Cromatógrafo de líquidos de alta resolución 1100 (rev final) · llave de purga de la bomba haciéndola girar 2 a 3 vueltas en el sentido contrario de las agujas del reloj. Esta

INSTRUCTIVO DE USO

CROMATÓGRAFO DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) AGILENT 1100

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1. OBJETIVO

1.1 Proveer al usuario un instructivo para el uso del equipo Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Agilent 1100, con software ChemStation A 10.02, del Laboratorio de Análisis químico Instrumental.

2. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

2.1 Definiciones

2.1.1 Cromatografía de Líquidos: es una técnica cromatográfica que permite analizar mezclas complejas de sustancias químicas que pueden disolverse en algún solvente. La muestra líquida se introduce a través de un puerto de inyección, desde donde es empujada hasta la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil líquida en la que es soluble la muestra, la cual se encarga de transportar los analitos a través de la columna, pero también de interactuar con ellos. La separación de los componentes de la mezcla se realiza por medio de una migración diferenciada que se logra gracias a la interacción de cada compuesto con las fases móvil y estacionaria al pasar a través de la columna cromatográfica. En la cromatografía instrumental, cada analito separado llega hasta un detector, el cual produce una señal a partir de algún principio fisicoquímico para luego generar un cromatograma (señal vs. tiempo de retención).

2.1.2 Purgar: Limpiar o purificar una cosa, eliminar lo que se considera malo o perjudicial.

2.2 Abreviaturas 2.2.1 V: Voltios 2.2.2 °C: grados centígrados 2.2.3 %: porcentaje

3. INSTRUCCIONES

3.1 Instalación

3.1.1 Instalar el equipo en una superficie sólida. 3.1.2 Verificar que las condiciones ambientales se encuentre a una temperatura entre 0-55ºC y humedad no

mayor a 95%. 3.1.3 Los módulos: Bomba Isocrática, Compartimiento Termostatizado para Columnas, Detector UV-Visible

y Detector de Fluorescencia, trabajarán con 110-120 V, con una variación +/- 10%, con sistema de protección de picos y respaldo en caso de apagones.

3.1.4 Instalar la columna de trabajo en el compartimiento termostatizado para columnas, verificando las instrucciones según el tipo de columna que se pueda utilizar.

3.1.5 Conectar en tomacorriente el cable de alimentación eléctrica. 3.1.6 Conectar en cable de conexión entre computadora y equipo Agilent 1100. 3.1.7 Conectar los cables de comunicación entre los módulos. 3.1.8 Colocar los frascos con fase móvil en la bandeja de solventes en la parte superior del aparato (ver

imagen 1), asegurándose que contengan al menos 0.5 L de líquido. 3.1.9 Instalar la manguera de la bomba isocrática y colocar en el otro extremo el filtro. 3.1.10 Colocar el filtro dentro del frasco con fase móvil a utilizar. 3.1.11 Instalar recipiente para desechos y colocar los extremos de las mangueras de purga y salida del

detector dentro del recipiente (ver imagen 2).

3.2 Operación 3.2.1 Encender cada uno de los módulos (compartimiento de bomba, compartimiento columna y detector)

presionando el botón de encendido hacia dentro (ubicado en el lado izquierdo, parte inferior). En ese momento aparecerá una luz de color amarillo en el botón y la luz indicadora del lado superior derecho (ver imagen 3).

3.2.2 Encender la computadora correspondiente al equipo e ingresar la clave. 3.2.3 En la pantalla presionar INICIO y luego buscar: INSTRUMENT 2 ONLINE, pulsar con doble click. 3.2.4 Cargar el método a utilizar, presionando la flecha que se indica en la siguiente figura y seleccionar el

método a utilizar según la técnica analítica (ver imagen 4).

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Imagen 1. Ubicación de la bandeja para

frascos con solventes.

Imagen 2. Ubicación del recipiente para desechos.

Imagen 3. Ubicación de los botones de encendido de cada módulo.

Imagen 4. Ventana principal del software ChemStation A 10.02.

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3.2.5 Acondicionamiento del equipo con fase móvil.

3.2.5.1 Antes de iniciar el análisis, se deberá purgar la bomba, para ello hay que asegurarse que la fase móvil a utilizar ya esté colocada en la bandeja superior y con el filtro dentro del frasco. Abrir la llave de purga de la bomba haciéndola girar 2 a 3 vueltas en el sentido contrario de las agujas del reloj. Esta llave es de color negro y está ubicada en el centro-medio frontal del compartimiento de la bomba (ver imagen 5).

3.2.5.2 Ir a la computadora y en el software configurar el contenido del frasco de fase móvil dando click al ícono correspondiente y luego click en la opción SET UP. Ingresar en la opción de “actual volume” la cantidad 0.5 (equivalente a 500 mL contenidos en el frasco de fase móvil) y dar OK (ver imágenes 6 y 7).

Imagen 5. Ubicación de la llave de purga de la bomba isocrática.

Imagen 6. Ícono para entrar a la configuración del contenido de fase móvil.

Imagen 7. Ventana para configurar el contenido de fase móvil del frasco correspondiente.

3.2.5.3 Dar click en el cuadrito de la esquina derecha abajo del icono de la bomba para encenderla y

aparecerá el mensaje: TURN ON THE PUMP? Dar click en SÍ (ver imagen 8). 3.2.5.4 La bomba empezará a funcionar. Se recomienda dejar que corra la fase móvil con la llave de

purga abierta por 5 minutos, asegurándose que no quede ninguna burbuja en el sistema. 3.2.5.5 Apagar la bomba presionando nuevamente el cuadrito de la bomba y aparecerá el mensaje:

SWITCH OFF THE PUMP (STAND BY MODE)? Presionar SÍ (ver imagen 9).

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3.2.5.6 Regresar al equipo y cerrar la llave de purga de la bomba girando la perilla negra a favor de las agujas del reloj hasta que se sienta un tope.

3.2.5.7 Una vez acondicionada la bomba se continúa con el acondicionamiento de todo el sistema: bomba, columna y detector, para ello se enciende en el software todo el sistema, dando click en el botón de ON, en la parte inferior derecha de todos los iconos (ver imagen 10).

3.2.5.8 En ese momento empezarán todos los iconos se tornarán de color amarillo. Cuando se hayan estabilizado se tornarán de color verde.

3.2.5.9 La línea que muestra la señal del detector durará al menos 30 minutos para mostrar una línea base estable y que se vea totalmente horizontal. Durante este tiempo se deberá ajustar (ADJUST) y balancear (BALANCE) la señal de la ventana (ver imagen 11).

Imagen 8. Botón de activación de la bomba isocrática.

Imagen 9. Desactivación de la bomba isocrática.

Imagen 10. Botón de encendido general de todos los

módulos del HPLC.

Imagen 11. Ventana que muestra la señal del detector y

los botones de ajuste de la señal.

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3.2.6 Inyección de soluciones y muestras. 3.2.6.1 Después de alcanzar una línea base estable se puede proceder a inyectar los estándares y

muestras según indique el método utilizado. Para ello se utilizan jeringas graduadas en microlitros y se insertan a través del inyector manual. Antes del procedimiento de inyección, deben ingresarse los datos de la muestra, para esto dar click en RUN CONTROL, bajar a SAMPLE INFO y dar click, se desplegará una ventana donde se deberá colocar toda la información de la inyección a realizar (ver imágenes 12 y 13).

3.2.6.2 Procedimiento de Inyección: con la palanca en posición LOAD se inserta la jeringa en el inyector y se descarga el volumen completo de la misma, normalmente 20 µL. Dejando la jeringa insertada la palanca se baja a la posición INYECT, luego se retira la jeringa y se deja en esa posición durante el tiempo de la corrida. Antes de realizar una nueva inyección, regresar la palanca a la posición LOAD (ver imágenes 14 y 15).

Imagen 12. Opción de Run Control para ingresar

los datos de la muestra.

Imagen 13. Ventana para ingresar los datos de la

muestra.

Imagen 14. Puerto de inyección con palanca en

posición LOAD.

Imagen 15. Puerto de inyección con palanca en

posición INYECT.

3.2.6.3 Luego de la inyección aparecerá en pantalla del software en la parte superior izquierda el mensaje IN PROCESS en color azul, indicando que la corrida de la muestra está en proceso.

3.2.6.4 Cuando se termine la corrida aparecerá el mensaje READY en color verde y se desplegarán los resultados de la corrida.

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3.2.6.5 Se puede continuar realizando las inyecciones que sean necesarias bajo el mismo método de trabajo siguiendo las indicaciones de los incisos 3.2.6.1 a 3.2.6.4.

3.2.6.6 Al terminar todas las corridas se hace click en el botón de OFF en la parte inferior derecha, con lo cual se apagarán todos los módulos (ver imagen 16).

3.2.6.7 Al momento de dar click en OFF, aparecerá el siguiente mensaje: SWITCH OFF LC PUMP, THERMOSTAT AND LAMP? Se presiona SÍ (ver imagen 17).

Imagen 16. Botón de apagado general de todos los módulos del HPLC.

Imagen 17. Ventana de confirmación para apagar todos los módulos del HPLC.

3.2.7 Limpieza de la columna. 3.2.7.1 Luego de realizar las inyecciones y apagar el sistema es importante limpiar la columna, sobre

todo si se utilizó una fase móvil con algún buffer. Para esto se deberá se colocar el filtro de la manguera de la bomba en una fase móvil limpiadora según la metodología del último análisis realizado.

3.2.7.2 Realizar la limpieza encendiendo únicamente la bomba en la ChemStation y durante el tiempo estipulado por la metodología utilizada.

3.2.7.3 Dejar el filtro en la solución de fase móvil de limpieza, controlando que el nivel de la misma no permita el ingreso de aire a la bomba.

3.2.7.4 Una vez lavada la columna, apague la bomba y traslade la manguera y el filtro a un frasco conteniendo metanol.

3.2.7.5 Encienda nuevamente la bomba y déjela funcionando el tiempo que recomiende la metodología para asegurarse que la columna está 100 % llena de metanol.

3.2.8 Apagado del equipo.

3.2.8.1 Después de apagar todos los módulos del equipo desde la ChemStation, presionar la X de la esquina superior derecha para cerrar el programa. Se desplegará el siguiente mensaje: CLOSE INSTRUMENT 2 (ONLINE)? Presionar SÍ (ver imagen 18).

3.2.8.2 Luego de cerrar el software, apagar el equipo, presionando el botón de encendido/apagado de cada módulo.

3.2.8.3 Anotarse en el registro de uso del equipo. 3.3 Limpieza del equipo y mantenimiento

3.3.1 La limpieza externa del equipo se realizará con un paño suave para eliminar partículas de polvo, siempre que sea necesario. La bandeja de solventes se podrá limpiar con una solución de limpieza neutra.

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3.3.2 Mantenimiento básico: el cambio cualquier consumible (por ejemplo: fritas) se realizará por el encargado del laboratorio según los parámetros de control previamente definidos. El cambio de columna también deberá realizarse por el encargado del laboratorio según el tipo de muestra y la metodología a trabajar.

3.3.3 Mantenimiento preventivo: se realizará de forma anual por personal calificado de alguna empresa de servicios de mantenimiento para el equipo específico.

Imagen 18. Mensaje de confirmación previo a cerrar el software ChemStation.

4. REFERENCIAS:

4.1 Referencias Bibliográficas 4.1.1. Manual de Referencia. Compartimiento Termostatizado para Columnas, Detector, Instalación HP

1100- Agilent 1100- Uso de HP ChemStation.

5. ANEXOS: 5.1 Anexo 1: Fotografías y señalización de partes de HPLC Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución

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Anexo 1: Fotografías y señalización de partes del C romatógrafo de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)

Partes del Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resoluc ión HPLC Agilent 1100 a. Bandeja de solventes b. Módulo de bomba isocrática c. Puerto de inyección manual d. Módulo de compartimiento termostatizado para columna e. Módulo de detector UV/VIS f. Módulo de detector de Fluorescencia

a.

b. c. d. e.

f.

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