Controle epigenético da expressão gênica em plantas

Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA

Caso clássico: Alterações epigenéticas que afetam propriedades de pigmentação

Duas possibilidades: permanecem após a meiose x não permanecem após a meiose

Mudancas epigenenéticas típicas das plantas: normalmente transmitidas na meiose

Mecanismos da variação epigenética: Metilação do DNA

Mudanças no posicionamento do nucleossomaMudanças no empacotamento dos nucleossomas

Metilação: mecanismos para garantir a heranca mitótica ou meiótica de padrões específicos de metilação.

DNA-metil transferase; preferência pelo motivo CpG ou Cp

Modificações covalentes do nucleossomaMetilação: mecanismo mais connhecido

1) : ATPase tipo SNF2 (Lsh) aflouxa os contatos entre o DNA e as histonas

2) Metiltransf. da histona (Suv39H1) metila Lys hist. (estrela):Configuração da cromatina permissível à metilação

3) “Targeting factor” reconhece a sequência a ser metilada,e traz consigo os fatores para a metilação:DNMT1: citosina-5-metil transferaseHDAC: desacetilase da histonaMeCP2: proteína de ligação ao DNA metilado

4) Sin3a +HDAC: desacetilação das histonasresultando em sua condensação

Metilação e repressão transcricional

Imprinting: a expressão de certos alelos difere dependendo da origem do gametaExs: mamiferos, fungos e plantas

Bom nível de expressão quando transmitido pelo óvulo ::cor sólida da

semente

Ex: pigmentação da semente de milho: alelos r (red):

Baixo nível de expressão quando transmitido pelo pólem ::cor variegada:

Mecanismo epigenético 1: Imprinting

Diferenças fenotípicas: não depende da dosagem do gene Rmas sim de mudanças epigenéticas que são macho-específicas

2x x 2x

Imprinting: sementes; mudanças epigenéticas relacionadas a dosagem gênica e ligadas ao sexo

Transgênicos e Mutantes hipometilados

Grande desenvolvimento do endospermaperiférico e chalazal, mas sem celularização

Fenocópia 4x x 2x

Fenocópia 2x x 4x Fenocópia 2x x 6x

Maternalização = redução da metilação

Reduzido endospermaperiférico e chalazal

Fatores epigenéticos controlando o desenvolvimento da semente

paternal

Mecanismo do imprinting (ratos)Dois genes reciprocamente sofrendo imprinting: 90 kb distância Igf2: fator cresc. fetal H19: RNA sem prot.

DMD: differentially methylated domain -> silenciador: papel no “desliga expressão” H19 e IGF2

Bloqueia o estimulador de Igf2

Estimuladores

Endoderme Mesoderma

Específico para mesoderme

?

Interação alélica: a expressão de um alelo em um heterozigoto é alterada napresenca de outro; herdável através da meiose

Alelo B(booster): B-I: pigmentacao forte; B’: pigmentacao fraca

B-I: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo B’B’: transcrição 10-20 vezes menor

Alelo Pl; forte pigmentação das anteras; Pl’: cor variegada

PI e P’: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo P’

Mecanismo epigenético 2: Paramutação

DNA metilado: proteínas ligam-se ao DNA metilado

Mecanismo da paramutação;

Mecanismo 1

Interação dos cromossomas

Mecanismo 2

formação da heterocromatina

Promotor 1

Promotor 2

RNAaberrante

Sinal difusivel: RNA

enzimas modificadoras das histonas fatores remodeladores da cromatina

Transferência direta de elementos da cromatina

Citosinas metiladas podem ser mantidas na replicação

Mutantes com alterações no mecanismo epigenético da regulação gênica

Milho: mop1: mediator of paramutation 1: bloqueia a paramutação do gene B e de outros pigmentos

ambos genes PAI tornam-se então metilados

Arabidopsis: o caso dos genes PAI: sintese triptofano:

2 genes, em 2 cromos.

PAI: Phosphoribosilanathranilate isomerase

Introdução de novos genes PAI não metilados tornam-se metilados

Estratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAIEstratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAI

metilacoes

Planta transgênicautilizado na

seleção genética

10 mutante isolado

20 mutante isolado

metilaçãoredução nafluorescência

Nivel de metilação = reostatoNivel de metilação = reostato

controle do nível de controle do nível de expressão gênicaexpressão gênica

intermediário fluorescenteReação catalizada pela enzima PAI

TriptofanoTriptofano……….

Única sequência PAI que pode ser expressa no

cromossoma 1 foi mutada

Met1 e CMT3: codificam paraduas diferentes

metil-transferases deDNA

[ ] XX

Mecanismo epigenético 3: Silenciamento

Detecção: plantas trangênicas; Arabidopsis, Petunia e tabaco

Repetição da presença de genes :::: silenciamento de outras sequências

Estrutura ou organização do cromossoma como causa do silenciamento

Petunia mutata : sem cor (sem o gene A1):

Adição da segunda cópia de A1: transcrição silenciada: herdável geneticamente

Gene silenciado A1 pode induzir silenciamento epigenético de outro gene A1 novo,somente quando esse gene A1 expresso é inserido próximo do primeiro.

Variegação: Silenciamento da segunda cópia

Introdução gene A1 do milho: cópia simples:Flor torna-se pigmentada

Mecanismos: TGA (transcriptional gene silencing) pela metilação

PTGA (post-transcriptional gene silencing) pela metilação: não afeta a transcrição

ddm1: afeta o reconhecimento da metilação

met1: afeta a metilação

mom1: TGS independente da metilação

Mecanismo epigenético 3: Silenciamento: Co-supressão

Transgene pode induzir o silenciamento de um gene endógeno e homólogo

Experiência da sobre-expressão da chalcone sintase

Co-supressão não herdável geneticamente: atividade endógena é restabelecida quando ocorre a segregação do transgene

Silenciamento de viróides: enxerto de planta contaminada por um vírus em outra planta contaminada com

outro vírus:.

Silenciamento de outro vírus:Transmissão do sinal por toda a

planta:

Efeito a nível pós-transcripcional

Silenciamento não-herdável

Autopoliploidia; oportunidade para alterar a expressão gênica (silenciamento), e criar um tampão contra o efeito de mutações deletérias

Vantagens dos alopoliplóides: manter a natureza híbrida indefinidamente

Mudanças durante o estabelecimento da um autopoliplóide: eliminação de sequências de DNA, expansão heterocromatina,

Silenciamento nos alopoliplóides: metilação: uso do aza-dC

AutopoliploideAutopoliploide

Duplicação gênica

Duplicação gênica

HíbridoF1

AlopoliplóideAlopoliplóide

Diferencas no número de cormossomas ou organização

Inicio da formação de um poliplóide: “choque”:

podem romper o pareamento e distribuição

: duplicação dos cromossomas

- silenciamento genes duplicados; - reduzir “infidelidade” cromossomal

translocacao recíproca de segmentos de cromossomas: ajudam diferenciar os cromossomas homólogos dos homeologos

Eventos epigenéticos na poliploidização (70% angiosperma; 95% pteridófitas)

Modelo explicativo do silenciamento em poliplóidesModelo explicativo do silenciamento em poliplóides

Causas potencias da origem da variabilidade em poliplóides

Seleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticasSeleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticas

ddm1: mutação no gene (SNW/SNF2) : fator de remodelação da cromatina;

Mamíferos mudanças na estrutura da cromatina devem anteceder a metilação

Sem fenótipo visível; autofecundação:

reduzido nível de metilação :: nova metilação e silenciamento de genes que são normalmente expressos e não metilados (SUPERMAN): flores anormais

Problema para a obtenção de plantas transgênicas: - súbito silenciamento do transgenes

1a defesa para superar este problema: selecionar planta transgênica com cópia unica

Plantas antisenso para MET1;redução em 30% no nível de metilação

Hipermetilaçãodo gene SUPERMAN

Hipermetilaçãodo gene SUPERMAN

e do gene AG

progenia anormal::desestabilização da programação epigenética

Paradoxo?

Genes do florescimento precoce: genes silenciadores: mecanismos epigéneticos no controle do florescimento (repressores epigeneticos)

Genes do florescimento precoce: genes de proteinas associadas a cromatina

Repressores epigenéticos

Mutantes tfl2, emf: 1) florescem precocemente,

35S:TFL135S:TFL1

4 sépalasnova influorescência

35S:EMF1 + DL35S:EMF1 + DL

duas folhas caulinaresflor terminal (2 silíquas)

novo broto terminal

35S:EMF1 + DC35S:EMF1 + DC

flores e brotosoriginados na mesma

regiao

Importância da remodelagem da cromatina no controle da expressão gênicae dos processos de desenvolvimento

Pouco compeendido como esses fatores de remodelagem da cromatina funcionam em plantas

2) florescem sob DC, flor terminal,

3) proteínas de reserva da semente são expressas antes

PGTS (post-transcriptional gene silencing):primeiramente descoberto em plantas

Primeiro gene regulatório para PGTS foi descoberto em Neurospora

PGTS: um poderoso meio para manipular a expressao em sistemas animais::RNAi

PGTS: mais conhecido em Drosophila e levedura (Saccharomyces)

Plantas usam as mudancas epigenéticas para se adaptar a mudancas genômicas ou ambientais::flexibilidade

Flexibilidade: reprogramação dos estágios de desenvolvimento

Mediado por moléculas de RNA pequenas (<70 nucleotídeos)

Funções: 1) proteção contra efeitos deletérios da transposição de transposons

2) Resistência contra viroses (Produzem dsRNA)

DICER

Pode ser transmitido entrecélulas e a longas distâncias

PGTS(Silenciamento pós-transc.

Comprimento médio de 25 nucleotídeos

Tamanho médio de 70 nucleotídeos

Tamanho médio de 70 nucleotídeos

Dupla fita

Fita simples

Fita simples

Perfeitamente complementar ao RNA alvo

Parcialmente complementar ao RNA alvo

Parcialmente complementar ao RNA alvo

Direciona a clivagem endonucleolítica

Mecanismo de ação desconhecido

Inibe a tradução do mRNA

RNA dupla fita perfeitamente ou quase perfeitamente pareado

RNA dupla fita pareado, mas com alças

RNA dupla fita pareado, mas com alças

Não conservado entre as espécies

Frequentemente conservado entre as espécies e filos

Altamente conservado entre as espécies e filosAltamente conservado entre as espécies e filos

Cromossomal ou citoplásmico

Cromossomal (IGR)

Cromossomal (IGR)

RNA curto de interferência (siRNA)

RNA curto temporal (stRNA)

Micro RNA (miRNA)

Originado de um RNA percursor de maior tamanho

Originado de um RNA percursor de maior tamanho

Originado de um RNA percursor de maior tamanho

Mecanismos pelos quaisos microRNAs promovem

o silenciamento

RNAse tipo III

Complexo deendonucleases

Locus de controle do cruzamento sexual em S. pombe (mat2P)

Metilação da histona

Recrutamento: criação de um sítio de nucleação da heterocromatina

Difusão do processo de diferenciação da heterocromatina:Silenciamento do locus mat2P

Dicer

Det. Da especificade de RISC: mutantes: arquit. mod

61 alvos potenciais: 41 são fatores transcricionais

Dif. Merist. Axilar e da folha

Separação de orgãos

Identidade floral

Desen. floral

Desen. floral

Desen. floral

Desen. floral

TRV: tobacco rattle virus

TRV-00: vírus sem insertoTRV-P: contendo 359 nt 3’ da GFPTRV-35S: 347 nt do promotor da GFP

Luz UV

Luz UV

Nuclear Run of: taxa de transcrição

Inoculação com o virus da planta transgênica 35SGFP

PTGS

PGS

Efeito da proteína HC-Pro no silenciamento sistêmico

HC-Pro: proteína viral quesuprime o silenciamento

SilGUS: locus de silenciamentode GUS

Silenciamentosistêmico

Supressão do silenciamento sistêmico

RNAi: poderosa ferramenta

atFAD2: Desaturase de A. thaliana

AttP1/AttP2: clonagem por Recombinação utilizando o sistema

Gateway

Amplifico o gene adicionando o sítios attB1 e attB2

Recombinação in vitro utilizando o sistema Gateway

Gene orientaçãoSenso substitui ccdB

Gene orientaçãoanti-senso substitui ccdB

Sistema ccdB: proteína letal: sistema para a seleção do vetor recombinante

RNAi