Controle de Dopagem no Esporte:Desafios Analíticos

1º Congresso Sul de Toxicologia Clínico-LaboratorialToxSul 2008

Prof. Henrique Marcelo Gualberto PereiraDepartamento de Química Analítica

LAB DOP - LADETEC / IQ – UFRJhenriquemarcelo@iq.ufrj.br

www.iq.ufrj.br/ladetec2008

Resumo da apresentação

- Controle de dopagem & WADA

- Controle de dopagem no Brasil

- Desafios analíticos- Detecção em ng/mL

- Hormônios peptídicos- Designer steroids

- Perfil endógeno & IRMS- Logística e acreditações

Controle de dopagem no esporte

19671967

19681968 Olimpíadas do México – Começam os exames de controle de dopagem.19881988

19991999

“Uso de substâncias, ou método, potencialmente perigosos à saúde do atleta e/ou capazes de aprimorar seu desempenho.”

Lista de substâncias proibidas

The World Anti-doping CodeThe 2008 Prohibited List

International Standard

S1. ANABOLIC AGENTSS2. HORMONES AND RELATED SUBSTANCESS3. BETA-2 AGONISTSS4 AGENTS WITH ANTI-ESTROGENIC ACTIVITYS5. DIURETICS AND OTHER MASKING AGENTSS6 STIMULANTSS7 NARCOTICSS8 CANNABINOIDSS9 GLUCOCORTICOSTEROIDSP.2 BETA-BLOCKERS

WADA – Laboratórios acreditados

LAB DOP / IQ-UFRJ

Equador

http://www.wada-ama.org/

Desafios analíticos

- Hormônios peptídicos

- Designer steroids

- Perfil endógeno & IRMS- Logística e

acreditações

- Detecção em ng/mL

- Doping genético

- Novas substâncias

- Número de substâncias

- Novos métodos

Detecção de baixa concentração (ng/mL).

- Esteróides anabolizantes.

Limite Mínimo de Desempenho1 – 10 ng/mL

3’- hidroxi-estanozolol

N

N

OH

HO

H

Glicocorticosteróide endógeno

Resultado por CG-EM (Q)

Detecção de baixa concentração (ng/mL).

0,2 ng/mL

N

N

CH3

CH3OH

CH3

H

H

HO

Condições de detecção

Íon pai m/z 545

Íons filhos m/z 455 (100%), 387(5%)

Corrente 50 uAmps

Energia de excitação 240,1 m/z

Tipo de onda Ressonante

Amplitude (volts) 1,0

Resultado - POS-QC - LAB DOP – LADETEC (PAN 2007).

Detecção por CG-EM (ITD)

Detecção de baixa concentração (ng/mL).

HO

OH

H

Epimetendiol

Urina fortificada em 2 ng/mLCG-EM x CG-EMAR

Resultados de Schänzer et. al.

Detecção de baixa concentração (ng/mL).

Espectrometria de massasde alta resolução

Conclusão: Necessidade de té cnicas mais sofisticadas e caras

para TRIAGEM.

- CG-EM (ITD)- CG-EMAR- CLAE-EM2

Aumento de custo com

estrutura e mão de obra

qualificada.

Detecção de baixa concentração (ng/mL).

- Eritropoietina

- hCG & LH

- hGH

- ACTH

Hormônios peptídicos

Hormônios peptídicos

Focalização isoelétrica, double blotting e revelação por Químioluminescencia.Presença de rEPO e NESP. Resultado – LAB DOP – LADETEC (PAN 2007).

rEPO e NESP

Hormônios peptídicos

Hoje: Ausência de métodos baseados em espectrometria de massas.

EPO - Método longo e caro. Porém, inequívocos.

hCG, LH, hGH – Imunoensáio. Inequívocos?

Hormônios peptídicos

Conclusão: Ausência de mé todos por espectrometria de massas

preconizam grande investimento em pesquisa.

Imunoensáios (qualificação inequívoca?).

Métodos longos e caros (porém, inequí vocos).

Aumento de custo com

estrutura e não de obra

qualificada.

Designer steroids

Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM)

Monitoramento Seletivo de Íons = Target compounds

Madol (2005)

Norboletona (2002)

THG (2004)

Don H. CatlinDepartament of Molecular & Medical PharmacologyUCLA - EUA

O

OH

OH

O

OH

Designer steroids

O

OH

Testosterona

Conclusão: Estratégia Target Compounds não atende mais a

todas as necessidades do controle

de dopagem.

Necessidades de estratégias abrangentes na

busca de compostos desconhecidos.

Designer steroids

Caso BalcoEscândalo de doping

Victor ConteFundador do laborat ório Balco

Alternativas: Métodos abrangentes em CL-EM n.

Cromatografia gasosa bidimencional

abrangente.Sistema CG x CG - TOF.

Grande resolução+

Grade velocidade de aquisição

=Superfície cromatográfica

Designer steroids

H O

O

H O

O H

O

O H

O

O D H E A

Andros tened io l

O

O H

H

Tes tos te ro na

An dro s ten ed io na

5a e 5b -D H T

H O

O H

H

H

O

H Oandros te ro na ee tioco lano lon a

5a e 5b -and ro s taned io l

H O C o les te ro l

17

2022 23

2425

A B

C DPerfil endógeno & IRMS

Perfil endógeno & IRMS

Esteróides anabolizantes endógenos

Número de casos

% de cada fármaco

dentro da classe

Testosterona 1124 57,2

Precursores da testosterona

13 0,7

Prasterona (DHEA) 11 0,6

Etiocolanolona 3 0,2

Androsterona 1 0,1

RAA WADA - 2006

Perfil endógeno & IRMS

Perfil endógeno – Complexidade dos perfis endógenos

torna, por vezes, a interpretação

extremamente complexa.Necessidade de técnica complementar de

caráter inequívoco para falso-positivos.

Cromatografia gasosa acoplada a

forno

de combustão acoplado

espectrômetria

massas por razão isotópica.

REPORTING AND EVALUATION GUIDANCE FORTESTOSTERONE, EPITESTOSTERONE, T/E RATIO AND OTHER ENDOGENOUS STEROIDSWADA Technical Document – TD2004EAAS

i) A e/ou Etio (G) > 10.000 ng/mL.

ii) T e/ou Epit (G) > 200 ng/mL.

iii) T/Epit superior a 4.

iv) DHEA (G) > 100 ng/mL.

Recomenda-se IRMShttp://www.wada-ama.org

CGAR/C/EMRI (IRMS) Resultado PAN-2007

Testosterona / precursor de testosterona

T/E = 5.2

RAA resultou na retirada da medalha de bronze e diploma no levantamento de peso de um atleta brasileiro.

Esteróide endógeno δδδδ 13C/12C [per mil]

Androsterona acetato - 25.45

Etiocolanolona acetato -24.90

5αααα-Androstanediol diacetato -31.42

5ββββ-Androstanediol diacetato - 25.51

Pregnanediol diacetato -22.25

14 amostras com T/E > 4 (maior = 8.2), todas negati vas por GC-C- IRMS.

Resultado - LAB DOP – LADETEC (PAN 2007).

Acreditações e Logística

Logística e Acreditações

Logístic

a •Equipe altamente

qualificada.

• Estrutura sólida.

• Apoio institucional

continuo.

• Apoio governamental

Conclusões

No Brasil:

- Controle de dopagem no LAB DOP – LADETEC desde

1989.

- Acreditação junto a WADA desde 2000.

- Predominantemente amostras de futebol (< 80%).

- No Brasil, o futebol é o esporte mais “limpo” (> 1% de

RRA).

Média inferior a internacional = trabalho de preven ção

de 20 anosControle de dopagem (WADA) = Experiência +

Investimentos

Controle de dopagem

(WADA)

=

Experiência + investimentos

Conclusões

Conclusões

No Brasil:

- PAN 2007 – controle dentro dos critérios da

WADA.

- RAA de difícil detecção:

Testosterona / precursores por IRMS

Boldenona por IRMS

NESP

- Duplos cego da WADA durante os Jogos

No

Brasil:

Conclusões / Preocupações

- A ausência da estrutura necessária e

apoio

institucional / governamental colocam

em risco a atividade de controle de

dopagem.

LAB DOP – LADETEC / IQ - UFRJ

AGRADECIMENTOS

Professores, alunos, técnicos, estagiários, administrativos dos laboratórios, IQ e instituições

colaboradoras

Patrocinadores e clientes preferenciais

THE PAN-AMERICAN TEAM

Muito obrigado!

LADETEC – IQ/UFRJ