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Bol. Soc. Argent. Bot. 34 (3-4):179-183. 2000

CULTIVO "IN VITRO" DE MICOBIONTES DE PARMOTREMA ECILIATUM

Y FLAVOPARMELIA EXORNATA (PARMELIACEAE, ASCOMYCOTA .LIQUENIZADOS) CON PRODUCCION DE TRIGLICERIDOS

Por MARIA D. BERTONI*, MONICA T. ADLER* y MARTA S. MAIER**

Summary: Invitrocultureofmycobiontsof ParmotremaeciWatum and F\avoparme\\aexomata(Parme\\aceae,lichenized Ascomycota) with production of triglycerides. The mycobionts of Parmotrema eciliatum (Nyl.) Haleand Flavoparmelia exornata (Zahlbr.) Hale have been cultured axenlcally on solid medium (malt extract-yeastextract- sucrose-agar) starting from ascospores. Growth was extremely slow In both species, whose myceliareached only 6-10 mm diam. after 10 months.The colonies were very compact, with fungal tissue constitutingmostlya paraplectenchymatous lamina with revolute marginsand poordevelopmentof aerial hyphae. Chemicalanalysis of the mycobionts by thin layer chromatography after 4, 7, and 10 months of growth did not detectaccumulation of the major secondary metabolites characteristicof the natural thalli, namely atranorin and sticticacid in Parmotrema eciliatum, and usnicand malonprotocetraricacids inFlavoparmelia exornata, compoundsof the acetate-polymalonate pathway. Nuclear magnetic resonance spectra taken after 1.0 months revealedmainly the accumulation of triglycerides (lipids of primary metabolism) by the mycobionts.

Keywords Lichen mycobionts, culture, Parmeliaceae,Parmotrema, Flavoparmelia, triglycerides.

INTRODUCCION la producción de los metabolitos secundarios. Al¬gunos ejemplos parecen indicar que la presenciadel fotobionte no es necesaria para la producciónde los metabolitos secundarios, ya que éstos pue¬den sintetizarse si se modifican las condiciones de

• Ahmadjian (1993) y Huneck & Yoshimura(1996), revisaron y sintetizaron la información bi¬bliográfica referente a cultivos de micobiontesliquénicos y las sustancias mayoritarias acumula¬das por los mismos. Algunos micobiontes produje¬ron las mismas sustancias que el liquen natural,resultados que demuestran que los genes que codi¬fican para la síntesis de las sustancias liquénicascaracterísticas del liquen, se encuentran en elgenoma del micobionte; otros produjeron com¬puestos secundarios diferentes a los de la entidadsimbiótica natural, mientras que otros micobiontesprodujeron solamente una parte de los metabolitosmayoritarios del liquen o acumularon solamentemetabolitos primarios.

La inconsistencia de estos resultados y la esca¬sez de información existente no ha permitido com¬

cultivo, por ejemplo a través de la desecación delmedio (Culberson & Armáleo, 1992) o por mediode un exceso de fuente carbonada (Hamada &Miyagawa, 1995).

En las revisiones de Ahmadjian (1993) y Huneck& Yoshimura (1996) no se menciona ningún estu¬dio experimental "in vitro" con Parmeliáceasfoliosas. Anteriormente, Ahmadjian (1961) habíaaislado el micobionte de Xanthoparmelia conspersa(Ach.) Hale, cultivándolo sobre medio sólido, perosin realizar estudios anatómicos ni químicos.Bloomer et al. (1970) cultivaron en medio líquido el

. micobionte de Cetraria islándica (L.) Ach., pero nopudieron demostrar la producción de ácido

prender hasta el presente el papel del fotobionte en protoliquesterínico que es acumulado en estadoliquenizado. Crittenden et al. (1995) aislaron losmicobiontes de varias Parmeliáceas foliosas pero

-'_ no estudiaron su anatomía ni la producción de‘Departamento de Ciencias Biológicas. ** Departamento de metabolitos.

Química Orgánica.Facultad deCiencias Exactas y Naturales, Universidad de Bue¬

nos Aires, Piso 4, Pabellón 2, Ciudad Universitaria, 1428 BuenosAires, Argentina.

En el presente trabajo se informa el aislamientode los micobiontes de Parmotrema eciliatum (Nyl.)Hale y Flavoparmelia exornata (Zahlbr.) Hale, obte-

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nidas a partir de ascosporas. Se describe la morfo¬logía y anatomía de lás colonias y se caracterizanlos metabolitos mayoritarios acumulados por ellas.

ácido sulfúrico concentrado y posterior calenta¬miento a 110 °C. La mezcla de triacilglicéridoseluída con cloruro de metileno : metanol (1:1) fueanalizada por RMN 'H y los ésteres metílicos de losácidos grasos fueron preparados utilizando BF3 14% en metanol (Metcalfe & Schmitz, 1961).

Los ésteres metílicos de los ácidos grasos fueronseparados en un cromatógrafo gas-líquido HewlettPackard 5890A equipado con un detector deionización de llama y una columna ULTRA 2 (5 %fenil metilsiloxano entrecruzado, 25 m, d.i. 0,2 mm)

con temperaturas entre 150 y 280 °C a una veloci¬dad de 15 °C/min. Las identidades de los ácidosgrasos fueron asignadas por cromatografía gas/líquido - espectrometría de masa utilizando un

espectrómetro de masa TRIO-2 VG acoplado a uncromatógrafo Hewlett Packard 5890A.

MATERIAL Y METODOS

Los talos de P. eciliatum y F. exornata fueroncoleccionados en una isla del Delta del Paraná (Pro¬vincia de Buenos Aires, Argentina) sobre el ArroyoCaraguatá, y secados al aire a temperatura ambien¬te. Para la obtención de ascosporas y colonias sesiguieron los procedimientos descriptos porHamada (1989). El medio de cultivo inicial fue MY:extracto de malta (10 g), extracto de levadura (4 g),sacarosa (4 g), agar (20 g), agua destilada (1 litro).Después de 4 meses de cultivo en tubos de ensayo,las pequeñas colonias de micobiontes se repicarona cajas con medio MY10, igual al medio MY perocon 100 g/1 de sacarosa (Hamada, 1989). Despuésde crecer en este medio durante 3 meses se realizóun repique final a MY10, donde las colonias crecie¬ron durante otros 3 meses. Las incubaciones serealizaron en oscuridad, a una temperatura de 18-22 °C. A los 10 meses las colonias fueron cosecha¬das y secadas a 50 °C hasta peso constante para losanálisis químicos.

Para las observaciones anatómicas, una coloniade cada especie, de 7 meses de edad, fue fijadadurante 24 horas en glutaraldehido 3% (en bufferfosfáto 0,13 M; pH 7,4), deshidratándola luego enuna Serie de alcoholes (50° hasta 100°) y acetona. La

• inclusión se realizó en resina Spurr. Se obtuvieroncortes de 2 pm de espesor con un ultramicrótomoSorvall (Porter-Blum) MT2-B con cuchilla de vi¬drio, los cuales se tiñeron con azul de toluidinapara la observación con microscopio óptico (D'Ambrogio de Argüeso, 1986).

Los talos liquénicos de P. eciliatum (100 mg) y F.exornata (100 mg) fueron secados a 50 °C hasta pesoconstante y extraídos con acetona (15 h) a tempera¬tura ambiente, obteniéndose 17,1 mg y 19,1 mg deextracto, respectivamente. Cada extracto fue anali¬zado por cromatografía en capa delgada(Culberson & Ammann, 1979) por comparacióncon muestras conocidas y mediante espectroscopiade resonancia magnética nuclear protónica (RMN*H). Los micelios de P. eciliatum (100 mg) y F,

exornata (100 mg) fueron extraídos en acetona erilas mismas condiciones que los talos liquénicos,obteniéndose 6,8 mg y 7,1 mg de extracto, respecti¬vamente. Cada extracto fue purificado porcromatografía en capa delgada (sílica gél 60, F-254,Merck) utilizando tolueno: ácido acético (17:3)como solvente de desarrollo. La detección de loscompuestos se realizó con luz ultravioleta (254 nm,360 nm) y por pulverización con vainillina 2 % en

RESULTADOS Y DISCUSION

Los análisis por cromatografía en capa delgada ‘y espectroscopia de resonancia magnética nuclearprotónica, de los extractos de talos de P. eciliatum yF. exornata, revelaron la presencia de atranorina ylos ácidos stíctico (mayor), constíctico (menor) ynorstíctico (menor) en P. eciliatum, mientras que enF. exornata los compuestos mayoritarios identifica¬dos fueron los ácidos úsnico y malonprotocetrárico.

Los ensayos de germinación de las ascosporasen agar-agua 2 % mostraron que la tasa degerminación es de 40 % en P. eciliatum y de 4 % enF. exornata, a los 15 días de disparadas sobre lasuperficie del agar. El desarrollo de las colonias fueextremadamente lento en ambas especies. La ob¬servación-de las mismas con el ojo desnudo fueposible recién a los 4 meses de crecimiento en me- .

dio MY. Los micelios de ambas especies eran muycompactos, color gris (los más pequeños) o castañooscuro (los más desarrollados) y de 1-2 mm diám.para P. eciliatum (Fig. 1A), y color crema a gris-castaño y 0,5-1,5 mm diám. para F. exornata. Los demayor tamaño mostraban gotas de exudado casta¬ño. Al séptimo mes de cultivo (luego de 3 meses enmedio MY10) las colonias de ambas especies teníanun diámetro de 2-4 mm para F. exornata y de 4-6 mmpara P. eciliatum. Las colonias más desarrolladas (de7-10 meses) eran morfológicamente similares enambas especies: redondas, muy compactas, colorcastaño oscuro, frecuentemente con gotas castañasexudadas en la superficie, y con escaso desarrollo dehifas aéreas (cortas y en mechones de varias hifaspegadas); los rangos de tamaños eran de 4-8 mmdiám. en F. exornata y de 6-10 mm en P. eciliatum. Laspresentes observaciones coinciden en gran parte conla descripción de Ahmadjian (196Í) del micobiontede Xanthoparmelia conspersa (Ach.) Hale¡

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M. D. Bertoni, M. T. Adler & M. S. Maier, Micobiontes de líquenes

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Fig.1.-Cultivo de micobiontes de Parmeliáceas. A. Colonia deParmotrema eciliatum después de 4 meses sobre medio MY;escala, 0,5 mm. B. Sección de una colonia deFlavoparmelia exornata de 7 meses de edad (4 meses sobre MY y 3 meses sobreMY10); escala 0,5 mm.C. Detalle de B, la lámina paraplectenquimática está diferenciada en dos zonas, una externa (flechagrande) que toma más la tinción y una interna más tenue y menos coloreada (flecha pequeña); escala 100 pm. D. Detallede C, la flecha señala un mechón de hifas aéreas; escala 50 pm.

Tanto en P. eciliatum como en F. 'exornata lassecciones de las colonias de 7 meses de edad, mos¬traron que eran casi huecas, aproximadamente conforma de boina (Fig, IB). Las mismas estabanconstituidas por una lámina de tejido paraplec-tenquimático de células cortas, orientadas al azar ymuy conglutinadas. En ella se podían diferenciardos zonas, una externa más compacta y de célulascon paredes gruesas y una interna más tenue, for¬mada por células de paredes más delgadas (Fig. 1Cy D). La mayor parte de la masa de la coloniacorrespondía al tejido paraplectenquimático, mien¬tras que el desarrollo de hifas aéreas era muy esca¬so (Fig. 1 C y D). El paraplecténquima es muyfrecuente en los talos naturales, especialmente enrepresentantes de las familias Parmeliaceae,Hypogymniaceae y Anziaceae (Hale, 1976).

Los análisis químicos por cromatografía en capadelgada de los micobiontes de 4, 7 y 10 meses deedad, no detectaron la acumulación de losmetabolitos secundarios característicos de las res¬

pectivas especies; así como ninguno de losmetabolitos secundarios de la vía metabólica delacetato-polimalonato ni de, otra vía secundaria. Elanálisis de los espectros de RMN 'H de los extrac¬tos de micobiontes de 10 meses de edad, tampocodetectó la presencia de los productos secundarioscaracterísticos del liquen, revelando en cambio enambas especies, la acumulación de triglicéridos (0,5% en fteso en P. eciliatum y 2 % en peso en F.exornata), no detectados en los talos naturales. Elanálisis por cromatografía gas-líquido de la mezclade ésteres metílicos de ácidos grasos de lostriglicéridos de P. eciliatum y F. exornata reveló lapresencia de los ácidos palmítico, esteárico y oleicocomo componentes mayoritarios, comprendiendolos mismos el 85% de la mezcla en P. eciliatum y un55% en F. exornata. Se identificó, además, la presen¬cia de los ácidos palmítico insaturado (A7), linoleico,docosanoico y tetracosanoico.

Estos resultados coinciden parcialmente con losobtenidos por Renner & Gerstrier (1982) con el

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AGRADECIMIENTOSmicobionte de Baeomyces rufas, un liquen con talo

combinado que en la naturaleza acumula losmetabolitos secundarios del grupo del ácidostíctico: ácidos constíctico, criptostíctico, norstíctico PIP 4492/96, el apoyo del PRHIDEB) y a la Univer-

y stíctico. Este último micobionte, cultivado sobre sidad de Buenos Aires (subsidios UBACYT EX047/extracto de malta (0,2 %), glucosa (0,2 %) y ribitol 95 y EX059/98), que financiaron parcialmente este

(0,2 %), agar (2 %) acumulaba triglicéridos, además trabajo. M. T. Adler agradece a la Facultad de Cien-

de carotenoides, en lugar de los metabolitos secun- cias Exactas y Naturales (UBA) por brindarle lugar

darios característicos del liquen natural. de trabajo como Investigadora del CONICET.

La acumulación de triglicéridos (lípidos del me¬tabolismo primario) como sustancias mayoritarias,podría indicar que 1) las condiciones experimenta¬les no fueron satisfactorias para la inducción de loscaminos biosintéticos del metabolismo secundario

Las autoras agradecen al CONICET (subsidio

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cundario.Some problemsinlichenmetabolism:Studies with the

mycobionts Cetraria islándica and Cladonia papillaria.

En el presente trabajo la alta relación C/N del Bryologist 73: 586- 591.

medio de cultivo fue aparentemente responsable CRITTENDEN, P. D.,J. C. DAVID, D. L. HAWSWORTH &,, i-'j.-i-'-j J F.S.CAMPBELL.1995.Attempted isolationandsuccessde la acumulación de triglicéridos, como sucede en . . . , . , _ , ,, . ? . , in theculturing ora broad spectrum or licnen-rormmghongos oleaginosos no simbióticos, que suelen acu-

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zar metabolitos secundarios, al contrario de lo quesuele suceder con las bacterias, donde él metabolis¬mo secundario frecuentemente es estimulado porelevadas concentraciones de carbono en el medio

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Los resultados obtenidos con los micobiontes deP. eciliatum y F. exornata no coincidieron como seesperaba, con los de Hamada & Miyagawa (1995)

donde el micobionte de Ramalina silicuosa pudosintetizar ácido salacínico, característico del liquennatural, en el medio MY10, con muy alta' concen¬tración de sacarosa. Los resultados del presente •

trabajo también difieren de los obtenidos porHamada (1996) quien logró la producción de losmetabolitos secundarios característicos de Buelliastellulata (atranorina y ácido norstíctico) por elmicobionte en medio MY10.

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Es posible que las condiciones óptimas de culti- HONEGGER, R. & V. KUTASI. 1990. Anthraquinonevo pára la producción de determinados metabolitossecundarios característicos, varíen según el sistema

liquénico en estudio, como sugieren los resultadosde Honegger & Kutasi (1990) al estudiar losmicobiontes de Xanthoria. Mientras en X. elegans lasíntesis de antraquinonas es estimulada en mediosmuy nutritivos, en X. parietina la acumulación dedichas sustancias disminuye notoriamente en las

mismas condiciones. Esto podría explicar la incon¬

sistencia de los resultados obtenidos por distintosautores al trabajar con distintos sistemas liquénicos.. RENNER, B. & E. GERSTNER. 1982. Stoffwechse-

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