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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS
MILENA FÉLIX
Desenvolvimento de hidroxiapatita contendo prata via
precipitação e imersão: avaliação do efeito antimicrobiano
PIRASSUNUNGA
2015
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MILENA FÉLIX
Desenvolvimento de hidroxiapatita contendo prata via precipitação
e imersão: avaliação do efeito antimicrobiano
PIRASSUNUNGA
2015
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós–
Graduação da Universidade de São Paulo como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciência e
Engenharia de Materiais.
Área de Concentração: Desenvolvimento, caracterização
e aplicação de materiais voltados à agroindústria.
Orientador: Profa. Dra. Eliana Cristina da Silva Rigo
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Milena Félix Desenvolvimento de hidroxiapatita contendo prata via precipitação e imersão: avaliação do efeito antimicrobiano
Aprovado em: _____________________________________________
Banca Examinadora
Prof. Dr. __________________________________________________
Instituição: ____________________Assinatura: __________________
Prof. Dr. __________________________________________________
Instituição: ____________________Assinatura: __________________
Prof. Dr. __________________________________________________
Instituição: ____________________Assinatura: __________________
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de
Pós–Graduação da Universidade de São Paulo como
parte dos requisitos para a obtenção do título de
Mestre em Ciência e Engenharia de Materiais.
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Serviço de Biblioteca e Informação da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos
da Universidade de São Paulo
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – o autor”
Félix, Milena
F316d Desenvolvimento de hidroxiapatia contendo prata via
precipitação e imersão: avaliação do efeito
antimicrobiano / Milena Félix. –- Pirassununga, 2015.
67 f.
Dissertação (Mestrado) -- Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos – Universidade de São Paulo.
Departamento de Ciências Básicas.
Área de Concentração: Engenharia e Ciências de
Materiais.
Orientadora: Profa. Dra. Eliana Cristina da Silva
Rigo.
1. Hidroxiapatita 2. Precipitação 3. Imersão
4. Prata 5. Efeito antimicrobiano. I. Título.
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À minha família, Aos meus pais que me deram a vida e me ensinaram o sentido e
significado do respeito ao próximo, da solidariedade, dignidade, da
humildade, do valor das próprias conquistas e acima de tudo o valor
de uma família. A vocês que se doaram por inteiro para que eu
pudesse realizar os meus sonhos, eu lhes a devo minha eterna
gratidão. Muito obrigado pela educação valiosa, pela presença e
apoio constante em todos os momentos da minha vida, pela
compreensão e amor concedido. Vocês são exemplo de caráter,
honestidade, esforço, trabalho e do amor incondicional! Amo vocês
com toda a força deste sentimento, o amor infinito que sinto por
vocês jamais poderá ser traduzido por palavras.
Ao meu filho Pedro,o qual também me ensinou o significado de
amor incondicional e da doação, dedico este trabalho.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter estado ao meu lado e permitir que eu concluísse mais um objetivo, me dando forças e me sustentando, iluminando meu caminhar, me dando sabedoria através do Espírito Santo. A Ti Senhor toda honra e toda glória.
Ao meu filho Pedro, que foi o maior presente de Deus pra mim, por ser meu companheiro, meu amigo, meu amor. Pedro sinônimo de amor incondicional.
Agradeço meus pais que me ensinaram os valores e princípios da vida, que me apoiaram, ajudaram e me deram toda a força ao longo da minha vida.
Aos meus irmãos e amigos Rodrigo, Ricardo, Renato e Mirela que sempre estiveram junto a mim, sempre me incentivaram, torceram por mim, me apoiaram, eu agradeço de todo coração. Eu amo vocês meus irmãos.
A minha Vó Olga, que já não se encontra em nosso meio, eu agradeço por toda ajuda. Me incentivou muito nos estudos, em minha vida pessoal, sempre esteve ao meu lado em todos os momentos, torcendo e orando por mim.
Agradeço minha orientadora Eliana Rigo por toda ajuda, paciência, compreensão durante este período. Além de ser uma excelente orientadora é uma verdadeira amiga. Tenho certeza que os laços afetivos que nos envolveram ficarão pra sempre. Muito obrigada minha amiga, mãe, orientadora, professora e doutora Lica.
Agradeço minha diretora Juliana Gomes da Costa Hanna que acreditou em mim, permitiu que eu pudesse cursar este mestrado, me incentivou e me incentiva sempre a estudar e a buscar novos conhecimentos. Ju muito obrigada.
Aos meus amigos irmãos em Cristo: Douglas, Jack, Gerson, Vânia, Mayara, anjos que foram enviados por Deus para me ajudarem e me trazerem forças e me apoiarem em um dos momentos mais difíceis da minha vida, muito obrigada.
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“Celebrai com júbilo ao Senhor, todas as terras. Servi ao Senhor com alegria; e entrai diante
dele com canto. Sabei que o Senhor é Deus; foi ele que nos fez, e não nós a nós mesmos;
somos povos seu e ovelhas do seu pasto. Entrai pelas portas dele com gratidão, e em seus
átrios com louvor, louvai-o, e bendizei o seu nome. Porque o Senhor é bom, e eterna a sua
misericórdia; e sua verdade dura de geração em geração”
Salmo 100
Bíblia Sagrada
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RESUMO
SANTOS, M.F. Desenvolvimento de hidroxiapatita contendo prata via precipitação e imersão:
avaliação do efeito antimicrobiano. 2015. 67 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2015.
A utilização de substitutos ósseos para recuperação da função perdida é uma constante busca dentro da área médica. Por isso os biomateriais têm recebido uma atenção muito grande por parte da comunidade científica, dentre eles os materiais a base de fosfato de cálcio. A hidroxiapatita, Ca10 (PO4)6(OH)2, tem sido muito estudada, pois além de representar a constituição da massa dos ossos naturais e dentes em 30 a 70%, possui propriedades de bioatividade e osteocondutividade, favorecendo e auxiliando o crescimento do tecido ósseo.Em contrapartida, infecções bacterianas podem surgir após o implante ocasionando a perda da funcionalidade a curto e médio prazo. Várias alternativas estão sendo testadas, geralmente associadas ao uso de antibióticos convencionais incorporados aos biomateriais. Uma alternativa a tais antibióticos seria a utilização de metais que possuem propriedades antibacterianas. A prata (Ag) é conhecida como um metal bactericida e por isso ganhou lugar de destaque dentre os estudos como um aliado importante no controle das infecções pós-cirúrgicas. Este trabalho teve como objetivo sintetizar, caracterizar e avaliar o efeito antimicrobiano da adição de íons de prata em hidroxiapatita. Foram obtidos pós de hidroxiapatita contendo prata (HAAg), nas concentrações de 0,1M; 0,01M e 0,001M pelo método de precipitação em temperatura ambiente e por imersão do pó de hidroxiapatita em soluções aquosas. As fases cristalinas e os grupamentos iônicos foram analisados para cada condição por técnicas de difração de raios X (DRX) e espectroscopia no infravermelho (IV) respectivamente. As informações sobre a morfologia e identificação de elementos químicos foi realizado pela técnica de microscopia eletrônica de varredura com espectroscopia de energia dispersiva (MEV EDS). As avaliações antimicrobianas foram realizadas por ensaios qualitativos e quantitativos, o ensaio qualitativo utilizou o teste de halo de difusão em disco para Staphylococcus aureus e Escherichia coli e o ensaio quantitativo utilizou contagem de bactérias para as cepas de Staphylococcus aureus. Os resultados de DRX e IV indicaram que independentemente do método de obtenção da HAAg foi possível observar a
presença de prata metálica caracterizada pelos picos em 2=38,1º e 44,3º nas amostras HAAg0,1Im, HAAg0,1Pr e HAAg0,01Pr. Observou-se também a presença
de AgO, correspondente ao pico em 2=37,5º nas amostras de HAAg0,01Pr e HAAg0,001Pr. Nos espectros de IV estão presentes as bandas que caracterizam a fase HA, referentes aos grupamentos PO4
3-, OH- e CO32-. Analisados em conjunto os
ensaios qualitativos e quantitativos, as amostras HAAg0,01Im e HAAg0,001Im sintetizadas por imersão indicaram os melhores resultados para o ensaio de disco difusão, por apresentarem formação de halo inibição do crescimento bacteriano para a bactéria S. aureus. Para os ensaios quantitativos as amostras obtidas por precipitação com concentrações 0,1M e 0,01M de prata apresentaram melhor resultado por inibirem o crescimento bacteriano para as cepas S. aureus.
Palavras-chave: Hidroxiapatita, Precipitação, Imersão, Prata, Efeito antimicrobiano.
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ABSTRACT
SANTOS, M.F. Desenvolvimento de hidroxiapatita contendo prata via precipitação e imersão:
avaliação do efeito antimicrobiano. 2015. 67 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2015.
The use of bone substitutes for recovery of lost function is a constant search within
the medical field. So biomaterials have received a very large attention from the
scientific community, including the materials the basis of calcium phosphate.
Hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2, has been studied as apart from representing the
natural constitution of the mass of bones and teeth in 30 to 70 % , has properties of
bioactivity and osteoconductivity , encouraging and assisting the growth of bone
tissue. In contrast, bacterial infections can arise after implantation causing the loss of
functionality in the short and medium term. Several alternatives are being tested,
usually associated with the use of conventional antibiotics incorporated into
biomaterials. An alternative would be to use antibiotics such metals that possess
antibacterial properties. Silver (Ag) is known as a bactericidal metal and so gained a
prominent place among the studies as an important ally in the control of post-
surgical infections. This study aimed to synthesize, characterize and evaluate the
antimicrobial effect of adding silver ions into hydroxyapatite. Were obtained
hydroxyapatite powders containing silver (Haag) at concentrations 0,1M; 0,01M and
0,001M by the precipitation method at room temperature and by immersion the
hydroxyapatite powder in aqueous solutions of AgNO3. The crystalline phases and
the ionic groups were analyzed for each condition by techniques of X-ray diffraction
(XRD) and infrared spectroscopy (IR) respectively. The information on the
morphology and identification of chemical elements was performed by the technique
of scanning electron microscopy with energy dispersive spectroscopy (SEM EDS).
The antimicrobial evaluations were carried out by qualitative and quantitative assays,
the assay used a qualitative diffusion halo disk test for Staphylococcus aureus,
Escherichia coli and quantitative assay employed bacteria count for Staphylococcus
aureus strains. The results of XRD and IR indicated that regardless of the method of
obtaining Haag was possible to observe the presence of metallic silver characterized
by peaks in 2=38,1º and 44,3º in HAAg0,1Im samples, HAAg0,1Pr and
HAAg0,01Pr. It also observed the presence of AgO, corresponding to the peak in
2=37,5º in samples HAAg0,01Pr and HAAg0,001Pr. In the IR spectra are present
bands that characterize the HA phase, referring to groups PO43-, OH- and CO3
2-.
Taken together qualitative and quantitative assays, and HAAg0,01Im HAAg0,001Im
synthesized by soaking samples showed the best results for the disk diffusion test by
presenting halo formation bacterial growth inhibition for S. aureus. For quantitative
assays, the samples obtained by precipitation with concentrations 0,1M and 0,01M
silver showed better results by inhibiting bacterial growth for Staphylococcus aureus
strains.
Keywords: Hydroxyapatite, Precipitation, Immersion, Silver, Antimicrobial effect.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Rede cristalina da hidroxiapatita.............................................................................14
Figura 2 – Esquema ilustrativo do fenômeno de difração de raios X (Lei de Bragg).............. 33
Figura3 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via imersão
comconcentrações 0,1M; 0,01M e 0,001M de prata.................................................................41
Figura 4 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via precipitação com
concentrações 0,1M; 0,01M e 0,001M de prata....................................................................... 42
Figura 5 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via precipitação e imersão
com concentrações 0,1M de prata.............................................................................................44
Figura 6 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via precipitação e imersão
com concentrações 0,01M de prata...........................................................................................45
Figura 7 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via precipitação e imersão
com concentrações 0,001M de prata.........................................................................................46
Figura 8 – Espectro de infravermelho da HA sintetizada e HAAg obtidas via imersão com
concentrações de 0,1M; 0,01 e 0,001M de prata......................................................................47
Figura 9 – Espectro de infravermelho da HA sintetizada e HAAg obtidas via precipitação com
concentrações de 0,1M; 0,01 e 0,001M de prata......................................................................47
Figura 10 – Espectro de EDS das amostras de HAAg obtidas via precipitação e imersão com
concentrações de 0,1M; 0,01 e 0,001M de AgNO3..................................................................49
Figura 11 – Espectro de EDS da amostras de HAAg obtida via imersão com concentração de
0,1M de AgNO3........................................................................................................................49
Figura 12 – Espectro de EDS da amostras de HAAg obtida via precipitação com
concentração de 0,1M de AgNO3.............................................................................................51
Figura 13 – Imagem da placa de Petri com cepas de Staphylococcus aureus..........................51
Figura 14 – Imagem da placa de Petri com cepas de Escherichia coli.....................................52
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Aplicações clínicas envolvendo as classes dos materiais sintéticos utilizados no
corpo humano............................................................................................................................08
Tabela 2 – Classificação das biocerâmicas..............................................................................11
Tabela 3 – Tipos, fórmulas e relação Ca/P dos fosfatos de cálcio...........................................12
Tabela 4 – Formas de HA empregadas na medicina e odontologia.........................................15
Tabela 5 - Contagens de Staphylococcus aureus após 24 horas de contato com as amostras
dos diferentes tratamentos. Inoculo inicial = 7,2 x 102 UFC (log contagem = 2,86) e 7,2 x 105
UFC (log contagem = 5,86)......................................................................................................53
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 5
2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O TECIDO ÓSSEO ....................................... 5
2.2 BIOMATERIAIS ....................................................................................................... 7
2.2.1 Biocerâmicas ..................................................................................................... 10
2.2.2 Hidroxiapatita ..................................................................................................... 13
2.2.2.1 Fosfatos de Cálcio como Trocadores Iônicos .............................................. 16
2.2.3 Método de obtenção da hidroxiapatita via precipitação química. ........................ 17
2.3 COMPLICAÇÕES DOS MATERIAIS IMPLANTÁVEIS ........................................... 20
2.3.1 Infecções cirúrgicas em próteses articulares ...................................................... 20
2.3.2 Adesão bacteriana aos biomateriais e formação de biofilmes ............................ 22
2.4 PROPRIEDADES GERAIS DA PRATA .................................................................. 23
2.5 HIDROXIAPATITA CONTENDO PRATA ............................................................... 25
3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 30
3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 30
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 30
4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 31
4.1 PRECIPITAÇÃO DA HIDROXIAPATITA ................................................................ 31
4.2 PRECIPITAÇÃO DA HIDROXIAPATITA COM PRATA .......................................... 31
4.3 IMERSÃO DO PÓ DE HIDROXIAPATITA EM SOLUÇÃO AQUOSA DE NITRATO
DE PRATA ....................................................................................................................... 32
4.4 CARACTERIZAÇÃO .............................................................................................. 32
4.4.1 Difração de raios X (DRX) .................................................................................. 32
4.4.2 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (IV) ................. 34
4.4.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)com Espectroscopia de Raios X por
Energia Dispersiva (EDS) ............................................................................................. 35
4.5 AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA .................................. 37
4.5.1 Teste de disco difusão em ágar ......................................................................... 38
4.5.2 Contagem bacteriana total ................................................................................. 39
4.5.2.1 Preparo das suspensões bacterianas ......................................................... 39
4.5.2.2 Ensaio de contagem bacteriana total .......................................................... 40
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 41
5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ................................................................. 41
5.1.1 Difratometria de raios X ...................................................................................... 41
5.1.2 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho ................................... 46
5.1.3 Microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de raios X por energia
dispersiva ..................................................................................................................... 48
5.2 AVALIAÇÕES IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ................................ 50
5.2.1 Análise qualitativa usando o teste de difusão em Agar ....................................... 50
5.2.2 Teste microbiológico .......................................................................................... 52
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 55
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 57
1
1. INTRODUÇÃO
O tecido ósseo tem capacidade de regeneração mediante produção de novo
tecido com a mesma organização estrutural original. No entanto, esta capacidade
regenerativa é limitada pelo tamanho da lesão.A necessidade de correção de
pequenos ou grandes defeitos ósseos tem se tornado bastante rotineira na área
ortopédica e odontológica nos últimos anos. Na área ortopédica as principais causas
estão relacionadas ao aumento do número de acidentes automobilísticos e ao
aumento da expectativa de vida da população mundial. A osteoartrose de quadril e
joelho é a condição clínica mais frequente para indicação de cirurgia de artroplastia
de substituição da articulação com uso de próteses. Na área odontológica, a
implantodontia vem ganhando espaço, pois as pessoas cada vez mais buscam uma
melhor qualidade de vida ou uma melhora na estética e autoestima (BELLOTI, 2009;
KUABARA et al., 2000).
Materiais avançados para aplicações biomédicas são considerados um dos
mais importantes desafios na área da ciência e engenharia dos materiais. Dentre os
materiais utilizados para a substituição e regeneração da estrutura óssea
enquadram-se a classe de materiais denominados biomateriais na qual se destaca a
hidroxiapatita–HA (Ca10(PO4)6(OH)2), devido à similaridade química e estrutural com
a fase mineral presente nos ossos e dentes (GUASTALDI; APARECIDA, 2010). Esta
cerâmica é um dos materiais mais biocompatíveis conhecidos, favorecendo o
crescimento ósseo para os locais em que ela se encontra (osteocondutora),
estabelecendo ligações com o tecido ósseo (bioativo), permitindo a proliferação de
fibroblastos, osteoblastos e outras células ósseas, sendo que as células não se
distinguem entre a hidroxiapatita e a superfície óssea, o que indica grande
similaridade química superficial (LEGEROS, 2002; FRANCO et al., 2001). Ela
também possui a capacidade de trocar íons com o meio fisiológico levando ao
equilíbrio entre implante e osso. A superfície da hidroxiapatita permite a interação de
ligações do tipo dipolo, fazendo com que moléculas de água e também, proteínas e
colágeno sejam adsorvidas na superfície induzindo a regeneração tecidual
(VOLKMER et al., 2007).
Um grande número de técnicas tem sido desenvolvido para a obtenção do pó
de hidroxiapatita, sendo um dos métodos mais utilizados a técnica da precipitação
via úmida. A partir dos diferentes pós é possível obter diversas morfologias e
2
formatos de materiais, de denso até materiais extremamente porosos, os quais
incluem técnicas de processamentos cerâmicos tradicionais e avançadas como:
prensagem, colagem de barbotina, gel casting, injeção, tape-casting, sol-gel, etc.
(COSTA et al., 2009).
Para o sucesso clínico do implante envolvendo os biomateriais é necessário
que haja uma boa osteointegração (uma união estável e funcional entre o osso e a
superfície do material implantado) e que esteja associada à resistênciamecânica
necessária para o desempenho de funções desuporte (GUTIERRES et al., 2006).
É sabido que dentre as complicações em procedimentos cirúrgicos pode
ocorrer infecções. Contudo, entre as infecções associadas a dispositivos médicos
implantáveis a ocorrência em próteses ortopédicas é considerada uma das com
maiores riscos, pois acarreta intervenções cirúrgicas repetidas, perda do implante e
dependendo da severidade da infecção pode levar o paciente ao óbito (BERTUCCI
et al., 2010).
Este é um sério problema que tem exigido desenvolvimentos constantes de
materiais com características e propriedades capazes de corrigirem e substituírem
os defeitos ósseos com elevados índices de sucesso, favorecendo assim uma
melhora na expectativa e qualidade de vida dos pacientes. Isso se deve ao trabalho
multidisciplinar de diversas áreas como Medicina, Odontologia, Física, Química,
Biologia e Engenharia.
A longa sobrevivência destes substitutos ósseos também está relacionada
com a prevenção e o combate eficaz de infecções bacterianas no pós-operatório. O
implante funciona como um corpo estranho, modificando o microambiente local, o
que facilita a contaminação bacteriana por via direta ou hematogênica, formando um
biofilme em toda a sua superfície. A infecção torna-se resistente aos mecanismos de
defesa do paciente e à ação de antimicrobianos, e na maioria das vezes é
necessária a sua remoção para a cura. A adesão bacteriana aos biomateriais e a
formação de biofilmes ocorre em duas fases distintas: inicialmente pela atração
física entre o microorganismoe o implante (fase reversível), nesta o crescimento do
biofilme pode ser inibido por meio de agentes antimicrobianos, e posteriormente em
uma segunda fase, caracterizada pela interação celular e molecular com a superfície
do biomaterial (fase irreversível) (CERCA et al., 2005; BUCKLEY et al., 2010;
BERTUCCI; TEDRUS, 2010). Nesta segunda fase, ocorre a produção de uma matriz
3
de polissacarídeo, tornando as bactérias vinculadas umas as outras e ligadas às
superfícies para o desenvolvimento das colônias (MACK et al., 2006).
Como forma de prevenir as possíveis infecções associadas às cirurgias para
colocação de implantes, médicos, enfermeiros e o próprio hospital devem seguir
uma série de recomendações, procedimentos e normas, dentre elas: o menor tempo
de internação do paciente no pré-operatório, o controle do ar no centro cirúrgico e a
administração de antimicrobianos antes e após os procedimentos (LIMA; OLIVEIRA,
2010).
Uma estratégia usual para tratar e prevenir as infecções associadas àalguns
casos de implantes biomédicos é a utilização de antibióticos de maneira controlada
antes e após os procedimentos cirúrgicos (PEERSMAN et al., 2001) com o objetivo
de administrar altas doses locais sem exceder a toxicidade sistêmica dos
medicamentos (MOREIRA, 1997; LEACH; WILSON, 1992).Entretanto, quando a
profilaxia com os antimicrobianos específicos não for realizada corretamente poderá
acarretar ao aparecimento de cepas bacterianas resistentes às drogas, e isto tem
despertado o desenvolvimento de biomateriaiscom agentes bacterianos, tais como a
prata e zinco, que apresentam ampla atividade e baixa incidência de resistência,
incluindo as bactérias envolvidas nas infecções de implantes biomédicos (ANDO et
al., 2009; BOSE; TARAFDER, 2012).
O efeito antimicrobiano da prata é reconhecido há muitos anos, na antiguidade,
a mesma era utilizada no tratamento de queimaduras e como agente quimioterápico
contra patologias provocadas por bactérias, como a Staphylococcus
aureus(MOSER; PEREIMA; PEREIMA, 2013). O poder antimicrobiano da prata tem
sido relacionado aos seus variados mecanismos de ação. A prata interfere no
metabolismo bacteriano, pode romper a parede da célula bacteriana e ligar-se ao
seu DNA (ácido desoxirribonucléico), inibindo assim a replicação e a possibilidade
de desenvolver resistência (BAI et al., 2011). As cepas bacterianas mais comuns
associadas às infecções de implantes estão incluídas na lista de patógenos as quais
a prata pode eliminar (JEONGet al., 2006; LOK, 2006).
Neste sentido, a fim de obterem-se materiais com elevada biocompatibilidade e
propriedades antimicrobianas diversas propostas de incorporação de prata aos
biomateriais, tal como na hidroxiapatita, vêm sendo descritas na literatura (CIOBANU
et al., 2011; STANIC et al., 2011; JEONG et al., 2006).
4
Diversos grupos de pesquisas têm voltado sua atenção para o
desenvolvimento de fosfatos de cálcio dopados com metais que possuem
funcionalidades biológicas específicas para aplicações como enxertos ósseos.
Dessa forma, o presente trabalho propõe a obtenção de hidroxiapatitas contendo
prata pelo método de precipitação em solução aquosa contendo AgNO3 e por
imersão do pó após o processo de precipitação em soluções aquosas contendo
AgNO3, visando a utilização como um material bioativo com características
antimicrobianas.
5
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O TECIDO ÓSSEO
O tecido ósseo é uma forma especializada de tecido conjuntivo constituído
por células e por uma matriz extracelular calcificada, a matriz óssea. A matriz
ósseatem 50% de seu peso composto por matéria inorgânica. Os íons mais
encontrados são o fosfato e o cálcio que formam cristais com estrutura de
hidroxiapatita. A porção orgânica damatriz ósseaé composta por 95% de fibras
colágenas e por pequena quantidade de proteoglicanoseglicoproteínas.Aassociação
de hidroxiapatita com fibras colágenas é responsável pela dureza e resistência do
tecido ósseo. Quando se remove o cálcio dessa associação o osso mantém sua
forma, mas fica tão flexível quanto umtendão. E quando se remove o colágeno, ele
também mantém a forma, mas fica tão quebradiço que dificilmente pode ser
manipulado sem se partir (JUDAS et al., 2012; JUNQUEIRA, 2008).
O tecido ósseo funciona como suporte para as partes moles do corpo; protege
órgãos vitais; aloja e protege amedula óssea; proporciona apoio aosmúsculos
esqueléticos, transformando suas contrações em movimentos úteis, e constitui um
sistemade alavancas que amplia as forças geradas pela contração muscular. Além
dessas funções, os ossos funcionam como depósitos decálcio,fosfatoe outrosíons,
armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada, para manter constante a
concentração desses importantes íons nos líquidos corporais (JUDAS et al., 2012;
JUNQUEIRA, 2008; KATCHBURIAN, 1999).
Apesar de seu aspecto inerte, o tecido ósseo participa de um contínuo e
dinâmico processo de remodelamento, isto para formar e manter suas propriedades
mecânicas e capacidades metabólicas. Os ossos quando lesados têm capacidade
regenerativa, isto é, o processo de reparação óssea é efetuado através da formação
de osso novo e não pela formação de tecido fibroso (JUNQUEIRA, 2008).
As células presentes no tecido ósseo são praticamente quatro tipos: as
células osteogênicas ou osteoprogenitoras, osteoblastos, osteócitos e os
osteoclastos (MOTA et al., 2008; KIERSZENBAUM, 2008; KATCHBURIAN, 1999).
As células osteogênicas localizam-se na camada celular interna do periósteo
(bainha resistente de tecido conjuntivo que reveste a superfície do osso) e no
6
endósteo (membrana que reveste a cavidade medular). Essas são as únicas células
ósseas que passam por divisão celular. Suas “células filhas” se desenvolvem em
osteoblastos, as quais são células formadoras de osso, ou seja, sintetizam e
secretam matriz óssea orgânica como fibras colágenas, proteoglicanas e
osteocalcina e iniciam a calcificação (JUNQUEIRA, 2008; MOTA et al., 2008).
Os osteócitos são células maduras e são as principais células do tecido
ósseo, derivam dos osteoblastos, porém não apresentam a função de secretar
componentes da matriz. Sua função, no entanto, é de manter as atividades diárias
do tecido ósseo, tais como a troca de nutrientes e metabólicos com o sangue
(JUNQUEIRA, 2008; MOTA et al., 2008).
Os osteoclastos são células grandes multinucleadas (podem conter até mais
de 50 núcleos) que ficam no endósteo. Sua função é absorver o tecido ósseo e pelo
processo de fagocitose, englobam pequenas partículas da matriz óssea e dos
cristais, dissolvendo-os e liberando os produtos no sangue (JUNQUEIRA, 2008;
VÄÄNÄNEN et al., 2000).
O osso não é completamente compacto, pois hápequenos espaços entre seus
componentes rígidos. Alguns espaços formam canais para os vasos sanguíneos que
suprem as células ósseas com nutrientes. Outros espaços constituem áreas de
armazenamento para a matriz óssea. Pode-se dizer que existe dois tipos de ossos:
osso primário (imaturo ou osteóide) e osso secundário (maduro ou lamelar). O osso
primário é imaturo e o primeiro a se formar durante o desenvolvimento fetal e
durante a recuperação óssea. É rico em osteócitos e em feixes de colágenos não
modelados, os quais mais tarde serão substituídos como osso secundário, que é
osso maduro com uma matriz mais calcificada sendo, portanto, mais forte que o
primário (JUNQUEIRA, 2008; MOTA et al., 2008).
O processo de formação óssea é chamado de osteogênese ou ossificação e é
dividido em dois: intramembranosa e endocondral. Na ossificação intramembranosa
o tecido ósseo é formado diretamente no tecido conjuntivo primário, como ocorre
com os ossos chatos do crânio. Na ossificação endocondral, o tecido ósseo substitui
uma cartilagem preexistente, que é molde ou primórdio do futuro osso
(KIERSZENBAUM; TRES, 2012; NIJWEID, 2002).
A osteogênese é a formação do tecido ósseo pela transferência ou
recolocação de osteoblastos viáveis, que atuam sintetizando o osso em novos sítios.
Na osteocondução, inicialmente é formado um material como uma malha onde vão
7
crescer vasos e osteoblastos que migram das regiões de osteotomia ou fratura
óssea. A osteocondução é principalmente ativa em traumas ósseos. Já, na
osteoindução, células não esqueléticas desmineralizadas são diferenciadas em
células mineralizadas e estruturadas através de estímulos indutivos (hormônios)
(KIERSZENBAUM; TRES, 2012).
A fratura é um tipo de patologia óssea que estimula a formação do tecido
ósseo. Quando o osso é fraturado, inúmeros vasos sanguíneos são lesados,
formando na região um coágulo, chamado hematoma de fratura. Logo após,
fibroblastos e células osteogênicas próximas ao periósteo migram em direção à área
lesada. Essas células são suportadas por uma malha de capilares e fibroblastos,
constituindo a matriz de colágeno para o início da formação do tecido ósseo, o calo
ósseo. Com o passar do tempo, a atividade de osteocondução é intensificada, o calo
ósseo é substituído e reabsorvido pelos osteoclastos, de grande atividade
lisossômica, formando o osso esponjoso (GERSTENFELD et al., 2003a).
Dependendo do tipo e da extensão da lesão no tecido ósseo a regeneração
do mesmo fica comprometida, sendo necessária a utilização de substitutos, os quais
são denominados de biomateriais, os quais devem apresentar propriedades físicas e
biológicas compatíveis com os tecidos vivos hospedeiros, de modo a estimular uma
resposta adequada dos mesmos (GUASTALDI; APARECIDA, 2010; KAWACHI et
al., 2000).
2.2 BIOMATERIAIS
Um biomaterial foi inicialmente definido como sendo "um material não vivo,
usado como dispositivo médico, projetado para interagir com sistemas biológicos"
(WILLIANS, 1987).A definição do termo biomaterial foi aprimorada ao longo dos
anos, principalmente após a segunda Conferência Consenso sobre Definições em
Biomateriais, realizada em Chester no ano de 1991 (GUTIERRES et al., 2005), e
mais recentemente pode ser melhor definida como toda a substância (exceto
fármacos – drogas) ou combinação de substâncias, de origem sintética ou natural
que durante um período indeterminado de tempo é empregado como um todo ou
parte integrante de um sistema para tratamento, ampliação ou substituição de
quaisquer tecidos, órgãos ou funções corporais (BLACK, 1999).
8
Outra propriedade complementar e essencial para a ciência dos biomateriais
é a biocompatibilidade, que pode ser definida como a capacidade do material ter
uma respostaapropriada numa aplicação específica, minimizando reações alérgicas,
inflamatórias outóxicas, quando em contato com os tecidos vivos ou fluidos
orgânicos. A biocompatibilidade compreende as interações dos tecidos humanos e
fluidos, incluindo sangue, com um implante ou material. As interações podem ser da
ação do material nocorpo ou do meio fisiológico sobre o material (RATNER et al.,
2004, WILLIANS, 1987). Além disso, o material deve ser biofuncional, ou seja, deve
ser capaz de exercer a função que lhe é incumbida como se fosse próprio do
organismo (RATNER et al., 2004; PARK, 2007).
Os biomateriais podem ser de origem natural: autógenos ou autólogos -
quando são transferidos de um local para outro no próprio paciente, os alógenos ou
homólogos - quando retirado de outra pessoa (origem humana) e os xenógenos ou
heterólogos – origem animal, principalmente bovina, e de origem sintética: metais,
cerâmicas, polímeros e compósitos (VALLET-REGI, 2001; PARK, 2007).
Na Tabela 1 estão descritas algumas aplicações clínicas envolvendo os
biomateriais de origem sintética.
Tabela 1 – Aplicações clínicas envolvendo as classes dos materiais sintéticos utilizados no
corpo humano.
Biomaterial Aplicações
Polímeros
(Polietileno, Poliéster, Poliuretano, PMMA
(polimetil-metacrilato), Silicone).
Suturas, vasos sanguíneos, maxilofacial (nariz,
orelha, maxilar, mandíbula, dente), cimento,
tendão artificial, oftalmologia.
Metais e Ligas
(Aço inoxidável, Titânio e suas ligas, liga
cobalto-cromo).
Fixação ortopédica (parafusos, pinos, placas,
fios, hastes), implantes dentários.
Cerâmicos
(Alumina, Zircônia, Carbono, Fosfatos de
Cálcio, Porcelana e Vidros Bioativos).
Ossos, juntas, dentes, válvulas, tendões, vasos
sanguíneos e traquéias artificiais.
Compósitos
(Fibra de carbono-resina termofixa, Fibra de
carbono-termoplástico, Carbono-carbono,
Fosfato de cálcio-colágeno).
Válvula cardíaca artificial, implantes de junta de
joelho.
Fonte: Adaptado de Kawachiet al., (2000).
9
De acordo com a resposta induzida ao meio biológico, os biomateriais podem
ser classificados em bioinertes, biotoleráveis, biorreabsorvíveis e bioativos
(GUASTALDI; APARECIDA, 2010).
Materiais bioinertes: tolerados pelo organismo, porém a formação do
envoltório fibroso é mínima. De acordo com a Conferência da Sociedade
Européia para Biomateriais, realizada em 1986 na Inglaterra, o termo
bioinerte não é adequado, visto que todo material induz algum tipo de
resposta do tecido hospedeiro, mesmo que mínima, portanto este termo
deve ser evitado (KAWACHI et al., 2000). Os mais utilizados são:
alumina, zircônia, titânio e ligas de titânio.
Materiais biotoleráveis: são tolerados pelo organismo, sendo isolados
dos tecidos adjacentes por formação de camada envoltória de tecido
fibroso. A espessura da camada é inversamente proporcional à
tolerabilidade dos tecidos ao material. São representantes deste grupo
quase todos os polímeros sintéticos, assim como a grande maioria dos
metais (aço inoxidável e ligas de cobalto-cromo).
Materiais bioativos: ocorrem ligações de natureza química entre material
e tecido ósseo (osteointegração), em função da similaridade química
entre estes materiais e a parte mineral óssea. Os tecidos ósseos se
ligam a estes materiais, permitindo a osteocondução através do
recobrimento por células ósseas. Os principais materiais desta classe
são os biovidros e vitrocerâmicas, fosfatos de cálcio, hidroxiapatita.
Materiais biorreabsorvíveis: materiais que após certo período de tempo
acabam sendo degradados, solubilizados ou fagocitados pelo
organismo. Esta característica os torna interessantes, pois, não há
necessidade de realização de outra cirurgia para retirada ou substituição
do material. Como exemplos desta classe de materiais encontram-se o
fosfato de cálcio (TCP) e o ácido polilático.
Para o sucesso clínico é necessário que uma boa osteointegração, esteja
associada àresistênciamecânica necessária para o desempenho de funções de
suporte. No sentido de potencializar as suas propriedades mecânicas e físico-
10
químicas, podem combinar-sediferentes tipos de materiais que se complementam
entre si (GUTIERRES et al., 2006).
2.2.1 Biocerâmicas
A utilização de cerâmicas como biomateriais iniciou quando Dreesman, em
1894, relatou a utilização de gesso (CaSO4.1/2H2O) como um possível substituto
para ossos. Porém, devido a sua baixa resistência mecânica e devido ao fato de ser
completamente reabsorvido pelo organismo, seu uso tornou-se inviável para
implantes ósseos (KAWACHI et al., 2000).
O início da utilização mais intensa de materiais cerâmicos como um
biomaterial se deu na década de 70. A primeira biocerâmica muito utilizada nesta
época foi a alumina densa (α-Al2O3), por se apresentar bioinerte. Este material vem
sendo utilizado até os dias de hoje devido a sua biocompatibilidade e elevada
resistência mecânica em próteses ortopédicas que substituem o osso ou parte dele.
Alguns exemplos de aplicação da alumina são: próteses para substituição da cabeça
de fêmur e a substituição de dentes por dentes artificiais implantáveis. Outras
cerâmicas, tais como, zircônia (ZrO2), dióxido de titânio (TiO2), os fosfatos de cálcio
e as vitrocerâmicas, têm seu uso bastante difundido(KAWACHI et al., 2000; HENCH;
WILSON, 1993).
Com o número de materiais cerâmicos utilizados como biomateriais é elevado
tem-se procurado classificá-los de acordo com os aspectos envolvidos na interação
com os tecidos vivos (KAWACHI et al., 2000; HENCH, 1991). De acordo com Larry
Hench, as cerâmicas são agrupadas em 4 classes, conforme descrito na tabela 2
abaixo:
11
Tabela 2 – Classificação das biocerâmicas
Tipo de Biocerâmica Interações com os tecidos Exemplos
Inertes Não há interações Alumina
Porosas Ocorre crescimento de tecido
através dos poros
Aluminatos e hidroxiapatita
porosos
Bioativas Forte ligação na interface osso -
implante
Biovidros, hidroxiapatita e
vitrocerâmicas.
Biorreabsorvíveis São degradas e substituídas
pelos tecidos
Gesso e fosfato tricálcico
Fonte:Kawachiet al (2000).
As biocerâmicas são utilizadas tanto na forma isolada quanto como
recobrimento de próteses metálicas ou na associação com materiais poliméricos,
exemplo do colágeno. São empregadas na forma densa e na forma porosa,
conforme descrito na Tabela 2. É sabido que o aumento da porosidade diminui a
resistência mecânica do material isoladamente, porém a existência de poros com
dimensões adequadas pode favorecer o crescimento de tecidos através deles,
fazendo com que ocorra um entrelaçamento do tecido com o implante, aumentando
assim a resistência do material in vivo (KAWACHI et al., 2000; VALLET-REGÍ, 2010).
Kawachi e Andrade compararam a resposta ao implante de cilindros
cerâmicos densos e porosos de hidroxiapatita em fêmures de ratos Wistar,
observando que os cilindros densos apresentaram a formação de uma cápsula
fibrosa ao redor do material, isolando-o do tecido hospedeiro e que foi lentamente
regredindo entre 8 e 24 semanas após o implante; entretanto os cilindros porosos
permitiu a invasão de tecido ósseo através de toda a extensão da cerâmica
implantada, formando um forte entrelaçamento entre o implante de hidroxiapatita e o
tecido (KAWACHI et al., 2000).
Dentre as biocerâmicas, os fosfatos de cálcio apresentam-se hoje como os
principais materiais estudados e empregados como biomaterial para a reposição e
regeneração do tecido ósseo, pois apresentam como principais características:
semelhança com a fase mineral de ossos, dentes e tecidos calcificados; excelente
biocompatibilidade; bioatividade; ausência de toxicidade; taxas de degradação
variáveis; osteocondutividade (indicam o caminho para o crescimento ósseo,
fazendo que ocorra sobre a superfície ou através dos poros) (GUASTALDI;
APARECIDA, 2010; VALLETI-REGÍ, 2010).
12
Uma forma de classificar os fosfatos de cálcio é através da razão molar entre
os átomos de cálcio e fósforo (Ca/P), a qual permite avaliar o seu grau de
solubilidade em água. Os fosfatos de cálcio com elevada razão Ca/P são
precipitados em meio básico, enquanto que os de baixo valor para esta razão são
precipitados em meio ácido. As fases a serem obtidas irão depender do método e
parâmetros envolvidos (KAWACHI et al., 2000).
A estequiometria da hidroxiapatita possui grande significância, uma vez que
leves desequilíbrios na relação Ca/P podem levar à formação de outras fases que
afetam a interação do material com os tecidos biológicos. Por exemplo, se a relação
Ca/P for menor do que 1,67 podem surgir após o processamento fases como alfa-
fosfato tricálcico (TCP) ou o beta-fosfato tricálcico (TCP); se a relação Ca/P for
maior do que 1,67, o óxido de cálcio pode estar presente juntamente com a fase
hidroxiapatita (BONAN et al., 2014).
Ressalta-se que nem todos os compostos de CaP são úteis para implantação
no corpo, principalmente os compostos com uma razão Ca/P menor que 1 devido à
sua alta solubilidade ( BEST et al., 2008).
Esta é uma das propriedades mais importantes e exploradas e que pode
predizer seu comportamento in vivo. Quanto maior a relação Ca/P menor será a sua
solubilidade (GUASTALDI; APARECIDA, 2010; LEGEROS, 2002).
Na Tabela 3 estão relacionados os diversos fosfatos de cálcio com suas
fórmulas químicas e a razão Ca/P.
Tabela 3 –Tipos, fórmulas e relação Ca/P dos fosfatos de cálcio.
Tipo Fórmula Ca/P
Fosfato tetracálcico (TTCP) Ca4O(PO4)2 2,0
Hidroxiapatita (HA)
Fosfato de cálcio amorfo (ACP)
Ca10(PO4)6(OH)2
Ca10-xH2x(PO4)6(OH)2 1,67
Fosfato tricálcico (TCP) Ca3(PO4)2 1,50
Fosfato octacálcico (OCP) Ca8H2(PO4)6.5H2O 1,33
Fosfato dicálcicodihidratado
(DCPD) CaHPO4.2H4O 1,0
Fosfato dicálcico (DCP) CaHPO4 1,0
Pirofosfato de cálcio (CPP) Ca2P2O7 1,0
13
Pirofosfato de cálcio dihidratado
(CPPD) Ca2P2O7.2H2O 1,0
Fosfato heptacálcico (HCP) Ca7(P5O16)2 0,7
Fosfato dihidrógenotetracálcico
(TDHP) Ca4H2P6O20 0,67
Fosfato
monocálcicomonohidratado
(MCPM)
Ca(H2O4)2.H2O 0,5
Metafosfato de cálcio (CMP) Ca(PO3)2 0,5
Fonte: Costa et al. (2009)
Dentre os fosfatos de cálcio, devido à similaridade química e estrutural com a
fase mineral presente em ossos e dentes, a hidroxiapatita é o principal material de
escolha para a reposição do tecido ósseo em aplicações médicas, ortopédicas e
odontológicas, como recobrimento ou materiais densos (GUASTALDI; APARECIDA,
2010; HENCH; WILSON, 1993; LEGEROS 1991).
2.2.2 Hidroxiapatita
A hidroxiapatita é o constituinte mineral natural encontrado nos ossos e
dentes (LEGEROS, 1991). A hidroxiapatitas sintética possui propriedades de
biocompatibilidade e osteointegração, o que a torna substituta do osso humano em
implantes e próteses, daí o grande interesse em sua produção (COSTA et al., 2009).
Apresenta fórmula química Ca5(PO4)3OH, podendo ser escrita também como
Ca10(PO4)6(OH)2, mostrando que há duas unidades na célula unitária.
Quanto a estrutura cristalina, a hidroxiapatitapertence ao sistema hexagonal,
do grupo espacial P63/m (caracterizado por um eixo C de 6 unidades perpendiculares
a 3 eixos equivalentes mantendo um triângulo de 120°), com dimensões de célula
unitária cristalina a = b = 9,43 Å, c = 6,88 Å, α = β = 90º e = 60º. Os átomos de
cálcio estão localizados em sítios não equivalentes, sendo 4 no sítio I (Ca1) e 6 no
sítio II (Ca2), e os íons OH- ocupam os denominados sítios canais (GUASTALDI;
APARECIDA, 2000). A Figura 1 representa a rede cristalina da hidroxiapatita.
14
Figura 1 – Rede cristalina da hidroxiapatita
Fonte: Costa et al. (2009)
A estrutura cristalina da hidroxiapatita lhe permite a realização de
substituições catiônicas e aniônicas. Os íons Ca2+ podem ser substituídos por um
grande número de íons metálicos, tais como: K+, Na+, Ag+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, ZN2+,
entre outros. Vale lembrar que essas substituições podem alterar acristalinidade, os
parâmetros de rede, as dimensões dos cristais, a textura superficial, a estabilidade e
a solubilidade da estrutura da hidroxiapatita, que por sua vez, alteram a degradação
e o comportamento in vivo (GUASTALDI; APARECIDA, 2010; COSTA et al., 2009).
A literatura aborda que existem dois tipos de substituições de carbonatos a
primeira substituição e do CO32- por OH- (tipo A) e CO3
2- por PO43- (tipo B), nos dois
casos as substituições podem influenciar nos parâmetros de rede do material. As
carboapatitas são estudadas como promissoras para aplicações em enxertos e
suportes ósseos (LALA et al., 2013).
As aplicações da hidroxiapatitas estendem-se desde a ortopedia e
traumatologia, sendo utilizada como recobrimento de próteses metálicas para
promover a ligação interfacial entre o material implantado e o tecido vivo, em
tumores músculo-esquelético sendo usada como suporte de ação prolongada onde
há introdução de drogas anticancerígenas permitindo uma liberação gradual da
mesma no organismo, entre outras aplicações. Na odontologia, nos casos
dedoenças periodontais, para correções buco-maxilofaciais, implantes dentários,
preenchimento de cavidades císticas ou mesmo aumentos de rebordo alveolar,pinos
15
de titânio recobertos com hidroxiapatita são usados no implante para a substituição
da raiz, além outras aplicações (COSTA et al., 2009).
As aplicações da hidroxiapatita sintética não se restringem à área biomédica,
devido à sua grande afinidade por proteínas, a HA tem sido aplicada como
adsorvente em cromatografia líquida. A capacidade de adsorção da HA está
relacionada à estrutura do poro e à natureza físico-química da superfície do sólido
(COSTA et al., 2009)..
A Tabela 4 traz exemplos das formas dehidroxiapatita e suas aplicações.
Tabela 4 – Formas de HA empregadas na medicina e odontologia
Usos Formas
Matriz ou suporte para crescimento ósseo Grãos, porosa
Osso artificial Grãos, densa, porosa.
Cimento ósseo Pó com PMMA
Articulações artificiais Metal revestido com HA
Próteses vasculares Densa
Próteses traqueais Porosa ou densa
Terminais pericutâneos Densa
Sistema de liberação densa Densa ou pó
Fonte: Costa et al. (2009)
Apesar das vantagens apresentadas pela HA, a sua lenta biodegradação lhe
confere uma desvantagem. Estudos efetuados por longos períodos de tempo têm
mostrado que a HA começa a ser reabsorvida gradualmente após 4 a 5 anos de
implantação. A reabsorção é uma característica desejada para biomateriais nos
quais o processo de degradação é concomitante com a reposição do osso em
formação (GUASTALDI; APARECIDA, 2010).
Como método de obtenção das hidroxiapatita, várias técnicas estão sendo
desenvolvidas para a síntese do pó devido a sua crescente utilização, tais como
precipitação via úmida, sol-gel, técnica hidrotermal, técnica de emulsão múltipla,
deposição biomimética, eletrodeposição, etc. (COSTA et al., 2009).
O método de síntese adotado para a obtenção de hidroxiapatita ou o seu
tratamento posterior podelevar ao aparecimento ou não de outras fases de
compostos de fosfato de cálcio. Quando presentes podem ser detectadas através da
técnica de caracterização por difratometria de raios X. Normalmente estas fases
16
apresentam-se em quantidades pequenas (ao redor de 5%). Alguns compostos
devem ser evitados, pois, possuem propriedades extremamente diferentes da
hidroxiapatita, podendo comprometer a osteocondução ou ainda comprometer a
integridade e eficiência mecânica do material em função de sua solubilização, como
no caso do surgimento de pirofosfato de cálcio ou metafosfato de cálcio (COSTA et
al., 2009).
2.2.2.1 Fosfatos de Cálcio como Trocadores Iônicos
Segundo Legeros et al. (1984), cátions com raios iônicos maiores que o do
cálcio podem ser incluídos na estrutura da apatita com mais facilidade do que
aqueles com raios iônicos menores. Como resultado teremos uma expansão dos
parâmetros de rede a e c, e com aumento do volume da célula unitária. Já a
substituição do cátion cálcio por um cátion menor, como exemplo podemos citar o
cobre (raio iônico igual a 0,68 Å), teremos como resultado dessa troca uma
contração dos parâmetros a e c, e como consequência a diminuição do volume da
célula unitária (Vc).
A rede cristalina da hidroxiapatita permite as substituições catiônicas e
aniônicas isomorfas com grande simplicidade (AFSHAR et al., 2003). O cátion Ca2+
pode ser trocado por metais tais como o chumbo (Pb2+), cádmio (Cd2+), cobre (Cu2+),
zinco (Zn2+), estrôncio (Sr2+), cobalto (Co2+), ferro (Fe2+), manganês (Mn2+), prata
(Ag+). Os grupos fosfatos e hidroxilas, negativos, podem ser trocados por carbonatos
(CO32-), silicatos (SiO4
2-), flúor (F-), cloro (Cl-), etc. (MAVROPOULOS, 1999). Dentre
as propriedades dos fosfatos de cálcio que são abalados através de substituintes
são: parâmetros de rede (dimensões dos eixos a e c), tamanhos e forma do cristal,
tensão cristalina, cristalinidade, propriedades espectrais de absorçãono
infravermelho e estabilidade térmica (AOKI, 1999). Quando as trocas estão
presentes ao mesmo tempo, elas podem ter aditivos, sinergia ou efeitos opostos às
propriedades cristalinas das apatitas (MAVROPOULOS et al., 2005).
17
2.2.3 Método de obtenção da hidroxiapatita via precipitação química.
O método de precipitação química ou via úmida é uma das metodologias mais
utilizadas para obtenção de HA. Esta técnica é caracterizada pelo baixo custo,
principalmente em relação aos reagentes, e pela simplicidade do método de
preparação, porém, a maioria dos procedimentos sintéticos pode levar a formação
de produtos não estequiométricos e mistura de fases. Isto se deve à presença de
vacâncias e substituições iônicas na rede, tais como carbonatos, hidrogeno-fosfatos,
potássio, sódio, nitrato e cloreto (RIGO; GEHRKE; CARBONARI, 2007).
Os processos de precipitação consistem na adição de grupos fosfatos em
suspensões que contenham íons cálcio, podem partir de diferentes reagentes. A
reação de neutralização que utiliza como reagentes o hidróxido de cálcio - Ca(OH2)
e o ácido ortofosfórico - H3PO4, apresenta maior potencial para produção de
hidroxiapatita uma vez que se tem apenas água como subproduto (RIGO; GEHRKE;
CARBONARI, 2007).
Os métodos de precipitação apresentam variáveis tais como, pH, temperatura
de obtenção, concentração molar dos reagentes, taxa de adição de reagentes,
tempo de agitação, tempo de envelhecimento e temperatura de calcinação. O tempo
de envelhecimento e a cinética de reação são variáveis críticas para a pureza e
características cristalográficas do material obtido (ANGELESCU; UNGUREANU;
ANGHELINA, 2011;RIGO; GEHRKE; CARBONARI, 2007).
A composição dos reagentes trata da pureza do material, que pode
apresentar ou não íons não esperados na rede, além de diferenças nas
características morfológicas e cristalográficas. A taxa na qual os reagentes são
adicionados, ou seja, o tempo de gotejamento influencia na taxa de nucleação dos
cristais (KOUTSOPOULOS, 2002). A velocidade de gotejamento está diretamente
relacionada à cinética da reação, a adição lenta de íons fosfato proporciona menor
taxa de nucleação e maior taxa de crescimento, o que implica na obtenção de
partículas maiores; pelo contrário, altas taxas de adição de reagentes permite a
formação de maior número de núcleos, mas sem que haja tempo suficiente para
crescimento de grão (RIGO; GEHRKE; CARBONARI, 2007).
A formação de um sólido envolve precipitação a partir de uma solução e
cristalização, esses dois processos ocorrem simultaneamente se o precipitado é
cristalino, por outro lado, se o sólido obtido não é cristalino, a razão com a qual tais
18
etapas acontecem determinam a cristalinidade do material. Esta razão pode ser
controlada pela variação da saturação da solução e pelo tempo médio de
cristalização, que tem como parâmetros a temperatura e a taxa de gotejamento
(TADIC; PETERS; EPPLE; 2002).
A temperatura na qual a precipitação se processa tem grande importância na
fase obtida e na conversão de uma em outra. O tamanho da partícula e a morfologia
também são influenciados pela temperatura. Temperaturas mais altas permitem a
obtenção de pós mais cristalinos (RIGO; GEHRKE; CARBONARI, 2007).
Durante o envelhecimento os cristais formados estão sujeitos a um processo
de dissolução e recristalização, no qual os cristais menores desaparecem em
detrimento dos maiores, os quais crescem mais rapidamente; em consequência
disto o número total de cristais diminui assim como a área superficial específica
(KOUTSOPOULOS, 2002). O crescimento das partículas durante o envelhecimento
comprova que a precipitação continua mesmo após o gotejamento de todo o volume
de ácido (SAERI et al., 2003).
A calcinação do pó obtido pode alterar a fase presente no sólido, pois cada
uma das fases dos fosfatos de cálcio apresenta diferentes estabilidades térmicas e
propriedades físicas. Uma pequena variação na razão Ca/P do pó sintetizado resulta
numa grande variação das proporções das fases formadas após a calcinação
(RAYNAUD, 2002).
De acordo com Saeri et al. (2003), HA foi obtida mediante a adição de uma
solução de H3PO4 (0,3M) em uma suspensão de Ca(OH2) (0,5M) a uma taxa de 2
gotas/s a 40ºC em pH=7.5, mantido constante por meio da adição de hidróxido de
amônio. Em seguida, o material obtido foi lavado com água destilada e a ele foi
adicionado 1mmol/l de ácido fosfórico, esta solução foi envelhecida por uma noite. O
pó sintetizado foi sinterizado a 850ºC e a 1200ºC e posteriormente caracterizado por
microscopia eletrônica de varredura, onde observaram que a morfologia e o
tamanho de partícula foram alterados em cada etapa do processo de obtenção e as
propriedades de sinterização afetadas significativamente. As partículas
apresentaram morfologia achatada e alongada com escala nanométrica, porém as
amostras com maior tempo de envelhecimento exibiram partículas maiores. Além
disso, as nanopartículas tenderam a formar aglomerados. Também foi observado
que o tempo de envelhecimento e a cinética de precipitação foram determinantes
para a pureza do material e suas características cristalográficas. Além disso, quanto
19
maior a temperatura de calcinação mais cristalina era a amostra, o que foi dado pela
diferença de intensidade dos picos no difratograma de raiosX.
Landi et al. (2004) obtiveram hidroxiapatitas carbonatada mediante a reação
de neutralização de Ca(OH)2e H3PO4. Uma suspensão de Ca(OH)2 foi aquecida a
40ºC e dióxido de carbono (CO2) foi borbulhado sobre esta suspensão
concomitantemente ao gotejamento de uma solução de H3PO4 por um período de 4
horas. Em seguida, o sistema foi agitado por 2 horas, envelhecido por um dia a
temperatura ambiente, lavado e desaglomerado. O processo de obtenção teve como
variáveis o fluxo de CO2, a taxa de adição de H3PO4, a concentração da solução e a
temperatura de síntese. O aumento no fluxo de dióxido de carbono levou a formação
de hidroxiapatitas carbonatada com substituição dos grupos OH; o aumento da taxa
de adição de ácido fosfórico provocou a menor incorporação de carbonato na
estrutura da HA, principalmente sobre os grupos fosfato, por outro lado, a diminuição
desta taxa propiciou a substituição de grupos fosfatos por grupos HPO42-,
característicos da hidroxiapatita deficiente em cálcio. Além disso, houve um aumento
na cristalinidade e no tamanho de partícula com o aumento da temperatura de
síntese, em detrimento da quantidade de carbonato presente na amostra. Por meio
dos difratogramas de raios X foi observado que a cristalinidade da hidroxiapatitas
carbonatada é menor que da HA pura. Nos espectros de espectroscopia no
infravermelho foram perceptíveis bandas relativas aos grupos carbonatos e fosfatos.
Afsharet al. (2003) prepararam hidroxiapatita a partir de suspensão de
Ca(OH)2(0,5M) a qual foi aquecida por 1 hora em 40ºC e agitada constantemente, e
sobre ela foi adicionada H3PO4(0,3M) a uma taxa de 2 gotas/s. O pH foi controlado
por meio da adição deNH4OH. O precipitado foi envelhecido por um período de um
dia na solução mãe, na qual decantou. O estudo do material obtido apresentou como
resultados partículas com forma de bastão de escala nanométrica mediante a
análise das micrografias. A quantidade de íons cálcio presente no material diminuiu
com a diminuição do pH durante a precipitação, o que foi concluído por meio de
cálculos envolvendo difração de raios X.
Uma solução de H3PO4(0,06M) foi adicionada a uma taxa de 4mL/min a uma
solução de Ca(OH)2(0,1M) para a obtenção de fosfatos de cálcio por Kumaret al.
(2004). Foram feitas pequenas inclusões de carbonato de cálcio para se obter
apatita carbonatada. Estudou-se o efeito da temperatura de precipitação, usando
40°C, 80°C e 100°C. Durante a adição dos reagentes o pH foi mantido constante em
20
7,4. A suspensão foi agitada por 2 horas e envelhecida por mais 15 horas. Mediante
difração de raios X observou-se a formação de HA como fase majoritária e pequena
quantidade de beta-fosfato tricálcio (β-TCP) em todas as temperaturas de
precipitação. Com o aumento da temperatura de reação houve um aumento na
cristalinidade da HA e uma diminuição na substituição de grupos carbonato na
estrutura da apatita. Por microscopia eletrônica de transmissão foi possível observar
que as partículas obtidas a 40°C apresentavam forma acicular, diferentemente
daquelas obtidas a 100°C cuja forma era esferoidal.
2.3 COMPLICAÇÕES DOS MATERIAIS IMPLANTÁVEIS
2.3.1 Infecções cirúrgicas em próteses articulares
O implante de próteses articulares, principalmente de quadril e joelho, vem se
tornando cada vez mais frequente. A osteoartrose é a condição clínica mais
frequente para a indicação da cirurgia de artroplastia de substituição da articulação
com uso de próteses. Ela apresenta uma condição clínica progressiva, evoluindo
com limitação e incapacidade funcional devido à dor, diminuição da amplitude de
movimento, rigidez e, consequentemente, fraqueza muscular (MOTA, 2010).
A indicação das artroplastias é mais freqüente em pacientes com idade entre
65 e 79 anos. Em razão da tendência do aumento significativo da longevidade na
população mundial nas últimas décadas, verifica-se aumento crescente da demanda
deste tratamento cirúrgico, com objetivo de melhorar a dor e a mobilidade articular e
a função dos pacientes nas suas atividades de vida diária. Na população geral, os
adultos acima de 30 anos têm a doença sintomática na articulação do joelho
(BELLOTI, 2009).
Apesar de todos os esforços e melhorias de algumas questões técnicas
relacionadas aos procedimentos cirúrgicos e aos materiais a serem implantados,
sabe-se que complicações podem ocorrer. Dentre essas complicações, a infecção
da prótese é considerada a mais devastadora, acarretando internações prolongadas,
intervenções cirúrgicas repetidas, perda do implante e até o óbito do paciente,
dependendo do tipo e grau da infecção (BERTUCCI; TEDRUS, 2010; LIMA;
OLIVEIRA, 2010).
21
O desenvolvimento da infecção no local da prótese pode ocorrer basicamente
de três maneiras (MORAES et al., 2013; BERTUCCI; TEDRUS, 2010; LIMA;
OLIVEIRA, 2010):
Por implantação direta do microrganismo no implante ou nos tecidos
durante o processo cirúrgico, por microrganismos presentes na pele do
paciente ou da equipe cirúrgica ou por patógenos presentes na sala
cirúrgica;
Por disseminação hematogênica: presença de germes na boca, trato
respiratório, urinário, pele e tecido celular subcutâneo ou
gastrointestinal;
Por reativação de uma infecção latente.
As infecções ainda podem ser divididas em estágios, de acordo com o seu
grau de manifestação (ERCOLE; CHIANCA, 2002):
Estágio I: caracterizada pela infecção superficial, ocorre entre três e seis
meses após a implantação da prótese. Resultado da contaminação
direta no ato cirúrgico;
Estágio II: caracterizada por infecção superficial ou profunda ocorre
entre seis meses a dois anos após a cirurgia. Resultado ainda da
contaminação direta.
Estágio III: caracterizado por infecções profundas que ocorrem
tardiamente, após dois anos de cirurgia. São decorrentes da
disseminação hematogênica.
As bactérias mais comumente encontradas em infecções associadas a
próteses ortopédicas são o Staphylococcus aureus e o Staphylococcus epidermidis,
representando a classe das bactérias gram-positivas. As infecções causadas por
bacilos gram-negativos, tais como Escherichia coli e por fungos como Candida sp
vêm sendo relatadas com maior frequência em todo o mundo (LIMA; OLIVEIRA,
2010).
Estudos in vitro mostraram que S. epidermidis adere preferencialmente à
superfície de polímeros, enquanto S. aureus à superfície metálica (GRISTINA;
NAYLOR; MYRVIK, 1990).
A avaliação pré-operatória dos pacientes para cirurgias de colocação de
próteses é de extrema importância na prevenção de infecções pós-operatórias. Além
22
deste cuidado são também recomendados: internação próxima ao ato cirúrgico,
limpeza e esterilização de todos os instrumentos que serão utilizados na cirurgia,
manutenção das condições adequadas do centro cirúrgico, administração adequada
de antibióticos (antibiótico profilaxia) iniciada antes do processo cirúrgico, menor
tempo cirúrgico possível e com técnica adequada, entre outros (LIMA; OLIVEIRA,
2010).
2.3.2 Adesão bacteriana aos biomateriais e formação de biofilmes
A maioria dos casos de contaminação ocorre durante a colocação das
próteses, por contato direto do biomaterial com o meio externo ou com tecidos
colonizados, tal como a pele. Os aspectos biofísicos da superfície do biomaterial e a
concentração bacteriana são fatores determinantes para a adesão definitiva do
microrganismo (EROCOLE; CHIANCA, 2002).
Segundo Costerton et al. (1999) biofilmes são "comunidades estruturadas de
células bacterianas encerradas em uma matriz polimérica auto-montada e aderente
a uma superfície inerte ou viva". Estes tipos de superfícies estão freqüentemente
presentes em próteses e sobre estas os biofilmes podem crescer lentamente e
serem resistentes a respostas celulares e imunes. Este autor realizou, ainda,
estudos envolvendo dispositivos ortopédicos relacionados às infecções em um
modelo animal que confirmaram o lento crescimento de S. aureus e E. coli. Dentre
os fatores que contribuem para a velocidade da formação de biofilmes pode-se citar
o número e tipo de células presentes no líquido ao qual a superfície está exposta, a
taxa de fluxo deste líquido através da superfície, as propriedades físico-químicas da
superfície, a composição nutricional e temperatura do ambiente.
Pode-se dizer que a adesão bacteriana ocorre em duas fases distintas
(TRAMPUZ; WIDMER, 2006; MORAES et al., 2013; BERTUCCI; TEDRUS, 2010):
Fase reversível: marcada por forças físicas, entre o germe e o implante.
A atração sofre o efeito de forças de “longas distâncias” descritas como
forças mútuas (em função da energia livre e da distância) e “curtas
distâncias” como forças de Wan der Walls. Como ainda nesta fase não
houve a interação molecular do microrganismo com o biomaterial, não
há formação de biofilmes e, portanto, medidas físicas como lavagem,
23
defesas do hospedeiro e a administração de antimicrobianos são
capazes de evitar a evolução para a infecção.
Fase irreversível: caracterizada pela interação celular e molecular do
microrganismo com a superfície do biomaterial ou proteínas adsorvidas
a ela, como o colágeno, por exemplo. As reações moleculares presentes
permitem uma adesão firme da bactéria à superfície do implante,
formando uma matriz extracelular conhecida como biofilme.
Uma vez formada as microcolônias, a propagação das bactérias sobre o
biomaterial se inicia e a adesão vai ficando cada vez mais forte e com isso a
infecção vai se tornando crônica e resistente. A retirada do implante, neste caso, é a
única opção para o controle eficaz da infecção (TRAMPUZ; WIDMER, 2006;
MORAES et al., 2013).
2.4 PROPRIEDADES GERAIS DA PRATA
O efeito antimicrobiano da prata é conhecido há muitos anos, na antiguidade,
a mesma era utilizada no tratamento de queimaduras ecomo agente quimioterápico
contra patologias provocadas por bactérias, como a Staphylococcus aureus. Após a
descoberta da penicilina, ouso da prata como agente bactericida diminuiu
consideravelmente. Porém, com a seleção de cepas resistentes a antibióticos, a
pratavoltou a despertar interesse na comunidade científica em virtude do
desenvolvimento de novos antimicrobianos (CHOPRA, 2007).
Moyer et al (1965) foram provavelmente os primeiros a abordarem o uso
tópico da prata no cuidado de feridas desenvolvendo um tratamento eficaz contra
queimaduras infectadas utilizando-se de um creme a base de nitrato de prata a
0,5%. Seus estudos concluíram que o mesmo era eficaz contra Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa e Streptococcus hemolyticus sem causar
resistência por conta da prata.
As propriedades antibacterianas da prata em baixas concentrações em uma
ampla gama de patógenos, incluindo a cepas bacterianas comuns envolvidas em
infecções associadas aos implantes, bem como a ausência de toxicidade para as
células de mamíferos, são bem conhecidas (SONDI, 2004).
24
O cátion de prata ou o íon carregado positivamente (Ag+) é ativo contra uma
grande variedade de patógenos bacterianos, fungos e vírus. O poder antimicrobiano
da prata tem sido relacionado aos seus variados mecanismos de ação. A prata
interfere no metabolismo bacteriano, pode romper a parede da célula bacteriana e
ligar-se ao seu DNA. Os íons de prata reagem com as proteínas (enzimas) através
da combinação de grupos SH (sulfidrilos), conduzindo à inativação das mesmas.
Como resultado o DNA das bactérias perde sua capacidade de replicação e as
proteínas bacterianas tornam-se inativadas, levando a morte dos microrganismos
(BAI et al., 2011; MORONES et al., 2005, FENG et al., 2000). O mecanismo de ação
da prata é sempre o mesmo, independente de sua forma de apresentação. No
entanto, se ela estiver na forma elementar, precisa sofrer um processo de oxidação
a fim de que seja transformada em um composto de óxido de prata e íons de prata,
que conferem o efeito antimicrobiano. Um dos benefícios da forma elementar é de
poder proporcionar um maior reservatório de prata disponível na cobertura,
permitindo um potencial de liberação por um tempo ampliado.
Conforme já dito anteriormente os íons de prata são um potente
antimicrobiano e eles se tornam disponíveis quando a prata está presente em uma
solução ou quando a prata elementar entra em contato com o oxigênio, que pode ser
do ar ou do fluido corpóreo. Ela sofre um processo de oxidação para formar óxido de
prata (Ag2O) que em dissolução no fluido se dissocia liberando os íons Ag+
(SYSTAGENIX, 2011).
Embora a prata apresente propriedades antimicrobianas, ela pode ser tóxica
às células humanas se a concentração ultrapassar um limiar (CHEN et al., 2006). O
resultado é uma descoloração grisácea (argíria ou argisore) na pele, unhas e
mucosas. A prata é absorvida pelo corpo e permanece no sangue até se depositar
nas membranas das mucosas, formando uma película acinzentada (SYSTAGENIX,
2013).
Feng et al. (2000) o efeito antimicrobiano dos íons de prata na Escherichia
Coli (bacilos gram-negativo) e no Staphylococcus aureus (gram-positivo). As
bactérias foram cultivadas a 37ºC, em meio LB (Luria Bertani), em agitação rotativa
por 16 horas. Após, 10 m/mL de AgNO3 foi adicionado ao meio. O cultivo
permaneceu por 4-12 horas. Uma amostra desta cultura foi centrifugada e lavada
com água destilada e a biomassa foi analisada por microscopia eletrônica de
transmissão (TEM). Os autores concluíram que a prata é capaz de fazer com que os
25
respectivos microrganismos percam sua capacidade de replicação, inativando as
proteínas bacterianas.
Com o objetivo de diminuir e prevenir as infecções associadas aos implantes
com biomateriais, vários estudos têm sido realizados a fim de se desenvolver um
material que apresente as propriedades de um biomaterial (bioatividade,
biocompatibilidade, osteoindução e osteocondutividade) aliadas às propriedades
antimicrobianas. Assim surgem os estudos e desenvolvimento da biocerâmica
hidroxiapatita com adição de prata.
2.5 HIDROXIAPATITA CONTENDO PRATA
Vários autores têm descrito a associação de diferentes formas de HA com a
prata (na forma iônica ou elementar) e avaliado seu efeito contra diversas bactérias,
como Staphylococcus aureus e Escherichia coli.
Kolmas e colaboradores (2014) realizaram um estudo cujo foco era analisar a
atividade antimicrobiana, através do ensaio microbiológico de contagem de
bactérias, da HA com concentrações de 0,1% a 10% em peso de prata. Relataram
que mesmo um teor tão baixo de prata como 0,2% em peso, inibe eficazmente o
crescimento da K. pneumoniae e C. krusei. Em contraste, a atividade antimicrobiana
contra E. coli e a B. Subtilis requereu um teor de 0,5% em peso de prata. Afirmaram
que o crescimento de S. aureus e S. epidermidis é claramente inibida com um teor
de prata de 1% em peso. A fim de determinarem o teor de prata ótima, realizaram
estudo de citotoxicidade in vitro em osteoblastos humanos, células tronco humanas
e fibroblastos de rato. Em células tronco humanas mostraram que HA contendo
0,3% em peso de prata não tem efeito negativo sobre o crescimento destas células
ao longo de 7 dias de cultura, enquanto que um teor de 0,7% em peso de prata inibe
ligeiramente o seu crescimento. Uma concentração de 8,3% em peso de prata
apresenta efeito citotóxico significativo para as células tronco humanas. Utilizando
osteoblastos nos ensaios in vitro têm demonstrado que um teor de 6% em peso de
prata inibe significativamente o crescimento destas células e leva algumas à morte,
enquanto que concentrações de 2 a 4% em peso de prata representaram o conteúdo
que permitem um bom equilíbrio entre a atividade antimicrobiana e a atividade
26
citotóxica. Nos estudos in vitro com células de rato foi confirmada toxicidade baixa
para HA com prata em concentrações até 4,3% em peso.
Dubnikaet al. (2013) avaliaram as propriedades físicas e antimicrobianas da
HA com prata, em concentrações de 0,1 a 5% em peso de prata, obtidas por
precipitação química, porém, com precursores diferentes.No primeiro processo, A,
os precursores foram Ca(OH)2, H3PO4 e AgNO3e no segundo processo, B, os
precursores foram Ca(NO3)2.4H2O, AgNO3, NH4OH e NH42HPO4. Os pós obtidos
foram caracterizadas por difração de raios X, onde os autores concluíram que as
amostras preparadas pelo método A continham três fases, ou seja, HA, prata e óxido
de prata, enquanto preparadas pelo método B continham duas fases, ou seja, HA e
óxido de prata. As amostras preparadas pelos processos A e B foram colocadas em
simulado de fluido corporal para medir a cinética de liberação de prata. A taxa de
liberação foi medida após 1, 24 e 50 horas das amostras em contato com o fluido.
Observaram que a quantidade de prata liberada pelas amostras obtidas pelo
processo A era duas vezes menor do que a quantidade liberada pelas amostras
obtidas pelo processo B. Esta diferença na quantidade de prata liberada pode ser
explicada pelo fato de existir nas amostras do processo A o óxido de prata e prata
metálica e nas amostras do processo B apenas o óxido de prata e a solubilidade do
óxido de prata em soluções aquosas ser maior do que a prata metálica. No ensaio
antimicrobiano de contagem de bactérias, utilizando cepas bacterianas de
Staphylococcus epidermidis e Pseudomonas aeruginosa, os resultados mostraram-
se positivos para ambas as amostras.
Na literatura encontram-se descritos vários métodos utilizados para dopar
aHA com Ag ou íons de prata, tais como: por precipitação (OH et al., 2004a; CHUNG
et al., 2005; RIGO et al., 2010; BRAJENDRA et al., 2011), por troca iônica (FENG et
al., 1998; CHOI et al., 2004; OH et al., 2004), nanopartículas (RAMESHBABU et al.,
2007; DIAZ et al., 2009; BERA et al., 2009;LARA et al., 2011), entre outras técnicas
(KATAKAM et al., 2003; SHIMAZAKE et al., 2010; OHTSUKI et al., 2010).
Rigoet al. (2010) obtiveram a HA nasconcentrações 0,01M; 0,05M e 0,1M de
prata via precipitação química. As amostras foram analisadas utilizando-se as
técnicas de difração de raios X (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e
o efeito bactericida foi avaliado mediante o método de difusão em disco com cultura
de Staphylococcus aureus. As amostras com as três concentrações de prata
apresentaram a fase HA como fase majoritária. Os resultados do ensaio de difusão
27
em disco mostraram que as três amostras de HA com Ag inibiram o crescimento das
bactérias.
Feng et al. (1998) utilizaram a imersão de substratos recobertos com HA em
soluções de AgNO3para promovera troca iônica entre os íons de Ag e Ca da
hidroxiapatita. As concentrações de prata utilizadas no estudo variaram de 20 a 100
ppm. O efeito bactericida para estas concentrações foi comprovado para quatro
microrganismos: E. coli, P. aeruginosa, S. aureus e S. epidermidis. Utilizando a
mesma metodologia de imersão para incorporar prata na HA, Lee et al. (2006), com
concentrações de 0,4 M de AgNO3, também verificaram através do ensaio in vitro de
contagem de bactérias o efeito bactericida em microrganismo E. coli.
Kim et al. (1998) avaliaram o efeito antimicrobiano de íons metálicos (Ag+,
Cu2+ e Zn2+) incorporados na HA pelo método de precipitação química.Foram
utilizados como reagentes 0,3M H3PO4 e 0,5M Ca(OH2) e AgNO3 nas concentrações
(0,001M; 0,01M e 0,0001M). O pH foi monitorado durante a reação permanecendo
em 9,1o que possibilitou a obtenção da HA estequiométrica com relação Ca/P igual
a 1,67. O precipitado foi filtrado e seco a temperatura de 120°C. Após seco, HA foi
passada em almofariz para obtenção de um pó fino. As amostras foram
caracterizadas por difratometria de raios X onde demonstrou a presença de HA e
nitrato apatita (este com o íon metálico que substituiu a HA). O ensaio
antimicrobiano de contagem de bactérias foi realizado para E. coli e mostrou
efetividade apenas para os íons de Ag, nas três concentrações ensaiadas (0,001M;
0,01M e 0,0001M). Verificou-se também que as maiores concentrações de Ag+
mostraram uma maior eficiência em relação ao efeito antimicrobiano.
Oh, Park e Jeong (2004) avaliaram o efeito antimicrobiano da hidroxiapatita
dopada com prata pelo método de co-precipitação, utilizando a etapa da lavagem do
precipitado em uma amostra e a outra sem a lavagem. Como reagentes foram
utilizadas soluções de 0,1M de Ca(NO3)24H2O com AgNO3 mantendo a relação
Ag/Ca entre 0,01 e 0,15 e outra solução de 0,1M (NH4)2HPO4. O pH foi mantido em
10 e o volume da solução de (NH4)2HPO4 foi preparado de modo que a relação Ca/P
ficasse entre 1,5 e 2,0. A temperatura da reação foi de 80°C, mantida sob agitação e
fervida após a precipitação. O precipitado foi separado e seco a temperatura de
90°C e posteriormente calcinado a 900°C por uma hora. O material foi caracterizado
por difratometria de raios X. Os resultados mostraram que quando adicionados 5 %
de Ag pelo método de co-precipitação sob relação estequiométrica de Ca/P=1,67,
28
obtinham fases diferentes após o tratamento térmico, dependendo da lavagem dos
precipitados. A lavagem do precipitado resultou em hidroxiapatita com baixas
concentrações de prata, a mesma foi seriamente perdida permanecendo em 0,1%.
Pelo contrário, o precipitado não lavado continha muito mais prata,
aproximadamente 1,4%. O precipitado não lavado resultou também na presença da
fase beta fosfato tricálcico (β – TCP), fase esta que favorece a perdada capacidade
de troca iônica. Em relação ao efeito antimicrobiano concluíram que quanto maior a
porcentagem de prata incorporada maior o efeito inibitório sobre E. coli e S. aureus.
Rameshbabu e colaboradores (2006) obtiveram hidroxiapatita com
nanopartículas de prata utilizando como reagentes Ca(OH)2, (NH4)2HPO4 e AgNO3
na precipitação por microondas. Nas condições estudadas eles obtiveram HA, β-
TCP e prata metálica quando as amostras foram tratadas termicamente a 900°C,
porém o efeito da substituição da Ag na HA foi baixo comparado a outros valores da
literatura, mas isso não afetou o processo de lixiviação das amostras de HA com a
Ag quanto ao seu efeito bactericida.
Sendo o método mais comum para obter hidroxiapatita com prata, a
precipitação em solução aquosa foi estudada por Chung et al. (2005), Rigo et al.
(2010) e Brajendra et al. (2011). A precipitação pode ser realizada por metodologias
em que se diferem a ordem de adição dos reagentes, podendo ser: método direto
que consiste em uma solução contendo cátions de cálcio que é adicionada
lentamente a uma solução contendo ânions fosfato e o método indireto/inverso que é
caracterizada pela adição, lentamente, de uma solução contendo ânions fosfatos em
uma solução contendo cátions cálcio (ASSADA et al., 1998).
Embora a prata apresente propriedade antimicrobiana, ela pode ser tóxica
para células humanas se a concentração utilizada exceder um determinado limite.
Bai e colaboradores (2011) avaliaram o efeito antimicrobiano através do ensaio in
vitro para S. aureus e a citotoxicidade de recobrimentos de hidroxiapatita dopada
com nanopartículas de prata sobre superfície de titânio foi avaliada in vitro utilizando
cultura de células humanas de osteoblastos. O recobrimento foi realizado pela
técnica IBDA (Ion beam assisted deposition). Os autores utilizaram concentrações
de Ag de 1, 3 e 6.5% em peso e o estudo sobre o efeito antimicrobiano mostraram
inibição de bactérias S. aureus, principalmente nas maiores concentrações de Ag.
Porém nos ensaios de citotoxicidade demonstraram que as amostras com 6,5 % em
peso de Ag tem um efeito negativo sobre o a resposta das células de osteoblastos,
29
proliferação e apoptose bem como um efeito negativo na produção de proteína e de
osteocalcina. Notaram que as amostras com 3% em peso de Ag ou menos
apresentaram citotoxicidade mínima, isto é, sugerem que a concentração de prata
de 1 a 3% em peso em revestimentos pode ser favorável.
É possível notar que dentre os estudos apresentados até agora a utilização
da HA com prata apresenta resultados positivos com relação às propriedades
antimicrobianas e dependendo da quantidade de prata incorporada não há toxidade
para as células humanas.
Independente do método de obtenção da hidroxiapatita com a prata, o
objetivo é único: obter um biomaterial que apresente propriedades antimicrobianas
adequadas aos microrganismos mais comuns relatados em infecções associadas
aos implantes de biomateriais e que não apresente toxicidade para as células
humanas.
30
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi obter hidroxiapatitas contendo
prata pelos métodos de imersão e precipitação química.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtenção e caracterização do pó de HA sintética por precipitação química.
Obtenção e caracterização do pó de HA impregnada com prata nas
concentrações 0,1M; 0,01M e 0,001M obtidas pelos métodos de
precipitação química e imersão.
Avaliar a atividade antibacteriana in vitro dos materiais obtidos.
31
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 PRECIPITAÇÃO DA HIDROXIAPATITA
Obteve-se a hidroxiapatita por precipitação química a temperatura ambiente,
utilizando a reação entre ácido fosfórico e hidróxido de cálcio, ambos com grau
analítico de alta pureza. Usando agitação constante 300 mL de solução 0,5M de
H3PO4 foi gotejada lentamente em 500 mL da solução0,5M de Ca(OH)2. Após o
gotejamento, a solução continuou sob agitação constante por 6 horas. Em seguida,
a suspensão foi filtrada usando papel filtro (Qualy) com poros de 14µm, o precipitado
lavado duas vezes com água destilada a fim de remover o excesso de quaisquer
íons ou contaminantes, e seco em estufa a 100°C por 24 h. O sólido obtido foi
desaglomerado em almofariz de ágata, passado por uma peneira granulométrica
com abertura de 0,180 mm. Finalmente, o pó foi calcinado a 800°C por 3 horascom
taxa de aquecimento de 15 °C/min.
4.2 PRECIPITAÇÃO DA HIDROXIAPATITA COM PRATA
A hidroxiapatita com prata foi obtida por precipitação química mediante a
reação entre ácido fosfórico e uma solução aquosa de nitrato de prata e hidróxido de
cálcioem temperatura ambiente. Adicionou-se Ca(OH)2 na concentração de 0,5M em
soluções de AgNO3 com três concentrações 0,1M – HAAg0,1Pr; 0,01M –
HAAg0,01Pr e 0,001M – HAAg0,001Pr, após completa homogeneização iniciou-se o
gotejamento da solução de H3PO4 na concentração de 0,5M sob agitação constante.
Após o gotejamento, a suspensão foi mantida sob agitação constante por 6h. Em
seguida o material foi filtrado e seco em estufa a 100ºC por 24h. O sólido foi
desaglomerado em almofariz da ágata e o pó foi calcinado a 800ºC por 3h com taxa
de aquecimento de 15 °C/min.
32
4.3 IMERSÃO DO PÓ DE HIDROXIAPATITA EM SOLUÇÃO AQUOSA DE
NITRATO DE PRATA
O pó obtido no item 4.1 foi imerso em uma solução de AgNO3 com
concentrações de 0,1M – HAAg0,1Im; 0,01M – HAAg0,01Im e 0,001M –
HAAg0,001Im. As suspensões em temperatura ambiente foram mantidassob
agitação por 30 minutos e em seguida filtradas, os precipitados foram secos em
estufa a 100ºC por 24horas. Os sólidos foram desaglomerados em almofariz de
ágata e calcinados a 800ºC por 3h com taxa de aquecimento de 15 °C/min.
4.4 CARACTERIZAÇÃO
Os pós obtidos em 4.1; 4.2 e 4.3 foram caracterizados por difração de raios X
(DRX) com o objetivo de identificar as fases cristalinas, por espectrofotometria no
infravermelho com transformada de Fourier por transmitância para avaliação dos
grupamentos iônicos presentes e por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
para analisar a morfologia.
4.4.1 Difração de raios X (DRX)
O princípio da técnica consiste na interação de dois feixes de raiosX
coerentes, ou seja, procedentes de uma fonte, que incide sobre a amostra. Devido à
proximidade do comprimento de onda de raios X e as distâncias interplanaresde um
cristal, este último atua como grade de difração. Dependendo do ângulo de
incidência, diferentes planos refletem os raios iniciais que já tem uma diferença de
fase. Estes dois feixes refletidos permitem caracterizar a distância interplanar e,
como os planos são numerosos, o quadro total vai caracterizar a estrutura cristalina
do composto.A difração de raios X ocorre segundo a Lei de Bragg (Equação A), a
qual estabelece a relação entre o ângulo de difração e a distância entre os planos
que a originaram (característicos para cada fase cristalina) (CALLISTER, 2008;
CULLITY, 2001):
33
nλ = 2dsen θ (A)
Onde,
n: número inteiro
λ: comprimento de onda dos raios X incidentes
d: distância interplanar
θ: ângulo de difração
Figura 2 – Esquema ilustrativo do fenômeno de difração de raios X (Lei de Bragg)
Fonte:Callister (2008).
As intensidades obtidas em ângulos 2representadas através dos picos nos
difratogramas, correspondem à difração do feixe incidente por um determinado
conjunto de planos do cristal, que possuem mesma distância interplanar, cada qual
com índices de Muller hkl (reflexões hkl). O padrão difratométrico representa uma
coleção de perfis de reflexões (difrações) individuais (ou picos difratados), cada qual
com sua altura, área integrada, posição angular, largura e caudas que decaem
gradualmente à medida que se distanciam da posição da altura máxima do pico. A
intensidade integrada é proporcional à intensidade de Bragg, Ihkl (CALLISTER,
2008).
As informações obtidas de cada pico são a intensidade, a posição angular
(2ou distância interplanar (d) e o perfil. Cada composto cristalino apresenta
padrão difratométrico característico, permitindo a sua identificação através das
posições angulares e intensidades relativas dos picos difratados. A identificação das
substâncias cristalinas é obtida através da comparação do difratogramas com
34
padrões difratométricos de fases individuais disposnibilizadospelo JCPDS – Joint
Committee of Powder Diffraction Standards, sendo possível também calcular os
parâmetros de cela unitária, avaliar o grau de cristalinidade, bem como quantificar
fases presentes (CALLISTER, 2008).
Estes dados permitem computar os parâmetros da rede cristalina e identificar
o composto através de uma base de dados. Essa técnica é às vezes chamada de
difratometria de pó, já que não precisa de monocristais para o refinamento da
estrutura, mas apenas o produto triturado.
Todos os pós obtidos foram caracterizados por DRX usando difratômetro
Rigaku Miniflex600 situado no Laboratório Multiusuário de Caracterização de
Materiais (MultiMat)da USP - FZEA. Foram adotados parâmetros de varreduras de
10° a 50° (2θ) e passo de 0,033° a cada segundo, com o objetivo de identificar as
fases cristalinas.
4.4.2 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (IV)
Neste trabalho a espectroscopia no infravermelho foi empregada para
detectar as frequências das vibrações das ligações químicas no sólido dando
informações complementares à técnica de difração de raios X.
A chamada radiação infravermelha corresponde à parte do espectro
eletromagnético situada entre as regiões do visível e das microondas. A banda
espectral mais utilizada corresponde ao infravermelho médio que cobre o número de
onda de 200 a 4.000 cm-1.
Na técnica de espectroscopia no infravermelho irradia-se a amostra com luz
infravermelha, de tal forma, que algumas das moléculas ou agrupamentos atômicos
presentes na amostra vibrem ou oscilem e consequentemente certa energia
luminosa é absorvida pela amostra. O comprimento de onda da energia absorvida
depende do tipo de molécula ou agrupamento atômico. Deste modo, gera-se um
espectro de infravermelho quando cada grupo funcional da amostra absorve energia
incidente com um determinado comprimento de onda.
O espectrofotômetro de infravermelho de transformada de Fourier contém
uma fonte, um interferômetro e um detector. O interferômetro processa todas as
frequências da radiação infravermelha simultaneamente. O interferograma resultante
35
é processado matematicamente empregando-se um algoritmo de transformada de
Fourier. O resultado dessa transformação é o espectro de infravermelho da amostra.
Quando a radiação infravermelha incide sobre a superfície de uma amostra
ocorre alguns dos seguintes eventos: absorção, reflexão, ou penetração superficial
seguida de dispersão difusa. Este último fenômeno é conhecido como
reflectânciadifusae é esta radiação dispersada que se mede na técnica de
reflectância difusa. Esta técnica é especialmente adequada para obtenção de
informações sobre a superfície de um material (poucos m de profundidade) além de
não ser necessária nenhuma preparação especial da amostra.
Todas as amostras de pós foram examinadas em um espectrofotômetro de
infravermelho com transformada de Fourier FTIR PerkinElmer modelo SpectrumOne.
Os espectros foram coletados na faixa de 4.000 à400 cm-1, com número de 32
scans. Os ensaios foram realizados no Laboratório de Tecnologia de Alimentos da
FZEA – USP.
4.4.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)com Espectroscopia de
Raios X por Energia Dispersiva (EDS)
O MEV é um aparelho que pode fornecer rapidamente informações sobre a
morfologia e identificação de elementos químicos de uma amostra sólida. Sua
utilização é comum em biologia, odontologia, farmácia, engenharia, química,
metalurgia, física, medicina e geologia.
O MEV é um dos mais versáteis instrumentos disponíveis para a observação
e análise de características microestruturais de objetos sólidos. A principal razão de
sua utilidade é a alta resolução que pode ser obtida quando as amostras são
observadas; valores da ordem de 2 a 5 nanômetros são geralmente apresentados
por instrumentos comerciais, enquanto instrumentos de pesquisa avançada são
capazes de alcançar uma resolução melhor que 1nm. Outra característica
importante do MEV é a aparência tridimensional da imagem das amostras, resultado
direto da grande profundidade de campo. Permite, também, o exame em pequenos
aumentos e com grande profundidade de foco, o que é extremamente útil, pois a
36
imagem eletrônica complementa a informação dada pela imagem óptica (DEDAVID;
GOMES; MACHADO, 2007).
O princípio de um microscópio eletrônico de varredura (MEV) consiste em
utilizar um feixe de elétrons de pequeno diâmetro para explorar a superfície da
amostra, ponto a ponto, por linhas sucessivas e transmitir o sinal do detector a uma
tela catódica cuja varredura está perfeitamente sincronizada com aquela do feixe
incidente. Por um sistema de bobinas de deflexão, o feixe pode ser guiado de modo
a varrer a superfície da amostra segundo uma malha retangular. O sinal de imagem
resulta da interação do feixe incidente com a superfície da amostra. O feixe
interagindo com a amostra produz elétrons e fótons que podem ser coletadas por
detectores adequados e convertidas em um sinal de vídeo.
Quando o feixe primário incide na amostra, parte dos elétrons difunde-se e
constitui um volume de interação. Neste volume, os elétrons e as ondas
eletromagnéticas produzidos são utilizados para formar as imagens ou para efetuar
análises físico-químicas.
Para serem detectadas, as partículas e/ou os raios eletromagnéticos
resultantes da interação do feixe eletrônico com a amostra devem retornar à
superfície da amostra e assim atingirem o detector. A profundidade máxima de
detecção, portanto, a resolução espacial, depende da energia com que estas
partículas ou raios atingem o detector, ou são capturadas pelo mesmo. Por exemplo:
elétrons retroespalhados possuem maior energia do que os elétrons secundários,
assim, o detector de elétrons retroespalhados irá operar na faixa de energia maior e
o de elétrons secundários na faixa menor. A imagem formada a partir do sinal
captado na varredura eletrônica de uma superfície pode apresentar diferentes
características, uma vez que a imagem resulta da amplificação de um sinal obtido de
uma interação entre o feixe eletrônico e o material da amostra. Diferentes sinais
podem ser emitidos pela amostra.
O EDS (energy dispersive x-ray detector) é um acessório essencial no estudo
de caracterização microscópica de materiais. Quando o feixe de elétrons incide
sobre a amostra, os elétrons externos dos átomos e os íons constituintes são
excitados, mudando de níveis energéticos. Ao retornarem para a sua posição inicial,
liberam a energia adquirida a qual é emitida em comprimento de onda no espectro
de raios-x. Um detector instalado na câmara de vácuo do MEV mede a energia
associada a esse elétron. Como os elétrons de um determinado átomo possuem
37
energias distintas, é possível, no ponto de incidência do feixe, determinar quais
elementos químicos estão presentes naquele local. O equipamento ainda permite o
mapeamento da distribuição dos elementos químicos, gerando mapas
composicionais de elementos desejados (GOLDSTEIN, 2003).
Todas as amostras de pós foram examinadas em um microscópio eletrônico
de varredura marca HITACHI modelo TM3000 com tensão de aceleração 15Kv.s
ensaios foram realizados no Laboratório de Tecnologia de Alimentos da FZEA –
USP.
4.5 AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Uma grande variedade de métodos pode ser empregada para medir a
atividade in vitro de microrganismos contra os agentes antimicrobianos. Uma
variedade de métodos é encontrada para esse efeito e como não são todos
baseados no mesmo princípio, os resultados obtidos serão também profundamente
influenciados, não só pelo método escolhido, mas também pelos microrganismos
utilizados para realizar o teste, e pelo grau de solubilidade de cada agente
anitmicrobiano (VANDEN; BERGHE et al., 1991). Os principais métodos
microbiológicos de detecção de atividade antimicrobiana encontrados na literatura
podem ser classificados em três tipos: ensaios bioautográficos, de difusão e de
diluição (RIOS et al., 1988). Os ensaios bioautográficos são aqueles que empregam
placas de cromatografia de camada fina (CCF) para a análise. Os compostos
separados por CCF são colocados por contato em placas de ágar previamente
inoculadas com o microrganismo teste. Zonas de inibição de crescimento microbiano
indicam a presença de substâncias antimicrobianas (RIOS et al., 1988). Ensaios de
diluição são ensaios quantitativos e aqueles nos quais as substâncias a serem
testadas são adicionados a um meio de cultura líquido, previamente inoculado com o
microrganismo teste. Após incubação, o crescimento do microrganismo é
determinado pela leitura visual direta ou turbidimétrica pelo uso de
espectrofotômetro em comprimento de onda apropriado (VANDEN; BERGHE et al.,
1991). Os ensaios de difusão são métodos qualitativos, nos quais o efeito pode ser
graduado. Fundamentam-se na difusão da substância a ser ensaiada em um meio
de cultura sólido e inoculado com o microrganismo. A partir da difusão ocorre o
38
aparecimento de um halo, no qual não há crescimento do microrganismo,
denominado halo de inibição. Diferentes tipos de reservatórios podem ser
empregados incluindo discos de papel, cilindros de porcelana ou de aço inoxidável e
poços feitos no meio de cultura (VANDEN; BERGHE et al., 1991). A substância a ser
testada é colocada em contato com o meio de cultura inoculado, e a maneira como
se processa esse contato define os diferentes métodos de difusão, dentre eles,
método do disco difusão, método dos cilindros e método de poços (RIOS et al.,
1988).
Podemos ainda dizer, em outras, palavras que os métodos utilizados para a
determinação da atividade antibacteriana podem ser divididos em dois grupos, os
qualitativos e os quantitativos. Entre os testes qualitativos, destacam-se o método de
disco-difusão que foi idealizado por Bauer et al. (1966), e desde então é um dos
métodos mais utilizados nos laboratórios de microbiologia clínica para testar a
suscetibilidade aos antimicrobianos (SEJAS et al., 2003). O princípio original deste
método baseia-se na difusão, através do ágar, de um antimicrobiano impregnado em
um disco de papel filtro que leva à formação de um halo de inibição do crescimento
bacteriano.
Em relação aos testes quantitativos, destaca-se a contagem bacteriana total,
em que é estimado o número de unidades formadoras de colônias de bactérias por
mililitros de solução (UFC/mL). Existem vários métodos disponíveis para
determinação das UFC/mL e entre estes a contagem bacteriana em placa é
considerada o método referência. A contagem das bactérias usando esse método
considera apenas as células viáveis, enquanto outras técnicas contam o número de
bactérias tanto mortas como vivas (CERCA, 2005).
4.5.1 Teste de disco difusão em ágar
Para o teste de disco-difusão em ágar utilizou-se meio de cultura Agar
Mueller-Hintone cepas Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli
(ATTC 25922). Os microorganismos foram incubados em meio TSB
(TryptoneSoyaBroth) por 18 horas sob agitação de 100 rpm à 37ºC. Posteriormente,
as suspensões de bactérias foram centrifugadas por 10 minutos a 3.500 rpm e os
sedimentos lavados por 3 vezes com PBS (Tampão salino-fosfato pH 7,4). Os
39
sedimentos finais obtidos foram ressuspendidos em PBS e diluídos para obtenção
da turbidez equivalente a 0,5 da escala McFarland (1,5 x 108 UFC/mL). O
plaqueamento foi realizado pelo método Spread Plate no qual 280 μL de cada
suspensão de bactérias foram inoculados em placa de 150 mm contendo ágar
Mueller-Hinton para crescimento dos micro-organismos. Em seguida, as pastilhas de
HAAg obtidas pelo método de precipitação química e imersãoforam aplicadas sobre
as superfícies semeadas. O antibiótico gentamicina (10 μg) foi utilizado como
controle positivo. As placas foram incubadas em aerobiose, a 37ºC por 24 horas, e
após este período foram realizadas as medidas dos halos de inibição de crescimento
e o registro das imagens fotográficas.Os ensaios foram realizados no Laboratório
Química Biológica (LBQ) do Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo.
4.5.2 Contagem bacteriana total
Avaliou-se a atividade antibacteriana das amostras de hidroxiapatita com
prata, obtidas pelos métodos de precipitação química e imersão, a frente de duas
quantidades distintas (1,0 x 103 UFC/mL e 1,0 x 106 UFC/mL) de Staphylococcus
aureus (ATC 6538). 100 mg de cada amostra foi transferida assepticamente, em
triplicata, para tubos de ensaio 13x100mm, previamente esterilizados. Este ensaio
foi realizado na Universidade Federal do ABC.
4.5.2.1 Preparo das suspensões bacterianas
Transferiu-se uma alçada de uma cepa liofilizada de Staphylococcus aureus
(ATCC 6538) para 10mL de caldo triptona de soja (TSB), seguido de incubação a
37ºC por 24 horas, para reativação da mesma. Após incubação, transferiram-se
20µL desta cultura para outro tubo contendo 10mL de TSB, com incubação a 37ºC
por 24 horas. Transferiram-se 20µL desta última cultura para 10mL de TSB, com
incubação a 37ºC/24h. Centrifugou-se esta cultura (5000 rpm/5min), desprezou-se o
sobrenadante e ressuspenderam-se as células decantadas em um volume de
solução salina 0,85% estéril até se obter uma suspensão com concentração
40
estimada de 1,0 x 108 UFC/mL, de acordo com turbidez 0,5 da escala de McFarland.
Realizaram-se diluições seriadas (1:10), em solução salina, até se obter uma
suspensão com concentração teórica estimada de 1,0 x 106 UFC/mL. A partir da
suspensão de 1,0 x 106 UFC/mL, realizaram-se diluições seriadas (1:10) em solução
salina, até se obter a concentração teórica de 1,0 x 103 UFC/mL. Obteve-se a
concentração real das suspensões 103 e 106, diluindo-se as mesmas (1:10) até 10-2
e 10-5, respectivamente. Semeou-se 1mL de cada diluição das duas suspensões em
placas de Petri, adicionaram-se 20mL de ágar triptona de soja (TSA),
homogeneizou-se cuidadosamente e incubou-se a 37°C por 48 horas.
4.5.2.2 Ensaio de contagem bacteriana total
Adicionou-se um volume de 200µL de cada suspensão (103 e 106) aos tubos
contendo as diferentes amostras, homogeneizou-se com auxílio de agitador
tipoorbital (vortex) por 15 segundos. Transferiram-se os tubos para estufa
bacteriológica à temperatura de 37°C, deixando-se os mesmos na posição
horizontal, de maneira a aumentar a superfície de contato entre o inóculo e o
material em estudo, por 24 horas. Após esse período, adicionou-se um volume de
5mL de solução salina estéril a cada tubo, homogenizou-se em vortex por 15
segundos e realizaram-se as diluições seriadas (1:10) até diluição 10-3 para o teste
com a suspensão mais concentrada (106) e até diluição 10-1 para o teste com a
suspensão menos concentrada (103). Transferiu-se 1mL de cada diluição, incluindo
aquela adicionada de 5mL de solução salina (menor diluição) para placas de Petri
estéreis. Adicionaram-se 20mL de TSA a cada placa e homogeneizou-se
cuidadosamente. Incubaram-se as placas a 37°C por 48 horas. Após incubação,
realizaram-se as contagens, expressando-se os resultados em unidades formadoras
de colônias (UFC)/mL.
41
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
5.1.1 Difratometria de raios X
Os padrões DRX dos pós de HA e HAAg resultantes apresentados
nasFiguras 3 e 4nos permitem observar que independente do método de obtenção
da HAAg há presença de prata metálica caracterizada pelos picos em 2θ=38,1° e
44,3°. Nota-se a formação de óxido de prata nas amostras obtidas por precipitação
HAAg0,01Pr e HAAg0,001Pr identificada pelo pico 2θ=37,5°.É possível ainda notar
que quanto maior a concentração de prata maior os picos correspondentes.
Adicionalmente observou-se que os picos assinalados no difratograma para a HA
correspondem à ficha padrão de difração JPCDS 09-0432 (Joint Commitee on
Powder Diffraction Standards). Não sendo observados picos relacionados às fases
β-TPC e CaO, correspondentes às fichas padrão de difração 09-0169 e 37-1497,
respectivamente.
25 30 35 40 45 50
Ag
Ag
Un
idad
es A
rbit
rári
as (
u.a
)
2
HAAg 0,1Im
HAAg0,01Im
HAAg0,001Im
HA
Figura 3 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via imersão com
concentrações 0,1M; 0,01M e 0,001M de prata.
42
25 30 35 40 45 50
AgO
AgAgO
Ag
Un
idad
es A
rbit
rári
as (
u.a
)
2
HAAg0,1Pr
HAAg0,01Pr
HAAg0,001Pr
HA
Ag
Figura 4 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via precipitação com
concentrações 0,1M; 0,01M e 0,001M de prata.
Katakam et al. (2003) utilizaram hidroxiapatitas comercial e óxido de prata
(Ag2O). Concentrações de 5 e 10% em mol de óxido de prata foram espalhados
homogeneamente sobre a HA e as misturas compactadas sob uma pressão de
80Mpa. As amostras foram aquecidas em forno microondas doméstico e irradiadas
durante 3 horas. Observaram a formação de prata metálica nas amostras, através
do ensaio de difratometria de raios X, devido a decomposição do Ag2Onas amostras
de HAAg.
Diaz et al. (2009) observaram resultado semelhante quando sintetizaram HA
pelo método de sol gel e posteriormente incorporaram nanopartículas de prata.
Ohtsuki e colaboradores (2010) realizaram a caracterização das amostras de
HA obtidas pelo método hidrotermal e imersas em solução de nanopartículas de
prata através da espectroscopia de raios X e observaram também a presença de
prata metálica caracterizada pelo pico 2θ =38,1°.
Chung e colaboradores (2005) utilizaram a técnica sol-gel em baixa
temperatura e através do resultado do DRX não evidenciaram a presença de prata
metálica, mas sim de Ag2O devido à atração eletrostática com HA.
43
Miranda et al. (2010) estudaram e caracterizaram nanopartículas de prata
incorporadas a uma matriz de HA, a qual foi obtida pelo método sol gel e
posteriormente adicionada a uma solução contendo AgNO3 a fim de se obter HA/nAg
com 1% em peso de prata metálica. O padrão DRX para as amostras resultou na
presença de Ag metálica caracterizada pelos picos 2θ =38,1° e 44,3°.
Rameshbabu e colaboradores (2006) obtiveram hidroxiapatita com
nanopartículas de prata utilizando como reagentes Ca(OH)2, (NH4)2HPO4 e AgNO3
na precipitação por microondas. Nas condições estudadas eles obtiveram HA, β-
TCP e prata metálica quando as amostras foram tratadas termicamente a 900°C,
porém o efeito da substituição da Ag na HA foi baixo comparado a outros valores da
literatura, porém isso não afetou o processo de lixiviação das amostras de HA com a
Ag.
Dubnika et al. (2013) analisaram suas amostras de HA com prata obtidas por
precipitação química, porém com precursores diferentes e com concentração de 0,1
a 5% em peso de prata. No primeiro processo, A, os precursores foram Ca(OH)2,
H3PO4 e AgNO3e no segundo processo, B, os precursores foram Ca(NO3)2.4H2O,
AgNO3, NH4OH e NH4.2HPO4. Os pós obtidos foram caracterizadas por difração de
raios X, onde os autores concluíram que a composição das fases dependem do
modo de preparo e da quantidade de prata adicionada. Pelos resultados
demonstrou-se que amostras preparadas pelo método A continham três fases, ou
seja, HA, prata e óxido de prata, enquanto as preparadas pelo método B continham
duas fases, ou seja, HA e óxido de prata. Nos resultados dos difratogramas os picos
de Ag metálica foram observados no 2= 38,2º e 44,4º e o AgO no pico referente ao
237,5º. Semelhante ocorre com as amostras de HAAg0,01Pr e HAAg0,001Pr
deste trabalho, onde a processo de obtenção também é precipitação química e os
precursores são os mesmos, diferenciando apenas na concentração de AgNO3
utilizada.
Rajendran e colaboradores (2014)realizam um estudo para verificar a
estabilidade de fase da HA e HA com 10, 20 e 30% prata em peso e posteriormente
calcinadas a 1200ºC. A HAp foi obtida através da reação dos reagentes nitrato
tetrahidratado de cálcio [Ca(NO3)2.4H2O] e di hidrogênio ortofosfato de amônio
[(NH4)H2PO4]. As amostras de HA com prata foram obtidas utilizando o pó de HA
previamente sintetizado misturado com as diferentes concentrações de prata e
posteriormente calcinadas. Através da caracterização das amostras pela técnica
44
DRX os autores identificaram a presença de prata metálica pelos picos no
difratogramano2=38,2º e 44,4º. Não evidenciaram a presença de outras fases
secundárias, tais como fosfato tricálcico.
Através da Figura 5 é possível verificar o resultado do ensaio de DRX
realizado para amostras com concentrações 0,1M de AgNO3 obtidas pelo método de
precipitação química e imersão, HAAg0,1Pr e HAAg0,1Im, respectivamente. Vê-se a
presença de Ag metálica caracterizada pelos picos em 2θ =38,1° e 44,3°. Os picos
referentes à prata são maiores na amostra obtida via precipitação química
comparados aos picos da amostra obtida por imersão. Não foi notada a presença de
outras fases, tais como β-TCP e CaO.
25 30 35 40 45 50
Ag
Ag
Unid
ade
s A
rbitrá
ria
s (
u.a
)
2
HAAg 0,1Im
HAAg 0,1Pr
HA
Ag
Figura 5 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via precipitação e imersão com
concentrações 0,1M de prata.
Nos espectros de DRX da Figura 6 é possível verificar o resultado do ensaio
realizado para amostras com concentrações 0,01M de AgNO3 obtidas pelo método
de precipitação química e imersão, HAAg0,01Pr e HAAg0,01Im, respectivamente.
Vê-se a presença de Ag metálica caracterizada pelos picos em 2θ =38,1° e 44,3°
apenas para as amostras obtidas por precipitação. Nota-se também a presença de
AgO nas amostras HAAg0,01Pr no pico 2θ =37,5°. Os picos referentes à prata são
45
menores comparados aos picos da Figura 4, pois, a concentração de prata é menor.
Também podemos notar que não houve a formação de fases β-TCP e CaO.
25 30 35 40 45 50
Ag
AgO
Un
ida
des
Arb
itrá
rias
(u
.a)
2
HAAg 0,01Im
HAAg 0,01Pr
HA
Ag
Figura 6 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via precipitação e imersão com
concentrações 0,01M de prata.
Nos espectros de DRX da Figura 7 comparou-se as amostras obtidas pelo
método de precipitação e imersão com concentração 0,001M de AgNO3, sendo
caracterizadas como HAAg0,001Pr e HAAg0,001Im, respectivamente. Pelos
resultados não notou-se a presença da prata metálica em nenhuma das amostras.
Vê-se apenas a presença doAgO caracterizado pelo pico em 2θ =37,5°para as
amostras obtidas por precipitação.
46
25 30 35 40 45 50
Un
idad
es A
rbit
rári
as (
u.a
)
2
HAAg 0,001Im
HAAg 0,001Pr
HA
AgO
Figura 7 – Espectro de DRX da HA sintetizada e da HAAg obtidas via precipitação e imersão com
concentrações 0,001M de prata.
5.1.2 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho
Nos espectros de absorção no infravermelho (Figura 8 e 9) estão presentes
as bandas que caracterizam a fase HA; em 582cm-1, 617cm-1, 655cm-1
(apresentando um triplete), 964cm-1, 1084cm-1 e 1180 cm-1 (apresentando um
duplete nas regiões de 1080 a 1200cm-1) tem-se os picos referentes ao grupamento
PO43
-, os picos 872cm-1 e 3574cm-1, referentes ao grupamento OH-. As bandas em
1411cm-1 e 1451cm-1 representam vibrações moleculares do grupo CO32-, o que
indica a presença deste grupo na fase, sendo, portanto, hidroxiapatitas carbonatada,
devido à substituição iônica do carbonato, na estrutura da HA. Nota-se também
picos em 1637cm-1 e 2047cm-1 que se referem à H2O. O método de precipitação de
HA em meio aquoso, quando realizado sem controle de atmosfera de síntese,
favorece aincorporação do CO32- à estrutura da HA (BOANINI et al., 2010 e
DRIESSENS et al., 1990), tal incorporação ocorreu e é evidenciada pela presença
das bandas de absorção nos intervalos descritos acima.
47
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
OH-
H2O
CO32-
PO43-
Re
flectâ
ncia
(%
)
Número de onda (cm1-)
HAAg0,1Im
HAAg0,01Im
HAAg0,001Im
HA
PO43-
Figura 8– Espectro de infravermelho da HA sintetizada e HAAg obtidas via imersão com
concentrações de 0,1M; 0,01 e 0,001M de AgNO3.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Re
fle
ctâ
nc
ia (
%)
Número de onda (cm1-)
HAAg0,1Pr
HAAg0,01Pr
HAAg0,001Pr
HA
PO43-
PO43-
CO32-
H2O
OH-
Figura 9– Espectro de infravermelho da HA sintetizada e HAAg obtidas via precipitação com
concentrações de 0,1M; 0,01 e 0,001M de AgNO3
48
Landi et al. (2004) obtiveram hidroxiapatitas carbonatada mediante a reação
de neutralização de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e ácido fosfórico (H3PO4). Uma
suspensão de Ca(OH)2 foi aquecida a 40ºC e dióxido de carbono (CO2) foi
borbulhado sobre esta suspensão, concomitantemente ao gotejamento de uma
solução de H3PO4, por um período de 4 horas. O aumento no fluxo de dióxido de
carbono levou à formação de hidroxiapatitas carbonatada com substituição dos
grupos OH; o aumento da taxa de adição de ácido fosfórico provocou a menor
incorporação de carbonato na estrutura da HA, principalmente sobre os grupos
fosfato. Por outro lado, a diminuição desta taxa propiciou a substituição de grupos
fosfatos por grupos HPO42-, característicos da hidroxiapatitadeficiente em cálcio.
Volkmer et al. (2007) ao medirem a influência do tempo de indução nas
propriedades da hidroxiapatita porosa obtida por gel casting de espuma observaram
espectros de absorção no infravermelho muito semelhantes, caracterizando a
hidroxiapatita.
Segundo Aoki (1991), a presença de grupos CO3-2 e HPO4
-2 indicariam uma
hidroxiapatita não estequiométrica, ou seja, com razão Ca/P <1,67.
Pela técnica de caracterização pelo infravermelho não se observou nenhuma
diferença nas amostras analisadas, ou seja, não observamos alterações nos
grupamentos iônicos comparando as amostras de HAAg com a HA, independente do
processo de obtenção: imersão ou precipitação.
5.1.3 Microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de raios X por
energia dispersiva
Nas micrografias das amostras sintetizadas (Figura10) observam-se a
presença da prata para as HAAg obtidas pelos métodos de imersão e precipitação
química, as quais aparecem como pontos brilhantes. Podemos notar também nas
imagens que quanto maior a concentração de prata utilizada maior a quantidade de
pontos brilhantes, independente do método de obtenção da HAAg.
49
Figura 10– Espectro de EDS das amostras deHAAg obtidas via precipitação e imersão com
concentrações de 0,1M; 0,01 e 0,001M de AgNO3.
A análise por EDS dessas superfícies permitiu, ainda, identificar os elementos
constituintes de forma semi-quantitativa (Figuras 11 e 12). É possível notar os picos
altos de Ca, P e O que são os principais elementos que compõe a hidroxiapatita
além do pico Ag, assim sendo, não há dúvidas de que os pontos brilhantes são a
prata. A pequena quantidade identificada do elemento carbono é devido à utilização
de fita de carbono na preparação das amostras.
Figura 11– Espectro de EDS da amostras deHAAg obtida via imersão com concentração de 0,1M; de
AgNO3, caracterizadas por HAAg0,1Im
HAAg0,1Im HAAg0,01Im HAAg0,001Im
HAAg0,01Pr HAAg0,001Pr HAAg0,1Pr
HAAg0,1Im
50
Figura 12– Espectro de EDS da amostras deHAAg obtida via precipitação com concentração de
0,1M; de AgNO3, caracterizadas por HAAg0,1Pr
5.2 AVALIAÇÕES IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
5.2.1 Análise qualitativa usando o teste de difusão em Agar
Os resultados do teste de difusão em ágar para os discos preparados, com os
microorganismos Staphylococcus aureus e Escherichia coli são mostrados nas
Figuras13 e 14, respectivamente. Observa-se na placa de Petri com a cepa S.
aureus halos de inibição circulares ao redor dos discos de HAAg0,1Im; HAAg0,01 e
um pequeno halo ao redor do disco HAAg0,1Pr e ausência de halo nos discos de HA
e demais discos de HAAg. Na placa de Petri com a cepa E. colinão se observa a
formação de halos de inibição para nenhum dos discos de HAAg e HA. Houve
crescimento uniforme das bactérias no restante da placa que não entrou em contato
com os materiais. Ainda podemos notar, para a bactéria S. aureus, que o disco da
amostra HAAg com concentração de 0,01M deAg obtida pelo processo de imersão
(HAAg0,01Im) possui halo ligeiramente menor comparado com o halo formado para
o disco de HAAg com concentração 0,1M obtido também por imersão (HAAg0,1Im).
Os halos formados para os discos das amostras de HAAg obtidas por imersão para
as concentrações de Ag 0,1M e 0,01M são maiores do que o halo formado para o
disco da amostra de HAAg com concentração 0,1M de Ag obtida por precipitação.
Esta diferença sugere que a prata esteja na superfície das amostras obtidas por
imersão enquanto que nas amostras obtidas pelo processo de precipitação química
a prata esteja não somente a superfície da HA, mas também esteja contida na
estrutura da mesma. Outro fato pelo qual houve a formação de pequeno halo no
HAAg0,1Pr
51
disco de HAAg0,1Pr pode se dever ao fato da mobilidade limitada dos íons prata
sobre o meio sólido do ágar, que sendo baixa indica ser um dos fatores limitantes
para a formação de halos maiores. A atividade antibacteriana de compostos HAAg,
semelhantes ao obtido no presente estudo, tem sido atribuída à liberação de Ag+ no
meio (CHEN et al., 2008; SIMON; ALBON; SIMON, 2008). Sabe-se que os íons e
compostos a base de prata podem destruir as membranas e as paredes celulares
das bactérias afetando seu crescimento (FURR et al., 1994; JUNG et al., 2008).
Figura 13– Imagem da placa de Petri com cepas de Staphylococcus aureus
Figura 14– Imagem da placa de Petri com cepas de Escherichia coli
52
Os resultados exibiram melhor efeito antibacteriano para a bactéria Gram-
positiva (S. aureus) quando comparada a Gram-negativa (E. coli). Diferentes cepas
bacterianas aderem de forma diferente uma vez que apresentam características
físico-químicas distintas. A interação de íons de prata com membranas biológicas
resulta em produção de espécies reativas de oxigênio, que danificam a membrana
da célula (DIBROV et al., 2002; DRAGIEVA et al., 1999; RUSSELL et al., 1996). Os
íons de Ag+ podem ainda reagir com várias proteínas no espaço citossomal,
ribossomal e dos ácidos nucléicos, impedindo assim a replicação e a tradução
causando a morte celular da bactéria(KIM et al., 1998; KLASEN, 2000). Estes
resultados possivelmente estejam relacionados com a espessura da parede celular
das bactérias Gram negativas, pois essas possuem natureza mais complexa da
parede celular, ou seja, possuem uma membrana externa a mais, constituída de
lipossacarídeos. Sendo assim as bactérias Gram negativas são mais resistentes à
ação de antibióticos, que não são capazes de cruzar efetivamente esta barreira
lipídica (ROCHA, 2011).
Embora os resultados de difusão em ágar demonstrem a atividade
antibacteriana dos materiais, não obtemos informações sobre o número de bactérias
afetadas. Além disso, o fato das colônias não crescerem ao redor dos materiais não
esclarece se as bactérias foram mortas ou estão apenas inibidas de crescer. Para tal
realizamos o ensaio microbiológico, um experimento quantitativo, utilizando
suspensões bacterianas para a avaliação da atividade antibacteriana.
5.2.2 Teste microbiológico
Os dados apresentados na Tabela 5 demonstraram que todos os tratamentos
contendo prata, tanto em menor concentração quanto na maior, exerceram ação
bactericida quando no ensaio realizado com a menor quantidade de células de S.
aureus (7,2 x 102 UFC).
53
Tabela 5 - Contagens de Staphylococcus aureus após 24 horas de contato com as amostras
dos diferentes tratamentos. Inoculo inicial = 7,2 x 102 UFC (log contagem = 2,86) e 7,2 x 105
UFC (log contagem = 5,86).
Amostras
Inoculo inicial = 7,2 x 102 UFC (log
contagem = 2,86)
7,2 x 105 UFC (log contagem =
5,86)
Contagem de S.
aureus (UFC)
Log contagens
de S. aureus
Contagem de
S. aureus
(UFC)
Log contagens
de S. aureus
HA 100% a 2,0 x 104 4,30 7,5 x 10
4 5,88
HA 100% b 6,4 x 104 4,81 6,25 x 10
4 5,80
HA 100% c 5,2 x 104 4,72 4,8 x 10
5 5,68
HA 0,001Pra 3,0 x 102 2,48 8,0 x 105 5,90
HA 0,001Pr b ND (< 25)* - 6,75 x 105 5,83
HA 0,001Pr c ND (< 25) - 1,9 x 106 6,28
HA 0,001Im a ND (< 25) - 4,1 x 106 6,61
HA 0,001Im b ND (< 25) - 2,0 x 106 6,30
HA 0,001Im c ND (< 25) - 6,3 x 106 6,80
HA 0,01Pr a ND (< 25) - ND (< 25)* -
HA 0,01Pr b ND (< 25) - ND (< 25) -
HA 0,01Pr c ND (< 25) - ND (< 25) -
HA 0,01Im a ND (< 25) - 7,0 X 102 2,85
HA 0,01Im b ND (< 25) - 2,3 X 102 2,36
HA 0,01Im c ND (< 25) - 2,5 X 102 2,40
HA 0,1Im a ND (< 25) - ND (< 25) -
HA 0,1Im b ND (< 25) - ND (< 25) -
HA 0,1Im c ND (< 25) - ND (< 25) -
HA 0,1Pr a ND (< 25) - ND (< 25) -
HA 0,1Pr b ND (< 25) - ND (< 25) -
HA 0,1Pr c ND (< 25) - ND (< 25) -
* ND = não detectado (abaixo do limite de detecção)
Pode-se verificar também através dos dados da Tabela 1 que as amostras
obtidas por precipitação e imersa com 0,001M de prata não exerceram atividade
antibacteriana. Dentre as amostras produzidas com 0,01M de prata, as obtidas pelo
processo de precipitação apresentaram forte ação bactericida, uma vez que as
contagens de S. aureus foram inferiores a 25 UFC. As amostras obtidas por imersão
apresentaram log UFC entre 2,36 e 2,85, com uma redução de aproximadamente
três ciclos logarítmicos (1000 reduções).Para as amostras correspondentes aos três
diferentes tratamentos contendo 0,1M de prata, as contagens de S. aureus foram
inferiores a 25 UFC, indicando elevada ação bactericida.
Quando comparamos os resultados dos ensaios qualitativos (teste de difusão
em Agar) com os resultados dos ensaios quantitativos (ensaio microbiológico de
contagem de bactérias) podemos observar que a ação bactericida, no ensaio de
contagem de bactérias, das amostras obtidas por precipitação com concentrações
0,1M e 0,01M de Ag é maior quando comparada com as amostras obtidas por
54
imersão nas mesmas concentrações de Ag. Já no ensaio qualitativo, temos a
formação dos maiores halos de difusão para as amostras de HAAg obtidas por
imersão nas concentrações 0,1M e 0,01M. Isto pode ser explicado pelo fato das
amostras de HAAg utilizadas no ensaio de contagem de bactérias estarem na forma
de pó, e com isso a superfície de contato com os microorganismos é maior, e ser um
meio líquido, permitindo a mobilidade da prata não só da superfície da HA mas
também da Ag que está na estrutura da mesma. Já no ensaio de disco de difusão
em Agar, as amostras são utilizadas na forma de pastilhas e o meio é sólido, ou
seja, a superfície de contato da HAAg com o microorganismo é menor e a
mobilidade da Ag da HA também é menor, neste caso somente a Ag mais superficial
das amostras reage com o microorganismo, que são os casos das amostras obtidas
por imersão nas concentrações 0,1M e 0,01M de Ag.
55
6. CONCLUSÕES
As hidroxiapatitas dopadas com prata obtidas pelos métodos de precipitação
química e imersãocom concentrações de 0,1M; 0,01M e 0,001M de AgNO3
mostraram através dos difratogramas de raios X a presença da prata metálica
identificada pelos picos em 238,1º e 44,3º. Nas amostras obtidas por precipitação
com concentrações 0,01M e 0,001M de AgNO3 pode-se observar a formação da fase
AgO caracterizada pelo pico em 237,5º.
As análises no espectrômetro de infravermelho mostraram a presença das
principais bandas vibracionais para as a hidroxiapatita, concluindo que independente
do método de obtenção das amostras de HAAg não há alterações significativas na
estrutura da HA.
Pelas técnicas de caracterização de MEV e EDS permitiu, ainda, identificar os
elementos constituintes de forma semi-quantitativa (Figuras 10 e 11). É possível
notar os picos altos de Ca, P e O que são os principais elementos que compõe a
hidroxiapatita além do pico Ag, assim sendo, não há dúvidas de que os pontos
brilhantes são a prata.
Neste estudo as avaliações quantitativas in vitro da atividade antibacteriana
mostraram que as hidroxiapatitas com prata nas concentrações 0,1M e 0,01M de
AgNO3 obtidas tanto pela precipitação química quanto por imersão, possuem uma
ação antimicrobiana para bactérias Gram-positivas, Staphylococcus aureus. No
entanto as amostras obtidas por precipitação foram mais eficientes para estas
concentrações de prata. Analisados em conjunto as amostras HAAg0,1Pr,
HAAg0,01Im e HAAg0,001Im mostram os melhores resultados, por apresentarem
inibição do crescimento bacteriano em diferentes concentrações.
As avaliações qualitativas da atividade antimicrobiana mostraram a formação
dos halos de difusão apenas para as cepas S. aureus e ao redor dos discos das
amostras obtidas por imersão com concentrações de 0,1M e 0,01M. Notou-se um
pequeno halo ao redor do disco da amostra HAAg com 0,1M de AgNO3 obtida por
precipitação. Para as cepas E. coli não houve formação de halo no ensaio de teste
de difusão, portanto nenhuma amostra mostrou-se com efeito antimicrobiano para
esta bactéria da classe Gram positiva.
Considerando a princípio os efeitos antibacterianos aliados a metodologia
simples e de baixo custo envolvido na produção destes materiais sintetizados, tanto
56
por precipitação química quanto por imersão, sugere-se que hidroxiapatitas
contendo entre 0,1 e 0,01M de prata podem ser mais favoráveis para o
desenvolvimento proposto visando futuras aplicações biomédicas.
57
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