Controle genético e epigenético da expressão heteromórfica de

Universidade de São Paulo

Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”

Controle genético e epigenético da expressão heteromórfica de regiões

organizadoras do nucléolo em Crotalaria retusa L.

(Leguminosae-Papilionoideae)

Maria Cecília Perantoni Fuchs

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Agronomia. Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas

Piracicaba

2009

1

Maria Cecília Perantoni Fuchs Bacharel em Ciências Biológicas

Controle genético e epigenético da expressão heteromórfica de regiões organizadoras do nucléolo em Crotalaria retusa L. (Leguminosae-Papilionoideae)

Orientador: Prof. Dr. MATEUS MONDIN

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Agronomia. Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas

Piracicaba 2009

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP

Fuchs, Maria Cecília Perantoni Controle genético e epigenético da expressão heteromórfica de regiões organizadoras do

nucléolo em Crotalaria retusa L. (Leguminosae-Papilionoideae) / Maria Cecília Perantoni Fuchs . - - Piracicaba, 2009.

87 p. : il.

Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2009. Bibliografia.

1. Citogenética vegetal 2. Crotalária 3. Controle genético 4. DNA 5. Expressão gênica 6. NucIeólo I. Título

CDD 633.562 F951c

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”

3

Aos meus pais (Edélcio e Maria Auxiliadora)

e avós maternos (Mário e Luiza),

que sempre me apoiaram incondicionalmente,

DEDICO.

5

AGRADECIMENTOS

A Deus, pai criador.

Ao Departamento de Genética e à todos os professores e funcionários pela estrutura e

pronta disponibilidade em ajudar na condução deste trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES pela bolsa

concedida.

Ao Prof. Dr. Mateus Mondin pela orientação, paciência e ensinamentos durante todo o

percurso deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Labate, Dr. Alexander de Andrade, José Matheus Camargo

Bonnato e equipe do Laboratório Max Feffer pela colaboração e ajuda prestada na realização dos

experimentos.

À Profa. Dra. Maria Luiza Silveira Mello, professora titular da Universidade Estadual de

Campinas, ao Prof. Dr. Benedicto de Campos Vidal, professor emérito da Universidade Estadual

de Campinas, e Prof. Dr. Alberto da Silva Moraes, professor adjunto da Universidade Federal de

Uberlândia, pela colaboração e auxílio na condução dos experimentos.

Ao Prof. Dr. Lyderson Facio Viccini, professor associado I da Universidade Federal de

Juiz de Fora, e equipe pela pronta disponibilidade e ajuda prestada.

À Profa. Dra. Margarida Lopes Rodrigues de Aguiar-Perecin pela contribuição em minha

formação acadêmica.

À técnica Silvia Cristina Menuzzo Molina por toda a ajuda, paciência e dedicação.

A todos os amigos do Laboratório de Citogenética Molecular de Plantas que me

incentivaram nos momentos mais difíceis.

À minha querida irmã por estar sempre presente, mesmo que longe, nos momentos de

alegria e tristeza.

Ao Alexandre por estar ao meu lado sempre, pelos momentos de alegria, ensinamentos,

companheirismo e apoio.

Aos amigos do curso de pós-graduação, em especial Larissa P. Castro, Daniel Pizzaia,

Carolina Grando, Maria Marta Pastina, Flávia A. Barbieri, Helen A. Penha, Carlos E. Batista e

Guilherme J. Farias pelo convívio, alegria, ajuda e paciência dedicados durante todo esse período.

Aos meus amigos Adriano (Covalente), Agda, Aida, Augusto (Letxuga), Aurélio (Luft),

6

Evandro, Fred, Fernanda Gusmão, Fernanda (Importada), Jean, Jerusha, Joze, Maíra, Pâmela,

Robson e Tâmara (Damasko) pelo apoio, lealdade, descontração e amizade dedicados desde

sempre.

A todos que contribuíram de alguma forma para que fosse possível a realização deste

trabalho.

MUITO OBRIGADA!

7

“As lições do passado fortalecem o presente e inspiram o futuro.”

Anônimo

8

9

SUMÁRIO

RESUMO ...................................................................................................................................... 11

ABSTRACT .................................................................................................................................. 13

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 15

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................... 17

2.1 DNA ribossômico - rDNA 45S ............................................................................................... 17

2.2 O rDNA 45S como marcador citogenético.............................................................................. 19

2.3 Transcrição e nucléolo ............................................................................................................. 20

2.4 Organização da cromatina e epigenética ................................................................................. 23

2.5 Dominância nucleolar .............................................................................................................. 31

2.6 Crotalaria retusa como modelo no estudo da expressão nucleolar ........................................ 35

3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................ 37

3.1 Material vegetal ....................................................................................................................... 37

3.2 Germinação .............................................................................................................................. 37

3.3 Pré-tratamento com inibidor do fuso mitótico ......................................................................... 37

3.4 Coloração com método de Feulgen ......................................................................................... 38

3.5 Preparação de lâminas ............................................................................................................. 38

3.6 Bandamento Ag-RON ............................................................................................................. 39

3.7 Coloração com fluorocromos .................................................................................................. 39

3.7.1 Coloração com 4’- 6’ diamidino - 2 - fenilindol - DAPI ...................................................... 40

3.7.2 Coloração com 4’- 6’ diamidino - 2 – fenilindol/ Actinomicina D - DAPI/AMD ............... 40

3.7.3 Coloração com Cromomicina A3 - CMA............................................................................. 40

3.7.4 Coloração com Cromomicina A3/ Distamicina - CMA/DA ................................................ 40

3.8 Hibridação molecular in situ fluorescente - FISH ................................................................... 41

3.8.1 Sonda .................................................................................................................................... 41

3.8.2 Marcação e hibridação molecular in situ fluorescente da sonda de DNA ribossomal 45S .. 41

3.9 Extração de proteínas............................................................................................................... 42

3.10 Quantificação de proteínas .................................................................................................... 43

3.11 Western blot ........................................................................................................................... 43

3.11.1 Eletroforese de proteínas em gel SDS-PAGE .................................................................... 43

10

3.11.2 Transferência de proteínas para membrana de nitrocelulose .............................................. 43

3.11.3 Detecção imunoquímica ...................................................................................................... 43

3.12 Eletroforese bidimensional .................................................................................................... 44

3.12.1 Focalização isoelétrica - IEF ............................................................................................... 44

3.12.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS-PAGE .......................................................... 45

3.12.3 Coloração dos géis .............................................................................................................. 45

3.12.4 Digestão das proteínas ........................................................................................................ 46

3.12.5 Sequenciamento das proteínas ............................................................................................ 47

3.12.6 Análise dos espectros de massa .......................................................................................... 47

3.13 Microscopia e análise de imagens .......................................................................................... 48

3.13.1 Preparações citogenéticas ................................................................................................... 48

3.13.2 Eletroforese bidimensional ................................................................................................. 48

3.14 Medidas cromossômicas e nucleolares .................................................................................. 49

4 RESULTADOS ........................................................................................................................... 51

4.1 Análises citológicas.................................................................................................................. 51

4.2 Western blot ............................................................................................................................. 58

4.3 Eletroforese bidimensional ...................................................................................................... 59

5 DISCUSSÃO .............................................................................................................................. 65

5.1 Estrutura cromossômica ........................................................................................................... 65

5.2 Expressão diferencial de genes ribossomais ............................................................................ 67

5.3 Modificações pós-traducionais em histonas ............................................................................ 69

5.4 Análise proteômica .................................................................................................................. 72

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................................... 75

REFERÊNCIAS ............................................................................................................................. 77

11

RESUMO

Controle genético e epigenético da expressão heteromórfica de regiões organizadoras do nucléolo em Crotalaria retusa L. (Leguminosae-Papilionoideae)

O presente trabalho teve por objetivo compreender e analisar os mecanismos genéticos e epigenéticos da expressão diferencial de regiões organizadoras do nucléolo - RONs através do estudo de dois acessos (CRT-1 e CRT-2) de Crotalaria retusa. O acesso CRT-1 é uma cultivar, enquanto que o acesso CRT-2 é proveniente de uma população periférica da orla marítima de Ilhéus – BA. Por serem temporalmente e espacialmente separados, acredita-se que os acessos foram submetidos a pressões seletivas diferentes, resultando em alterações dos padrões epigenéticos, principalmente nas RONs. Para o desenvolvimento deste trabalho foram realizadas medidas cromossômicas e nucleolares a partir de células coradas pelo método de Feulgen e por nitrato de prata, coloração com fluorocromos específicos às regiões cromossômicas ricas em nucleotídeos GC e AT, mapeamento físico dos locos de DNA ribossômico 45S por hibridação in

situ fluorescente, análise qualitativa e quantitativa de modificações pós-traducionais de histonas por Western blot e eletroforese bidimensional de extrato protéico radicular com enfoque em proteínas envolvidas nos mecanismos epigenéticos. As análises citológicas demonstraram uma grande semelhança nos cariótipos dos dois acessos, diferindo apenas no tamanho do segmento proximal do braço curto do cromossomo 1. Em ambos os acessos foi observada uma expressão nucleolar diferencial em, aproximadamente, 50% das células; contudo, a expressão diferencial em CRT-2 apresentou-se consideravelmente maior. Além disso, os dois acessos demonstraram diferenças quantitativas nas modificações pós-traducionais de histonas e em proteínas possivelmente envolvidas em mecanismos epigenéticos. Uma vez que as variações epigenéticas podem ser modificadas por fatores ambientais, sugere-se que as diferenças nos padrões de modificações de histonas e nos perfis protéicos encontradas entre os acessos, como também a expressão diferencial mais expressiva em CRT-2, sejam devidas às diferentes pressões seletivas as quais as populações originais foram submetidas. O estudo dos mecanismos genéticos e epigenéticos na dominância nucleolar possibilita uma maior compreensão da ação do remodelamento da cromatina no controle da expressão gênica do rDNA, como também da expressão gênica em geral. Palavras-chave: Dominância nucleolar; Epigenética; Expressão diferencial; rDNA 45S; Região

organizadora do nucléolo

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13

ABSTRACT

Genetic and epigenetic control of the heteromorphic expression of nucleolus organizer regions in Crotalaria retusa L. (Leguminosae-Papilionoideae)

The aim of this present work was to understand and analyze the genetic and epigenetic mechanisms of differential expression of the nucleolus organizer regions - NORs through the study of two accesses (CRT-1 and CRT-2) of Crotalaria retusa. Access CRT-1 is a cultivar, while access CRT-2 is from a peripheral population of the shoreline of Ilhéus – BA. Because they are temporally and spatially separated, it is believed that the accesses were submitted to different selective pressures, resulting in changes in epigenetic patterns, primarily in NORs. To develop this work, it was carried out chromosomal and nucleolar measurements from cell stained by Feulgen method and silver nitrate, staining with specific fluorochromes to chromosomal regions rich in GC and AT nucleotides, physical mapping of 45S ribosomal DNA loci by fluorescent in

situ hybridization, qualitative and quantitative analysis of post-translational histone modifications by western blot, and two-dimensional electrophoresis of root extract protein focusing on proteins involved in epigenetic mechanisms. The cytological analysis showed a great similarity in karyotypes of two accessions, differing only in size of the proximal segment of the sort arm of chromosome 1. In both accesses, it was observed a differential nucleolar expression in approximately 50% of the cells; however, the differential expression in CRT-2 showed considerably larger. Furthermore, the two accesses showed quantitative differences in the post-translational histone modifications, and in a protein possibly involved in epigenetic mechanisms. Since epigenetic variations can be modified by environmental factors, it is suggested that differences in patterns of histone modifications and protein profiles found between the accesses, but also the most significant differential expression in CRT-2, are due to different selective pressures to which the original populations were submitted. Studies of the epigenetic mechanisms in nucleolar dominance allows a better understanding of the action of the remodeling of chromatin in controlling the dosage of rRNA genes, but also in the control of gene expression in general. Keywords: Nucleolar dominance; Epigenetic; differential expression; rDNA 45S; Nucleolar

organizer region

14

15

1 INTRODUÇÃO

O DNA ribossômico 45S consiste em centenas ou milhares de cópias, arranjadas in

tandem, de unidades dos genes de rRNA 18S, 5.8S e 25-26S, separadas por espaços intergênicos

(IGS) não transcritos (CAPESIUS, 1997; FLAVELL, 1989; GERBI, 1986; HESLOP-

HARRISON, 2000; LEWIN, 2004; PIKAARD, 2000a; RAŠKA et al., 2004; SONE et al., 1999;

WEIDER et al., 2005). A transcrição dos genes de rRNA pela RNA polimerase é relacionada

com a formação e manutenção do nucléolo; compartimento nuclear no qual é realizado a

biogênese das subunidades ribossomais (DOUSSET et al., 2000; DUNDR; MISTELI; OLSON,

2000; GRANNEMAN; BASERGA, 2005; LONG et al., 2008; OLSON; DUNDR; SZEBENI,

2000; OLSON; HINGORANI; SZEBENI, 2002; RAŠKA et al., 2004; RUSSELL; ZOMERDIJK,

2005; SCHEER; HOCK, 1999). Apenas uma fração do total dos genes de rRNA são ativamente

transcritos e a atividade relativa de cada região organizadora do nucléolo - rDNA 45S reflete no

volume do nucléolo correspondente (CAPERTA et al., 2002; RUSSELL; ZOMERDIJK, 2005;

SARDANA; O’DELL; FLAVELL, 1993; WEIDER et al., 2005).

O controle transcricional do rDNA 45S é realizado através do ajuste no número de genes

ativamente engajados na transcrição via remodelamento da cromatina, ou do ajuste na taxa de

transcrição de cada gene ativo (JASENČÁKOVÁ, 2003; PIKAARD, 2000a; RAŠKA et al.,

2004; RUSSELL; ZOMERDIJK, 2005). Geralmente, a proporção de genes de rRNA ativos é

estavelmente propagada através do ciclo celular, no entanto, esta proporção pode ser alterada por

modificações no estado da cromatina, resultado de processos epigenéticos (JASENČÁKOVÁ,

2003; RAŠKA et al., 2004; RUSSELL; ZOMERDIJK, 2005; WEIDER et al., 2005).

O controle epigenético da expressão gênica ocorre sem que haja alterações nas sequências

de nucleotídeos do DNA. Este modo de regulação denota um estado herdável da estrutura da

cromatina através de modificações covalentes reversíveis nos nucleotídeos e na extremidade N-

terminal das histonas (FUCHS, J. et al., 2006; HESLOP-HARRISON, 2000; JASENČÁKOVÁ,

2003; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; NEVES et al., 2005; RICHARDS, 2006; SHILATIFARD,

2006). Cada modificação pós-traducional em histonas, ou a combinação de modificações, implica

em diferentes efeitos na estrutura e função da cromatina e, consequentemente, em funções

biológicas particulares, como a expressão gênica nas regiões organizadoras do nucléolo (FUCHS,

J. et al., 2006; JIN et al., 2008; LEWIN, 2004; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; LODISH et al.,

16

2003; PETERSON; LANIEL, 2004; SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001).

As principais modificações pós-traducionais de histonas são as metilações e acetilações de

lisinas das histonas H3 e H4 (FUCHS, J. et al., 2006; JIN et al., 2008; LEWIN, 2004; LI;

BUTENKO; GRAFI, 2005; LODISH et al., 2003; PETERSON; LANIEL, 2004;

SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001). A acetilação neutraliza as cargas positivas do grupo

NH+3 dos aminoácidos básicos das histonas, resultando na alteração da interação histona-DNA e,

consequentemente, na descompactação da cromatina, o que facilita a ligação dos fatores de

transcrição aos seus sítios no DNA (JASENČÁKOVÁ, 2003; JASENCAKOVA et al., 2000;

LEWIN, 2004; LODISH et al., 2003; TURNER, 2001). Por outro lado, a metilação de histonas é

associada com a inatividade transcricional da cromatina, mas esta não é uma regra simples, pois

há exceções no qual a metilação de histonas é correlacionada com sítios transcricionalmente

ativos no DNA (FUCHS, J. et al., 2006; JASENČÁKOVÁ, 2003; LAWRENCE et al., 2004;

LEWIN, 2004; SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001).

A dominância nucleolar é um fenômeno epigenético no qual ocorre a transcrição

preferencial dos genes de rRNA (rDNA 45S) provindo de um dos genitores, resultando no

silenciamento total, ou parcial do grupo de genes de rRNA originados do outro genitor

(McSTAY, 2006; NEVES et al., 2005; PIKAARD, 1999, 2000a). Geralmente, é observado em

híbridos interespecíficos ou alopoliplóides, mas já existem evidências deste fenômeno em

espécies diplóides (CAPERTA et al., 2002; CHEN; PIKAARD, 1997a, 1997b; EARLEY et al.,

2006; FLAVELL, 1989; HOUCHINS et al., 1997; LAWRENCE et al., 2004; LEWIS;

CHEVERUD; PIKAARD, 2004; NEVES et al., 1997; PONTES et al., 2003). Em experimentos

prévios envolvendo dois acessos da espécie Crotalaria retusa, observou-se dominância nucleolar

em ambos (FUCHS, M.C.P. et al., 2006). Uma vez que os acessos são provenientes de

populações localizadas em ambientes diferentes e que as variações epigenéticas são

potencialmente sensíveis aos fatores ambientais (RICHARDS, 2006), C. retusa tornou-se um

modelo de estudo para a compreensão e análise dos mecanismos genéticos e epigenéticos da

expressão nucleolar diferencial.

17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 DNA ribossômico - rDNA 45S

Os RNAs ribossomais - rRNAs, juntamente com várias classes de complexos protéicos,

formam as organelas responsáveis pela síntese de proteínas, denominadas ribossomos. Essas

organelas são constituídas por duas subunidades, uma maior e uma menor, designadas, em

eucariotos, como 60S e 40S, respectivamente (LEWIN, 2004; NEVES et al., 2005; WEIDER et

al., 2005). Em vegetais superiores, semelhante aos outros eucariotos, a subunidade menor possui

a molécula de rRNA 18S, enquanto que a subunidade maior possui as moléculas de rRNA 5S,

5.8S e 25-26S (WEIDER et al., 2005).

Os genes que codificam os rRNAs 18S, 5.8S e 25-26S formam um arranjo in tandem de

centenas ou milhares de cópias, separadas por espaços intergênicos -IGS não transcritos (Figura

1), eu um determinado loco cromossômico denominado DNA ribossômico 45S - rDNA 45S

(CAPESIUS, 1997; FLAVELL, 1989; GERBI, 1986; HESLOP-HARRISON, 2000; LEWIN,

2004; PIKAARD, 2000a; RAŠKA et al., 2004; SONE et al., 1999; WEIDER et al., 2005). Entre

os genes de uma mesma unidade, existem os espaços intergênicos transcritos - ITS (Figura 1), e,

sabendo-se que cada unidade repetitiva é transcrita como um único cístron, os ITSs são

removidos do precursor primário (pré-rRNA), originando as moléculas de rRNA 18S, 5.8S e 25-

26S maduras (CAPESIUS, 1997; FLAVELL, 1989; GERBI, 1986; HESLOP-HARRISON, 2000;

LEWIN, 2004; NEVES et al., 2005; PIKAARD, 2000a; RAŠKA et al., 2004; SONE et al., 1999;

WEIDER et al., 2005). É importante destacar que os IGSs incluem elementos repetitivos de DNA

que regulam a transcrição das unidades gênicas, tais como promotores, terminadores e enhancers

(CAPESIUS, 1997; FLAVELL, 1989; PIKAARD, 2000a).

A unidade repetitiva de rDNA (5’ – IGS – rRNA 18S – ITS – rRNA 5.8S – ITS – rRNA

25-26S – 3’) possui regiões com diferentes níveis de pressão seletiva, variando em suas taxas de

divergência inter e intra-específica (CAPESIUS, 1997; FLAVELL, 1989; GERBI, 1986; LEWIN,

2004; WEIDER et al., 2005). Os IGSs variam amplamente em comprimento entre e, algumas

vezes, dentro de espécies, em contraste com a alta conservação de sequências da unidade de

transcrição (CAPESIUS, 1997; GERBI, 1986; HESLOP-HARRISON, 2000; LEWIN, 2004;

WEIDER et al., 2005). Experimentos envolvendo hibridação demonstraram que existem regiões,

dentro das unidades transcritas, que são altamente conservadas entre as diferentes espécies

18

eucariotas. Essas regiões evolutivamente conservadas foram definidas dentro das sequências

gênicas dos rRNA e podem estar correlacionadas com as funções das moléculas de rRNA dentro

dos ribossomos (GERBI, 1986; WEIDER et al., 2005).

Figura 1 – Esquema demonstrando a estrutura do rDNA 45S e suas unidades repetitivas com os genes de rRNA 18S, 5.8S e 25-26S, ITS (espaços intergênicos transcritos), IGS (espaços intergênicos não transcritos) e elementos repetitivos de DNA

Fonte: Adaptado de Pikaard (1999, 2000a) e Raška et al. (2004)

O número de cópias - CN de unidades de rDNA também varia entre as espécies eucariotas

(DAVISON; TYAGI; COMAI, 2007; GERBI, 1986; HESLOP-HARRISON, 2000; WEIDER et

al., 2005). Não se sabe ao certo o mecanismo envolvido na amplificação do CN das unidades de

19

rDNA, no entanto, têm-se sugerido que o crossing-over desigual seja o responsável pelo processo

(GERBI, 1986; HESLOP-HARRISON, 2000; WEIDER et al., 2005).

2.2 O rDNA 45S como marcador citogenético

Atualmente, existem muitos táxons pouco conhecidos e com divergências de opiniões

quanto a sua classificação. Como consequência, os materiais que poderiam ser de grande

utilidade no melhoramento genético possuem nomenclaturas diferentes ou são equivocadamente

identificados, assim, os melhoristas hesitam em utilizar tais materiais em seus programas de

melhoramento genético (RAINA et al., 2001). As dificuldades na correta identificação e

nomenclatura surgem devido às similaridades na morfologia vegetativa, no número

cromossômico e morfologia cromossômica, sendo necessário obter evidências moleculares,

cariotípicas, citoquímicas e bioquímicas, juntamente com a análise morfológica, para proceder a

identificação e nomenclatura corretamente (ALI; MEISTER; SCHUBERT, 2000; HAN et al.,

2008; HASTEROK et al., 2006; RAINA et al., 2001; RAN; HAMMETT; MURRAY, 2001).

Contudo, as análises cariotípicas são, muitas vezes, dificultadas devido ao alto grau de ploidia e

ao pequeno tamanho e uniformidade morfológica dos cromossomos (HAN et al., 2008;

HASTEROK et al., 2006).

O polimorfismo intra e interespecífico nas sequências, no número de unidades repetitivas

e na localização do rDNA 45S, têm fornecido importantes informações para o entendimento da

organização do genoma, evolução cromossômica e citotaxonomia (ALI; LYSAK; SCHUBERT,

2005; ALI; MEISTER; SCHUBERT, 2000; DATSON; MURRAY, 2006; HAN et al., 2008;

HASTEROK et al., 2006; HESLOP-HARRISON, 2000; HŘIBOVÁ et al., 2007; MONDIN;

SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007a; RAINA et al., 2001; RAN; HAMMETT;

MURRAY, 2001; SHISHIDO; SANO; FUKUI, 2000; WEIDER et al., 2005). Deste modo, as

sequências repetitivas de rDNA 45S têm sido amplamente utilizadas como marcadores

cromossômicos moleculares, no qual, através da hibridação molecular in situ fluorescente - FISH,

pode-se determinar o número e a localização dos sítios de rDNAs, auxiliando na identificação

individual dos cromossomos e, consequentemente, na taxonomia (ALI; LYSAK; SCHUBERT,

2005; HAN et al., 2008; HASTEROK et al., 2006; HESLOP-HARRISON, 2000; RAINA et al.,

2001).

O estabelecimento de cariótipos através da técnica de FISH provê fundamentos não

20

somente para a integração entre os mapas moleculares, genéticos e citogenéticos, como também

para um melhor conhecimento da organização genômica e cromossômica, e para a evolução

(DATSON; MURRAY, 2006; HAN et al., 2008; HŘIBOVÁ et al., 2007; MONDIN; SANTOS-

SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007a; RAN; HAMMETT; MURRAY, 2001; SHISHIDO;

SANO; FUKUI, 2000; RASKINA; BELYAYEV; NEVO, 2004b). É muito difícil discernir a

direção pelo qual as mudanças cariotípicas ocorrem durante a evolução, todavia, a comparação do

número e distribuição dos locos de rDNA 45S entre diferentes espécies, de um mesmo táxon,

pode revelar a ocorrência de alguns processos de evolução cromossômica (DATSON;

MURRAY, 2006; RAN; HAMMETT; MURRAY, 2001; SHISHIDO; SANO; FUKUI, 2000).

Em geral, a evolução cromossômica ocorre via rearranjos estruturais, como translocações e

inversões (DATSON; MURRAY, 2006). Entretanto, existem evidências nos quais o mecanismo

de transposição esteja envolvido na mudança posicional dos genes ribossomais de algumas

espécies vegetais (CUCO et al., 2005; DATSON; MURRAY, 2006; SHISHIDO; SANO; FUKUI,

2000; RASKINA; BELYAYEV; NEVO, 2004a, 2004b). Sugere-se que a transposição do rDNA

ocorre em períodos de atividade dos transposons, sendo que esta atividade está relacionada com

condições de estresse (DATSON; MURRAY, 2006; SHISHIDO; SANO; FUKUI, 2000).

2.3 Transcrição e nucléolo

Uma célula eucariota produz, aproximadamente, 1000 tipos diferentes de RNAs, sendo a

maioria desses tipos representados por RNA transportadores - tRNAs e por RNA mensageiros -

mRNAs. Contudo, os rRNAs representam cerca de 80% do conteúdo total de RNA e 20% do

peso celular seco de uma célula em crescimento (WEIDER et al., 2005). Estima-se que 50% da

capacidade transcricional celular esteja envolvido na síntese de rRNA pela RNA polimerase I -

Pol I. O nível de transcrição pela Pol I é diretamente proporcional à demanda de síntese protéica

e, consequentemente, da biogênese ribossomal (RAŠKA et al., 2004; RUSSELL; ZOMERDIJK,

2005; WEIDER et al., 2005). Presumi-se que em torno de 2000 ribossomos são sintetizados por

minuto em uma célula em crescimento, no qual o nível de síntese protéica é alto, direcionando,

assim, a maior parte do metabolismo celular para o processo de biogênese ribossomal

(GRANNEMAN; BASERGA, 2005; RAŠKA et al., 2004; RUSSELL; ZOMERDIJK, 2005;

WEIDER et al., 2005).

Segundo Weider et al. (2005), a biogênese ribossomal é um dos principais processos na

21

biologia celular a partir de uma perspectiva funcional, devido à sua estreita conexão com o ritmo

de crescimento e de desenvolvimento celular. Tal processo é realizado em um subcompartimento

nuclear não delimitado por membrana, o nucléolo (DOUSSET et al., 2000; DUNDR; MISTELI;

OLSON, 2000; GRANNEMAN; BASERGA, 2005; LONG et al., 2008; RAŠKA et al., 2004;

RUSSELL; ZOMERDIJK, 2005). Neste, ocorre a transcrição pela Pol I, originando um pré-

rRNA que será modificado e clivado, resultando nos rRNAs 18S, 5.8S e 25-26S os quais serão

associados à proteínas ribossomais e ao rRNA 5S para a formação das subunidades ribossomais

(DOUSSET et al., 2000; GRANNEMAN; BASERGA, 2005; LONG et al., 2008; OLSON;

DUNDR; SZEBENI, 2000; OLSON; HINGORANI; SZEBENI, 2002; RUSSELL; ZOMERDIJK,

2005; SCHEER; HOCK, 1999). O cumprimento de todos esses eventos é facilitado pela

organização espacial das estruturas nucleolares; são elas: o componente fibrilar denso - DFC, o

componente granular - GC e o centro fibrilar - FC (DOUSSET et al., 2000; DUNDR; MISTELI;

OLSON, 2000; OLSON; DUNDR; SZEBENI, 2000; OLSON; HINGORANI; SZEBENI, 2002;

RAŠKA et al., 2004). O FC é uma estrutura esférica envolvida pelo DFC e acredita-se que o

limite entre essas duas estruturas seja o local de transcrição dos pré-rRNAs (OLSON; DUNDR;

SZEBENI, 2000; OLSON; HINGORANI; SZEBENI, 2002; SCHEER; HOCK, 1999). No DFC

estão os pré-rRNAs e proteínas necessárias para a biossíntese ribossomal, ao passo que o GC

possui as partículas pré-ribossomais que serão destinadas ao citoplasma (OLSON; DUNDR;

SZEBENI, 2000; OLSON; HINGORANI; SZEBENI, 2002). Dessa forma, conclui-se que a

síntese das subunidades ribossomais seja realizada em uma cascata de eventos, que se inicia no

limite físico entre o FC e o DFC e se orienta em direção ao GC (OLSON; HINGORANI;

SZEBENI, 2002; SCHEER; HOCK, 1999; RAŠKA et al., 2004). A produção ribossomal em uma

cascata de eventos é considerada uma vantagem evolutiva, no qual os componentes necessários à

sua realização estariam concentrados em um local ao invés de dispersos no núcleo (OLSON;

HINGORANI; SZEBENI, 2002).

O nucléolo não está presente em todas as fases celulares, pois é dissociado no início da

divisão celular, precedido pela interrupção da transcrição e do processamento dos pré-rRNAs

(DUNDR; MISTELI; OLSON, 2000; OLSON; DUNDR; SZEBENI, 2000). Durante a

dissociação do nucléolo alguns componentes nucleolares se dispersam, no entanto, a maquinaria

de transcrição permanece ancorada à RON (DOUSSET et al., 2000; DUNDR; MISTELI;

OLSON, 2000; OLSON; DUNDR; SZEBENI, 2000; OLSON; HINGORANI; SZEBENI, 2002).

22

Ao final da divisão (fim da anáfase ou início da telófase), o nucléolo volta a se reorganizar

através de um processo denominado nucleologênese, no qual os componentes nucleolares e pré-

rRNAs dispersos voltam ao núcleo e são incorporados à estruturas denominadas corpos pré-

nucleolares que fundem-se, formando o nucléolo (DOUSSET et al., 2000; DUNDR; MISTELI;


Existe uma íntima relação entre a dinâmica nucleolar e a transcrição pela Pol I, sendo que várias

classes de componentes nucleolares estão envolvidos na ativação da Pol I, incluindo os fatores de

transcrição e ligação SL1 e UBF, respectivamente, como também diferentes sítios do fator UBF e

componentes da maquinaria de processamento do pré-rRNA (DOUSSET et al., 2000; DUNDR;

MISTELI; OLSON, 2000; GRANNEMAN; BASERGA, 2005; OLSON; DUNDR; SZEBENI,

2000; OLSON; HINGORANI; SZEBENI, 2002; SCHEER; HOCK, 1999). Todavia, Dousset et

al. (2000) presumem que a nucleologênese, apesar de estar relacionada com a transcrição do

rDNA 45S, necessita de outros mecanismos, como a restauração do processamento do pré-rRNA

(RAŠKA et al., 2004), para que esta ocorra. No Quadro 1 foram apresentados alguns

componentes nucleolares envolvidos no processamento do pré-rRNA e síntese ribossomal.

Apesar da grande demanda de produção de rRNA, existe uma redundância com relação

aos seus genes. Presume-se que em uma célula, com produção máxima de rRNA, somente uma

fração de 50% destes genes são ativamente transcritos (CAPERTA et al., 2002; RUSSELL;

ZOMERDIJK, 2005; WEIDER et al., 2005). Em algumas plantas, como em Pisum sativum, a

fração de genes de rRNA ativos é de 5%, indicando que apenas uma diminuta parte destes genes

parece ser o suficiente para suprir as necessidades da célula (CAPERTA et al., 2002;

GONZÁLEZ-MELENDI et al., 2001). São sugeridos dois mecanismos para o controle

transcricional do rDNA 45S: o ajuste no número de genes ativamente engajados na transcrição

através do remodelamento da cromatina, e o ajuste na taxa de transcrição de cada gene ativo

(JASENČÁKOVÁ, 2003; PIKAARD, 2000a; RAŠKA et al., 2004; RUSSELL; ZOMERDIJK,

2005). Este controle responde às necessidades ribossomais celulares e dependem do estado

fisiológico da célula, como também de fatores externos (PIKAARD, 2000a; RUSSELL;

ZOMERDIJK, 2005; WEIDER et al., 2005). Geralmente, as células tendem a alterarem as taxas

de transcrição dos genes ativos ao invés de ativar genes adicionais. No entanto, apesar da

proporção de genes de rRNA ativos ser estavelmente propagada através do ciclo celular, esta

pode ser alterada por modificações no estado da cromatina, ocasionadas por efeitos epigenéticos

23

(JASENČÁKOVÁ, 2003; RAŠKA et al., 2004; RUSSELL; ZOMERDIJK, 2005; WEIDER et al.,

2005). Assim, o remodelamento da cromatina parece representar um ajuste da atividade gênica a

longo prazo, enquanto que ajustes através da modulação da síntese de rRNA via alteração na

maquinaria de transcrição representa um controle a curto prazo (RAŠKA et al., 2004).

Ribonucleases Endonucleases: B23, RNase P, RNase MRP, PR1, Rnt1p

Exonucleases: Mtr3p, Rat1p, Rrp40p, Rrp41p, Rrp42p, Rrp43p, Rrp44p/Dis3p,

Rrp45p, Rrp46p, Rrp6p, Rrp4p, Xrn1p

Proteínas envolvidas no processamento do pré-rRNA Fibrilarina, Gar2, Gar1p, Imp3p, Imp4p, Mpp10p, Nip7p, Nop1p, Nop2p, Nop4p,

(Nop77p), Nop5p, Nop8p, Nop56p, Nop58p, nucleolina/Nsr1p, p120, Rrp5p, snR10, Sof1p

Helicases Dbp3p, Dbp4p, Dbp6p, Dbp7p, Dbp8p, Dbp9p, Dbp10p, Dob1p, Drs1p, Fa/1p, Mak5p,

Rrp3p, RHII/Gu, Rok1p, Sbp4p, Sen1p

Chaperonas moleculares B23, Hsp70, Hsp72, Hsp32

Proteínas snoRNP com função indefinida Proteína 65kDa, proteína 68kDa, hU3-55k, Nhp2p, Nop10p, p17nhp2, p68, snR42,

snR30

Enzimas de modificação do rRNA e proteínas associadas Cbfp, NAP57, Nop60Bp, Nopp140, Treacher-Collins protein

Quadro 1 - Proteínas nucleolares envolvidas no processamento do pré-rRNA e na biogênese ribossomal

Fonte: Olson, Dundr e Szebeni (2000)

2.4 Organização da cromatina e epigenética

Uma vez que o comprimento total do DNA celular é até 100 vezes maior que o

comprimento de uma célula, é necessário um mecanismo de empacotamento para que este seja

alojado no núcleo celular (LODISH et al., 2003; SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001;

VERMA, 1990). Tal mecanismo é encontrado de maneira geral em células de todos os

eucariotos, e consiste na formação de um complexo de nucleoproteínas denominado cromatina

(JASENČÁKOVÁ, 2003; LEWIN, 2004; LODISH et al., 2003). A cromatina é organizada em

24

unidades básicas, os nucleossomos, que consistem em um centro protéico no qual o DNA enrola-

se em, aproximadamente, 1,7 voltas com ~146 pares de bases (pb) de comprimento (EARLEY et

al., 2007; HESLOP-HARRISON, 2000; JASENČÁKOVÁ, 2003; JIN et al., 2008; LEWIN,

2004; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; LODISH et al., 2003; PETERSON; LANIEL, 2004;

SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001; VERMA, 1990; WAGNER; MAGUIRE; STALLINGS,

1993). O centro protéico é um octâmero formado por duas moléculas das histonas H2A, H2B, H3

e H4, sendo que no octâmero as histonas H2A e H2B formam dois dímeros (H2A-H2B)2, e as

histonas H3 e H4 formam um tetrâmero (H32-H42) (EARLEY et al., 2007; JIN et al., 2008;

JASENČÁKOVÁ, 2003; JASENCAKOVA et al., 2000; LEWIN, 2004; LI; BUTENKO; GRAFI,

2005; LODISH et al., 2003; PETERSON; LANIEL, 2004; SHILATIFARD, 2006; TURNER,

2001; VERMA, 1990; WAGNER; MAGUIRE; STALLINGS, 1993). Os nucleossomos

adjacentes são interligados por uma dupla fita de DNA livre, denominado DNA de ligação, com

comprimento que varia de 15 a 55 pb (HESLOP-HARRISON, 2000; JASENČÁKOVÁ, 2003;

LEWIN, 2004; LODISH et al., 2003; PETERSON; LANIEL, 2004; VERMA, 1990; WAGNER;

MAGUIRE; STALLINGS, 1993).

Dois tipos de fibra de cromatina podem ser observadas: a fibra de 10 nm de diâmetro e a

fibra de 30nm de diâmetro (LEWIN, 2004). A fibra de 10 nm é uma cadeia flexível com aspecto

de “colar de contas”, no qual cada esfera corresponde a um nucleossomo (JASENČÁKOVÁ,

2003; LEWIN, 2004; LODISH et al., 2003; PETERSON; LANIEL, 2004; SHILATIFARD,

2006; TURNER, 2001; VERMA, 1990; WAGNER; MAGUIRE; STALLINGS, 1993). O

segundo nível de organização é a fibra de 30 nm, considerada como a subunidade principal da

estrutura dos cromossomos (HESLOP-HARRISON, 2000; LEWIN, 2004; VERMA, 1990).

Nesta, os nucleossomos são dobrados em um espiral irregular (ou arranjo solenóide) com,

aproximadamente, seis nucleossomos por volta (LEWIN, 2004; LODISH et al., 2003; VERMA,

1990; WAGNER; MAGUIRE; STALLINGS, 1993). Sugere-se que tal conformação seja

facilitada pela histona H1, situada na região do DNA de ligação imediatamente adjacente ao

nucleossomo (JASENČÁKOVÁ, 2003; LEWIN, 2004; PETERSON; LANIEL, 2004; TURNER,

2001; WAGNER; MAGUIRE; STALLINGS, 1993). Segundo Lodish et al. (2003) a cromatina

em regiões cromossomais que não estão sendo transcritas encontra-se sob a forma condensada,

em fibra de 30 nm ou em uma estrutura mais condensada, enquanto que as regiões da cromatina

transcricionalmente ativas encontra-se na forma distendida de fibra de 10 nm.

25

Sabendo-se que os termos heterocromatina e eucromatina são classificações aplicadas às

regiões cromossômicas transcricionalmente inativas e ativas, respectivamente, foi possível

compreender o padrão de organização da cromatina da RON (CAPERTA et al., 2002;

JASENČÁKOVÁ, 2003; LEWIN, 2004; LODISH et al., 2003; RAŠKA et al., 2004). Tal modelo

propõe que a RON ativa possui dois domínios, funcionalmente e estruturalmente, diferentes.

Esses domínios incluem um grupo heterocromático com genes de rRNA inativos, e um grupo

eucromático com genes de rRNA ativos, o que condiz com o fato de que somente uma fração dos

genes de rRNA da RON ativa é transcrita (CAPERTA et al., 2002; NEVES et al., 2005). Tanto o

grupo heterocromático, quanto o eucromático da RON podem sofrer modificações covalentes que

atuam no remodelamento da cromatina e afetam diretamente a atividade transcricional nesta

região (HESLOP-HARRISON, 2000; NEVES et al., 2005; SHILATIFARD, 2006).

O remodelamento da cromatina pode impedir ou facilitar a ligação dos fatores de

transcrição aos seus sítios, promovendo o silenciamento ou a ativação gênica (ALBERTS et al.,

2002; ATTWOOD; YUNG; RICHARDSON, 2002; EARLEY et al., 2007; FUCHS, J. et al.,

2006; JASENCAKOVA et al., 2000; LEWIN, 2004). Este modo de regulação gênica tem sido

referido como “regulação epigenética”, que denota um estado herdável da estrutura da cromatina,

ocasionadas por modificações covalentes em nucleotídeos e pós-traducionais em histonas, sendo

independente de sua sequência de nucleotídeos (FUCHS, J. et al., 2006; HESLOP-HARRISON,

2000; JASENČÁKOVÁ, 2003; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; NEVES et al., 2005;

RICHARDS, 2006; SHILATIFARD, 2006). Apesar de reversível, uma vez que a estrutura da

cromatina é estabelecida por essas modificações, esta pode persistir através das divisões celulares

e serem conservadas ao longo das gerações (FUCHS, J. et al., 2006; LEWIN, 2004; RICHARDS,

2006; SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001).

Cada uma das histonas que compõem o octâmero nucleossomal possui uma cadeia de

aminoácidos terminais, denominada cauda N-terminal, que se estendem do nucleossomo

(LEWIN, 2004; LODISH et al., 2003; PETERSON; LANIEL, 2004; SHILATIFARD, 2006;

WAGNER; MAGUIRE; STALLINGS, 1993). Os resíduos de aminoácidos das caudas N-

terminais são sujeitos a diversas modificações pós-traducionais, que incluem carbonilação,

fosforilação, ubiquitinação, glicosilação, sumoilação, ADP-ribosilação e, principalmente,

acetilação e metilação (Figura 2) (EARLEY et al., 2007; JASENČÁKOVÁ, 2003;

JASENCAKOVA et al., 2000; LEWIN, 2004; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; LODISH et al.,

26

2003; PETERSON; LANIEL, 2004; SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001; WAGNER;

MAGUIRE; STALLINGS, 1993). Cada modificação pós-traducional, ou a combinação de

modificações, implica em diferentes efeitos na estrutura e função da cromatina e são

correlacionadas com funções biológicas particulares (FUCHS, J. et al., 2006; JIN et al., 2008;

LEWIN, 2004; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; LODISH et al., 2003; PETERSON; LANIEL,

2004; SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001). Alguns desses efeitos estão descritos na Tabela

1. Apesar da existência de diversas modificações pós-traducionais, nosso trabalho tomou por foco

as acetilações e metilações nos resíduos de lisina das histonas H3 e H4, e as conseqüências dessas

modificações na regulação da expressão gênica das regiões organizadoras do nucléolo.

Figura 2 – Diagrama demonstrando os sítios de acetilação e metilação nas caudas N-terminais do tetrâmero de histonas H3 e H4

27

Tabela 1 – Algumas modificações pós-traducionais em histonas e seus efeitos na estrutura e

função da cromatina (continua)

Histona Sítio

(lisina)

Modificação Função

H3 4 Metilação Silenciamento telomérico

Ativação transcricional

Relacionado com a eucromatina

Acetilação Ativação transcricional

9 Metilação Manutenção da heterocromatina

Silenciamento transcricional

Relacionado com a heterocromatina (mono-, di-Me)

Relacionado com a eucromatina (tri-Me)


14 Acetilação Ativação transcricional

Reparo do DNA


Reparo do DNA

Replicação do DNA


Reparo do DNA

27 Metilação Silenciamento transcricional

Relacionado com a heterocromatina (mono-, di-, tri-Me)

Relacionado com a eucromatina (di-, tri-Me)



Ativação transcricional


79 Metilação Silenciamento telomérico


28

Tabela 1 – Algumas modificações pós-traducionais em histonas e seus efeitos na estrutura e função da cromatina

(conclusão) Histona Sítio

(lisina)

Modificação Função

H4 5 Acetilação Ativação transcricional





20 Metilação Relacionado com a eucromatina (di-, tri-Me)

Relacionado com a heterocromatina (mono-Me)



Fontes: Alberts et al. (2002) Fuchs, J. et al. (2006), Peterson e Laniel (2004) e Shilatifard (2006)

As acetilações são catalizadas por uma família de proteínas denominadas histona

acetiltransferase - HAT e podem ocorrer na cauda N-terminal de todas as histonas que formam o

octâmero nucleossomal (ALBERTS et al., 2002; FUCHS, J. et al., 2006; LEWIN, 2004; LODISH

et al., 2003; TURNER, 2001). Contudo, os principais sítios de acetilação são os resíduos de lisina

nas posições 4, 9, 14, 18, 23 e 27 da histona H3, e nas posições 5, 8, 12, 16, e em plantas 20 da

histona H4 (Figura 2) (FUCHS, J. et al., 2006; JASENČÁKOVÁ, 2003; JASENCAKOVA et al.,

2000; LEWIN, 2004; LODISH et al., 2003; PETERSON; LANIEL, 2004; TURNER, 2001).

Existe uma correlação entre a acetilação de histonas e a cromatina transcricionalmente

ativa, sendo demonstrada em diversos experimentos que utilizam inibidores das enzimas histona

desacetilase - HDAC, tais como Tricostatina A, ácido butírico e butirato de sódio (EARLEY et

al., 2007; FUCHS, J. et al., 2006; JASENČÁKOVÁ, 2003; JASENCAKOVA et al., 2000;

LAWRENCE et al., 2004; LEWIN, 2004; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; LODISH et al., 2003;

WAGNER; MAGUIRE; STALLINGS, 1993). A cauda N-terminal das histonas contém grandes

quantidades de aminoácidos básicos, como lisinas e argininas, resultando em uma carga positiva

e possibilitando sua interação com o DNA de ligação. Ao ocorrer a acetilação, as cargas positivas

do grupo NH+3 dos aminoácidos básicos são neutralizados, eliminando, assim, sua interação com

29

o grupo fosfato do DNA, resultando em uma estrutura da cromatina menos condensada e

facilitando o acesso dos fatores regulatórios ao DNA (JASENČÁKOVÁ, 2003; LEWIN, 2004;

LODISH et al., 2003; TURNER, 2001). A acetilação é um processo reversível, sendo que a

remoção dos grupos acetil (desacetilação) é mediada pelas enzimas histona desacetilases -

HDACs, e é, geralmente, requerida para o silenciamento transcricional (ALBERTS et al., 2002;

EARLEY et al., 2007; FUCHS, J. et al., 2006; JASENČÁKOVÁ, 2003; LEWIN, 2004;

PETERSON; LANIEL, 2004; TURNER, 2001).

A transferência de um grupo metil do S-adenosilmetionina - SAM para os resíduos de

aminoácidos das histonas é realizada pela enzima histona metiltransferase - HMT (PETERSON;

LANIEL, 2004; SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001). Os principais sítios de metilação

referem-se às argininas nas posições 2, 17 e 26 e lisinas nas posições 4, 9, 17, 27, 36 e 79 da

histona H3, e às lisinas nas posições 20 (em animais) e 59 e arginina na posição 3 da histona H4

(Figura 2), sendo que as lisinas podem adquirir até três grupos metil, enquanto que a arginina

pode receber apenas dois (FUCHS, J. et al., 2006; JASENČÁKOVÁ, 2003; LEWIN, 2004;

PETERSON; LANIEL, 2004; SHILATIFARD, 2006; TURNER, 2001). Por outro lado, a

metilação, geralmente associada com a inatividade transcricional da cromatina, não remove as

cargas da cauda N-terminal, mas promove o recrutamento da HP1, proteína envolvida na

formação de heterocromatina e silenciamento gênico (JASENČÁKOVÁ, 2003;

JASENCAKOVA et al., 2003; LEWIN, 2004; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; RICHARDS,

2006; TURNER, 2001). No entanto, esta não é uma regra simples, pois há exceções na qual a

metilação de histonas é correlacionada com sítios transcricionalmente ativos no DNA. Como

exemplo, temos a metilação nas lisinas 4 e 9 da histona H3 que pode representar tanto a

atividade, como o silenciamento transcricional (Tabela 1) (FUCHS, J. et al., 2006;

JASENČÁKOVÁ, 2003; LAWRENCE et al., 2004; LEWIN, 2004; SHILATIFARD, 2006).

Outra modificação epigenética envolvida no controle da transcrição é a metilação do

carbono 5 nas citosinas do DNA. Essa modificação é catalisada pela enzima metiltransferase, a

qual transfere um grupo metil para a posição 5 do anel pirimidínico. As metilações não ocorrem

ao acaso no DNA, mas em locais específicos que incluem os sítios simétricos CpG e CpNpG

(N=G, C, T, A) e os sítios assimétricos CpHpH (H=C, A, T) (ATTWOOD; YUNG;

RICHARDSON, 2002; CASTILHO et al., 1999; GRAFI; ZEMACH; PITTO, 2007; INAMDAR;

EHRLICH; EHRLICH, 1991; LEWIN, 2004).

30

Diversos experimentos utilizando inibidores das metiltransferases (5-azacitidina e 5-aza-

2-desoxicitosina) demonstraram a correlação positiva entre a metilação das citosinas e o

silenciamento gênico, sendo este realizado por vários mecanismos (ATTWOOD; YUNG;

RICHARDSON, 2002; CASTILHO et al., 1999; GRAFI; ZEMACH; PITTO, 2007; INAMDAR;

EHRLICH; EHRLICH, 1991; LAWRENCE et al., 2004; LEWIN, 2004). Dentre estes

mecanismos há dois principais: o primeiro compreende na incapacitação dos fatores de

transcrição de se ligarem às suas sequências regulatórias a partir da ligação de proteínas

específicas - MDB aos sítios metilados no DNA (ATTWOOD; YUNG; RICHARDSON, 2002;

GRAFI; ZEMACH; PITTO, 2007; LEWIN, 2004). No segundo mecanismo, as MDBs são

capazes de recrutar complexos protéicos contendo atividade histona desacetilase, como também

complexos protéicos com atividade histona metiltransferase, o que estabelece uma configuração

compacta da cromatina, dificultando o acesso aos enhancers e promotores pela maquinaria de

transcrição (ATTWOOD; YUNG; RICHARDSON, 2002; GRAFI; ZEMACH; PITTO, 2007;

PIKAARD, 2000a).

Lawrence et al. (2004) e Preuss e Pikaard (2007), ao utilizarem inibidores da metilação da

citosina e inibidores da enzima histona desacetilase em seus experimentos, observaram que a

RON inativa e os genes de rRNA silenciados da RON ativa eram reativados, demonstrando que

os arranjos de rDNA estão sujeitos ao remodelamento da cromatina, e, consequentemente, do

controle da expressão dos genes de rRNA a partir de eventos epigenéticos. Acredita-se que o

responsável pelo remodelamento da cromatina do arranjo do rDNA seja um complexo protéico

ATP-dependente, denominado complexo de remodelamento do nucléolo - NoRC, capaz de

mediar a desacetilação da histona H4, a dimetilação da lisina 9 da histona H3 e a metilação do

DNA, estabelecendo, assim, uma característica heterocromática na região promotora dos genes

de rRNA (NEVES et al., 2005; PREUSS; PIKAARD, 2007; RAŠKA et al., 2004; SANTORO;

GRUMMT, 2005).

Com relação ao remodelamento do rDNA 45S é proposto um modelo de mecanismo que

se inicia com o recrutamento do NoRC pelo fator transcricional de terminação TTF-I unido ao

sítio adjacente ao promotor do gene de rRNA. Uma vez recrutado ao rRNA, o NoRC interagem

com enzimas com atividade HDAC e DNA metiltransferase, resultando na compactação da

cromatina (PREUSS; PIKAARD, 2007; RAŠKA et al., 2004; SANTORO; GRUMMT, 2005). A

metilação do DNA possibilita, ainda, a desacetilação de histonas via MDB, potencializando a

31

condensação da cromatina (SANTORO; GRUMMT, 2005). Santoro e Grummt (2005)

demonstraram que o NoRC também está relacionado com a dimetilação da lisina 9 da histona H3,

no entanto, não se sabe ao certo o que desencadeia tal processo. Provavelmente, este ocorre

através do recrutamento de HTM aos genes de rRNA pelo NoRC, ou então, pelo recrutamento de

HTM aos genes de rRNA pelas MDBs ligadas ao DNA metilado (SANTORO; GRUMMT,

2005). Entretanto, este modelo foi desenvolvido conforme observações em mamíferos. Através

dessas informações, podemos constatar a importância dos mecanismos epigenéticos na expressão

do nucléolo e, consequentemente, na dominância nucleolar.

2.5 Dominância nucleolar

Dominância nucleolar é um fenômeno no qual ocorre a transcrição preferencial dos genes

de rRNA provindo de um dos genitores, resultando no silenciamento total, ou parcial do grupo de

genes de rRNA originados do outro genitor (McSTAY, 2006; NEVES et al., 2005; PIKAARD,

1999, 2000a). Em geral, é observado em híbridos interespecíficos ou alopoliplóides de diversos

gêneros de plantas, incluindo Brassica, Triticum, Hordeum, Secale e Arabdopsis (CHEN;

PIKAARD, 1997a, 1997b; EARLEY et al., 2006; FLAVELL, 1989; HOUCHINS et al., 1997;

LAWRENCE et al., 2004; LEWIS; CHEVERUD; PIKAARD, 2004; NEVES et al., 1997;

PONTES et al., 2003). Não obstante, já existem evidências deste fenômeno em espécies diplóides

como Secale cereale (CAPERTA et al., 2002).

A dominância nucleolar foi primeiramente observada por Navashin, em 1928, quando

estudava cariótipos de várias espécies do gênero Crepis. Ao analisar cariótipos de 21

combinações de híbridos, Navashin notou que 13 falhavam na formação da constrição secundária

no complemento cromossômico de um dos genitores e denominou este fenômeno como

‘anfiplastia diferencial’, mas atualmente é conhecido como dominância nucleolar (CHEN;

PIKAARD, 1997a; McSTAY, 2006; PIKAARD, 1999, 2000a, 2000b; PONTES et al., 2003;

PREUSS; PIKAARD, 2007). Posteriormente, Navashin observou que nas progênies cujo

cariótipo era restaurado para o ‘original’, ou seja, similar a um dos genitores do híbrido, havia a

formação de constrição secundária nos complementos cromossômicos herdados de ambos

genitores, indicando que a dominância nucleolar é um fenômeno reversível (revisão em

PIKAARD, 1999, 2000a 2000b; PREUSS; PIKAARD, 2007). McClintock, ao analisar os dados

de Navashin, sugeriu que as RONs derivadas de espécies diferentes podem ser organizadas em

32

uma dominância hierárquica com relação à sua habilidade de formar o nucléolo. Assim, se uma

espécie A for dominante sobre a espécie B, ou seja, em um híbrido AB somente a RON da

espécie A é ativa, e se a espécie B for dominante sobre a espécie C, então a espécie A seria

dominante sobre as espécies B e C. Tal hierarquia foi comprovada posteriormente por

cruzamentos testes feitos por Wallace e Langridge (McSTAY, 2006; PIKAARD, 1999, 2000a,

2000b). Hierarquias análogas de dominância nucleolar podem ser encontradas em alotetraplóides

originados de espécies diplóides do gênero Brassica (CHEN; PIKAARD, 1997a, 1997b).

Sabendo-se da íntima relação entre a transcrição dos genes rRNAs das RONs e a

formação nucleolar, pode-se inferir que a dominância nucleolar seja um processo controlado por

meio da expressão gênica. Por conseguinte, duas hipóteses foram sugeridas: a hipótese de fatores

de transcrição espécie-específicos (species-specific transcription factor hypothesis) e a hipótese

do desequilíbrio de enhancers (enhancer-imbalance hypothesis) (CHEN; PIKAARD, 1997a;

PIKAARD, 1999, 2000a, 2000b). A primeira hipótese integra a rápida evolução interespecífica

das sequências regulatórias presentes nos IGSs dos genes de rRNA e a co-evolução dos fatores de

transcrição que reconhecem essas sequências. Consequentemente, as sequências regulatórias dos

genes de rRNA de uma espécie não são, frequentemente, reconhecidas pelos fatores de

transcrição da Pol I de espécies não relacionadas devido à incompatibilidade. Assim, o

silenciamento dos genes que codificam os fatores de transcrição herdados de um dos genitores

em um híbrido pode, de uma maneira concebível, resultar no completo silenciamento dos genes

de rRNA herdados deste genitor (CHEN; PIKAARD, 1997a; McSTAY, 2006; PIKAARD, 1999,

2000a, 2000b; PONTES et al., 2003). Contudo, esta hipótese não é aplicada para explicar a

dominância nucleolar em espécies estreitamente relacionadas e capazes de realizar cruzamentos,

como ocorre nos gêneros Brassica e Arabidopsis (CHEN; PIKAARD, 1997a, 1997b; PIKAARD,

1999, 2000a, 2000b; PONTES et al., 2003), e muito menos nos casos de dominância nucleolar

em uma mesma espécie, como é o caso do trigo hexaplóide (Triticum aestivum) (FLAVELL,

1989), do cultivar ‘Imperial’ de centeio (Secale cereale) (CAPERTA et al., 2002, 2007) ou de

híbridos intra-específicos de Arabidopsis thaliana (LEWIS; CHEVERUD; PIKAARD, 2004). Os

genitores envolvidos nestes eventos apresentavam sequências regulatórias dos genes de rRNA

similares.

Na segunda hipótese é proposto que diferenças na sequência ou no número de elementos

repetitivos (enhancers), situados nos IGSs, entre as RONs resultam em uma maior afinidade dos

33

fatores de transcrição pela RON dominante. Portanto, haveria uma competição entre os

promotores e enhancers acessíveis aos fatores de transcrição, que estariam numa concentração

limitada, assim, a RON que possuísse um maior número de promotores ou enhancers livres, ou

uma maior afinidade do enhancer em se ligar ao fator de transcrição, seria dominante sobre a

outra RON (CHEN; PIKAARD, 1997a, 1997b; HOUCHINS et al., 1997; LEWIS; CHEVERUD;

PIKAARD, 2004; McSTAY, 2006; PIKAARD, 1999, 2000a, 2000b). Em plantas, a correlação

entre o tamanho do IGS e a dominância nucleolar é evidenciada em trigo (Triticum aestivum).

Este cereal hexaplóide possui múltiplas RONs, no entanto, as RONs que possuem espaço

intergênico maior são preferencialmente expressas (CHEN; PIKAARD, 1997b; FLAVELL,

1989; HOUCHINS et al., 1997; LEWIS; CHEVERUD; PIKAARD, 2004; PIKAARD, 1999,

2000a; SARDANA; O’DELL; FLAVELL, 1993). Assim como a hipótese de fatores de

transcrição espécie-específicos, a hipótese do desequilíbrio de enhancers não é aplicada para

todos os casos, como por exemplo, em híbridos do gênero Brassica e Arabidopsis (CHEN;

PIKAARD, 1997b; PIKAARD, 1999, 2000a, 2000b; PONTES et al., 2003), híbridos

intraespecíficos (LEWIS; CHEVERUD; PIKAARD, 2004) e em espécies diplóides (CAPERTA

et al., 2002, 2007), pois estes apresentam RONs com similaridade genética.

Existem evidências substanciais de que a base molecular para a dominância nucleolar seja

o silenciamento seletivo do conjunto de genes de rRNA de um dos genitores através do

remodelamento da cromatina, resultante de modificações epigenéticas. A utilização de inibidores

da atividade da enzima citosina metiltransferase (5-aza-2’desoxicitidina, aza-dC), em

experimentos com espécies com dominância nucleolar, resultou na reativação da RON suprimida,

como também no aumento da expressão da RON dominante (CAPERTA et al., 2007; CHEN;

PIKAARD, 1997a; LAWRENCE et al., 2004). Baseados no uso da endonucleases de restrição

Hpa II que reconhece e cliva sequências CCGG, desde que esta não esteja metilada, Chen e

Pikaard (1997a), Houchins et al. (1997), Sardana, O’Dell e Flavell (1993) demonstraram que a

RON dominante era preferencialmente clivada. Seguindo a mesma linha de raciocínio Lawrence

et al. (2004) e Earley et al. (2006) empregaram a técnica ChIP-chop PCR após tratamento com

McrBC, uma endonuclease de restrição que cliva os locais com citosinas metiladas do DNA,

dessa forma, o DNA com citosinas metiladas seria clivado pela enzima e não poderia ser

amplificado por PCR. Ambos os trabalhos revelaram que a RON dominante era resistente à

enzima e, então, hipometilada, enquanto que a RON silenciada não apresentou produto de PCR,

34

demonstrando seu estado hipermetilado. Em adição, Lawrence et al. (2004) realizaram o

sequenciamento de promotores dos genes de rRNA após tratamento com bissulfito. O bissulfito

catalisa a conversão da citosina em uracila, sendo que a reação é bloqueada se a citosina for

metilada. Assim, Lawrence et al. (2004) revelaram que a maioria dos promotores da RON

silenciada eram extensivamente metiladas. Tais evidências confirmam o papel da metilação do

DNA na dominância nucleolar.

Em certos híbridos, nenhuma diferença considerável no status de metilação dos genes de

rRNA das RONs silenciada e ativa foi encontrada, sugerindo que somente a metilação do DNA

não explica a dominância nucleolar em todos os organismos (CHEN; PIKAARD, 1997a;

PIKAARD, 1999, 2000a, 2000b; PREUSS; PIKAARD, 2007). Tais resultados induziram uma

investigação sobre o papel das modificações de histonas na dominância nucleolar. Assim como o

tratamento com aza-dC, tratamentos com butirato de sódio ou tricostatina A - TSA (químicos

que inibe a atividade histona desacetilase) ou, ainda, o silenciamento de histona desacetilases

através de RNA de interferência resultaram na reativação de genes de rRNA silenciados,

indicando a participação das modificações de histonas na dominância nucleolar (CHEN;

PIKAARD, 1997a; EARLEY et al., 2006; LAWRENCE et al., 2004). Notavelmente, o

tratamento com aza-dC e TSA não revelou efeito adicional aos tratamentos com apenas um

inibidor, o que sugere a ação conjunta da metilação de citosinas e a desacetilação de histonas no

silenciamento dos genes de rRNA e na dominância nucleolar ao nível de estrutura de cromatina

(CHEN; PIKAARD, 1997a; LAWRENCE et al., 2004). Com relação aos organismos que não

apresentam diferença considerável no status de metilação de citosinas entre as RONs, a atividade

histona desacetilase parece não estar relacionada com a metilação, assim, devem existir outros

sinais moleculares importantes para especificar o local de remodelamento da cromatina

(PIKAARD, 1999).

Além da verificação do papel da histona desacetilase na dominância nucleolar, foi descrito

quais modificações histônicas estão relacionadas com esse fenômeno. Experimentos com

imunoprecipitação da cromatina - ChIP e espectometria de massa têm demonstrado que

promotores de genes de rRNA ativos estão relacionados com a acetilação das lisinas 9 e 14 da

histona H3, acetilação das lisinas 5, 8, 12 e 16 da histona H4, como também com a trimetilação

da lisina 4 da histona H3, enquanto que o silenciamento gênico está relacionado com a

dimetilação da lisina 9 da histona H3 (EARLEY et al., 2006, 2007; LAWRENCE et al., 2004).

35

No entanto, estes experimentos não revelaram marcas para acetilação das lisinas 14 e 23 da

histona H3 nas RONs, sugerindo que estas modificações não estão relacionadas com a

dominância nucleolar (EARLEY et al., 2006). A partir da técnica ChIP-chop PCR após

tratamento com McrBC, Earley et al. (2006) demonstraram que os promotores em associação

com acetilação nas lisinas 9 e 14 e trimetilação da lisina 4 da histona H3 eram resistentes à

digestão com McrBC, indicando que estas modificações de histonas, em especial, são vinculadas

à hipometilação de citosinas em genes de rRNA ativos.

Apesar do grande progresso que os estudos sobre modificações epigenéticas na

dominância nucleolar têm realizado, questões de como as RONs são selecionadas para o

silenciamento permanecem sem resposta (LEWIS; CHEVERUD; PIKAARD, 2004; McSTAY,

2006). Dessa forma, podemos concluir que a compreensão dos mecanismos da dominância

nucleolar é importante para o entendimento de como o remodelamento da cromatina está

envolvido na expressão geral dos genes.

2.6 Crotalaria retusa como modelo no estudo da expressão nucleolar

Crotalaria é um gênero pertencente à família Leguminosae-Papilionoideae, com

aproximadamente, 600 espécies descritas com distribuição tropical e subtropical (FLORES,

2004). Nas Américas foram descritas 71 espécies, sendo mais da metade endêmicas do Brasil

(FLORES, 2004). Em geral, citogeneticamente as espécies são caracterizadas pela presença da

região organizadora do nucléolo localizada no braço curto do primeiro par de cromossomos

(OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999).

Crotalaria retusa é uma espécie cultivada, em rotação de cultura, para a cobertura do solo

e fixação de nitrogênio atmosférico. Esta espécie cresce naturalmente em diferentes regiões do

país, principalmente em locais onde predominam cerrados e campos (FLORES, 2004; JACOBI,

2005). A caracterização citogenética desta espécie revelou apenas uma constrição secundária no

braço curto do cromossomo 1 (OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999) e a hibridação in situ

com sonda de rDNA 45S não mapeou sítios adicionais àquele do cromossomo 1 (MONDIN et al.,

2007b).

Experimentos prévios envolvendo dois acessos de C. retusa permitiram a observação de

células interfásicas contendo mais de um nucléolo, sendo que em muitas dessas células os

nucléolos eram nitidamente de tamanhos diferentes (FUCHS, M.C.P. et al., 2006). Células

36

multinucleoladas no gênero Crotalaria haviam sido descritas anteriormente nas espécies C.

juncea e C. agatiflora (MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007a; VERMA;

RAINA 1981). No caso de C. juncea, além da presença de vários nucléolos, devido a um sítio

adicional de rDNA 45S, foi demostrado que RONs homólogas podem gerar nucléolos de

tamanhos distintos (MONDIN, 2003; MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN,

2007a). Pelas características apresentadas, C. retusa tornou-se um modelo interessante para o

estudo da dominância nucleolar em espécies diplóides.

37

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material vegetal

No presente trabalho foram estudados dois acessos (denominados como CRT-1 e CRT-2)

da espécie Crotalaria retusa L., pertencente à seção Crotalaria da família Leguminosae-

Papilionoideae. Estes acessos fazem parte do banco de sementes mantido pelo Departamento de

Genética da ESALQ/USP. O acesso CRT-1 é um cultivar cedido anteriormente pela Pirahy

Sementes (Piracicaba – SP) e multiplicado no Departamento de Genética, enquanto que o acesso

CRT-2 é originário de uma população periférica, de tamanho reduzido, coletado em ambiente

litorâneo, mais especificamente na orla de Ilhéus – BA, e multiplicado no Departamento de

Genética.

Crotalaria retusa, popularmente conhecida como chocalho, xique-xique, amendoim-

bravo, guizo-de-cascavel, mata-pasto-roxa e cascaveleira, possui provável centro de origem na

Ásia, mas foi amplamente introduzida em todo o mundo, inclusive no Brasil, como planta fibrosa

e adubo verde, sendo encontrada em locais alterados ou sob cultivo (FLORES, 2004). Segundo

Jacobi (2005), C. retusa é a espécie exótica, do gênero Crotalaria, mais abundante na costa

atlântica do Nordeste do Brasil, seguida pelas espécies C. pallida e C. lanceolata.

3.2 Germinação

Para a germinação, as sementes foram quimicamente escarificadas com ácido sulfúrico

P.A., durante 20 a 30 minutos e, em seguida, lavadas cuidadosamente em água corrente, até que

todo o ácido fosse eliminado. As sementes lavadas foram postas para secar em papel filtro por 12

horas, e após a secagem as sementes foram embebidas em placa de Petri contendo papel filtro

umedecido, até a germinação das sementes. Após a germinação, as sementes foram semeadas em

Sphagnum umedecido sob temperatura controlada de 28 a 30ºC.

Em aproximadamente 18 horas, as raízes alcançaram tamanho de 1 a 3 cm de

comprimento, adequado para a realização da coleta e pré-tratamento.

3.3 Pré-tratamento com inibidor do fuso mitótico

As raízes coletadas foram submetidas ao pré-tratamento com inibidores do fuso mitótico

de acordo com Cuco et al. (2003), com algumas alterações. Em seguida à coleta, as raízes foram

38

colocadas solução de hidroxiquinolina a 300 ppm + cicloheximida 25 ppm por 1 hora e 30

minutos sob temperatura controlada de 28 a 30ºC. Este pré-tratamento permite a obtenção de

preparações citológicas com alta freqüência de prometáfases e metáfases mitóticas com nitidez

em sua morfologia.

O material pré-tratado foi fixado em solução de Carnoy (3 partes de etanol e 1 parte de

ácido acético) por 24 horas e, posteriormente, armazenado a -4°C até a preparação citológica. As

raízes destinadas à coloração convencional pelo método de Feulgen, após a fixação, foram

transferidas para uma solução de etanol a 70%, no qual foram mantidas sob temperatura

controlada de 28 a 30ºC por 24 horas e, posteriormente, armazenadas a -4°C até o momento da

coloração.

3.4 Coloração com método de Feulgen

As raízes armazenadas em solução de etanol a 70% a -4°C foram deixadas atingir

temperatura ambiente. A seguir, foram lavadas duas vezes em água destilada, por 5 minutos cada,

e então hidrolisadas por 8 minutos em solução de HCl 1N pré-aquecida em banho-maria a 60ºC.

Após a hidrólise as raízes foram novamente lavadas duas vezes em água destilada por 5 minutos

cada, e transferidas para o reativo de Schiff. A reação com o reativo de Schiff foi realizada em

câmara escura durante 45 minutos. Em seguida o material foi lavado em água corrente em placas

de Petri para a retirada do excesso de reativo.

3.5 Preparação de lâminas

Para a preparação de lâminas, as raízes armazenadas em fixador de Carnoy ou as raízes

coradas pelo método de Feulgen, já em temperatura ambiente, foram lavadas em tampão citrato

(citrato trissódico + ácido cítrico, 0,01M, pH 4,6) por 5 minutos e, em seguida, colocadas em

microtubos contendo solução enzimática (celulase a 9,2 u/ml e pectinase a 14,9 u/ml) pré-

aquecida a 37°C, e mantidas a esta temperatura por 50 minutos. Após a digestão enzimática, as

raízes foram lavadas em tampão citrato frio, em placa de Petri mantida sobre um bloco de gelo.

Cada lâmina corresponde a uma única raiz que foi retirada do tampão citrato e transferida

para uma solução de ácido acético a 60% e mantidas neste até atingir um aspecto transparente.

Logo a seguir, a raiz foi colocada sobre a lâmina, e seu meristema foi cuidadosamente dissociado

com auxílio de uma pinça fina. Após a dissociação, o material foi coberto por lamínula e levemente

39

esmagado entre papel de filtro para a retirada do excesso de ácido acético e permitir o espalhamento dos

cromossomos. Após este procedimento, as lâminas foram analisadas em microscópio, sendo as lâminas

destinadas às colorações com fluorocromos, nitrato de prata e para hibridação molecular in situ

fluorescente - FISH analisadas em microscópio de contraste de fase.

As melhores lâminas preparadas com raízes coradas pelo método de Feulgen e as

destinadas ao bandamento Ag-RON tiveram as lamínulas removidas em solução de ácido acético

a 45%. Lâmina e lamínula foram secas ao ar e as lâminas preparadas com raízes coradas pelo

método de Feulgen foram montadas permanentemente com bálsamo do Canadá. As lâminas

destinadas ao bandamento Ag-RON foram coradas imediatamente após a secagem ao ar.

As melhores lâminas destinadas à coloração com fluorocromos e FISH tiveram suas

lamínulas removidas em nitrogênio líquido, secas ao ar e conservadas a -20°C em cubas altas

com sílica gel para evitar a hidratação.

3.6 Bandamento Ag-RON

A coloração de lâminas com nitrato de prata foi baseado no protocolo de Howell e Black

(1980), com algumas modificações de acordo com Mondin (2003). Este protocolo consiste na

utilização de duas soluções estoque, misturadas imediatamente antes do uso. Tais soluções

estoque são: uma solução de nitrato de prata (AgNO3) a 50% e um revelador coloidal (solução de

gelatina a 2% em ácido fórmico a 1% de concentração final).

Sobre uma lâmina, preparada com raízes com não mais de dois dias de fixação, foram

aplicadas duas gotas de revelador coloidal e duas gotas de solução de nitrato de prata a 50%.

Cobriu-se com lamínula e encubou-se em câmara úmida a 60ºC, por um tempo variando de 5 a 10

minutos, até que a solução apresentasse coloração dourada. Após o tempo de coloração a

lamínula foi removida em água deionizada, as lâminas foram secas ao ar e montadas em

Entellan®.

3.7 Coloração com fluorocromos

A coloração com fluorocromos foi realizada conforme Mondin (2003).

As lâminas armazenadas a -20ºC foram retiradas do freezer e deixadas nas cubas até

atingirem temperatura ambiente. Após atingirem a temperatura desejada foram submetidas à

40

coloração com fluorocromos, sendo que todo o processo de coloração foi realizado em ambiente

escuro.

3.7.1 Coloração com 4’- 6’ diamidino - 2 – fenilindol - DAPI

Sobre a lâmina foram aplicados 50 µl de solução de DAPI, diluída em tampão McIlvaine

(pH 7,0) na concentração de 0,2 µg/ml e recoberto com uma lamínula de parafilme (Parafilm). As

lâminas com corante foram, então, colocadas em banho-maria a 37ºC durante 30 minutos. Após o

tempo de coloração, a lamínula foi retirada e a lâmina lavada em água deionizada e seca ao ar.

Depois de secas, as lâminas foram montadas com 5 µl de Vectashield H-1000 e armazenadas para

a estabilização dos corantes, antes de serem analisadas em microscópio de fluorescência.

3.7.2 Coloração com 4’- 6’ diamidino - 2 – fenilindol/ Actinomicina D - DAPI/AMD

Logo após a secagem das lâminas coradas com DAPI, foram aplicados 50 µl de solução

de actinomicina D - AMD diluída em tampão fosfato (pH 7,0), contendo 1mM de EDTA, na

concentração de 0,2 mg/ml, e recoberto com lamínula de parafilme (Parafilm). As lâminas foram,

então, colocadas em banho-maria a 37ºC durante 10 a 15 minutos. Após o tempo determinado, as

lamínulas foram retiradas e as lâminas lavadas em água deionizada e secas ao ar. Após a secagem

as lâminas foram montadas com 5 µl de Vectashield H-1000 e armazenadas para a estabilização

dos corantes, antes de serem analisadas em microscópio de fluorescência.

3.7.3 Coloração com Cromomicina A3 - CMA

Sobre a lâmina aplicou-se 50 µl de solução de CMA diluída em tampão McIlvaine (pH

7,0), contendo MgCl2 a 5mM, na concentração de 0,5 mg/ml, e coberta com uma lamínula de

parafilme (Parafilm). As lâminas foram colocadas em banho-maria a 37ºC durante 2 horas. Após

o tempo de coloração, a lamínula foi retirada e a lâmina lavada em água deionizada e seca ao ar.

Depois de secas as lâminas foram montadas com 5 µl de Vectashield H-1000 e armazenadas para

a estabilização dos corantes, antes de serem analisadas em microscópio de fluorescência.

3.7.4 Coloração com Cromomicina A3/ Distamicina - CMA/DA

Após a secagem das lâminas coradas com CMA, foram aplicados 50 µl de solução de DA,

diluída em tampão McIlvaine (pH 7,0) na concentração de 0,2 mg/ml, e coberto com lamínula de

41

parafilme (Parafilm). As lâminas foram colocadas em banho-maria a 37ºC durante 10 minutos.

Após o tempo determinado, as lamínulas foram retiradas e as lâminas lavadas em água

deionizada e secas ao ar. Depois de secas as lâminas foram montadas com 5 µl de Vectashield H-

1000 e armazenadas para a estabilização dos corantes, antes de serem analisadas em microscópio

de fluorescência.

3.8 Hibridação molecular in situ fluorescente - FISH

3.8.1 Sonda

Foi utilizada como sonda a sequência de rDNA 18S – 5.8S – 25S (unidade 9,1 kb, sendo

mencionada como rDNA 45S) de milho, clonada no plasmídeo pUC8 no sítio Eco RI,

cordialmente cedida pelo Dr. R. L. Phillips (University of Minesota, EUA).

3.8.2 Marcação e hibridação molecular in situ fluorescente da sonda de DNA ribossomal

45S

A sequência de DNA utilizada como sonda foi marcada com biotina via ‘nick translation’,

de acordo com protocolo fornecido pelo fabricante.

Como preparação inicial à hibridação, as preparações cromossômicas foram lavadas com

RNase (5 µg/µl) e pepsina (5 µg/µl) para a remoção do RNA e do excesso de proteínas,

respectivamente. Posterior à lavagem, as preparações cromossômicas foram fixadas em

paraformaldeído a 4% e desidratadas em uma série alcoólica (70%, 96% e 100%).

A solução de hibridação, constituída de 50% formamida, 2 x SSC, 10% dextran sulfato,

0,1% SDS, 1 mg/ml de “herring sperm DNA” e 6 ng/ml das sondas de rDNA 45S, foi aquecida

de 95 a 98ºC por 10 minutos, para a desnaturação da sonda, e imediatamente colocada em gelo.

Sobre as lâminas foram aplicados 20 µl da solução de hibridação e, então, estas foram aquecidas

a 83ºC por 9 minutos. Após o aquecimento, a temperatura foi gradualmente reduzida até 37ºC e

mantida nesta por, no mínimo, 16 horas para a realização da hibridação. O aumento e redução de

temperatura no processo de hibridação foram realizados utilizando-se um termociclador (PTC-

100, MJ). Em seguida, as lâminas foram lavadas em 2 x SSC a 42ºC por 5 minutos, lavadas duas

vezes em formamida 20%/0,5 x SSC a 42ºC (74% de estringência) por 5 minutos cada e, por

último, lavadas em 0,5 x SSC a 42ºC por 5 minutos.

42

A sonda de rDNA 45S, marcada com biotina, foi detectada com o anticorpo primário

“mouse anti-biotin” (Dako), seguido do anticorpo secundário “rabbit anti-mouse” - TRITC

(Dako). As preparações foram contra-coradas com DAPI (4’- 6’ diamidino - 2 - fenilindol) a 0,2

µg/ml e, então, as lâminas foram montadas em 5 µl de Vectashield H-1000.

3.9 Extração de proteínas

A extração de proteínas foi realizada pelo método de extração fenólica desenvolvido por

Hurkman e Tanaka, 1986 apud Celedon et al. (2007), com algumas modificações. Raízes dos dois

acessos de C. retusa foram maceradas em almofariz com nitrogênio líquido até a formação de

uma pasta bem fina. Em 15ml de tampão de extração, constituído de 0,7M sacarose, 0,5M Tris-

HCl, 0,1 M KCl, 50mM EDTA, 1mM PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride), 1% p/v PVPP

(polyvinylpolypyrrolidone) e 2% v/v β-mercaptoetanol, pH 7,5, a 4ºC, adicionou-se 2,5g de

material vegetal macerado. Depois de homogeneizar a amostra em “vortex”, adicionou-se o

mesmo volume de fenol saturado em Tris-HCl, pH 7,5. A amostra foi novamente homogeneizada

em “vortex” e, então, centrifugada a 10000g por 20 minutos a 4ºC. A fase superior foi transferida

para um novo tubo, adicionou-se 15ml de tampão de extração, sem PVPP, e fenol saturado em

Tris-HCl, pH 7,5. A amostra foi homogeneizada em “vortex” e novamente centrifugada a 10000g

por 20 minutos a 4ºC. A fase superior foi transferida para um novo tubo, no qual foram

adicionados sete volumes de 0,1M de acetato de amônio em metanol gelado. A solução foi

mantida a -20ºC por 12 horas e, em seguida, centrifugada a 16000g por 20 minutos a 4ºC. O

sobrenadante foi descartado e sobre o pellet resultante adicionou-se solução de acetona gelada a

80%. A solução foi mantida a -20ºC por 1 hora e, em seguida, centrifugada a 16000g por 20

minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado, sobre o pellet adicionou-se metanol e a solução foi

mantida a -20ºC por 1 hora. A seguir, foi realizada uma centrifugação a 16000g por 20 minutos a

4ºC, o sobrenadante foi descartado e o pellet de proteínas resultante foi seco em câmara a 4 ºC

por 24 horas. Após a secagem, as proteínas foram ressuspendidas em 1 ml de tampão de

ressolubilização (7M Uréia, 2M Tiuréia, 10mM DTT, 0,4% v/v Triton X-100) e armazenadas a -

20ºC.

43

3.10 Quantificação de proteínas

A quantificação de proteínas foi realizada pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976),

utilizando o kit BioRad Protein Assay (BioRad). Foi preparada uma solução contendo 5 µl de

extrato protéico, 5 µl de HCl a 0,1N e 3ml do reagente de Bradford diluído (3 partes de água

Milli-Q e 1 parte do reagente), e esta foi incubada por 10 minutos a temperatura ambiente. Após

o tempo de reação, a solução foi transferida para uma cubeta de vidro e colocada em

espectofotômetro (Hitach U3300) para realização da leitura de absorbância com comprimento de

onda pré-definido em 595 nm. Os valores emitidos foram comparados com uma curva de

calibração padrão, construída com a mesma metodologia utilizando-se a proteína BSA (albumina

de soro bovino), para a obtenção da concentração protéica.

3.11 Western blot

3.11.1 Eletroforese de proteínas em gel SDS-PAGE

As amostras foram submetidas à eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-

PAGE) (10% p/v acrilamida), em cuba vertical. Primeiramente as amostras de proteínas foram

dissociadas adicionando-se 2x de tampão de amostra (100mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% p/v SDS,

20% v/v glicerol, 0.2M β-mercaptoetanol, 0.4% azul de bromofenol). Em seguida, foram

aplicadas 20µg de proteínas em cada canaleta do gel e foram submetidas à eletroforese em uma

corrente constante de 35mA, sendo interrompida somente quando as amostras alcançaram o final

do gel.

3.11.2 Transferência de proteínas para membrana de nitrocelulose

As proteínas submetidas à separação eletroforética foram transferidas para uma membrana

de nitrocelulose (Amersham Hybond ECL), utilizando tampão de transferência (25 mM Tris, 40

mM glicina, 20% v/v metanol, pH 8.5). A transferência foi realizada em um tanque de

transferência a 250 mA, por 1 hora.

3.11.3 Detecção imunoquímica

As membranas, com as proteínas das amostras, foram inicialmente lavadas em solução

bloqueadora (TBS + 4% leite em pó), mantida sob agitação constante, por 1 hora, a temperatura

44

ambiente. Em seguida, as membranas foram incubadas pernoite em uma solução contendo

anticorpo primário diluído em solução bloqueadora em concentração de 1:1000, a 4ºC, sob

agitação. Cada membrana com amostra dos dois acessos foi submetida a um tipo de anticorpo

primário que detecta modificações em lisinas (Lys) das histonas H3 e H4. Os tipos de anticorpos

utilizados foram: anti-acetil-histona H3 Lys 14, anti-acetil-histona H4 Lys 8, anti-acetil-histona

H4 Lys 5, anti-monometil-histona H3 Lys 9, anti-dimetil-histona H3 Lys 9 e anti-trimetil-histona

H3 Lys 9 (Upstate Biotechnology). Após a lavagem das membranas, estas foram incubadas por 1

hora, a temperatura ambiente, sob agitação, em anticorpo secundário conjugado com “horseradish

peroxidase” - HPR diluído na solução bloquedora em concentração de 1:7500. As membranas

foram lavadas novamente e detectadas a partir de quimioluminescência, utilizando o sistema

Amershan ECL (GE Healthcare).

3.12 Eletroforese bidimensional

A eletrofose bidimensional compreende duas etapas: focalização isoelétrica - IEF, onde as

proteínas serão separadas de acordo com o ponto isoelétrico - PI; e eletroforese desnaturante em

gel SDS-poliacrilamida - SDS-PAGE, no qual as proteínas serão separadas de acordo com o peso

molecular. As etapas de eletroforese bidimensional foram desenvolvidas conforme Celedon et al.

(2007), Andrade (2006) e Meireles (2006), com algumas modificações.

3.12.1 Focalização isoelétrica - IEF

Nesta etapa, as proteínas foram separadas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI) através

do processo de focalização isoelétrica - IEF, utilizando o sistema IPGphor Strip Holder

(Immobilized pH Gradient gel strips – Amersham Biosciences). As amostras foram preparadas

através da solubilização de proteínas, diluindo-se 600µg de proteínas em tampão constituído de

7M Uréia, 2M Tiuréia, 10 mM DTT, 0,4% v/v Triton X-100, 4% p/v Chaps, 1,5% v/v Anfólitos

pH 3-10 (IPG buffer, Amersham Biosciences), 2mM TCEP (triscarboxietilfosfina) e 0,005% p/v

azul de bromofenol, obtendo-se um volume final de, aproximadamente, 400 µl. A focalização das

proteínas presentes na amostra foi realizada em fitas IPGs (Immobilized pH Gradient gel strips –

Amersham Biosciences), 18 cm, pH 3-10 NL.

As amostras foram aplicadas nas fitas IPG, sobre as fitas adicionou-se 1 ml de óleo

mineral (Fluid Cover - Amersham Pharmacia Biosciences) para evitar a evaporação dos

45

reagentes, e a focalização foi conduzida no IPGphor (Amersham Biosciences) à corrente

constante de 50 µA por fita, a 20ºC. O programa de focalização constituiu dos seguintes passos:

reidratação a 50V por 12 horas, 100V por 1 hora, 500V por 1 hora, 1000V por 1 hora, 4000V por

1 hora e 8000V até atingir 70000 V-h. Após a focalização, as fitas foram lavadas em água

destilada e armazenadas a -20ºC.

3.12.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS-PAGE

Após a focalização isoelétrica, as fitas IPG foram mantidas por 15 minutos em 3 ml de

solução de equilíbrio e redução (50mM Tris-HCl pH 8,8, 6M Uréia, 30% v/v glicerol, 2% p/v

SDS, 2% p/v DTT), transferidas para uma solução de alquilação (50mM Tris-HCl pH 8,8, 6M

Uréia, 30% v/v glicerol, 2% p/v SDS, 2,5% p/v iodoacetamida e 0,005% de azul de bromofenol)

e mantidas nesta por 15 minutos.

A eletroforese de segunda dimensão foi realizada em gel vertical de acrilamida, preparado

com 12,5% p/v Acrilamida/Bis (30/08), 0,5M Tris-HCl pH 8,8, 0,5% v/v persulfato de amônio e

0,075% v/v TEMED. Após alquilação, as fitas IPG foram colocadas sobre o gel de acrilamida e

fixadas com uma solução pré-aquecida de 0,1% p/v de agarose, solubilizada em tampão de

corrida (25mM Tris-HCl, 192mM Glicina, 0,1% p/v SDS). O gel de acrilamida, juntamente com

a fita IPG, foi colocado em uma cuba modelo PROTEIN II XI 2-D Cell (BioRad) contendo

tampão de corrida. Inicialmente foi aplicado uma corrente fixa de 16 mA/h por gel durante 30

minutos e, após tal período, a corrente foi aumentada para 24 mA/h por gel durante,

aproximadamente, 4 horas.

3.12.3 Coloração dos géis

A coloração dos géis foi realizada de acordo com Andrade (2006). Após a eletroforese, os

géis foram imersos em solução fixadora (40% v/v etanol, 10% v/v ácido acético) durante 1 hora,

lavados duas vezes em água Milli-Q e mantidos por 12 em solução de coloração (0,1% p/v

Coomassie Brilliant Blue G-250, 10% v/v ácido fosfórico, 10% p/v sulfato de amônio, 20% v/v

metanol). Após o tempo de coloração, os géis foram lavados em água Milli-Q e estocados em

solução de ácido acético a 1%.

46

3.12.4 Digestão das proteínas

As regiões do gel contendo as proteínas (spots) foram extraídas, fragmentadas em pedaços

menores, transferidas para microtubos contendo solução de ácido acético 1% e armazenados a

4ºC. Primeiramente, foi realizada a remoção do corante dos fragmentos, que consistiu em: três

lavagens em solução de 50% v/v de acetonitrila - ACN e 25mM de bicarbonato de amônio -

AMBIC, por 30 minutos cada; desidratação com ACN 100% por 10 minutos; e remoção da ACN,

sendo que o resíduo remanescente foi deixado evaporar em temperatura ambiente. Uma segunda

etapa consistiu na redução e alquilação dos fragmentos de gel com as proteínas. Os fragmentos

foram reidratados e reduzidos em solução de 20mM ditiotreitol - DTT e 50mM AMBIC, a 56ºC,

por 40 minutos, e alquilados em solução de 55mM iodoacetamida - IAA e 50mM AMBIC, em

temperatura ambiente, por 30 minutos. Após o tempo determinado, os fragmentos foram lavados

em 25mM AMBIC e desidratados em 100% ACN. A ACN foi removida e seu resíduo deixado

evaporar em temperatura ambiente.

A digestão consistiu na quebra das proteínas em peptídeos mais simples pela ação da

enzima tripsina. Para tal foram adicionados 15µl de solução contendo 150 ng de tripsina em

25mM AMBIC, com posterior adição de 25mM AMBIC até a completa cobertura dos

fragmentos. Os fragmentos foram mantidos nesta solução por 14 horas, a 37ºC. Após o tempo

determinado, foram adicionados 30µl de metanol 100% e os fragmentos incubados por 1 hora, a

56 ºC. Em seguida, a ação da tripsina foi interrompida pela adição de 15 µl de solução

bloqueadora (50% v/v ACN e 5% v/v ácido fórmico).

Após a digestão, a solução obtida foi transferida para um novo microtubo e os fragmentos

remanescentes foram submetidos a uma série de lavagens para promover a eluição dos peptídeos

da acrilamida. Foram realizadas lavagens de 20 minutos cada, a 40ºC, sob sonicação, em soluções

de 50% v/v ACN em 1% v/v ácido fórmico (duas vezes), 60% v/v metanol em 1% ácido fórmico

(uma vez) e 100% ACN (uma vez). O volume recuperado em cada lavagem foi transferido para o

mesmo tubo no qual estava a solução obtida após a digestão com tripsina e o volume final,

contendo os peptídeos, submetido à secagem em um concentrador (Eppendorf, modelo 5301), por

2-3 horas, em temperatura ambiente. Após a secagem, os peptídeos foram ressuspendidos em

12µl de 1% v/v ácido fórmico, para serem, posteriormente, analisados e identificados por

espectometria de massas.

47

3.12.5 Sequenciamento das proteínas

Os peptídeos, após serem solubilizados em 1% v/v ácido fórmico, foram analisados em

espectômetro de massas caracterizado por uma fonte de ionização de eletronebulização - ESI e

analisador de massas híbrido Q-TOF (quadrupolo – time of flight) (Ultima API - Waters,

Micromass), sendo o sequenciamento conduzido em modo MS/MS (íons de peptídeos

fragmentados). Acoplado ao analisador, havia um sistema on-line de cromatografia capilar

(CaplC XE Pump – Waters).

Primeiramente, a separação dos peptídeos foi realizada em uma pré-coluna C18 (Sentry

Guard Column C18 – Waters), seguida por uma coluna de fase reversa C18 (Symmetry C18, 5

µm, 0,32 x 150 mm – Waters). Em seguida, os peptídeos foram eluídos pela diferença de

gradiente entre o tampão A (95% v/v H2O, 5% v/v acetonitrila e 0,1% v/v ácido fórmico) e o

tampão B (95% v/v acetonitrila, 5% v/v H2O e 0,1% v/v ácido fórmico). Durante a corrida, foi

utilizado um fluxo de 5µl/minuto nos primeiros 15 minutos, passando a 2µl/minuto entre 15 e 40

minutos e, novamente, 5µl/minuto entre 40 e 45 minutos. A variação de gradiente do tampão B

adotado durante a corrida foi de 10 a 15% v/v em 5 minutos, 15 a 35% v/v em 20 minutos, 35 a

45% v/v em 5 minutos, 45 a 80% v/v em 5 minutos e de 10% v/v nos últimos 5 minutos.

As moléculas peptídicas recuperadas da coluna foram ionizadas por ESI com uma

voltagem fixa de 3000 V, a 90ºC, sob 5 psi de gás nitrogênio. Os espectros de massa, em modo

MS/MS, foram obtidos automaticamente em um limiar de 25 counts, em uma amplitude de 50 a

2000 m/z. As aquisições foram calibradas, simultaneamente, com o peptídeo padrão GFP (GLU1-

fibrinopeptide B) através do sistema Nanolock Spray (Micromass), que visa a correção de

variações de calibração ao longo da análise.

3.12.6 Análise dos espectros de massa

Os espectros de massa (MS/MS) obtidos foram analisados e processados pelos programas

MassLynx NT BioLynx V 4.0 e ProteinLynx V 2.1 (Micromass) e a identificação realizada a

partir do banco de dados Swiss-Prot, através do programa Blast.

O Swiss-Prot é um banco de sequências de centenas de espécies, mantido pelo Swiss

Institute of Bioinformatics - SIB e EBI/EMBL. Além do nome e sequência peptídica das

proteínas, este banco fornece outras informações importantes, como função da proteína, estrutura

48

dos domínios protéicos e modificações pós-traducionais, tão importantes nas análises dos

resultados (ANDRADE, 2006; MEIRELES, 2006).

3.13 Microscopia e análise de imagens

3.13.1 Preparações citogenéticas

As metáfases coradas pelo método de Feulgen foram fotografadas em fotomicroscópio

Zeiss Axiophot 2, utilizando-se filme Technical Pan 2 25 ASA, reveladas e ampliadas para a

realização das medidas cromossômicas. As imagens de bandamento Ag-RON e metáfases

coradas pelo método de Feulgen foram capturadas via câmera CCD acoplada ao fotomicroscópio

Zeiss Axiophot 2, através do programa IKARO (Metasystems). As preparações fluorescentes

foram observadas em fotomicroscópio de fluorescência Zeiss Axiophot 2 e capturadas, via

câmera CCD acoplada ao microscópio, através do programa ISIS (Metasystems). Para a

montagem das pranchas, as imagens digitalizadas foram processadas no programa Adobe

PhotoShop, sendo que as preparações fluorescentes foram pré-processadas no próprio programa

de digitalização (ISIS - Metasystems).

As análises morfométrica de nucléolos em células binucleoladas, obtidos pela técnica de

bandamento Ag-RON, foram realizadas no Laboratório de Genética de Departamento de Biologia

da Universidade Federal de Juiz de Fora. As medidas nucleolares foram obtidas através da análise

de imagens digitalizadas no programa Image Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics), após terem sido

capturadas por uma câmera acoplada a um microscópio Olympus

3.13.2 Eletroforese bidimensional

As imagens para a análise protéica foram obtidas digitalizando os géis de eletroforese

bidimensional, via scanner, pelo programa Image scanner UTA-1100 (Amersham Biosciences).

As análises foram realizadas através do programa Image Master 2D versão 3.10 (Amersham

Biosciences), sendo que os géis foram submetidos aos mesmos parâmetros de detecção de spots e

determinação de seu volume (smooth = 2, área mínima = 21 e saliência = 200), realizadas

automaticamente pelo programa, seguida de edição manual. A determinação da massa molecular

aparente das proteínas foi realizada utilizando-se padrões de massa molecular (Broad Range –

Molecular Weight Marker, Bio-Rad).

49

3.14 Medidas cromossômicas e nucleolares

As medidas cromossômicas foram realizadas em cópias fotográficas de metáfases

mitóticas, coradas pelo método de Feulgen, utilizando-se um compasso de ponta seca e papel

milimetrado. Foram medidos o braço curto - BC e o braço longo - BL de cada cromossomo, e a

partir destes valores foi possível obter os seguintes dados:

- Comprimento absoluto - CA: soma dos valores dos braços curto e longo de cada

cromossomo.

- Relação de braços - RB: comprimento do braço longo/comprimento do braço curto.

- Comprimento total do lote haplóide - CTLH: somatória do comprimento absoluto dos

cromossomos (comprimento absoluto do par cromossômico/2) do lote haplóide.

- Comprimento relativo - CR%: comprimento absoluto do cromossomo/CTLH

multiplicado por 100.

As medidas dos braços cromossômicos que apresentavam constrição secundária foram

realizadas medindo-se os segmentos proximal e distal do braço, descartando a constrição

secundária.

A construção dos idiogramas foi realizada com base nos valores de comprimento do braço

longo e do braço curto dos cromossomos. Foram calculadas as médias e desvios padrão de ambos

os valores e estas foram convertidas para micrômetro (µm) a partir de uma escala.

As análises de diferenças de expressão das regiões organizadoras do nucléolo foram

realizadas a partir das razões (valor maior/valor menor) das constrições secundárias dos

cromossomos homólogos e dos nucléolos de células binucleoladas. As medidas das constrições

secundárias foram realizadas em cópias fotográficas de metáfases mitóticas, coradas pelo método

de Feulgen, utilizando-se um compasso de ponta seca e papel milimetrado. E, a partir do

programa Image Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics) foi possível mensurar a área dos nucléolos das

células binucleoladas.

50

51

4 RESULTADOS

4.1 Análises citológicas

As medidas cromossômicas (Tabela 2) realizadas a partir dos resultados de coloração pelo

método de Feulgen permitiram a elaboração dos idiogramas dos acessos CRT-1 e CRT-2 de

Crotalaria retusa. Ambos os acessos apresentam um conjunto cromossômico simétrico de n=8,

com cromossomos metacêntricos e submetacêntricos e com uma única constrição secundária no

braço curto do cromossomo 1 (Figura 3), tal como descrito por Oliveira e Aguiar-Perecin (1999).

Nota-se que, em CRT-2, houve uma redução do comprimento do segmento proximal ao

centrômero do cromossomo 1 (Figura 3).

Tabela 2 – Medidas cromossômicas: comprimento médio do braço curto (BC) e braço longo (BL) dos cromossomos de Crotalaria retusa

Acessos Cromossomos

1 2 3 4 BC BL BC BL BC BL BC BL CRT - 1 1,29 (0,44)* 1,43 1,52 1,79 1,1 1,77 1,37 1,57 + 0,18 + 0,18 + 0,2 + 0,19 + 0,17 + 0,17 + 0,17 + 0,16

CRT - 2 1,17 (0,22)* 1,51 1,44 1,71 0,92 1,71 1,21 1,49 + 0,16 + 0,2 + 0,21 + 0,18 + 0,17 + 0,15 + 0,17 + 0,2

Cromossomos 5 6 7 8 BC BL BC BL BC BL BC BL CRT - 1 1,21 1,41 0,96 1,49 1,11 1,35 1,09 1,27 + 0,16 + 0,17 + 0,15 + 0,17 + 0,13 + 0,15 + 0,15 + 0,15

CRT - 2 1,16 1,29 0,99 1,34 1 1,24 0,9 1,19 + 0,14 + 0,15 + 0,14 + 0,16 + 0,17 + 0,19 + 0,16 + 0,19

* Comprimento médio do segmento proximal ao centrômero.

A coloração com os fluorocromos CMA (cromomicina A3) e DAPI (4’-6’-diamidino-2-

fenilindol), como também a coloração seqüencial de fluorocromos CMA/DA (cromomicina

A3/Distamicina) e DAPI/AMD (4’-6’-diamidino-2-fenilindol/Actinomicina D) revelaram padrões

de fluorescência semelhantes nos dois acessos. As metáfases mitóticas coradas com os

fluorocromos CMA e CMA/DA apresentaram somente a heterocromatina adjacente à constrição

secundária fluorescente e as coradas com DAPI e DAPI/AMD não apresentaram regiões

52

fluorescentes (Figura 4). A técnica de hibridação in situ fluorescente com a sonda de rDNA 45S

revelou metáfases com sinais de hibridação somente no par cromossômico 1 de ambos acessos

(Figura 5), indicando que estes não possuem sítios adicionais de rDNA 45S como ocorre nas

espécies diplóides C. juncea e C. incana (MONDIN, 2003; MONDIN; SANTOS-SEREJO;

AGUIAR-PERECIN, 2007a; MONDIN et al., 2007b).

Figura 3 – Idiogramas dos acessos CRT-1 (A) e CRT-2 (B) Nota: As flechas indicam os segmentos proximais (entre o centrômero e a constrição secundária) associados às

RONs com tamanhos diferentes entre os dois acessos.

53

Figura 4 – Coloração com fluorocromos Nota: As flechas indicam fluorescência adjacente à constrição secundária nas colorações com CMA e CMA/DA e as

constrições secundárias com coloração negativa para DAPI e DAPI/AMD. Barra de 5µm.

54

Figura 5 – Metáfase demonstrando sinais de hibridação para a sonda de rDNA 45S no par cromossômico 1 em C. retusa

Nota: As bandas azuis fluorescentes são resultado da desnaturação e renaturação que o DNA sofre na realização da

técnica de FISH.

As observações de preparações coradas pelo método de Feulgen revelaram células com

constrições secundárias de tamanhos distintos, como também, de tamanhos similares em ambos

os acessos (Figura 6). A análise morfométrica das constrições secundárias constatou que o acesso

CRT-2 possui diferenças entre as constrições secundárias homólogas mais expressivas do que o

acesso CRT-1, chegando a um valor de até 11,12 vezes maior que a constrição secundária menor

(Figura 7 e Tabela 3). Apesar da grande extensão de algumas constrições secundárias, não foram

encontrados fragmentos ou outras alterações cromossômicas.

Figura 6 – Células coradas pelo método de Feulgen demonstrando constrições secundárias de tamanhos diferentes (A) e similares (B)

55

Figura 7 – Gráfico demonstrando o número de metáfases referente ao valor da razão entre as constrições secundárias maiores e menores dos dois acessos de C. retusa

Tabela 3 – Medidas de metáfases que apresentaram expressão diferencial maior que 2,5 entre as

constrições secundárias

Acessos Metáfases Tamanho das constrições secundárias Razão (L/S) Maior (L) Menor (S)

CRT-1 31 F2 12,60 04,70 02,68 02 F1 05,60 01,90 02,95 23 F1 36,00 11,10 03,24 02 F2 22,20 06,80 03,26 14 F2 09,00 02,40 03,75 08 F1 06,00 01,40 04,28

CRT-2 49 24,50 08,00 02,61 01 11,00 04,00 02,75 65 07,00 02,50 02,80 53 26,00 09,00 02,89 45 24,50 08,00 03,06 35 08,00 02,20 03,63 11 29,50 07,00 04,21 57 10,20 01,80 05,67 13 44,50 04,00 11,12

A coloração com nitrato de prata permitiu a análise de células interfásicas binucleoladas.

Tais células apresentaram nucléolos heteromórficos e homomórficos em ambos os acessos

(Figura 8). Não houve diferença significativa com relação à frequência de células binucleoladas

heteromórficas dos acessos, ambos apresentaram cerca de 50%. A análise morfométrica dos

nucléolos consistiu na realização da razão (maior/menor) entre os nucléolos heteromórficos e a

56

divisão destes em classes a partir dos valores obtidos. Nossos dados demonstraram diferenças de

15,27% a 89,66% entre o tamanho dos nucléolos heteromórficos, sendo que CRT-2 apresentou

maior número de células nas classes de maior valor (Figura 9).

Figura 8 – Células binucleoladas demonstrando nucléolos heteromórficos (A) e Homomórficos (B)

Nota: Barra de 10µm.

Figura 9 – Gráfico demonstrando o número de células com nucléolos heteromórficos referente ao valor da razão entre nucléolo maior e menor

57

O bandamento Ag-RON em metáfases mostrou claramente a expressão diferencial entre

os rDNAs 45S homólogos, corroborando com os resultados encontrados na análise nucleolar.

Além disso, verificaram-se diferentes níveis de expressão diferencial tanto nas metáfases, como

nas interfases (Figura 10a). A correlação entre o tamanho do nucléolo e a atividade da RON foi

constatada a partir da análise de uma prometáfase com nucléolos remanescentes. Nesta, a RON

com maior atividade encontra-se relacionada com o nucléolo maior, enquanto que a RON com

menor atividade apresentou-se ligada ao nucléolo menor (Figura 10b).

Figura 10 – Diferentes níveis de expressão diferencial dos rDNAs 45S homólogos representados por células binucleoladas e constrições secundárias de tamanhos distintos (A); Prometáfase com nucléolos remanescentes demonstrando a correlação entre o tamanho do nucléolo e a atividade da RON (B)

Nota: As flechas vermelhas indicam os braços do par cromossômico 1, e as flechas amarelas indicam os nucléolos.

Em detalhe, tem-se a representação dos nucléolos com suas respectivas RONs.

58

4.2 Western blot

Os padrões do estado da cromatina (eucromatina e heterocromatina), tanto no DNA

nuclear total quanto no rDNA, podem divergir de acordo com o tipo, idade e taxa metabólica

celular (NEVES et al., 2005). Dessa forma, o extrato protéico utilizado para a realização das

análises de Western blot foi obtido a partir de raízes, a fim de evitar resultados não

complementares às análises citológicas dos meristemas radiculares.

Nossas análises permitiram a caracterização qualitativa e quantitativa das seguintes

modificações pós-traducionais em histonas: acetilação na lisina 14 da histona H3 (H3K14Ac),

acetilação das lisinas 5 e 8 da histona H4 (H4K5Ac e H4K8Ac) e mono-, di- e trimetilação da

lisina 9 da histona H3 (H3K9Met1, H3K9Met2 e H3K9Met3). Os resultados obtidos certificaram

a presença de H3K14Ac, H3K9Met1, H3K9Met3 e H4K8Ac nos dois acessos. Nota-se que, com

exceção da H3K9Met1, todas as modificações de histonas apresentaram maior quantidade em

CRT-1 (Figura 11).

Figura 11 – À direita: gráfico demonstrando a análise quantitativa dos Western blots Nota: À esquerda: análise de Western blot das modificações histônicas.

A análise quantitativa demonstrou que comparativamente CRT-2 possui,

aproximadamente, 30% menos H3K14Ac e H3K9Met3 que CRT-1 (Figura 11). Apesar de não

ter sido possível realizar a quantificação para H3K9Met1 e H4K8Ac, pois não houve número de

repetições suficientes, foi observado claramente que existem diferenças consideráveis de sinais

59

entre as bandas dos dois acessos (Figura 11). Semelhante aos resultados encontrados em

experimentos preliminares de imunocitoquímica com anticorpos para H4K5Ac (MONDIN, dados

não publicados), não foram observadas marcas para esta modificação histônica, indicando a

ausência desse tipo de modificação em Crotalaria. Com relação à H3K9Met2, não foram

detectadas marcas ou estas apareciam muito fracas. Além do mais, dados preliminares de

imunocitoquímica revelaram marcas para esta modificação (MONDIN, dados não publicados),

sugerindo a necessidade de novos experimentos com concentrações maiores de anti-dimetil-

histona H3 (Lys 9). 4.3 Eletroforese bidimensional

Os perfis de proteínas expressas nos acessos de C. retusa foram caracterizados em gel de

pI 3-10, sendo que a maior parte das proteínas encontram-se concentradas na região de pI 5.1-9

(Figura 12). Nota-se que os acessos demonstram perfis eletroforéticos muito semelhantes (Figura

12).

Figura 12 – Perfis de distribuição de proteínas em gel de PI 3-10 dos acessos CRT-1 (A) e CRT-2

(B)

Um total de 458 spots foram detectados, e destes, 444 (96,94%) eram comuns entre os

acessos. Através do teste t, observou-se que, dentre os spots em comum nos dois acessos, 41

(9,23%) variaram em volume com nível de significância p<0,01 e 28 (6,31%) com nível de

significância p<0,05. Estes spots apresentaram uma grande variação de volume, com valores de

15 a 75%. Ambos os acessos apresentaram spots exclusivos, sendo que CRT-1 demonstrou 13

60

spots, enquanto que CRT-2 apresentou 14 spots. Os spots exclusivos e com variação de volume

com valor significativo estão demonstrados na Figura 13.

Entre os 458 spots detectados, 66 (14,41%) foram selecionados, mas apenas 32 spots

(6,99%) foram submetidos à espectrometria de massa. Destes, 17 (53,13%) apresentaram

similaridade com proteínas dos bancos de dados MSDB, NCBInr e SwissProt. A Tabela 4

apresenta as proteínas identificadas nos spots dos géis bidimensionais dos dois acessos de C.

retusa.

Figura 13 – Perfis de distribuição de proteínas de CRT-1 (A) e CRT-2 (B), demonstrando os

spots exclusivos (vermelho) e os spots que variam em volume com significância p<0,01 (amarelo) e p<0,05 (verde)

61

Tabela 4 – Proteínas identificadas nos acessos de C. retusa (continua)

Spot Expressão Proteína Nº de acesso Similaridade

Score mascot* Peptídeos

PM**/PI*** teórico

PM**/PI*** experimental

174 Maior em CRT-2

30S ribosomal protein S15, chloroplastic B1NWK6

Manihot esculenta 32 M.VKNSFISVISQEEK.D 10833/10.66 52332/5,96

K.DENKGSVEFQIVSFTNKIR.R

477 Maior em CRT-2

Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase 2, chloroplastic (RuBisCO activase 2) Q40565

Nicotiana tabacum 64 K.VPLILGVWGGK.G 48541/8.14 18546/8.67

Solanum pennellii K.SFQCELVFR.K

R.VPIIVTGNDFSTLYAPLIR .D

K.IVDTFPGQSIDFFGALR.A

732 Maior em CRT-2 Formate dehydrogenase (EC 1.2.1.2) Q5NE18

Solanum lycopersicum 168 K.IVGVFYK.A 42352/6.87 34912/5.43

Solanum tuberosum K.HIPDLHVLISTPFHPAYVTAER.I

Arabidopsis thaliana R.ILILVR.N

K.GVLIVNNAR.G

799 Maior em CRT-1

5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase (EC 2.1.1.14) Q42662

Solenostemon scutellarioides 39 K.FALESFWDGK.S 84822/6.09 70984/5.79

Arabidopsis thaliana K.YLFAGVVDGR.N

K.KLNLPI LPTTTIGSFPQTVELR.R

K.DEV EDLEKAGITVIQIDEAALR.E

K.YGA GIGPGVYDIHSPR.I

892 Maior em CRT-1 Putative uncharacterized protein Q1S5I1

Medicago truncatula 37 M.VVGGGSGAVVGEPSRLR.R 6216/10.40 49834/5.66

R.R AGNESVPFFI FFRPLFFFSL PLSDFK.L

1063 Maior em CRT-1 Oleosin 18 kDa A2XL05

Oryza sativa subsp. indica 35 R.DRAGQYYQQQRGQVGETVK.G 17211/10.10 7021/6.17

Oryza sativa subsp. japonica R.TPDYVEQARRR.M

1195 Maior em CRT-1 Apocytochrome f O47042 Picea abies 35 .MQNRNTYDLKK.K 35243/9.18 37854/6.40

R.EATGRIVCANCHLAK.K

K.YPIYLGGNRGRGQIYPDGSK.S

1299 Maior em CRT-2

Phosphoglycerate kinase, chloroplastic (EC 2.7.2.3) P41758

Chlamydomonas reinhardtii 32 R.VAAVAPRVVPFSSASSSVLR.S 49262/8.84 46943/6.45

R.CLWTSAAWAALASVVEAVK.K

K.I IIGGGMIFTFYK.A

62

Tabela 4 – Proteínas identificadas nos acessos de C. retusa

(conclusão)

Spot Expressão Proteína Nº de acesso Similaridade

Score mascot* Peptídeos

PM**/PI*** teórico

PM**/PI*** experimental

1314 Maior em CRT-2 Putative uncharacterized protein B9TIA4

Ricinus communis 47 M.PMVANDGPHYGDNIKLMGPGK.Y 8292/9.52 53359/7.8

K.YTVAPPTANPHSHFGR.H

1360 Somente em CRT-1

Ribulose bisphosphate carboxylase small chain SSU1, chloroplastic (RuBisCO small subunit SSU1) (EC 4.1.1.39) P00872 Lemna gibba 42 R.ENNASPGYYDGRYWTMWKLPMFGCTDASQVIAEVEEAK.K 14282/5.01 93917/6.18

1438 Maior em CRT-1 Ribonuclease H (Fragment) Q6QVH9

Phaseolus vulgaris 25 K.EGFFFLRNELGILDLNNLS. 3305/4.79 53359/5.84

Non-specific lipid-transfer protein P4 (Fragment) (LTP P4) P80274 Vitis sp. 24 .TVTCGQVASALSPCIDYLQK.D 3893/5.63

1469 Maior em CRT-2 Ribonuclease H (Fragment) Q6QVH9

Phaseolus vulgaris 25 K.EGFFFLRNELGILDLNNLS. 3305/4.79 2332/7.34

Non-specific lipid-transfer protein P4 (Fragment) (LTP P4) P80274 Vitis sp. 24 .TVTCGQVASALSPCIDYLQK.D 3893/5.63

1488 Maior em CRT-2 Putative uncharacterized protein A5B8T3 Vitis vinifera 72 K.LGDDEFGHMLAGILK.E 35405/5.13 25380/7.7

R.NPSADMLLKPEELNLELIR.S

K.VFHYGSISLIVEPCR.S

K.EAGALLSYDPNLR.L

1523 Somente em CRT-2 Maturase K Q8WIV8

Camellia sasanqua 41 .MEEFKRYLELDR.S 59457/9.33 31357/5.39

Stewartia pseudocamellia R.LNPSMVRSQMLENSFLIGNAIKKFDTIVPIIPMIGSLSK.A

1525 Somente em CRT-2 Maturase K Q8WJQ9

Crataegus monogyna 51 K.NLYSQMMSEGFAVIVEIPFSLRL 60558/9.36 25380/8.43

Vauquelinia californica R.FFLHEYYNWNSLITPK.K

Sorbus californica K.KIIFSKSNPR.L

R.FVHICRNLSHYYSGSSRK.K

K.HKSTVRTFLK.R

1527 Somente em CRT-2

Non-specific lipid-transfer protein P4 (Fragment) (LTP P4) P80274 Vitis sp. 24 -.TVTCGQVASALSPCIDYLQK.D 3893/5.63 23280/9.7

1541 Somente em CRT-2 Ribonuclease H (Fragment) Q6QVH9

Phaseolus vulgaris 28 K.EGFFFLRNELGILDLNNLS.- 3305/4.79 25380/9.7

Non-specific lipid-transfer protein P4 (Fragment) (LTP P4) P80274 Vitis sp. 27 -.TVTCGQVASALSPCIDYLQK.D 3893/5.63

*Score mascot: Score encontrado na base de dados Mascot. **PM: Peso molecular. ***PI: Ponto isoelétrico.

63

Os spots submetidos à espectrometria de massa foram distribuídos em categorias

funcionais segundo Rison et al. (2000), com algumas modificações de acordo com Andrade

(2006) (Figura 14).

Figura 14 – Classificação dos spots submetidos à espectrometria de massa

A categoria Metabolismo apresentou o maior número de spots com proteínas detectadas

(15,63%). Nesta encontra-se proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos (5-

methyltetrahydropteroyltriglutamate - homocysteine methyltransferase), no metabolismo de

carboidratos (phosphoglycerate kinase) e na produção de energia (RuBisCO e apocytochrome f).

A categoria Transporte é representada por spots nos quais foi identificado um fragmento de uma

mesma proteína de transporte de lipídios, a non-specific lipid-transfer protein. As categorias

menos representativas (Estrutura e organização da estrutura, Vias de informação e Processos

celulares) envolvem spots nos quais foram identificadas proteínas envolvidas na estrutura dos

64

ribossomos cloroplastidiais e da membrana plasmática (30S ribosomal protein S15 e oleosin 18

kDa, respectivamente), na síntese e degradação do RNA (maturase K e ribonuclease H,

respectivamente) e nas reações de oxi-redução (Formate dehydrogenase).

65

5 DISCUSSÃO

5.1 Estrutura cromossômica

De acordo com Oliveira (1992), o gênero Crotalaria possui um padrão cariotípico básico,

caracterizado pela presença da constrição secundária no primeiro par cromossômico, predomínio

de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos e gradação no tamanho dos cromossomos,

resultando em um cariótipo relativamente simétrico e bastante conservativo. Ambos os acessos de

C. retusa demonstraram tais características cariotípicas, além de um número cromossômico de

2n=16 condizente à maioria das espécies diplóides do gênero (ALMADA; DAVIÑA; SEIJO,

2006; FLORES, 2004; FLORES et al., 2006; MONDIN, 2003; MORALES, 2008; OLIVEIRA,

1992; OLIVEIRA; AGUIAR-PERECIN, 1999).

Apesar de estarem temporalmente e espacialmente separadas e por sofrerem pressões

seletivas diferentes, pois um acesso é proveniente de um cultivar que sofreu seleção artificial e o

outro de uma população litorânea periférica, os acessos possuem cariótipos muito semelhantes,

sugerindo a ausência de rearranjos cromossômicos, como inversões e translocações recíprocas,

importantes no processo de especiação (RIESEBERG, 2001; SCHUBERT, 2007; STEBBINS,

1971; SWANSON; MERZ; YOUNG, 1969). Contudo, através da observação dos dois idiogramas

nota-se que houve uma redução do segmento proximal ao centrômero no braço curto do

cromossomo 1 em CRT-2. Essa redução pode ser resultado de um maior número de genes de

rRNA expressos nessa população, refletindo no aumento de tamanho da constrição secundária e,

consequentemente, na diminuição do bloco heterocromático adjacente. Em geral, o aumento na

expressão dos genes de rRNA é associada a uma maior demanda de ribossomos pela célula, sendo

este dependente do estado fisiológico celular ou de fatores externos (PIKAARD, 2000a; RAŠKA

et al., 2004; RUSSELL; ZOMERDIJK, 2005; WEIDER et al., 2005). Dessa forma infere-se que o

acesso CRT-2, por ser oriundo de um ambiente diferente do acesso CRT-1, tenha uma demanda

ribossomal maior.

Muitas substâncias interagem com o DNA de maneira específica, provendo uma coloração

que reflete a característica na sequência de DNA de regiões cromossômicas. O bandamento

realizado com o fluorocromo CMA revela regiões ricas em nucleotídeos GC, enquanto que o

bandamento com o fluorocromo DAPI revela regiões ricas em AT (APPELS et al., 1998;

FRIEBE; ENDO; GILL, 1996; MONDIN, 2003; MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-

66

PERECIN, 2007a; MORALES, 2008). Contudo, estas regiões podem apresentar resíduos de

outros nucleotídeos, sendo necessária a aplicação de outra molécula para melhorar a fluorescência

relativa de certas regiões (APPELS et al., 1998; MONDIN, 2003; MONDIN; SANTOS-SEREJO;

AGUIAR-PERECIN, 2007a; MORALES, 2008). Ao ser aplicado junto à CMA, o contra-corante

não fluorescente DA (distamicina) se liga aos resíduos de nucleotídeos AT próximos às regiões

GC, impossibilitando a ligação do CMA. Neste caso, há uma competição entre o sítio pelas duas

substâncias e somente as regiões muito ricas em resíduos GC e com pouco resíduo AT

demonstram fluorescência (MONDIN, 2003; MORALES, 2008). Semelhantemente, a coloração

com DAPI pode ser modificada pela aplicação do contra-corante AMD (actinomicina-D), que é

específico para regiões GC. Quando a AMD se liga aos resíduos GC há a absorção da energia

luminosa do DAPI, pois este possui emissão de energia no mesmo comprimento de onda da

absorção da AMD, resultando em um baixo nível de background fluorescente e de interações não

específicas (APPELS et al., 1998; MONDIN, 2003).

Os bandamentos fluorescentes com CMA e CMA/DA revelaram fluorescência apenas na

heterocromatina associada à região organizadora do nucléolo nos dois acessos, indicando que esta

região é rica em nucleotídeos GC. A coloração DAPI e DAPI/AMD não revelou bandas

fluorescentes nos acessos de C. retusa, entretanto foi observada fluorescência negativa

correspondente à fluorescência revelada pelas colorações com CMA e CMA/DA, confirmando,

mais uma vez, a natureza rica em GC dessa região. Muitos trabalhos, inclusive os que envolvem o

gênero Crotalaria, já haviam demonstrado as regiões associadas à RON como sítio CMA

fluorescente (FUCHS et al., 1998; MARCON; BARROS; GUERRA, 2005; MONDIN, 2003;

MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007a; MORALES, 2008; RUAS et al.,

2005), sendo assim, descrito por Friebe, Endo e Gill (1996) como uma circunstância comum.

A observação de fluorescência CMA-positiva e DAPI-negativa associada à RON,

sugerindo que esta região é muito rica em GC, já havia sido descrita para o gênero em questão

(MONDIN, 2003; MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007a; MORALES,

2008). Espécies da seção Crotalaria, a qual pertence C. retusa, demonstram fluorescência CMA-

positiva na heterocromatina pericentromérica. No entanto, ao realizar a coloração com a

combinação CMA/DA, estas apresentam um padrão de bandamento fluorescente semelhante às

colorações de CMA e CMA/DA em C. retusa, ou seja, somente a heterocromatina adjacente às

constrições secundárias fluorescente (MONDIN, 2003; MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-

67

PERECIN, 2007a; MORALES, 2008). Tal resultado infere que essas espécies, tal como C. retusa,

apresentam apenas a heterocromatina adjacente às constrições secundárias ricas em nucleotídeos

GC.

A ausência de sítios adicionais de rDNA 45S, comprovada pela presença de sinal de

hibridação com a sonda de rDNA 45S somente na constrição secundária do cromossomo 1 e

heterocromatinas adjacentes, é uma das características mais importante para o estudo de

dominância nucleolar em C. retusa. Os sítios adicionais de rDNA, encontrados em algumas

espécies diplóides e poliplóides de Crotalaria, podem influenciar na análise da expressão

diferencial de um mesmo loco de rDNA, uma vez que estes podem se apresentarem ativos

(MONDIN, 2003; MONDIN; SANTOS-SEREJO; AGUIAR-PERECIN, 2007a).

5.2 Expressão diferencial de genes ribossomais

Em células nas fases de metáfase e prometáfase, a RON aparece como uma região um

pouco menos condensada e distendida (denominada como constrição secundária), que reflete a

expressão do arranjo dos genes ribossomais 18S-5.8S-26S na interfase anterior (APPELS et al.,

1998; CAPERTA et al., 2002). Em geral, RONs homólogas possuem comportamento idêntico em

termos de expressão, deste modo, infere-se que constrições secundárias homólogas sejam de

tamanhos semelhantes (CAPERTA et al., 2002). No entanto, nossas análises citológicas revelaram

constrições secundárias de tamanhos similares e distintos, indicando, respectivamente, níveis de

expressão dos genes de rRNA semelhantes e desiguais entre locos homólogos. Além disso,

através do bandamento Ag-RON, que detecta os genes ribossomais ativos devido à especificidade

do nitrato de prata por um grupo de proteínas (argirofílicas) associadas à sua atividade gênica

(CAPERTA et al., 2002; ZURITA et al., 1998), foi possível notar claramente que existem

diferentes graus de heteromorfismo na expressão gênica deste loco.

Caperta et al. (2002), ao analisarem a expressão de rDNAs homólogos em centeio,

revelaram resultados semelhantes ao nosso estudo. No estudo de Caperta et al. (2002), as células

consideradas com expressão heteromórfica foram aquelas que possuíam constrições secundárias

com razão (maior/menor) maior que 1,25, enquanto que nosso estudo considerou as células que

possuíam razão entre as constrições secundárias maior que 2, indicando uma maior exigência em

nosso estudo.

Apesar de ambos os acessos demonstrarem diferenças entre as constrições secundárias, o

68

acesso CRT-2 apresentou diferenças mais expressivas, com valores diferindo em até 11 vezes

entre as constrições. A grande extensão das constrições secundárias em CRT-2 reflete em

quantidades maiores de genes de rRNA ativos, o que sugere uma maior biogênese ribossomal em

CRT-2 em resposta aos fatores externos diferenciais (PIKAARD, 2000a; RAŠKA et al., 2004;

RUSSELL; ZOMERDIJK, 2005; WEIDER et al., 2005) que foi submetido no ambiente

(litorâneo) do qual proveio.

Em certas circunstâncias, a RON pode se comportar como um sítio frágil sujeito a quebras,

originando cromossomos com rDNA 45S na região terminal. A quebra nesses sítios pode, ainda,

originar uma série de anomalias cromossômicas, tais como translocações recíprocas, inversões,

deleções, produção de fragmentos cromossômicos ou cromossomos extras (APPELS et al., 1998;

BUTLER, 1992; KOO; JIANG, 2008). Em nossas análises não foram encontradas as alterações

cromossômicas descritas, indicando que, apesar de os dois acessos serem oriundos de ambientes

diferentes e por possuírem uma das constrições secundárias com maior extensão, não houveram

quebras. A quebra no rDNA 45S em um dos dois acessos poderia ocasionar rearranjos

cromossômicos, diferenciando os cariótipos e iniciando um processo de especiação entre os dois

(KOO; JIANG, 2008; RIESEBERG, 2001; SCHUBERT, 2007; STEBBINS, 1971; SWANSON;

MERZ; YOUNG, 1969).

Uma vez que a atividade relativa de cada RON pode ser correlacionada com o tamanho

nucleolar (SARDANA; O’DELL; FLAVELL, 1993), foi possível estimar a atividade das RON a

partir de observações de nucléolos corados com nitrato de prata. Ao final da divisão celular (final

da anáfase ou início da telófase) inicia-se um processo celular denominado nucleologênese, que

consiste na reunião de componentes nucleolares ao redor de cada rDNA 45S ativo, originando o

nucléolo no início do ciclo celular (interfase) (DOUSSET et al., 2000; DUNDR; MISTELI;


Teoricamente, cada RON ativa deve formar um nucléolo, assim, uma célula diplóide com um par

cromossômico com RON deveria conter dois nucléolos. No entanto, os nucléolos tendem a se

fundir durante a interfase (JASENCAKOVA et al., 2000; OLSON; HINGORANI; SZEBENI,

2002).

Nossas análises nucleolares limitaram-se à células binucleolares, no qual cada nucléolo

correspondia a uma RON do primeiro par cromossômico. Em ambos os acessos foram observadas

células binucleoladas com nucléolos de tamanhos similares e diferentes em uma frequência de

69

cerca de 50%. No entanto, as análises morfométricas dos nucléolos demonstraram que, em CRT-

2, a diferença de tamanho entre os nucléolos heteromórficos é mais expressiva. A observação de

células binucleoladas com nucléolos heteromórficos indica a ocorrência de dominância nucleolar

parcial em C. retusa, onde há a transcrição preferencial dos genes de rRNA do rDNA 45S de um

dos homólogos, resultando no silenciamento parcial do grupo de genes de rRNA do outro

homólogo (McSTAY, 2006; NEVES et al., 2005; PIKAARD, 1999, 2000a). Tal expressão

diferencial permanece após a fusão dos nucléolos, pois esta se reflete mais adiante nas constrições

secundárias de tamanhos distintos que observamos. Estudos em S. cereale (centeio) demonstraram

resultados semelhantes ao analisarem a expressão de RONs homólogas (CAPERTA et al., 2002,

2007). O motivo pelo qual algumas células apresentam expressão diferencial entre RONs

homólogas ainda não está claro. No entanto, o tratamento com 5-azacitidina em S. cereale, indica

que a diferença de expressão entre as RONs homólogas seja, provavelmente, devido às

modificações epigenéticas, mais especificamente por metilações nas citosinas do DNA

(CAPERTA et al., 2007).

5.3 Modificações pós-traducionais em histonas

A modificação pós-traducional de histonas é correlacionada com o controle da estrutura e

função da fibra de cromatina, sendo assim, diferentes modificações, assim como diferentes

combinações de modificações, implicam em funções biológicas distintas. Dentre as diversas

funções que as modificações de histonas estão envolvidas, encontra-se a regulação gênica em

geral, e, consequentemente, dos genes de rRNA (BELYAEV et al., 1997; FUCHS, J. et al., 2006;

JASENCAKOVA et al., 2003; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; PETERSON; LANIEL, 2004;

RICHARDS, 2006; SHILATIFARD, 2006; TARIQ; PASZKOWSKI, 2004). Este modo de

regulação provê uma ‘marca epigenética’ que denota um estado herdável da estrutura da

cromatina, independente da sequência de nucleotídeos (FUCHS, J. et al., 2006; RICHARDS,

2006; SHILATIFARD, 2006; TARIQ; PASZKOWSKI, 2004; VAILLANT; PASZKOWSKI,

2007).

A acetilação de histonas, em geral, é associada com a eucromatina e transcrição gênica

(BELYAEV et al., 1997; EARLEY et al., 2007; FUCHS, J. et al., 2006; HESLOP-HARRISON,

2000; JASENČÁKOVÁ, 2003; JASENCAKOVA; MEISTER; SCHUBERT, 2001;

JASENCAKOVA et al., 2000; JIN et al., 2008; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; LUSSER;

70

KOLLE; LOIDL, 2001). Essa modificação pós-traducional altera a interação histona-DNA,

resultando na descondensação da cromatina e, assim, facilita a ligação dos fatores de transcrição

aos seus sítios no DNA (JASENČÁKOVÁ, 2003; JASENCAKOVA et al., 2000; LODISH et al.,

2003). Por outro lado, a metilação da H3K9 promove o recrutamento da HP1, uma proteína

envolvida na formação da heterocromatina e silenciamento gênico (JASENČÁKOVÁ, 2003;

JASENCAKOVA et al., 2003; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005; RICHARDS, 2006). Entretanto,

apesar da mono-, di- e trimetilação da H3K9 serem fatores básicos para a formação de

heterocromatina nos sistemas de animais e fungos (FUCHS, J. et al., 2006; JACKSON et al.,

2004; JASENCAKOVA et al., 2003; NAUMANN et al., 2005; NEVES, et al., 2005; TARIQ;

PASZKOWSKI, 2004), o sistema vegetal demonstra apenas a mono- e dimetilação associadas à

heterocromatina. No sistema vegetal, a trimetilação tem sido identificada como uma marca típica

para eucromatina (FUCHS, J. et al., 2006; JACKSON et al., 2004; NAUMANN et al., 2005).

Nossos resultados revelaram isoformas acetiladas de histonas H3K14 e H4K8 em ambos

os acessos, sendo que estes estavam presentes em maior quantidade em CRT-1. Em adição, a

análise quantitativa determinou uma diferença de, aproximadamente, 30% de H3K14Ac entre os

acessos. Outra isoforma acetilada testada com anticorpos foi a H4K5, contudo, semelhante aos

resultados de experimentos preliminares com anticorpos para esta modificação (MONDIN, dados

não publicados), esta não revelou marcas, sugerindo que Crotalaria não possui tal marca

epigenética. Com relação às isoformas metiladas de H3K9, a técnica detectou as isoformas mono-,

di- e trimetiladas, no entanto, as marcas para H3K9Met2 apresentaram-se muito fracas ou

ausentes, revelando uma necessidade de novos experimentos com concentrações maiores de anti-

dimetil-histona H3 (Lys 9). Em contraste com os resultados para as isoformas acetiladas, houve

uma redução de H3K9Met1 e aumento de H3K9Met3 em CRT-1 com relação à CRT-2.

Semelhante à H3K14Ac, H3K9Met3 demonstrou uma diferença de, aproximadamente 30% entre

os acessos.

De acordo com os dados obtidos, os acessos de C. retusa demonstram padrões de

modificações pós-traducionais de histonas divergentes. Uma vez que fatores ambientais podem

influenciar nas modificações epigenéticas, infere-se que tais diferenças podem ser resultado da

ação das diferentes pressões seletivas as quais as populações originais eram submetidas

(RICHARDS, 2006). Além disso, podemos inferir que, comparando-se ao acesso CRT-1, CRT-2

possui um genoma com mais marcas para heterocromatina (H3K9Met1) e menos para

71

eucromatina (H3K14Ac, H4K8Ac e H3K9Met3), sugerindo uma maior quantidade de cromatina

aberta em CRT-1. Contudo, a cromatina descondensada per se não é o suficiente para a

transcrição; esta necessita de vários fatores para sua inicialização (LEWIN, 2004). Dessa forma,

não se pode afirmar que o acesso CRT-2 possui uma produção protéica menor e,

consequentemente, uma demanda ribossomal menor do que o acesso CRT-1. Até mesmo porque,

se CRT-2 apresentar menor quantidade de cromatina aberta, esta poderia ter um nível de

expressão gênica (taxa transcricional) mais elevada devido à influência de fatores internos ou

externos (LODISH et al., 2003; TURNER, 2001), o que resultaria em uma produção protéica

similar ou maior que a realizada por CRT-1.

Uma importante questão que devemos levar em consideração é que as modificações pós-

traducionais em histonas formam diversas combinações (LEWIN, 2004; PETERSON; LANIEL,

2004; LOIDL, 2004; STRAHL; ALLIS, 2000; TURNER, 2000). Em humanos, por exemplo,

foram identificadas mais de 150 combinações diferentes para metilações e acetilações de lisinas

da histona H3 (GARCIA et al., 2007; KANG; YUZAWA; SUGA, 2008). Cada modificação

histônica ou combinação de modificações forma um ‘código de histonas’, que é ‘lido’ por

proteínas específicas e implica na determinação da estrutura e função da cromatina, afetando

determinadas funções biológicas (JIN et al., 2008; LEWIN, 2004; LI; BUTENKO; GRAFI, 2005;

LODISH et al., 2003; LOIDL, 2004; STRAHL; ALLIS, 2000; TURNER, 2000). Em Arabidopsis,

a dimetilação de H3K9 necessita da presença da dimetilação em H3K27 para o silenciamento

gênico, enquanto que em animais, a combinação de acetilação de H4K8, acetilação de H3K14 e a

fosforilação de H3S10 é frequentemente associada com a transcrição gênica (ALVAREZ-

VENEGAS; AVRAMOVA, 2005; PETERSON; LANIEL, 2004). Dessa forma, não podemos nos

basear apenas em uma modificação pós-traducional em particular para associá-la à estrutura e

função da cromatina. Além disso, os diferentes sistemas biológicos têm desenvolvido diferentes

formas para traduzir o código, sugerindo que a ‘linguagem’ do ‘código de histonas’ seja táxon

(espécie) específico e, portanto, a inferência do estado e função da cromatina com base em uma

espécie relativamente distante torna-se inviável (ALVAREZ-VENEGAS; AVRAMOVA, 2005;

FUCHS, J. et al., 2006).

72

5.4 Análise proteômica

De acordo com Mizrahi-Aviv et al. (2005), a submissão de plantas ao estresse abiótico,

como o estresse salino, induz mudanças na expressão de genes relacionados com os processos

fisiológicos e bioquímicos da célula e, por conseguinte, dos genes de rRNA. No entanto, apesar

dos dois acessos de Crotalaria retusa serem provenientes de locais apresentando pressões

seletivas diferentes, foi observado um número reduzido de diferenças entre os perfis protéicos.

Dentre os 458 spots analisados, apenas 3,06% representam os spots exclusivos dos dois acessos e

8,95% representam os spots em comum com diferenças significativas.

A eficiência na identificação de proteínas de cada espectro a partir das bases de dados

disponíveis foi de 53,13%. Segundo Andrade (2006), a baixa eficiência na identificação de

proteínas por MS está, possivelmente, relacionada à baixa resolução do gel de eletroforese

bidimensional ao se utilizar fitas IPG com gradiente de 3-10. Além disso, as fitas IPG com

gradiente de 3-10 apresentam predomínio de mais de uma proteína por spot (ANDRADE, 2006).

Contudo, a ocorrência de mais de uma proteína por spot em nosso trabalho pode ser decorrente à

co-migração, durante a eletroforese bidimensional, de proteínas com peso molecular e ponto

isoelétrico com valores próximos (CAMARGO, 2008; JORGE et al., 2005).

As proteínas ribonuclease H, non-specific lipid-transfer protein P4 e maturase K foram

identificadas em mais de um spot, sendo que estes apresentavam diferenças no valor do ponto

isoelétrico e peso molecular. A ocorrência de múltiplos spots para uma mesma proteína na

eletroforese bidimensional já havia sido relatada em diversos gêneros, como Quercus, Medicago,

Pinus, Populus e Eucalyptus (ANDRADE, 2006; CAMARGO, 2008; GION et al., 2005; JORGE

et al., 2005; MATHESIUS et al., 2001; MIJNSBRUGGE et al., 2000). Diferentes isoformas de

uma mesma proteína, originadas a partir de modificações pós-traducionais, variações alélicas,

variações isoenzimáticas, splicing ou promotores alternativos, ou ainda, diferentes genes de uma

família multigênica, são as principais causas da presença de múltiplos spots de uma mesma

proteína (ANDRADE, 2006; CAMARGO, 2008; CHEN; HARMON, 2006; GION et al., 2005;

GODOVAC-ZIMMERMANN et al., 2005; HERBERT et al., 2001; JORGE et al., 2005; MANN;

JENSEN, 2003; MATHESIUS et al., 2001; MIJNSBRUGGE et al., 2000; ROBERTS; SMITH,

2002). Outros mecanismos que, possivelmente, originam múltiplos spots são a degradação e as

alterações químicas, tal como as modificações pós-traducionais, que podem ocorrer durante a

preparação das amostras (ANDRADE, 2006; CAMARGO, 2008; CHEN; HARMON, 2006;

73

GION et al., 2005; HERBERT et al., 2001; JORGE et al., 2005).

Grande parte das proteínas identificadas apresentou homologia de sequências em espécies

divergentes, como por exemplo, a identificação de 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-

homocysteine methyltransferase em Solenostemon scutellarioides e Arabidopsis thaliana, a

identificação de RuBisCO activase 2 em Nicotiana tabacum e Solanum pennellii e a identificação

de formate dehydrogenase em Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum e Arabidopsis

thaliana. Segundo Andrade (2006), a homologia de sequências em diferentes espécies indica que

tais proteínas são altamente conservadas.

Nosso principal objetivo ao realizar a técnica de eletroforese bidimensional era de

encontrar proteínas envolvidas no processo de modificações pós-traducionais em histonas, como

também proteínas nucleolares, diferencialmente expressas ou exclusivas. Dentre as 14 proteínas

identificadas, somente a 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase

se enquadra nesse perfil. Esta proteína possui atividade homocisteína metiltransferase, que

cataliza a transferência do grupo metil da 5-methyltetrahydrofolate para a homocisteína,

resultando na biosíntese do aminoácido metionina (CAMARGO, 2008; HESSE et al., 2001;

MIJNSBRUGGE et al., 2000; WHITFIELD; STEERS Jr.; WEISSBACH, 1970). No ciclo do

metil (Figura 15), a metionina é precursora da S-adenosilmetionina - SAM, principal doadora de

grupos metil para os processos epigenéticos de metilação do DNA e de histonas (ATTWOOD;

YUNG; RICHARDSON, 2002; CAMARGO, 2008; GRAFI; ZEMACH; PITTO, 2007; HESSE et

al., 2001; MIJNSBRUGGE et al., 2000; PETERSON; LANIEL, 2004; SHILATIFARD, 2006;

TURNER, 2001; WHITFIELD; STEERS Jr.; WEISSBACH, 1970).

A expressão diferencial de proteínas envolvidas na síntese e descarboxilação da S-

adenosilmetionina (ciclo do metil) em plantas submetidas ao estresse salino (KAWASAKI et al.,

2001), juntamente com nossos resultados, sugere que exista expressão diferencial da proteína 5-

methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase na população original do

acesso CRT-2, resultado de sua longa permanência em um ambiente litorâneo. Contudo, o

diferencial de expressão da 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine

methyltransferase (maior em CRT-1) não nos permite fazer inferência sobre os diferentes níveis

de alterações epigenéticas (metilação do DNA e de histonas) entre os dois acessos. Para tal é

necessário realizar estudos mais aprofundados relacionados com a expressão protéica.

O estresse salino pode causar adaptações de uma variedade de funções fisiológicas ou

74

metabólicas da célula, tais como controle da oxiredução, estrutura da membrana plasmática e

fotossíntese (HASEGAWA et al., 2000; KAWASAKI et al., 2001; MIZRAHI-AVIV et al., 2005;

WINICOV, 1998). Curiosamente, nossos resultados apresentaram expressão diferencial de

proteínas relacionadas com tais funções, principalmente as envolvidas na fotossíntese, sugerindo,

mais uma vez, alterações na expressão gênica da população original do acesso CRT-2 devido ao

estresse salino ambiental.

Figura 15 – Ciclo do metil em plantas demostrando a ação da 5-

methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase na biosíntese da metionina, e a formação da S-adenosilmetionina

Nota: Adaptado de Mijnsbrugge et al. (2000)

75

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Desde que a dominância nucleolar foi observada pela primeira vez por Navashin, em 1934

(PIKAARD, 1999, 2000a, 2000b; PREUSS; PIKAARD, 2007), ainda existem muitas questões

relativas aos mecanismos responsáveis pela sua realização e estabelecimento. A dominância

nucleolar é considerada como um fenômeno epigenético envolvido no controle da dosagem dos

genes de rRNA. Dessa forma, o entendimento dos mecanismos de remodelamento da cromatina

na dominância nucleolar proveria, sem dúvida, a compreensão de como a dominância nucleolar é

inicialmente estabelecida, como também da ação dos mecanismos epigenéticos na expressão geral

dos genes.

Ambos os acessos de Crotalaria retusa apresentaram expressão nucleolar diferencial em,

aproximadamente, 50% das células, no entanto, CRT-2 demonstra uma expressão nucleolar

diferencial consideravelmente maior do que CRT-1. Além disso, nossas análises verificaram

diferenças no tamanho do segmento proximal do braço curto do cromossomo 1, diferenças

quantitativas nas modificações pós-traducionais de histonas e em proteínas possivelmente

envolvidas em mecanismos epigenéticos. Sugere-se que tais diferenças encontradas sejam devidas

às diferentes pressões seletivas as quais as populações originais foram submetidas. Uma vez que

as variações epigenéticas podem ser modificadas por fatores ambientais, C. retusa tornou-se um

modelo muito importante no estudo da epigenética na dominância nucleolar.

Este trabalho possibilitou verificar os efeitos ambientais nos padrões epigenéticos de dois

acessos diferentes em C. retusa. No entanto, experimentos imunocitoquímicos envolvendo

modificações pós-traducionais de histonas com seqüencial hibridação in situ fluorescente com

sondas para sequências heterocromáticas isoladas, possibilitariam estabelecer relações mais

seguras entre o estado da cromatina e as modificações pós-traducionais de histonas em C. retusa.

Assim como estudos mais aprofundados relacionados à expressão protéica poderiam revelar

proteínas e enzimas envolvidas nos processos de alterações epigenéticas, permitindo uma

compreensão mais ampla de seu mecanismo.

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Controle genético e epigenético da expressão heteromórfica de