UNESP - INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA APLICADA À ENFERMAGEM

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS: BACTERIOLOGIA

CURSO DE ENFERMAGEM - 1º ANO

- 2016 -

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METODOLOGIA DE ENSINO I - INTRODUÇÃO As aulas da Disciplina de Microbiologia serão ministradas em 3 períodos semanais: Terças e Quartas, pela manhã. Na maioria das vezes cada aula teórica será acompanhada (anteriormente ou posteriormente) por uma aula correspondente prática. II - PROGRAMA Compreende quatro unidades a saber: 1) Bacteriologia Geral: Estudo das características gerais das bactérias, como: estrutura, cultivo, ação dos agentes antimicrobianos, genética, etc. 2) Bacteriologia Especial: Estudo dos principais gêneros bacterianos de importância em patologia humana. 3) Micologia: Estudo das características gerais dos fungos e dos principais agentes causadores de micoses humanas. 4) Virologia: Estudo das características gerais dos vírus e dos principais agentes causadores de viroses humanas. III - ATIVIDADES DIDÁTICAS 1. Aulas Práticas e Teóricas

As aulas práticas serão realizadas no Laboratório 1 da Central de Aulas I do Instituto de Biociências. Os alunos serão distribuídos em grupos para realização dos trabalhos práticos.

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LIVRO ADOTADO - TRABULSI, L.R., Microbiologia, 4a. edição, 2005 ASSUNTOS PÁGINAS Morfologia e coloração das bactérias 07- 08 Estrutura da célula bacteriana 08 - 19 Nutrição bacteriana 21 - 23 Meios de cultura 23 - 28 Crescimento bacteriano 31 - 36 Genética bacteriana 37 - 49 Controle dos Microrgansimos 57 - 65 Mecanismo de ação dos antimicrobianos e Mecansimos de resistência 79 - 89 Controle laboratorial do tratamento das infecções bacterianas (antibiograma) 91 - 97 Staphylococcus 175 – 187 Streptococcus 189 – 217 Neisseria 219 – 227 Generalidades sobre Enterobactérias 269 – 276 Escherichia 277 – 309 Shigella

311 – 317 Salmonella

319 – 328 Micobactérias 409 – 421 Anaeróbios 377 – 387 Fungos 451 – 499 Vírus 509 - 564

CUIDADOS 1. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são realizados 2. Não fume e não coma no laboratório. Evite levar à boca qualquer objeto (lápis, dedo, etc). 3. Não use frascos do laboratório para tomar água. 4. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a mesa ou assoalho, ferimentos de qualquer espécie, aspirações da cultura na boca, etc). 5. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 6. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório. 7. Antes de iniciar suas atividades e depois de terminá-las, limpe com desinfetante, o seu local de trabalho. NOTA: É OBRIGATÓRIO O USO DE AVENTAL DURANTE OS TRABALHOS PRÁTICOS.

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BACTERIOLOGIA GERAL

TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

Os materiais que comumente são utilizados em Microbiologia podem ser enumerados em: 1. Alça e Fio de Platina 2. Meios de Cultura (Sólidos e Líquidos) 3. Placas de Petri e Tubos de Ensaio 4. Pipeta Pasteur 5. Microscópio 6. Lâminas de Vidro 7. Estufa e Banho-maria 8. Autoclave e Forno Pasteur Dentre os cuidados que são necessários para que o material não seja contaminado, salientamos as seguintes regras: 1. Alça e fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Isto será conseguido, aquecendo-se os mesmos e logo após, a parte inferior do cabo deverá ser passada na chama de Bico de Bunsen, 2 a 4 vezes. A posição ideal para a flambagem da alça é um ângulo de 45º em relação à mesa de trabalho. Outro cuidado indispensável é o de promover o esfriamento da alça antes de ser colhido o material. Para tanto a alça quente deverá ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio. 2. Relativamente às semeaduras procedidas em tubos de ensaio, exige-se flambar a boca dos mesmos após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. O tampão de algodão deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão direita e nunca deve ser deixado sobre a mesa do laboratório. 3. As pipetas que utilizaremos serão previamente esterilizadas e embrulhadas em papel. Para sua utilização e ao mesmo tempo evitar que se contaminem, deve-se torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente a parte superior do papel e depois a inferior (ponta da pipeta). A pipeta utilizada deverá ser colocada dentro de um recipiente de vidro, contendo solução de desinfetante. 4. As placas de Petri deverão ser manuseadas com cuidado e não deverão ficar abertas, isto é, expostas ao ambiente. Com esta medida e mais a exigência de abrí-las próximo ao Bico de Bunsen, o tempo suficiente para a semeadura, colheita do material ou simplesmente inspeção, será evitada a contaminação através de germes do ar. Uma vez semeadas, devem ser incubadas em estufas, com tampa voltada para baixo. 5. Tendo em vista os exercícios de bacterioscopia, as lâminas contendo esfregaços de material fixado e corado sempre serão observadas através do uso da objetiva de imersão; a lâmina, após detalhada observação, deverá ser colocada em recipiente próprio colocado no laboratório. O microscópio uma vez utilizado, deverá ser limpo e imediatamente procedido o seu acondicionamento.

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Nº 1

MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DAS BACTÉRIAS 1.MORFOLOGIA 1.1.As bactérias de um modo geral, apresentam-se sob a forma de: a) Cocos (esferas) b) Bastonetes retos (bacilos) c) Bastonetes encurvados (espirilos) As formas básicas acima mencionadas estão sujeitas a variações(formas plemórficas e formas de involução). 1.2.Agrupamentos Segundo o(s) plano(s) de divisão celular as bactérias podem agrupar-se: a) diplococo b) estafilococo c) estreptococo, estreptobacilo 2. MÉTODOS DE COLORAÇÃO 1.1. Método de Gram Este método de coloração diferencial permite a separação das bactérias em dois grandes grupos: GRAM-positivas: São aquelas que não se deixam descorar quando submetidas à ação de solventes orgânicos (álcool, éter, etc) e permanecem com a cor do cristal violeta.

GRAM-POSITIVA = COR AZUL GRAM-negativas: São, portanto, aquelas que se deixam descorar pelo solvente orgânico tomando a cor do corante de contraste (safranina ou fucsina).

GRAM-NEGATIVA = COR VERMELHA 2.1.Método de coloração de Ziehl-Neelsen Constitui um método específico para a coloração das Micobactérias (Ex.bacilo de Hansen e bacilo da tuberculose). Tais bactérias se caracterizam por resistirem à ação do álcool-ácido permanecendo, portanto, com a cor do primeiro corante (fucsina-fenicada).

B.A.A.R. = COR VERMELHA EXERCÍCIOS A) COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE GRAM. MATERIAL NECESSÁRIO - Culturas A, B, C, D; - Bateria de Gram: violeta genciana, lugol, álcool e fucsina;

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- Lâminas bem limpas; - Alça de platina; - Solução fisiológica. TÉCNICA 1.Com auxílio da alça de platina, fazer esfregaços bem finos sobre a lâmina de microscopia. Esperar secar. 2.Fixar os esfregaços passando a lâmina três vezes sobre a chama do Bico de Bunsen. 3.Deixar a lâmina esfriar e cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1 minuto. 4.Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1 minuto. 5.Escorrer o lugol e decorar os esfregaços pelo álcool. Para isso deixe o álcool cair gota a gota sobre a lâmina, man tendo-a inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos. 6.Lavar a lâmina em água corrente. 7.Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto. 8.Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro. 9.Examinar ao microscópio com a objetiva de imersão. 10.Desenhar nos espaços abaixo as bactérias observadas. Lâmina A Lâmina B Lâmina C Lâmina D

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B) Coloração de Bactérias pelo Método de Ziehl-Neelsen MATERIAL NECESSÁRIO - Lâmina de microscopia contendo esfregaço de escarro; - Bateria de Ziehl-Neelsen: fucsina fenicada, álcool-ácido e azul de metileno. TÉCNICA 1.Cobrir a lâmina com fucsina fenicada. Com auxílio de Bico de Bunsen aquecer a preparação até a emissão de vapores. Manter o aquecimento durante 3 a 5 minutos. NÃO DEIXAR A FUCSINA FERVER OU SECAR 2.Escorrer a fucsina e descorar completamente pelo álcool-ácido. 3.Lavar em água corrente. 4.Cobrir o esfregaço com a solução de azul de metileno. Esperar de 30 segundos a 1 minuto. 5.Lavar em água corrente. Secar com papel de filtro. 6.Examinar ao microscópio com a objetiva de imersão. 7.Desenhar no espaço abaixo as bactérias observadas:

Nº 2 ESTRUTURA DA CÉLULA BACTERIANA

A célula bacteriana apresenta as seguintes estruturas: 1. Estruturas externas a) Flagelos d) Parede celular b) Fímbrias e) Membrana citoplasmática c) Cápsula 2. Estruturas internas a) Esporo d) Ribossomas b) Citoplasma e) Núcleo c) Mesossomas f) Grânulos citoplasmáticos EXERCÍCIOS A) Coloração da cápsula - Método de Hiss - Esfregaço a partir de cultura de Klebsiella sp - Observar ao microscópio com objetiva de imersão - Desenhar a estrutura visualizada:

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B) Coloração da parede celular - Metodo de G.Moreno. - Esfregaço a partir de cultura de Bacillus sp - Observar ao microscópio com objetiva de imersão - Desenhar a estrutura visualizada: C) Coloração de esporos - Método de Wirtz - Esfregaço a partir de cultura de Bacillus sp - Observar ao microscópio com objetiva de imersão - Desenhar a estrutura visualizada:

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Nº 3 MEIOS DE CULTURA - CULTIVO BACTERIANO

A) Meios de cultura Para o cultivo e identificação das bactérias usamos soluções e substâncias nutritivas, denominadas Meios de Cultura. Estes meios, quanto às substâncias nutritivas, podem ser: I) Quanto às Substâncias Nutritivas 1) Meios sintéticos: Quando as soluções de substâncias são quimicamente definidas. 2) Meios simples: Quando constituídos somente de substâncias essenciais para o crescimento de algumas bactérias. 3) Meios complexos: Quando se adicionam ao meio simples,substâncias orgânicas complexas. II) Quanto ao Estado Físico 1) Meios líquidos: Também denominados caldos. 2) Meios sólidos: Quando se adiciona ao caldo 1,5 a 2% de ágar. 3) Meios semi-sólidos: Quando se adiciona ágar ao caldo, na concentração igual ou menor que 0,5%. III) Quanto à força seletiva e diferencial 1) Meios enriquecidos: meios básicos adicionados de certas substâncias como sangue, soro, extrato de levedura, etc. Estes meios servem para o cultivo de bacterias que necessitam de substratos complexos. Ex: ágar-sangue, ágar-chocolate, ágar-soro, etc. 2) Meios seletivos: são meios de cultura adicionados com algumas substâncias que impedem o crescimento de certas bactérias e possibilitam o crescimento de outras. Ex: MacConkey, tetrationato, verde brilhante, etc. 3) Meios diferenciais: são aqueles que contém substâncias que, quando utilizadas, indicam certas características bioquímicas das bactérias. Exemplos: A) O sangue quando adicionado ao meio de cultura, indica se uma bactéria é hemolítica ou não. Nesse caso, o meio além de enriquecido é também diferencial. Ex: ágar-sangue. B) A lactose, quando adicionada juntamente com um indicador dará reação no meio de cultura, permitindo distinguir as bactérias que fermentam esse açúcar das que não o fermentam. Ex: MacConkey. 4) Meios de enriquecimento: Quando favorecem o crescimento de determinadas bactérias. Ex: Tetrationato e Selenito permitem maior crescimento do Gênero Salmonella. 5) Além desses, existem outros meios de cultura, como por exemplo meios para conservação de bactérias, meios para a contagem do número de bactérias, etc. B) Condições físicas de cultivo: Além de fornecer os nutrientes necessários, para cultivarmos e identificarmos uma bactéria, outros fatores deverão ser observados, tais como: 1) pH do meio de cultura: deve ser geralmente em torno de 7. 2) Temperatura de crescimento: geralmente a 370C Quando as bactérias crescem em temperaturas baixas (10 a 20ºC), são denominadas de psicrófilas.

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Quando as bactérias crescem em temperaturas médias (20 a 40ºC), são denominadas mesófilas. Quando as bacterias crescem em temperaturas mais altas (50 a 60ºC), são denominadas termófilas. 3) Teor de oxigênio A) Bactérias aeróbias: são aquelas que só crescem na presença de oxigênio. B) Bactérias anaeróbias estritas: crescem somente na ausência de oxigênio. C) Bactérias anaeróbias facultativas: crescem tanto na presença como na ausência de oxigênio. D) Bactérias microaerófilas: crescem somente em baixo teor de oxigênio. EXERCÍCIOS A) Necessidades nutricionais de algumas bactérias: Material necessário -Cultura A; -Cultura B; -Cultura C; -Caldo sintético (sulfato de amônia, cloreto de sódio, glicose, fosfato de potássio e água destilada); -Caldo comum; -Caldo glicosado (caldo comum mais glicose); -Alça de Platina; Técnica 1) Semear cada um dos 3 germes nos diferentes meios de cultura. 2) Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte. 3) Verificar a presença de crescimento (turvação do meio). 4) Registrar os resultados no quadro seguinte: MEIOS BACTÉRIAS

CALDO SINTÉTICO CALDO COMUM CALDO GLICOSADO

A B C B) Relação das bactérias com oxigênio Material necessário -Meio de tiogel; -Cultura A; -Cultura D; -Agulha de platina; Técnica Com a agulha de platina semear cada uma das culturas em um tubo de tiogel. Colocar todos os tubos na estufa. No dia seguinte, examinar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a localização do crescimento. Observar também o tubo de tiogel já semeado com a cultura F. Registrar os resultados.

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Local do Crescimento (Meio de Tiogel)

CULTURAS SUPERFÍCIE DO

MEIO TODA EXTENSÃO DO MEIO

BASE DO MEIO

A D F

Nº 4 CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS

I - Ação dos agentes físicos sobre as bactérias O calor e várias formas de radiação, bem como outros processos físicos, são frequentemente utilizados com a finalidade de destruir bactérias e outros microrganismos. Verificaremos a ação do calor úmido sobre duas bactérias, uma esporulada e outra não esporulada. EXERCÍCIOS A) Ação da temperatura, em função do tempo, sobre culturas bacterianas Material - Cultura A - Cultura E - Placa de Petri contendo ágar nutriente - Banho-Maria a 60º C - Alça de Platina Técnica 1. Divida as placas de ágar nutriente em 4 quadrantes, anotando diferentes períodos de tempo

em cada um: 0’, 5’, 10’ e 15’. 2. Coletar com a alça de platina, um pouco da cultura A e inocular a suspensão no quadrante

correspondente ao tempo 0’. Repetir o procedimento com a cultura E na placa correspondente.

3. Coloque os tubos com a suspensão em banho-maria a 60º C e, aos 5', 10' e 15', retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes das placas de Petri (proceda exatamente como no item 2).

4. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.

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5. Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++, conforme a intensidade de crescimento). Discuta as diferenças de crescimento.

Tempo de aquecimento

0' 5' 10' 15' Cultura A Cultura E

II - Ação dos agentes químicos sobre as bactérias A ação dos agentes químicos sobre as bactérias é muito importante, do ponto de vista prático e todos devem se familiarizar com estas substâncias, suas ações e limitações. Verificaremos a ação do fenol e do álcool iodado sobre algumas bactérias. EXERCÍCIOS C) Ação do fenol a 0,8% de acordo com o tempo. Material - Tubo contendo solução aquosa a 0,8% de fenol (10 ml) - Cultura A em caldo - Placa de Petri contendo ágar nutriente - Alça de platina - Pipeta de 1 ml esterilizada Técnica 1. Adicione, com a pipeta, 1 ml da cultura A aos 10 ml da solução de fenol e misture bem. 2. Imediatamente e após 5', 10' e 15', retire com a alça de platina, amostra da mistura (fenol

mais cultura A) e inocule nos respectivos quadrantes da placa de Petri (0', 5', 10' e 15'). 3. Deixe a placa na estufa, a 37oC, até o dia seguinte. 4. Leia os resultados, anotando a variação quantitativa de crescimento (+ a ++++) em cada um

dos quadrantes da placa, em função do tempo de tratamento da cultura com o fenol.

Tempo de tratamento com o fenol 0’ 5’ 10’ 15’

D) Ação do álcool iodado a 0,1% sobre as bactérias da pele Material - Placa de Petri contendo ágar nutriente - Zaragatoas estéreis - Álcool iodado 0,1% - Solução salina estéril Técnica 1. Divida a placa de ágar nutriente em duas partes.

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2. Umedeça uma zaragatoa em solução salina e esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mãos, numa extensão de aproximadamente 4 cm2. Inocule, a seguir, numa das metades da placa de ágar nutriente.

3. Umedeça uma outra zaragatoa com álcool iodado e esfregue-a no dorso da outra mão, em área semelhante.

4. Espere 5 minutos para que haja ação do antisséptico e secagem da superfície. Passe então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida com salina, tomando cuidado para não atingir a área não tratada. Inocule a outra metade da placa de ágar.

5. Deixe a placa na estufa, a 37o C, até o dia seguinte. 6. Leia os resultados, anotando a variação quantitativa de crescimento (+ a ++++), em função

da presença do álcool iodado.

Tratamento Sem álcool iodado Com álcool iodado

Nº 5 TRANSFERÊNCIA DE RESISTÊNCIA A DROGAS

A resistência, de muitos germes, às drogas antimicrobianas depende, geralmente, da presença de partículas de DNA no citoplasma da célula. Estas partículas podem ser transferidas de célula para célula, algumas por conjugação e outras por transdução. Este fenômeno será demonstrado "in vitro". EXERCÍCIOS Material necessário -Placa de MacConkey sem antibiótico; -Placa de MacConkey com antibiótico Canamicina (K20), na concentração de 20 µg/ml; -Cultura em caldo da bactéria A (não fermentadora da lactose) (Salmonella sp); -Cultura em caldo da bacteria B (fermentadora da lactose) (E.coli K12); -Tubo de ensaio contendo mistura das culturas A e B (0,1 ml da cultura A e 0,1 ml da cultura B foram transferidas para 5,0 ml de caldo nutriente e, em seguida, esta mistura foi colocada na estufa, 37ºC por 18 horas); -Alça de platina; Técnica 1. Semear com a alça de platina a cultura A numa das metades de uma placa de MacConkey contendo Canamicina. Fazer o mesmo com a cultura B na outra metade. Incubar a 37ºC até o dia seguinte. 2. Semear, a cultura A numa das metades da placa de MacConkey sem Canamicina. Fazer o mesmo com a cultura B na outra metade.Incubar a 37ºC até o dia seguinte. 3. Após 24 horas de inoculação examinar as placas e verificar o crescimento das culturas A e B. 4. Registrar os resultados no quadro abaixo, identificando as culturas resistentes e sensíveis. 5. Tomar uma alçada da mistura das culturas A e B e semear na superfície da placa de MacConkey contendo Canamicina. 6.Examinar as placas no dia seguinte e anotar os resultados no quadro abaixo: RESULTADOS

PRESENÇA DE CRESCIMENTO CULTURA MC COM CANAMICINA MC SEM CANAMICINA

A (Salmonella sp) B ( E. coli K 12) Bactéria resistente = presença de crescimento.

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Bactéria sensível = ausência de crescimento.

Nº 6 DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS

Após o isolamento de uma bactéria de um processo infeccioso, é desejável em alguns

casos, conhecer a sua sensibilidade ou resistência a vários antibióticos e quimioterápicos. Isto se consegue com o emprego de vários métodos, sendo que o método do disco de papel de filtro impregnado com solução da droga (Método de Bauer e Kirby) é o mais amplamente utilizado. EXERCÍCIO Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby Material - Culturas bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos contendo

drogas distintas - Régua - Tabela de referência 1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento. 2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no quadro abaixo.

Droga Concentração (ug/ml)

Diâmetro do halo de inibição do crescimento

Interpretação*

1 2 3 4 5 * S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário

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BACTERIOLOGIA ESPECIAL

Nº 1 GÊNERO Staphylococcus

EXERCÍCIOS A) Examinar placas de Ágar-sangue semeadas com S.aureus e S.epidermidis. Descrever as características das colônias e verificar hemólise. CULTURAS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS HEMÓLISE S. aureus S. epidermidis B) Observar, pelo método de Gram, esfregaços das culturas de S.aureus e S.epidermidis. Examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Desenhar o observado. S.aureus S.epidermidis C) Prova de Catalase Colocar sobre a cultura de S.aureus (em caldo) algumas gotas de água oxigenada. Repartir a experiência com a cultura de S.epidermidis. Leitura positiva = desprendimento de bolhas Anotar o resultado no quadro abaixo: CULTURA RESULTADO S.aureus S. epidermidis D) Prova da Coagulase Misturar 0,5 ml da cultura de S.aureus em 0,25 ml de plasma citratado a 1%, de coelho. Incubar a 37ºC e observar durante quatro horas. Repetir a experiência com a cultura de S.epidermidis. Leitura positiva = coagulação do plasma Anotar o resultado no quadro abaixo. CULTURA RESULTADO S.aureus S. epidermidis

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Nº 2

GÊNERO Streptococcus EXERCÍCIOS A) Examinar placas de Ágar-sangue semeadas com Streptococcus Beta Hemolítico, Streptococcus Grupo viridans e Streptococcus pneumoniae. Descrever as características das colônias e verificar hemólise.

CULTURAS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS HEMÓLISE Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae

Streptococcus pneumoniae B) Observar pelo método de Gram, esfregaços das culturas de Streptococcus agalactiae e Streptococcus pneumoniae. Examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Desenhar o observado. Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae C) Prova da Catalase Colocar sobre a cultura de Streptococcus agalactiae e Streptococcus pneumoniae (em caldo) algumas gotas de água oxigenada. Anotar o resultado no quadro abaixo: CULTURAS RESULTADOS Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae

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D) Prova da Bile-Solubilidade Adicionar 0,1 ml de uma solução a 10% de desoxicolato de sódio a 1,0 ml da cultura de Streptococcus do grupo viridans. Incubar a 37ºC e examinar após 15 minutos. Repetir a experiência com a cultura de S.pneumoniae. Leitura positiva = a suspensão torna-se clara Anotar o resultado no quadro abaixo: CULTURAS RESULTADOS Streptococcus pneumoniae

Nº 3

GÊNERO Neisseria EXERCÍCIOS A) Examinar placa de Ágar-Sangue semeada com Neisseria spp. Descrever as características das colônias e verificar hemólise.

CULTURAS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS HEMÓLISE Neisseria B) Observar pelo método de Gram, esfregaços da cultura de Neisseria spp. Examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Desenhar o observado. Neisseria spp.

Nº 4 GÊNERO Pseudomonas

EXERCÍCIOS A) Examinar placa de Ágar-Sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa.

Descrever as características das colônias e verificar hemólise. CULTURAS CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS HEMÓLISE Pseudomonas aeruginosa

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B) Observar pelo método de Gram, esfregaços de cultura de Pseudomonas aeruginosa. Examinar ao microscópio com objetiva de imersão.Desenhar o observado. P. aeruginosa C) Examinar meio de ágar simples semeado com P. aeruginosa e observar a presença de pigmento.

Nº 5 ENTEROBACTÉRIAS

MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA O ENRIQUECIMENTO E ISOLAMENTO DAS

ENTEROBACTÉRIAS I) Meio de Enriquecimento Meio de Tetrationato: Impediente para coliformes, permitindo o crescimento praticamente irrestrito de Salmonella. II) Meios Utilizados no Isolamento de Enterobactérias Esses meios de cultura foram idealizados para o isolamento de enterobactérias patogênicas das fezes e visam sempre os mesmos objetivos: eliminar a flora indesejável e facilitar a diferenciação dos não patogênicos, são portanto, meios seletivos e diferenciais. Os meios mais usados são MacConkey, SS, Verde Brilhante. 1) Ágar MacConkey: Impediente para bactérias Gram-positivas, permitindo o crescimento das Enterobactérias. Aquelas que fermentam a lactose crescem em colônias vermelhas e aquelas que não a fermentam, em colônias claras (indicador: vermelho neutro). 2) Ágar SS: (Shigella-Salmonella): Impediente para bactérias Gram positivas, permitindo o crescimento de Shigella e Salmonella. As bactérias fermentadoras de lactose crescem em colônias vermelhas e as não fermentadoras em colônias incolores (indicador: vermelho neutro). 3) Ágar Hektoen: Impediente para bactérias Gram positivas, enterobactérias da microbiota intestinal normal, possibilitando o crescimento de Shigella e Salmonella (exceto Salmonella typhi, que cresce com menor intensidade). As bactérias fermentadoras de lactose formam colônias de cor amarela ou alaranjada enquanto que as não fermentadoras apresentam

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colônias incolores. EXERCÍCIOS A) Examinar e interpretar placas de MC, SS e HE, semeadas com E.coli e Salmonella sp

MEIOS CULTURAS

MC SS Hektoen

Escherichia coli Salmonella spp. B) Observar, pelo método de Gram, esfregaços das culturas de E.coli e Salmonella sp. Examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Desenhar o observado. E.coli Salmonella spp. C) Examinar meio de Tríplice Açúcar com ferro(TSI) semeado com E.coli e Salmonella spp. Anotar os resultados no quadro abaixo:

Tríplice Açúcar E.coli Salmonella spp. Base do Meio

Superfície do Meio H2S Gás

D) Identificação bioquímica A partir do TSI, inocular as culturas E. coli e Salmonella sp em séries bioquímicas (meios de EPM, MILi e citrato de Simmons) . Incubar a 37o C, 24 horas. Fazer a leitura e anotar os resultados no quadro abaixo:

Provas Bioquímicas E.coli Salmonella sp Indol

Vermelho de Metila Voges-Proskauer

Citrato de Simmons Uréia

Fenilalanina Movimento

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Glicose Lactose

E) Realizar aglutinação em lâmina com a cultura de E.coli, semeada em ágar inclinado, utizando o soro anti-E.coli 0 55. Repetir a experiência com a cultura de Salmonella sp utilizando o soro anti-Salmonella. Anotar os resultados no quadro abaixo: CULTURA ANTI-E.coli O55 ANTI-Salmonella E. coli Salmonella

Perfil Bioquímico e Motilidade de Algumas Espécies de Enterobactérias Prova

E. coli

Shigella sonnei

Edwardsiella tarda

Salmonella sp Citrobacter freundii

Klebsiella pneumoniae

Enterobacter cloacae

Serratia marcescens

Proteus mirabilis

Proteus vulgaris

Morganella morganii

Providencia rettigeri

Citrato - - - + ou - + + + + + ou - + ou - - + Glicose + + + + + + + + + + + + Gás + - + + + + + + ou - + + ou - + ou - + ou - Urease - - - - + ou - + + ou - + ou - + ou - + + + H2S - - + + + - - - + + - - Fenilalanina - - - - - - - - + + + + Motilidade + ou - - + + + - + + + + + ou - + Lisina + ou - - + + - + - + - - - - Indol + - + - - - - - - + + + Lactose + - - - + ou - + + ou - - - - - -