UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDEDEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICASPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

DAIANE PEREIRA CAMACHO

A ADERÊNCIA DE LEVEDURAS EM ANEL VAGINAL

CONTRACEPTIVO NuvaRing® ESTARIA RELACIONADA COM

CANDIDÍASE VULVOVAGINAL?

MARINGÁ2007

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Resumo

Avaliar a aderência in vitro de diferentes leveduras, isoladas de exsudato

vaginal de pacientes com candidíase vulvovaginal (CVV), em anel vaginal

contraceptivo NuvaRing®. Foram utilizados quatro isolados de Candida sp e um

isolado de Saccharomyces cerevisiae. Foram realizados ensaios de aderência por

UFC/ml e radiomarcada, microscopia eletrônica de varredura (MEV) do anel e

determinada a hidrofobicidade de superfície celular (HSC) das leveduras. Todas as

leveduras foram capazes de aderir ao anel vaginal, apresentando diferenças entre si

quanto à capacidade de aderência em UFC/ml, o que não ocorreu no ensaio

radiomarcado. A HSC foi compatível com a aderência por UFC/ml. A MEV

comprovou a adesão, que mostrou-se diferente entre C. albicans e C. tropicalis. A

aderência das leveduras testadas ao NuvaRing® poderia facilitar o desenvolvimento

de CVV e CVVR nas pacientes susceptíveis usuárias deste método contraceptivo.

Palavras chaves: NuvaRing, aderência, Candida sp, candidíase vulvovaginal

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

1- Considerações gerais

O gênero Candida é constituído de aproximadamente 200 diferentes espécies

de leveduras, que vivem normalmente nos mais diversos nichos corporais, como

orofaringe, cavidade bucal, dobras da pele, secreções brônquicas, vagina, urina e

fezes. Dentre as espécies que compõem este gênero, Candida albicans apresenta

maior relevância em função de sua taxa de prevalência em condições de

normalidade e de doença (ODDS et al., 1988; KURTZMAN e FEEL, 1998).

As leveduras do gênero Candida, e em particular C. albicans, são patógenos

oportunistas freqüentemente isolados das superfícies mucosas de indivíduos

normais (MORAGUES et al., 2003), estando muito bem adaptada ao corpo humano,

sendo por isto capaz de colonizá-lo sem produzir sinais de doença em condições de

normalidade fisiológica (GHANNOUM e RADWAN, 1990). Coloniza as mucosas de

todos os seres humanos no decorrer ou pouco depois do nascimento, havendo

sempre o risco de infecção endógena (BROOKS et al., 2000). O delicado balanço

entre o hospedeiro e este fungo comensal pode transformar-se em uma relação

parasitária, resultando no desenvolvimento de infecções denominadas candidíases

(CHAFFIN et al., 1998). Estas infecções fúngicas variam desde lesões superficiais

em pessoas sadias até infecções disseminadas em pacientes neutropênicos

(COTRAN et al., 2000). Um aumento na incidência de infecções fúngicas causadas

por espécies de Candida tem sido observado em pacientes imunocomprometidos

(FIDEL et al., 1996).

C. albicans é um fungo com capacidade de dimorfismo, ou seja, pode ser

encontrado sob formas leveduriformes (blastoconídios) no estado saprofítico,

diagnóstico da CVV é cada vez mais freqüente na prática diária da ginecologia e

sua incidência tem aumentado drasticamente, tornando-se a segunda infecção

genital mais freqüente nos Estados Unidos e no Brasil, precedida apenas pela

vaginose bacteriana, representando 20 a 25% dos corrimentos vaginais de natureza

infecciosa (CORSELLO et al., 2003). Estima-se que cerca de 75% das mulheres

adultas apresentem pelo menos um episódio dessa vulvovaginite fúngica em sua

vida, sendo que destas, 40 a 50% vivenciarão novos surtos e 5% atingirão o caráter

recorrente CVVR (MARDH et al., 2002). Candida albicans é o principal agente que

responde por 80 a 90% das CVV, e 10 a 20% a outras espécies chamadas C. nãoalbicans

(SOBEL, 1993). C. glabrata é a segunda espécie em freqüência nas CVV,

embora tenham sido referidos os achados de Candida tropicalis, Candida

parapsilosis, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon sp dentre outras

(CONSOLARO et al., 2004; CORSELLO et al., 2003; COTRAN et al., 2000;

PICHOVÁ et al., 2001; SOBEL, 1993).

Esta infecção caracteriza-se por prurido, ardor, dispareunia e pela eliminação

de um corrimento vaginal em grumos, semelhante à nata de leite. Com freqüência,

a vulva e a vagina encontram-se edemaciadas e hiperemiadas, algumas vezes

acompanhadas de ardor ao urinar e sensação de queimadura (SOBEL, 1990). Os

sintomas se intensificam no período pré-menstrual, quando a acidez vaginal

aumenta (SALVATORE, 1980).

A principal fonte de leveduras vaginais é o trato gastrointestinal, através de

um processo chamado transmissão endógena. As mesmas são veiculadas para a

vagina por auto-inoculação, onde se adaptam e se desenvolvem. A transmissão

sexual também é aceita o que a torna uma doença sexualmente transmissível

(DST). Através da ação de enzimas como proteases e hidrolases, as leveduras que

chegam à vagina penetram no seu epitélio superficial, ali permanecendo albergadas,

podendo causar distúrbios imediatos ou constituir-se em reservatório para

reinfecções posteriores (FIDEL et al., 1996).

3- Candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR)

Aproximadamente 5% das mulheres com CVV desenvolvem CVVR, a qual é

definida usualmente como a ocorrência de 4 ou mais episódios de CVV no período

de 12 meses (MARRAZZO, 2003; PATEL et al., 2004). Ao contrário das mulheres

que tem episódios esporádicos de CVV, aquelas com a doença recorrente não se

beneficiam de uma diminuição na freqüência de episódios sintomáticos com o

passar da idade (MARRAZZO, 2003).

A patogênese da CVVR entre mulheres que não tem condições

predisponentes aparentes, que são a grande maioria, está sob investigação. Uma

elevação na resistência de espécies de Candida não tem sido observada na

maioria dos casos, embora, se analisarmos estas pacientes como um grupo,

mulheres com recorrência tem uma prevalência discretamente mais elevada de C.

glabrata, a qual é menos sensível às drogas imidazólicas, comumente utilizadas no

tratamento de CVV e CVVR (SOBEL et al., 2001).

4- Fatores predisponentes do hospedeiro

A expressão da relação parasita/hospedeiro depende do balanço entre a

virulência do microrganismo e as defesas do hospedeiro. Tanto fatores locais como

sistêmicos podem contribuir para a invasão tecidual por C. albicans e por leveduras

C. não- albicans. Sua intensa multiplicação no canal vaginal é favorecida por uma

série de fatores predisponentes. Do ponto de vista do hospedeiro, a colonização

prévia por levedura e posterior diminuição da capacidade de resposta imunológica

observada em doenças imunossupressoras, gestantes e usuárias crônicas de

corticóides, parecem favorecer a infecção. Ainda parecem contribuir o uso de

antibióticos, estrogenioterapia, pequenos traumas como o ato sexual, hábito de

usar roupas muito justas ou de fibras sintéticas, além da dieta alimentar muito

ácida (FERNANDES e MACHADO, 1996; NARDIN et al., 2000). A utilização de

antibióticos pode incrementar tanto a colonização quanto à infecção por Candida.

Embora diferentes estudos não tenham sido conclusivos neste sentido, antibióticos

podem suprimir a flora vaginal lactobacilar, que é o principal mecanismo defensivo

vaginal frente aos fungos (ZIARRUSTA, 2002).

Na prática, a infecção vaginal por C. albicans geralmente é associada com

situações de debilidade do hospedeiro ou quando o teor de glicogênio do meio

vaginal está elevado e a conseqüente queda do pH local propicia o desenvolvimento

da infecção. Qualquer alteração dos níveis de glicose, especialmente em situações

de hiperglicemia, e qualquer estado em que se produz uma elevação do glicogênio

vaginal, pode desencadear CVV (GOSWAMI et al., 2006). O excesso de glicogênio

aumenta o substrato nutritivo dos fungos, promovendo um incremento na sua

capacidade de adesão (LACAZ, 1980; PEREIRA et al., 1996). Altos níveis de

produção de hormônios femininos, especialmente a progesterona, aumentam a

disponibilidade de glicogênio no ambiente vaginal, o qual serve como excelente

fonte de carbono para o crescimento e germinação das leveduras (SOBEL, 1990).

Raramente isola-se Candida na pré-menarca, fato este que associado a baixa

prevalência CVV na menopausa enfatizam a dependência hormonal da infecção

(FERRER, 2000). Como muitas mulheres são portadoras assintomáticas de Candida

em pequenas quantidades, neste estado a levedura é considerada como comensal e

as alterações no ambiente vaginal do hospedeiro são necessárias para que a

mesma induza aos seus efeitos patológicos e a paciente desenvolva CVV (SOBEL,

1993).

Fatores predisponentes do hospedeiro já bem conhecidos, incluindo Diabetes

mellitus, imunossupressão, gravidez e terapias hormonais, apenas explicam

parcialmente a CVVR. O uso de antibiótico de amplo espectro, uso de contraceptivo

oral, dispositivo intra-uterino, higiene pessoal e práticas sexuais têm sido estudados

como fatores de risco para recorrência (PATEL et al., 2004). Acredita-se que a

CVVR esteja relacionada com uma depressão nos processos imunes da mucosa

normal, o que permitiria uma certa "tolerância" da mucosa ao microrganismo, pelo

fato de ser encontrada alta incidência de CVVR em mulheres com imunidade celular

prejudicada (FIDEL et al.,1996).

5- Fatores de virulência de leveduras

A patogenicidade ou virulência de um microrganismo é definida como a sua

capacidade de determinar doença, sendo esta mediada por múltiplos fatores. Apesar

de certos aspectos da virulência serem determinados geneticamente, estes são

expressos pelos microrganismos apenas quando existem condições ambientais

favoráveis, tais como teor nutricional, atmosfera de oxigênio e temperatura. Estas

condições são específicas para cada microrganismo e para cada isolado de

determinado agente. Podem variar de hospedeiro para hospedeiro e mesmo entre

os diferentes tecidos de um mesmo hospedeiro (GHANNOUM e RADWAN, 1990).

A virulência das espécies patogênicas de Candida spp depende dos vários

fatores, tais como adesão a substratos inertes e biológicos, formação de tubo

germinativo com conseqüente desenvolvimento da forma filamentosa, variabilidade

genotípica, produção de toxinas e enzimas extracelulares hidrolíticas, variabilidade

antigênica, imunomodulação dos mecanismos de defesa do hospedeiro e

hidrofobicidade da superfície celular (CALDERONE e FONZI, 2001).

Os fatores de virulência de leveduras relacionados com esta dissertação são

descritos a seguir:

5.1- Aderência

A aderência das leveduras à mucosa vaginal é reconhecida como um passo

essencial na colonização microbiana e um evento chave na iniciação do processo

patogênico, uma vez que, a colonização prévia é aceita como fator predisponente ao

processo infeccioso (KAMAI et al., 2002). Alguns microrganismos não invasivos

permanecem aderidos à superfície hospedeira, enquanto outros utilizam essa

adesão como a primeira etapa para a invasão tecidual (FINLAY e FALKOW, 1989).

A aderência é considerada um importante fator de virulência de Candida spp,

sendo o primeiro estágio para a colonização dessas leveduras em diversas regiões

do hospedeiro, com subseqüente disseminação quando ocorre um desequilíbrio nas

defesas do hospedeiro (HAZEN et al., 2001). Vários mecanismos de aderência de

Candida spp têm sido propostos, incluindo atração eletrostática, interação

hidrofóbica e envolvimento de adesinas específicas (JABRA-RIZKI et al., 2001). A

adesão de patógenos à superfície de células eucarióticas é mediada por

macromoléculas denominadas adesinas, as quais são estruturas da superfície do

microrganismo que interagem com receptores específicos nas células eucarióticas

(FINLAY e FALKOW, 1989; PIRES et al., 2001). As fibronectinas têm sido

caracterizadas como receptores em células de mamíferos para a ligação de certos

microrganismos. Foi descrita sua presença na superfície das células epiteliais

vaginais e a interação de Candida spp com a mesma, sobretudo em certas fases do

ciclo menstrual (KLOTZ et al., 1985).

Devido a importância e significância da aderência, alguns estudos in vivo e in

vitro tem sido desenvolvidos para quantificar e caracterizar a aderência de C.

albicans a superfícies celulares e inanimadas (JABRA-RIZKI et al., 2001; SHIN et al.,

2002). A ligação de C. albicans à superfícies mucosas têm sido demostrada como

um importante passo no processo infeccioso, particularmente na cavidade oral e

mucosa vaginal (JABRA-RIZKI et al., 2001).

5.2- Biofilme

Estuda-se também a aderência de um microrganismo avaliando a sua

capacidade de formar biofilmes, que constituem um outro tipo de aderência, na qual

os microrganismos formam agregados unicelulares, gerando estruturas

multicelulares que aderem a superfícies. Sua formação ocorre em resposta a uma

variedade de condições, incluindo alta densidade celular, privação de nutrientes e

estresse físico ambiental (O´TOOLE et al., 2000).

Atualmente, biofilmes são conhecidos como comunidades microbianas

organizadas que ficam aderidas a superfícies (DOUGLAS, 2003; WATNICK e

KOLTER, 2000). Essas comunidades quase sempre são constituídas por vários

gêneros e espécies, envoltos em suas matrizes extracelulares, que por sua vez são

formadas por componentes do hospedeiro e produtos bacterianos secretados

(WATNICK e KOLTER, 2000). Estudos recentes sugerem que nos biofilmes ocorre

uma complicada “conversa” dos microrganismos entre si e com as células do

hospedeiro, através da liberação de moléculas sinalizadoras conhecidas como

“quorum-sensing”, as quais são essenciais para sua formação e manutenção

(HOGAN et al., 2004; RAMAGE et al., 2002).

Em CVV, a avaliação da capacidade de formação de biofime é importante

devido à possibilidade de sua ocorrência em dispositivos intra-uterinos e em anel

vaginal contraceptivo. Porém, apresenta-se também importante nas CVV e CVVR

não relacionadas a este contraceptivo vaginal, isto porque algumas células fúngicas

na mucosa vaginal podem existir como uma mistura de espécies formando biofimes,

inclusive com bactérias da flora vaginal. Estas leveduras têm maior resistência a

terapia antifúngica convencional e isto pode ser responsável pela não erradicação

da C. albicans do lúmen vaginal, explicando, pelo menos em parte, a ocorrência de

CVVR (DOUGLAS, 2003).

Além de fatores inerentes ao hospedeiro, tem sido postulado que existem

diferenças na patogenicidade de isolados de Candida sp. Em estudos in vitro tem se

observado que isolados de C. não-albicans produzem mais biofimes e de maior

consistência, quando comparados a isolados de C. albicans. Em estudo in vitro de

aderência e formação de biofilme em superfície cateter, observou-se que isolados de

C. parapsilosis e C. tropicalis foram mais biofilme quando comparado a C. albicans

(CAMACHO et al., 2007). Outro estudo de SHIN et al. (2002), mostrou que C.

tropicalis e C. parapsilosis produzem quantidades significativas de biofilme quando o

meio contém 8% de glicose. Estes dados confirmam as evidências de que as

infecções fúngicas caudas por C. não-albicans apresentam interesse especial por

duas razões: primeiramente a virulência e a patogenicidade; secundariamente, a

ocorrência da resistência às drogas antifúngicas atualmente disponíveis (DIEKEMA

et al, 2002), sendo importante ressaltar a resistência a antifúngicos de biofilmes

formados por espécies de Candida (CHANDRA et al, 2001).

5.3- Hidrofobicidade de superfície celular (HSC)

Já é conhecido que células leveduriformes hidrofóbicas são mais virulentas

em ratos do que células leveduriformes hidrofílicas. A expressão de HSC por C.

albicans tem sido desta forma correlacionada com virulência aumentada,

provavelmente por estimular fenômenos de aderência, resistência à fagocitose e

germinação (HAZEN et al., 2001). Embora o mais forte mecanismo envolvendo a

aderência está provavelmente relacionada a uma adesina manoproteína de C.

albicans, HSC tem sido descrita por vários investigadores como envolvida na

aderência (JABRA-RIZKI et al., 2001).

Em estudos realizados por LUO e SAMARANAYAKE (2002), foi observado

correlação positiva entre HSC e aderência à superfície acrílica, indicando que C.

glabrata apresenta maior HSC e aderência ao substrato estudado em relação à C.

albicans.

6- Métodos Contraceptivos e relação com CVV

A flora vaginal composta por lactobacilos constituem uma barreira defensiva

importante frente a CVV, sendo que os lactobacilos atuam em três diferentes níveis.

Em primeiro lugar, competem com os fungos pelo nutrientes. Em segundo, realizam

um processo de co-agregação, sendo com isto capazes de competir e bloquear os

receptores epiteliais para os fungos, inibindo desta forma a adesão dos mesmos ao

epitélio vaginal. Este mecanismo de defesa é o mais importante. E em terceiro, são

capazes de produzir substâncias (bacteriocinas) capazes de inibir a germinação de

micélios. Isto pode explicar porque tratamentos com antibióticos podem

desencadear CVV em decorrência da depleção da flora vaginal (ZIARRUSTA, 2002).

As alterações hormonais, principalmente as estrogênicas, parecem influenciar

na incidência de episódios agudos de CVV. Existe uma incidência aumentada desta

infecção entre mulheres grávidas, usuárias de anticoncepcionais orais com alto teor

de estrogênio, e aquelas sob terapia hormonal de reposição após a menopausa. Em

contraste, mulheres no período anterior à menarca e posterior à menopausa

raramente adquirem infecções vaginais fúngicas. Porém, a relação entre hormônios

reprodutivos e imunidade vaginal local permanece ainda desconhecida.

(FERNANDES e MACHADO, 1996).

Os métodos contraceptivos podem também promover a CVVR. As mulheres

que tomam pílulas contraceptivas orais têm uma taxa mais alta de CVVR

(RINGDAHL, 2000; SOBEL et al., 1998), uma vez que células de Candida

apresentam receptores para estrogênio e progesterona que, quando estimulados,

aumentam a proliferação fúngica (REED , 1992; RINGDAHL, 2000).

Com a incidência relativamente elevada de vaginite na população feminina

em geral, é plausível que mulheres usuárias de NuvaRing® também sejam afetadas.

Durante um grande estudo de eficácia e tolerabilidade, 13,7% das mulheres usuárias

do anel contraceptivo informaram a presença de vaginite, embora apenas 5%

acreditassem que a vaginite estava relacionada ao tratamento (ROUMEN et

al.,2001; VERHOEVEN et al., 2004).

JUSTIFICATIVA

Atualmente, observa-se um grande número de mulheres que fazem uso de

métodos contraceptivos. Apesar de todos os benefícios destes métodos, existem

aquelas que apresentam maior predisposição a infecções vaginais. As leveduras

que habitam normalmente a mucosa vaginal podem tornar-se patógenos

oportunistas devido a situações de debilidade da hospedeira, desenvolvendo

infecções denominadas candidíases. O diagnóstico de candidíase vulvovaginal

(CVV) é cada vez mais freqüente na prática diária da ginecologia e sua incidência

tem aumentado drasticamente. Candida albicans é o principal agente das CVV, no

entanto, outras espécies não-albicans podem causar esta infecção.

São vários os fatores identificados como causa do aparecimento de CVV tais

como: gravidez, Diabetes mellitus e o uso de corticóides. Contudo, o uso de

contraceptivo oral contendo estrógeno ou uso de dispositivos intra-uterinos, também

podem constituir risco para o desenvolvimento de candidíase.

Até o presente momento, são escassos os estudos que avaliam a influência

do anel vaginal contraceptivo no desenvolvimento de CVV, sendo uma possibilidade

plausível, uma vez que o anel permanece por três semanas alojado na vagina,

podendo levar a adesão de leveduras sobre sua superfície. Considerando a adesão

um dos principais fatores de virulência de leveduras, podendo predispor a um

processo patogênico no ambiente vaginal, a proposta deste trabalho visa avaliar se

este novo método contraceptivo poderia estar envolvido na manutenção de

leveduras vaginais e conseqüentemente no desenvolvimento de CVV.

OBJETIVOS

Objetivo geral:

O presente estudo teve como objetivo avaliar a aderência in vitro de diferentes

leveduras, isoladas de exsudato vaginal de pacientes com CVV, em anel vaginal

contraceptivo NuvaRing®.

Objetivos específicos:

1. Avaliar a aderência de leveduras C. albicans e não-albicans ao anel vaginal

contraceptivo através da técnica de contagem de colônias em placas, após

período de incubação de 1 hora;

2. Avaliar a aderência de leveduras ao anel vaginal contraceptivo por

incorparação de timidina tritiada;

3. Determinar a hidrofobicidade de superfície celular das leveduras;

4. Avaliar a aderência de leveduras ao anel vaginal contraceptivo através de

visualização em Microscopia Eletrônica de Varredura.

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22-24, 2002.

CAPÍTULO II

Artigo “WOULD THE ADHERENCE OF YEAST TO NuvaRing®

CONTRACEPTIVE VAGINAL RING BE RELATED TO VULVOVAGIN AL

CANDIDIASIS? ” , pág.22-48, submetido para publicação aguardando resultado.

Address correspondence:

Dra. Terezinha Inez Estivalet SvidzinskiUniversidade Estadual de Maringá, Departamento de Análises ClínicasAv. Colombo, 5790; Maringá – PR – Brasil; 87020-900Telefone (+55 44) 3261-4864 / FAX: (+55 44) 3261-4931E-mail: tiesvidzinski@uem.br

CAPÍTULO III

CONCLUSÕES

1. Todas as leveduras testadas aderiram muito bem ao anel vaginal, tanto

através do ensaio de aderência in vitro por UFC/ml, que evidenciou C.

albicans como a menos aderente e C. glabrata e C. tropicalis as mais

aderentes, quando por adesão radiomarcada, cujas leveduras aderiram de

maneira mais uniforme.

2. A adesão foi comprovada também através da MEV, que demonstrou um

padrão de adesão muito diferente entre C. albicans e C. tropicalis, e que

portanto, parece ser característico de cada levedura.

3. A MEV evidenciou também a superfície irregular do NuvaRing®, o que muito

provavelmente auxilia no processo de adesão.

4. Os resultados de HSC do presente estudo variam consideravelmente entre os

diferentes isolados testados, em escala crescente de valores na mesma

ordem que os de UFC/ml, demonstrando que, quanto maior o caráter

hidrofóbico destas leveduras, mais aderentes ao anel.

5. O aumento freqüente de isolados de leveduras C. não-albicans em CVV em

algumas populações, pode ser explicado, ao menos em parte, neste estudo,

demonstrando a correlação entre a grande capacidade de adesão e de HSC

destas leveduras, em particular C. glabrata.

6. Tanto para CVV quanto para CVVR, o anel vaginal poderia contribuir com a

dificuldade de eliminação destas leveduras do canal vaginal pelo tratamento

adotado.

7. Os resultados obtidos apontam fortes evidências de que a aderência das leveduras testadas

ao NuvaRing® poderia facilitar o desenvolvimento de CVV e especialmente de CVVR nas

pacientes susceptíveis usuárias deste novo método contraceptivo.

PERSPECTIVAS FUTURAS

1. Realizar estudos de co-agregação de leveduras com Lactobacillus acidophilus

da flora microbiana vaginal predominante.

2. Avaliar a capacidade de adesão do co-agregado em anel vaginal

contraceptivo e em células epiteliais vaginais, com intuito de verificar

possíveis alterações no processo de adesão.

3. Estudar o processo de adesão de leveduras em dispositivo intra-uterino (DIU).

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