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Caroline De Paula Lopes
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CDTec
GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA MICROBIANA I
CONTROLE DO CRESCIMENTO
MICROBIANO – MÉTODOS FÍSICOS
E QUÍMICOS
O controle dos microrganismos iniciou-se há cerca de 100 anos:
◦ Estudo de Pasteur;
◦ Joseph Lister:
Industrial
Laboratorial
Hospitalar....
A escolha do método depende do objetivo, do tipo de material e do nível de controle que se deseja obter.
Controle de microrganismos
= Redução da carga microbiana
Microbiologia – MORTE – Perda da capacidade reprodutiva
Parede Celular
Membrana Citoplasmática
Enzimas e Proteínas
DNA e RNA
Você sabe o que é....
Desinfecção?
Esterilização?
Sanitização?Assepsia?
Limpeza?
Bacteriostase?
Germicida?
ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a
destruição total de todas as formas de
vida de um material ou ambiente,
através de métodos físicos ou químicos.
DESINFECÇÃO: eliminação parcial dos microrganismos, mata as formas vegetativas, mas não necessariamente as esporuladas de microorganismos patogênicos presentes num material inanimado.
Métodos: substâncias químicas (desinfetantes), radiação UV, água fervente ou vapor.
◦ SANITIZAÇÃO: Utiliza um agente, normalmentequímico, em utensílios e equipamentos, quereduz a população microbiana até níveiscompatíveis com às exigências da saúde pública
◦ ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar oretorno da contaminação a um objeto, superfícieou local.
◦ ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos,como pele e mucosas.
◦ LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos
de desinfecção ou esterilização.
◦ BACTERIOSTASE: inibição do crescimento, pelainibição da síntese protéica, entretanto a bactérianão está morta.
◦ BACTERICIDA: MORTE CELULAR
◦ BACTERIOLÍTICO: morte celular por lise
Inibição da síntese de parede celular
Tamanho da população; Intensidade ou concentração do
agente microbiocida; Tempo de exposição ao agente; Temperatura; Natureza do material contendo
os microrganismos; Características dos
microrganismos; Condições ambientais (pH,
concentração de carboidratos,presença de matéria orgânica).
PARA OBTER MAIOR EFICIÊNCIA DO CONTROLE MICROBIANO, DEVE-SE LEVAR EM
CONSIDERAÇÃO ALGUNS PRINCÍPIOS BÁSICOS, OS MESMOS DEVEM SER APLICÁVEIS
A TODOS OS MÉTODOS.
1- Avaliar susceptibilidade das espécies paraesse agente
2- O contato do agente com o microrganismodeve ser facilitado
3- O tempo de exposição adequado, entre oagente escolhido e o microrganismo parapermitir a ação necessária.
Tempo de redução decimal =VALOR D
1 Físicos:- Calor (úmido, seco, pasteurização)- Filtração;- Baixas temperaturas;- Alta pressão;- Dessecação- Pressão osmótica- Radiação
2 Químicos:
Desinfetantes e/ou anti-sépticos:
- halogênios (cloro, iodo)
- álcoois (etanol 70%, isopropanol)
- fenóis e bifenóis (o-fenilfenol, tricosan)
- biguanidas (clorexidina)
- agentes tensoativos (sabões e detergentes)
- Quaternários de amônio
- Metais (Ag, Hg, Cu)
- Conservantes de alimentos
- Antibióticos (nisina)
- Esterilizantes gasosos (oxirano)
- Aldeídos (glutaraldeído)
CONTROLE FÍSICO
Calor (úmido, seco, pasteurização)
- Mecanismos de ação: desnaturação das proteínas (enzimas)
- Fervura: destrói formas vegetativas de bactérias patogênicas, fungos e grandes partes de vírus em 10 minutos( vírus hepatite e endosporos resistem por mais tempo)
- Autoclave: maior temperatura devido a pressão (esterilização efetiva)
Métodos físicos de controle Microbiano
Métodos físicos de controle Microbiano
Pasteurização:
- Objetivo: eliminar microrganismos patogênicos, prolongar a qualidade, utilizado em alimentos perecíveis (leite, iogurte, sorvete, cerveja)
- Tempo de pasteurização difere: viscosidade, teor de gorduras ....
Métodos físicos de controle Microbiano
Pasteurização:
Métodos físicos de controle Microbiano
Saída dos tubos Entrada da câmara
Saída da câmara
Entrada dos tubos
septos
Lenta (62-65ºC – 30 minutos)
Rápida (72-75ºC/15 a 20
segundos)
UHT (135-145ºC/2 a 5 segundos)
Métodos físicos de controle Microbiano
Aplicado principalmente a instrumentos e materiais sólidos (por exemplo vidraria)
Requer uma temperatura e um tempo maior (170-180°C/algumas horas)
Obtido em fornos de esterilização (Forno de Pasteur)
Métodos físicos de controle Microbiano
Testes utilizados para monitorar e validarprocessos, garantindo a segurança do métodos,podem ser;
Químicos – fitas termossensíveis
Biológicos-consiste numa populaçãopadronizada de microrganismos viáveis(usualmente esporulados) conhecidos comoresistentes ao modo de esterilização a sermonitorizado.
Métodos físicos de controle Microbiano
Recipiente de plástico flexível
Ampola quebrável (de vidro)
com meio de cultura estéril
Papel de filtro com esporos
Controle do
processo de
esterilização em
autoclave
•Cor inalterada
•pH inalterado
•Esporos mortos
•Não há germinação
•Cor alterada
•pH alterado
•Esporos vivos
•Há germinação
Funcionamento da
autoclave normal
Funcionamento da
autoclave comprometido
Métodos físicos de controle Microbiano
Mecanismo de ação: remoção mecânica
Soluções sensíveis ao calor, ar;
Filtros de membrana: ésteres de celulose, polímeros plásticos◦ 0,22μm e 0,45μm para bactérias.
Bactéria retida num filtro tipo Isopore
Métodos físicos de controle Microbiano
Métodos físicos de controle Microbiano
Capelas de fluxo laminar
Filtros de ar de alta
eficiencia (90%)
Membranas de acetato
de celulose
Métodos físicos de controle Microbiano
Mecanismo de ação: interrupção do metabolismo bacteriano.
◦ Liofilização: água sublimada do interior da célula. Os MO permanecem viáveis, porem latentes com a ausência de água.
Métodos físicos de controle Microbiano
Refrigeração comum: bacteriostático 0-7ºC; (exceção bactérias psicrotróficas)
Congelamento -20ºC; ◦ Lento: bactérias em estado latente
◦ Rápido: mais letal, ciclos de congelamento e descongelamento são utilizados
Nitrogênio líquido -179ºC.
Métodos físicos de controle Microbiano
Comprimento de onda
Intensidade
Distância da fonte
Duração
Métodos físicos de controle Microbiano
Ionizantes: Raios gama, raios X e feixes de elétrons de alta energia.
◦ Mecanismo de ação: os raios ionizam a água, formando radicais hidroxila altamente reativos.
Métodos físicos de controle Microbiano
Não-ionizantes: radiação não muito penetrante: UV (260nm)
Mecanismo de ação: alteram o DNA pela formação de dímeros.
C A T C A
Métodos físicos de controle Microbiano
Fortes e curtos pulsos elétricos;
Ação sobre bactérias: ruptura da membrana celular, formação de poros na membrana.
Métodos físicos de controle Microbiano
Aumento da concentração de sais ouaçúcares;
Mecanismo de ação: provoca a saída de águacondensando o citoplasma e retraindo amembrana.
Ex???????
Métodos físicos de controle Microbiano
CONTROLE QUÍMICO
Capacidade de penetração na matéria orgânica sem perder sua ação germicida e ausência de ação corrosiva.
Desinfetantes:
Não ser irritante, não interferir no processo de
cicatrização e não ser absorvido pela pele
Anti-sépticos:
Métodos químicos de controle Microbiano
1- Possuir alta eficiência germicida,
2- Ser de efeito rápido, ter amplo espectroantimicrobiano e ação prolongada.
3- Apresentar estabilidade química, devendoser solúvel em água e nos líquidos orgânicos;
4- Ser inodoro ou ter odor agradável;
5- Incolor;
6- Não produzir manchas.
Métodos químicos de controle Microbiano
Alvo/Efeito de alguns agentes químicos
•Parede celular
•Membrana plasmática
•Ligação cruzada entre macromoléculas
•Intercalação de DNA
•Interação com grupos tióis (sulfidrilas)
•Oxidação
SH
Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas e dissolução de lipídios de membranas.
Bactericida;
Não age sobre endósporos e vírus não envelopados.
Álcool etílico: 70%
Álcool isopropílico: puro é superior ao etílico.
Métodos químicos de controle Microbiano
Mecanismo de ação: liberação de O nascente; oxida os sistemas enzimáticos
Exemplos:
Peróxidos: H2O2 3% age sobre organismos anaeróbios;
Ácido peracético: efetivo contra bactérias, fungos, endosporos e vírus.
Ozônio: empregado na desinfecção de água.
Mecanismo de ação: alquilação dos grupos funcionais das proteínas (aminas, carboxilas, hidroxilas), inativando-as.
Aldeído fórmico : solução em água de 3 a 8 %
Aldeído glutárico: soluções alcalinas a 2%
Formalina: solução aquosa de formol, associada a um sabão ou detergente 40%
OBS: Alquilação é a transferência de um grupo alquila de uma molécula para outra.
Mecanismo de ação antimicrobiana do glutaraldeído
Alvo Ação
Esporos bacterianos •Inibe germinação (concentrações);
É esporocida (concentrações)
Micobactérias •Provavelmente a parede celular
Outras bactérias que
não formam esporos
•Associação forte com camadas mais
externas da parede celular; Ligação
ente aminoácidos de proteínas;
Inibição de transporte na célula
Fungo •Parede celular
Vírus •Ligação proteína-DNA e
mudanças no capsídio
Mecanismo de ação: desnaturam proteínas e rompem membranas plasmáticas lipídicas.
Exemplos:
fenol;
cresol
hexaclorofeno;
Fenol: desinfetante fraco, atividade bactericida em [0,2 a 1%]
Cresóis: creolina superfícies;
Triclosano (bifenol): uso em superfícies;
Hexaclorofeno (bifenol): em desuso por causar alterações neurológicas.
anti-sepsia da pele e bucal
IODO
◦ Solução alcoólica a 2%, bactericida, fungicida, virucida,
[ ] esporocida
◦ Mecanismo de ação: presume-se que há a combinação irreversível a proteínas, interação com os aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, inibindo suas funções.
CLORO
cloro + água = ácido hipocloroso
◦ Cl2 + H2O H+ + Cl- + HOCl
◦ Mecanismo de ação do 2HOCl: oxida grupos SH e NH2 de enzimas bacterianas, inibindo-as.
CLORO◦ Hipoclorito de sódio;
◦ Dióxido de cloro;
◦ Cloraminas (cloro + amônia);
Mecanismo de ação: alteram a permeabilidade da membrana, inibem enzimas, desnaturação de proteínas;
◦ Ativas contra G+ e pouco menos ativas contra G-
◦ EXEMPLOS:
Cloreto de benzalcônio
Cloreto de cetilpiridínio Cepacol
Agentes de superfície
Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas combinam-se com proteínas, geralmente nos grupos SH (sulfidrilas);
ação bacteriostática;
Mercurocromo e mertiolate
Mecanismo de ação: alquilação direta dos grupos carboxilas, hidroxilas e sulfidrilas, inativando certas enzimas;
Óxido de etileno: atua pela interação com proteínas, alta capacidade de penetração, é explosivo;
Betapropiolactona: baixa capacidade de penetração, carcinogênico.
OBS: Alquilação é a transferência de um grupo alquila de uma molécula para outra.
Agente Químico Concentração (%) Aplicações Nível de
Atividade
Compostos Fenólicos 0.5-3.0 Desinfecção de objeto inanimado Intermediário
Álcoois 70-90 Anti-sepsia da pele, desinfecção de
instrumentos cirúrgicos
Intermediário
Iodo 1 Anti-sepsia da pele, pequenos
cortes, desinfecção da água
Intermediário
Compostos Clorados 0.5-5.0 Desinfecção da água, superfícies
não metálicas, equipamentos de
laticínios, materiais domésticos
Baixo
Mercúrio 1 Anti-sepsia da pele, desinfecção de
instrumentos
Baixo
Alta – Mata todas as formas de vida microbiana
Intermediário – Mata o bacilo da Tuberculose, Fungos e vírus, mas não os esporos
Baixo – Não mata o bacilo da tuberculose, nem os esporos e vírus em um tempo
aceitável
Fatores importantes associados
ao uso de agentes químicos
•Potência
•Espectro de ação
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
Fenol Substância a ser testada
2 Banho maria (20°C/5 min)
Determinação do Coeficiente fenólico
1
FenolSubstância a
ser testada
3 Acrescentar 0,5 ml de cultura
padrão
4 Depois de 5, 10 e 15 minutos, semear em
placas estéreis 1 amostra de cada diluição
Salmonella typhi
Staphylococcus aureus
Determinação do Coeficiente fenólico
5 Após 48h, observar as culturas e identificar a
maior diluição onde não se observa
crescimento (turbidez), após 10 min.
Diluição da substância, em que há crescimento
Diluição do fenol em que há crescimento•Coeficiente fenólico =
Determinação do Coeficiente fenólico
1/64
1/8= 8
Exemplo:
Agente Staphylococcus aureus Salmonella typhi
Fenol
Cloramina
Cresols
Etanol
Formalina
Água oxigenada
Lisol
Cloreto de mercúrio
Tintura de iodo
1,0
133,0
2,3
6,3
0,3
-------
5,0
100,0
6,3
1,0
100,0
2,3
6,3
0,7
0,01
3,2
143,0
5,8
Coeficiente fenólico de alguns agentes
químicos
Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Determinando o espectro de ação de um
desinfetante
1
3
24
1
3
24
1
3
24
= Disco impregnado com desinfetante
Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Incubar
Determinando o espectro de ação de um
desinfetante
Determinando o espectro de ação de um
desinfetante
Ácidos orgânicos: acético, láctico, sórbico...
pH ácido inibe o crescimento microbiano
Nitritos e Nitratos
Formam ác. nitroso e óxido nítrico que são substâncias oxidantes
Gás Sulfeto, metabissulfito e SO2
Redução das pontes dissulfeto em proteínas
Adição de sal e açúcar
VERMELHO, A.L., PEREIRA, A.F., COELHO, R.R.R., SOUTO-PADRÓN, T. Práticas de Microbiologia,Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2006.
FRANCO, B.G.M.F; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu, São Paulo, 2005.
TORTORA, G. J.;FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia, Artmed, Porto Alegre, 2005.