC CC0.0
0.5
1.0
1.5
2.0Al
tura
(em
m)
**
CTL WSC CC0
10
20
30
IMC(
kg/m
²)
CTLWSCCC
A B
0 5 10 1555
60
65
70
75
Δ Pe
so (e
m K
g)/ Δ
t
CTLWSCCC
57
Figura 10. Comorbidades relatadas. CTL n=1; WSC n=9; CC n=10.
A fim de facilitar a análise estatística, agrupamos os tumores colorretais
quanto à sua localização (Figura 11), em cólon direito (ceco, ascendente, flexura
hepática e 2/3 proximais do cólon transverso) e cólon esquerdo (1/3 distal do
cólon transverso, flexura esplênica, descendente, sigmoide, retossigmoide e
reto).
Figura 11. Lateralidade do cólon.
Quanto à localização anatômica do tumor, a maioria dos pacientes apresentou
câncer no cólon esquerdo, tanto no grupo WSC (80%) quanto no grupo CC (60%)
CTL WSC CC0
1
2
3
4
5Comorbidades
Alergia
DLP
HAS
Asma
Hipotir.
Hipercolest.
Depressão
Epilepsia
DM2
Pré-DM
Dor
58
(Figura 12A). Referente ao estadiamento tumoral, os maiores percentuais se
concentraram nos estadios II e III, em ambos os grupos com câncer (Figura 12B).
Figura 12A- Localização anatômica do tumor. Dados expressos em percentuais; teste exato de Fisher (p > 0.5). Figura 12B - Estadiamento tumoral, segundo o sistema de classificação de tumores TNM. Os números dentro das barras correspondem ao número de casos em cada estadio. Dados expressos em percentuais; teste Qui-quadrado (p > 0.5). WSC n=10; CC n=10.
Não houve diferença estatística entre os grupos ao avaliar a Escala de
Saúde Global do questionário QLQ-C30 (Figura 13A). Já na avaliação da Escala
Funcional do questionário, o grupo CC apresentou o menor índice (75,6 ± 4,3),
quando comparado ao grupo CTL (90,8 ± 2,5) (Figura 13B). O grupo CC teve
uma tendência a apresentar maior índice na Escala de Sintomas (Figura 13C).
Figura 13A - Escala de Saúde Global do questionário QLQ-C30. Figura 13B - Escala Funcional do questionário QLQ-C30. Figura 13C - Escala de Sintomas do questionário QLQ-C30. Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste 1-way ANOVA. CTL n=8; WSC n=10; CC n=10. *: indica diferença entre WSC/CC e CTL (p<0.05).
Cólon d
ir.
Cólon e
sq.
Cólon d
ir.
Cólon e
sq.
0
2
4
6
8
10
4 62 8
Loca
lizaç
ão d
o tu
mor
%
I II III IV I II III IV0
2
4
6
1 3 4 21 5 3 1Es
tadi
amen
to T
NM %
WSCCC
A B
CTL WSC CC0
20
40
60
80
100
QLQ
-C30
Esc
. Saú
de G
loba
l
CTL WSC CC0
20
40
60
80
100
QLQ
-C30
Esc
ala
func
iona
l
**
CTL WSC CC0
10
20
30
QLQ
-C30
Esc
ala
de s
into
mas
p=0.054
A B C
59
A avaliação do questionário FAACT-A/CS mostrou que não houve
diferença entre os grupos na pontuação de anorexia (Figura 14).
Figura 14 - Pontuação anoréxica. Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste 1-way ANOVA (p > 0.05). WSC n=10; CC n=10.
O Índice de Karnofsky descreve os níveis de atividade e independência
dos pacientes com câncer; esse índice foi ligeiramente menor (mas sem
diferença estatística) entre voluntários do grupo WSC em comparação ao grupo
CC (Figura 15A). A escala de capacidade funcional (Zubrod Performance Status)
avalia sinais da doença e o nível de atividade do paciente com câncer; não houve
diferença estatística significativa entre os grupos (Figura 15B).
Figura 15A - Escala de Karnofsky. Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste 1-way ANOVA (p>0.05). Figura 15B - Zubrod Performance Status. Dados expressos como percentual. WSC n=10; CC n=10.
WSC CC0
10
20
30
40
FAACT-A/CS
WSC CC0
50
100
Karn
ofsk
y
PS0 PS1 PS20
2
4
6
8
10
8 1 17 3
Zubr
od (%
)
WSCCC
A B
60
A Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão é utilizada para rastrear
esses sintomas em pacientes em ambiente hospitalar. A subescala de
Ansiedade e a subescala de Depressão não demonstraram diferença entre os
grupos (Figura 16).
Figura 16 - Avaliação de Ansiedade e Depressão. Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste 1-way ANOVA (p>0.05). CTL n=8; WSC n=10; CC n=10.
Os níveis de colesterol total e da fração LDL foram menores nos grupos
CTL e CC, quando comparados ao grupo WSC (Figuras 17A-B); a fração HDL,
os triglicérides e glicose séricos não foram diferentes entre os grupos (Figuras
17C-E).
A D A D A D0
5
10
15
Ansi
edad
e e
depr
essã
o CTLWSCCC
61
Figuras 17A-E - Níveis lipídicos e de glicose séricos, em mg/dL. Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste 1-way ANOVA. CTL n=8; WSC n=10; CC n=10. *: indica diferença entre CTL/CC e WSC (p<0.05).
6.3 Parâmetros bioquímicos utilizados no diagnóstico de caquexia
A caquexia associada ao câncer caracteriza-se por mudanças
metabólicas e sistêmicas. Para ter ferramentas que auxiliassem o diagnóstico da
CAC, foram propostos que parâmetros sanguíneos, como hemoglobina, proteína
C-Reativa (PCR) e albumina, fossem avaliados (45,51). Os níveis de Hemoglobina
foram menores no grupo CC quando comparados aos do grupo Controle (Figura
18A). Os níveis de PCR foram maiores em CC quando comparado ao grupo CTL
(Figura 18B). Albumina (Figura 18C) não apresentou diferença estatística entre
os grupos.
CTL WSC CC0
100
200
300C
oles
tero
l tot
al (m
g/dL
) ****
CTL WSC CC0
50
100
150
200
Col
este
rol L
DL
(mg/
dL) ***
CTL WSC CC0
20
40
60
80
Col
este
rol H
DL
(mg/
dL)
CTL WSC CC0
50
100
150
Trig
licér
ides
(mg/
dL)
A B C
D
CTL WSC CC0
50
100
150
Glic
ose
(mg/
dL)
E
62
Figura 18A - Níveis séricos de hemoglobina (Hb), em g/dL. Figura 18B - Níveis séricos de PCR, em mg/L. Figura 18C - Níveis séricos de albumina, em g/dL. Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste ANOVA 1-way. CTL n=8; WSC n=10; CC n=10. *: indica diferença entre CC e CTL (p<0.05).
Como a concentração plasmática de albumina não variou entre os grupos,
decidimos fazer a razão PCR/Albumina, que revelou diferença significativa
quando o grupo CC foi comparado ao CTL (Figura 19).
Figura 19. Razão PCR/Albumina (mg/g). Dados expressos como média ± erro padrão da média; teste ANOVA 1-way. CTL n=8; WSC n=10; CC n=10. *: indica diferença entre CC e CTL (p<0.05).
6.4 Análise da Expressão Gênica dos Tecidos Adiposos Subcutâneo e Peritumoral e conteúdo proteico do Subcutâneo
As amostras de tecidos subcutâneo e peritumoral de cada um dos
voluntários foi pesada em balança de precisão, dividida em 2 pedaços, picotadas
e colocadas em placas de cultura por 24 horas, sem (basal) e com o estímulo de
CTL WSC CC0
5
10
15
20
Hem
oglo
bina
(g/d
l) *****
CTL WSC CC0
5
10
15
PCR
(mg/
l)
**
CTL WSC CC0
1
2
3
4
5
Albu
min
a (g
/dl)
A B C
CTL WSC CC0
1
2
3
PCR/
Alb
(mg/
g)
*
63
lipopolissacarídeo (LPS). A análise foi feita entre os grupos, em ambas as
condições de incubação em cultura. O conteúdo proteico de caspase-1 e das
citocinas IL-1β e IL-18 do tecido adiposo subcutâneo foi avaliado no
sobrenadante coletado após 24h de cultura.
Os receptores TLR4 e o CD36 são importantes para a ativação do
inflamassoma no tecido adiposo. A análise da expressão gênica basal de TLR4
não mostrou diferenças distintas entre os grupos de estudo em explantes de
tecido adiposo subcutâneo ou peritumoral. A incubação com LPS induziu a
expressão de TLR4 em explantes de SC em CTL e CC, embora o efeito em CC
não tenha sido significativo (Figuras 20A e 20C). Idêntica à TLR4, a expressão
do gene CD36 basal não diferiu entre os grupos em explantes de ambos os
depósitos de tecido adiposo. Em explantes subcutâneos do grupo WSC, a
expressão de CD36 aumentou devido ao desafio de LPS, enquanto em explantes
peritumorais, o aumento de expressão induzido por LPS foi visto no grupo CC
(Figuras 20B e 20D).
Figura 20. Receptores envolvidos na ativação do inflamassoma. (A-B): expressão de TLR4 e CD36 no TASC e (C-D): os mesmos genes no TAPT.
64
A ativação do TLR4, bem como da cascata do receptor CD36, resulta na
ativação das subunidades NF-𝜅B p50 e p65, o que leva à sua translocação para
o núcleo, onde induz a transcrição de NLRP3, grande parte da estrutura do
inflamassoma. A análise da expressão gênica das subunidades NF-𝜅B p50 e p65
revelou que a expressão média de p50 em explantes subcutâneos de CC foi
cerca de 2 vezes maior do que em CTL ou WSC. O LPS suprimiu a expressão
do gene NF-𝜅B p50 no grupo CC no tecido subcutâneo (Figura 21A), enquanto
um efeito contrário foi observado no tecido adiposo peritumoral, com o LPS
levando a um aumento na expressão de NF-𝜅B p50 no grupo CC (Figura 21D).
Nenhuma diferença na expressão basal do gene NF-𝜅B p65 pode ser
observada entre os grupos em ambos os depósitos de tecido adiposo
subcutâneo. Contrapondo com NF-𝜅B p50, a expressão do gene NF-𝜅B p65
aumentou devido à incubação de LPS em explantes subcutâneos de CC (Figura
21B). O mesmo efeito de LPS foi observado em explantes de tecido adiposo
peritumoral do grupo CC (Figura 21E).
A expressão média basal do gene NLRP3 em explantes de tecido adiposo
subcutâneo foi cerca de 5 vezes maior em CC do que em CTL ou WSC, resultado
que se repetiu no tecido adiposo peritumoral (Figuras 21C e 21F). O desafio de
LPS teve um efeito supressor sobre NLRP3 em CC em ambos os depósitos de
tecido adiposo. Com uma redução de aproximadamente 60%, este efeito foi
aparentemente mais forte no tecido adiposo subcutâneo do que no tecido
adiposo peritumoral, onde a expressão de NLRP3 foi reduzida em um terço.
65
Figura 21. Indução da expressão de NLRP3 através da via NF-𝜅B. (A-C): expressão de NF-𝜅B p50/p65 e NLRP3 no TASC e (D-F): os mesmos genes no TAPT.
O inflamassoma ativa a caspase-1 que, por sua vez, cliva e ativa as
citocinas IL-1β e IL-18. No tecido adiposo subcutâneo, a expressão basal do
gene da caspase-1 não foi estatisticamente diferente entre os grupos (Figura
22A). Contudo, os níveis de proteína caspase-1 foram significativamente
maiores no subcutâneo de WSC e CC em comparação com CTL. O estímulo de
LPS aumentou a expressão do gene caspase-1 em explantes de TASC em CC,
mas este efeito não foi observado ao avaliar as concentrações de proteína em
CC ou nos outros grupos (Figura 22D). Entretanto, a expressão da caspase-1
basal no tecido adiposo peritumoral de pacientes com CC foi maior do que em
explantes de WSC. Já o tecido adiposo peritumoral do CC não foi sensível ao
estímulo por LPS (Figura 22G).
A expressão do gene IL-1β basal no tecido subcutâneo foi menor em
ambos os grupos de câncer quando comparada ao CTL, com uma diferença
significativa em WSC e uma tendência no grupo CC (Figura 22B). No entanto, o
conteúdo de proteína basal IL-1β no subcutâneo não foi significativamente
diferente entre os grupos (Figura 22E). O estímulo de LPS suprimiu a expressão
do gene IL-1β no tecido adiposo subcutâneo de CTL e CC, enquanto não houve
efeito do LPS na expressão do gene IL-1β no tecido adiposo peritumoral. No
66
tecido peritumoral, também houve uma tendência para uma menor expressão de
IL-1β em CC comparado a WSC (Figura 22H). O efeito supressor de LPS sobre
IL-1β em explantes de subcutâneo do grupo CTL também foi confirmado por
níveis mais baixos da proteína. Surpreendentemente, o desafio de LPS levou a
um aumento no conteúdo da proteína IL-1β, o que foi contrário aos dados de
expressão gênica em explantes do grupo CC.
A expressão basal do gene e da proteína IL-18 não diferiu entre os grupos
em explantes do subcutâneo (Figura 22C e 22F), enquanto a expressão do gene
IL-18 no tecido peritumoral tendeu a ser maior em CC em comparação ao WSC
(Figura 22I). No tecido adiposo subcutâneo, a incubação com LPS resultou em
um aumento da expressão do gene IL-18 em WSC, o que não foi refletido pelos
dados de proteína neste grupo, enquanto que em CC, o mesmo estímulo levou
a um aumento significativo no conteúdo de proteína IL-18. Nenhum efeito LPS
foi observado no depósito peritumoral.
67
Figura 22. Ativação de citocinas inflamatórias mediada por caspase-1. expressão gênica (A-C) e proteica (D-F) de caspase-1, IL-1β e IL-18 no TASC e (G-I): os mesmos genes no TAPT.
68
7. DISCUSSÃO
7.1 Achados clínicos
A caquexia associada ao câncer é uma síndrome de difícil diagnóstico e
tratamento; sua etiologia é desconhecida e sua fisiopatologia é complexa e
pouco compreendida, a despeito dos esforços de décadas de estudo. É difícil
desvincular suas raízes do câncer e é fato corriqueiro confundi-la com outras
condições, de tal modo que, na maioria das vezes, a caquexia só é diagnosticada
quando não há mais um ponto de retorno na resposta do paciente, ou seja,
caquexia refratária. As estratégias terapêuticas utilizadas atualmente para a
CAC incluem exercício, suporte nutricional e remoção cirúrgica do tumor
(principalmente os obstrutivos) (17). Ensaios clínicos têm utilizado protocolos
(monodroga ou uma combinação de drogas), como por exemplo, anamorelina,
enobosarm, ômega 3, L-carnitina, ibuprofeno, Nabilone etc., como estratégias
farmacológicas de tratamento da caquexia oncológica (40,143,144).
A caquexia impacta não só a progressão do câncer, como também
compromete a resposta terapêutica, aumenta os custos de tratamento e o tempo
de internação (145) e é a causa imediata de morte em pelo menos 20% dos
pacientes (4,17). Em uma revisão sistemática, Anker e colaboradores estimaram
que, dos pacientes diagnosticados com câncer colorretal, 50% estão sob risco
de desenvolver caquexia e, calcularam em 66% a taxa de sobrevida em cinco
anos, para pacientes com as duas patologias (146).
Não se observou diferença entre a média de idade ou de sexo entre os
grupos. A altura foi menor no grupo CC, e os dois grupos com câncer se
igualaram no quesito IMC. O cálculo de IMC não é uma ferramenta adequada
para avaliar composição corporal, mas tem sido usada como um marcador de
caquexia (147). Analisando várias metanálises, CUP Panel (Continuous Update
Project, da World Cancer Research Fund) indicaram que indivíduos com IMC >
27 kg/m2 tem maior risco de desenvolverem CCR (148). Cerca de 80% dos
pacientes com câncer experimentam a perda involuntária de peso, critério clínico
cardinal no diagnóstico da caquexia. Nesse estudo, o peso habitual de CC se
igualava ao de CTL, no momento do recrutamento. A média percentual de perda
69
de peso de WSC foi de 5.1% e no grupo CC foi de 11,6%, no período de 12
meses ou menos.
Três pacientes do grupo WSC e nove do grupo CC informaram ter
comorbidades; 2 do grupo WSC e 3 do grupo CC relataram ter mais de uma
comorbidade. A comorbidade mais frequente foi hipertensão arterial sistêmica
(HAS). O CCR geralmente se apresenta em maior proporção em pacientes
idosos, que também tendem a ter mais doenças crônicas. Não foram observados
estudos analisando a correlação entre a existência de comorbidades e o
desenvolvimento da caquexia oncológica. Isto faz com que se levante a questão:
a presença de uma ou mais comorbidades aumentam as chances de
desenvolvimento da caquexia associada ao câncer?
Tem sido observado aumento no número de casos de CCR em pacientes
com idade inferior a 50 anos, principalmente no cólon esquerdo. Existem
diferenças embriológicas, biológicas, anatômicas e moleculares no CCR situado
no lado direito e no lado esquerdo (29), sendo consideradas como entidades
biológicas diferentes (149). Foi demonstrado que tumores situados no cólon direito
se associam com anemia, estadiamento e idade avançados; as lesões tendem
a ser polipoides e volumosas e crescer para dentro da luz do órgão, enquanto
que as características de tumores do lado esquerdo são lesões infiltrantes e
constritivas que causam obstrução (149,150). Um estudo demonstrou que pacientes
com CCR do lado esquerdo tinham tempo de sobrevida livre de doença maior do
que os que a tinham no lado direito, a depender do estadio do tumor. Também
mostraram que, entre os pacientes que perderam peso, o maior percentual
estava entre os pacientes com CCR no lado direito (151). Em nosso estudo, a
maioria dos tumores concentrou-se no lado esquerdo do cólon (80% em WSC e
60% em CC). Lim e colaboradores relataram que pacientes com tumores no lado
direito do cólon apresentavam tamanho aumentado de tumor, câncer em estadio
avançado e menores taxas de sobrevida livre de doença e de sobrevida
global(150). Nosso trabalho mostrou que os estadios II e III apresentaram os
maiores percentuais. Ainda que possuam o mesmo tipo de câncer e carga
tumoral, um paciente pode vir a desenvolver caquexia e outro não; Fearon e
outros atribuíram esse fato a possíveis variações genotípicas na imunidade(152).
Trabalhos de nosso grupo (84,153) mostram que há também um padrão distinto de
70
secreção de fatores inflamatórios pelo tumor e diferenças no microambiente
tumoral em pacientes caquéticos versus pacientes com peso estável.
O questionário QLQ-C30 foi elaborado para mensurar a qualidade de vida
em pacientes com câncer e avalia como o paciente percebe sua capacidade de
cumprir suas atividades diárias e como a doença impacta seu bem-estar físico,
psicológico e social. É composto por 30 questões, dividido em vários domínios
de estados funcionais, qualidade de vida/estado de saúde global e intensidade
dos sintomas. A Escala de Saúde Global (QLQ-C30 ESG) foi muito similar entre
os grupos. A Escala Funcional (EF) teve um menor escore em CC, evidenciando
prejuízo funcional. A Escala de Sintomas (ES) teve pontuação maior em CC,
apontando para um nível mais alto de sintomas nesse grupo.
A anorexia é um sintoma frequente em pacientes com câncer e foi
avaliada pela ferramenta FAACT-A/CS, que conta com um sistema de pontuação
de nível (0-4 pontos para cada questão), onde uma soma mais alta indica melhor
qualidade de vida. Menor pontuação (32,3 ± 2,2) foi observada em CC,
evidenciando presença de anorexia. Mas cabe aqui lembrar que a caquexia pode
progredir mesmo na ausência de anorexia (154).
O Escore de Karnofsky foi ligeiramente menor em WSC em relação ao
grupo CC, sem apresentar diferença entre os grupos. Os maiores percentuais do
Zubrod Performance Status se concentraram em PS0, 70% em WSC e 80% em
CC. Esses resultados condizem com o estado clínico dos pacientes (capazes de
realizar suas funções diárias, apesar de apresentarem sinais e sintomas da
doença); os pacientes passaram por cirurgia e ainda não tinham feito nenhum
outro tipo de tratamento anticâncer.
Os grupos com câncer mostraram respostas similares no que tange aos
sintomas de ansiedade e depressão. A Escala Hospitalar de Ansiedade e
Depressão é utilizada para rastreamento de sintomas de ansiedade e depressão
em pacientes internados. O escore varia de 0 a 21 pontos para cada subescala,
com pontuação de 0 a 7 significando ausência de sintomas, de 8 a 10 um
possível caso, e de 11 a 21 pontos, um provável caso.
O metabolismo lipídico desregulado também é marca do câncer, pois tem
a função crucial de fornecer constituintes para a membrana das células e para
as vias tumorigênicas (154). No presente estudo, os níveis de colesterol total e
71
LDL estavam diminuídos em CC, o que foi observado em outros trabalhos do
nosso grupo de pesquisa (155–157). Os níveis séricos de HDL, triglicérides e glicose
não diferiram entre os grupos.
Para o diagnóstico de caquexia, utilizamos os parâmetros séricos
hemoglobina, PCR e albumina (51). A concentração de hemoglobina estava
diminuída em CC em relação a CTL e WSC, indicando anemia nos pacientes
caquéticos, como relatado em outros trabalhos do nosso grupo (155–157). A
secreção hepática de PCR é estimulada por citocinas inflamatórias, como IL-6 e
IL-1β (158). O aumento dos níveis séricos de PCR é consistentemente relatado
em pacientes com CAC, o que também foi observado em nosso trabalho nos
pacientes caquéticos, evidenciando inflamação sistêmica nesse grupo. Níveis de
PCR igual ou maior que 10 mg/dL tem sido associados com perda de peso e
anorexia em pacientes com câncer (159). A albumina não apresentou diferença
entre os grupos, mantendo-se dentro dos níveis normais, e, portanto, superiores
aos níveis indicados em consenso internacional (51). Por isso, fizemos a razão
PCR/Albumina, que se mostrou elevada no grupo CC, comprovando seu valor
como uma ferramenta a ser usada no diagnóstico da CAC. PCR aumentada e
albumina diminuída foram associados com sobrevida global prejudicada em
pacientes em estadio I-III após cirurgia curativa de câncer colorretal (160).
7.2 Análise da expressão gênica e conteúdo proteico
Ao avaliar se havia heterogeneidade na resposta inflamatória do tecido
adiposo dependendo da localização anatômica (mesentérica, retroperitoneal e
epididimal) em modelo animal de caquexia, Neves e colaboradores (2016) (26)
relataram resposta heterogênea dos diferentes tecidos à caquexia e
demonstraram que a via do inflamassoma poderia estar envolvida na inflamação
do tecido adiposo na CAC. Assim, o presente trabalho se propôs a demonstrar
como cada depósito de tecido adiposo branco se comportava na caquexia
associada ao câncer com relação à ativação da via do inflamassoma NLRP3.
Estabelecer a relação entre a inflamação do TASC e TAV e a expressão do
inflamassoma NLRP3 talvez acrescente mais uma peça à compreensão de como
a caquexia começa e se mantém, pois até o momento não há estudos sobre a
72
ativação do inflamassoma no contexto da caquexia associada ao câncer em
humanos.
TASC e TAV (e, portanto, o TAPT, no cenário da CAC) são muito distintos,
portanto diferenças nos perfis de expressão gênica e proteica podem contribuir
para os distúrbios observados. O tecido adiposo branco não é mais considerado
apenas um repositório inerte de energia; é um órgão muito complexo, com
grande plasticidade ao remodelamento. Diferentes depósitos de gordura diferem
quanto ao tamanho das células, em função fisiológica e contribuição para
estados patológicos (161). No TAV, os adipócitos têm atividade lipolítica maior e
geralmente secretam mais citocinas pró-inflamatórias do que TASC, contribuindo
para a inflamação sistêmica associada a desordens metabólicas. No TASC, a
estocagem de triacilgliceróis ocorre a longo prazo (ou seja, é mais difícil de ser
mobilizado); é um depósito mais celularizado, mais densamente vascularizado,
metabolicamente menos ativo do que TAV, apresenta menor taxa de infiltração
de macrófagos e consequentemente menor secreção de fatores pro-
inflamatórios (162).
O tecido adiposo dos pacientes com CAC fica cronicamente
comprometido pela inflamação (15), tornando-se uma importante fonte de
mediadores pro-inflamatórios (79,84). O aumento na secreção de citocinas
promove um ambiente favorável ao tumor. Zoico e colaboradores descreveram
mudanças morfofuncionais do TAPT in vitro (“encolhimento” em tamanho e
número dos adipócitos pela lipólise intensa e maior taxa de infiltração por
macrófagos) (163).
O LPS em cultura foi utilizado no intuito de simular um estímulo que
desencadeia toda a cascata de sinalização do inflamassoma NLRP3. Olhando
especificamente para a expressão basal nos tecidos subcutâneo e peritumoral,
que reflete a real condição dos pacientes no momento da cirurgia, identificamos
as diferenças descritas a seguir. A expressão do mRNA do gene TLR4 estava
diminuída no grupo CC no TASC e aumentada no TAPT, enquanto a expressão
do gene CD36 estava diminuída no grupo CC em ambos os tecidos. Foi
demonstrado que o tecido adiposo expressa todos os subtipos de TLR, que está
associado à ativação de NF-𝜅B e posterior liberação de citocinas (18,164). A
sinalização do gene CD36 tem sido implicada no desenvolvimento de doenças
73
crônicas (110) e variantes genéticas foram associadas a anormalidades lipídicas
e suscetibilidade a síndrome metabólica em humanos (165). No grupo CC, NF-𝜅B
p50 e NF-𝜅B p65 se comportaram igual, aumentando no TASC e diminuindo a
expressão no TAPT. A expressão dos genes NLRP3 e IL-18 estava aumentada
no grupo caquético em ambos os tecidos, e a expressão do RNAm de Caspase-
1 estava diminuída no TASC e aumentada no TAPT dos pacientes do grupo CC.
A expressão gênica para a citocina IL-1β, no grupo CC, estava aumentada no
TASC e diminuída no TAPT, como demonstrado em nosso grupo por Riccardi
(2015) (155). No grupo WSC, com exceção do gene TLR4, a expressão de todos
os outros genes estava diminuída.
Os níveis da proteína Caspase-1 no sobrenadante de meio de cultura
estavam maiores em WSC e CC quando comparados ao grupo CTL. A
concentração de IL-1β era menor no grupo CC em relação aos outros grupos.
Os níveis proteicos de IL-18 estavam diminuídos no grupo WSC e aumentados
no CC. Portanto, a expressão proteica contrariou o que foi visto na expressão
gênica.
Faz-se necessário relatar as limitações impostas à realização desse
trabalho. O peso corporal anterior dos voluntários foi relatado pelo próprio
paciente e, portanto, imprecisões são possíveis. Não foi possível realizar a
análise de composição corporal dos pacientes através do DXA (Dual energy X-
ray absorciometry; Absorciometria de energia dupla de raios X) porque não
houve tempo hábil entre o recrutamento e a realização da cirurgia. O número de
indivíduos estudados foi baixo pela dificuldade em se obter amostras de tecido
adiposo durante a cirurgia. Devido à variação intrínseca entre amostras de tecido
humano, algumas análises não foram realizadas para todos os indivíduos
inicialmente inscritos, pois algumas amostras mostravam valores aberrantes.
Também não foi possível avaliar o perfil proteico no TAPT, porque não havia
reagentes nem recursos suficientes para tal; como a intenção primária do nosso
projeto era avaliar apenas o TASC, priorizamos essa análise. No entanto, até
onde sabemos, este é o primeiro estudo que aponta diferenças na expressão de
da via NLRP3 nos tecidos adiposos subcutâneo e peritumoral em pacientes
caquéticos com câncer colorretal.
74
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estudo da via inflamassoma NLRP3 é uma área emergente para
diversas doenças, principalmente metabólicas, por sua capacidade de modular
importantes respostas inflamatórias. Demonstramos aqui, pela primeira vez, que
há diferenças significativas na expressão de alguns componentes desta via nos
tecidos adiposos subcutâneo e peritumoral de pacientes com caquexia
associada ao câncer colorretal. Essa via surge, assim, como potencial alvo de
estratégias terapêuticas com o objetivo de mitigar a caquexia oncológica.
75
ANEXOS
Anexo 1 - Parecer consubstanciado do CEP FMUSP
76
77
78
79
Anexo 2 - Parecer consubstanciado do CEP HU-USP
80
81
82
83
Anexo 3 - Parecer consubstanciado do CEP ICB-USP
84
85
86
87
Anexo 4 – TCLE
88
89
90
Anexo 5 – EORTC-QLQ-C30
91
92
Anexo 6 – Pontuação Anoréxica (FAACT-A/CS)
93
Anexo 7 – Escalas de Zubrod e de Karnofsky
94
Anexo 8 – Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão
95
REFERÊNCIAS
1. Lancaster E. Continuum: The Paraneoplastic Disorders. Continuum (NY). 2015; 312 (24): 2668-75.
2. Porporato PE. Understanding cachexia as a cancer metabolism syndrome. Oncogenesis. 2016; 5 (2): e200-10.
3. Petruzzelli M, Wagner EF. Mechanisms of metabolic dysfunction in cancer-
associated cachexia. Genes Dev. 2016;30(5):489-501. 4. Bing C, Trayhurn P. New insights into adipose tissue atrophy in cancer
cachexia. Proc Nutr Soc. 2009; 68 (4): 385-92.
5. Laviano A, Meguid MM, Inui A, Muscaritoli M, Rossi-Fanelli F. Therapy insight: Cancer anorexia-cachexia syndrome - When all you can eat is yourself. Nat Clin Pract Oncol. 2005; 2 (3): 158-65.
6. Reynolds J V., Donohoe CL, Ryan AM. Cancer cachexia: Mechanisms and clinical implications. Gastroenterol Res Pract. 2011; 2011: 601434.
7. Penet M, Bhujwalla ZM. Cancer Cachexia, Recent Advances, and Future
Directions. Cancer J. 2015; 21 (2): 117-22.
8. Cinti S. The adipose organ at a glance. DMM Dis Model Mech. 2012; 5 (5): 588-94.
9. Cinti S. The adipose organ. Prostaglandins Leukot Essent Fat Acids. 2005;
73(1 SPEC. ISS.):9-15. 10. Mraz M, Haluzik M. The role of adipose tissue immune cells in obesity and
low-grade inflammation. J Endocrinol. 2014; 222: R113-27. 11. Federico A, D’Aiuto E, Borriello F, Barra G, Gravina AG, Romano M, De
Palma R. Fat: A matter of disturbance for the immune system. World J Gastroenterol. 2010; 16 (38): 4762-72.
12. Schäffler A, Schölmerich J, Salzberger B. Adipose tissue as an immunological organ: Toll-like receptors, C1q/TNFs and CTRPs. Trends Immunol. 2007; 28 (9): 393-9.
13. Chazenbalk G, Bertolotto C, Heneidi S, Jumabay M, Trivax B, Yoshimura K, Simmons CF, Dumesic DA, Azziz R. Novel Pathway of Adipogenesis through Cross-Talk between Adipose Tissue Macrophages , Adipose Stem Cells and Adipocytes: Evidence of Cell Plasticity. PLoS One. 2011; 6 (3): e17834.
14. Grant RW, Dixit VD. Adipose tissue as an immunological organ. Obesity. 2015; 23 (3): 512-8.
96
15. Alves MJ, Figuerêdo RG, Azevedo FF, Cavallaro DA, Neto NIP, Lima JDC, Matos-Neto E, Radloff K, Riccardi DM, Camargo RG, Alcântara PSM, Otoch JP, Batista Jr ML, Seelaender M. Adipose tissue fibrosis in human cancer cachexia: The role of TGFβ pathway. BMC Cancer. 2017;17 (1): 190.
16. Tsoli M, Swarbrick MM, Robertson GR. Lipolytic and thermogenic depletion of adipose tissue in cancer cachexia. Semin Cell Dev Biol. 2016; 54: 68-81.
17. Vaitkus JA, Celi FS. The role of adipose tissue in cancer-associated cachexia. Exp Biol Med. 2017; 242 (5): 473-81.
18. Schäffler A, Schölmerich J. Innate immunity and adipose tissue biology. Trends Immunol. 2010; 31 (6): 228-35.
19. Martinon F, Burns K, Tschopp J. The Inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of pro-IL-1b. Mol Cell. 2002; 10: 417-26.
20. Sutterwala FS, Haasken S, Cassel SL. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 2014; 1319 (1): 82-95.
21. Chamaillard M, Girardin SE, Viala J, Philpott DJ. Nods, Nalps and Naip: intracellular regulators of bacterial-induced inflammation. Cell Microbiol. 2003; 5 (9): 581-92.
22. Karin M. Nuclear factor-κB in cancer development and progression How infection and inflammation affect cancer development. Nature. 2006. 441 (7092): 431-6.
23. Kolb R, Liu GH, Janowski AM, Sutterwala FS, Zhang W. Inflammasomes in cancer: A double-edged sword. Protein Cell. 2014; 5 (1): 12-20.
24. Lamkanfi M, Dixit VM. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 2014; 157 (5): 1013-22.
25. Menu P, Vince JE. The NLRP3 inflammasome in health and disease: The good, the bad and the ugly. Clin Exp Immunol. 2011; 166 (1): 1-15.
26. Neves RX, Rosa-Neto JC, Yamashita AS, Matos-Neto EM, Riccardi DMR, Lira FS, Batista Jr ML, Seelaender M. White adipose tissue cells and the progression of cachexia: Inflammatory pathways. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2016;7(2):193-203.
27. Brasil. Ministério da Saúde. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA). Estimativa 2020 - Incidência de câncer no Brasil. Rio de Janeiro: INCA, 2019.
28. Keum NN, Giovannucci E. Global burden of colorectal cancer: emerging trends, risk factors and prevention strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol.
97
2019; 16 (12): 713-32.
29. Dekker E, Tanis PJ, Vleugels JLA, Kasi PM, Wallace MB. Colorectal cancer. Lancet. 2019; 394 (10207): 1467-80.
30. Brasil. Ministério da Saúde. Portaria no 958, de 26 de setembro de 2014. 2014. Disponível em: https://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/sas/2014/prt0958_26_09_2014.html.
31. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 2011; 144 (5): 646-74.
32. Bremnes RM, Al-Shibli K, Donnem T, Sirera R, Al-Saad S, Andersen S, et al. The role of tumor-infiltrating immune cells and chronic inflammation at the tumor site on cancer development, progression, and prognosis: Emphasis on non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2011; 6 (4): 824-33.
33. Grivennikov SI, Karin M. Inflammation and oncogenesis: a vicious connection. Curr Opin Genet Dev. 2010; 20 (1): 65-71.
34. Khatami M. Unresolved inflammation: “Immune tsunami” or erosion of integrity in immune-privileged and immune-responsive tissues and acute and chronic inflammatory diseases or cancer. Expert Opin Biol Ther. 2011; 11 (11): 1419-32.
35. Brigati C, Noonan DM, Albini A, Benelli R. Tumors and inflammatory infiltrates: Friends or foes? Clin Exp Metastasis. 2002; 19 (3): 247-58.
36. Landskron G, De La Fuente M, Thuwajit P, Thuwajit C, Hermoso MA. Chronic inflammation and cytokines in the tumor microenvironment. J Immunol Res. 2014; 2014: 149185.
37. Karin M, Lawrence T, Nizet V. Innate immunity gone awry: Linking microbial infections to chronic inflammation and cancer. Cell. 2006; 124 (4): 823-35.
38. Dvorak HF. Tumors: Wounds that never heal. similarities between tumor stroma generation and wound healing. N Engl J Med. 1986; 315: 1650-9.
39. Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 2010; 140 (6): 883-99.
40. Aoyagi T, Terracina KP, Raza A, Matsubara H, Takabe K. Cancer cachexia, mechanism and treatment. World J Gastrointest Oncol. 2015; 7 (4): 17-29.
41. Tan BHL, Fearon KCH. Cachexia: Prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2008; 11 (4): 400-7.
42. Inui A. Cancer Anorexia-Cachexia Syndrome: Current Issues in Research and
98
Management. CA Cancer J Clin. 2002;52(2):72-91.
43. Katz AM, Katz PB. Diseases of the heart in the works of Hippocrates. Br Hear J. 1962; 24 (3): 257-64.
44. Associação Brasileira de Cuidados Paliativos. Consenso Brasileiro de Caquexia/anorexia. Rev Bras Cuid Paliativos. 2011; 3 (3): 23.
45. Fearon K, Strasser F, Anker SD, Bosaeus I, Bruera E, Fainsinger RL, et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. Lancet Oncol. 2011; 12: 489-95.
46. Farkas J, Haehling S Von, Kalantar-zadeh K, Morley JE, Anker SD, Lainscak M. Cachexia as a major public health problem: frequent, costly, and deadly. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2013; 4: 173-8.
47. Haehling S Von, Anker MS, Anker SD. Prevalence and clinical impact of cachexia in chronic illness in Europe , USA , and Japan: facts and numbers update 2016. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2016; 7: 507-9.
48. Fearon KCH, Barber MD, Moses AG, Ahmedzai SH, Taylor GS, Tisdale MJ, Murray GD. Double-Blind, Placebo-Controlled, Randomized Study of Eicosapentaenoic Acid Diester in Patients With Cancer Cachexia. J Clin Oncol. 2006; 24: 3401-7.
49. Stephens NA, Skipworth RJE, Gallagher IJ, Greig CA, Guttridge DC, Ross JA, Fearon KCH. Evaluating potential biomarkers of cachexia and survival in skeletal muscle of upper gastrointestinal cancer patients. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2015; 6: 53-61.
50. Tsoli M, Robertson G. Cancer cachexia: malignant inflammation, tumorkines, and metabolic mayhem. Trends Endocrinol Metab. 2013; 24 (4): 174-83.
51. Evans WJ, Morley JE, Argilés J, Bales C, Baracos V, Guttridge D, et al. Cachexia: A new definition. Clin Nutr. 2008; 27 (6): 793–9.
52. Tan BHL, Ross JA, Kaasa S, Skorpen F, Fearon KCH. Identification of possible genetic polymorphisms involved in cancer cachexia : a systematic review. J Genet. 2011; 90: 165-77.
53. Seelaender M, Batista M, Lira F, Silverio R, Rossi-fanelli F. Inflammation in cancer cachexia: To resolve or not to resolve (is that the question?). Clin Nutr. 2012; 31: 562-6.
54. Park A, Kim WK, Bae K. Distinction of white, beige and brown adipocytes derived from mesenchymal stem cells. World J Stem Cells. 2014; 6 (1): 33–42.
55. Lee BC, Lee J. Cellular and molecular players in adipose tissue inflammation
99
in the development of obesity-induced insulin resistance. Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis. 2014; 1842 (3): 446-62.
56. Trujillo ME, Scherer PE. Adipose Tissue-Derived Factors : Impact on Health
and Disease. Endocr Rev. 2006; 27 (7): 762-78.
57. Booth A, Magnuson A, Fouts J, Foster M. Adipose tissue, obesity and adipokines: Role in cancer promotion. Horm Mol Biol Clin Investig. 2015; 21 (1): 57–74.
58. Marcadenti A, Abreu-silva EO De, Paulo S. Different adipose tissue depots: Metabolic implications and effects of surgical removal. Endocrinol y Nutr. 2015; 62 (9): 458-64.
59. Cinti S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009; 297: E977-E986.
60. Bjørndal B, Burri L, Staalesen V, Skorve J, Berge RK. Different adipose depots: Their role in the development of metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. J Obes. 2011; 2011: 490650.
61. Tsoli M, Schweiger M, Vanniasinghe AS, Painter A, Zechner R, Clarke S, Robertson G. Depletion of White Adipose Tissue in Cancer Cachexia Syndrome Is Associated with Inflammatory Signaling and Disrupted Circadian Regulation. PLoS One. 2014; 9 (3): e92966.
62. Himbert C, Delphan M, Scherer D, Bowers LW, Hursting S, Ulrich CM. Signals from the adipose microenvironment and the obesity-cancer link - a systematic review. Cancer Prev Res. 2017; 10 (9): 494-506.
63. Arner P, Spalding KL, Coelho M, Oliveira T, Fernandes R, Cannon B, et al. a Função Endócrina Do Tecido Adiposo. Rev Fac Ciênc Méd Sorocaba. 2014; 16 (1): 111-20.
64. Ibrahim MM. Subcutaneous and visceral adipose tissue: Structural and functional differences. Obes Rev. 2010; 11 (1): 11-8.
65. Ebadi M, Martin L, Ghosh S, Field CJ, Lehner R, Baracos VE, Mazurak VC. Subcutaneous adiposity is an independent predictor of mortality in cancer patients. Br J Cancer. 2017; 117 (1): 148-55.
66. Catalán V, Gómez-Ambrosi J, Rodríguez A, Frühbeck G. Adipose tissue immunity and cancer. Front Physiol. 2013; 4: 1-13.
67. Batista Jr ML, Henriques FS, Neves RX, Olivan MR, Matos-Neto EM, Alcântara PSM, Maximiano LF, Otoch JP, Alves MJ, Seelaender M. Cachexia-associated adipose tissue morphological rearrangement in gastrointestinal cancer patients. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2016; 7 (1): 37-47.
100
68. Deng T, Lyon CJ, Bergin S, Caligiuri MA, Hsueh WA. Obesity, Inflammation, and Cancer. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2016; 11: 421-49.
69. Seelaender MCL, Batista Jr ML. Adipose tissue inflammation and cancer cachexia: The role of steroid hormones. Horm Mol Biol Clin Investig. 2014; 17 (1): 5-12.
70. Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 2006; 444 (7121): 860-7.
71. Galic S, Oakhill JS, Steinberg GR. Adipose tissue as an endocrine organ. Mol Cell Endocrinol. 2010; 316: 129-39.
72. Larsen GL, Henson PM. Mediators of Inflammation. Annu Rev Immunol. 1983; 1: 335-59.
73. Aran D, Lasry A, Zinger A, Biton M, Pikarsky E, Hellman A, Butte AT, Ben-Neriah Y. Widespread parainflammation in human cancer. Genome Biol. 2016; 17 (1): 1-14.
74. Medzhitov R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 2008; 454 (7203): 428-35.
75. Li C, Xu MM, Wang K, Adler AJ, Vella AT, Zhou B. Macrophage polarization and meta-inflammation. Transl Res. 2018; 191: 29-44.
76. Divella R, De Luca R, Abbate I, Naglieri E, Daniele A. Obesity and cancer: The role of adipose tissue and adipo-cytokines-induced chronic inflammation. J Cancer. 2016; 7 (15): 2346-59.
77. Hotamisligil GS, Shargill NS, Spiegelman BM. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: Direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 1993; 259 (5091): 87-91.
78. Minihane AM, Vinoy S, Russell WR, Baka A, Roche HM, Tuohy KM, Teeling JL, Blaak EE, Fenech M, Vauzour D, McArdle HJ, Kremer BH, Sterkman L, Vafeiadou K, Benedetti MM, Williams CM, Calder PC. Low-grade inflammation, diet composition and health: Current research evidence and its translation. Br J Nutr. 2015; 114 (7): 999-1012.
79. Batista ML, Olivan M, Alcântara PSM, Sandoval R, Peres SB, Neves RX, Silverio R, Maximiano LF, Otoch JP, Seelaender M. Adipose tissue-derived factors as potential biomarkers in cachectic cancer patients. Cytokine. 2013; 61 (2): 532-9.
80. Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante AW Jr. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest. 2003;112 (12): 1796-808.
101
81. Hursting SD, Dunlap SM. Obesity, metabolic dysregulation, and cancer: A growing concern and an inflammatory (and microenvironmental) issue. Ann N Y Acad Sci. 2012; 1271 (1): 82-7.
82. Camargo RG, Riccardi DM, Ribeiro HQ, Carnevali LC Jr, Matos-Neto EM,
Enjiu L, Neves RX, Lima JD, Figuerêdo RG, de Alcântara PS, Maximiano L, Otoch J, Batista M Jr, Püschel G, Seelaender M. NF-κBp65 and Expression of Its Pro-Inflammatory Target Genes Are Upregulated in the Subcutaneous Adipose Tissue of Cachectic Cancer Patients. Nutrients. 2015; 7 (6): 4465-79.
83. Ebadi M, Mazurak VC. Evidence and mechanisms of fat depletion in cancer. Nutrients. 2014; 6 (11): 5280-97.
84. Neto NIP, Murari ASP, Oyama LM, Otoch JP, Alcântara PSM, Tokeshi F, Figuerêdo RG, Alves MJ, Lima JD, Matos-Neto EM, Seelaender M, Nascimento CMO. Peritumoural adipose tissue pro-inflammatory cytokines are associated with tumoural growth factors in cancer cachexia patients. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2018; 9 (6): 1101-8.
85. Paramel G V., Sirsjö A, Fransén K. Role of Genetic Alterations in the NLRP3 and CARD8 Genes in Health and Disease. Mediators Inflamm. 2015; 2015: 1-10.
86. Hansen JD, Vojtech LN, Laing KJ. Sensing disease and danger: A survey of vertebrate PRRs and their origins. Dev Comp Immunol. 2011; 35 (9): 886-97.
87. Choi JSA, Ryter SW. Inflammasomes: Molecular Regulation and Implications for Metabolic and Cognitive Diseases. Mol Cells. 2014; 37 (6): 1-8.
88. Schroder K, Tschopp J. The Inflammasomes. Cell. 2010; 140 (6): 821-32.
89. Chen G, Shaw MH, Kim Y-G, Nuñez G. NOD-Like Receptors: Role in Innate Immunity and Inflammatory Disease. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2009; 4 (1): 365-98.
90. Takeuchi O, Akira S. Pattern Recognition Receptors and Inflammation. Cell. 2010; 140 (6): 805-20.
91. Meylan E, Tschopp J, Karin M. Intracellular pattern recognition receptors in the host response. Nature. 2006; 442 (7098): 39-44.
92. Jeannin P, Jaillon S, Delneste Y. Pattern recognition receptors in the immune response against dying cells. Curr Opin Immunol. 2008; 20 (5): 530-7.
93. Ciraci C, Janczy JR, Sutterwala FS, Cassel SL. Control of innate and adaptive immunity by the inflammasome. Microbes Infect. 2012; 14 (14): 1263-70.
94. Tian X, Pascal G, Monget P. Evolution and functional divergence of NLRP
102
genes in mammalian reproductive systems. BMC Evol Biol. 2009; 9 (1): 1-13.
95. Carneiro LAM, Travassos LH, Girardin SE. Nod-like receptors in innate immunity and inflammatory diseases. Ann Med. 2007; 39 (8): 581-93.
96. Kinoshita T, Imamura R, Kushiyama H, Suda T. NLRP3 Mediates NF-kB
activation and cytokine induction in microbially induced and sterile inflammation. PLoS One. 2015; 10 (3): 1-15.
97. Koenen TB, Stienstra R, Van Tits LJ, Joosten LAB, Van Velzen JF, Hijmans A, et al. The inflammasome and caspase-1 activation: A new mechanism underlying increased inflammatory activity in human visceral adipose tissue. Endocrinology. 2011; 152 (10): 3769-78.
98. Man SM, Hopkins LJ, Nugent E, Cox S, Glück IM, Tourlomousis P, et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111 (20): 7403-8.
99. Yehuda-Shnaidman E, Schwartz B. Mechanisms linking obesity, inflammation and altered metabolism to colon carcinogenesis. Obes Rev. 2012; 13 (12): 1083-95.
100. Rakoff-Nahoum S, Medzhitov R. Toll-like receptors and cancer. Nat Rev Cancer. 2009; 9 (1): 57-63.
101. Rathinam VAK, Chan FKM. Inflammasome, Inflammation, and Tissue Homeostasis. Trends Mol Med. 2018; 24 (3): 304-18.
102. Cildir G, Low KC, Tergaonkar V. Noncanonical NF-κB Signaling in Health and Disease. Trends Mol Med. 2016; 22 (5): 414-29.
103. Hoesel B, Schmid JA. The complexity of NF-κB signaling in inflammation and cancer. Mol Cancer. 2013; 12: 86.
104. Giuliani C, Bucci I, Napolitano G. The role of the transcription factor Nuclear Factor-kappa B in thyroid autoimmunity and cancer. Front Endocrinol (Lausanne). 2018; 9 (AUG): 1-8.
105. Lin L, Wu C, Hu K. Tissue Plasminogen Activator Activates NF-κB Through a Pathway Involving Annexin A2 CD11b and Integrin-Linked Kinase. J Am Soc Nephrol. 2012; 23: 1329-38.
106. Krishnan SM, Sobey CG, Latz E, Mansell A, Drummond GR. IL-1β and IL-18: Inflammatory markers or mediators of hypertension? Br J Pharmacol. 2014; 171 (24): 5589-602.
107. Wolf BB, Green DR. Suicidal tendencies: Apoptotic cell death by caspase family proteinases. J Biol Chem. 1999; 274 (29): 20049-52.
103
108. Dinarello CA. The IL-1 family and inflammatory diseases. Clin Exp
Rheumatol. 2002; 20 (5 SUPPL. 27): 1-13.
109. Mathur A, Hayward JA, Man SM. Molecular mechanisms of inflammasome signaling. J Leukoc Biol. 2018; 103 (2): 233-57.
110. Sheedy FJ, Grebe A, Rayner KJ, Kalantari P, Ramkhelawon B, Carpenter SB, et al. CD36 coordinates NLRP3 inflammasome activation by facilitating intracellular nucleation of soluble ligands into particulate ligands in sterile inflammation. Nat Immunol. 2013; 14 (8): 812-20.
111. Heni M, Müssig K, MacHicao F, MacHann J, Schick F, Claussen CD, et al. Variants in the CD36 gene locus determine whole-body adiposity, but have no independent effect on insulin sensitivity. Obesity. 2011; 19 (5): 1004-9.
112. Wang J, Li Y. CD36 tango in cancer: Signaling pathways and functions. Theranostics. 2019; 9 (17): 4893-908.
113. Febbraio M, Abumrad NA, Hajjar DP, Sharma K, Cheng W, Pearce SFA, et al. A null mutation in murine CD36 reveals an important role in fatty acid and lipoprotein metabolism. J Biol Chem. 1999; 274 (27): 19055-62.
114. Man SM, Karki R, Kanneganti TD. Molecular mechanisms and functions of pyroptosis, inflammatory caspases and inflammasomes in infectious diseases. Immunol Rev. 2017; 277 (1): 61-75.
115. Gerner RR, Wieser V, Moschen AR, Tilg H. Metabolic inflammation: Role of cytokines in the crosstalk between adipose tissue and liver. Can J Physiol Pharmacol. 2013; 91 (11): 867-72.
116. Apte RN, Voronov E. Interleukin-1 - a major pleiotropic cytokine in tumor–host interactions. Semin Cancer Biol. 2002; 12: 277-90.
117. Dinarello CA. Biologic basis for interleukin-1 in disease. J Am Soc Hematol. 1996; 87 (6): 2095-147.
118. Stylianou E, Saklatvala J. Interleukin-1. Int J Biochem Cell Biol. 1998; 30 (10): 1075-9.
119. Carta S, Lavieri R, Rubartelli A. Different members of the IL-1 family come out in different ways: DAMPs vs. cytokines? Front Immunol. 2013; 4: 1-9.
120. Garlanda C, Dinarello CA, Mantovani A. The Interleukin-1 Family: Back to the Future. Immunity. 2013; 39 (6): 1003-18.
121. Dinarello CA. Interleukin-1 and the Pathogenesis of the Acute-Phase Response. N Engl J Med. 1984; 311 (22): 1413-8.
104
122. Gao D, Madi M, Ding C, Fok M, Steele T, Ford C, et al. Interleukin-1β Mediates Macrophage-Induced Impairment of Insulin Signaling in Human Primary Adipocytes.pdf. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2014; 307: E289-304.
123. Lamkanfi M. Emerging inflammasome effector mechanisms. Nat Rev Immunol. 2011; 11 (3): 213-20.
124. Dinarello CA. Interleukin-18 and the Pathogenesis of Inflammatory Diseases. Semin Nephrol. 2007; 27 (1): 98-114.
125. Drexler SK, Yazdi AS. Complex roles of inflammasomes in carcinogenesis. Cancer J (United States). 2013; 19 (6): 468-72.
126. Ahechu P, Zozaya G, Martí P, Hernández-Lizoáin JL, Baixauli J, Unamuno X, et al. NLRP3 Inflammasome: A Possible Link Between Obesity-Associated Low-Grade Chronic Inflammation and Colorectal Cancer Development. Front Immunol. 2018; 9: 2918.
127. Zhang J, Fu S, Sun S, Li Z, Guo B. Inflammasome activation has an important role in the development of spontaneous colitis. Mucosal Immunol. 2014; 7 (5): 1139-50.
128. Hirota SA, Ng J, Lueng A, Khajah M, Parhar K, Li Y, et al. NLRP3 inflammasome plays a key role in the regulation of intestinal homeostasis. Inflamm Bowel Dis. 2011; 17 (6): 1359-72.
129. Karki R, Kanneganti TD. Diverging inflammasome signals in tumorigenesis and potential targeting. Nat Rev Cancer. 2019; 19 (4): 197-214.
130. Villani AC, Lemire M, Fortin G, Louis E, Silverberg MS, Collette C, et al. Common variants in the NLRP3 region contribute to Crohn’s disease susceptibility. Nat Genet. 2009; 41 (1): 71-6.
131. Wang B, Li H, Wang X, Zhu X. The association of aberrant expression of NLRP3 and p-S6K1 in colorectal cancer. Pathol Res Pract. 2020; 216 (1): 152737.
132. Zaki MH, Vogel P, Body-Malapel M, Lamkanfi M, Kanneganti T-D. IL-18 Production Downstream of the Nlrp3 Inflammasome Confers Protection against Colorectal Tumor Formation. J Immunol. 2010; 185 (8): 4912-20.
133. Zaki MH, Boyd KL, Vogel P, Kastan MB, Lamkanfi M, Kanneganti TD. The NLRP3 Inflammasome Protects against Loss of Epithelial Integrity and Mortality during Experimental Colitis. Immunity. 2010; 32 (3): 379-91.
134. Dupaul-Chicoine J, Yeretssian G, Doiron K, Bergstrom KSB, McIntire CR, LeBlanc PM, et al. Control of Intestinal Homeostasis, Colitis, and Colitis-Associated Colorectal Cancer by the Inflammatory Caspases. Immunity.
105
2010; 32 (3): 367-78.
135. Becker C, Watson AJ, Neurath MF. Complex roles of caspases in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2013; 144 (2): 283-93.
136. Li Y, Wang L, Pappan L, Galliher-Beckley A, Shi J. IL-1β promotes
stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 2012; 11: 1-13.
137. Lurje G, Hendifar AE, Schultheis AM, Pohl A, Husain H, Yang D, et al. Polymorphisms in interleukin 1 beta and interleukin 1 receptor antagonist associated with tumor recurrence in stage II colon cancer. Pharmacogenet Genomics. 2009; 19 (2): 95-102.
138. Karki R, Man SM, Kanneganti TD. Inflammasomes and Cancer. Physiol Behav. 2017; 5 (2): 94-9.
139. Hauner H, Petruschke T, Russ M, Röhrig K, Eckel J. Effects of tumour necrosis factor alpha (TNFα) on glucose transport and lipid metabolism of newly-differentiated human fat cells in cell culture. Diabetologia. 1995; 38 (7): 764-71.
140. Vatier C, Kadiri S, Muscat A, Chapron C, Capeau J, Antoine B. Visceral and subcutaneous adipose tissue from lean women respond differently to lipopolysaccharide-induced alteration of inflammation and glyceroneogenesis. Nutr Diabetes. 2012; 2: e51-7.
141. Szalowska E, Dijkstra M, Elferink MG, Weening D, De Vries M, Bruinenberg M, et al. Comparative analysis of the human hepatic and adipose tissue transcriptomes during LPS-induced inflammation leads to the identification of differential biological pathways and candidate biomarkers. BMC Med Genomics. 2011; 4: 71.
142. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 2001; 25 (4): 402-8.
143. Baracos VE, Martin L, Korc M, Guttridge DC, Fearon KCH. Cancer-associated cachexia. Nat Rev Dis Prim. 2018; 4: 17105.
144. Anderson LJ, Albrecht ED, Garcia JM. Update on Management of Cancer-Related Cachexia. Curr Oncol Rep. 2017; 19 (1): 1-11.
145. Karin M, Bogut A, Hojsak I, Babić E, Volarić M, Bevanda M. Nutritional status and its effect on complications in patients with colorectal cancer. Wien Klin Wochenschr. 2020; 132 (15–16): 431-7.
146. Anker MS, Holcomb R, Muscaritoli M, von Haehling S, Haverkamp W, Jatoi
106
A, et al. Orphan disease status of cancer cachexia in the USA and in the European Union: a systematic review. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2019; 10 (1): 22-34.
147. Dev R. Measuring cachexia - diagnostic criteria. Ann Palliat Med. 2019; 8 (2): 24-32.
148. World Cancer Research Fund/American Institute of Cancer Research.
Diet, nutrition, physical activity and colorectal cancer. Contin Updat Proj [Internet]. 2018. Disponível em: dietandcancerreport.org.
149. Patel M, McSorley ST, Park JH, Roxburgh CSD, Edwards J, Horgan PG, et al. The relationship between right-sided tumour location, tumour microenvironment, systemic inflammation, adjuvant therapy and survival in patients undergoing surgery for colon and rectal cancer. Br J Cancer. 2018; 118 (5): 705-12.
150. Lim DR, Kuk JK, Kim T, Shin EJ. Comparison of oncological outcomes of right-sided colon cancer versus left-sided colon cancer after curative resection. Med (United States). 2017; 96 (42): 1-7.
151. Qin Q, Yang L, Sun Y-K, Ying J-M, Song Y, Zhang W, et al. Comparison of 627 patients with right- and left-sided colon cancer in China: Differences in clinicopathology, recurrence, and survival. Chronic Dis Transl Med. 2017; 3 (1): 51-9.
152. Fearon KCH, Glass DJ, Guttridge DC. Cancer cachexia: Mediators, signaling, and metabolic pathways. Cell Metab. 2012; 16 (2): 153-66.
153. Matos-Neto EM, Lima JDCC, de Pereira WO, Figuerêdo RG, Riccardi DM do. R, Radloff K, et al. Systemic inflammation in cachexia - Is tumor cytokine expression profile the culprit? Front Immunol. 2015; 6: 1–11.
154. Al-Zhoughbi W, Huang J, Paramasivan GS, Till H, Pichler M, Guertl-Lackner B, et al. Tumor macroenvironment and metabolism. Semin Oncol. 2014; 41 (2): 281-95.
155. Riccardi DM. Perfil Lipídico e Inflamação Sistêmica na Caquexia Associada ao Câncer [Dissertação]. São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2015.
156. Matos-Neto EM. Treinamento físico: estratégia eficaz e segura de redução da inflamação em pacientes com caquexia associada ao câncer [Tese]. São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2016.
157. Radloff K. The role of the fatty acid profile and its modulation by cytokines in the systemic inflammation in cancer cachexia [Tese]. São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2018.
107
158. Shrotriya S, Walsh D, Nowacki AS, Lorton C, Aktas A, Hullihen B, et al. Serum c-reactive protein is an important and powerful prognostic biomarker in most adult solid tumors. PLoS One. 2018; 13 (8): 1-12.
159. Amano K, Maeda I, Morita T, Baba M, Miura T, Hama T, et al. C-reactive protein, symptoms and activity of daily living in patients with advanced cancer receiving palliative care. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2017; 8 (3): 457-65.
160. Egenvall M, Mörner M, Martling A, Gunnarsson U. Prediction of Outcome
after Curative Surgery for Colorectal Cancer: Preoperative Haemoglobin, CRP and Albumin. Color Dis. 2018; 20 (1): 26-34.
161. Santosa S, Swain J, Tchkonia T, Kirkland JL, Jensen MD. Inflammatory characteristics of adipose tissue collected by surgical excision vs needle aspiration. Int J Obes. 2015; 39 (5): 874-6.
162. Wronska A, Kmiec Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol. 2012; 205 (2): 194-208.
163. Zoico E, Rizzatti V, Darra E, Budui SL, Franceschetti G, Vinante F, et al. Morphological and Functional Changes in the Peritumoral Adipose Tissue of Colorectal Cancer Patients. Obesity. 2017; 25: S87-94.
164. Kopp A, Buechler C, Neumeier M, Weigert J, Aslanidis C, Schölmerich J, et al. Innate immunity and adipocyte function: Ligand-specific activation of multiple toll-like receptors modulates cytokine, adipokine, and chemokine secretion in adipocytes. Obesity. 2009; 17 (4): 648-56.
165. Pietka TA, Schappe T, Conte C, Fabbrini E, Patterson BW, Klein S, et al. Adipose and muscle tissue profile of CD36 transcripts in obese subjects highlights the role of CD36 in fatty acid homeostasis and insulin resistance. Diabetes Care. 2014; 37 (7): 1990-7.
![Análise da expressão do inflamassoma em melanoma cutâneo e nevo … · 2018-10-24 · Análise da expressão do inflamassoma em melanoma cutâneo e nevo melanocítico [tese]. São](https://img.document.onl/doc/110x75/5f7af9310504e2794d27564e/anlise-da-expresso-do-inflamassoma-em-melanoma-cutneo-e-nevo-2018-10-24.jpg)
