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PRODUÇÃO DE BIODIESEL UTILIZANDO LIPASES FÚNGICAS COMO
CATALISADOR DAS REAÇÕES
Autores:
DAIANE BORGES SAMPAIO1, MARIA LUIZA FERNANDES RODRIGUES 2, CARLOS
EDUARDO DELAY 3.
1- Acadêmica do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade
Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR);
2- Dra. em Química Orgânica, Profa. Co-Orientadora e Adjunto da Faculdade de Ciências
Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brasil.
3- Dr. em Química Orgânica, Prof. Orientador e Adjunto da Faculdade de Ciências Biológicas
e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, Paraná, Brasil.
Endereço eletrônico para correspondência: Maria Luiza Fernandes Rodrigues,
Endereço: Rua Alferes Poli, 271, apto 1505. Bairro Centro, Curitiba, PR.
CEP 80230-090. Telefone: 41 9914-55-43
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RESUMO:
O biodiesel é um combustível obtido de fontes renováveis vegetais como o óleo de mamona,
soja, canola, girassol, amendoim, dentre outros e animais como o sebo suíno, bovino e de
aves. Utiliza-se também o óleo de cozinha usado em frituras. Sua principal vantagem é ser
uma fonte renovável de energia, assim sendo de grande importância pelas razões de o petróleo
ser uma fonte de energia finita, ter alto custo de extração e também por ser grande poluente. O
biodiesel provém da reação de transesterificação que é a etapa da conversão do óleo em
ésteres metílicos ou etílicos de ácidos graxos que constituem o biodiesel e a separação da
glicerina do óleo vegetal. Cerca de 20% de uma molécula de óleo vegetal é formada por
glicerina. A glicerina torna o óleo mais denso e viscoso. Durante o processo de
transesterificação, a glicerina é removida do óleo vegetal, deixando o óleo mais fino e
reduzindo a viscosidade. Essa reação ocorre a partir da reação de um álcool, etanol ou
metanol, com o óleo e a presença de um catalisador (enzimas) para haver formação de ésteres
de biodiesel e a glicerina como subproduto. O objetivo deste trabalho foi testar a eficiência
das lipases produzidas pelo fungo endofítico Penicillium sp., isolados das folha de erva-mate
(Ilex paraguariensis St. Hill) e a eficiência do óleo de mamona na produção do biodiesel. Foi
utilizada a técnica de fermentação no estado sólido (FES) para a produção da lipase. A síntese
do biodiesel foi realizada em Shaker a 37 0C e 300 rpm, adicionando-se o solvente (hexano), o
óleo de mamona e etanol. As alíquotas foram coletadas de 0 a 120 h, para análise em
Cromatografia de Camada Delgada, com visualização em câmara de UV (254 nm) e revelação
em Iodo sublimado. A formação de ésteres de biodiesel foi observada após 24 h de reação.
Palavras-chave: Biodiesel, Transesterificação e Óleo de Mamona.
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ABSTRACT :
Biodiesel is a fuel obtained from renewable sources such as vegetable oil, castor bean,
soybean, canola, sunflower, peanut, among other animals such as tallow and pork, veal
and poultry. It is also used cooking oil used in frying. Its main advantage is to be a renewable
source of energy, thus being of great importance for the reasons oil is a finite
energy source, have a high cost of extraction and also be large pollutant. Biodisel comes from
the transesterification reaction is the step of converting the oil in methyl or ethyl esters of
fatty acids, and the separation of glycerin from vegetable oil. About 20% of a vegetable oil
molecule is made up of glycerin. The glycerin makes the oil more dense and viscous. During
the process of transesterification, the glycerin is removed from the vegetable oil,
leaving a thinner oil and reducing viscosity. This reaction occurs from the reaction of an
alcohol, ethanol or methanol, with the oil and the presence of a catalyst (enzyme) to be
formation of esters of biodiesel and glycerin as a byproduct. The objective of this study was
to test the efficiency of lipases produced by the endophytic fungus Penicillium sp., isolated
from the leaves of yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hill) and the efficiency of castor oil in
biodiesel production. We used the technique of solid-state fermentation (SSF) for the
production of lipase. The synthesis of biodiesel was held in Shaker at 300 rpm and 37 0C by
adding the solvent (hexane), castor oil and ethanol. Aliquots were collected from 0 to
120 h for analysis of thin layer chromatography with UV viewing chamber (254 nm) and
sublimed iodine revelation. The formation of esters of biodiesel was observed after 24 h of
reaction.
Keywords: Biodiesel, Transesterification, Castor Oil.
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1. INTRODUÇÃO
O biodiesel é um combustível renovável, biodegradável e ambientalmente correto,
sucedâneo ao óleo diesel mineral, constituído de uma mistura de ésteres metílicos ou etílicos
de ácidos graxos obtidos da reação de transesterificação de qualquer triglicerídeo com um
álcool de cadeia curta (SANTOS et al., 2004).
O uso indiscriminado de combustíveis fósseis ocasionou a escassez, por serem obtidos
de fontes não-renováveis e determinou sérios riscos ao planeta com números alarmantes no
que diz respeito aos gases tóxicos lançados na atmosfera. Os problemas ambientais e a
preocupação com o desenvolvimento de fontes limpas destacaram o biodiesel como uma fonte
de combustível não poluente. Este combustível foi utilizado primeiramente pelo Dr. Rudolf
Diesel em 1900, que utilizou o óleo de amendoim como combustível em sua invenção na
época, o motor diesel (SUAREZ e MENEGHETTI, 2007).
No processo de produção do biodiesel, obtemos a glicerina de subproduto que é de
extrema importância ao setor industrial para produção de sabonetes, sabões e medicamentos,
viabilizando os processos industriais e diminuindo os custos da matéria-prima pela produção
de biocombustíveis e geração da glicerina em larga escala. Obtemos glicerina livre e total,
sendo a primeira relacionada ao processo de purificação, enquanto que a total produz
informações sobre o processo de transesterificação (GONÇALVES FILHO e MICKE, 2006).
A síntese de biocombustíveis pode ser catalisada por enzimas como as lipases. Esta
classe de enzimas pode catalisar reações de esterificação e transesterificação em meio
orgânico com alta seletividade e especificidade, o que torna a rota catalítica de síntese de
ésteres do biodiesel uma alternativa bastante atraente em termos econômicos e tecnológicos
(FERNANDES et al., 2007).
O teor de óleo nas sementes de mamona situa-se entre 35% e 55%. Toda a produção
da mamona é industrializada, obtendo-se o óleo como produto principal e a torta de mamona
como subproduto, a torta de mamona tem grande capacidade de restauração de terras
esgotadas (COSTA et al., 2004).
O principal ácido graxo da mamona é o ácido ricinoléico (12-hidroxi-9-octadecenóico)
formado pela adição de uma hidroxila (OH) ao 12º carbono do ácido oléico. A quantidade
total de ácidos graxos insaturados, incluindo o ricinoléico, é de 97% ou mais (FREIRE, 2006).
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O objetivo deste trabalho é a produção de biodiesel a partir do óleo de mamona,
utilizando lipases fúngicas produzidas por fermentação no estado sólido como catalisador da
reação química.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido na Universidade Tuiuti do Paraná, na Faculdade
de Ciências Biológicas e da Saúde – Campus Barigui. Este trabalho foi baseado em trabalhos
anteriores realizados pelos alunos Renata Amorim e Douglas Henrique Portelli Vendruscolo
em 2010/02.
2.1. MICRORGANISMOS
O micro organismo utilizado neste trabalho foi o fungo endofítico isolado das folhas
de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hill) caracterizado por microcultivo como Penicillium
sp., que foi gentilmente cedido pelas Professoras Pesquisadoras Msc. Roseli Mello e Dra.
Maria Luiza F. Rodrigues, do laboratório de Microbiologia da Universidade Tuiuti do Paraná.
2.2. ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS E EQUIPAMENTOS
Para garantir condições estéreis de crescimento dos micro organismos, os meios
sólidos de propagação, do inóculo e de produção, bem como todos os materiais utilizados
foram esterilizados em autoclave a 121 ºC, durante 15 minutos.
2.3. ESTOQUE E MANUTENÇÃO DAS CEPAS
As cepas foram inoculadas em meio BDA e incubadas por 7 dias a 28 ºC, fazendo-se
repiques mensais, sendo após o crescimento mantidas sob refrigeração (4 ºC).
2.4. FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO
2.4.1. Preparação dos Substratos
Nestes estudos foram utilizados como substratos as sementes de girassol (Helianthus
annuus), que possuem alto valor lipídico.
Estes substratos foram utilizados na FES para a produção de lipases, os quais foram
previamente secos a 55-60 ºC em estufa por 24 horas. Depois de secos foram moídos,
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tamisados e embalados em sacos plásticos, sendo utilizada as frações dos substratos com
granulometria de 1 mm (dimensões da tamisa) de diâmetro para os estudos de FES.
Todos os experimentos de produção da enzima foram realizados pelos alunos de
graduação do 4º período do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia.
2.4.2. Condições de Cultivo no Meio Sólido
Os experimentos foram realizados nas condições otimizadas previamente pela aluna de
graduação do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia do ano 2010/02 Renata
Amorim.
Os ensaios de FES foram realizados conforme metodologia descrita por Fernandes
(2006). Após crescimento do fungo em ágar BDA por 7 dias, as esporos foram suspensas em
solução de tween 80 (0,001% v/v) e submetidas a agitação, até a obtenção de uma solução
homogênea. A concentração de esporos foi determinada por contagem em câmara de
Neubauer.
A fermentação foi conduzida em frascos erlenmeyers de 125 mL, com 10g de
substrato sólido e umidade a 60% mantida por tampão fosfato 0,1 M pH 7,0. Neste meio foi
inoculado assepticamente a solução de esporos na concentração de 107 esporos/gSS. Os
Erlenmeyers foram incubabos em Shaker a 30 ºC e retirados após 72 horas de fermentação
(FERNANDES, 2006).
A produção de lipase foi acompanhada pela dosagem da atividade lipolítica (método
titulométrico) no material fermentado. A atividade lipolítica foi expressa como unidades de
atividade enzimática por grama de sólido fermentado (U/gSS).
2.4.3. Secagem do Sólido Fermentado
Os sólidos fermentados foram congelados a 0 ºC por 24 horas para interromper o
crescimento fúngico. Após, os sólidos foram secos em estufa a 30 ºC por 48 horas e
acondicionados em sacos plásticos, os quais foram armazenados em temperatura ambiente.
2.5. BIOCATÁLISE: ESTUDO DE REAÇÃO DE SÍNTESE DE ÉSTERES DE BIODIESEL
Os estudos de síntese foram realizados utilizando-se o sólido fermentado (adição
direta).
A biocatálise realizou-se com o material fermentado contendo a enzima lipase. A
fermentação em estado sólido (FES) foi realizada a 30 ºC, contendo 10 g de farelo de semente
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de girassol (FSG), contendo 60% de umidade. No pico máximo de produção da enzima (72
horas), o cultivo foi interrompido e o material fermentado foi seco em estufa a 30 ºC.
Os estudos cinéticos foram realizados para a verificação de síntese dos ésteres de
biodiesel.
Ensaios foram realizados adicionando-se quantidade fixa do material fermentado (3g)
e seco em 30 mL de n-hexano, com razão molar (álcool:óleo) 6:1 e 100 U de atividade.
2.5.1. Óleo de Mamona
O óleo de mamona (Ricinus communis L.) foi o substrato escolhido para os
experimentos. O óleo utilizado neste trabalho foi obtido na Farmanilquima (Curitiba-PR).
2.5.2. Adição Direta do Material Fermentado
Estudos cinéticos foram realizados para a verificação de síntese de ésteres de
biodiesel, utilizando-se o material fermentado seco.
Os substratos utilizados foram o óleo de mamona e o álcool etílico.
As reações foram realizadas em shaker nas seguintes condições: 30 ºC, 180 rpm, em n-
hexano como solvente e tempo de reação 120 h.
O monitoramento da reação foi acompanhado durante 120 h, sendo retiradas alíquotas
do meio racional nos intervalos de tempo zero até 120 h, a cada 24h. A transesterificação do
óleo de mamona para síntese de ésteres foi avaliada qualitativamente por Cromatografia em
Camada Delgada (CCD).
2.6. MÉTODOS ANALÍTICOS
2.6.1. Ensaio Enzimático
Método Titulométrico
Os ensaios de atividade frente à triacilgliceróis foram realizados utilizando-se o óleo
de oliva como substrato. A dosagem da atividade enzimática foi determinada pelo método
titulométrico descrito por Franken (2007), com adaptações. Para as dosagens foi preparada
uma emulsão contendo óleo de oliva (7,15 % m/v) emulsificada em goma arábica (10 % m/v)
em tampão fosfato pH 7,0.
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O ensaio foi realizado em erlenmeyers de 125 mL, adicionando-se 20 mL da emulsão
e 1g do sólido fermentado, obtido conforme o item 2.4.2. As amostras foram incubadas em
shaker, sob agitação, por 15 minutos a 30 ºC. A reação foi paralisada adicionando-se 15 mL
de solução de etanol/acetona (1:1 v/v). Os ácidos graxos liberados foram titulados em solução
de NaOH (0,05 N) até pH 10.
Os brancos reacionais foram preparados adicionando-se a solução etanol/acetona (1:1
v/v) ao meio reacional contendo 1g do material sólido fermentado para desnaturar a enzima.
Uma unidade de atividade lipolítica foi definida como a quantidade de enzima que
libera 1 mM de ácido graxo por minuto nas condições descritas acima, sendo o resultado
expresso em unidades por grama de substrato sólido (U/gSS).
2.6.2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cada alíquota foi retirada do meio reacional nas reações de síntese de ésteres do
biodiesel, nos intervalos de zero até 120 horas e aplicada em uma cromatoplaca contendo
fluoresceína (Merck), com auxílio de um tubo capilar. Após, a cromatoplaca foi transferida
para uma cuba de vidro hermeticamente fechada contendo hexano, éter etílico e ácido acético
na proporção 7:3:0,1 (v/v/v) respectivamente, como fase móvel. A cromatoplaca foi retirada
da cuba de vidro e evaporadas a temperatura ambiente para posterior visualização das
manchas.
A placa foi primeiramente visualizada em câmara UV a 254 nm. Em seguida, foi
revelada com iodo sublimado (I2). As manchas apareceram gradativamente em decorrência da
interação do iodo com os componentes da amostra (mancha marrom).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste trabalho foi utilizada a técnica de FES a 30 ºC, com 10 g de farelo de semente
de girassol contendo 60% de umidade. No pico máximo de produção da enzima (72 h), o
cultivo foi interrompido e o material foi seco em estufa a 30 ºC por 48 h.
Todos os experimentos de produção da enzima foram realizados pelos alunos de
graduação do 4º período do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia.
Os experimentos foram realizados nas condições otimizadas previamente pela aluna de
graduação de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia em 2010/02 Renata Amorim.
As lipases são enzimas que atuam na quebra de lipídeos e óleos, liberando ácidos
graxos, monoacilgliceróis, digliceróis e glicerol (MENONCIN, 2009). Do ponto de vista
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industrial, as lipases fúngicas são muito valorizadas, pois as enzimas produzidas por fungos
são geralmente extracelulares, o que facilita sua retirada do meio fermentado por filtração
(CARVALHO et al. apud VULFSON, 2005).
Na transesterificação de óleos vegetais, um triacilglicerídeo reage com um álcool na
presença de uma base ou ácido forte, produzindo uma mistura de ésteres de ácidos graxos e
glicerol. O processo geral é uma seqüência de três reações consecutivas, na qual mono e
diacilglicerídeos são formados como intermediários. Para uma transesterificação
estequiometricamente completa, uma proporção molar 3:1 de álcool por triacilglicerídeo é
necessária. Entretanto, devido ao caráter reversível da reação, o agente transesterificante
(álcool) geralmente é adicionado em excesso contribuindo, assim, para aumentar o
rendimento do éster, bem como permitir a sua separação do glicerol formado (GERIS et al.,
2007).
Durante o processo foram coletadas alíquotas nos tempos de zero a 120 h. As reações
de síntese foram acompanhadas por CCD conforme descrito em 2.6.2.
Verificou-se que a lipase catalisou as reações de síntese do éster do biodiesel, a partir
de 24 h de reação, conforme pode ser visualizado na Figura 01.
Os ésteres do biodiesel, sendo pouco polares, interagem mais com a fase móvel e
pouco com a fase estacionária (sílica). As manchas correspondentes aos ésteres podem ser
visualizadas no topo da cromatoplaca.
4. CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos pela cromatografia de camada delgada, conclui-se
qualitativamente que a transesterificação do óleo de mamona catalisada pela enzima do fungo
endofítico Penicillium sp. foi eficaz, havendo formação de ésteres de biodiesel a partir de 24h
de reação.
No entanto, sugere-se continuidade dos experimentos com intuito de quantificar os
ésteres de biodiesel. Poderão ser feitos experimentos com Cromatografia Preparativa para
isolar os ésteres e em seguida quantificá-los por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) ou por Cromatografia Gasosa (CG).
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12
Figuras:
Figura 01: Manchas reveladas em Iodo sublimado (I2) referentes aos experimentos 2.6.2, 6:1
(100 U), após 24 h de reação. As machas superiores indicam a formação de ésteres devido à
afinidade com os solventes apolares (fase móvel).
13
Figura 02: Manchas reveladas em Câmara de UV após 24h de reação, antes de ser revelada
em Iodo sublimado.
