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II Simpósio de Ciências Biológicas
Universidade Católica de PernambucoRecife - Pernambuco
23 a 27 de agosto de 2010
14 - PRODUÇÃO DE ASTAXANTINA EM RESÍDUO INDUSTRIAL POR Mucorcircinelloides
Mayara Nunes Vitor Anjos1, 5; Priscilla Andrade de Moura1, 5; Aline Alves Barbosa da Silveira2, 5; Jaceline Maria de Negreiros Lima 3, 5;
Rita de Cássia Freire Soares da Silva 3, 5; Kaoru Okada4, 5.
1Graduanda em Licenciatura Plena em Ciências Biológicas UNICAP, bolsista PIBICCNPq/UNICAP; 2Doutoranda da Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO/UNICAP;3Mestranda em Desenvolvimento de Processos Ambientais – UNICAP; 4Professora docurso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas UNICAP; 5Núcleo de Pesquisas emCiências Ambientais (NPCIAMB).
RRESUMO
Os resíduos industriais podem apresentar elevados problemas de disposição final e são
considerados potenciais poluentes. A utilização destes resíduos como substratos
alternativos de baixo custo, permite a redução dos custos de produção e minimiza
problemas ambientais. Os carotenóides são pigmentos naturais que podem ser
sintetizados por microrganismos fotossintetizantes e não fotossintetizantes. A astaxantina é
um dos principais carotenóides amplamente utilizado na indústria e na aquicultura e que
pode ser extraída de fontes naturais ou sintetizada quimicamente. Com a recente
substituição dos pigmentos sintéticos pelos pigmentos naturais houve um crescente
interesse dos carotenóides obtidos por processos biotecnológicos. Neste trabalho, foi
estudada a produção de astaxantina por Mucor circinelloides utilizando resíduo
agroindustrial manipueira, com concentrações distintas (4%, 7% e 10%) sob diferentes
estresses de luminosidade. Após o processo fermentativo, a astaxantina foi extraída em
solução de Hexano/metanol e analisada por espectroscopia UV-visível. O maior rendimento
da produção de astaxantina (72,5 µg/g) deu-se na concentração de 4% sob a influência de
146
da produção de astaxantina (72,5 µg/g) deu se na concentração de 4% sob a influência de
luz azul. A utilização da manipueira como meio de cultura favorece a produção de
astaxantina.PALAVRAS-CHAVE: Resíduos industriais; substrato alternativo; carotenóides.
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, conceitos de minimização, recuperação, aproveitamento de subprodutos e
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
bioconversão de resíduos são cada vez mais difundidos e necessários para as cadeias
agroindustriais. Uma alternativa de agregar valor a esses resíduos seria a bioconversão
utilizando microrganismos, principalmente os fungos (VILLAS-BOAS, S.G; ESPOSITO, E,
2001).
A manipueira constitui o mais importante líquido do processamento da mandioca. É rica emA manipueira constitui o mais importante líquido do processamento da mandioca. É rica em
potássio, fósforo, nitrogênio e açúcar, contudo essa quantidade de nutrientes pode variar
dependendo das condições de cultivo. A produção anual de raízes de mandioca no Brasil é
ao redor de 2,3 x107 tonelada. Deste total, cerca de 80% é processado nas farinheiras e
feculiarias, gerando um volume de manipueira extremamente elevado (JUNIOR, 2001).
O termo carotenóides refere se a ma classe de pigmentos nat rais de coloração amarelaO termo carotenóides refere-se a uma classe de pigmentos naturais, de coloração amarela
a vermelha, os quais estão amplamente distribuídos nos reinos animal e vegetal sendo
reportados e caracterizados mais de 600 variantes estruturais desta família de pigmentos,
encontrados em fontes naturais (UENOJO et al., 2007). Industrialmente os carotenóides
tais como β-caroteno e astaxantina são utilizados como corantes naturais para alimentos
ou adicionados em ração para aqüicultura (AKSU; EREN, 2007).
A astaxantina (3, 3’ - diidroxi-β, β-caroteno-4, 4’ diona) é um carotenóide com alto valor
para o mercado farmacêutico e indústrias alimentícias (GUERIN et al., 2003). Pode ser
produzida comercialmente por síntese química, fermentação ou isolada em pequenas
quantidades providas de fontes naturais (LEE; SCHMIDT-DANNERT, 2002). Nos últimos
anos houve um aumento no interesse na produção de astaxantina, principalmente por via
biotecnológica, através de microrganismos como algumas microalgas e fungos. A
acumulação de astaxantina pelos microrganismos pode ser induzida sob condições de
estresse, como deficiência de nutrientes, alta intensidade de luz, suplementação com luz
azul e a adição de suplementos oxidativos no meio (LABABPOUR et al., 2004).
147
azul e a adição de suplementos oxidativos no meio (LABABPOUR et al., 2004).
Os carotenóides são metabólitos secundários acumulados durante o crescimento micelial
em culturas típicas de Mucor circinelloides De acordo com Papp et al (2006) o Mucor
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
em culturas típicas de Mucor circinelloides. De acordo com Papp et al., (2006) o Mucor
circinelloides apresenta características morfológicas importantes aplicadas a estudos sobre
a produção de carotenóides.
Neste trabalho, foi utilizado o resíduo agroindustrial manipueira, como meio de cultura para
a produção da astaxantina por Mucor circinelloides sob diferentes fontes de luminosidade.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Microrganismo
A produção de astaxantina foi investigada a partir da linhagem de Mucor circinelloides,
(IFM 45507), Research Center for Pathogenic Fungi – Chiba University, Japão, depositada
no Banco de culturas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais (NPCIAMB),
Universidade Católica de Pernambuco.
2.2 Condições de cultivo e de produção
O inóculo utilizado para o crescimento em meio líquido foi obtido a partir de culturas
crescidas em placas de Petri contendo meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA), após 5 dias de
incubação a 28 ºC. A contagem de esporos foi realizada em Câmara de Neubauer,
padronizando o inóculo em 107 esporos/ml. Para a preparação do pré-inóculo, 5mL da
suspensão de esporos foi inoculada em frascos de Erlenmeyer de 250 ml, contendo 100 ml
do meio utilizado para a produção de astaxantina Os frascos foram incubados a 25ºCdo meio utilizado para a produção de astaxantina. Os frascos foram incubados a 25 C
durante 24 horas, sob agitação orbital de 150 rpm. Foi adicionado 1 mL do pré-inóculo (1%,
v/v) em frascos de Erlenmeyer de 250mL, contendo 100mL do meio de manipueira (4%,
7% e 10%). O pH foi fixado em 6,5 e os cultivos incubados em shaker orbital a 120 rpm, a
25ºC, por 96 horas com influência da luz azul, luz branca e sem luz. Ao termino do
f t ti lt f filt d l d á d til d li fili d
148
processo fermentativo as culturas foram filtradas, lavadas com água destilada e liofilizadas.
2.3 Extração da astaxantina
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
A extração do carotenóide foi realizada com hexano/metanol (1:1, v/v). A amostra,
contendo a astaxantina, foi separada através de centrifugação a 2000 rpm durante 10
minutos. A fração final foi analisada por espectrometria (UV-visível), 470 nm.
2.4 Construção do planejamento fatorial
Com o objetivo de estudar a influência de várias condições de cultivo na produção de
astaxantina, foi utilizado um planejamento fatorial 32 com três repetições no ponto central
como o primeiro passo em busca das melhores condições experimentais. Este
planejamento visa avaliar a influência dos principais fatores, bem como suas interações.
Os dois fatores estudados e seus respectivos níveis foram: 1) Concentração do meio: 4%Os dois fatores estudados e seus respectivos níveis foram: 1) Concentração do meio: 4%,
7% e 10%; 2) Cor da luz: SL (sem luz), B (branca) e A (azul). Foram realizadas análises
estatísticas utilizando-se o Software Statistica 7.0 da Stat Soft®.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Produção de astaxantina por meio de manipueira (4%, 7% e 10%).
Para análises da melhor condição de produção de astaxantina foi necessária a construção
de um planejamento fatorial 32 para identificar os fatores ou variáveis independentes que
possam apresentar resultados significativos na produção de astaxantina. A Tabela 1
descreve todas as combinações utilizadas nesse planejamento. A Tabela 2 demonstra os
resultados experimentais de astaxantina a partir de culturas de Mucor circinelloides sob as
diferentes fontes de luminosidade.
149
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
150
O teor máximo de astaxantina (72,5 µg/g) foi obtido na condição 3 em meio de manipueira
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
a 4% sob a influência de luz azul, aumentando em aproximadamente 16% a produção,
quando comparada com as culturas crescidas na condição 2 em ausência de luz (34,7
µg/g). A partir dos resultados sob a influência de luz branca verificou-se que a
concentração máxima de astaxantina (39,1 µg/g) é atingida na condição 1 com o meio de
manipueira também a 4%.
Esses resultados demonstram que a luz azul e branca interfere diretamente na síntese de
astaxantina, corroborando com Lababpour et al., (2004) e Tatsch (2008), que afirmam que
a luz pode ser utilizada como fator de influência na produção de astaxantina.
Os experimentos apontam que o Mucor circinelloides apresenta potencial para a produção
de astaxantina utilizando manipueira como substratode astaxantina utilizando manipueira como substrato.
3.2 Influência das variáveis na produção de astaxantina
Com os resultados expressos na Tabela 2 e utilizando o programa Statistica, obteve-se os
valores dos efeitos de cada parâmetro (Meio de cultura; Concentração do Meio; Cor da luz)
b di t d t ti P t t f i á i d t i i â tsobre o rendimento de astaxantina. Para tanto foi necessário determinar quais parâmetros
realmente apresentam influência estatística significativa e isso pode ser observado por
meio do Diagrama de Pareto (Figura 1).
151
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
O Diagrama de Pareto demonstra que os termos de concentração do meio e cor da luz
(linear e quadrático) são estatisticamente relevantes para a produção de astaxantina
utilizando o meio de manipueira.
Figura 1. Diagrama de Pareto da variável astaxantina produzida por Mucor circinelloides
4. CONCLUSÃO
No cultivo do Mucor circinelloides em meio de manipueira sob diferentes condições, o
aumento na produção de astaxantina foi observado tanto na presença de luz azul como na
luz branca. O meio alternativo manipueira a 4% apresentou maior potencial biotecnológico
para a produção de astaxantina.
5. REFERÊNCIAS
AKSU, Z; EREN, A. T. Production of carotenoids by isolated yeast of Rhodotorula glutinis.Biochemical Engineering Journal. v. 35, p. 107-113, 2007.
152
GUERIN, M; HUNTLEY, M.E; OLAIZOLA, M. Haematococcus astaxanthin: application forhuman health and nutrition. Trends Biotechnology. v. 21, p. 210-216, 2003.
JUNIOR, A.F. Tratamentos físicos e biológicos da manipueira. In: CEREDA, M.P. (Coord).Manejo, uso e tratamento de subprodutos da industrialização da mandioca. SãoPaulo: fundação Cargill, v.4, cap.10, p.138-150 2001.
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
LEE, P. C; SCHMIDT-DANNERT, C. Metabolic engineering towards biotechnologicalproduction of carotenoids in microorganisms. Applied Microbiology Biotechnology. v. 60,n.1- 2, p.1-11, 2002.
PAPP, T; VELAYOS, A; BARTÓK, T; ESLAVA, A.P; VÁGVOLGVI, C; ITURRIAGA, E.A.Heterologous expression of astaxanthin biosynthesis genes in Mucor circinelloides.Applied Microbiology and Biotechnology. v. 69, p.526-531, 2006.
PFANDER, H. Carotenoids: an overview. Methods in Enzymology, v. 213, p. 3-13, 1992.
TATSCH, P.O. Produção de carotenóides em meio sintético por Sporidiobolussalmonicolor CBS2636 em biorreator. 2008. 94f. Dissertação (mestrado) – UniversidadeRegional Integrada do Alto Uruguai e das Missões. Curso de mestrado em Engenharia deAlimentos, 2008.
UENOJO, M; MARÓSTICA JUNIOR, M. R; PASTORE, G. M. Carotenóides: propriedades,aplicações e biotransformação para formação de compostos de aroma Q ímica No aaplicações e biotransformação para formação de compostos de aroma. Química Nova, v.30, n. 3, p. 616-622, 2007.
VILLAS-BOAS, S. G; ESPOSITO, E. Bioconversão do bagaço de maçã. Biotecnologia-Ciência & Desenvolvimento. v.14, p. 38-42, 2001.
153
15 - INFLUÊNCIA DE DIFERENTES MÉTODOS DE RECUPERAÇÃO DE PASTAGEMNA COMUNIDADE DE BACTÉRIAS DO SOLO
Tatianne Leite Nascimento1; Patrícia Vieira Tiago1; Jorge Luiz Schirmer de Mattos1; Phelipe Manoel Oller Costa1.
1Universidade do Estado de Mato Grosso e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT).
RESUMO
A recuperação de áreas degradadas depende, dentre outros fatores, de uma microbiota
ativa, já que estes são componentes chaves na manutenção de um agroecossistema em
equilíbrio. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência de diferentes métodos de
recuperação de pastagem degradada na dinâmica da comunidade de bactérias. O
delineamento experimental foi o de blocos ao acaso em esquema de parcelas subdivididas
no tempo, com três repetições. Os métodos avaliados foram: Testemunha; Orgânico;
Convencional; Leguminosa; Consorciação; Controle Biológico; Recuperação. A densidade,
diversidade e uniformidade bacteriana foram verificadas pelo método de diluição seriada a
partir de amostras de solo coletadas alternando período chuvoso e seco. A implantação do
experimento causou decréscimos na densidade de bactérias, no entanto a comunidade de
bactérias não foi sensível à aplicação dos métodos de recuperação e renovação dep ç p ç ç
pastagens. A diversidade bacteriana de morfoespécies foi baixa, principalmente, devido às
mudanças nos habitats causadas pelos métodos aplicados, no entanto, a uniformidade foi
alta.
Palavras-chave: Morfoespécie bacteriana; pastagem degradada; Brachiaria humidicola.
154
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
1. INTRODUÇÃO
A insistência em se explorar as pastagens de forma extrativista, faz com que a
degradação das mesmas seja um dos maiores problemas da pecuária no Brasil
(MARTHA-JÚNIOR; CORSI, 2001).
Na aplicação de diferentes tipos de manejos ou métodos de recuperação de áreas
degradadas se espera uma modificação qualitativa e quantitativa na constituição do solo,
que podem significar diferentes disponibilidades de substrato que em última instância vão
determinar, favorecendo ou inibindo, o estabelecimento dos diferentes grupos microbianos
(CARDOSO, 1992). Como os microrganismos respondem rapidamente às alterações
impostas ao ambiente, o monitoramento de mudanças microbiológicas e a correlação
dessas com as práticas de manejo das culturas tem grande potencial para o
estabelecimento de indicadores da qualidade do solo (NIELSEN; WINDING, 2002).q ( ; , )
Embora as propriedades químicas e físicas do solo e seus efeitos no crescimento das
plantas sejam intensamente investigados, apenas recentemente tem sido dada atenção
aos aspectos envolvendo a atividade microbiana. O objetivo deste estudo foi avaliar a
influência da implantação de diferentes métodos de recuperação de pastagem degradada
na densidade e diversidade da comunidade de bactérias do solona densidade e diversidade da comunidade de bactérias do solo.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em uma área de recuperação de pastagem degradada de
Brachiaria humidicola na Fazenda Capitão Verdi em Tangará da Serra - Mato Grosso. O
delineamento experimental foi de blocos ao acaso em esquema de parcelas (parcela =
método) subdivididas no tempo (subparcela = época), com três repetições. Os métodos
de recuperação e renovação de pastagem utilizados foram: Testemunha: Pastagem
degradada de Brachiaria humidicola; Orgânico (renovação): Gradagem + Calcário
calcítico + Fosfato natural + Sulfato de potássio + Adubo orgânico (cama de frango) +
155
10kg/ha de semente de Brachiaria brizantha cv. Marandu; Convencional (renovação):
Gradagem + Calcário calcítico + Superfosfato simples + Cloreto de potássio + Sulfato de
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
Amônio + 10kg/ha de semente de B. brizantha cv. Marandu + Uréia; Leguminosa
(recuperação): Rebaixamento rente ao solo do pasto de B. humidicola através de roçada
+ 4,5kg/ha de semente de Estilosantes Campo Grande; Consorciação (renovação):
Gradagem + Calcário calcítico + 7,0 kg/ha de semente de B. brizantha cv. Marandu + 3,0
kg/ha de semente de Estilosantes Campo Grande; Controle biológico (renovação):
Gradagem + Calcário calcítico + 10kg/ha de B. brizantha cv. Marandu + Metarhizium
anisopliae (IPA-133D); Recuperação: Gradagem de pastagem de B. humidicola + Calcário
calcítico + Fosfato natural + Sulfato de potássio + Cama de frango + Adubação verde (10t
MV/ha de Milheto).
A coleta das amostras de solo foi realizada alternando período chuvoso e seco. As épocas
de determinação da densidade de bactérias compreenderam os meses de fevereiro (10
dias antes da implantação do experimento) e abril de 2005, janeiro e setembro de 2006 ep ç p ) , j
fevereiro de 2007; para a determinação dos índices ecológicos, janeiro e setembro de
2006 e fevereiro de 2007. Para cada época de estudo foram coletadas 21 amostras
compostas de solo a uma profundidade de 0-20cm. As amostras foram armazenadas sob
refrigeração a 4°C até o momento da análise (MACHADO, 2003) que foi realizada no
laboratório de Microbiologia da Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT)laboratório de Microbiologia da Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT),
Campus Universitário de Tangará da Serra.
A densidade bacteriana foi obtida por contagem direta em placa através do método de
diluições seriadas (TORTORA et al., 2005). Posteriormente foi realizado o plaqueamento
em triplicata no meio de cultura Ágar Nutriente (AN), com incubação a 30ºC por três dias.
Os resultados foram expressos em Unidades Formadoras de Colônia por grama de solo
(UFC/g solo), seguindo as normas para interpretação e contagem padrão em placa
(SOARES; MAIA, 1999). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade, através do software ASSISTAT
(SILVA, 2007).
156
Os índices de diversidade de Shannon-Wiener e uniformidade de Pielou (e) foram
calculados através do software DivEs – Diversidade de espécies (RODRIGUES, 2005).
III Simpósio Nordestino de Ciências BiológicasPara aplicar os índices, as bactérias foram agrupadas em morfoespécies de acordo com
suas características morfológicas (SILVA et al., 2001).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve interação entre os métodos de recuperação de pastagem e a época de
avaliação para as populações de bactérias (Tabela 1). Não ocorreu interferência
significativa das épocas de chuva e seca no entanto verificou-se uma tendência dassignificativa das épocas de chuva e seca, no entanto verificou-se uma tendência das
populações de bactérias diminuírem a partir de abril/2005 (Tabela 1). Provavelmente a
ocorrência de alterações químicas e físicas do solo, associadas a mudanças da rizosfera,
podem ter gerado modificações no habitat microbiano influenciando a densidade de
bactérias (CARDOSO, 1992).
Foram categorizadas um total de 24 morfoespécies de bactérias. Verificou-se que a
diversidade bacteriana aumentou em todos os métodos, exceto para consórcio, entre
janeiro/2006 (chuva) e setembro/2006 (seca) (Tabela 2). Em janeiro/2006, foi verificada
entre os métodos uma considerável variação nos índices de diversidade (0 4105 a
157
entre os métodos uma considerável variação nos índices de diversidade (0,4105 a
0,8322) e uniformidade (0,3581 a 0,7261) das morfoespécies de bactérias quando
comparados as demais épocas estudadas (Tabela 2). A diversidade encontrada foi baixa,
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
segundo Smit et al. (2001), solos provenientes de cultivo agrícola apresentam índices de
diversidade muito baixos geralmente em torno de Shannon-Wiener=1,0.
4.CONCLUSÃO
A densidade de bactérias não foi alterada após à aplicação dos métodos de recuperaçãoA densidade de bactérias não foi alterada após à aplicação dos métodos de recuperação
e renovação de pastagens nas épocas estudadas. A diversidade microbiana de
morfoespécies foi baixa.
5. REFERÊNCIASCARDOSO, E.J.B.N. Ecologia microbiana do solo. In: CARDOSO, E.J.B.N.; TSAI, S.M.;NEVES, M.C.P. Microbiologia do solo. Campinas: Sociedade Brasileira de Ciência doSolo, 1992. p. 33-40.
MACHADO, P. L. O. A. Coleta de amostras de solo. 2003. Disponível em: <http://www.cnps.embrapa.br/search/pesqs/dica01.htm>. Acesso em: 11 out. 2006.
MARTHA-JÚNIOR, G.B.; CORSI, M. Pastagens no Brasil: Situação Atual e Perspectivas.Preços Agrícolas, Piracicaba, v. 171, p. 3-6, jan/fev de 2001.
158
NIELSEN, M.N.; WINDING, A. Microorganisms as indicators of soil health. Denmark,National Environmental Research Institute, 2002. 84p. (Technical Report, 388).
III Simpósio Nordestino de Ciências Biológicas
RODRIGUES, W.C. DivEs - Diversidade de espécies. Versão 2.0. Software e Guia doUsuário, 2005. Disponível em: <http://www.ebras.bio.br>. Acesso em: 10 maio 2007.p p
SILVA, F. de A.S. SAEG. ASSISTAT - Assistência Estatística, versão 7.4 beta. UAEA-CTRN-UFCG Campina Grande-PB, 2007. Disponível em:<http://assistat.sites.uol.com.br>. Acesso em: 20 abr. 2007.
SILVA, R.; SCHWAN, R.F.; DIAS, E.S. Aulas práticas de microbiologia geral. Lavras:UFLA, 2001. 52 p.
SMIT E., LEEFLANG P., GOMMANS S., VAN DEN BROEK J., VAN MIL S., WERNARS K., , , , ,Diversity and seasonal fluctuations of the dominant members of the acterial soilcommunity in a wheat field as determined by cultivation and molecular methods. Appliedand Environmental Microbiology, v.67, n 5, p. 2284-2291, 2001
SOARES, J.B.; MAIA, A.C.F. Água: microbiologia e tratamento. Fortaleza: EUFC, 1999.
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 8. ed. Porto Alegre: Artmed,2005. 894 p.
159
16 - PRODUÇÃO DE LIGNINA PEROXIDASE POR Penicillium sp
SANTANA, E.C.1; MONTE, K.R.1; DE PAULA, M.V2.;MACIEL,C.C.S.3, GUSMÃO, N.B.3.; CAMPOS-TAKAKI, G.M.3,4
1Pós-graduação em Microbiologia, FAFIRE-PE, 2Pós-graduação em saúde ambiental, 3 4FAFIRE-PE, 3Pós-graduação em Biologia de Fungos, UFPE- PE, 4Núcleo de Pesquisa e
Ciências Ambientais, UNICAP- PE
RESUMO
A produção de enzimas visando aplicação na remediação de ambientes impactados
constitui uma alternativa dentro dos processos de biorremediação existentes O presenteconstitui uma alternativa dentro dos processos de biorremediação existentes. O presente
trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lignina peroxidase por Penicillium sp.
utilizando óleo diesel como substrato. Foi realizado um planejamento fatorial completo, 32
variando o potencial Hidrogeniônico e a temperatura para cada fungo, no período de 48, 72
e 96 horas. Após este período de cultivo os índices de pH variaram de 5.0 a 7.24 em todas
as condições. Os maiores valores de biomassa observados foram: 8.534 g/L, pH= 8,0, a
30ºC após 96 horas de incubação. O maior valor produzido de lignina peroxidase foi de 680
U/L, na condição de pH= 4,0, a 35ºC, após 48 horas de incubação. Diante do que foi
exposto é possível inferir que o fungo em questão foi capaz de produzir lignina peroxidase
tendo como substrato exclusivamente o óleo diesel, sendo candidato a estudos
subseqüentes visando aplicação em processos de biorremediação.
Palavras-chave: Biorremediação, Lignina peroxidase, Penicillium sp.
1. INTRODUÇÃO
O petróleo é um recurso natural não renovável, responsável por 40% de toda energia
160
p p p g
mundial, o aumento da exploração de petróleo e seus derivados, implica no maior risco de
vazamentos acidentais, gerando graves danos ao meio ambiente1,2,3. A indústria de refino
do petróleo destaca-se pelo potencial de afetar o ambiente em todos os níveis. Elas
consomem grandes quantidades de água e de energia, produzem despejos líquidos,
liberam diversos gases nocivos para a atmosfera e produzem resíduos sólidos de difícil
tratamento e disposição4.
Com o aumento das taxas de poluição pelos derivados do petróleo é imprescindível oCom o aumento das taxas de poluição pelos derivados do petróleo, é imprescindível o
desenvolvimento de tratamentos adequados e eficientes para recuperação de ambientes
poluídos. A biorremediação vem sendo considerada um processo bastante promissor e é
baseada na degradação bioquímica dos contaminantes através da atividade de
microrganismos presentes no ambiente contaminado5,6. Os fungos são considerados bons
bi d d d i i l t d it d b tâ i t ibiodegradadores principalmente por serem decompositores de substâncias naturais, como
celulose e lignina e por terem rápida ramificação no substrato, degradando-o através da
secreção de enzimas extracelulares, que os tornam organismos capazes de sobreviver em
ambientes considerados extremos7.
A biosíntese da lignina é um campo de pesquisa bastante promissor principalmente devido
à sua relevância econômica. A lignina peroxidase é uma glicoproteína hémica que catalisa
uma variedade de compostos fenólicos, não fenólicos, hidratos de carbono aromáticos e
outros compostos mais resistentes ao ataque microbiano. Estas enzimas precisam de
peróxido de hidrogênio como cofator e a reação enzimática ocorre através da oxidação de
elétrons seguida de reações não enzimáticas. Vários parâmetros de cultivo afetam a
produção e a atividade das enzimas lignolíticas por fungos: disponibilidade de oxigênio,
fonte e concentração de carbono e nitrogênio, microelementos, pH e temperatura 8.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lignina peroxidase por
Penicillium sp. utilizando óleo diesel como substrato.
161
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Microrganismos
Para realização deste trabalho, foi utilizado o fungo Penicillium sp. isolado de Mangue
Branco- BA e estocado na Coleção de Culturas do Departamento de Antibióticos, UFPE. As
amostras de óleo diesel foram cedidas pela Petrobras Transporte S A – TRANSPETROamostras de óleo diesel foram cedidas pela Petrobras Transporte S.A. TRANSPETRO.
2.2 Ensaio de produção enzimática
Foi realizado um planejamento fatorial completo 32, totalizando 9 corridas para cada tempo
de cultivo: 48,72 e 96 horas, visando determinação das melhores condições de produção
d i d i i (t b l 01)da enzima por cada microrganismo (tabela 01).
Tabela 1. Condições experimentais obtidas para oplanejamento fatorial 32, obtido através do programaEstatística 6.0.
Foram utilizados 3 discos de crescimento fúngico (0,6mm) transferidos para frascos de
162
Erlenmeyer contendo 49,5 mL de meio mineral de Bushnell Haas9, acrescido de 0,5mL de
óleo diesel. O ensaio foi conduzido de modo estático com duração máxima de 96 horas e
após o período de cultivo, foram avaliados o pH, os índices de biomassa e a dosagem de
lignina peroxidase. Testes estatísticos foram realizados para se determinar quais as
melhores condições de cultivo para a produção da enzima. Após o período de incubação, o
material foi filtrado em bomba à vácuo e a fase líquida foi analisada quanto ao pH, através
de um potenciômetro A partir da fase sólida retida foi determinado o índice de biomassade um potenciômetro. A partir da fase sólida retida, foi determinado o índice de biomassa,
através da determinação do peso seco (g/L) obtido por gravimetria e posterior secagem a
80ºC por 24 horas, sendo transferido em seguida para um dessecador por 24 horas.
2.3 Quantificação de Lignina peroxidase
Os testes foram realizados de acordo com Arora & Gil (2001)10 onde se observou a
oxidação do álcool veratrílico (10mM), H2O2 (2 mM), 1mL de tampão fosfato citrato (125
mM, pH 3,0) e 500µL do extrato enzimático, sendo a oxidação observada em
espectrofotômetro a 310nm.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nos ensaios realizados, foi observado que o valor do pH variou entre 5.0 e 7.24, valores
que oscilam entre levemente ácido e em torno da neutralidade, o que é ideal para ação dos
microrganismos11 (Figura 1). Os fungos filamentosos são mais tolerantes as condições
ácidas, pH entre 6,0 e 8,0 aumenta a velocidade de degradação. A acidez do meio emp g ç
processo de degradação é indicativo de produção de ácidos intermediários, como ácido
oxálico12,13 .
A maior formação de biomassa ocorreu após 96 horas de incubação, observou-se cerca de
8g/L, na condição 7: pH= 8,0, a 30ºC (Figura 1). O resultado pode indicar uma adaptação
da microbiota que estaria utilizando o óleo diesel na formação de biomassa e
163
da microbiota, que estaria utilizando o óleo diesel na formação de biomassa e
biodegradando seus compostos, indicando a possibilidade desses fungos serem usados
em estudos futuros em processos de biorremediação. O microrganismo teve como fonte de
carbono exclusivamente o óleo diesel, isto se deve ao fato de secretar enzimas
extracelulares. A produção de enzimas extracelulares como a lignina peroxidase, faz com
que sejam capazes de crescer em ambientes considerados extremos.14,15.
Ensaio de Bioestímulo - Penicillium sp.
2
4
6
8
10
12
Biom
assa
(g/L
)
2
4
6
8
pH
Biomassa 48hBiomassa 72hBiomassa 96hpH 48hpH 72hpH 96h
No que se refere à produção de lignina peroxidase a maior produção foi de 680U/L ocorreu
0
2
1 2 3 4 5 6 7 8 90
Figura 2. Valores de pH e biomassa obtidos durante o ensaio de Bioestímulo em meiolíquido para Penicillium sp. nas 9 corridas com os períodos de 48, 72 e 96 horas deincubação.
No que se refere à produção de lignina peroxidase, a maior produção foi de 680U/L ocorreu
após 48 horas de incubação na corrida 4, onde o pH foi de 4.0 e a temperatura 35 ºC. Em
estudos anteriores para quantificação de Lignina Peroxidase com o fungo Phanerochaette
chrysosporium, os melhores resultados obtidos por Arora et al., (2002)16 foi de 0.94 U/mL a
0.39 U/mL da enzima. Em ensaios para a quantificação de lignina peroxidase, utilizando
arroz como substrato, obtiveram índices por volta de 900 U/L produzidos por Corilopsis
hyrsina. Os melhores valores de pH para quantificação de Manganês peroxidase e Lignina
peroxidase, variaram entre 4,5 e 6,0.17 O processo de biodegradação pode ser otimizado
em até 59% (+ 3) quando no ensaio de bioestímulo se verifica qual a melhor condição de
degradação.18
164
Tabela 2. Valores obtidos para a produção de ligninaperoxidase, por Curvularia lunata e Penicillium sp. nascondições ensaiadas nos tempos de 48, 72 e 96 horas.Anova de Kruskal-Wallis/Student-Newman-Keuls, sendoa = p<0.05 e b = p<0.01 e * = melhor (es) valor(es)obtido(s) no tempo de cultivo.
5. CONCLUSÕES
O fungo Penicillium sp. foi capaz de produzir biomassa tendo como exclusiva fonte de
carbono o óleo diesel e além disso o microrganismo produziu lignina peroxidase a partir
desse substrato xenobiótico. Este microrganismo é candidato a estudos subseqüentes de
biorremediação de diesel e ainda otimização e purificação de lignina peroxidase visando
aplicação industrial
165
aplicação industrial.
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