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Determinação de Clorofenóis em águas por LC-MS/MS
Caso de estudo: 2-amino-4-clorofenol
Marta Sofia Tavares da Fonseca Lopes Mourato
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia Química
Orientadores: Profª. Dra. Margarida Maria Portela Correia dos Santos Romão
Engª. Georgina Maria Sarmento Felisberto
Júri
Presidente: Prof. Dr. Sebastião Manuel Tavares da Silva Alves
Orientador: Profª. Dra. Margarida Maria Portela Correia dos Santos Romão
Vogal: Engª. Maria Paula Machado de Barros Viana
Novembro 2014
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“A persistência é o melhor caminho para o êxito”
Charles Chaplin
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Agradecimentos
A concretização da presente dissertação só foi possível graças à colaboração directa e
indirecta de diversas pessoas.
À Professora Margarida Romão, pela orientação deste trabalho, pelas palavras de incentivo e
pelas sugestões prestadas.
À Engenheira Georgina Sarmento por me ter recebido no Laboratório de Análises do Instituto
Superior Técnico (LAIST) para a realização do estágio, por todos os conhecimentos transmitidos e
por todo o apoio e orientação prestados no decorrer do presente trabalho.
Aos colegas com quem tive o prazer de conviver durante os últimos meses no LAIST, em
particular aos técnicos do núcleo dos Orgânicos, pela recepção calorosa, por todos os conhecimentos
transmitidos e por todo o apoio e amizade demonstrados. Gostaria, no entanto, de realçar o papel
fundamental dos técnicos Hélder Gageiro e Ana Fernandes no acompanhamento de todo o trabalho
experimental efectuado e, deste modo prestar-lhes o meu mais sincero agradecimento.
Ao LAIST por me ter permitido contactar de perto com diversas metodologias utilizadas no
ramo das análises químicas e por ter contribuído para o meu enriquecimento enquanto futura
profissional.
À Márcia por todo o apoio e motivação prestados na sua passagem pelo LAIST.
Aos meus pais, Edmundo e Maria João, à minha irmã Ana, aos meus avós e restante família
agradeço todo o apoio, todas as palavras de incentivo e toda a paciência que tiveram ao longo desta
importante etapa da minha vida.
Por último, mas não menos importante, presto os meus agradecimentos a todos os amigos e
colegas que me acompanharam ao longo deste semestre, em especial à Ana e à Fátima.
A todos os meus mais sinceros agradecimentos.
Marta Sofia Mourato
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Resumo
Os clorofenóis (CP’s) são descritos como possuindo elevada toxicidade, propriedades
carcinogénicas e mutagénicas, consistindo a sua monitorização numa peça-chave para a diminuição
da contaminação do ambiente e dos problemas para a saúde humana.
O objectivo principal do presente trabalho consistiu na implementação de uma nova
metodologia analítica para a determinação de CP’s em águas, focando a sua atenção para um
composto em particular, o 2-amino-4-clorofenol. Os restantes compostos analisados foram 2-
clorofenol, 3-clorofenol, 4-clorofenol, 2,4-diclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, 2,4,6-triclorofenol,
pentaclorofenol e 4-cloro-3-metilfenol.
A metodologia desenvolvida envolve a extracção em fase sólida seguida da análise por
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massa sequencial com
ionização por electrospray (SPE-LC-ESI-MS/MS). A escolha deste método analítico deve-se à
polaridade média a elevada dos compostos em estudo.
O processo de optimização do método inicia-se com a obtenção das condições óptimas de
espectrometria de massa que possibilitam a formação do ião precursor e dos iões produto, seguindo-
se a selecção das condições para a separação cromatográfica, destacando-se a escolha da coluna
cromatográfica e da fase móvel. A técnica de extracção de amostras por SPE com recurso a
cartuchos do tipo SDB (copolímero de estireno e divinilbenzeno) de 6 mL e 200 mg foi desenvolvida
apenas para o composto 2-amino-4-clorofenol.
A metodologia implementada permite apenas quantificar o composto 2-amino-4-clorofenol,
apresentando recuperações de 73%, para 100 mL de água Milli-Q fortificados com padrão de 10
mg/L.
Palavras-chave: Clorofenóis, SPE, HPLC, MS/MS.
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ix
Abstract
Chlorophenols (CP’s) are described as having high toxicity, carcinogenic and mutagenic
properties, consisting their monitoring in a key piece to reduce contamination of the environment and
human health problems.
The main objective of this work is to implement a new analytical methodology for the
determination of CP’s in water, focusing on a particular compound, 2-amino-4-chlorophenol. The
remaining compounds studied are: 2-chlorophenol, 3-chlorophenol, 4-chlorophenol, 2,4-
dichlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4,6-trichlorophenol, pentachlorophenol and 4-chloro-3-
methylphenol.
The methodology developed involves solid phase extraction followed by analysis by high
performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry with electrospray ionization
(SPE-ESI-LS-MS/MS). The choice of this method is due to the properties of the target compounds,
specifically to its high polarity.
The optimization process of the method starts with obtaining the optimum conditions for mass
spectrometry that allow the formation of the parent ion and the product ions, followed by selection of
the conditions for chromatographic separation, especially the choice of chromatographic column and
mobile phase. The sample extraction technique using SPE with 6 mL and 200 mg SDB (styrene
divinylbenzene copolymer) cartridges was designed only for the compound 2-amino-4-chlorophenol.
The proposed methodology allows only quantify the compound 2-amino-4-chlorophenol, with
recoveries of 73% to 100 mL of Milli-Q water fortified with standard of 10 mg/L.
Key words: Chlorophenols, SPE, HPLC, MS/MS.
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xi
Índice
Agradecimentos ................................................................................................................................v
Resumo ........................................................................................................................................... vii
Abstract ............................................................................................................................................ix
Índice de Figuras ........................................................................................................................... xiii
Índice de Tabelas ............................................................................................................................ xv
Lista de Símbolos e Abreviaturas ................................................................................................ xvii
1. Introdução ....................................................................................................................................1
1.1. O Laboratório de Análise do IST .............................................................................................1
1.2. Objectivo ................................................................................................................................1
1.3. Enquadramento ......................................................................................................................2
1.3.1. Clorofenóis ......................................................................................................................2
1.3.2. Origem e Utilizações dos Clorofenóis ..............................................................................3
1.3.3. Propriedades Físicas e Químicas dos Clorofenóis ...........................................................4
1.3.4. Impacto no Ambiente e na Saúde Humana ......................................................................5
1.3.5. Legislação – Limites Legais .............................................................................................6
1.4. Metodologia Analítica .............................................................................................................7
1.4.1. Estado da Arte ................................................................................................................7
1.4.2. Métodos de Preparação de Amostras ..............................................................................8
1.4.3. Cromatografia ............................................................................................................... 11
1.4.4. Cromatografia Gasosa ................................................................................................. 12
1.4.5. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) ........................................................... 13
1.4.6. Espectrometria de massa .............................................................................................. 15
1.5. Controlo de Qualidade – Validação de Métodos Analíticos .................................................... 19
1.6. Incerteza do Método ............................................................................................................. 20
2. Parte Experimental ..................................................................................................................... 21
2.1. Reagentes e Padrões ........................................................................................................... 21
2.2. Material ................................................................................................................................ 21
2.3. Equipamento ........................................................................................................................ 21
2.4. Procedimento Experimental .................................................................................................. 23
2.4.1. Segurança .................................................................................................................... 23
2.4.2. Descontaminação do Material ....................................................................................... 23
2.4.3. Preparação das Soluções Padrão e da Fase Móvel ....................................................... 23
2.4.4. Optimização das condições de LC-ESI-MS/MS ............................................................. 24
2.4.5. Amostras ....................................................................................................................... 27
2.4.6. Extracção e pré-concentração das amostras ................................................................. 27
2.4.7. Controlo de Qualidade – Validação de Métodos Analíticos ............................................ 28
3. Apresentação e Discussão dos Resultados ............................................................................. 29
xii
3.1. Optimização das condições de LC-ESI-MS/MS ..................................................................... 29
3.1.1. Condições de Espectrometria de Massa ........................................................................ 29
3.1.2. Condições Cromatográficas .......................................................................................... 31
3.2. Quantificação – Curvas de Calibração .................................................................................. 34
3.3. Razão Ião de Quantificação/Ião de Qualificação ................................................................... 35
3.4. Selecção do método de extracção ........................................................................................ 35
3.4.1. Extracção líquido-líquido (LLE) ...................................................................................... 35
3.4.2. Extracção em fase sólida (SPE) .................................................................................... 36
3.5. Estabilidade dos Clorofenóis em estudo ............................................................................... 38
3.6. Resultados das amostras ..................................................................................................... 39
4. Conclusões e Perspectivas Futuras ......................................................................................... 42
5. Bibliografia ................................................................................................................................. 44
Anexo I – Procedimento para ligar/desligar o sistema LC-MS/MS ............................................... 48
Anexo II – Estrutura Molecular dos Clorofenóis em estudo ......................................................... 49
Anexo III – Espectros de fragmentação dos Clorofenóis em estudo ........................................... 50
Anexo IV – Cromatograma obtido por injecção de uma solução padrão conjunta, para o ião de
quantificação................................................................................................................................... 54
Anexo V – Tratamento de Resultados ............................................................................................ 55
Anexo VI – Recuperações dos Clorofenóis em estudo obtidas por LLE ..................................... 58
xiii
Índice de Figuras
Figura 1 – Estrutura geral dos CP’s (n – nº de Cl). ..............................................................................2
Figura 2 – Ciclo dos CP’s.[3] ..............................................................................................................3
Figura 3 – Representação da montagem utilizada em LLE.[20] ..........................................................9
Figura 4 – Representação de um cartucho (A) e de um disco (B) de extracção. [19] ...........................9
Figura 5 – Diferentes sistemas de extracção: A-seringa, B-Kitasato e C-Sistema extractor. [19] ....... 10
Figura 6 – (a) Representação do dispositivo utilizado em SPME; (b) Técnicas de SPME por
headspace e imersão directa. ........................................................................................ 11
Figura 7 – Processos cromatográficos. [22] ...................................................................................... 12
Figura 8 – Esquema geral de um cromatógrafo gasoso. ................................................................... 12
Figura 9 – Esquema geral das partes integrantes de um cromatógrafo líquido. [27] .......................... 14
Figura 10 – Esquema geral de um espectrómetro de massa............................................................. 15
Figura 11 – Esquema representativo da fonte de ionização por ESI. [32] .......................................... 16
Figura 12 – Esquema representativo da fonte de ionização por APCI. [32] ....................................... 17
Figura 13 – Esquema representativo da espectrometria de massa sequencial (MS/MS). [33] ........... 18
Figura 14 – Sistema de LC-ESI-MS/MS utilizado para a realização do presente trabalho.................. 22
Figura 15 – Representação esquemática do modo de operação do MS1 e MS2 para obtenção: (a) ião
precursor; (b) iões produto.[39] ...................................................................................... 25
Figura 16 – Janela do software Masslynx 4.0 com o método definido (MS Method). ......................... 26
Figura 17 – Espectro de massa resultante da fragmentação do ião precursor para o 2-A-4-CP. ....... 30
Figura 18 – Procedimento: a – LLE; b – Rotavapor; c – Evaporação sob corrente de N2. .................. 35
Figura 19 – Montagem utilizada na extracção SPE com discos......................................................... 36
Figura 20 – Sistema de extracção SPE com cartuchos utilizado. ...................................................... 37
Figura 21 – Cromatogramas obtidos para a análise em duplicado da amostra de água do Rio Tejo da
zona do Parque Tejo fortificada com (a) e (b) – 4 mg/L e (c) e (d) – 10 mg/L do composto
2-A-4-CP. ...................................................................................................................... 39
Figura 22 – Cromatogramas obtidos para a análise da amostra de água do Rio Tejo da zona da
Chamusca (50 e 100 mL) fortificada com 4 mg/L (a) e (b), e 10 mg/L (c) e (d), do
composto 2-A-4-CP. ...................................................................................................... 41
xiv
xv
Índice de Tabelas
Tabela 1 – Propriedades Físicas e Químicas dos CP’s em estudo.[4],[5],[7]. .......................................4
Tabela 2 – Concentração das soluções padrão dos CP’s analisados. ............................................... 23
Tabela 3 – Condições gerais do espectrómetro de massa para os CP's analisados. ......................... 24
Tabela 4 – Condições operatórias do HPLC para os CP’s analisados ............................................... 25
Tabela 5 – Dados para definição do método, no software Masslynx 4.0, para a análise dos CP’s em
estudo por LC-ESI-MS/MS.. ............................................................................................ 26
Tabela 6 – Procedimento de extracção com cartuchos do tipo SDB de 6 mL e 200 mg de
adsorvente…. .............................................................................................................. 27
Tabela 7 – Ião de Quantificação e Ião de Qualificação para os CP’s em estudo ............................... 30
Tabela 8 – Tempos de retenção para o ião de quantificação referente a cada um dos CP’s em estudo
para as condições cromatográficas optimizadas (Anexo IV)............................................. 33
Tabela 9 – Dados obtidos para a regressão linear, na gama de trabalho de 2 – 10 mg/L, para o 2-A-4-
CP pela metodologia LC-ESI-MS/MS... ........................................................................... 34
Tabela 10 – Cartuchos utilizados e respectivas percentagens de recuperação para a extracção de 50
mL de água Milli-Q fortificada com padrão de 10 mg/L de 2-A-4-CP e acidificada a pH
2… ................................................................................................................................ 37
Tabela 11 – Resultados obtidos para os ensaios de recuperação com os cartuchos SDB (6 mL, 200
mg) para diferentes volumes de água Milli-Q e para uma fortificação de 10 mg/L de 2-A-
4-CP... ......................................................................................................................... 38
Tabela 12 – Resultados obtidos para os ensaios de recuperação com os cartuchos SDB (3 mL, 100
mg) para diferentes volumes de amostra de água do Rio Tejo da zona da Chamusca e
fortificação de 4 e 10 mg/L... ........................................................................................ 41
xvi
xvii
Lista de Símbolos e Abreviaturas
%Rec: Percentagem de recuperação
2,4,5-TCP: 2,4,5-triclorofenol
2,4,6-TCP: 2,4,6-triclorofenol
2,4-DCP: 2,4-diclorofenol
2-A-4-CP: 2-amino-4-clorofenol
2-CP: 2-clorofenol
3-CP: 3-clorofenol
4-C-3-MP: 4-cloro-3-metilfenol
4-CP: 4-clorofenol
ACN: Acetonitrilo
APCI: Ionização química à pressão
atmosférica
CC: Curva de calibração
CID: Dissociação induzida por colisão
CP’s: Clorofenóis
ESI: Ionização por Electrospray
FE: Fase estacionária
FM: Fase móvel
GC: Cromatografia gasosa
HPLC: Cromatografia líquida de alta
eficiência
HS: Headspace
IPAC: Instituto Português de Acreditação
IUPAC: União Internacional de Química Pura
e Aplicada
Ka: Constante de dissociação
Kow: Coeficiente de partição no sistema
octanol/água
L.D.: Limite de detecção
L.Q.: Limite de quantificação
LAIST: Laboratório de Análises do Instituto
Superior Técnico
LC-MS/MS: Cromatografia líquida com
detector de espectrometria de
massa sequencial
LLE: Extracção líquido-líquido
MeOH: Metanol
MM: Massa molecular
MRC: Materiais de Referência Certificados
MS: Espectrometria de massa
MS1: 1º Quadrupolo
MS2: 2º Quadrupolo
OMS: Organização Mundial de Saúde
PC: Padrão de controlo
PCP: Pentaclorofenol
Q: Célula de colisão
RSD %: Desvio-padrão relativo
SIM: Monitorização selectiva de iões
SPE: Extracção em fase sólida
SPME: Microextracção em fase sólida
Tr: Tempo de retenção
US-EPA: Agência de Protecção Ambiental
dos Estados Unidos
VMA: Valor máximo admissível
xviii
1
1. Introdução
1.1. O Laboratório de Análise do IST
O Laboratório de Análises foi criado no final do século XIX (Portaria
de 13 de Dezembro e 1892), pelos Professores Charles LePierre e
Herculano de Carvalho, ainda no Instituto Industrial e Comercial de
Lisboa, o qual deu origem ao Instituto Superior Técnico (IST) mantendo-se
nas mesmas instalações. Em 15 de Julho de 1911 foi publicado o
regulamento do IST e neste a posição do Laboratório é individualizada
como “estação oficial para análises industriais e químicas”. Esta posição manteve-se após a
passagem do IST para as presentes instalações. Actualmente, o Laboratório de Análises do IST
(LAIST), depende directamente do Conselho de Gestão do IST.[1]
O LAIST encontra-se dividido em cinco núcleos analíticos e uma área Administrativa, definidos
de acordo com as suas áreas de actividade (Análises gerais, Orgânicos, Metais e Microbiologia) sob
a orientação de técnicos qualificados e dirigidos por um coordenador técnico. O laboratório possui
acreditação desde 1994, encontrando-se actualmente acreditado segundo a Norma NP EN ISO/IEC
17025 pelo Instituto Português de Acreditação (IPAC).[1]
A posição de destaque que o LAIST tem vindo a assumir deve-se em grande parte às
ferramentas de que dispõe para responder da melhor maneira aos seus clientes, não só no que
respeita à análise de águas, mas também e cada vez mais no que se refere à análise de outras
matrizes (matrizes sólidas, alimentos, detergentes, entre outras). O leque variado de metodologias e
de parâmetros que possui permite dar resposta às exigências legislativas nos diversos tipos de
matrizes.[1]
O estágio que serviu de base à presente dissertação foi desenvolvido no Núcleo II dos
Orgânicos, com a coordenação da Engenheira Georgina Sarmento.
1.2. Objectivo
Actualmente o LAIST já dá resposta aos seus clientes no que respeita à determinação dos
CP’s (2-CP, 3-CP, 4-CP, 2,4-DCP, 2,4,5-TCP, 2,4,6-TCP, PCP e 4-C-3-MP) em águas de consumo,
águas residuais e águas naturais. Estas análises são efectuadas por microextracção em fase sólida
em headspace com recurso à técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa
(HS-SPME-GC-MS). Contudo, a determinação do 2-A-4-CP através da metodologia referida não é
possível, devido à sua elevada polaridade.
Assim, o presente trabalho teve como principal objectivo desenvolver uma nova metodologia
analítica por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por espectrometria de massa para
a análise conjunta de CP’s em águas, com especial ênfase no composto 2-A-4-CP. Pretendeu-se
2
deste modo, alargar o leque de metodologias do LAIST permitindo que o mesmo possa, futuramente,
dar resposta a clientes que solicitem a determinação do 2-A-4-CP em águas.
Para a concretização dos objectivos do presente trabalho foram seguidas as seguintes
directrizes:
- Pesquisa bibliográfica sobre a metodologia de extracção dos CP’s. Avaliação das melhores
condições, nomeadamente as aplicáveis no LAIST;
- Após selecção, implementação da metodologia de extracção mais adequada aos fins em
vista;
- Determinação dos CP’s por cromatografia líquida com detecção por espectrometria de
massa;
- Comparação dos resultados obtidos com os dos métodos existentes e aplicáveis.
1.3. Enquadramento
Nas últimas décadas a descarga para o meio ambiente de elevadas quantidades de compostos
químicos de origem sintética provenientes das actividades industrial, agrícola, médica e doméstica
tem sido prejudicial para os organismos vivos.
Os CP’s enquadram-se no cenário supramencionado, sendo alguns deles considerados
poluentes prioritários por agências governamentais em todo o mundo. Embora com toxicidade
variável todos são descritos como possuindo elevada toxicidade, propriedades mutagénicas e
carcinogénicas. Deste modo a presença de CP’s em águas residuais e de consumo humano é sujeita
a uma apertada legislação.
1.3.1. Clorofenóis
Os CP’s são compostos organoclorados constituídos pelo fenol, cujo anel aromático possui
átomos de cloro que podem ir até cinco (Figura 1). Existem 5 tipos básicos de CP’s: monoclorofenóis,
diclorofenóis, triclorofenóis, tetraclorofenóis e pentaclorofenóis. No total existem 19 CP’s diferentes,
distinguindo-se entre si pelo número de átomos de cloro bem como pela posição ocupada pelos
mesmos face ao grupo hidroxilo (-OH).[2]
Figura 1 – Estrutura geral dos CP’s (n – nº de Cl).
3
De entre os compostos fenólicos, os CP’s consistem no maior e mais difundido grupo. A sua
aplicação num leque variado de actividades, desde a agricultura até à indústria, tem contribuído ao
longo das últimas décadas para a dispersão dos mesmos nos ecossistemas, verificando-se a
contaminação de águas superficiais e subterrâneas e, por conseguinte de águas para consumo
humano. A Figura 2 pretende ilustrar o que acima foi referido.[3]
Figura 2 – Ciclo dos CP’s.[3]
1.3.2. Origem e Utilizações dos Clorofenóis
Os CP’s são compostos orgânicos de origem sintética que podem ser obtidos pela cloração do
fenol ou pela hidrólise de clorobenzenos. O processo de branqueamento da polpa de madeira, bem
como toda a indústria da celulose constitui uma das maiores fontes de CP’s. Contudo, estes
compostos podem também surgir no meio ambiente como produtos resultantes da degradação de
alguns pesticidas ou do processo de desinfecção por cloração da água para consumo humano.[4]
De entre os diferentes CP’s, o pentaclorofenol (PCP) tem sido extensamente utilizado como
agente conservante da madeira. Misturas de CP’s, por exemplo, de 2,4,6-triclorofenol e 2,3,4,6-
tetraclorofenol, são também utilizadas com a finalidade de prevenir a infecção fúngica e microbiana
da madeira.[5]
A nível industrial, somente oito dos CP’s existentes (monoclorofenóis, 2,4-diclorofenol, 2,4,6-
triclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, 2,3,4,5-tetraclorofenol, 2,3,4,6-tetraclorofenol e pentaclorofenol) têm
sido utilizados. Por exemplo, os compostos 2,4-diclorofenol, 2,4,5-triclorofenol e 2,4,6-triclorofenol
têm sido aplicados como intermediários na síntese de herbicidas ácidos, nomeadamente dos 2,4-D e
2,4,5-T.[4], [5]
O caso de estudo do presente trabalho, o composto 2-amino-4-clorofenol também designado
por 5-cloro-2-hidroxianilina ou p-cloro-o-aminofenol é utilizado como um intermediário para a síntese
de corantes, pigmentos e produtos farmacêuticos, por exemplo o Clorzoxazona que consiste num
relaxante muscular.[6]
4
1.3.3. Propriedades Físicas e Químicas dos Clorofenóis
Existe uma grande variabilidade entre os CP’s no que respeita às propriedades físicas e
químicas, sendo a mesma resultante dos diferentes graus de cloração e da posição dos átomos de
cloro relativamente ao grupo OH.
No que respeita ao estado físico dos CP’s, à excepção do 2-CP que é líquido, os restantes
encontram-se no estado sólido à temperatura ambiente.[4]
Em termos de solubilidade, os CP’s em geral dissolvem-se mal em água, mas bem em
solventes orgânicos. A solubilidade em água diminui à medida que o número de átomos de cloro
substituintes aumenta. Este parâmetro apresenta uma extrema importância, uma vez que está
directamente associado ao transporte dos CP’s no meio ambiente.[4]
Os CP’s são considerados compostos ligeiramente ácidos, sendo de notar que a sua acidez é
inferior à do fenol.[4]
Outros parâmetros directamente relacionados com o destino e transporte destes compostos
para o meio ambiente são a constante de dissociação (Ka) e o coeficiente de partição no sistema
octanol/água (Kow). A constante de dissociação depende da estrutura molecular do composto,
destacando-se neste caso a influência do número de átomos de cloro substituintes. Assim, para os
CP’s a constante Ka aumenta (pKa diminui) à medida que o grau de cloração também aumenta.[4]
Por sua vez, os coeficientes de partição no sistema octanol/água aumentam significativamente
com o número de átomos de cloro.[4]
Na Tabela 1 apresentam-se sintetizadas as propriedades físicas e químicas dos CP’s em
estudo.
Tabela 1 – Propriedades Físicas e Químicas dos CP’s em estudo.[4], [5], [7]
Neste ponto interessa referir outra propriedade importante – a toxicidade. Este parâmetro
define-se como a capacidade de um composto químico afectar os sistemas biológicos. A toxicidade
dos CP’s depende do seu grau de cloração, diminuindo à medida que o mesmo aumenta. Depende,
igualmente, da posição dos átomos de cloro relativamente ao grupo hidroxilo (-OH). [4]
Assim, de
acordo com alguns estudos citados na literatura [4], os CP’s com um átomo de cloro na posição 2 do
Composto Fórmula MM
(g/mol)
Ponto de Fusão
(°C)
Ponto de Ebulição
(°C) pKa log Kow
Solubilidade em água a 20°C (g/L)
2-CP C6H5ClO 128,56 9,3 174,9 8,3 – 8,6 2,12 – 2,17 28
3-CP C6H5ClO 128,56 33 – 34 214 8,8 – 9,1 2,48 – 2,50 26
4-CP C6H5ClO 128,56 42 – 44 217 – 219 9,1 – 9,4 2,35 – 2,44 27
2,4-DCP C6H4Cl2O 163,00 45 210 7,5 – 8,1 2,75 – 3,30 4,5
2,4,5-TCP C6H3Cl3O 197,45 67 – 70 sublima 7,0 – 7,7 3,72 – 4,10 0,948
2,4,6-TCP C6H3Cl3O 197,45 69 243 – 249 6,0 – 7,4 3,60 – 4,05 0,434
PCP C6HCl5O 266,34 190 300 4,7 – 4,9 5,01 – 5,86 0,014
4-C-3-MP C7H7ClO 142,58 63 – 65 235 – 239 9,55 3,10 3,9
2-A-4-CP C6H6ClNO 143,57 140 - - 1,24 3
5
anel são menos tóxicos do que os restantes. Por sua vez, quando os átomos de cloro se encontram
nas posições 3, 4 e 5 a toxicidade dos CP’s aumenta, verificando-se a situação contrária, caso os
grupos clorados ocupem as posições 2 e 6.
A carcinogenicidade dos CP’s depende do pH e da presença de outros compostos no meio
ambiente. Para o organismo humano, o risco não advém somente da presença de alguns CP’s, mas
também dos compostos com nível de toxicidade superior resultantes do seu metabolismo. [4]
Os CP’s são bioacumuláveis, isto é, acumulam-se em elevadas quantidades nos organismos,
por via directa ou através da cadeia alimentar. [4]
1.3.4. Impacto no Ambiente e na Saúde Humana
Tal como já foi referido anteriormente, os CP’s estão presentes em diversos ecossistemas, tais
como águas subterrâneas e superficiais, sedimentos, ar atmosférico e solos.
As formas de ocorrência dos CP’s dependem não só do pH do meio, mas também das
propriedades físico-químicas dos compostos em particular.[4]
A contaminação dos ambientes
aquáticos contribui para o envenenamento dos organismos aí existentes e, consequentemente dos
que pertencem a níveis tróficos superiores. Esta realidade é agravada pelas características
recalcitrantes dos CP’s, isto é, pelo facto destes compostos poderem permanecer no ambiente com
níveis de toxicidade inalterados durante um longo período de tempo.[8]
No ar atmosférico, os CP’s estão presentes sob a forma de vapores provenientes de
actividades relacionadas com a produção e manufactura de alguns produtos, combustão de resíduos,
carvão ou madeira. Os níveis de concentração de CP’s no ar ambiente é um efeito de fontes de
emissão local.[4]
Nos solos, os CP’s são originados a partir de processos tecnológicos, da biodegradação de
herbicidas e pesticidas e da deposição atmosférica. O transporte de CP’s no solo é afectado por
diversos factores, nomeadamente a sua solubilidade em água, o pH do solo, a precipitação total, o
conteúdo em matéria orgânica, a granulação e permeabilidade do solo, os processos biológicos que
ocorrem no solo, a taxa de evaporação, entre outros.[4]
Os níveis de concentração nos ecossistemas supramencionados variam de forma significativa
e em grande parte dependem da taxa de industrialização da região e das fontes de emissão locais.
Em suma, a contaminação do meio ambiente com CP’s consiste num sério problema ecológico
nos países onde são vulgarmente utilizados como agentes de conservação da madeira e de
protecção de plantas.[4]
No que respeita à saúde humana, os efeitos da exposição aos CP’s dependem de diversos
factores, tais como dose, tempo de exposição e via (inalação, ingestão, contacto dérmico e ocular),
interacções com outros compostos e condições físicas do organismo. Verificam-se diferentes níveis
de intoxicação consoante o grau de cloração dos compostos. Assim, enquanto a exposição a fenóis
mono ou diclorados provoca convulsões, os fenóis mais clorados provocam fosforilação oxidativa que
pode proporcionar o envelhecimento celular e diversas patologias.[4]
6
Relativamente à maior fonte de CP’s e produtos relacionados - a indústria – têm vindo a ser
realizados testes a operários, verificando-se que os mesmos têm uma maior probabilidade de serem
portadores de patologias do foro oncológico (cancro de pulmão, linfoma de Hodgkin, entre outros) por
via da sua exposição a este tipo de compostos. Pelas razões enumeradas, certos CP’s (2,4,6-TCP,
2,4,5-TCP e PCP) são classificados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como compostos
passíveis de apresentar propriedades carcinogénicas.[8]
1.3.5. Legislação – Limites Legais
Em todo o mundo, devido aos efeitos adversos dos CP’s no meio ambiente e na saúde humana
têm vindo a ser impostas limitações quanto ao uso e produção deste tipo de compostos.[4]
A descarga de compostos químicos no meio ambiente provenientes de diferentes fontes afecta
a qualidade do ar, água e solo e a saúde humana. A monitorização desses compostos constitui assim
uma ferramenta imprescindível no controlo de qualidade dos diferentes ecossistemas.[4]
Posto isto, as agências governamentais em todo o mundo emitiram declarações políticas não
apenas com o objectivo de preservar a saúde da população mundial mas também o meio ambiente.
Neste ponto, tendo em conta o objectivo do trabalho, é dado especial destaque ao meio
hídrico.
A União Europeia e a Agência de Protecção Ambiental dos Estados Unidos (US-EPA)
classificaram um número de compostos como substâncias perigosas que devem ser monitorizadas
em águas, devido à sua toxicidade e persistência no meio ambiente. Nesse leque estão presentes os
CP’s e substâncias que podem ser convertidas nesses compostos organoclorados.[4]
Por forma a reduzir a utilização de CP’s e assim minimizar as contaminações ambientais e os
riscos para a saúde humana foram estabelecidos limites legais.
A OMS estabelece para águas para consumo humano os valores de referência 9 µg/L e 200
µg/L para os compostos PCP e 2,4,6-TCP, respectivamente. [9]
De acordo com o normativo nacional - Decreto-Lei n.º 236/98, de 1 de Agosto - e comunitário -
Directiva 76/464/CEE, de 4 de Maio - é necessário controlar a poluição causada pela descarga de
certas substâncias perigosas no meio aquático. Este documento estabelece, no Anexo XXI, para
águas superficiais o valor máximo admissível (VMA) de 100 µg/L por composto. O Anexo XX deste
Decreto impõe como VMA 2 µg/L para o PCP nos diversos tipos de águas. [10]
A Directiva 76/464/CEE
foi revogada em 2013, passados treze anos após a entrada em vigor da Directiva-Quadro da Água
(2000/60/CE).
O Decreto-Lei nº.103/2010, de 24 de Setembro – transposição da Directiva n.º 2008/105/CE,
de 16 de Dezembro – estabelece, no Anexo III, como norma de qualidade ambiental (NQA) para
águas superficiais o valor de 0,4 µg/L de PCP. Este documento veio revogar as direcções do Decreto-
Lei n.º 236/98 relativas aos CP’s.[11]
A Directiva 2013/39/UE, de 12 de Agosto efectua a revisão da
Directiva n.º 2008/105/CE no que respeita às substâncias prioritárias no domínio da política da água.
Por sua vez, o Decreto-Lei nº 506/99 de 20 de Novembro estabelece os objectivos de
qualidade para águas interiores, estuarinas e de transição para os compostos 4-C-3-MP, 2-CP, 2,4-
DCP e triclorofenóis (2,4,5-TCP e 2,4,6-TCP) em 40, 50, 20 e 1 µg/L, respectivamente.[12]
7
A US-EPA fixou como concentração máxima admissível de PCP em águas para consumo
humano o valor de 1 µg/L.[13]
Como se verifica, no que respeita à legislação de CP’s não é feita referência ao composto 2-A-
4-CP (caso de estudo).
1.4. Metodologia Analítica
Esta secção do trabalho inicia-se com um breve levantamento das metodologias existentes
para determinação de CP’s. Seguidamente, apresentam-se as técnicas de preparação de amostras
mais utilizadas. Por fim, efectua-se uma breve abordagem ao conceito de cromatografia, bem como
aos tipos de processos cromatográficos existentes, destacando-se a cromatografia gasosa por ser
actualmente a técnica vigente no LAIST para a análise de CP’s e a cromatografia líquida por constituir
o objectivo do presente trabalho juntamente com a espectrometria de massa.
1.4.1. Estado da Arte
Pretende-se neste ponto do trabalho efectuar o levantamento dos métodos existentes para a
determinação de compostos fenólicos.
Estes compostos como já foi referido anteriormente possuem características que tornam a sua
monitorização necessária, sendo por isso de extrema importância a existência de metodologias
analíticas confiáveis e com elevada sensibilidade. [14]
Os métodos analíticos actuais da US-EPA (604, 605 e 8041) para a determinação de
compostos fenólicos baseiam-se na extracção líquido-líquido (LLE) seguida de cromatografia gasosa
(GC) com recurso a diferentes detectores, nomeadamente detector por captura electrónica (ECD),
detector por ionização de chama (FID) ou detector de espectrometria de massa (MS).[15]
Verifica-se, no entanto, uma tendência crescente para a substituição destas técnicas por
extracção em fase sólida (SPE) e cromatografia líquida (LC) com o propósito de evitar o
manuseamento de elevadas quantidades de solventes orgânicos tóxicos e eliminar a necessidade de
derivatização antes da análise.[15]
De entre os vários tipos de adsorventes utilizados em SPE, os materiais poliméricos têm vindo
a assumir uma posição de destaque no que respeita à extracção de compostos fenólicos.
Relativamente à análise por LC, os detectores de UV são os mais utilizados. Porém, a detecção
electroquímica (ED) surge como uma alternativa viável principalmente quando se analisam amostras
limpas, por exemplo água para consumo humano. O desenvolvimento de interfaces à pressão
atmosférica (API), permitiu superar alguns obstáculos associados ao acoplamento LC-MS,
conduzindo a uma maior utilização deste tipo de sistemas para a análise de compostos fenólicos.
Outras abordagens emergentes são a utilização da microextracção em fase sólida (SPME) e a
combinação da SPE com a cromatografia de fluido supercrítico (SFE).[15]
Em alternativa aos métodos clássicos de cromatografia, a electroforese capilar (CE) tem sido
utilizada, nas suas diversas formas, para a determinação de compostos fenólicos. Esta técnica
8
analítica apresenta, para além da elevada resolução, compatibilidade com detectores MS. [15]
Existem
relatos na literatura sobre a separação dos CP’s, mais concretamente dos isómeros, por electroforese
capilar de zona (CZE) ou por cromatografia electrocinética micelar (MEKC).[16]
As técnicas biológicas, tais como ensaios imunológicos e biossensores surgem da necessidade
de desenvolver tecnologias rápidas, portáteis e económicas que possam ser aplicadas por exemplo
como métodos de rastreio dos analitos de interesse antes da análise cromatográfica. [15]
Um exemplo
do progresso verificado ao nível dos ensaios imunológicos consistiu no desenvolvimento de um
método baseado no teste ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) para a determinação de CP’s
em matrizes aquosas.[17]
Relativamente aos biossensores, o aperfeiçoamento em termos de sensibilidade e estabilidade
dos biossensores amperométricos tem contribuído para a sua utilização com sucesso na análise de
compostos fenólicos.[18]
1.4.2. Métodos de Preparação de Amostras
Neste capítulo descrevem-se de modo sucinto as técnicas de preparação de amostras
aplicadas no presente trabalho, nomeadamente a extracção líquido-líquido (LLE) e a extracção em
fase sólida (SPE). A microextracção em fase sólida (SPME) é aqui também mencionada, uma vez
que constitui a técnica vigente no LAIST para a extracção de CP’s.
As diversas técnicas utlizadas na preparação de amostras têm como principal objectivo isolar
o(s) componente(s) de interesse ou analito(s) de uma matriz complexa, eliminando assim as
substâncias interferentes. As técnicas de LLE e SPE continuam a ser primeira escolha no decorrer da
implementação de novas metodologias analíticas.[19]
A etapa de preparação de amostras é determinante para a precisão e exactidão do método
implementado, sendo de extrema importância a escolha de uma técnica que seja capaz de produzir
recuperações reprodutivas do analito e dessa forma garantir a qualidade dos resultados analíticos.
É importante referir que dependendo do tipo de matriz pode ser ou não necessário o pré-
tratamento das amostras.[19]
1.4.2.1. Extracção líquido-líquido (LLE)
A extracção líquido-líquido é uma técnica cujo princípio de funcionamento assenta na
distribuição do analito entre dois líquidos imiscíveis de acordo com um coeficiente de partição,
utilizando a montagem representada na Figura 3. Desta feita, a LLE requer a escolha de um solvente
extractor adequado e que possua afinidade para com os analitos a extrair, por forma a minimizar-se a
quantidade utilizada do mesmo, sem prejudicar a recuperação do analito.[19]
9
Figura 3 – Representação da montagem utilizada em LLE.[20]
Consiste numa técnica bastante simples, de baixo custo e elevada versatilidade, sendo a
utilização de elevadas quantidades de solventes orgânicos tóxicos o principal entrave à sua aplicação
como método de extracção.[19]
1.4.2.2. Extracção em fase sólida (SPE)
A extracção em fase sólida (SPE) consiste na adsorção selectiva do analito em materiais
sólidos, designados de adsorventes, seguida da desadsorção com solventes. Apresenta maior
utilização quando se está perante matrizes complexas. De entre a variada gama de adsorventes
destacam-se os derivados de sílica C8 (octil), C18 (octadecil) e CN (ciano). [19]
De acordo com o tipo de adsorvente e com o tipo de utilização, a SPE pode ser classificada em
modo reverso, modo normal e troca iónica. No modo reverso a retenção do analito ocorre devido a
interacções de van der Waals não polares. No que respeita ao modo normal, as interacções são do
tipo ligações de hidrogénio, - e dipolo-dipolo. Por fim, no modo troca iónica observam-se
interacções electrostáticas. [19]
A SPE pode ser efectuada com recurso a cartuchos (colunas) ou discos de extracção,
representados na Figura 4.
Figura 4 – Representação de um cartucho (A) e de um disco (B) de extracção. [19]
Por forma a ser possível efectuar um elevado número de extracções num curto espaço de
tempo utilizam-se sistemas de extracção sob vácuo (Figura 5).
Fase superior
Abertura superior destapada
Aro de suporte
Fase inferior
Torneira
Recipiente de recolha
adsorvente
adsorvente
10
Figura 5 – Diferentes sistemas de extracção: A-seringa, B-Kitasato e C-Sistema extractor. [19]
As etapas típicas de um procedimento de extracção por SPE são as seguintes [21]
:
Condicionamento da coluna/disco: utilizam-se volumes definidos de solvente, tendo o
cuidado de não deixar secar a coluna/disco após esta etapa.
Adição da amostra: a amostra deve percolar através do cartucho/disco a um fluxo
constante (menor ou igual a 5 mL/min, no caso dos cartuchos).
Lavagem da coluna/disco: utiliza-se um volume definido de solvente e por fim deixa-se
secar a coluna/disco, se necessário com o auxílio de uma bomba de vácuo por um tempo pré-
determinado.
Eluição dos analitos: utilizam-se alíquotas definidas de solvente para eluir os analitos da
coluna/disco.
1.4.2.3. Microextracção em fase sólida (SPME) [19]
A microextracção em fase sólida é uma técnica associada à análise de compostos por
cromatografia gasosa (GC). Actualmente está também associada à cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC).
A SPME recorre a uma fibra óptica de sílica fundida coberta com um adsorvente adequado. A
fibra encontra-se acondicionada no interior de uma espécie de agulha num amostrador semelhante a
uma seringa (Figura 6 – (a)), sendo exposta apenas no momento da extracção.
O processo de extracção pode ser efectuado de duas formas, por imersão da fibra
directamente na matriz ou através da exposição no espaço confinante, isto é, o designado headspace
(Figura 6 – (b)). A extracção em headspace requer o aquecimento e/ou agitação da matriz, de modo a
promover a passagem dos compostos voláteis para o espaço de cabeça do recipiente, onde ficarão
em contacto com a fibra. Deste modo minimiza-se a contaminação da fibra pela adsorção de
compostos não voláteis presentes na matriz. A extracção por imersão directa da fibra utiliza-se
quando os analitos de interesse são pouco voláteis.
Posteriormente à extracção, o analito é desadsorvido com recurso a aquecimento (GC) ou a
quantidades reduzidas de um solvente adequado (HPLC).
11
Figura 6 – (a) Representação do dispositivo utilizado em SPME; (b) Técnicas de SPME por headspace e
imersão directa.
1.4.3. Cromatografia
Pretende-se neste ponto do trabalho abordar de um modo sucinto e claro o conceito de
cromatografia, focando alguns aspectos importantes a ele associados.
Assim, o fenómeno designado de cromatografia foi descoberto em 1906 pelo botânico russo
Mikhael Tswett, no decorrer do seu trabalho para obtenção do grau de doutor em ciências,
debruçando-se o mesmo na separação de pigmentos coloridos presentes em vegetais. O termo
cromatografia provém das palavras gregas chroma (cor) e grafein (grafia).[22]
‘I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic
method.’ – M.S. Tswett [23]
A IUPAC (International Union of Pure Applied Chemistry, 1993) define cromatografia como um
método físico-químico de separação em que os componentes a separar são distribuídos entre duas
fases, uma das quais é estacionária (fase estacionária) enquanto a outra se move (fase móvel) numa
determinada direcção. A interacção dos componentes de uma mistura com as duas fases acima
mencionadas é influenciada por diferentes forças intermoleculares (iónica, dipolar, apolar) e efeitos
específicos de afinidade e solubilidade. [24]
A cromatografia pode ser utilizada para separar, identificar ou quantificar compostos químicos,
existindo muitas vezes associada a outras metodologias analíticas. [22]
Os métodos cromatográficos podem ser classificados de acordo com o tipo de sistema
cromatográfico, com a fase móvel (FM) e com a fase estacionária (FE), como se indica na Figura 7.[22]
12
Figura 7 – Processos cromatográficos. [22]
De entre os diversos processos cromatográficos será dado especial destaque à cromatografia
gasosa e à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), por consistirem nas metodologias de
análise vulgarmente utilizadas.
1.4.4. Cromatografia Gasosa [25]
A cromatografia gasosa (GC) é uma técnica que permite a separação e análise de misturas de
substâncias voláteis.
O princípio básico de funcionamento de GC envolve a vaporização da amostra no injector,
sendo a mesma introduzida num fluxo de gás inerte que constitui a FM. Os gases H2, He ou N2 são
geralmente utilizados como gás de arraste. O conjunto amostra vaporizada e gás de arraste
atravessa a coluna cromatográfica que contém a FE e onde ocorre a separação da mistura.
Posteriormente, os componentes separados saem da coluna dissolvidos no gás de arraste e passam
por um detector que gera um sinal eléctrico proporcional à quantidade de composto eluído. O registro
do sinal obtido em função do tempo consiste num cromatograma, no qual se observam picos relativos
a cada composto com áreas proporcionais à sua massa.
Apresenta-se na Figura 8 o esquema geral de um cromatógrafo gasoso.
Figura 8 – Esquema geral de um cromatógrafo gasoso.
Cromatografia
Planar Coluna
Camada Fina
Papel Líquida Fluido
Supercrítico Gasosa
Clássica HPLC
13
Relativamente à FE, esta pode consistir num sólido adsorvente ou num filme de líquido pouco
volátil suportado por um sólido inerte ou pela própria parede do tubo. As FE líquidas são as mais
requeridas para GC, sendo necessário que as mesmas preencham alguns requisitos, tais como,
permitirem a boa dissolução dos constituintes da amostra e ao mesmo tempo a obtenção de
solubilidades suficientemente diferentes que possibilitem a separação. Resta salientar, que as FE
devem ser quimicamente inertes em relação à amostra.
Em GC a separação dos componentes de uma mistura é influenciada por dois factores,
nomeadamente a solubilidade na FE anteriormente mencionada e a volatilidade. Assim, quanto maior
a solubilidade de um composto na FE, mais demorada é a sua eluição, isto é, ele atravessa a coluna
mais lentamente. Por sua vez, quanto mais voláteis são os constituintes de uma mistura, maior é a
sua tendência em permanecer vaporizados e, consequentemente mais rápida é a sua eluição.
No que respeita aos detectores usualmente empregues em GC, destacam-se os seguintes:
Detector por Condutividade Térmica (TCD)
Detector de Azoto e Fósforo (NPD)
Detector por Ionização de Chama (FID)
Detector por Captura Electrónica (ECD)
Detector de Espectrometria de Massa (MS)
1.4.5. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
A cromatografia líquida (LC) utiliza partículas sólidas empacotadas num tubo feito de material
inerte que é atravessado pela fase móvel. De acordo com o tipo de interacção, os solutos terão uma
maior afinidade com a FE ou com a FM. As interacções podem ser do tipo forças de Van der Waals,
interacções de dipolo induzido, ligações de hidrogénio, interacções dieléctricas ou interacções
electrostáticas. [26]
A cromatografia líquida de alta eficiência apresenta uma instrumentação mais complexa e
sofisticada do que a cromatografia líquida clássica. Devido às reduzidas dimensões das partículas
usadas (da ordem dos µm) é necessário usar pressões elevadas (da ordem das dezenas de
atmosferas) o que requer sistemas complexos de bombas e de válvulas de injecção. É possível
efectuar por HPLC, separações e análises quantitativas de uma grande variedade de compostos
presentes em diferentes matrizes, num curto espaço de tempo e com elevada resolução, eficiência e
sensibilidade. [26]
Ao contrário do que acontece em GC, os equipamentos em LC são, frequentemente,
modulares o que permite recorrer a diversos fabricantes de acordo com o interesse do utilizador.
De um modo geral, num sistema de HPLC o solvente denominado de eluente ou FM é
conduzido com o auxílio de uma bomba de alta pressão em direcção à coluna cromatográfica. No
decorrer desse processo, a amostra é introduzida na FM (por um sistema automático ou por uma
válvula de injecção) e arrastada para a coluna onde irá ocorrer a separação. O efluente da coluna é
direccionado para um detector que gera um sinal eléctrico proporcional à quantidade de analito. Esse
14
sinal é transformado, com recurso a um software apropriado, num cromatograma, tal como acontece
em GC. [26]
Na Figura 9 ilustram-se as partes integrantes de um cromatógrafo líquido.
Figura 9 – Esquema geral das partes integrantes de um cromatógrafo líquido. [27]
Relativamente às fases estacionárias, as mais vulgarmente utilizadas são líquidas,
quimicamente ligadas a um suporte sólido inerte que contém grupos silanóis (Si-OH) que reagem
com compostos contendo grupos polares (Fase Normal) ou não polares (Fase Reversa). Em
cromatografia de Fase Normal os grupos funcionais polares mais comuns são sílica, amino (NH2),
ciano (CN) e diol. Por sua vez, na cromatografia em Fase Reversa, os grupos butil (C4), octil (C8),
octadecil (C18) e fenil são os mais utilizados. [27]
Outro dos parâmetros essenciais para o bom funcionamento de qualquer sistema de HPLC é a
escolha e preparação correcta da fase móvel. Na escolha da FM são tidas em consideração algumas
características, destacando-se a viscosidade, a compatibilidade com o tipo de detector utilizado, a
polaridade e a miscibilidade. O solvente ou mistura de solventes utilizados não devem possuir
elevada viscosidade para não dificultar o bombeamento isocrático ou por gradiente e evitar a queda
de pressão na coluna. [26]
Em fase reversa, a força de eluição aumenta com a diminuição da polaridade da FM,
verificando-se a situação oposta quando se utiliza fase normal (força de eluição aumenta com o
aumento da polaridade da FM). A FM seleccionada deve permitir uma boa dissolução dos compostos
e ao mesmo tempo ser imiscível com a FE. [26]
No que respeita aos detectores, considera-se um detector ideal para HPLC aquele que possua
as seguintes características: alta sensibilidade e baixo limite de detecção, resposta rápida a todos os
solutos, insensibilidade a alterações nas temperaturas e no fluxo da fase móvel, resposta
independente da fase móvel, resposta que aumente linearmente com a quantidade de soluto, não
destruição do soluto, segurança e conveniência de uso, informação qualitativa do pico desejado. [26]
Assim, os detectores vulgarmente utilizados em HPLC são [27]
:
Detectores de UV-Visível (UV-VIS)
Detector de Índice de Refracção (IR)
Detector de Fluorescência (FLD)
Detector de Condutividade (CD)
Detector Electroquímico (ED)
15
Detector de Espectrometria de Massa (MS)
No presente trabalho será utilizado o detector de espectrometria de massa, mais
concretamente a espectrometria de massa sequencial ou tandem (MS/MS).
De seguida efectua-se uma breve abordagem ao método de detecção supramencionado,
destacando-se algumas particularidades associadas ao acoplamento entre HPLC e este tipo de
sistema.
1.4.6. Espectrometria de massa
A IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) define de forma clara e sucinta a
espectrometria de massa como o estudo da matéria pela formação de iões em fase gasosa, com ou
sem fragmentação, que são posteriormente caracterizados de acordo com o seu rácio massa/carga
(m/z) e intensidades relativas, sob a forma de espectro de massas. [28]
Na Figura 10 referem-se os principais constituintes de um espectrómetro de massa.
Figura 10 – Esquema geral de um espectrómetro de massa.
A espectrometria de massa (MS) possui um elevado potencial analítico, nomeadamente em
termos de sensibilidade, selectividade e velocidade de análise. [28]
A técnica MS surge geralmente associada a sistemas de cromatografia. Este acoplamento
permite combinar o melhor de dois mundos, nomeadamente a elevada selectividade e eficiência de
separação associadas à cromatografia com a capacidade de fornecer informação estrutural, massa
molecular e adicionar selectividade inerentes à espectrometria de massa. [29]
Como referido anteriormente, o presente trabalho utiliza a espectrometria de massa associada
a HPLC. Um entrave a este acoplamento consiste no estabelecimento de uma interface com o
sistema de HPLC e no elevado custo associado ao espectrómetro de massa comparativamente com
outros tipos de detectores utilizados. Tendo em conta os fluxos muito elevados que se utilizam em
HPLC não é possível bombear directamente a fase móvel para o interior da fonte do espectrómetro
de massa que opera a pressões de cerca de 10-4
Pa. Este inconveniente é ultrapassado pela criação
de uma interface entre os dois sistemas, HPLC e MS, com o propósito de eliminar na totalidade ou
em parte a fase móvel. [29]
De acordo com as características dos compostos a analisar por HPLC foram desenvolvidas
interfaces ou fontes de ionização, com a particularidade de operarem à pressão atmosférica. [29]
A
ionização à pressão atmosférica (API) consiste numa técnica suave de ionização que fornece
informação quasi-molecular. De entre os tipos de API destacam-se os mais utilizados,
nomeadamente a ionização por electrospray (ESI) e a ionização química à pressão atmosférica
(APCI).[30]
16
Neste ponto será dado particular relevo a ionização por electrospray (ESI), uma vez que
consiste na interface utilizada no presente trabalho.
Fonte de Ionização por ESI
O princípio básico do processo de ESI consiste na geração de iões em fase gasosa a partir da
conversão dos analitos em solução. É, assim, de importância vital quando estamos perante um
sistema deste tipo, a escolha adequada da fase móvel utilizada em HPLC. [30], [31]
Primeiramente, o eluente do HPLC contendo os analitos é pulverizado por meio de um gás de
nebulização aquecido (normalmente N2) através de um capilar metálico de pequenas dimensões que
é mantido a um potencial elevado e à pressão atmosférica. Á saída do capilar formam-se pequenas
gotas altamente carregadas (aerossol) que são dessolvatadas com recurso a um fluxo contínuo de
gás inerte aquecido (gás de dessolvatação), geralmente N2. O tamanho das gotas é reduzido há
medida que a dessolvatação ocorre, até que a força de repulsão entre as cargas semelhantes supere
as forças de coesão da fase líquida (tensão superficial). Atingido esse momento, seguem-se uma
série de explosões até se obterem iões do analito isentos de solvente. Estes iões são posteriormente
encaminhados por um conjunto de dispositivos de focalização (lentes) para o analisador de massas.
[30], [31]
Dependendo das características dos analitos, a ionização pode ocorrer em modo positivo ou
negativo. No caso de ESI positivo podem adicionar-se ácidos voláteis (geralmente ácido fórmico ou
acético) para promover a protonação do analito. No que respeita a ESI negativo pode recorrer-se a
hidróxido de amónio para favorecer a desprotonação, caso seja necessário. Em alternativa, podem
utilizar-se tampões voláteis (usualmente acetato ou formato de amónio) para controlar o pH do
meio.[28]
A Figura 11 pretende ilustrar o funcionamento da fonte de ionização por ESI.
Figura 11 – Esquema representativo da fonte de ionização por ESI. [32]
A técnica de ESI é particularmente adequada para compostos orgânicos polares termicamente
lábeis que não podem ser analisados por GC-MS. [31]
Um dos inconvenientes em trabalhar com este
tipo de interface consiste na possibilidade de ocorrer supressão (ion supression) ou enriquecimento
(ion enhancement) iónico. Estes efeitos são causados pela competição existente entre os iões
ejectados durante a dessolvatação. [32]
17
De um modo sucinto, a supressão iónica é uma alteração na resposta para uma dada
concentração de analito resultante da presença de outros componentes na matriz. Uma forma de
minimizar este problema consiste em utilizar diferentes procedimentos de limpeza na preparação das
amostras. [32]
De acordo com a informação presente em diversas bibliografias, a determinação de CP’s em
amostras ambientais por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa é efectuada na
maioria das vezes com recurso a fonte de ionização por APCI. Como tal, considerou-se oportuno
efectuar uma breve descrição do processo de ionização acima mencionado.
Fonte de Ionização por APCI
A APCI surge como técnica complementar a ESI, sendo adequada para a análise de
compostos polares e não polares termicamente estáveis e de pequenas dimensões. [31]
Neste processo, o eluente do HPLC contendo o analito é pulverizado através de um
vaporizador aquecido (250-400 °C). [32]
Primeiramente, as moléculas de solvente em fase gasosa são ionizadas pelos electrões
descarregados da agulha de corona. Por conseguinte os iões do solvente ionizam os analitos por
transferência de carga, sendo os iões resultantes encaminhados para o analisador de massas. [32]
A Figura 12 pretende ilustrar o funcionamento da fonte de ionização por APCI.
Figura 12 – Esquema representativo da fonte de ionização por APCI. [32]
O processo de APCI permite a utilização em HPLC de tampões com concentrações elevadas,
uma vez que o efeito de supressão iónica não é tipicamente uma preocupação quando se trabalha
com este tipo de interface. Contudo, como referido anteriormente, os compostos a analisar têm de ser
termicamente estáveis e voláteis, uma vez que a ionização ocorre em fase gasosa. [32]
Após a breve abordagem efectuada aos dois tipos de fontes de ionização mais utilizados,
interessa referir outra parte essencial, o “coração” de um espectrómetro de massas, nomeadamente o
analisador.
18
Analisador de massas
A função de qualquer analisador de massas consiste em separar e seleccionar os iões de
acordo com a sua razão massa/carga (m/z). Existem diversos tipos de analisador, sendo o mais
utilizado em análises quantitativas, o do tipo Quadrupolo. Este consiste num conjunto de quatro
bastões colocados em paralelo, aos quais são aplicadas diferentes voltagens (DC e RF) que
possibilitam a transmissão selectiva dos iões consoante a razão m/z. Um quadrupolo pode operar em
modo de varrimento contínuo (Full Scan) e em modo de monitorização selectiva de iões (SIM). [28]
O presente trabalho teve como particularidade a utilização da técnica de espectrometria de
massas sequencial (MS/MS). Esta difere da técnica convencional pelo facto de recorrer a mais do
que um nível de análise de massas (analisador). O tipo de configuração MS/MS utilizada consistiu em
dois analisadores do tipo quadrupolo separados por uma célula de colisão (hexapolo).
No primeiro quadrupolo (MS1), de entre os iões em fase gasosa provenientes da fonte de
ionização, selecciona-se o ião precursor de acordo com o seu rácio m/z. Esse ião é encaminhado
para a célula de colisão (Q) onde sofre fragmentação, tipicamente por dissociação induzida por
colisão (CID) com um gás inerte denominado de gás de colisão (geralmente árgon, Ar). Os iões
produto gerados são direccionados para o segundo quadrupolo (MS2) onde ocorre o varrimento das
massas para a obtenção do espectro de massas. [29]
Na Figura 13 apresenta-se um esquema representativo da espectrometria de massa
sequencial.
Figura 13 – Esquema representativo da espectrometria de massa sequencial (MS/MS). [33]
19
1.5. Controlo de Qualidade – Validação de Métodos Analíticos
Após o desenvolvimento e optimização de um método analítico é necessário efectuar a sua
validação. De acordo com a norma NP EN ISO/IEC 17025, segundo a qual o LAIST é acreditado,
este procedimento pretende assegurar que o método desenvolvido possui os requisitos necessários
para impor qualidade nos resultados obtidos.
‘A Validação de métodos é um aspecto vital da garantia da qualidade analítica’ [34]
Apresentam-se de seguida os parâmetros a analisar no decorrer do processo de validação do
método analítico [35]
:
Especificidade/Selectividade: o primeiro termo refere-se à capacidade de um método
analítico discriminar o analito relativamente a outras substâncias que possam estar presentes na
amostra; a selectividade, por sua vez, define-se como a capacidade de um método identificar e
distinguir um analito em particular numa mistura complexa sem interferência dos outros componentes.
Gama de Trabalho: consiste na gama entre os limites de quantificação superior e inferior
de um método analítico. É definido aquando da confirmação de que o método é exacto, preciso e
apresenta linearidade quando aplicado a amostras com quantidades de substância dentro do
intervalo especificado. Pode ser avaliada por um método estatístico que consiste no teste de
homogeneidade de variâncias.
Linearidade: refere-se à capacidade que o método apresenta para fornecer resultados
directamente proporcionais à concentração do analito em amostra, numa determinada gama de
concentrações. [34]
A juntar ao critério do coeficiente de correlação a linearidade pode ser avaliada
através de um modelo estatístico, nomeadamente o teste de Mandel ou de Fisher/Snedecor.
Limite de Detecção (L.D.): corresponde à menor quantidade do analito de interesse que
pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada. Encontram-se descritos no Guia Relacre
Nº13 [35]
os diferentes modos de estimativa deste parâmetro.
Limite de Quantificação (L.Q.): corresponde à menor concentração medida a partir da qual
é possível quantificar o analito com precisão e exactidão aceitáveis dentro das condições
experimentais estabelecidas. Tal como descrito no Guia Relacre Nº13 [35]
, este parâmetro pode ser
determinado de diversas formas.
Precisão (Fidelidade[36]
): traduz o grau de concordância dos resultados entre ensaios
independentes, repetidos sobre uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em
condições definidas. Pode ser medida através da repetibilidade, da precisão intermédia e da
reprodutibilidade. A primeira envolve ensaios realizados sobre uma mesma amostra, em condições
idênticas ou estáveis, nomeadamente a utilização do mesmo analista, do mesmo equipamento, entre
outros. A precisão intermédia é uma medida da concordância entre os resultados obtidos pelo mesmo
laboratório mas em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. A
reprodutibilidade, por sua vez, é uma medida da precisão de um método realizado em condições
diferentes, tais como diferentes analistas, diferentes equipamentos, entre outros.
20
Exactidão (Veracidade[36]
): constitui uma medida da concordância entre os resultados de
um ensaio e o valor de referência aceite como convencionalmente verdadeiro. Pode ser avaliada
através de MRC, ensaios interlaboratoriais, testes comparativos e ensaios de recuperação.
Robustez: é uma medida da capacidade de um método analítico resistir a pequenas
variações das condições analíticas.
1.6. Incerteza do Método
A Norma NP EN ISO/IEC 17025, pela qual o LAIST se encontra acreditado refere a
necessidade de se efectuar a estimativa da incerteza associada a uma medição.[37]
Essa, por sua vez,
deve ser reportada sempre que o cliente o solicite.
Assim, após a implementação e validação do método analítico dever-se-á efectuar o cálculo da
incerteza associada, seguindo para tal as directrizes presentes no guia do IPAC OGC007.[38]
21
2. Parte Experimental
Nesta secção apresenta-se a descrição pormenorizada do trabalho experimental realizado ao
longo do estágio no núcleo dos Orgânicos do LAIST.
2.1. Reagentes e Padrões
Reagentes:
Acetato de Amónio, C2H7NO2 (p.a., Pureza 98%)
Acetonitrilo, C2H3N (HPLC, Pureza 98%)
Ácido fórmico, CH2O2 (p.a., Pureza 98%)
Ácido fosfórico, H3PO4 (p.a., 85%)
Água Milli-Q, sistema Millipore
Cloreto de sódio, NaCl (Pureza 99,5%)
Metanol, CH4O (HPLC, Pureza 99,9%)
Padrões:
2-amino-4-clorofenol, C6H6ClNO (Pureza = 97%, Acros)
2-clorofenol, C6H5ClO (Pureza = 99,3%, Fluka)
3-clorofenol, C6H5ClO (Pureza = 98,1%, Fluka)
4-clorofenol, C6H5ClO (Pureza = 99,3%, Fluka)
2,4-diclorofenol, C6H4Cl2O (Pureza = 99,4%, Fluka)
4-cloro-3-metilfenol, C7H7ClO (Pureza = 99,3%, Aldrich)
2,4,5-triclorofenol, C6H3Cl3O (Pureza = 99,6%, Fluka)
2,4,6-triclorofenol, C6H3Cl3O (Pureza = 99,6%, Fluka)
Pentaclorofenol, C6HCl5O (Pureza ~ 99%, Fluka)
2.2. Material
Material de uso corrente de laboratório
Microseringas de vidro de 25 µL, 50 µL, 100 µL, 500 µL e 1000 µL
Micropipeta de 1000 µL
Cartuchos de extracção de 6 mL com 200 mg de adsorvente do tipo SDB (copolímero de
estireno e divinilbenzeno), Telos
2.3. Equipamento
Balanças analíticas: Sartorius e Mettler Toledo
22
Sistema de obtenção de água ultra pura, modelo Milli-Q Integral 3, Millipore
Medidor de pH, modelo pH-Meter Basic 20+, Crison
Banho ultrassónico, Elma
Vórtex, modelo REAX top, Heidolph
Sistema extractor de SPE, modelo Variant.
Bomba de vácuo V-800, Büchi
HPLC, modelo Waters 2695 Separations Module, Waters, equipado com:
- Desgaseificador
- Bomba quaternária
- Injector automático
- Compartimento termostatizado para a coluna cromatográfica
Espectrómetro de massa sequencial (MS/MS), modelo Waters – Micromass Quattro Micro
API, Waters equipado com:
- Sonda de Ionização por Electrospray (ESI)
- Analisador de triplo quadrupolo
- Fotomultiplicador
O sistema LC-ESI-MS/MS utilizado (Figura 14) está equipado com o software Masslynx 4.0,
Micromass Ltd.
Figura 14 – Sistema de LC-ESI-MS/MS utilizado para a realização do presente trabalho.
23
2.4. Procedimento Experimental
2.4.1. Segurança
De acordo com as propriedades físico-químicas dos compostos manuseados foram respeitadas
as medidas de segurança necessárias para evitar qualquer tipo de incidente. Assim, para além do
uso de bata e de luvas, o manuseamento dos compostos foi efectuado em locais bem ventilados
(hottes).
2.4.2. Descontaminação do Material
O material de vidro utilizado no presente trabalho foi lavado e descontaminado de acordo com
o procedimento vigente no LAIST. Após a descontaminação do material (não graduado) com a
mistura cromossulfúrica, preparada no Laboratório, o mesmo foi descontaminado com o solvente
utilizado na preparação das soluções, neste caso com acetonitrilo (ACN).
2.4.3. Preparação das Soluções Padrão e da Fase Móvel
Soluções Padrão
Inicialmente, procedeu-se à preparação de soluções-mãe com aproximadamente 1 g/L dos
CP’s em estudo, utilizando como solvente o metanol (MeOH).
A partir das soluções-mãe prepararam-se as soluções padrão individuais para infusão no
espectrómetro de massa (injecção directa no espectrómetro de massa) de cerca de 0,5 mg/L e, numa
fase posterior uma solução intermédia de cerca de 50 mg/L com todos os CP’s em estudo.
Por sua vez, as soluções para calibração com as concentrações pretendidas foram obtidas por
diluições sucessivas a partir da solução intermédia. Convém realçar que os padrões de calibração
foram preparados na primeira linha do gradiente utilizado no sistema LC-ESI-MS/MS.
Na Tabela 2 indicam-se as concentrações das várias soluções padrão dos CP’s analisados.
Tabela 2 – Concentração das soluções padrão dos CP’s analisados.
Composto Conc. Sol.
Mãe (g/L)
Conc. Sol. Intermédia
(mg/L)
Conc. Soluções de Calibração (mg/L)
2-CP 1,230 49,2 0,25 0,49 0,98 2,0 3,9 5,9 7,9 9,8
3-CP 1,470 51,4 0,26 0,52 1,0 2,1 4,1 6,2 8,2 10
4-CP 7,110 49,8 0,25 0,50 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10
2,4-DCP 2,090 52,2 0,26 0,52 1,0 2,1 4,2 6,3 8,4 10
2,4,5-TCP 1,160 52,2 0,26 0,52 1,0 2,1 4,2 6,3 8,4 10
2,4,6-TCP 2,810 49,2 0,25 0,49 0,98 2,0 3,9 5,9 7,9 9,8
PCP 2,010 50,2 0,25 0,50 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10
4-C-3-MP 1,480 51,8 0,26 0,52 1,0 2,1 4,1 6,2 8,3 10
2-A-4-CP 1,045 52,2 2,1 4,2 6,3 8,4 10
24
Fase Móvel
A fase móvel utilizada consistiu em (A) solução tampão de acetato de amónio 2,5 mM (pH 6,8)
e (B) ACN. A solução tampão de acetato de amónio foi preparada antes de cada sessão de trabalho.
Após preparação, a solução foi colocada no banho ultrassónico durante um certo período de tempo
que permitisse a completa dissolução do acetato de amónio.
A solução tampão bem como o ACN foram colocados em frascos próprios e devidamente
rotulados.
Quando se utilizam soluções tampão, como acontece no presente trabalho, o contacto das
mesmas com o sistema para além do período de análise deve ser evitado, devido a cristalização de
sais na região do pistão da bomba. [29]
Assim, após cada sessão de trabalho efectuou-se a limpeza do
sistema, deixando os filtros em solvente.
2.4.4. Optimização das condições de LC-ESI-MS/MS
Como mencionado anteriormente, o sistema de análise utilizado na realização do presente
trabalho consistiu num equipamento de HPLC acoplado a um espectrómetro de massa sequencial
(MS/MS) equipado com uma sonda de ESI.
Começou-se por optimizar as condições de espectrometria de massa recorrendo para tal à
infusão de padrões individuais dos CP’s em estudo, com uma concentração de aproximadamente 0,5
mg/L. Seguidamente para umas condições iniciais de voltagem de cone, energia de ionização e modo
de ionização (positivo ou negativo) efectuou-se o MS Scan (aquisição em Full Scan), com o objectivo
de obter o sinal correspondente ao ião precursor ou ião molecular. Nesta fase apenas o primeiro
quadrupolo (MS1) foi requerido (Figura 15). Este procedimento foi efectuado para cada composto
individualmente, efectuando-se a lavagem do capilar com MeOH entre as diferentes infusões.
O processo de optimização das condições MS/MS consistiu em efectuar, para cada um dos
CP’s analisados, os ajustes ou alterações necessárias aos parâmetros supramencionados por forma
a obter-se o maior sinal (mais intenso) para o ião precursor com o menor ruído da linha de base.
Na Tabela 3 encontram-se presentes as condições pré-definidas que se mantiveram ao longo
de todo o processo de optimização do método LC-ESI-MS/MS.
Tabela 3 – Condições gerais do espectrómetro de massa para os CP’s analisados.
Gás de nebulização, dessolvatação e de cone Azoto (N2)
Gás de colisão Árgon (Ar)
Ionização Electrospray
Extractor 2 V
Radiofrequência 0,5 V
Temperatura da fonte 120°C
Temperatura de dessolvatação 270°C
Fluxo do gás de dessolvatação 450 L/h
Fluxo do gás de cone 60 L/h
25
O passo seguinte consistiu na obtenção dos iões produto ou iões-filho pela fragmentação
induzida do ião precursor por colisão com o árgon (gás de colisão utilizado). Nesta fase a aquisição
efectuou-se em modo Daughter Scan, isto é, verificou-se o varrimento em Full Scan no segundo
quadrupolo (MS2), tal como é evidenciado na Figura 15.
Figura 15 - Representação esquemática do modo de operação do MS1 e MS2 para obtenção: (a) ião precursor;
(b) iões produto.[39]
O parâmetro a optimizar, nesta fase, consistiu na energia de colisão.
Após reunidas as condições óptimas para o espectrómetro de massas, procedeu-se à
optimização das condições cromatográficas (fase móvel, coluna cromatográfica, temperatura da
coluna e fluxo). Para tal, procedeu-se à injecção de 50 µL de soluções padrão individuais de 10 mg/L,
bombeadas a um fluxo de 0,2 mL/min. Na Tabela 4 apresentam-se as condições de operação
definidas para o HPLC.
Tabela 4 – Condições operatórias do HPLC para os CP’s analisados.
Nesta fase, os quadrupolos encontravam-se em modo SIM, servindo apenas para monitorizar o
ião precursor e os iões produto, referentes aos CP’s em estudo, durante um período de tempo mais
longo, conferindo ao método uma maior sensibilidade e selectividade.[40]
Após a optimização das condições cromatográficas, injectou-se uma solução padrão conjunta
de 10 mg/L, por forma a estabelecer-se a ordem de eluição. Na Tabela 5 encontram-se sintetizados
Coluna cromatográfica XBridgeTM
Phenyl 3,5 µm 2,1150 mm
Fluxo 0,2 mL/min
Volume de injecção 50 µL
Temperatura da coluna 40°C
Fase móvel (A) Solução tampão de acetato de amónio 2,5 mM (pH 6,8)
(B) Acetonitrilo
Gradiente
Tempo (min) % A % B
0 90 10
20 20 80
22 20 80
27 90 10
30 90 10
26
os dados necessários para a definição, no software Masslynx 4.0, do método a utilizar para a análise
dos CP’s por LC-ESI-MS/MS.
Tabela 5 – Dados para definição do método, no software Masslynx 4.0, para a análise dos CP’s em estudo por
LC-ESI-MS/MS.
Composto Modo de Ionização
Janela de retenção (min)
Ião precursor
(m/z)
Voltagem de cone (V)
Energia de colisão
(eV)
Iões produto
(m/z)
2-A-4-CP Positivo 0.00-15.00 144 27
15 35
15 126
5 144
4-CP Negativo 10.00-17.00 127 37 15 35
17 91
3-CP Negativo 10.00-16.00 127 27 15 35
15 91
2-CP Negativo 10.00-17.00 127 30 20 35
15 91
PCP Negativo 10.00-17.00 263 50 5 35
5 263
4-C-3-MP Negativo 12.00-19.00 141 35 20 35
20 105
2,4-DCP Negativo 12.00-18.00 161 35
15 35
20 89
15 125
2,4,5-TCP Negativo 14.00-22.00 195 30
20 35
27 123
15 159
2,4,6-TCP Negativo 14.00-22.00 195 40
20 35
25 123
20 159
Apresenta-se na Figura 16 o método de análise definido no software Masslynx 4.0, sendo
possível visualizar as janelas de retenção relativas a cada um dos CP’s em estudo (barras verdes). A
monitorização dos fragmentos dos CP’s em estudo não foi efectuada ao longo de toda a corrida
cromatográfica, mas apenas no período referente a cada uma das janelas de retenção. Pretendeu-se,
deste modo, aumentar significativamente a sensibilidade do método.
Figura 16 – Janela do software Masslynx 4.0 com o método definido (MS Method).
27
2.4.5. Amostras
A água Milli-Q para os testes de recuperação foi recolhida do sistema Milli-Q da Millipore no
próprio dia do ensaio experimental. Analisaram-se duas amostras de água do Rio Tejo. Uma das
amostras foi colhida na zona do Parque Tejo, tendo sido transportada até ao LAIST em frascos de
vidro de 2,5 litros condicionados a baixa temperatura. A outra água utilizada consistiu numa amostra
que já se encontrava no LAIST para análise de outros parâmetros, sendo proveniente da zona da
Chamusca.
2.4.6. Extracção e pré-concentração das amostras
Nesta fase do trabalho, testaram-se diferentes técnicas de extracção de amostra, tais como a
LLE e a SPE com recurso a discos e a cartuchos. Contudo, apenas para o método de SPE com
cartuchos se teve sucesso no que respeita ao caso de estudo (2-A-4-CP).
De acordo com o que se encontra na literatura [41], a acidificação das amostras é necessária
para evitar a desprotonação parcial dos CP’s.
Apresenta-se na Tabela 6 o procedimento efectuado para o tipo de extracção optimizado,
nomeadamente SPE com cartuchos de 6 mL e 200 mg de adsorvente do tipo SDB (copolímero de
estireno e divinilbenzeno).
Tabela 6 – Procedimento de extracção com cartuchos do tipo SDB de 6 mL e 200 mg de adsorvente.[42]
Etapas Solventes
Lavagem/Condicionamento
2 mL Água Milli-Q
2x 2 mL MeOH
2 mL Água Milli-Q
2 mL Água a pH 2
Adição da amostra(*)
-
Lavagem 3x 2 mL Água Milli-Q
Eluição 5x 2 mL MeOH
A passagem da água Milli-Q (ponto 1 da etapa de lavagem/condicionamento) é forçada com
auxílio de uma bomba de vácuo. Do mesmo modo, a amostra é forçada a percolar através do
cartucho a um fluxo controlado.
A água a pH 2 foi preparada por acidificação da água Milli-Q com uma solução aquosa de
ácido fosfórico (1:1).
Utilizaram-se volumes de 50 e 100 mL de amostra acidificada a pH 2 também com a solução
aquosa de ácido fosfórico (1:1).
O eluato contendo o analito foi recolhido num vial e evaporado sob corrente de azoto, até se
obter um volume de cerca de 100 µL. Perfez-se o volume com 900 µL de solução tampão de acetato
de amónio 2,5 mM (pH 6,8), reconstituindo assim a primeira linha do gradiente.
28
2.4.7. Controlo de Qualidade – Validação de Métodos Analíticos
Neste ponto pretende-se apresentar o procedimento efectuado para a definição de alguns
parâmetros de qualidade necessários à validação da metodologia analítica implementada.
Primeiramente, aquando da optimização das condições operatórias do LC-ESI-MS/MS, avaliou-
se a selectividade do método para com os isómeros (2-CP, 3-CP, 4-CP, 2,4,5-TCP e 2,4,6-TCP).
Para tal, preparou-se uma solução com esses compostos em diferentes concentrações, por forma a
averiguar se o método os consegue distinguir, uma vez que como se tratam de isómeros, possuem as
mesmas massas.
Procedeu-se ao traçado das curvas de calibração (CC) de modo a ser possível quantificar os
CP’s em estudo. Considerou-se o limite de quantificação para cada composto como sendo o primeiro
ponto das CC, tal como é efectuado em diferentes metodologias analíticas no LAIST.
Utilizaram-se padrões de controlo por forma a verificar a existência de alguma alteração nas
condições de análise e, por conseguinte para validar as CC traçadas.
Efectuou-se o estudo da variação da razão Ião de Quantificação/Ião de Qualificação, que
consiste num parâmetro utilizado para qualificar os analitos. Este é vulgarmente utilizado quando se
trabalha com espectrometria de massa sequencial.
Em cada sessão de trabalho foi preparado um branco que consiste num vial com 1 mL da fase
móvel nas proporções correspondentes à primeira linha do gradiente.
Efectuaram-se ensaios de recuperação, por forma a avaliar a exactidão do método. Os
mesmos consistiram na fortificação da amostra com um padrão de concentração conhecida.
29
3. Apresentação e Discussão dos Resultados
Nesta secção apresentam-se os resultados obtidos ao longo de todo o trabalho experimental
para implementação do método de análise, bem como a discussão pormenorizada dos mesmos.
3.1. Optimização das condições de LC-ESI-MS/MS
3.1.1. Condições de Espectrometria de Massa
No que respeita ao processo de optimização das condições de espectrometria de massa, mais
concretamente à obtenção do ião precursor, o primeiro parâmetro a optimizar foi o modo de
ionização. Nesta fase foi necessário ter em conta a estrutura molecular dos CP’s em estudo (Anexo
II). Para todos os compostos, à excepção do 2-A-4-CP, efectuou-se a análise em modo de ionização
negativa ([M – H]-) como referido na literatura [14]. No caso do 2-A-4-CP começou-se por
experimentar a ionização em modo negativo. Contudo, tendo em conta a existência de um grupo
amino (NH2) passível de sofrer protonação, procedeu-se à preparação de uma solução padrão de 0,5
mg/L, mas desta feita com 1% de ácido fórmico. Verificou-se que a intensidade do sinal
correspondente ao ião precursor aumentou ao efectuar-se a ionização em modo positivo ([M – H]+).
Para o composto 4-C-3-MP efectuou-se o mesmo procedimento que o referido para o caso de
estudo. Contudo, efectuando a aquisição em modo MS Scan não se constatou a presença de
qualquer sinal referente ao ião precursor, o que seria de esperar uma vez que o grupo metil não sofre
protonação.
Após a definição do tipo de ionização, testaram-se diferentes voltagens de cone tendo como
objectivo estabelecer as condições óptimas para os CP’s analisados, isto é, os parâmetros
operatórios que permitem obter o maior sinal para o ião precursor, com o menor ruído da linha de
base. Na Tabela 5 (página 26) encontram-se reunidas as condições óptimas para obtenção do ião
precursor para cada um dos CP’s analisados.
Para a obtenção dos iões-filho, aplicaram-se diferentes energias de colisão por forma a
determinar o valor que permite respeitar o compromisso estabelecido, isto é, obter os iões produto
com boa intensidade do sinal e ao mesmo tempo garantir que pelo menos 10% da intensidade do ião
precursor se mantém. Verificou-se, por vezes, que um ligeiro aumento na energia de colisão resultou
não só na fragmentação do ião precursor, mas também dos iões-filho contribuindo desse modo para
o aumento do nível de ruído. O cenário oposto também foi observado, isto é, a aplicação de energias
de colisão incapazes de induzir a fragmentação do ião precursor.
Apresentam-se na Tabela 5 (página 26) as condições óptimas para obtenção dos iões produto
para os CP’s analisados. Para a maioria dos CP’s, os iões produto obtidos sugerem a perda na
estrutura do ião precursor de um ou mais HCl. No que respeita ao caso de estudo, o ião filho com m/z
igual a 126 sugere a perda da amina protonada. Uma vez que nos encontramos na presença de
compostos clorados, na selecção dos iões produto entrou-se em linha de conta com a abundância
isotópica Cl35
e Cl37
.
30
A análise da maioria dos CP’s em estudo foi efectuada através da selecção de dois iões
produto, um para quantificação (o mais intenso) e outro para qualificação (o segundo mais intenso),
tal como é evidenciado na Tabela 7.
Tabela 7 – Ião de Quantificação e Ião de Qualificação para os CP’s em estudo.
Composto Ião de Quantificação Ião de Qualificação
2-A-4-CP 144 126
4-CP 91 35
3-CP 91 35
2-CP 91 35
PCP 263 -
4-C-3-MP 105 35
2,4-DCP 125 89
2,4,5-TCP 159 123
2,4,6-TCP 159 123
Por observação da Tabela 7 constata-se que os iões de quantificação para o PCP e para o 2-
A-4-CP correspondem aos respectivos iões precursores após a aplicação de uma energia de colisão
baixa. No que respeita ao composto 2-A-4-CP seleccionou-se como ião para qualificação o ião
produto com m/z igual a 126, uma vez que para o ião produto com m/z igual a 35 não se obteve um
sinal distinguível do ruído existente na linha de base.
Quanto ao PCP foi difícil definir uma energia de colisão que não conduzisse à fragmentação
total do ião molecular e dos próprios iões produto (ruído da linha de base muito elevado). Não foi
possível seleccionar um ião para qualificação, uma vez que não se conseguiu obter um ião produto
com sinal distinguível do ruído da linha de base.
A título de exemplo, apresenta-se na Figura 17 o espectro de fragmentação referente ao
composto 2-A-4-CP. No Anexo III encontram-se os espectros referentes aos restantes CP’s
analisados.
Figura 17 – Espectro de massa resultante da fragmentação do ião precursor para o 2-A-4-CP.
Cone 27V Col 15V
m/z110 112 114 116 118 120 122 124 126 128 130 132 134 136 138 140 142 144 146 148 150 152 154 156 158
%
0
100
DGSCAN_2A4CP_ESIPOS_3 1 (2.022) Daughters of 144ES+ 2.22e6144.07
126.12
109.23 127.06
Ião de
Quantificação
Ião de
Qualificação
31
Do ponto de vista da espectrometria de massa os objectivos foram cumpridos, isto é,
obtiveram-se os iões característicos (ião precursor e iões produto) dos CP’s em estudo com boa
intensidade de sinal.
3.1.2. Condições Cromatográficas
Tendo reunidas as condições de operação do espectrómetro de massa sequencial, procedeu-
se à optimização das condições do HPLC, destacando-se como peças chave para um bom
desempenho cromatográfico, a escolha da coluna cromatográfica a utilizar bem como da sua
temperatura de funcionamento, da fase móvel e tipo de eluição.
Neste ponto do trabalho experimental foi necessário proceder à injecção de padrões individuais
com uma determinada concentração que permitisse a detecção dos compostos e, a partir daí
efectuaram-se diferentes testes para averiguar quais as condições óptimas para a análise
cromatográfica dos CP’s em estudo.
Como ponto de partida utilizaram-se soluções padrão para injecção de 50 µg/L. Contudo, não
se detectaram quaisquer picos referentes aos compostos em estudo. Optou-se, então, pela injecção
de padrões individuais com uma concentração de 10 mg/L. Como resultado, observaram-se picos
com boa intensidade de sinal.
Apresenta-se de seguida o procedimento efectuado para a optimização dos parâmetros
anteriormente referidos.
Escolha da Coluna Cromatográfica e sua Temperatura
Efectuou-se a escolha da coluna que permitiu a separação dos CP’s em estudo assegurando
uma boa resolução e definição dos picos e um tempo de corrida razoável.
Testaram-se quatro colunas cromatográficas com diferentes características, nomeadamente:
1. Atlantis® HILIC Silica, 3 µm, 2.1x150 mm
2. XBridgeTM
Amide, 3,5 µm, 2.1x150 mm
3. Atlantis® T3, 5 µm, 2.1x150 mm
4. XBridgeTM
Phenyl, 3,5 µm, 2.1x150 mm
Convém realçar que as colunas foram testadas para as mesmas condições de operação,
tendo-se utilizado como fase móvel o par (A) solução tampão de acetato de amónio 10 mM: (B) ACN.
Ao utilizar a coluna HILIC Silica (cromatografia de interacção hidrofílica) obtiveram-se picos mal
definidos e com baixa intensidade de sinal. Os resultados obtidos podem ser justificados pelo facto
deste tipo de colunas ser utilizado, geralmente, para a retenção de bases muito polares que não
podem ser retidas usando cromatografia de fase reversa. [43]
Para a coluna cromatográfica Amide (sílica ligada a grupo funcional amida, interacção
hidrofílica), apesar de se terem obtido picos definidos e com elevada intensidade, verificou-se uma
má resolução dos mesmos (2,08 < Tr (min) < 2,35).
Com a coluna T3 (sílica ligada a grupo funcional C18) obtiveram-se picos bem definidos, com
elevada intensidade e boa resolução. Os resultados eram expectáveis, uma vez que o tipo de coluna
32
utilizado é bastante apropriado para a retenção e separação de compostos polares e apresenta
elevada compatibilidade com fases aquosas.[43]
Contudo, apesar dos bons resultados obtidos, não foi possível escolher a coluna T3 para a
realização do presente trabalho, devido à sua utilização em análises de rotina no LAIST.
Por fim, testou-se a coluna Phenyl (sílica ligada ao grupo funcional fenil-hexil) por possuir
grande afinidade para com os compostos aromáticos. A utilização desta coluna conduziu à obtenção
de picos definidos com elevada intensidade e boa resolução. A título de exemplo, verificou-se para o
composto 2-A-4-CP uma intensidade de sinal da mesma ordem de grandeza obtida aquando da
utilização da coluna T3, porém constatou-se uma pior definição dos picos. Verificou-se a diminuição
em cerca de 1 minuto nos tempos de retenção obtidos com a coluna Phenyl comparativamente com a
coluna T3. Posto isto, a coluna utilizada nas fases posteriores do trabalho foi a XBridgeTM
Phenyl, por
permitir a obtenção de picos definidos e intensos, com boa resolução e um tempo de corrida razoável.
Após a escolha da coluna cromatográfica a utilizar, procedeu-se à optimização da temperatura
de funcionamento da mesma, tendo-se testado as temperaturas de 30, 40 e 45°C. De acordo com os
resultados obtidos optou-se pela temperatura de 40°C, pois comparativamente com a de 30°C os
picos obtidos apresentaram maior intensidade e resolução. Quando se utilizou a temperatura de
45°C, não se observaram grandes diferenças no que respeita à forma dos picos e à intensidade dos
mesmos. Assim, optou-se por utilizar a temperatura mais baixa que conduziu a melhores resultados,
logo os 40°C, com objectivo de aumentar o tempo de vida útil da coluna.
Escolha da Fase Móvel e Tipo de Eluição
Como ponto de partida utilizaram-se as condições empregues pelo LAIST na determinação dos
pesticidas diquato e paraquato, isto é, utilizou-se como fase móvel o par (A) solução tampão de
formato de amónio: (B) ACN em modo de eluição isocrático. Contudo, não se observaram quaisquer
picos referentes aos CP’s em estudo.
Posteriormente, de acordo com a informação presente na literatura [14] testou-se como eluente
o par (A) solução tampão de acetato de amónio 10 mM: (B) ACN e a eluição por gradiente, tendo-se
obtido bons resultados. Como referido anteriormente, utilizaram-se estas condições para a selecção
da coluna cromatográfica.
Concluída essa fase, efectuaram-se testes com soluções tampão de acetato de amónio com
diferentes concentrações, nomeadamente 5, 2,5 e 1 mM. Este procedimento teve como objectivo
reduzir a probabilidade de entupimento do capilar por precipitação do acetato de amónio e também a
supressão iónica, sendo este um efeito característico do tipo de interface utilizado no presente
trabalho (ESI).
Constatou-se que a concentração de 2,5 mM é a que permite obter, para a maioria dos CP’s
em estudo incluindo o 2-A-4-CP, picos com intensidade de sinal mais elevada. Contudo, verificou-se
que há medida que se diminuiu a concentração do tampão, os picos apresentaram mais cauda
(tailing). A dissolução dos analitos pode provocar alterações no pH da FM, sendo este efeito
minimizado pelo aumento da concentração do tampão. Num meio sem controlo de pH, o grau de
33
ionização dos CP’s em estudo varia ao longo da banda cromatográfica, resultando normalmente em
picos com caudas.[44]
Posto isto, apesar do pequeno efeito de tailing que se fez notar, optou-se por utilizar uma
solução tampão de acetato de amónio de 2,5 mM (pH 6,8), por permitir a obtenção de um bom sinal
para os CP’s em estudo, em particular para o 2-A-4-CP e ao mesmo tempo por diminuir o risco de
degradação de constituintes essenciais ao bom funcionamento do equipamento e minimizar o efeito
de supressão iónica.
Tendo reunidas as condições cromatográficas (Tabela 4, página 25) procedeu-se à injecção de
uma solução padrão conjunta de 10 mg/L, por forma a definir a ordem de eluição dos CP’s em
estudo. Os resultados obtidos apresentam-se na Tabela 8.
Tabela 8 – Tempos de retenção para o ião de quantificação referente a cada um dos CP’s em estudo para as
condições cromatográficas optimizadas (Anexo IV).
Composto Tr (min)
2-A-4-CP 10,14
4-CP 12,97
3-CP 12,98
2-CP 12,99
PCP 13,31
4-C-3-MP 14,78
2,4-DCP 15,38
2,4,5-TCP 16,98
2,4,6-TCP 17,00
Por observação dos resultados obtidos, verificou-se que os isómeros 2-CP, 3-CP e 4-CP
eluíram praticamente ao mesmo tempo, tal como aconteceu com os compostos 2,4,5-TCP e 2,4,6-
TCP. Nesta fase averiguou-se a selectividade do método implementado para com os CP’s referidos,
tendo-se procedido para tal à injecção de uma solução contendo os mesmos em concentrações
diferentes. Constatou-se que a metodologia desenvolvida não é selectiva no que respeita aos
isómeros em estudo, uma vez que não os consegue separar.
Concluiu-se do ponto de vista da separação cromatográfica que as condições utilizadas
permitiram obter picos definidos e intensos e evidenciaram uma boa separação dos CP’s em estudo,
à excepção dos isómeros.
34
3.2. Quantificação – Curvas de Calibração
Para ser possível quantificar os CP’s em amostras procedeu-se ao traçado de CC. Estas foram
obtidas a partir do método de padronização externa, representando a resposta do sistema analítico
(área) em função da concentração do analito.
Apresentam-se na Tabela 9 os parâmetros relativos às CC obtidas por regressão linear para o
2-A-4-CP, num total de 12 sessões de trabalho. Para os restantes CP’s em estudo como a
metodologia implementada não permite a quantificação dos mesmos, os valores de calibração
obtidos estão apresentados no Anexo V.
Tabela 9 – Dados obtidos para a regressão linear, na gama de trabalho de 2 – 10 mg/L, para o 2-A-4-CP, pela
metodologia LC-ESI-MS/MS.
Coef. de Determinação, R
2 Declive
Ordenada na origem/10
-3
Dia 1 0,9986 6,1(7) 0,4(2) -1 3
Dia 2 0,9996 5,2(6) 0,1(9) 4 1
Dia 3 0,9996 4,3(4) 0,1(7) -7 1
Dia 4 0,9734 3,0(2) 0,9(2) -6 6
Dia 5 0,9868 4,3(6) 0,9(3) -9 6
Dia 6 0,9969 2,4(8) 0,2(6) -4 2
Dia 7 0,9993 5,2(7) 0,2(5) -1 2
Dia 8 0,9880 6,7(5) 1,3(6) -9 9
Dia 9 0,9945 6,7(4) 0,9(2) -12 6
Dia 10 0,9942 3,1(6) 0,4(4) -6 3
Dia 11 0,9988 4,6(5) 0,3(0) -6 2
Dia 12 0,9990 9,5(3) 0,5(4) -0 4
Por observação dos dados referentes às regressões lineares e analisando os resultados
obtidos para o Teste de Mandel ou de Fisher/Snedecor (Anexo V) pode constatar-se que as CC
apresentam na sua grande maioria boa linearidade para o composto 2-A-4-CP na gama de
concentrações 2 – 10 mg/L.
A calibração diária justifica-se pela ausência de reprodutibilidade de uma sessão de trabalho
para outra, traduzida pelas diferenças verificadas nos valores de declive (Tabela 9).
De acordo com os critérios de qualidade do LAIST, considerou-se que o limiar analítico
corresponde ao limite de quantificação e que o mesmo equivale ao primeiro ponto da curva de
calibração, ou seja, L.Q. igual a 2 mg/L. O primeiro ponto da curva de calibração foi estabelecido com
base no critério de que a razão sinal/ruído deve ser superior a 10, para fins de quantificação. [45]
Por interpolação das áreas obtidas na curva de calibração referente ao 2-A-4-CP obtiveram-se
os valores de concentração respectivos, procedendo-se deste modo à quantificação do composto.
35
3.3. Razão Ião de Quantificação/Ião de Qualificação
A razão ião de quantificação/ião de qualificação é utilizada para a qualificação do analito. Foi
avaliada a sua variação ao longo da gama linear de trabalho para o composto 2-A-4-CP, tendo-se
obtido o valor médio de 6,0 e um desvio-padrão relativo de 1,9%. De acordo com o resultado obtido
pode concluir-se que existe boa repetibilidade.
3.4. Selecção do método de extracção
Apresenta-se nesta fase do trabalho o procedimento efectuado bem como a discussão dos
resultados obtidos ao longo do processo de selecção da técnica de extracção de amostras.
3.4.1. Extracção líquido-líquido (LLE)
Como ponto de partida efectuou-se a extracção líquido-líquido de 1 L de água Milli-Q fortificada
com uma solução padrão conjunta de cerca de 6 mg/L e acidificada a pH 2 com uma solução aquosa
de ácido fosfórico (1:1). Utilizou-se o procedimento vigente no LAIST para a extracção de pesticidas
que aplica o diclorometano como solvente extractor (3x 40 mL). Concentrou-se o extracto a 1 mL
reconstituindo o mesmo na primeira linha do gradiente para posterior análise no LC-ESI-MS/MS.
Na Figura 18 encontram-se representadas as diferentes fases do procedimento de preparação
da amostra, desde a LLE até à concentração do extracto.
Figura 18 – Procedimento: a – LLE; b – Rotavapor; c – Evaporação sob corrente de N2.
Após injecção da amostra no equipamento de LC-ESI-MS/MS, por observação dos resultados
constatou-se que a partir do procedimento efectuado não se conseguiu extrair o composto 2-A-4-CP.
Tal facto pode ser devido à elevada polaridade do composto e por isso à elevada afinidade que o
mesmo tem para com o meio onde se encontra (água).
Obtiveram-se para os restantes compostos percentagens de recuperação entre 45 e 78%
(Anexo VI).
Efectuou-se então um outro ensaio de recuperação por LLE seguindo o mesmo procedimento,
mas acrescentando à água Milli-Q uma certa quantidade de sal (neste caso, cloreto de sódio), de
modo a baixar a solubilidade dos CP’s na fase aquosa.[46]
36
Não se verificaram quaisquer alterações quanto ao caso de estudo (2-A-4-CP), observando-se
contudo para os restantes CP’s um ligeiro aumento nas percentagens de recuperação.
Deste modo, efectuaram-se diversas experiências utilizando outra técnica de extracção,
nomeadamente a extracção em fase sólida (SPE). Pretendeu-se acima de tudo optimizar uma técnica
que permitisse a extracção do 2-A-4-CP, independentemente de se poder comprometer a extracção
dos restantes.
3.4.2. Extracção em fase sólida (SPE)
Efectuaram-se, nesta fase, ensaios de recuperação utilizando a técnica de SPE com recurso a
discos e a cartuchos de extracção. Existe um leque variado de adsorventes no mercado para SPE
com características diferentes que os tornam adequados para diferentes tipos de análise. Neste
trabalho os adsorventes testados foram os existentes no LAIST.
Discos
Assim, utilizaram-se discos do tipo SDB-XC (matriz de poliestireno divinilbenzeno) e do tipo
Envi-18 (matriz de fibra de vidro poroso contendo sílica ligada ao grupo funcional C18). A Figura 19
ilustra a montagem utilizado para as experiências de SPE com discos.
Figura 19 – Montagem utilizada na extracção SPE com discos.
Com o disco SDB-XC utilizou-se o procedimento de extracção SPE vigente no LAIST para os
pesticidas, com uma pequena alteração na etapa de eluição, nomeadamente a adição de 5 mL de
diclorometano. Para o segundo tipo de discos (Envi-18) o procedimento consistiu em condicionar com
5 mL de diclorometano, 10 mL de MeOH e 20 mL de água Milli-Q adicionados sequencialmente e,
após a adição da amostra, eluir os analitos com duas alíquotas de 5 mL de MeOH.
Com os discos SDB-XC os testes foram realizados fortificando as amostras com padrão
conjunto e acidificando-as a pH 2 com solução aquosa de ácido fosfórico (1:1). Utilizaram-se
diferentes volumes de água Milli-Q (250, 500 e 1000 mL) para verificar a possível saturação dos
discos. Obtiveram-se recuperações não quantificáveis para todos os CP’s analisados, não tendo sido
possível retirar qualquer conclusão acerca da saturação dos discos.
Quanto ao disco Envi-18, optou-se por fortificar a amostra apenas com o composto 2-A-4-CP,
mas de novo não se obteve recuperação do composto.
37
A eficiência da extracção com discos depende muito da etapa de condicionamento. Este facto
contribui para dificultar a operação desta técnica. Assim, uma das justificações para os resultados
obtidos pode ter consistido no incorrecto condicionamento dos discos de extracção.
Para as experiências seguintes, procedeu-se à fortificação da água Milli-Q novamente com o
composto 2-A-4-CP.
Cartuchos
A Figura 20 pretende ilustrar o sistema de extracção utilizado nas experiências de SPE com
recurso a cartuchos.
Figura 20 – Sistema de extracção SPE com cartuchos utilizado.
Os cartuchos testados encontram-se presentes na Tabela 10. Estes possuem características
adequadas à extracção de compostos de polaridade média a elevada. O procedimento de extracção
para cada tipo de cartucho foi retirado da literatura.[42]
,[47],[48],[49],[50]
Efectuaram-se ensaios de recuperação para os diferentes cartuchos utilizando 50 mL de água
Milli-Q fortificada com padrão de 10 mg/L de 2-A-4-CP e acidificada a pH 2 com solução aquosa de
ácido fosfórico (1:1).
Tabela 10 – Cartuchos utilizados e respectivas percentagens de recuperação para a extracção de 50 mL de
água Milli-Q fortificada com padrão de 10 mg/L de 2-A-4-CP e acidificada a pH 2.
Designação Adsorvente % Rec
Carbon Carvão activado -
Elut C18 Sílica ligada a grupo C18 34
RP-18 Sílica ligada a grupo C18 42
HLB Polidivinilbenzeno-co-N-vinilpirrolidona 60
SDB Copolímero de estireno e divinilbenzeno 72
Como se indica na Tabela 10, a utilização do cartucho do tipo Carbon não permitiu a
recuperação do composto de interesse. No que respeita aos cartuchos do tipo HLB, RP-18 e Elut C18
obtiveram-se recuperações de cerca de 60, 42 e 34%, respectivamente.
Os melhores resultados em termos de recuperação do composto 2-A-4-CP foram obtidos para
os cartuchos do tipo SDB.
38
Posteriormente, efectuaram-se ensaios de recuperação com os cartuchos SDB, utilizando
diferentes volumes de água Milli-Q (50 mL e 100 mL). Na Tabela 11 apresentam-se para cada volume
testado e para um grau de fortificação de 10 mg/L do composto 2-A-4-CP, a média das percentagens
de recuperação obtidas num total de quatro ensaios (n=4) e o desvio-padrão relativo.
Tabela 11 – Resultados obtidos para os ensaios de recuperação com os cartuchos SDB (6mL, 200 mg) para
diferentes volumes de água Milli-Q e para uma fortificação de 10 mg/L de 2-A-4-CP.
Volume de amostra (mL) % Rec (n=4) RSD %
50 72 6
100 73 4
Por observação dos resultados obtidos, constatou-se que é indiferente utilizar um volume de 50
ou 100 mL de amostra quando se está a utilizar este tipo de cartucho com estas características.
Como tal, optou-se por utilizar um volume de amostra de 100 mL, de modo a baixar o limite de
quantificação do método para o 2-A-4-CP (assumindo uma recuperação de 73%, obteve-se como
L.Q. do método o valor de 27 µg/L). Não foi possível efectuar mais ensaios para volumes de água
Milli-Q superiores devido à limitada quantidade de cartuchos disponíveis.
Efectuou-se um ensaio de recuperação com o disco do tipo SDB-XC, utilizando o mesmo
procedimento de extracção presente na Tabela 6 (página 27). De novo, não se obteve qualquer
recuperação do composto de interesse. Caso se tivesse obtido um resultado semelhante ao dos
cartuchos SDB, a utilização dos discos iria permitir trabalhar com volumes de amostra muito
superiores contribuindo desse modo para a diminuição do L.Q. do método para o 2-A-4-CP.
Em suma, o método de extracção por SPE com recurso a cartuchos do tipo SDB de 6 mL e
com 200 mg de adsorvente apresentou-se como sendo o mais robusto, isto é, o que permite obter
resultados confiáveis e reprodutíveis. Os ensaios de recuperação contribuíram para avaliar a
exactidão do método.
3.5. Estabilidade dos Clorofenóis em estudo
Por forma a averiguar a estabilidade dos CP’s em estudo, efectuaram-se testes que
consistiram em levar 1 mL de uma dada solução padrão conjunta à secura, sob corrente de azoto
(N2). Após reconstituição na primeira linha do gradiente e posterior análise verificaram-se perdas
totais da maioria dos compostos. As excepções consistiram no caso de estudo, o 2-A-4-CP, e no PCP
para os quais se observaram perdas de cerca de 20 e 30%, respectivamente.
Assim, foi possível concluir que para assegurar a qualidade dos resultados para além da
selecção de um procedimento adequado de extracção, deve garantir-se numa fase posterior que os
extractos obtidos não são conduzidos à secura.
39
3.6. Resultados das amostras
Quanto a amostras reais, tendo em conta o limite de quantificação obtido para o composto 2-A-
4-CP e o factor de concentração baixo, escolheu-se analisar de entre os diferentes tipos de água
existentes, águas superficiais.
Efectuou-se a colheita de uma amostra de água do Rio Tejo próximo da zona do Parque Tejo.
A colheita foi realizada em baixa-mar, para minimizar a diluição da amostra por junção com a água do
mar. Filtrou-se a amostra com o objectivo de eliminar a matéria em suspensão.
Procedeu-se à extracção para um volume de amostra de 100 mL seguindo o procedimento
presente na Tabela 6 (página 27). Realizaram-se ensaios de recuperação em duplicado para cada
nível de fortificação (4 mg/L e 10 mg/L).
Adicionalmente, efectuou-se uma análise por cromatografia iónica para determinar a
quantidade de cloretos presentes na amostra, tendo-se obtido um valor bastante elevado, cerca de 26
g/L.
Apresentam-se na Figura 21 os cromatogramas obtidos a partir da análise cromatográfica para
o ião de quantificação do composto 2-A-4-CP.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 21 - Cromatogramas obtidos para a análise em duplicado da amostra de água do Rio Tejo da zona do
Parque Tejo fortificada com (a) e (b) – 4 mg/L e (c) e (d) – 10 mg/L do composto 2-A-4-CP.
min
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 126
20140918_8 Smooth(Mn,1x2)
Teste41_AmostraFiltrada_100mL_4mgL
1.742e+0024.043.52
3.37
0.02
0.581.53 2.81
7.444.56
6.01 6.737.86
8.70 11.808.989.71
12.34
14.26
min
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 144
20140918_8 Smooth(Mn,1x2)
Teste41_AmostraFiltrada_100mL_4mgL
2.885e+0031.77
0.01
1.600.44
8.346.893.993.49
3.00
6.664.295.7814.36
8.80
9.20 12.279.85
11.5213.71
min
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 126
20140918_9 Smooth(Mn,1x2)
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9.868.93 10.38 14.2612.88
min
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 144
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min
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 126
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2.820.01
0.572.00
4.87
4.55 6.565.01
7.44 9.118.14 13.1611.719.97
10.80
min
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 144
20140918_10 Smooth(Mn,1x2)
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0.01
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3.02
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4.17 5.09 8.84 9.09 13.4312.209.7910.66
min
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 126
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5.265.61
7.99
7.5011.569.21
8.79
9.87 10.71 13.4312.54 13.71
min
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 144
20140918_11 Smooth(Mn,1x2)
Teste44_AmostraFiltrada_100mL_10mgL
2.616e+0031.80
0.01
1.620.94
7.093.643.54
2.93
6.984.51
4.91 8.44 14.368.82
12.139.77 11.33
12.88
40
Por observação dos cromatogramas obtidos, verificou-se a inexistência de qualquer sinal
referente ao composto 2-A-4-CP. Este resultado pode, eventualmente, dever-se à presença de
compostos na matriz analisada que possam interferir na extracção do analito. Sabe-se que o
mecanismo de retenção da fase estacionária utilizada (copolímero de estireno divinilbenzeno)
consiste na adsorção. Como tal, pensa-se que os sítios disponíveis do adsorvente possam ter
interagido tanto com a molécula do analito e/ou com as substâncias interferentes. Assim, a elevada
quantidade de cloretos na matriz analisada e a possibilidade de existência de substâncias (por
exemplo, susbtâncias húmicas bastante comuns em águas de estuário) que interagem com o analito
podem ter contribuído para a insucesso da extracção do mesmo. De acordo com a literatura a
salinidade, o pH e a presença de susbtâncias húmicas podem afectar a recuperação do analito
quando se utiliza SPE.[51], [52]
Seguidamente, analisou-se outra amostra de água superficial, sendo esta proveniente também
do Rio Tejo mas da zona da Chamusca. A quantidade de cloretos presente foi muito inferior ao
verificado para a outra amostra, cerca de 22 mg/L. Efectuou-se o mesmo procedimento de extracção,
mas devido à quantidade limitada de cartuchos de SPE do tipo SDB 6mL e 200 mg de adsorvente
recorreu-se a cartuchos com o mesmo tipo de adsorvente mas com metade da capacidade (3 mL e
100 mg de adsorvente).
Assim, por se utilizarem outros cartuchos testaram-se novamente dois volumes de amostra (50
e 100 mL) efectuando-se quatro ensaios de recuperação, para 50 e 100 mL fortificados com 4 mg/L e
50 e 100 mL fortificados com 10 mg/L, apresentando-se na Figura 22 os cromatogramas obtidos.
(a)
(b)
(c)
min
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 126
20140925_8 Smooth(Mn,1x2)
Teste45_AmostraRTChamusca_cartucho100mg_50mL_4mgL
2.331e+0032_amino_4Clorofenol
10.52
1495.51
2254
36.68
4.412.621.63 6.045.66
6.95 8.98
min
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 144
20140925_8 Smooth(Mn,1x2)
Teste45_AmostraRTChamusca_cartucho100mg_50mL_4mgL
1.417e+0042_amino_4Clorofenol
10.47
9006.00
12752
7.72
2.080.012.46
3.17
5.93 7.517.05
min
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 126
20140925_10 Smooth(Mn,1x2)
Teste47_AmostraRTChamusca_cartucho100mg_100mL_4mgL
7.428e+0022_amino_4Clorofenol
10.47
423.17
669
7.85
2.512.031.54
3.992.97
5.17 7.567.376.52 8.679.01 11.85 12.34 13.30
min
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 144
20140925_10 Smooth(Mn,1x2)
Teste47_AmostraRTChamusca_cartucho100mg_100mL_4mgL
5.251e+0032_amino_4Clorofenol;10.52;2856.07;3982;1.36
1.98
0.01
0.480.61
2.10
2.652.75
4.284.40 6.09 7.05 7.36 8.709.86 13.5712.27
min
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 126
20140925_9 Smooth(Mn,1x2)
Teste46_AmostraRTChamusca_cartucho100mg_50mL_10mgL
9.270e+0032_amino_4Clorofenol
10.38
6011.71
9193
159.70
min
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 144
20140925_9 Smooth(Mn,1x2)
Teste46_AmostraRTChamusca_cartucho100mg_50mL_10mgL
5.646e+0042_amino_4Clorofenol
10.38
36278.12
55517
26.13
2.03
41
(d)
Figura 22 – Cromatogramas obtidos para a análise da amostra de água do Rio Tejo da zona da Chamusca (50 e
100 mL) fortificada com 4 mg/L (a) e (b), e 10 mg/L (c) e (d), do composto 2-A-4-CP.
Pode observar-se, a partir da Figura 22, a presença de sinal referente ao analito para os dois
níveis de fortificação utilizados. Este resultado parece estar relacionado com o facto da matriz
apresentar na sua constituição uma concentração de cloretos bastante inferior à da amostra
analisada anteriormente, apresentando-se na Tabela 12 as percentagens de recuperação obtidas
para os ensaios efectuados.
Não tendo sido possível repetir estes ensaios, devido a já não se dispor de mais cartuchos é
difícil retirar conclusões a partir dos valores apresentados na Tabela 12. Por outro lado, a utilização
de cartuchos com metade do volume e da quantidade de adsorvente, isto é, com capacidade de
retenção inferior pode contribuir para recuperações mais baixas do analito, quando comparadas com
os valores presentes na Tabela 11.
Mas podem também estar afectados pela interferência dos cloretos que embora numa
concentração muito inferior à encontrada no estuário do Tejo podem ainda competir com o analito
para o adsorvente.
Tabela 12 - Resultados obtidos para os ensaios de recuperação com os cartuchos SDB (3 mL,100 mg) para
diferentes volumes de amostra de água do Rio Tejo da zona da Chamusca e fortificação de 4 e 10 mg/L.
Volume de amostra (mL)
% Rec para fortificação de 4 mg/L
% Rec para fortificação de 10 mg/L
50 23 37
100 7 22
Caso se tivesse à disposição uma maior quantidade de cartuchos do tipo SDB de 6 mL e 200
mg de adsorvente seria oportuno efectuar ensaios, em condições de repetibilidade, com diferentes
volumes de amostra para encontrar o volume que permitisse diminuir o L.Q. do método para o
composto 2-A-4-CP sem comprometer a recuperação do mesmo. Consoante o volume estabelecido,
caso se conseguisse diminuir o L.Q. do método, poderia apostar-se na análise de outro tipo de águas.
min
2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 126
20140925_11 Smooth(Mn,1x2)
Teste48_AmostraRTChamusca_cartucho100mg_100mL_10mgL
6.576e+0032_amino_4Clorofenol
10.47
3849.74
6466
98.92
min
%
0
100
F1:MRM of 3 channels,ES+
144 > 144
20140925_11 Smooth(Mn,1x2)
Teste48_AmostraRTChamusca_cartucho100mg_100mL_10mgL
3.740e+0042_amino_4Clorofenol
10.47
21894.70
35843
12.20
1.99
42
4. Conclusões e Perspectivas Futuras
Este estudo mostra que que é possível determinar o 2-amino-4-clorofenol através da
metodologia implementada de SPE-LC-ESI-MS/MS, o que constitui um resultado importante face a
não ser possível quantificá-lo através da metodologia de análise de CP’s vigente no LAIST (HS
SPME-GC-MS)
O método cromatográfico de LC-ESI-MS/MS desenvolvido apresenta boa linearidade, traduzida
por bons coeficientes de determinação e de acordo com os resultados obtidos pelo teste de Mandel.
A gama linear de trabalho obtida para o composto 2-A-4-CP situa-se entre 2 e 10 mg/L, sendo o L.Q.
igual a 2 mg/L.
Do estudo efectuado à variação da razão Ião de Quantificação/Ião de Qualificação conclui-se
que a mesma se mantém estável (desvio-padrão relativo de 1,9%) ao longo de toda a gama linear de
trabalho para o composto 2-A-4-CP.
No que respeita à técnica de extracção em fase sólida (SPE) de acordo com os resultados
obtidos conclui-se que os cartuchos do tipo SDB (copolímero de estireno e divinilbenzeno) com 6 mL
e 200 mg de adsorvente são os que permitem recuperar o analito de interesse (2-A-4-CP). O
procedimento de extracção é bastante simples e rápido e recorre a pequenas quantidades de
solvente o que constitui uma vantagem sob o ponto de vista ambiental. A recuperação obtida, em
condições de repetibilidade, para o limite máximo da curva de calibração nos testes com água Milli-Q
(100 mL) foi de 73%.
Relativamente às amostras de água do Rio Tejo analisadas não foi possível retirar conclusões,
tendo em conta o número reduzido de ensaios realizados. Contudo, a presença de elevadas
quantidades de cloretos e possivelmente de outras substâncias interferentes na matriz pode ter
contribuído para o insucesso dos ensaios realizados para a água do Rio Tejo proveniente da zona do
Parque Tejo.
As agências responsáveis pela protecção do ambiente e da saúde humana presentes em todo
o mundo impõem diferentes limites para os CP’s em águas. Assim, de acordo com esta realidade e
tendo em conta que não existe legislação implementada para o 2-A-4-CP, não se pode inferir se o
limite de quantificação obtido para este composto é ou não elevado.
No caso de se dispor de uma quantidade razoável de cartuchos de SPE do tipo SDB com 6 mL
e 200 mg de adsorvente, deveriam efectuar-se testes para diversos volumes de amostra por forma a
averiguar qual o máximo de capacidade dos cartuchos. Tentaríamos desse modo estabelecer um
compromisso entre o volume de amostra que não comprometesse a recuperação do analito de
interesse e que ao mesmo tempo permitisse baixar o limite de quantificação do método, alargando
desse modo o leque de águas a analisar.
Outra opção poderia passar pela aquisição de discos de extracção adequados ao tipo de
analitos analisados que permitissem a utilização de um volume de amostra superior ao utilizado com
os cartuchos, por exemplo SDB-RPS (copolímero de poli-estireno e divinilbenzeno modificado com
43
grupos de ácido sulfónico), que de acordo com a informação presente na literatura permitem obter
bons resultados no que respeita à extracção de compostos fenólicos.[15]
Para os restantes CP’s em estudo, o intervalo de linearidade obtido foi 0,25-10 mg/L.
Constatou-se que o método não é selectivo para com os isómeros 2-CP, 3-CP, 4-CP e 2,4,5-TCP,
2,4,5-TCP. Verifica-se que os limites obtidos são superiores aos que se obtêm pela metodologia de
GC-MS vigente no LAIST. Por outro lado, por GC-MS só não se conseguem separar os isómeros 3-
CP e 4-CP. Assim, conclui-se que o método cromatográfico implementado não é adequado para a
determinação dos CP’s em estudo, à excepção do 2-A-4-CP.
44
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48
Anexo I – Procedimento para ligar/desligar o sistema LC-MS/MS
Ligar:
1) Ligar o equipamento de HPLC no botão.
2) Ligar o azoto (N2) no MS Tune (software Masslynx 4.0).
3) Em Inlet Method carregar no símbolo de uma torre para se comandar a partir do HPLC.
4) No HPLC, em Menu/Status ligar o desgaseificador (Degasser).
5) Carregar em Diag e de seguida em Prime Seal Wash e Start (+/- 2 minutos, é desligado
por nós carregando em Halt).
6) Carregar em Diag e de seguida em Prime Needle Wash (está gravado 1 minuto; efectua-se
duas vezes, sendo necessário carregar novamente no Start após o primeiro minuto). Depois carregar
em Close.
7) Efectuar a purga dos 4 canais. Para tal, ir a Menu/Status, Direct Function, Wet prime (3
minutos) e carregar em OK.
8) Efectuar a purga do sistema. Faz-se passar 12 a 18 vezes no loop, já nas percentagens
correspondentes à primeira linha do gradiente. Colocar o Flow a 0,05 mL/min e ir aumentando
lentamente até aos 0,2 mL/min.
9) Em Inlet Method, carregar em Load Method e de seguida no símbolo de uma torre para se
iniciar o comando directamente no software Masslynx 4.0. Ligar o árgon e carregar em Press to
operate no MS Tune.
Desligar:
1) Em Inlet Method, pressionar o símbolo de uma torre para se comandar a partir do HPLC.
2) Lavar o sistema e deixar os filtros em solvente.
3) Desligar o desgaseificador (Degasser).
4) Desligar o HPLC no botão.
5) No software Masslynx 4.0, carregar em Press to standby.
6) Abrir a pasta Shutdown e escolher Shutdown 20C.
7) Desligar o azoto (N2) e o árgon (Ar)
Nota: No que já foi purgado colocamos o valor zero e carregamos em Enter
até os 100% passarem para o canal seguinte. Repetir o passo 7.
49
Anexo II – Estrutura Molecular dos Clorofenóis em estudo
2-amino-4-clorofenol
2-clorofenol
3-clorofenol
4-clorofenol
2,4-diclorofenol
4-cloro-3-metilfenol
2,4,5-triclorofenol
2,4,6-triclorofenol
Pentaclorofenol
50
Anexo III – Espectros de fragmentação dos Clorofenóis em estudo
Apresentam-se os espectros de fragmentação para os CP’s em estudo com indicação dos iões
de quantificação e de qualificação. No que respeita aos isómeros (2-CP, 3-CP e 4-CP; 2,4,5-TCP e
2,4,6-TCP), optou-se por apresentar a título de exemplo os espectros para um dos compostos, uma
vez que as transições são as mesmas, variando apenas as condições de obtenção das mesmas.
2-clorofenol
Condicao inicial Cone 30V Col 15V
m/z60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120
%
0
100
DGSCAN_2CP_3 1 (2.022) Daughters of 127ES- 2.30e491.12
67.5362.07
59.56
60.94 62.70 65.08
70.79
68.9790.87
85.2372.61
83.09
73.81 82.9075.5680.14
87.11
86.1790.69
94.07
92.51
106.81
100.35
99.9195.39
103.11103.86
113.02
110.26
109.88 112.90
118.35114.53
115.15
120.61
Condicao inicial Cone 30V Col 20V
m/z20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
%
0
100
DGSCAN_2CP_4 1 (2.022) Daughters of 127ES- 2.64e435.15
34.71
31.5128.49
22.85
20.1521.09
23.35 25.6124.10 27.49
29.50
34.52
32.57
55.04
38.98
36.97
49.65
46.4443.3741.1739.67 45.7545.25
49.4648.39
53.60
50.52 52.34 54.29
55.86
57.9357.24 59.12 59.50
Ião de
Quantificação
Ião de
Qualificação
[M-H-HCl]-
[Cl]-
51
2,4-diclorofenol
4-cloro-3-metilfenol
Cone 35V Col 20V
m/z70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180
%
0
100
DGSCAN_24DCP_02 1 (2.022) Daughters of 161ES- 9.69e5125.07
89.05
161.01
Cone 35V Col 20V
m/z50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
%
0
100
DGSCAN_24DCP_02 1 (2.022) Daughters of 161ES- 2.08e589.05
61.19
Cone 35V Col 20V
m/z90 92 94 96 98 100 102 104 106 108 110 112 114 116 118 120 122 124
%
0
100
DGSCAN_4C3MP_02 1 (2.022) Daughters of 141ES- 1.94e4105.12
90.56
100.7997.15
92.6991.06 93.7695.08 96.83
97.46
100.22
98.15
104.80103.11
105.30
108.44
105.74
106.06
112.58
110.14
109.38
111.01123.50
117.04114.97114.40 120.68117.85
122.18123.62 125.38
Ião de
Qualificação
Ião de
Quantificação
Ião de
Quantificação
[M-H-HCl]-
[M-H-2HCl]-
[M-H-HCl]-
52
2,4,6-triclorofenol
Cone 35V Col 20V
m/z20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76
%
0
100
DGSCAN_4C3MP_02 1 (2.022) Daughters of 141ES- 3.24e435.21
35.02
34.58
21.97 31.0123.41 30.0626.55
32.51
53.66
52.2241.30
38.9137.1645.1944.31
48.08 50.52
69.1059.18
58.4354.04 63.2060.69 65.46 68.54 70.17 73.62 74.18
Cone 40V Col 20V
m/z115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190
%
0
100
DGSCAN_246TCP_02 1 (2.022) Daughters of 195ES- 1.68e5159.19
123.12
122.75
116.03144.64
129.14125.69 140.75137.17
147.84154.43
173.49170.67
168.41 183.65192.12
Cone 40V Col 25V
m/z102 104 106 108 110 112 114 116 118 120 122 124 126 128 130 132 134 136 138 140 142 144 146
%
0
100
DGSCAN_246TCP_03 1 (2.022) Daughters of 195ES- 4.45e4123.19
119.80
109.76
109.07101.67
107.50
113.59
111.26 118.54116.97115.53
122.43
131.15
129.02124.50 126.13132.97
138.87135.67 141.19 146.15142.13
Ião de
Qualificação
Ião de
Qualificação
Ião de
Quantificação
[M-H-HCl]-
[M-H-2HCl]-
[Cl]-
53
Pentaclorofenol
TS120 TDS270 Col 5V
m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640
%
0
100
DGSCAN_PCP_ESINEG_1 1 (2.022) Daughters of 263ES- 3.40e6263.08
Ião de
Quantificação
[M-H]-
54
Anexo IV – Cromatograma obtido por injecção de uma solução
padrão conjunta, para o ião de quantificação
O cromatograma seguinte foi obtido por injecção de uma solução padrão conjunta de 10 mg/L,
para o ião de quantificação referente a cada composto, aquando da definição do método de análise
por LC-ESI-MS/MS. Permitem estabelecer a ordem de eluição.
55
Anexo V – Tratamento de Resultados
Teste de Mandel ou de Fisher/Snedecor [35]
O teste de Mandel ou de Fisher/Snedecor é uma ferramenta estatística útil para avaliar a
linearidade da curva de calibração.
Assim, procede-se inicialmente à determinação de duas funções de calibração, uma linear e
outra polinomial de segundo grau, a partir do conjunto de resultados obtidos, nomeadamente dos
valores de áreas e de concentração.
Para cada função de calibração calculam-se os respectivos desvios-padrão relativos a partir
das equações 1 e 2.
Sy/x=√∑(yi-y)2
N-2 Equação 1
𝑆𝑦2 = √∑(𝑦𝑖 − 𝑦)2
𝑁 − 3 Equação 2
Sendo, y o valor estimado a partir da função de calibração ajustada e N o número de pontos da curva
de calibração.
Posteriormente efectua-se a determinação do valor de teste (VT ou PG) através da equação 4,
sendo necessário para tal calcular primeiramente a diferença de variâncias (DS2) a partir da equação
3.
𝐷𝑆2 = 𝑆𝑦/𝑥2 × (𝑁 − 2) − 𝑆𝑦2
2 × (𝑁 − 3) Equação 3
𝑉𝑇 =𝐷𝑆2
𝑆𝑦22 Equação 4
Por fim, o valor teste (VT) é comparado com o valor da distribuição F de Fisher/Snedecor,
para um grau de confiança de 95%. Caso se verifique VT inferior ou igual a F, conclui-se que a
função de calibração é linear. Caso contrário constata-se que a função é não linear, devendo avaliar-
se a possibilidade de reduzir a gama de trabalho.
Apresentam-se de seguida, a título de exemplo, para os CP’s em estudo (à excepção do 2-
amino-4-clorofenol), os dados referentes a duas das curvas de calibração obtidas para cada
composto (Tabela 1).
56
Tabela 1 – Dados obtidos a partir da regressão linear para os CP’s em estudo efectuando a metodologia LC-
MS/MS.
Composto Gama Linear de Trabalho
(mg/L)
Coeficiente de Correlação, R
2
Declive Ordenada na
origem L.Q.
(mg/L)
2-CP 0,25 - 10 Dia 1: 0,9991 Dia 1: 0,64 Dia 1: -43,27
0,25 Dia 2: 0,9966 Dia 2: 0,79 Dia 2: 13,38
3-CP 0,25 - 10 Dia 1: 0,9986 Dia 1: 0,58 Dia 1: 172,44
0,25 Dia 2: 0,9986 Dia 2: 0,66 Dia 2: 79,81
4-CP 0,25 - 10 Dia 1: 0,9989 Dia 1: 0,81 Dia 1: 190,15
0,25 Dia 2: 0,9990 Dia 2: 0,89 Dia 2: 98,25
PCP 0,25 - 10 Dia 1: 0,9972 Dia 1: 91,38 Dia 1: 19318
0,25 Dia 2: 0,9993 Dia 2: 97,03 Dia 2: 584,18
4-C-3-MP 0,25 - 10 Dia 1: 0,9980 Dia 1: 0,53 Dia 1: 94,90
0,25 Dia 2: 0,9987 Dia 2: 0,60 Dia 2: 2,00
2,4-DCP 0,25 - 10 Dia 1: 0,9988 Dia 1: 0,56 Dia 1: -134,29
0,25 Dia 2: 0,9983 Dia 2: 0,62 Dia 2: -93,57
2,4,5-TCP 0,25 - 10 Dia 1: 0,9996 Dia 1: 26,39 Dia 1: -6800,1
0,25 Dia 2: 0,9997 Dia 2: 28,16 Dia 2: -5227,7
2,4,6-TCP 0,25 - 10 Dia 1: 0,9994 Dia 1: 31,85 Dia 1: 446,66
0,25 Dia 2: 0,9998 Dia 2: 37,45 Dia 2: -7577,7
Seguidamente encontram-se sumarizados (Tabela 2) os resultados obtidos para o teste de
Mandel também para as curvas traçadas em duas sessões de trabalho.
Tabela 2 - Resultados obtidos para o teste de Mandel ou de Fisher/Snedecor para os CP’s em estudo.
CC – Dia 1 CC – Dia 2
Composto Valor teste (VT) Valor teste (VT) Valor F Tabelado Função de calibração
2-CP 0,06 0,08 6,61 Linear
3-CP 1,38 0,03 6,61 Linear
4-CP 1,80 1,44 6,61 Linear
2,4-DCP 1,22 2,06 6,61 Linear
2,4,5-TCP 1,30 0,34 6,61 Linear
2,4,6-TCP 0,65 3,41 6,61 Linear
PCP 0,37 6,58 6,61 Linear
4-C-3-MP 2,51 0,91 6,61 Linear
2-A-4-CP 0,09 1,72x10-3 18,51 Linear
Ensaios de Recuperação
Para a determinação da percentagem de recuperação (%Rec) utiliza-se a equação 5.
% 𝑅𝑒𝑐 =𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎 − 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑡𝑎𝑙 𝑒 𝑞𝑢𝑎𝑙
𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑎 Equação 5
57
Ensaios de Repetibilidade
Por forma a averiguar a repetibilidade dos resultados procede-se ao cálculo do desvio-padrão
relativo (RSD) utilizando para tal a equação 6.
𝑅𝑆𝐷 % =𝑆
�̅�× 100 Equação 6
Sendo S o desvio-padrão absoluto e �̅� a média dos resultados obtidos.
58
Anexo VI – Recuperações dos Clorofenóis em estudo obtidas por
LLE
Apresentam-se na Tabela 3 as percentagens de recuperação obtidas para a extracção líquido-
líquido de 1 L de água Milli-Q fortificado com solução padrão conjunta de 6 mg/L e acidificado a pH 2
com uma solução aquosa de ácido fosfórico (1:1).
Tabela 3 – Resultados obtidos para o ensaio de recuperação efectuado por LLE, para os CP’s estudados.
Composto % Rec
2-CP 45
3-CP 46
4-CP 46
2,4-DCP 75
2,4,5-TCP 78
2,4,6-TCP 77
PCP 73
4-C-3-MP 65
2-A-4-CP -
A técnica LLE utilizada permitiu obter resultados satisfatórios para a maioria dos CP’s em
estudo, à excepção do 2-A-4-CP.
