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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE
REGIONAL JATAÍ
DETECÇÃO DE IMUNOCOMPLEXOS CIRCULANTES EM
AMOSTRAS DE SORO DE PACIENTES COM DIABETES MELLITUS
INFECTADOS POR Strongyloides stercoralis
ÉMELIN ALVES DOS SANTOS
JATAÍ - GO
2016
ÉMELIN ALVES DOS SANTOS
DETECÇÃO DE IMUNOCOMPLEXOS CIRCULANTES EM
AMOSTRAS DE SORO DE PACIENTES COM DIABETES MELLITUS
INFECTADOS POR Strongyloides stercoralis
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Goiás, como requisito parcial
para obtenção do título de mestre em
Ciências Aplicadas à Saúde.
Orientadora
Profª. Drª. Rosângela Maria Rodrigues
JATAÍ - GO
2016
DETECÇÃO DE IMUNOCOMPLEXOS CIRCULANTES EM
AMOSTRAS DE SORO DE PACIENTES COM DIABETES MELLITUS
INFECTADOS POR Strongyloides stercoralis
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO:
Profª. Drª. Rosângela Maria Rodrigues
Universidade Federal de Goiás – Regional Jataí
Orientador
Profª. Drª. Ivanildes Solange da Costa Barcelos
Universidade Federal de Goiás – Regional Jataí
Membro
Profª. Drª. Eleuza Rodrigues Machado
Universidade de Brasília
Membro
Data: 04/04/2016
Dedico aos meus amados pais e irmã pelo
amor incondicional e apoio em todas as
minhas decisões.
AGRADECIMENTOS
A Deus por me tranquilizar frente a tantos obstáculos e não me deixar desanimar com as
dificuldades.
Aos meus pais Irani Alves de Almeida Santos e João Eurípedes dos Santos Vieira, que me
fazem crescer como pessoa, que sempre apoiaram em meus estudos, trazendo incentivos,
confiança e força para que eu pudesse concluir mais esta etapa da minha vida. Amo vocês!
A minha irmã Évelin Alves dos Santos, pelo amor, carinho e amizade, minha companheira de
todas as horas.
Ao meu namorado Thiago Assis Carvalho Vasconcelos, seu carinho, amor e companheirismo
foram essenciais para que eu chegasse até aqui.
A minha querida orientadora Profª. Drª. Rosângela Maria Rodrigues, que nunca mediu
esforços para auxiliar em meus trabalhos, sempre me incentivou e confiou em meu potencial.
Foi um privilégio aprender com você, sempre será meu espelho de generosidade, dedicação,
perseverança e competência.
Aos meus amigos do Laboratório de Parasitologia Natane Barcelos, Vanessa Carvalho,
Laura Vilela, Marcia Carolina, Bruna Campos, Dayane Moraes, Arthur Perillo, Lorena
Freitas, Jefferson Elias, Eduardo Cabral e João Batista, pelos momentos de descontração
após dias de muito trabalho.
Aos meus amigos do Laboratório de Microbiologia Juliano Lima e Thaynara Gonzaga, pelos
momentos vividos que tive a honra de partilhar com vocês, pelos cafés na cozinha do
laboratório e pelas ótimas risadas.
Em especial, agradeço minha amiga Natane Barcelos por estes dois anos partilhando a vida,
os sonhos, as tristezas, alegrias e conhecimento. Foram ótimos momentos juntas que serão
inesquecíveis. Vanessa Carvalho, que com tão pouco tempo conquistou minha amizade e me
mostrou o verdadeiro significado de simplicidade e bondade. A Laura Vilela que tanto
contribuiu na execução deste trabalho, me ensinando a ter mais calma e paciência.
A minha amiga de longa data Julliane Chaves Arruda, que mesmo longe sei que sempre
esteve torcendo por mim.
A Natália Sousa minha amiga, parceira e confidente, que esteve ao meu lado nos melhores e
piores momentos, sempre me dando força para continuar.
A Ana Carolina Ferreira Franco, quem me acolheu nos momentos mais difíceis de adaptação
e tanto ajudou na ausência de meus pais.
Ao Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Uberlândia, em especial a Drª.
Ana Lúcia Ribeiro Gonçalves e a Profª. Drª. Júlia Maria Costa-Cruz, pela colaboração e
parceria no desenvolvimento deste trabalho.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG), por todo apoio financeiro
recebido.
A Universidade Federal de Goiás - Regional Jataí, a todos os professores do curso de
Biomedicina e do Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Saúde, por todo
conhecimento que foi transmitido a mim.
A cidade de Jataí, Goiás que me acolheu durante estes seis anos.
“O maior inimigo do conhecimento não é a
ignorância, mas sim a ilusão de conhecimento”.
Stephen Hawking
RESUMO
A estrongiloidíase é predominante principalmente em regiões de climas tropicais e
subtropicais, podendo apresentar-se assintomática quando limitada ao trato gastrointestinal.
No entanto, a imunodepressão pode levar a quadros de hiperinfecção e disseminação das
larvas. O Diabetes Mellitus (DM) provoca disfunção do sistema imune, tornando o indivíduo
mais susceptível a infecções secundárias, como a estrongiloidíase. A cronicidade da doença
neste grupo de pacientes dificulta o seu diagnóstico, fato este que tem levado a pesquisa de
novas metodologias, como a detecção de imuncomplexos circulantes. Atualmente, existem
poucos relatos na literatura sobre a avaliação do perfil imunológico da estrongiloidíase em
pacientes com DM, sendo a investigação epidemiológica desta doença importante para o
acompanhamento do número de casos. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo
determinar os níveis séricos de anticorpos IgG específicos e imunocomplexos circulantes em
amostras de soros de pacientes infectados e de indivíduos controle negativo, por ELISA. A
pesquisa foi realizada com pacientes atendidos no ambulatório de diabetes da prefeitura de
Jataí - GO e indivíduos não diabéticos residentes no município. A autorização para coleta das
amostras de sangue foi obtida pela assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE), sendo os indivíduos caracterizados em dois grupos: Grupo I pacientes portadores de
DM1 e 2, Grupo II indivíduos controle negativo para S. stercoralis e DM. As amostras de
soro foram testadas pela técnica imunoenzimática ELISA para detecção de IgG e
imunocomplexos circulantes. Foram analisadas 50 amostras de soro do Grupo I e 50 do
Grupo II, sendo que 30% eram do sexo masculino e 70% do sexo feminino, para ambos os
grupos. Um total de 19 (38%) amostras de soro foram reagentes para IgG no Grupo I e 2 (4%)
para o Grupo II, sendo a maioria do sexo feminino com faixa etária entre 57 e 69 anos. Para
detecção de imunocomplexos circulantes, apenas uma amostra foi reagente no Grupo I (2%) e
nenhuma no Grupo II (0%). A soroprevalência para detecção de IgG anti-Strongyloides em
pacientes diabéticos foi elevada quando comparado ao grupo controle, enquanto que a
detecção de imunocomplexos circulantes no Grupo I foi baixa. Neste contexto, ressalta-se a
importância da realização da pesquisa de imunocomplexos por ELISA como ferramenta
complementar para o diagnóstico da infecção ativa por S. stercoralis.
Palavras-chave: diabéticos, ELISA, estrongiloidíase, imunodiagnóstico
ABSTRACT
Strongyloidiasis is mainly predominant in regions of tropical and subtropical climates may
present asymptomatic limited to the gastrointestinal tract. However, immunosuppression can
cause hyperinfection and dissemination of larvae. Diabetes Mellitus (DM) causes immune
dysregulation, became the individual more susceptible to secondary infections as
strongyloidiasis. The chronicity of the disease in this group patients difficult the diagnosis,
this fact conduct to research new methodologies such as circulating immune complex
detections. Currently, there are few reports in literature on the evaluation immunological
profile of strongyloidiasis in patients with DM and epidemiological research this disease
important for monitoring the number of cases. In this context, this study had as objective
determine serum levels of specific IgG antibodies and circulating immune complex in serum
samples of infected patients and control individuals negative by ELISA. The survey was
conducted with patients attended at the diabetes ambulatory in Jataí - GO and nondiabetic
individuals residing in the city. The authorization for collect blood samples was obtained by
signature Term of Informed Consent (TIC) it is characterized individuals in two groups:
Group I patients with DM1 and 2, Group II individuals negative control for S. stercoralis and
DM. Serum samples were tested by ELISA for detection of IgG and circulating immune
complexes. We analyzed 50 serum samples from Group I and 50 in Group II, 30% were male
and 70% female, for both groups. A total of 19 (38%) serum sample were positive for IgG in
Group I and 2 (4%) for Group II, the majority were female age between 57 and 69 years. For
detection circulating immune complexes only one sample was positive in Group I (2%) and
Group II (0%). The seroprevalence of IgG anti-Strongyloides detection in diabetic patients
was high when compared to the control group, detection of circulating immune complexes in
Group I was low. In this context, we emphasize the importance the realization of immune
complex research by ELISA as complementary tool in diagnosis of active infection S.
stercoralis.
Keywords: diabetics, ELISA, strongyloidiasis, immunodiagnostic
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Formas evolutivas de S. stercoralis. An: ânus; Es: esôfago; Ut: útero; Vu: vulva;
Ov: ovário; In: intestino; Cl: cloaca; Ep: espículo; Bo: boca; Te: testículo; Vb: vestíbulo
bucal; Pg: primórdio genital; Ca: cauda entalhada. ................................................................. 15
FIGURA 2- Ciclo de vida do parasito S. stercoralis ............................................................... 17
FIGURA 3- Distribuição de estrongiloidíase mundialmente, observando endemicidade nos
continentes latino-americano, africano e asiático .................................................................... 19
FIGURA 4- Detecção de anticorpos IgG anti-Strongyloides e imunocomplexo expressos em
Índice ELISA de 50 pacientes diabéticos (Grupo I). A linha tracejada indica o limiar de
reatividade (IE > 1,0) ............................................................................................................... 36
FIGURA 5- Detecção de anticorpos IgG anti-Strongyloides e imunocomplexo expressos em
Índice ELISA de 50 indivíduos controles não diabéticos e copronegativos para S. stercoralis
(Grupo II). A linha tracejada indica o limiar de reatividade (IE > 1,0) .................................. 37
FIGURA 6- Frequência de positividade para ELISA IgG e imunocomplexo (média
geométrica) dos Grupos I e II, expressos em IE. Cut-off > 1,0 (linha tracejada); *** p <
0,001 ........................................................................................................................................ 38
FIGURA 7- Níveis de anticorpos IgG anti-Strongyloides, expressos em índice ELISA (IE)
utilizando extrato antigênico heterólogo de S. venezuelensis em 50 amostras de soros de
pacientes do Grupo I e 50 amostras de soros controles (copronegativos; Grupo II). A linha
tracejada indica o limiar de reatividade (IE > 1,0)***p<0,001 ............................................... 39
FIGURA 8- Distribuição da positividade para os pacientes do Grupo I e controles do Grupo II
positivos para IgG anti- larvas de S. venezuelensis, em relação ao gênero e faixa etária ....... 40
FIGURA 9- Níveis de imunocomplexos circulantes, expressos em índice ELISA (IE) em 50
amostras de soros de pacientes do Grupo I e 50 amostras de soros controles (copronegativos;
Grupo II). A linha tracejada indica o limiar de reatividade (IE > 1,0) .................................... 40
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Distribuição das 100 amostras de soro dos grupos I e II testadas pela técnica de
ELISA para detecção de IgG anti- larvas de S. venezuelensis e imunocomplexo, segundo sexo
e faixa etária............................................................................................................................. 35
LISTA DE SIGLAS
ºC ............................................................................................................................ Graus Celsius
% .............................................................................................................. Por cento/porcentagem
µg .............................................................................................................................. Micrograma
µl ................................................................................................................................... Microlitro
µm .............................................................................................................................. Micrometro
1n ................................................................................................................... ................Haplóide
2n ............................................................................................................... .....................Diplóide
3n ........................................................................................................................ ...........Triplóide
ADCC .............................................................. Citotoxicidade celular dependente de anticorpos
APC ......................................................................................... Célula apresentadora de antígeno
CoEP .............................................................................................. Comitê de Ética em Pesquisa
DM .................................................................................................................... Diabetes Mellitus
DMG ............................................................................................................ Diabetes gestacional
DNA ...................................................................................................Ácido desoxirribonucleico
DO ....................................................................................................................Densidade Óptica
ELISA .............................................................................. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
g ................................................................................................................................... Gravidade
GO ....................................................................................................................................... Goiás
Grupo I ..................................................................................... Pacientes portadores de DM1 e 2
Grupo II ............................................................................................ Pacientes controle negativo
HCl ..................................................................................................................... Ácido clorídrico
HIV ....................................................................................... Vírus da imunodeficiência humana
H2O2 .........................................................................................................Peróxido de hidrogênio
H2SO4 .................................................................................................................. Ácido sulfúrico
IC ........................................................................................................................ Imunocomplexo
IE ............................................................................................................................ Índice ELISA
IFI .................................................................................................... Imunofluorescência Indireta
IFN-γ ................................................................................................................... Interferon gama
Ig ..........................................................................................................................Imunoglobulina
IL ............................................................................................................................... Interleucina
Kg .............................................................................................................................. Quilograma
L1 ........................................................................................ Larva rabditoide de primeiro estádio
L2 ........................................................................................ Larva rabditoide de segundo estádio
L3 ......................................................................................................................... Larva filarioide
L4 .......................................................................... Estádio de diferenciação de larvas filarioides
M ................................................................................................................................ Molaridade
mg .................................................................................................................... Média geométrica
mg ............................................................................................................................... Miligrama
MG ........................................................................................................................... Minas Gerais
Min .................................................................................................. ................................Minutos
mL ....................................................................................................................................Mililitro
mm ................................................................................................................................ Milímetro
MODY ....................................................................................... Outros tipos específicos de DM
NaOH ............................................................................................................. Hidróxido de sódio
nm ............................................................................................................................... Nanômetro
OPD ........................................................................................................... Orto-fenilenodiamina
PBS ........................................................................................................... Tampão fosfato salino
PBS-T ................................................................................................... PBS acrescido de Tween
PBS-TM ............................................................................... PBS-T acrescido de leite desnatado
PCR .......................................................................................... Reação em Cadeia da Polimerase
PECDM .............................................................. Programa de Educação e Controle de Diabetes
pH ......................................................................................................... Potencial hidrogeniônico
PR ................................................................................................... ...................................Paraná
RT-qPCR ...................................... Reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real
sp ....................................................................................................................... ................Espécie
TCLE .................................................................... Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Th1 ........................................................................................................... Células T helper tipo 1
Th2 ........................................................................................................... Células T helper tipo 2
T reg ........................................................................................................... Células T reguladoras
Tween .................................................................................. Polioxietilensorbitano-monolaurato
UFG ............................................................................................. Universidade Federal de Goiás
WB ......................................................................................................................Western blotting
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 14
1.1 Aspectos morfológicos de S. stercoralis ......................................................................... 14
1.2 Ciclo biológico ................................................................................................................ 16
1.3 Epidemiologia .................................................................................................................. 18
1.4 Resposta imune do hospedeiro ........................................................................................ 19
1.5 Aspectos clínicos ............................................................................................................ 21
1.6 Diagnóstico ...................................................................................................................... 22
1.7 Diabetes mellitus e infecção por S. stercoralis................................................................ 25
1.8 Tratamento da estrongiloidíase ........................................................................................ 27
2 OBJETIVOS .................................................................................................................... 30
2.1 Geral ................................................................................................................................ 30
2.2 Específicos ....................................................................................................................... 30
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 31
3.1 Aspectos éticos da pesquisa ............................................................................................. 31
3.2 Caracterização da população estudada ............................................................................ 31
3.3 Critérios de inclusão e exclusão dos participantes da pesquisa ....................................... 31
3.4 Coleta de sangue .............................................................................................................. 32
3.5 Obtenção de extrato alcalino de S. venezuelensis ............................................................ 32
3.6 Dosagem de anticorpo IgG específico ............................................................................. 32
3.7 Detecção de imunocomplexos circulantes ....................................................................... 33
3.8 Normas de biossegurança ................................................................................................ 34
3.9 Análise estatística ............................................................................................................ 34
4 RESULTADOS ............................................................................................................... 35
4.1 Caracterização da população estudada ............................................................................ 35
4.2 ELISA para detecção de IgG anti- larvas de S. venezuelensis e imunocomplexo
circulante ................................................................................................................................. 35
5 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 41
6 CONCLUSÃO .................................................................................................................. 45
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 46
ANEXO A ............................................................................................................................... 64
APÊNDICE I ........................................................................................................................... 68
APÊNDICE II .......................................................................................................................... 70
14
1 INTRODUÇÃO
A estrongiloidíase é uma doença negligenciada, causada principalmente pelo
geohelminto Strongyloides stercoralis que atinge cerca de 30 a 100 milhões de pessoas em
mais de 70 países (AZIRA et al., 2013; SCHÄR et al., 2013). Vários autores demonstraram
que no Brasil, as variações na prevalência dessa parasitose estão diretamente associadas a
fatores, como idade, diferenças geográficas e socioeconômicas (KOBAYASHI et al., 1996;
COSTA-CRUZ et al., 1998; MACHADO; COSTA-CRUZ, 1998; OLIVEIRA et al., 2002;
PAULA; COSTA-CRUZ, 2011), sendo Minas Gerais, Amapá, Goiás e Rondônia os estados
de maior ocorrência da estrongiloidíase (BRASIL, 2010).
O gênero Strongyloides pertence ao reino Animalia, sub-reino Metazoa, filo
Nematoda, classe Secernentasida, ordem Rabdiasoidea, família Strongyloididae (MELO,
2011; REY, 2011). Atualmente são conhecidas 52 espécies, no entanto apenas duas delas, S.
stercoralis e S. fuelleborni, são capazes de causar infecções no homem (MORAIS et al.,
2014). S. stercoralis é a espécie de maior importância clinica apresentando distribuição
mundial, enquanto que S. fuelleborni é encontrada esporadicamente na África, Filipinas e
Nova Guiné (GROVE, 1996; SIDDIQUI; BERK et al., 2001).
Geralmente, em indivíduos imunocompetentes a estrongiloidíase é assintomática,
limitando-se somente ao trato gastrointestinal. No entanto, pode ocorrer hiperinfecção e
invasão sistêmica do parasito em seu estágio de larva nos indivíduos que fazem uso de
corticosteroides, diabéticos, portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), etilistas,
pacientes com neoplasias, lúpus eritematoso sistêmico, dentre outros, podendo levar a óbito
(KEISER; NUTMAN, 2004; FREITAS; SOUZA, 2007; DE BONA; BASSO, 2008; SILVA
et al., 2014).
1.1 Aspectos morfológicos de S. stercoralis
O nematódeo S. stercoralis apresenta diferentes formas evolutivas durante o seu
ciclo de vida, sendo elas a fêmea partenogenética, fêmea e macho de vida livre, larva
rabditoide, larva filarioide e ovo, como representado na Figura 1 (GROVE, 1996).
As fêmeas partenogenéticas são cilíndricas, podem alcançar de 1,7 a 2,5 mm de
comprimento, são revestidas por uma cutícula delgada e apresentam esôfago filariforme.
Enquanto que as fêmeas de vida livre são fusiformes, medem cerca de 0,8 a 1,2 mm, são
recobertas por uma cutícula fina e possuem esôfago curto do tipo rabditoide. Ambas as
15
fêmeas apresentam extremidade posterior afilada. Os machos de vida livre são fusiformes
com tamanho aproximado de 0,7 mm de comprimento, possuem aparelho digestivo simples
com esôfago do tipo rabditoide e extremidade posterior recurvada ventralmente, com presença
de dois espículos utilizados para a cópula (VINEY; LOK, 2007; COSTA-CRUZ, 2011).
As larvas rabditoides (L1 e L2) medem cerca de 250 a 300 µm de comprimento,
possuem vestíbulo bucal curto, esôfago do tipo rabditoide e extremidade posterior afilada
(KOZUBSKY; ARCHELLI, 2004). Enquanto que as larvas filarioides (L3) são as formas
infectantes e apresentam aproximadamente 500 µm de comprimento, esôfago longo do tipo
filarioide e cauda afilada entalhada (ARANGO, 1998).
Os ovos são elípticos e transparentes podendo medir de 0,05 a 0,07 mm quando
originados da fêmea partenogenética e de vida livre, respectivamente. Raramente são
observados nas fezes dos indivíduos infectados e no seu interior podem ser encontradas larvas
L1 (COSTA-CRUZ, 2011).
Figura 1- Formas evolutivas de S. stercoralis. An: ânus; Es: esôfago; Ut: útero; Vu: vulva; Ov: ovário; In:
intestino; Cl: cloaca; Ep: espículo; Bo: boca; Te: testículo; Vb: vestíbulo bucal; Pg: primórdio
genital; Ca: cauda entalhada. Fonte: Adaptado Costa-Cruz, In: Neves (2011).
16
1.2 Ciclo biológico
O ciclo de vida do geohelminto S. stercoralis é monoxênico, apresentando uma fase
no homem (ciclo direto) e outra no solo (ciclo indireto) (KEISER; NUTMAN, 2004; WOLL
et al., 2013). As fêmeas partenogenéticas são triploides (3n) e responsáveis por realizar a
postura de ovos larvados no duodeno (GENTA, 1992). Em seguida, os ovos eclodem e
liberam larvas rabditoides triploides (3n) que dão continuidade ao ciclo direto, larvas
rabditoides diploides (2n), que se diferenciam em fêmeas de vida livre e larvas rabditoides
haploides (1n), que dão origem aos machos de vida livre, completando o ciclo indireto
(COSTA-CRUZ, 2011).
O ciclo direto prossegue-se em condições ideais de solo, temperatura e umidade no
qual as larvas rabditoides eliminadas pelas fezes se diferenciam em larvas filarioides
infectantes. Estas podem penetrar de forma ativa na pele do hospedeiro humano ou pela
mucosa e esôfago através da ingestão de alimentos contaminados. Logo em seguida, as larvas
atravessam os tecidos, com o auxílio de enzimas proteolíticas que secretam, alcançando a
circulação sanguínea chegando ao coração e capilares pulmonares, onde sofrem muda para
L4. Posteriormente, as larvas L4 ascendem à árvore brônquica alcançando a faringe podendo
ser expelidas ou são deglutidas e vão para o intestino delgado se diferenciando em fêmeas
partenogenéticas (ARANGO, 1998; SILVA, 2008).
No ciclo indireto, as larvas rabditoides diploides e haploides sofrem quatro mudas e
dão origem às fêmeas e machos de vida livre, respectivamente. Após o acasalamento, as
fêmeas realizam a postura dos ovos que eclodem e liberam larvas rabditoides, que após duas
mudas, se diferenciam em larvas filarioides infectantes completando o ciclo indireto
(LAIGNIER, 2011) (Figura 2).
17
As formas de transmissão da estrongiloidíase humana podem ocorrer por
mecanismos de auto-infecção ou hetero-infecção (MORAIS et al., 2014). A primeira pode ser
classificada como externa, na qual as larvas rabditoides se diferenciam em filarioides e
penetram na região perianal alcançando a circulação sanguínea, ou interna, decorrente da
diferenciação de larvas rabditoides em filarioides ainda na parede intestinal do indivíduo. Na
auto-infecção interna podem ocorrer complicações levando a quadros graves devido a
disseminação de larvas filarioides por vários órgãos, resultando em estrongiloidíase sistêmica
ou hiperinfecção (CARRADA-BRAVO, 2008; COSTA-CRUZ, 2011). Na hetero-infecção, o
indivíduo desenvolve estrongiloidíase devido à penetração ativa das larvas infectantes na pele
íntegra ou pela ingestão acidental das mesmas em alimentos contaminados (MEJIA;
NUTMAN, 2012).
FIGURA 2 – Ciclo de vida do parasito S. stercoralis. Fonte: Adaptado
http://www.cdc.gov/dpdx/strongyloidiasis/index.html (2013)
18
1.3 Epidemiologia
A estrongiloidíase apresenta distribuição heterogênea sendo responsável por altos
índices de morbidade e mortalidade (CROKER et al., 2010; SCHÄR et al., 2013).
Predominante principalmente em regiões de climas tropicais e subtropicais, esta doença é
endêmica nos países em desenvolvimento localizados na Ásia, África Subsaariana e América
Latina (BOULWARE et al., 2007; ALQARAWI et al., 2015), conforme demonstrado na
Figura 3.
No continente asiático, pesquisa realizada em Takéo situada no sul do Camboja,
apontou positividade para estrongiloidíase de 21% (KHIEU et al., 2014b). Na Tailândia,
Anamnart et al. (2010) utilizando diferentes métodos diagnósticos verificaram ocorrência da
doença em 28% da população, enquanto que no Irã esta frequência apresentou-se mais
elevada, 42% (ASHRAFI et al., 2010).
Nos países africanos a prevalência de S. stercoralis varia entre 0,1% a 91,8% (BRAZ
et al., 2015). Estudos realizados por Assefa et al. (2009) e Getaneh et al. (2010) na Etiópia em
pacientes HIV positivos e negativos, demonstraram positividades para a estrongiloidíase no
país de 12,6% e 12%, respectivamente. Elevada prevalência também foi observada na
Tanzânia em crianças durante período escolar, cuja pesquisa revelou uma ocorrência de
10,2% desta infecção (KNOPP et al., 2009).
A estrongiloidíase é elevada na América Latina, apresentando no norte da Argentina
positividade de 29,4% em pacientes atendidos no Instituto de Pesquisa de Doenças Tropicais
(KROLEWIECKI et al., 2010). Enquanto que na cidade peruana de Puerto Maldonado a
prevalência estimada foi de 20% (EGIDO et al., 2001). Por outro lado, em áreas esporádicas
como os Estados Unidos e Espanha, a maioria dos casos reportados são de indivíduos
imigrantes ou viajantes de países endêmicos (AZIRA et al., 2013; OSTERA; BLUM, 2016).
Estima-se que no Brasil, a prevalência de estrongiloidíase seja de aproximadamente
5,5% (PAULA; COSTA-CRUZ, 2011). Segundo Brasil (2010), as maiores ocorrências são
nos estados de Goiás, Amapá, Rondônia e Minas Gerais. De acordo com pesquisas realizadas
por Paula e Costa-Cruz (2011) em regiões brasileiras, a prevalência encontrada para esta
doença foi de 7,9% na região nordeste, 6,6% no centro-oeste, 5,3% no norte, 4% no sul e
3,9% no sudoeste, classificando o país como hiperendêmico. No município de Ibiporã - PR
foi encontrada uma positividade de 38,5% entre os anos de 2004 a 2006 (VIEIRA;
AMARANTE, 2011). Em Pará de Minas - MG, o nematódeo S. stercoralis foi o helminto
19
mais prevalente dentre os residentes no município, 4,2%. Enquanto que a ocorrência dessa
infecção em crianças de escolas públicas de Jataí - GO foi de 2,9% (SANTOS et al., 2015).
A hiperinfecção por S. stercoralis é decorrente principalmente da deficiência
imunológica (MURALI et al., 2010) e tem sido responsável por um alto número de mortes, o
qual varia entre 15% e 87% dos casos (MARCOS et al., 2008). Mendonça et al. (2006) em
levantamento epidemiológico no município de Uberlândia - MG, demonstraram prevalência
de estrongiloidíase em pacientes diabéticos de 3,8%, usando o diagnóstico parasitológico de
fezes, e de 23%, por meio de técnicas imunológicas.
1.4 Resposta imune do hospedeiro
A resposta imune desencadeada durante infecção pelo nematódeo S. stercoralis ainda
é pouco elucidada, uma vez que a maioria dos experimentos é realizado em roedores
infectados por espécies que apresentam diferentes características (IRIEMENAM et al., 2010;
RAMÍRIZ-OLIVENCIA et al., 2014).
Geralmente em infecções helmínticas há uma indução de resposta do tipo T helper 2
(Th2), com produção de interleucinas (IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13),
eosinófilos, neutrófilos, mastócitos, anticorpos Imunoglobulina A (IgA), IgE, IgM, IgG1,
IgG4 e hiperplasia de células caliciformes (TAYLOR et al., 2012; GAUSE et al., 2013;
FIGURA 3– Distribuição de estrongiloidíase mundialmente, observando endemicidade nos continentes
latino-americano, africano e asiático. Fonte: Adaptado Puthiyakunnon et al. (2014)
20
RODRIGUES et al., 2013). Além disso, macrófagos e células B e T reguladoras também são
recrutados durante este processo inflamatório (GIRGIS et al., 2013).
Logo após a primeira infecção por S. stercoralis, há estimulação do sistema imune
inato com consequente indução de eosinófilos, neutrófilos e sistema complemento, que
constituem barreiras importantes e auxiliam na resposta imune adaptativa (WOLL et al.,
2013). Na resposta imune adaptativa, os linfócitos T desenvolvem um papel fundamental ao
ativar uma resposta do tipo Th2 produtoras de IL-4, IL-5 e IL-13, que por sua vez estão
envolvidas na indução de anticorpos IgE, ativação de mastócitos e eosinófilos que são
essenciais na eliminação do parasito (HÜBNER et al., 2012; MATSUMOTO et al., 2013;
BRELOER; ABRAHAM, 2016). Por esse motivo, quando há uma redução no nível de células
Th2, a possibilidade da ocorrência de disseminação e hiperinfecção se tornam elevadas
(BENINCASA et al., 2007).
Os mastócitos são ativados por anticorpos IgG e IgE conferindo a eles capacidade de
secretar IL-4, IL-5, leucotrienos, quimiocinas, proteases, heparina e sintetizar grânulos de
histamina (BUI VAN, 2009; YASUDA et al., 2014). Esta última age diretamente contra o
parasito e ativa outras células de defesa, tais como os eosinófilos (PORTO et al., 2002), que
são células efetoras capazes de auxiliar na morte das larvas ao liberarem citocinas e
quimiocinas, se comportando como células apresentadoras de antígeno (APC) (GALIOTO et
al., 2006; PADIGEL et al., 2006; DE VEER et al., 2007; STEIN et al., 2009; SHETH et al.,
2014).
Os eosinófilos também podem desenvolver mecanismo de citotoxicidade celular
dependente de anticorpos (ADCC), no qual eles se infiltram em torno das larvas L3 liberando
grânulos tóxicos. Estudos demonstraram que na fase assintomática ou leve da doença tem-se
observado altos níveis de IgE, enquanto que os mesmos apresentam baixas quantidades na
forma grave (PORTO et al., 2002).
Pacientes com quadros de disseminação, apresentam baixos níveis de IgM e IgG
(GONÇALVES, 2011a). Os anticorpos IgM podem ativar o sistema complemento auxiliando
na morte do parasito (BONNE-ANNÉE et al., 2013). As frações IgG1 e IgG4 são
predominantes no soro de indivíduos com estrongiloidíase, sendo o primeiro importante para
a proteção do hospedeiro e o segundo na cronicidade da doença, uma vez que IgG4 são
capazes de inibir a resposta protetora produzida por IgE (RODRIGUES et al., 2007).
Os imunocomplexos (IC) são formados a partir da ligação de antígenos parasitários a
anticorpos específicos produzidos pelo hospedeiro, que podem ser detectados no soro de
pacientes durante infecção ativa pela técnica de Enzyme Linked Immunosorbent Assay
21
(ELISA), sendo eles importantes para a ativação do sistema complemento (ITURRY-
YAMAMOTO; PORTINHO, 2001; GONÇALVES et al., 2012a). As quantidades de
antígenos e anticorpos circulantes influenciam diretamente no tamanho dos imunocomplexos,
os quais são extensos (zona de equivalência) na presença de altas concentrações de antígenos
e anticorpos (ABBAS et al., 2011). Imunocomplexos extensos podem prejudicar sua
depuração, a qual é decorrente da interação do componente C3b com o receptor de
complemento CR1, os quais permitem o transporte dos imunocomplexos até o fígado e baço,
onde são eliminados por macrófagos (MARZOCCHI-MACHADO et al., 1997; CRUVINEL
et al., 2010).
No entanto, quando esses imunocomplexos não são removidos adequadamente,
podem se depositar nos tecidos levando a quadros de nefrite e vasculite (ABBAS et al., 2011).
Os imunocomplexos são estudados na esquistossomose e podem desenvolver durante a fase
crônica mecanismos imunomoduladores que são capazes de suprimir a reação granulomatosa,
induzindo a produção de prostaglandina E, que reduz os níveis de TNF-α e eleva os de IL-10
(REZENDE et al., 1997).
1.5 Aspectos clínicos
A interação entre S. stercoralis e o hospedeiro humano é complexa em decorrência
de sua capacidade intrínseca de reprodução, existindo em indivíduos infectados três
possibilidades de evolução: a erradicação da infecção, a cronicidade decorrente da auto-
infecção e a possibilidade de hiperinfecção ou disseminação (COSTA-CRUZ, 2011).
Indivíduos imunocompetentes infectados por S. stercoralis são assintomáticos em
50% dos casos, enquanto que os outros apresentam sintomas leves (GETANEH et al., 2010).
Quando sintomática, pode provocar distúrbios gastrointestinais como dores abdominais ou
epigástricas, perda ponderal, náuseas, vômitos, diarreia e problemas pulmonares como falta de
ar, tosse e asma (WOLL et al., 2013; BRAZ et al., 2015). Além disso, a penetração ativa das
larvas pela pele pode provocar sinais dermatológicos, como a presença de urticária,
comichões e migração das larvas (larva currens) (KHIEU et al., 2014a; MAKKER et al.,
2015).
Nos pacientes imunodeprimidos em decorrência de lúpus eritematoso sistêmico,
câncer, DM, tratamento com imunossupressores, dentre outros (AZIRA et al., 2013;
MATSUMOTO et al., 2013; WANG et al., 2013), a estrongiloidíase pode levar a quadros
22
graves de hiperinfecção ou disseminação (MEJIA; NUTMAN, 2012; NEUMANN et al.,
2012; GRAVELLONE et al., 2015).
Na forma disseminada da doença, as larvas são capazes de se instalarem em vários
órgãos como vesícula biliar, rins, cérebro, tireoide, coração, pâncreas, fígado, linfonodos e
adrenais (COSTA-CRUZ, 2011). Nesses casos, pode ser observada a ocorrência de infiltrado
pulmonar, febre, dor abdominal, diarreia, além de infecção bacteriana secundária
(NEWBERRY et al., 2005; LAM et al., 2006). Na hiperinfecção há aumento no número de
larvas presentes nos sistemas gastrointestinal e pulmonar (MARCOS et al. 2008; ABANYIE
et al., 2015).
A fase crônica da estrongiloidíase é geralmente assintomática (LUNA et al., 2007),
no entanto pode ocasionar anemia, eosinofilia, palpitações, incontinência urinária e
emagrecimento (COSTA-CRUZ, 2011). Além disso, a doença crônica pode dificultar o
diagnóstico e aumentar a propensão do desenvolvimento de quadros graves principalmente
em pacientes imunodeprimidos, como diabéticos (VELOSO et al., 2008). Vários relatos de
casos de disseminação e hiperinfecção por S. stercoralis em pacientes diabéticos estão
reportados na literatura (COOVADIA et al., 1993; EMAD, 1999; AL-SAJEE; AL-
HAMDANI, 2010; AZIRA; ZEEHAIDA, 2010; MURALI et al., 2010; TIWARI et al., 2012;
SHUKLA et al., 2015; WON et al., 2015).
1.6 Diagnóstico
O diagnóstico da estrongiloidíase pode ser realizado por métodos parasitológicos,
imunológicos e moleculares (MAKKER et al., 2015). O diagnóstico parasitológico utilizado
para detectar S. stercoralis nas fezes (ANAMNART et al., 2010), baseia-se no termotropismo
das larvas pelas técnicas de Baermann (1917), modificado por Moraes (1948) e de Rugai,
Mattos e Brisola (1954). Ambas permitem a visualização direta das formas parasitárias
(GONÇALVES, 2011a) e apresentam baixo custo, porém possuem baixa sensibilidade, uma
vez que a eliminação das larvas ocorre de forma irregular e reduzida (SIDDIQUI; BERK,
2001; ALTINTOP et al., 2010).
O método de cultura em placa de ágar possui maior eficiência, pois permite elevar o
número de larvas aumentando consequentemente a sensibilidade de detecção das mesmas,
devendo ser empregada principalmente em pacientes imunodeprimidos (ARAKAKI et al.,
1988; FREITAS; SOUZA, 2007; INÊS et al., 2011). Como desvantagem, a cultura em placa
de ágar possui alto risco de contaminação com as larvas, é uma técnica demorada e onerosa
23
(ANAMNART et al., 2010). Os exames parasitológicos são até 50% mais sensíveis quando
realizados com pelo menos três amostras de fezes coletadas em dias alternados,
exclusivamente naqueles casos em que a infecção é crônica e assintomática devido à baixa
carga parasitária (SIDDIQUI; BERK, 2001; KOZUBSKY; ARCHELLI, 2004; KHIEU et al.,
2014a; RASCOE et al., 2015).
Os métodos imunológicos têm sido utilizados como complementares no diagnóstico
da estrongiloidíase, uma vez que apresentam maior sensibilidade quando comparado às
técnicas parasitológicas (FELICIANO et al., 2014; BUONFRATE et al., 2015). Dentre eles, o
teste imunoenzimático ELISA tem sido o mais empregado, devido a sua simplicidade e alta
sensibilidade (CHAVES, 2014). No entanto, essa técnica apresenta baixa especificidade
principalmente quando é utilizado o extrato bruto antigênico de S. stercoralis, podendo
ocorrer reatividade cruzada com antígenos de outros helmintos como ancilostomídeos,
Schistosoma mansoni, Ascaris lumbricoides, Taenia sp. e filarídeos, acarretando em
resultados falso-positivos (SUDRÉ et al., 2006; RIGO et al., 2008; INÊS et al., 2012;
SALVADOR et al., 2014). Ao utilizar extrato salino total de S. venezuelensis para detectar
anticorpos IgG anti-S. stercoralis por ELISA, Silva et al. (2014) encontraram sensibilidade e
especificidade de 73,33% e 82,15%, respectivamente.
Vários estudos têm demonstrado que o uso de antígenos heterólogos provenientes de
larvas de S. ratti e S. venezuelensis apresentam resultados semelhantes aos encontrados com a
utilização de antígeno homólogo, além de ser de fácil obtenção e minimizar os riscos de
infecção (COSTA-CRUZ et al., 1997; RODRIGUES et al., 2007; RIGO et al., 2008;
CORRAL et al., 2015).
A técnica de ELISA também pode ser realizada para a pesquisa de coproantígenos
(GONÇALVES et al., 2010). Segundo Gonçalves et al. (2010), a alta sensibilidade da
detecção de antígenos parasitários nas fezes, pode contribuir para o diagnóstico precoce da
estrongiloidíase em indivíduos imunodeprimidos.
A imunofluorescência indireta (IFI) é uma técnica imunológica quantitativa, que
utiliza anticorpos anti-IgG humano marcados com fluorocromo, permitindo que a leitura das
lâminas seja realizada em microscópio de fluorescência (BOSCOLO et al., 2007;
MACHADO et al., 2008). Paula et al. (2015a) utilizando a técnica de IFI, encontraram taxas
de sensibilidade e especificidade de 95,4% e 95,8%, respectivamente. Esse mesmo estudo
demonstrou que a IFI pode ser empregada no rastreio da infecção por S. stercoralis em
indivíduos imunodeprimidos.
24
A técnica de Western blotting (WB) apresenta alta especificidade visto que reduz a
ocorrência de reatividade cruzada com outros nematódeos, podendo ser utilizado como teste
confirmatório no diagnóstico da estrongiloidíase (SILVA et al., 2003). No entanto, consiste
em um método de difícil execução, exige o consumo de muitos reagentes e um maior tempo
para análise dos resultados (YORI et al., 2006; LEVENHAGEM; COSTA-CRUZ, 2014).
Rigo et al. (2008) demonstraram taxas de sensibilidade e especificidade de 100% e 96%,
respectivamente utilizando como antígeno o extrato salino de larvas filarioides. Mendonça et
al. (2006) ao realizar as técnicas imunológicas de ELISA, IFI e WB, demonstraram uma
soroprevalência para estrongiloidíase de 23% em pacientes portadores de DM, enquanto que o
exame parasitológico apresentou uma positividade de 3,8%.
O diagnóstico molecular têm produzido excelentes resultados na pesquisa de ácido
desoxirribonucleico (DNA) do parasito em amostras de fezes, aumentando a chance de
detecção ao apresentar elevada sensibilidade e especificidade (MARRA, 2009; PAULA et al.,
2013). Paula et al. (2015b) encontraram sensibilidade e especificidade de 90% e 85,7%,
respectivamente ao realizarem a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase quantitativo em
tempo real (RT-qPCR). Porém, o PCR é oneroso, de difícil execução e a detecção de DNA do
parasito é prejudicada quando há baixa eliminação de larvas, principalmente em indivíduos na
fase crônica da doença (ZUETER et al., 2014).
Atualmente não existem técnicas consideradas como padrão-ouro (KHIEU et al.,
2014a), por este motivo vários estudos tem conduzido na pesquisa de novas metodologias que
visam melhorar o diagnóstico da estrongiloidíase (VAN DOORN et al., 2007;
KROLEWIECKI et al., 2010). Dentre elas pode-se destacar a pesquisa de imunocomplexos,
os quais são formados durante infecções por S. stercoralis. Os imunocomplexos são antígenos
do parasito ligados a anticorpos específicos presentes no sangue, que podem ser identificados
em amostras de soro de pacientes durante infecção ativa, pela técnica de ELISA
(LEVENHAGEM; COSTA-CRUZ, 2014).
A pesquisa de imunocomplexos circulantes apresentou melhores resultados quando
comparado à pesquisa de antígeno ou anticorpo no soro, principalmente nos casos de
imunodepressão (GONÇALVES et al., 2012a). As taxas de sensibilidade e especificidade
verificadas foram de 93,3% e 86,1%, respectivamente (GONÇALVES et al. 2012c). Em
portadores de diabetes mellitus (DM) a ausência de sintomas além de dificultar o diagnóstico
da estrongiloidíase, pode levar a disseminação de larvas (MENDONÇA et al., 2006). Dessa
forma, ressalta-se a importância da utilização de técnicas sorológicas adicionais, tais como a
25
pesquisa de imunocomplexos circulantes por ELISA, para o rastreio da doença nesse grupo de
pacientes.
1.7 Diabetes mellitus e infecção por S. stercoralis
O DM é uma doença metabólica que assim como a estrongiloidíase atinge milhões de
pessoas no mundo e tem apresentado elevada taxa de mortalidade, sendo considerado um
importante desafio para os sistemas de saúde (SCHMIDT et al., 2011). Além disso, pode
gerar altos gastos e influencia diretamente na qualidade de vida da população (VIGGIANO,
2007; BRASIL, 2013). É responsável por causar alterações nos níveis plasmáticos de glicose
resultando em hiperglicemia crônica (GROSS et al., 2002; FERREIRA et al., 2011). Essa
disfunção pode comprometer o funcionamento de vários órgãos como rins, nervos, olhos,
coração e vasos sanguíneos (HALLER et al., 2005; GIL et al., 2008). Estima-se que a
incidência dessa doença no Brasil seja de 7,6% em indivíduos com idade entre 30 e 69 anos,
podendo ser classificada em quatro grupos: diabetes mellitus tipo 1 (DM1), diabetes mellitus
tipo 2 (DM2), diabetes gestacional (DMG) e outros tipos específicos de DM (MODY)
(PASQUALOTTO et al., 2012).
DM1 acomete cerca de 10 a 20 milhões de pessoas em todo o mundo podendo se
apresentar em qualquer idade, no entanto, a maioria das pessoas é diagnosticada antes dos 20
anos (SESTERHEIM et al., 2007). Trata-se de uma doença autoimune que se manifesta em
indivíduos geneticamente predispostos, caracterizada pela destruição das células beta
pancreáticas produtoras de insulina, principalmente por linfócitos T CD8 (FERNANDES, et
al., 2005; KAHALY; HANSEN, 2016), provocando carência total desse hormônio (BALDA;
PACHECO-SILVA, 1999; RIBEIRO et al., 2010; NOVOTNA et al., 2015).
A insulina tem o papel de levar glicose para o interior das células ao se ligar a
receptores específicos (GUYTON; HALL, 2011). Quando esse hormônio está deficiente, não
há degradação de glicose gerando uma hiperglicemia (SPARAPANI, 2010). Sendo assim,
seus níveis podem ser regulados a partir da administração de insulina exógena, pela prática de
exercícios físicos e alimentação saudável (ALVES et al., 2011). Pacientes com DM1, podem
se tornar menos imunes a infecções e apresentar quadros de polidipsia, poliúria, polifagia,
problemas visuais e emagrecimento (SANTOS et al., 2012).
Estima-se que cerca de 173 milhões de pessoas mundialmente são portadoras de
DM2 e sua ocorrência geralmente está ligada ao sobrepeso (MEDEIROS et al., 2012). No
entanto, outros fatores predispõem seu surgimento tais como a etnia, sexo, idade, caso de
26
diabetes na família, sedentarismo e glicemia elevada (VASCONCELOS et al., 2010; O’DEA
et al., 2015). Indivíduos diagnosticados com essa enfermidade podem apresentar poliúria,
polifagia, polidipsia, alterações visuais e feridas com difícil processo de cicatrização
(VIANA; RODRIGUEZ, 2011).
No DM2 ocorre a chamada resistência insulínica, a qual possui ação e secreção
ineficiente (ALBORGHETTI et al. 2012). A real causa dessa doença metabólica ainda não foi
totalmente esclarecida, porém sabe-se que seu aparecimento sofre influência genética e
ambiental (SOUZA; SILVESTRE, 2013). DM2 pode ser diagnosticado em qualquer idade, no
entanto é mais frequentemente observado em pacientes com mais de 40 anos (PEREIRA,
2011).
Quanto ao DMG, este é decorrente de uma ação ineficiente da insulina juntamente
com o aumento de hormônio do crescimento ou devido à redução de sua quantidade secretada
pelo pâncreas (PASQUALOTTO et al., 2012). Existem ainda outros tipos de diabetes que
pode ser provocado por vários fatores como defeitos genéticos nos receptores de insulina e na
célula beta pancreática, doença no pâncreas, distúrbios hormonais, dentre outros (VIANA;
RODRIGUEZ, 2011).
O aumento da glicose e a diminuição nos níveis de insulina ocasionados pelo DM
podem interferir na defesa imunológica, uma vez que geram modificações nas funções dos
macrófagos, linfócitos, mediadores quimiotáticos, fagócitos e na apresentação de antígenos
(LUND; O’BRIEN, 2011; SEISCENTO, 2012). Além disso, ele reduz Interferon gama (IFN-
γ), IL-13 (MOAZEZI et al., 2014), compromete a imunidade humoral e os sistemas
antioxidantes, dificultando a eliminação do parasito (SHAH; HUX, 2003). Este fato aumenta
a predisposição dos portadores de DM, a uma série de infecções secundárias causadas por
parasitos, fungos, vírus e bactérias, havendo assim a necessidade de se realizar exames para a
pesquisa desses agentes (GEERLINGS; HOEPELMAN, 1999; MINELLI et al., 2003;
BAFGHI et al., 2015).
A imunodepressão pode proporcionar a disseminação de larvas de S. stercoralis em
indivíduos infectados pelo parasito, como foi demonstrado por Murali et al. (2010) ao relatar
a ocorrência de derrame pericárdico em paciente portador de DM2 mal controlada
diagnosticado com estrongiloidíase. Outra característica importante da resposta imune de
pacientes portadores de DM é a produção de citocinas de padrão Th1, que consequentemente
inibe Th2 que por sua vez é essencial na proteção contra S. stercoralis, conferindo aos
helmintos uma proteção contra os mecanismos de defesa do sistema imune do indivíduo
diabético (BALDA; PACHECO-SILVA, 1999; ALVES et al., 2007; RODRIGUES et al.,
27
2009). Segundo Cabral et al. (2015), os quadros de disseminação e hiperinfecção das larvas
estão associados principalmente a desregulação da resposta imune celular.
Por outro lado, trabalhos como o de Moazezi et al. (2014) têm questionado a
imunodeficiência de pacientes diabéticos, uma vez que esses indivíduos apresentaram redução
apenas nos níveis de IL-13 e IFN-γ. Ao avaliar a prevalência de enteroparasitoses em
portadores de DM, Nazligul et al. (2001) não encontraram ligação entre estas infecções e o
DM, enquanto que Akinbo et al. (2013) em estudo semelhante, afirmaram haver esta
associação. O DM é uma doença complexa que pode resultar em outras alterações, como
doenças renais e vasculares, as quais podem influenciar diretamente na defesa imunológica
desses indivíduos tornando-os mais susceptíveis a complicações por infecções parasitárias
(YENDE et al., 2010; KNAPP, 2013).
Em contraste, fatores ambientais como exposição a infecções helmínticas pode
reduzir à incidência do DM por mecanismos de imunomodulação que podem melhorar a ação
da insulina (CHAWLA et al., 2012; ZACCONE; COOKE, 2013). A prevenção de DM por
helmintos é possível devido um aumento de células Th2 (ARAÚJO et al., 2004), células T
reguladoras (T reg), IL-10 e uma redução de células TCD8 (HÜBNER et al., 2008). Esse fato
pôde ser observado em estudos experimentais, nos quais demonstraram que os parasitos S.
mansoni (ZACCONE et al., 2009), Trichinella spiralis, Heligmosomoides polygyrus
(SAUNDERS et al., 2007) e S. stercoralis podem proteger o indivíduo quanto ao
desenvolvimento de DM1 (PERES et al., 2013).
Embora existam poucos dados na literatura sobre a associação entre infecções por S.
stercoralis e DM, foram registrados alguns relatos de casos de disseminação e hiperinfecção
de larvas, no qual um dos motivos encontrados para ocorrência desses quadros foi o
diagnóstico de DM descompensada (COOVADIA et al., 1993; IRAZ et al., 2014; SHUKLA
et al., 2015). Considerando esse fato, o esclarecimento diagnóstico da doença é de grande
relevância para essa população, pois pode estabelecer estratégias que constituirão importante
ferramenta para o controle dessa parasitose principalmente na fase crônica, minimizando
danos causados devido à co-infecção.
1.8 Tratamento da estrongiloidíase
A estrongiloidíase pode ser tratada pela administração dos fármacos ivermectina,
albendazol, tiabendazol, cambendazol e mebendazol (COSTA-CRUZ, 2011; RAMÍREZ-
OLIVENCIA et al., 2014). A ivermectina é considerada como droga de escolha
28
principalmente em casos de hiperinfecção e disseminação (MEJIA; NUTMAN, 2012; MERZ,
2015) por apresentar maior eficiência terapêutica em relação ao albendazol, menos reações
adversas e maior eliminação das larvas (BRAZ et al., 2015).
Hays et al. (2015) ao avaliar a eficácia terapêutica da ivermectina em pacientes com
DM infectados por S. stercoralis, demonstraram falha no tratamento em alguns indivíduos. Os
autores sugeriram que essa falha poderia estar diretamente relacionada ao DM, pois 51% dos
indivíduos incluídos na pesquisa eram portadores dessa doença, cujos medicamentos
utilizados para seu tratamento, como a gliclazida e metformina, podem sofrer interações com
a ivermectina. Além disso, a hiperinsulinemia e o uso de metformina podem produzir efeitos
gástricos, provocando alterações na microbiota que consequentemente influenciam na
absorção da ivermectina (HAYS et al., 2015).
O tiabendazol inibe as vias metabólicas de fêmeas partenogenéticas e foi utilizado
como tratamento de escolha por muitos anos (ZAHA et al., 2000; COSTA-CRUZ, 2011).
Bisoffi et al. (2011) demonstraram eficiências de 95% e 86% para tiabendazol e ivermectina,
respectivamente comprovando a maior eficácia do primeiro. No entanto, seu uso não é
preconizado, pois apresenta elevada toxicidade (ADENUSI et al., 2003) podendo causar
náuseas, vômitos, diarreia, tontura, dor de cabeça e abdominal (LEYVA et al., 2011).
O albendazol é a droga alternativa para o tratamento da estrongiloidíase (TAVARES
et al., 2011; GRAVELLONE et al., 2015) e sua administração é feita a partir da ingestão de
doses diárias de 400 a 800 mg durante 3 a 6 dias apresentando melhorias em 75% dos casos
(LEYVA et al., 2011).
Em quadros de infecção gastrointestinal, a administração via oral de 200 μg/kg de
ivermectina por um ou dois dias tem apresentado resultados satisfatórios em até 97% dos
casos (LUNA et al., 2007). Em pacientes com intolerância ao medicamento por via oral ou
com absorção dificultada, é administrado 200 μg/kg por via parenteral (MEJIA; NUTMAN,
2012). O mecanismo de ação pelo qual a ivermectina elimina o parasito é através de sua
ligação a canais de cálcio, imobilizando vermes adultos (PUTHIYAKUNNON et al., 2014;
HAYS et al., 2015).
Atualmente, os relatos existentes na literatura sobre a avaliação do perfil
imunológico da estrongiloidíase em pacientes com DM ainda são incipientes. O índice dessa
parasitose ainda continua elevado no Brasil e seu impacto é variável nas diferentes formas de
imunodepressão. Além disso, o diagnóstico da estrongiloidíase é dificultado, ressaltando
assim, a importância da utilização de novas estratégias de diagnóstico, como a pesquisa de
29
imunocomplexos circulantes, que têm apresentado excelentes resultados principalmente nos
casos de imunossupressão.
30
2 OBJETIVOS
2.1 Geral:
Avaliar o perfil imunológico da estrongiloidíase em pacientes com Diabetes Mellitus
no município de Jataí, GO.
2.2 Específicos:
Determinar os níveis séricos de anticorpos IgG específicos em amostras de soros de
pacientes com Diabetes Mellitus infectados por S. stercoralis e de indivíduos controle
negativo, por ELISA;
Detectar imunocomplexos circulantes em amostras de soro de pacientes com
Diabetes Mellitus infectados por S. stercoralis e indivíduos controles, por ELISA.
31
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Aspectos éticos da pesquisa
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CoEP) da
Universidade Federal de Goiás (ANEXO A). Protocolo 929.187/2015.
3.2 Caracterização da população estudada
Os participantes da pesquisa foram pacientes atendidos no ambulatório de diabetes
da prefeitura municipal de Jataí - GO que estavam fazendo uso de insulina e indivíduos não
diabéticos residentes no município. O trabalho conta com a anuência da Secretaria Municipal
de Saúde de Jataí (APÊNDICE I). Foi obtido consentimento formal e por escrito dos
participantes por meio da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
(APÊNDICE II). Os indivíduos foram categorizados em dois grupos: Grupo I pacientes
portadores de Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1) e tipo 2 (DM2), Grupo II indivíduos controle
negativo para S. stercoralis no exame parasitológico e DM, esses indivíduos eram da
comunidade geral e acadêmica da UFG-Regional Jataí.
3.3 Critérios de inclusão e exclusão dos participantes da pesquisa
Foram incluídos no Grupo I os pacientes com diagnóstico de DM1 (dosagem de
Auto-Anticorpos – Anti-GAD e Anti-insulina), DM2 (uso de insulina há mais de cinco anos)
e pacientes cadastrados no Programa de Educação e Controle de Diabetes (PECDM) da
unidade Básica de Saúde James Phillip, do município de Jataí - GO. Para o Grupo I e II,
foram incluídos pacientes com idade igual ou superior a 18 anos, de ambos os gênero, que não
fizeram uso de anti-helmíntico nos últimos seis meses e que assinaram o TCLE concordando
com a participação na pesquisa. Foram excluídos do estudo os indivíduos que não fornecerem
consentimento formal por meio da assinatura do TCLE, não cadastrados no PECDM (para
participantes do Grupo I), e aqueles que fizeram uso de anti-helmíntico nos últimos seis
meses.
32
3.4 Coleta de sangue
Foi colhida uma amostra de sangue por punção venosa de cada indivíduo do grupo
amostral, em tubo seco para obtenção do soro, no período de março de 2015 a fevereiro de
2016. A amostra de soro obtida para dosagem de anticorpos e imunocomplexos foi
identificada, centrifugada e armazenada a -200C até o momento de uso.
3.5 Obtenção de extrato alcalino de S. venezuelensis
A extração antigênica foi feita segundo Machado et al. (2003). Foram utilizadas
100.000 larvas filarioides de S. venezuelensis, posteriormente foi adicionado NaOH 0,15 M
com inibidores de proteases, em seguida foi deixado em repouso por 18 horas a 40C sob
agitação lenta. Subsequentemente foi adicionado 0,5 mL de HCL 0,3 M até atingir pH 7,0 e a
solução foi centrifugada a 1000 g por 30 min a 40C. O conteúdo proteico do sobrenadante foi
dosado utilizando-se o método de Lowry et al. (1951), para dosagem de anticorpos
específicos.
3.6 Dosagem de anticorpo IgG específico
A detecção de anticorpos IgG específicos foi feita utilizando o extrato alcalino de S.
venezuelensis pelo teste ELISA, de acordo com Rodrigues et al. (2007) com algumas
modificações.
Microplacas de poliestireno de alta afinidade foram sensibilizadas com extrato
alcalino de S. venezuelensis na concentração de 5 g/mL, diluídos em tampão carbonato-
bicarbonato (0,06 M pH 9,6) e incubadas durante 18 horas a 4ºC. Em seguida as placas foram
submetidas a três lavagens de cinco minutos cada em tampão fosfato salino (PBS) acrescido
de Tween a 5% (PBS-T) e bloqueadas (100 l/poço) com PBS-T contendo molico a 3%
(PBS-TM) por 45 minutos a 37ºC. Após a realização de novas lavagens as amostras de soro
foram adicionadas (50 µl/poço) em duplicata na diluição de 1/80 em PBS-T e posteriormente
incubadas por 45 minutos a 37ºC.
Após incubação, as placas foram submetidas a três ciclos de lavagens e foram
adicionados 50 µl/poço de conjugado anti-IgG humano produzido em cabra marcado com
peroxidase (1/2000; Sigma). Posteriormente, as placas foram incubadas por 45 minutos a
37ºC. Após lavagens como descritos anteriormente, a reação foi revelada após adição de 50
33
l/poço do substrato H2O2 e solução cromógena de orto-fenilenodiamina (OPD) preparado no
momento do uso (5 mg de OPD + 12,5 mL de tampão citrato fosfato pH 5,0 + 5 l de H2O2
30%). Depois de 15 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, a reação foi
interrompida pela adição de 25 l de solução de ácido sulfúrico (2N H2SO4) em cada poço.
Os valores de Densidade Óptica (DO) foram determinados em leitor de ELISA, a
492 nm. Dois soros controles positivos e nove negativos foram incluídos em cada reação. Os
resultados foram expressos em índice ELISA (IE), segundo fórmula: IE = (DO amostra/ DO
cut-off), sendo o cut-off calculado para cada placa, pela média das DO obtidas de 9 soros
controles negativos acrescidas de 3 desvios padrões. Foram considerados positivos os
pacientes que apresentaram IE > 1,0.
3.7 Detecção de imunocomplexos circulantes
Os reagentes utilizados para a detecção de imunocomplexos foram gentilmente
cedidos pelo Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Uberlândia. A detecção
de imunocomplexo foi realizada conforme técnica descrita por Gonçalves et al., (2012a). Os
anticorpos IgG anti-larvas de S. venezulensis foi gentilmente cedido pelo Laboratório de
Parasitologia da Universidade Federal de Uberlândia.
Microplacas de poliestireno foram sensibilizadas com 50µl/poço de IgG anti-larvas
de S. venezuelensis na concentração de 40 µg/mL em tampão carbonato bicarbonato 0,06 M,
pH 9,6 por 18 horas a 40C. Em seguida as placas foram lavadas três vezes em PBS-T por
cinco minutos cada lavagem; a seguir foram adicionados 50 µl/poço das amostras de soro dos
pacientes dos dois grupos analisados diluídos a 1/80 em PBS-T, posteriormente foram
incubadas por 45 minutos a 370C.
Após incubação, as placas foram submetidas a novos ciclos de lavagem e o
conjugado marcado com peroxidase anti-IgG humano (1/2000; Sigma) foi adicionado (50
µl/poço). Após incubar novamente por 45 minutos a 37ºC, as placas foram lavadas e
reveladas, pela adição de 50 l do substrato H2O2 e solução cromógena de orto-
fenilenodiamina (OPD) preparado no momento do uso (5 mg de OPD + 12,5 mL de tampão
citrato fosfato pH 5,0 + 5 l de H2O2 30%). Depois de 15 minutos à temperatura ambiente e
ao abrigo da luz, a reação foi interrompida pela adição de 25 l de solução de ácido sulfúrico
(2N H2SO4) em cada poço.
34
Os valores de Densidade Óptica (DO) foram determinados em leitor de ELISA, a
492 nm. Foram adicionados em cada placa dois soros controles positivos obtidos de pacientes
que eliminavam larvas de S. stercoralis e nove negativos de indivíduos copronegativos para
Strongyloides. Os resultados foram expressos em índice ELISA, segundo fórmula: IE = (DO
amostra/ DO cut-off), sendo o cut-off calculado para cada placa, pela média das DO obtidas de
9 soros controles negativos acrescidas de 3 desvios padrões. Foram considerados positivos os
pacientes que apresentaram Índice ELISA > 1,0.
3.8 Normas de biossegurança
Todos os procedimentos seguiram normas básicas de biossegurança, tanto nos
procedimentos de colheita, manuseio dos materiais biológicos e reagentes, bem como, a
utilização dos equipamentos (MASTROENI, 2011).
3.9 Análise estatística
A análise estatística foi realizada por meio do programa Graphpad Prism versão 5.0.
Para análise das médias geométricas no grupo estudado foram feitas pelo teste t de Student.
Os dados dos grupos foram analisados por ANOVA utilizando o teste de Mann-Whitney
quando apropriado. Para as variáveis sexo e faixa etária foi utilizado o teste de χ2. Os valores
de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
35
4 RESULTADOS
4.1 Caracterização da população estudada
Um total de 100 amostras de soros sendo 50 do Grupo I (pacientes diabéticos) e 50
do grupo II (controle negativo) foram analisadas pela técnica imunoenzimática ELISA, para
detecção de anticorpos IgG anti- larvas de S. venezuelensis e imunocomplexos circulantes, das
quais 15/50 (30%) pertencia ao sexo masculino e 35/50 (70%) ao sexo feminino, para ambos
os grupos. A faixa etária variou de 18 a 88 anos e a média de idade foi de 55,5 anos, conforme
Tabela 1. Ao analisar estatisticamente sexo e faixa etária verificou-se que houve diferença
estatística significante (p= 0,0128).
Faixa etária
(Anos)
Grupo I Total
Grupo II Total
Feminino Masculino Feminino Masculino
18 – 30 03 00 03 06 03 09
31 – 43 01 02 03 10 01 11
44 – 56 07 05 12 04 01 05
57 – 69 12 07 19 12 05 17
≥ 70 12 01 13 03 05 08
Total 35 15 50 35 15 50
4.2 ELISA para detecção de IgG anti- larvas de S. venezuelensis e imunocomplexo
circulante
Os Índices ELISA (IE) obtidos para cada amostra de pacientes do Grupo I e II
analisadas para IgG e imunocomplexo, estão demonstradas na Figura 4 e 5. Sendo que para o
Grupo I, 19/50 apresentaram IE > 1 para IgG e 1/50 para imunocomplexo (Figura 4).
Enquanto que no Grupo II, 2/50 amostras exibiram IE > 1 para IgG e nenhuma foi positiva
para imunocomplexo (Figura 5).
TABELA 1- Distribuição das 100 amostras de soro dos Grupos I e II testadas pela técnica de ELISA para
detecção de IgG anti- larvas de S. venezuelensis e imunocomplexo, segundo sexo e faixa etária
36
FIGURA 4- Detecção de anticorpos IgG anti-Strongyloides e imunocomplexo expressos em Índice ELISA
de 50 pacientes diabéticos (Grupo I). A linha tracejada indica o limiar de reatividade (IE > 1,0)
37
Níveis de anticorpos IgG e de imunocomplexos circulantes dos pacientes do grupo I
e indivíduos do grupo II estão demonstrados na Figura 6. No grupo I a média geométrica dos
níveis de IgG foi de 0,9474, significativamente maior que no grupo II 0,3932 (p<0,001).
Quanto aos níveis de imunocomplexos circulantes verificou-se que a média geométrica dos
pacientes do grupo I 0,6776 foi significativamente maior que no grupo II 0,1825 (p<0,001).
FIGURA 5- Detecção de anticorpos IgG anti-Strongyloides e imunocomplexo expressos em Índice ELISA de
50 indivíduos controles não diabéticos e copronegativos para S. stercoralis (Grupo II). A linha tracejada indica
o limiar de reatividade (IE > 1,0)
38
Os níveis de anticorpos IgG anti-larvas de S. venezuelensis expressos em IE
quantificados em 100 amostras de soros de pacientes do grupo I e indivíduos controles, estão
demonstrados na Figura 7. A taxa de positividade para estrongiloidíase no Grupo I foi de 38%
(19/50) e no Grupo II de 4% (2/50). Ao analisar estatisticamente verificou-se que a
positividade do Grupo I foi significativamente maior que no grupo II (p<0,001).
FIGURA 6- Frequência de positividade para ELISA IgG e imunocomplexo (média geométrica) dos Grupos I e
II, expressos em IE. Cut-off > 1,0 (linha tracejada); *** p < 0,001
39
Ao analisar positividade, gênero e faixa etária, verificou-se que a maioria dos
indivíduos com sorologia positiva para IgG encontrava na faixa etária de 57 a 69 anos, 6/19
(31,6%) para o Grupo I e 2/2 (100%) Grupo II. Em relação ao gênero, houve predomínio de
mulheres no Grupo I 14/19 (73,7%) e II 2/2 (100%), como demonstrado na Figura 8. Ao
comparar positividade, gênero e faixa etária verificou-se que houve diferenciação estatística
significante (χ2
= 25,46; p= 0,0128).
FIGURA 7- Níveis de anticorpos IgG anti-Strongyloides, expressos em índice ELISA (IE) utilizando
extrato antigênico heterólogo de S. venezuelensis em 50 amostras de soros de pacientes do Grupo I e 50
amostras de soros controles (copronegativos ; Grupo II). A linha tracejada indica o limiar de reatividade
(IE > 1,0) ***p<0,001
40
A taxa de positividade para a detecção de imunocomplexos circulantes está
demonstrada na Figura 9. A positividade para imunocomplexo circulante foi de 2% (1/50) em
pacientes do Grupo I e 0% para os indivíduos do grupo II. Houve diferença estatística
significativa ao comparar os dois grupos (p<0,001).
FIGURA 8- Distribuição da positividade para os pacientes do Grupo I e controles do Grupo II positivos para
IgG anti- larvas de S. venezuelensis, em relação ao gênero e faixa etária
FIGURA 9- Níveis de imunocomplexos circulantes, expressos em índice ELISA (IE) em 50 amostras de soros
de pacientes do Grupo I e 50 amostras de soros controles (copronegativos; Grupo II). A linha tracejada indica o
limiar de reatividade (IE > 1,0)
41
5 DISCUSSÃO
DM é uma doença metabólica caracterizada pelo estado de hiperglicemia crônica
capaz de influenciar diretamente na qualidade de vida de seus portadores, cujas prevalências
apresentam-se crescentes mundialmente (VIGGIANO, 2007; BARBOSA, 2013; SHAH et al.,
2016).
A hiperglicemia promove alterações na resposta imune inata e adaptativa de
pacientes portadores de DM, provocando disfunções de neutrófilos, macrófagos, monócitos e
comprometimento da imunidade humoral, resultando em diminuição nos níveis de IgM e IgG
(CANTUÁRIA, 2014; SCHUETZ et al., 2011). Além disso, estudo experimental em seres
humanos demonstraram haver aumento de IgA, redução de IFN-γ e IL-13, enquanto que os
níveis de IL-10 permaneceram normais (MOAZEZI et al., 2014). Estas alterações
imunológicas tornam os pacientes diabéticos predispostos a infecções secundárias (MINELLI
et al., 2003).
Acredita-se que o DM controlado pode melhorar a resposta imune dos seus
portadores (GEERLINGS; HOEPELMAN, 1999; LUND; O’BRIEN, 2011). No entanto,
alguns autores sugerem que as disfunções imunológicas observadas em pacientes diabéticos
não são suficientes para classifica-los como imunodeprimidos, e que os fatores relacionados à
imunodepressão nesse grupo não estão totalmente elucidados, necessitando de mais estudos
(KNAPP, 2013; MOAZEZI et al., 2014).
Por outro lado, alguns estudos têm demonstrando haver associação entre o DM e a
predisposição a infecções parasitárias, sendo os helmintos um dos mais importantes agentes
responsáveis por causar infecções nesse grupo de pacientes (MENDONÇA et al., 2006;
AKINBO et al., 2013). Nesse contexto, destaca-se o geohelminto S. stercoralis, agente
etiológico da estrongiloidíase que constitui importante problema de saúde pública com
predominância principalmente em áreas tropicais e subtropicais (GRAVELLONE et al.,
2015).
A estrongiloidíase geralmente é assintomática quando limitada ao trato
gastrointestinal (PANDA et al., 2015). Porém, em alguns casos de imunossupressão e
imunodepressão provocada por diferentes fatores podem levar a quadros de disseminação e
hiperinfecção (COOVADIA et al., 1993; BENINCASA et al., 2007; DE BONA; BASSO,
2008; ALTINTOP et al., 2010; TEIXEIRA et al., 2010; WIN et al., 2011; BOLLELA et al.,
2013; IRAZ et al., 2014; SHUKLA et al., 2015).
42
Azira; Zeehaida (2010) reportaram caso de hiperinfecção por S. stercoralis em
paciente portador de DM, o qual foi a óbito em decorrência da septicemia provocada por
bactérias intestinais que foram deslocadas juntamente com as larvas. Enquanto que Murali et
al. (2010) relataram o primeiro caso conhecido na literatura de derrame pericárdico em
paciente diabético devido a disseminação de larvas.
Estudo realizado com pacientes internados em hospital escola na Malásia
demonstrou que 25% dos pacientes diagnosticados com infecção pelo S. stercoralis eram
diabéticos (AZIRA et al., 2013). No entanto, há poucos estudos realizados no Brasil que
demonstram a prevalência da estrongiloidíase em pacientes portadores de DM. Esta escassez
de estudo pode estar diretamente associada com a dificuldade da realização do diagnóstico
dessa doença, devido à baixa e irregular eliminação das larvas nas fezes, de indivíduos
infectados, levando assim, ao comprometimento da sensibilidade dos métodos parasitológicos
(CARVALHO et al., 2015). Por esta razão a confirmação diagnóstica da estrongiloidíase por
exames sorológicos tem sido cada vez mais empregada (RAPOPORT et al., 2015).
Os métodos imunológicos para pesquisa de anticorpos, tais como ELISA, WB e IFI
são amplamente empregados no diagnostico da estrongiloidíase, podendo ser utilizados em
estudos soroepidemiológicos e para avaliar o perfil imunológico do hospedeiro (YORI et al.,
2006; MERCADO et al., 2007; RODRIGUES et al., 2007; SULTANA et al., 2012; GEORGE
et al., 2015). Dentre esses, a técnica imunoenzimática ELISA tem-se destacado por apresentar
alta sensibilidade, fácil aplicabilidade e segurança, sendo considerada como excelente método
para triagem sorológica (SCHAFFEL et al., 2001; KOOSHA et al., 2004). Porém, a
inexistência do padrão-ouro tem acarretado no desenvolvimento de novas metodologias, como
a pesquisa de imunocomplexos circulantes que tem demonstrado ser uma estratégica
importante no diagnóstico da estrongiloidíase, principalmente nos casos de imunodepressão
(VAN DOORN et al., 2007; GONÇALVES et al., 2012a; KHIEU et al., 2014a).
No presente estudo, 70% dos indivíduos que participaram da pesquisa eram mulheres
e 30% homens, para Grupo I e II. Segundo Gomes et al. (2007), há uma certa resistência por
parte dos homens na procura por serviços de saúde, o que pode estar ligado a aspectos
culturais ou por medo de serem portadores de alguma enfermidade.
A positividade para IgG anti- larvas de S. venezuelensis no Grupo I e II foi de 38% e
4%, respectivamente. Resultado esse que difere do encontrado por Mendonça et al. (2006) em
Uberlândia - MG, que registraram uma prevalência para estrongiloidíase de 23% em
indivíduos diabéticos e 7,1% em pacientes controle.
43
A alta reatividade de anticorpos IgG anti- Strongyloides testados por ELISA no
Grupo I, pode estar associada a cronicidade da doença ou presença de plasmócitos de vida
longa, os quais permanecem por um longo período após o tratamento da estrongiloidíase
(LINDO et al., 1996). Esses anticorpos são detectados no soro dos indivíduos cerca de duas
semanas após a infecção e podem persistir por até 20 semanas (LEVENHAGEN; COSTA-
CRUZ, 2014). Os indivíduos infectados por S. stercoralis podem exibir altos títulos de IgG no
soro, que representam de 70 a 75% do total de anticorpos séricos (BOSQUI et al., 2015).
No Grupo II, duas amostras foram reagentes para ELISA IgG. Essa positividade
verificada para o grupo controle pode estar diretamente relacionada à ocorrência de
reatividade cruzada com outros helmintos, os quais possuem antígenos semelhantes aos de S.
stercoralis (INÊS et al., 2012). Estudo realizado por Inês et al. (2013) para detecção de IgG
anti-Strongyloides em soros de pacientes atendidos no Laboratório de Análises Clínicas da
Universidade Federal da Bahia, demonstrou porcentagem de reatividade cruzada de 10% com
antígenos de S. mansoni, Trichuris trichiura e ancilostomídeos.
Em relação ao gênero e positividade, houve predomínio de indivíduos do gênero
feminino reagentes para IgG em ambos os grupos, o que pode estar relacionado ao maior
número de mulheres participantes, resultados esses não condizentes com os encontrados por
Mendonça et al. (2006). A faixa etária de predominância foi de 57 a 69 anos, não
corroborando com Mercado et al. (2007) cuja idade de maior frequência foi a de 21 a 39 anos.
O imunocomplexo tem sido estudado em infecções por S. mansoni, o qual tem
demonstrando suprimir a reação granulomatosa (REZENDE et al., 1997). Porém, na
estrongiloidíase o papel do imunocomplexo não está totalmente elucidado, uma vez que
existem poucos relatos na literatura sobre sua produção e detecção, sendo este estudo
considerado pioneiro na pesquisa de imunocomplexos em amostras de soro de pacientes
diabéticos.
No presente estudo, a prevalência de S. stercoralis estimada pela pesquisa de
imunocomplexo por ELISA foi de 2% para o Grupo I, sendo a amostra reagente de uma
paciente de 70 anos também positiva para IgG. Além do quadro de DM, este paciente
apresentou um segundo fator de risco, considerado importante para aquisição dessa
helmintose, que é a idade. Segundo Tangi et al. (2016), pacientes idosos são mais susceptíveis
a complicações por infecções parasitárias devido a disfunção do sistema imunológico. Nesse
contexto, pode-se inferir que a paciente está em uma fase ativa da infecção por S. stercoralis.
Por outro lado, no Grupo II não foi observado reatividade para detecção de imunocomplexos.
44
A pesquisa de imunocomplexos circulantes por ELISA tem apresentado resultados
satisfatórios experimentalmente, demonstrando ser eficiente para o diagnóstico da
estrongiloidíase, principalmente nos quadros de imunodepressão (GONÇALVES, 2011b).
Gonçalves et al. (2012c) ao realizarem a pesquisa de imunocomplexos circulantes por ELISA
em amostras de soro pacientes sabidamente saudáveis, com estrongiloidíase e outras
parasitoses, obtiveram excelentes taxas de sensibilidade e especificidade, 93,3% e 86,1%,
respectivamente.
Outras doenças, como a vasculite cutânea e o lúpus eritematoso sistêmico, podem
resultar em deposição de imunocomplexos (FORTE et al., 2003; BRANDT et al., 2007),
assim como infecções causadas pelo parasito S. mansoni, na qual a sua deposição glomerular
pode causar nefropatia esquistossomótica (SOUZA et al., 2011). Além disso, altos níveis de
imunocomplexos também podem ser detectados em indivíduos portadores de DM
(NICOLOFF et al., 2004), porém não existem estudos suficientes que comprovem a
inespecificidade da pesquisa de imunocomplexos de S. stercoralis no ELISA (CAMPOS et
al., 1986).
Nesse contexto, os resultados obtidos para IgG e imunocomplexo no presente estudo,
demonstraram a importância da associação de diferentes técnicas para o esclarecimento
diagnóstico da estrongiloidíase. Além disso, a técnica de ELISA para pesquisa de
imunocomplexos circulantes pode ser uma alternativa diagnóstica em pacientes
imunodeprimidos, sendo este trabalho pioneiro em sua pesquisa no DM.
45
6 CONCLUSÃO
A soroprevalência para detecção de IgG anti-Strongyloides em pacientes diabéticos
foi elevada quando comparado ao grupo controle.
A detecção de imunocomplexos circulantes por ELISA no Grupo I demonstrou que a
maioria dos pacientes não apresentou infecção ativa. Neste contexto, ressalta-se a importância
da realização desta técnica como ferramenta complementar para o diagnóstico da infecção por
S. stercoralis.
Além disso, pode-se destacar a necessidade da utilização de mais de uma técnica
para o esclarecimento diagnóstico da estrongiloidíase, uma vez que o ciclo de vida do parasito
S. stercoralis, apresenta uma peculiaridade, a autoinfecção interna, capaz de causar infecções
crônicas dificultando o diagnóstico dessa doença.
46
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therapy. The Korean Journal of Parasitology, v. 53, N. 2, p. 223-226, abr. 2015.
YASUDA, K.; MATSUMOTO, M.; NAKANISHI, K. Importance of both innate immunity
and acquired immunity for rapid expulsion of S. venezuelensis. Frontiers in immunology, v.
5, n. 118, mar. 2014.
YENDE, S.; POLL, T. V. D.; LEE, M. J.; HUANG, D. T.; NEWMAN, A. B.; KONG, L.;
KELLUM, J. A.; HARRIS, T. B.; BAUER, D.; S. S.; ANGUS, D. C. The influence of pre-
existing diabetes mellitus on the host immune response and outcome of pneumonia: analysis
of two multicenter cohort studies. Thorax, v. 65, n. 10, p. 870-877, out. 2010.
YORI, P. P.; KOSEK, M.; GILMAN, R. H.; CORDOVA, J.; BERN, C.; CHAVEZ, C. B.;
OLORTEGUI, M. P.;MONTALVAN, C.; SANCHEZ, G. M.; WORTHEN, B.; WORTHEN,
J.; LEUNG, F.; ORÉ, C. V. Seroepidemiology of strongyloidiasis in the Peruvian Amazon.
The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 74, n. 1, p. 97-102, jan. 2006.
ZACCONE, P.; BURTON, O.; MILLER, N.; JONES, F. M.; DUNNE, D. W.; COOKE, A.
Schistosoma mansoni egg antigens induce Treg that participate in diabetes prevention in NOD
mice. European Journal of Immunology, v. 39, p. 1098-1107, 2009.
ZACCONE, P.; COOKE, A. Helminth mediated modulation of Type 1 diabetes (T1D).
International Journal for Parasitology, v. 43, p. 311-318, 2013.
63
ZAHA, O.; HIRATA, T.; KONJO, F.; SAITO, A. Strongyloidiasis--progress in diagnosis and
treatment. Internal Medicina, v. 39, n. 9, p. 695-700, 2000.
ZUETER, A. M.; MOHAMED, Z.; ABDULLAH, A. D.; MOHAMAD, N.; ARIFIN, N.;
OTHMAN, N.; NOORDIN, R. Detection of Strongyloides stercoralis infection among cancer
patients in a major hospital in Kelantan, Malaysia. Singapore Medical Journal, v. 55, n. 7, p.
367-371, 2014.
64
ANEXO A
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APÊNDICE I
CARTA DE ANUÊNCIA INSTITUCIONAL
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA: Título do Projeto: “Avaliação do perfil parasitológico, imunológico e molecular da
estrongiloidíase em pacientes com Diabetes mellitus”
Pesquisador Responsável: Profa. Dra. Rosângela Maria Rodrigues
Telefone para contato: (64)3606-8286/ 3632-7261 e (64) 9623-2172
Pesquisadores participantes: Profa. Márcia Carolina Mazzaro, Técnico em Análises Clínicas
Curso de Biomedicina João Batista Alves de Souza,
Acadêmicos do Curso de Biomedicina Jefferson Elias de Oliveira; Laura Vilela Souza
Discente de pós-graduação: Émelin Alves dos Santos - Pós-graduação em Ciências Aplicadas
à Saúde Regional Jataí
Descrição da pesquisa
A estrongiloidíase é uma doença parasitária de importância em países de clima tropical e
subtropical. Embora seja uma infecção limitada ao trato gastrointestinal geralmente é
assintomática, mas pode levar o paciente a óbito em casos de hiperinfecção e doença
disseminada. O diabetes mellitus atualmente constitui uma epidemia mundial, atinge todas as
faixas etárias, inclusive gestantes, não tem distinção entre sexo, raça e condições
socioeconômicas. A prevenção do diabetes e suas complicações consistem em uma
preocupação mundial devido às complicações agudas e crônicas que ocasiona alta
morbimortalidade, além de acarretar elevados custos para os sistemas de saúde. O indivíduo
portador de diabetes esta propenso a desenvolver várias patologias decorrentes da doença,
bem como outras doenças associadas como a estrongiloidíase. O projeto será realizado na
unidade básica de saúde James Philip, Jataí - GO. A pesquisa será realizada mediante a
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. As amostras de fezes e sangue
serão obtidas de pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2 e indivíduos
saudáveis controle negativo para estrongiloidíase confirmado pelo exame parasitológico de
fezes. Detalhes sobre o curso da doença serão obtidos a partir da análise do prontuário médico
previamente obtido na Unidade Básica de Saúde com atenção especial aos dados clínicos e
laboratoriais de cada paciente. O diagnóstico imunológico para detecção de anticorpos
específicos e imunocomplexos circulantes soro de pacientes diabéticos com estrongiloidíase e
grupo controle serão feito pelo teste ELISA. Para detectar o DNA de S. stercoralis em
amostras de fezes de pacientes com diabetes mellitus será realizada reação em cadeia da
polimerase (PCR). Considerando o impacto da estrongiloidíase em determinados grupos de
pacientes, ressalta-se a necessidade de realizar este estudo que tem como objetivo delinear o
perfil parasitológico, imunológico e molecular da estrongiloidíase, em pacientes diabéticos.
Neste contexto, a realização desta pesquisa servirá também de suporte para o diagnóstico
desta doença em outros grupos considerados de riscos para a forma disseminada da
estrongiloidíase.
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Nome e Assinatura do pesquisador _______________________________________
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO INSTITUCIONAL
Eu,___________________________________________________________________,
RG/matrícula/CPF________________________, cargo: Secretário Municipal de Saúde
abaixo assinado, concordo que o estudo “Avaliação do perfil parasitológico, imunológico e
molecular da estrongiloidíase em pacientes com Diabetes mellitus”
Fui devidamente informado (a) e esclarecido(a) pelo pesquisador(a)
___________________________ sobre a pesquisa, os procedimentos nela envolvidos, assim
como os possíveis riscos e benefícios decorrentes de minha participação. Foi-me garantido
que posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que isto leve a qualquer
penalidade.
Jatai, / /2014.
Nome e Assinatura do representante institucional:_____________________________
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APÊNDICE II
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA
LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário (a), desta pesquisa. Após ser
esclarecido (a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine
ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador
responsável. Em caso de recusa você não será penalizado de forma alguma. Em caso de
dúvida você poderá procurar o Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de
Goiás pelos telefones (62) 3521-1215 /1076
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA: Título do Projeto: “Avaliação do perfil parasitológico, imunológico e molecular da
estrongiloidíase em pacientes com Diabetes mellitus”
Pesquisador Responsável: Profa. Dra. Rosângela Maria Rodrigues
Telefone para contato: (64)3606-8286/ 3632-7261 e (64) 9623-2172
Pesquisadores participantes: Profa. Márcia Carolina Mazzaro, Técnico em Análises Clínicas
Curso de Biomedicina João Batista Alves de Souza,
Acadêmicos do Curso de Biomedicina Jefferson Elias de Oliveira; Laura Vilela Souza
Discente de pós-graduação: Émelin Alves dos Santos - Pós-graduação em Ciências Aplicadas
à Saúde Regional Jataí
Descrição da pesquisa: A sua participação será de grande importância para o nosso estudo. Através dela poderemos
verificar a presença de infecção por um parasito chamado Strongyloides stercoralis. Para tal,
precisamos do seu consentimento para obtenção de três amostras de fezes e uma de sangue
para realização do diagnóstico parasitológico e imunológico e também para termos acesso ao
seu prontuário para anotarmos os dados laboratoriais e clínicos. Para iniciarmos nossas
atividades entregaremos um pote de plástico, para que o Sr. (a) em sua residência proceda a
coleta de amostras de fezes, posteriormente entregaremos os potes seguintes até completar as
três amostras. Os potes poderão ser entregues nos postos de saúde, ou no centro médico, ou se
não for possível levar até esses locais, buscaremos em sua residência. Nessa amostra de fezes
serão realizados testes para pesquisa de parasito intestinal (Strongyloides stercoralis), e caso
seja positivo, será oferecido tratamento gratuito. Na amostra de sangue faremos o diagnóstico
para verificar a presença de anticorpos contra este parasito. As amostras de fezes e as de
sangue serão acondicionados em caixas de isopor separadamente e conduzidas para o
Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal da Regional Jataí onde serão analisadas.
O benefício do estudo é conhecer quantos pacientes que tratam diabetes apresentam essa
infecção. Seu nome não será exposto em hipótese alguma. As fezes serão identificadas por
números. Serão garantidos o anonimato e sigilo das informações, além da utilização dos
resultados para fins unicamente científicos. O Sr. (a) poderá solicitar informações ou
esclarecimentos sobre o andamento da pesquisa a qualquer momento, assim como poderá
retira-se do estudo e poderá não permitir a utilização de seus dados em qualquer momento do
71
estudo. Sendo um participante voluntário, o Sr.(a) não terá nenhum pagamento ou despesa
referente a sua participação no estudo
_________________________________________________________________
Assinatura do membro da equipe
Telefone para contato: (64) 9623-2172
Comitê de Ética: (62) 3521-1215 /1076
Eu _________________________________________________________________, me
responsabilizo pela participação de ____________________________________________ no
projeto de pesquisa intulado “Avaliação do perfil parasitológico, imunológico e molecular
da estrongiloidíase em pacientes com Diabetes mellitus” Este projeto será realizado no Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Goiás
Regional Jataí.
Estou ciente de todos os procedimentos abaixo relacionados serão realizados no Laboratório
de Parasitologia da Universidade Federal de Goiás
- Coleta de três amostras de fezes, para realização de exames coproparasitológicos e análise
molecular
- Coleta de uma amostra de sangue, para a realização da análise sorológica para
estrongiloidíase.
Terei a garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida
a cerca de procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a
investigação. Terei a liberdade de me retirar da pesquisa a qualquer momento em que desejar,
sem a necessidade prévia de explicações. Estarei ciente que a amostra de soro obtida pela
coleta do sangue poderá ser utilizada para realização de outras pesquisas clínicas pelos
pesquisadores no intervalo de 10 anos.
Autorizo amostra de sangue para pesquisas futuras ( )
Não autorizo ( )
Será respeitado o caráter confidencial das informações fornecidas, não sendo permitida minha
identificação.
Jataí, _____ de __________________ de 201__
__________________________________________________________
Assinatura do Responsável
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