UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

DIABETES TIPO I: ESTRATÉGIAS PARA IMUNOTERAPIA

Murilo Pissinati Perez

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo.

Orientadora: Dulcineia Saes Parra

Abdalla

São Paulo

2017

SUMÁRIO

Pág.

Lista de Abreviaturas .......................................................................... 1

RESUMO .......................................................................................... 2

1. INTRODUÇÃO................................................................................. 4

2. OBJETIVOS.................................................................................... 7

3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................... 7

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................

4.1 Células T regulatórias que expressam Foxp3 como ferramenta

protetora contra o diabetes tipo I...................................................

4.2 Papel das células B no desenvolvimento da diabetes tipo I e suas

possíveis intervenções imunoterapêuticas.........................................

4.3 Estudos variados de alta relevância para o tratamento do diabetes tipo

I...........................................................................................

9

9

16

18

5. CONCLUSÃO...................................................................................

35

6. BIBLIOGRAFIA................................................................................. 37

1

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

FDA Food and Drug Administration

DM1

DM2

CTLA-4

T-reg

Diabetes Mellitus Tipo 1

Diabetes Mellitus Tipo 2

Proteína 4 associada à Linfócito T citotóxico

Células T regulatórias

LPS

ND

CRP

TLR

GM-CSF

CTL

HbA1C

Lipopolissacarídeo

Não diabético

Proteína C reativa

Receptor do tipo Toll (Toll-Like receptor)

Granulócito/Macrófago Fator Estimulador de Colônia

Linfócito T citotóxico

Hemoglobina glicada A1c

2

RESUMO

PEREZ, MP. Diabetes Tipo I: estratégias para imunoterapia. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Palavras-chave: “type 1 diabetes, immune tolerance, β-cell, cytokine, immunotherapy, regulatory T cell.” INTRODUÇÃO: O diabetes tipo I (DM1) é uma disfunção metabólica autoimune caracterizada pela deficiência de insulina resultante da destruição de células beta nas ilhotas de Langerhans do pâncreas. Devido à impossibilidade atual de cura e poucos recursos para o tratamento da doença (basicamente aplicação de insulina e acompanhamento dietético), há diversos estudos, apoiados no conhecimento da fisiopatologia da doença, que enfocam as estratégias imunoterápicas. Alguns desses estudos já estão sendo desenvolvidos em humanos, porém a maioria ainda se encontra na etapa pré-clínica em modelos experimentais. Esses estudos demonstram a potencial aplicabilidade de ferramentas de bloqueios do processo autoimune e elucidam as funções de determinadas células no desenvolvimento da doença. Considerando-se o conhecimento gerado nos estudos desenvolvidos até o momento, essa monografia enfoca as áreas de futura investigação para as possíveis imunoterapias no tratamento do DM1. OBJETIVO: Essa monografia tem como objetivo a descrição de potenciais alvos terapêuticos para o futuro da imunoterapia no DM1, assim como averiguar as estratégias imunoterápicas já identificadas ou em fase de estudo. A metodologia utilizada foi a pesquisa bibliográfica de estudos publicados a partir de 1996. MATERIAIS E MÉTODOS: O estudo foi desenvolvido por meio de revisão de literatura utilizando as bases de dados PUBMED e SCIELO (Scientific Eletronic Library Online). RESULTADOS: As estratégias imunoterapêuticas para o tratamento do DM1 são diversas, sendo a utilização de citocinas, fatores de transcrição e substâncias moduladoras do sistema imune as principais vias de ativação e desativação de células imunológicas para diminuir a resposta autoimune. Atualmente, modulação da resposta autoimune via células regulatórias, seja linfócitos B ou linfócitos T, assim como, o papel dos diferentes subtipos de linfócitos T helper, em especial a indução à polarização para o fenótipo Th2, tem sido bastante estudado. A produção de citocinas também é muito investigada, considerando-se que, o papel das citocinas pró-inflamatórias é primordial para a destruição das células produtoras de insulina e que a inibição dessa destruição por modulação das citocinas anti-inflamatórias também é uma potencial estratégia para imunoterapias. O risco de combinações imunoterápicas surge quando não se obtém o efeito esperado ao se administrar, concomitantemente, anticorpos e imunossupressores,

3

sendo necessário muito cuidado com essas associações para se obter tratamentos confiáveis, eficientes e de qualidade. CONCLUSÃO: Apesar dos avanços no entendimento da imunopatologia do DM1, ainda há barreiras difíceis de ultrapassar devido à sua complexidade. Existem vários fatores que são primordiais para o desenvolvimento do DM1, tais como: i) a destruição das células β pancreáticas mediada por células Th1; ii) a ação de proteção das células Th2; iii) a apresentação de autoantígenos do pâncreas pelas células B; iv) a participação de fatores de transcrição que regulam a ação das células imunes, como o Foxp3 nas células T regulatórias. O papel das citocinas e suas ações nas células do sistema imune também é alvo de estudos de intervenção no DM1, como por exemplo, o papel das citocinas IL-8 (pró-inflamatória) e IL-10 (anti-inflamatória) ou ainda, a ação da citocina IL-2 sobre as células T regulatórias. Outro enfoque importante é elucidar o potencial de aplicabilidade das terapias combinadas no tratamento do DM1, tal como a associação de rapamicina com anticorpos anti-CD3 que resultou no efeito oposto ao esperado. Em conclusão, constata-se que a imunoterapia desenvolveu-se muito nos últimos anos, porém ainda há muitos desafios a serem vencidos para se obter um tratamento específico para o DM1, com baixo risco de efeitos colaterais e com boa eficácia terapêutica.

4

1. INTRODUÇÃO O diabetes tipo I (DM1) é uma disfunção metabólica autoimune

caracterizada pela deficiência de insulina resultante da destruição de células beta

nas ilhotas de Langerhans. Essa destruição de células próprias é característica de

uma doença autoimune e é determinada por diversos fatores, dentre os quais

podemos citar uma falha no importante processo do sistema imunológico chamado

tolerância central (processo que ocorre no timo e, basicamente, deleta timócitos

auto-reativos). Muitos outros processos estão envolvidos na fisiopatologia do

diabetes tipo I, como, por exemplo, o papel inibitório na expansão clonal da

proteína de membrana CTLA-4 de linfócitos T [1], sendo que a indução da

expressão de CTLA-4 em células T de ratos preveniu a autoimunidade por

indução da tolerância periférica e por também mantê-la [2]. A figura 5 ilustra,

resumidamente, a patogênese da DM1.

5

Figura 5. Patogênese da DM1. Os fatores ambientais e genéticos iniciam um

processo de ataque autoimune às células produtoras de insulina. Células

dendríticas ativadas estimulam células T a secretarem citocinas pro-inflamatórias

(IL-1β, IL-6, IL-17, IL-12, TNF-α e interferon (IFN)-γ). As infiltrações de células

imunes contribuem para a inflamação do microambiente (macrófagos, monócitos,

células dendríticas, células T helper, células T citotóxicas (CTL – CD8+). Esse

microambiente de inflamação nas ilhotas pancreáticas leva a uma resposta

superexpressada de células imunológicas (natural killer (NK), células B

regulatórias (Breg), células T regulatórias (Treg)), porém de forma gradual e lenta,

que varia de indivíduo para indivíduo. Finalmente, o processo de destruição de

células produtoras de insulina se estabiliza quando apenas um residual dessas

células permanece presente nas ilhotas [3].

O DM1 pode ser classificado como [4]: tipo 1, resultante da destruição de

células beta do pâncreas por reação autoimune, sendo subdividido em tipo 1B

idiopático e tipo 1A determinado pela participação de células T auto-reativas

contra antígenos das células beta. Portanto, as células T são participantes

fundamentais no desenvolvimento da doença.

O DM1 fulminante é um subtipo de diabetes que acomete, principalmente,

os asiáticos. Caracteriza-se por destruição praticamente total de células beta,

sendo que a produção de insulina pelo indivíduo é quase zero, apresentando

características como: rápido desenvolvimento, sintomas do diabetes passageiros,

diagnóstico muitas vezes realizado quando o paciente já está em acidose,

ausência de anticorpos autorreativos; secreção indetectável de peptídeo C e

atividade elevada de enzimas pancreáticas [5].

Há uma equivalência na epidemiologia do diabetes tipo I com relação ao

acometimento da doença entre os sexos e não existe uma correlação de maior

incidência em determinada raça ou etnia. Por outro lado, existe uma maior

incidência de acordo com o país ou região. Os fatores de risco para a doença são

diversos, por exemplo: ambientais, vírus, dieta, substâncias químicas e genética

6

Com relação ao fatores genéticos, mais desenvolvidos e estudados dentre

os fatores de risco para o DM1, há uma correlação de 18 regiões no genoma que

estão ligadas ao desenvolvimento da doença, sendo que cada uma dessas

regiões correspondem a um gene, que foram nomeados, na sequência, de IDDM1

a IDDM18. Dentre esses genes, o mais estudado é o IDDM1, que contem genes

HLA que codificam proteínas de resposta imune. As variações nesses genes HLA

são importantes fatores de risco genético, porém não podem ser estabelecidos

como únicos causadores da doença, pois diversos outros genes estão envolvidos

no processo. Outros dois genes não-HLA foram identificados como fatores de

risco para o desenvolvimento do DM1, são eles: IDDM2, que é o gene codificador

da insulina; IDDM12, que é o gene codificador de receptores co-estimuladores nos

linfócitos T, sendo o CTLA-4 o mais provável dos receptores codificados nesse

gene [6].

Ainda sobre a epidemiologia do DM1, há muita variação de ocorrência da

doença de acordo com a região no mundo ao longo dos anos. Em países com

vasto território como o Brasil, também é difícil de obter dados homogêneos, uma

vez que a incidência varia muito entre as cidades, notando-se que a cidade de

São Paulo lidera o ranking das cidades do Brasil em incidência de DM1. Em um

estudo de 1998 realizado em Londrina (PR), analisou-se a variância de novos

casos de DM1 a cada ano, notando-se que a doença acometia números

significativamente distintos de indivíduos por ano, como por exemplo, em 1993

registraram-se 2,4 novos casos de DM1 a cada 100.000 habitantes, porém em

1994 esse número foi de 9,4 a cada 100.000, mostrando que os valores não

podem ser analisados de forma uniforme em um grande espaço de tempo. Além

disso, a incidência de DM1 no mundo é diferente, sendo que a América do Norte e

a Europa lideram esse ranking. [7]

A incidência do DM1 é majoritariamente sobre crianças [8], sendo as

populações mais afetadas a da Escandinávia, Sardenha e Kuwait [9]. Já as

populações menos afetadas são os asiáticos e os latinos americanos. Nas últimas

décadas, a taxa de aumento de incidência da doença nos países desenvolvidos

tem-se mantido em 3% ao ano [10][11][12].

7

Não há atualmente uma cura para o diabetes tipo I e o seu controle é feito

por dieta e intervenções medicamentosas. As únicas alterativas farmacológicas

existentes para controle da hiperglicemia são: administração de insulina

subcutânea e hipoglicemiantes orais.

Esta monografia aborda o futuro da imunoterapia no tratamento para o

diabetes tipo I, sendo que alguns estudos em animais já estão concluídos e muitos

ainda estão em andamento. Gandhi e col. (2008) realizaram uma meta-análise

sobre algumas abordagens imunoterápicas para o diabetes tipo I apontando o uso

de agentes antiproliferativos (metotrexato, azatioprina), anticorpos monoclonais

(CD3, CD4), inibidores de células T (ciclosporina) e outros agentes imunoterápicos

(photopheresis, linomida, fusidin, buffy coat, imunoglobulina intravenosa, BCG,

nicotinamida) em pacientes com diabetes tipo 1 recém-diagnosticados e seguidos

por 6 meses ou mais [13]. Dessa forma, estudos de revisão sistemática são uma

boa abordagem introdutória sobre o que existe de mais novo em pesquisa para o

tratamento imunoterápico do diabetes tipo I.

2. OBJETIVO(S)

O objetivo do trabalho é descrever o estado atual da investigação sobre a

imunoterapia do DMI. Dessa forma, futuras pesquisas nessa área poderão se

beneficiar desse trabalho no que tange às informações sobre os estudos já

realizados com essa abordagem terapêutica.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

O estudo foi desenvolvido por meio de revisão de literatura utilizando as

bases de dados PUBMED e SCIELO (Scientific Eletronic Library Online).

8

Foram utilizados livros texto de imunologia, patologia e de fisiologia para

suporte às informações mais atualizadas dos artigos científicos e como fonte de

conhecimento básico.

3.1. Estratégias de pesquisa

A pesquisa bibliográfica foi realizada com a utilização dos seguintes

unitermos: “type 1 diabetes, immune tolerance, β-cell, cytokine, immunotherapy,

regulatory T cell.” Dessa forma houve uma restrição e especialização do campo de

imunoterapias a ser analisado, considerando-se que há uma imensidão de tópicos

abordando estratégias imunológicas para o tratamento de DM1.

3.2. Critérios de inclusão

Os critérios de inclusão de estudos na revisão bibliográfica foram baseados

na importância, inovação e aplicabilidade de cada estudo para o tratamento de

DM1. Para garantir esses critérios levou-se em conta: i) o ano de publicação do

artigo, a partir de 1996; ii) artigos indexados nas bases PUBMED ou SCIELO.

3.3. Critérios de exclusão

Os critérios de exclusão foram baseados na não conformidade dos termos

descritos nos critérios de inclusão (3.2).

3.4. Coleta e análise dos dados

A metodologia de revisão aplicada neste estudo foi baseada nas

orientações do NHS/York [14], em que descreve a revisão sistemática de dados

como sendo realizada em nove passos agrupados em três estágios:

a) estágio I: Planejando a revisão

9

Fase 0: Identificação da necessidade da revisão

Fase 1: Preparação de uma proposta para a revisão sistemática

Fase 2: Desenvolvimento de um projeto da revisão

b) estágio II: Conduzindo a revisão

Fase 3: Identificação da literatura

Fase 4: Seleção dos estudos

Fase 5: Avaliação da qualidade dos estudos

Fase 6: Extração dos dados e monitorização do progresso

Fase 7: Síntese dos dados

c) estágio III: Apresentação do relatório e divulgação

Fase 8: Relatório e recomendações

Fase 9: Transferindo evidências para a prática

O estudo aqui apresentado refere-se ao estágio III com a apresentação e

discussão das informações obtidas na literatura, respectivamente, nas seções 4

(Resultados e Discussão) e 5 (Conclusões).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Células T regulatórias que expressam Foxp3 como estratégia protetora

para o diabetes tipo I.

A relação estabelecida entre o papel das células T regulatórias e a resposta

imunológica determinante para o desenvolvimento do DM1 é algo bastante

explorado para a imunoterapia da doença [15]. Há três fenótipos típicos

estabelecidos de células T que expressam Foxp3, sendo:

CD45RA+FoxP3low inativo Tregs (r-Tregs), CD45RA−FoxP3highativo Tregs (a-Tregs)

e CD45RA−FoxP3low T cells não supressoras (non-Tregs). A análise de 20 pacientes

DM1 do tipo A, 15 pacientes com DM1 fulminante, 20 pacientes DM2 e 30

indivíduos saudáveis para controle objetivou estabelecer o papel supressor da

10

função dos a-Tregs com a finalidade de avaliar a sua habilidade de suprimir a

proliferação da resposta celular. Por citrometria de fluxo do sangue periférico foi

possível demonstrar que a frequência de a-Tregs foi significantemente maior nos

DM1 do tipo A do que no grupo controle, além de não apresentar significativo

aumento dos a-Tregs nos pacientes com DM1 fulminante. Além disto, a proporção

de Tregs entre as células CD4+FoxP3+ T foi significativamente maior em pacientes

com diabetes 1A que apresentavam peptídeo C detectável em comparação com

os que não os apresentavam e com naqueles com DM1 fulminante [16]. A tabela 1

traz informações sobre os pacientes estudados:

Tabela 1: Demografia dos pacientes [16]

n

Gênero (M/F)

Idade (anos) GAD/IA-2 anticorpo positivo (%) HbA1c (%) Duração (anos)

Diabetes Tipo 1A 20 5/15 48,6 ± 15,6 100/50 (n=8) 8,15 ± 1,55 11,5 (1,3-38,0)

Diabetes Tipo 1 fulminante 15 8/7 49,7 ± 16,0 7/0 7,84 ± 1,43 3,7 (0,0 - 9,6)

Diabetes Tipo 2 20 8/12 49,6 ± 9,6 0/n.d. 8,07 ± 1,43 n.d.

Grupo controle (indivíduos saudáveis) 30 10/20 49,5 ± 11,8 n.d./n.d. n.d.

M/F: masculino/feminino ; n.d: não determinado; GAD: ácido glutâmico descarboxilase

A identificação da função exata dos Tregs nos pacientes com diabetes tipo

1, pode ser realizada analisando-se a proporção das 3 subpopulações de células

T que expressam Foxp3 (CD4+FoxP3+) como mostrado na Figura 1.

11

Figura 1. Análise de citometria de fluxo das células T regulatórias (Tregs) de

sangue periférico fresco. Os gráficos representativos de uma amostra de um grupo

controle saudável de os linfócitos T CD4+ (a) mostrando o isotipo controle (b) ou

CD45RA coloração intracelular para forkhead box protein 3 (Foxp3) (c) ou Foxp3

(d) ou CD25 e Foxp3 (e) ou CD25 (f) ou CD45RA e CD25 (g). Histogramas

mostram a expressão de cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) (h) e C-C

chemokine receptor type 4 (CCR4) (i) por cada fração definida em (c); na parte de

baixo; (a-Treg, r-Treg e não-Treg) do controle de sujeitos saudáveis [16].

12

Na Figura 2 mostra-se os gráficos das proporções de Tregs ativados (a-

Tregs), Tregs inativos (r-Tregs) e os não Tregs (non – Tregs) dentre as células T

(CD4+FoxP3+) do sangue dos pacientes

estudados.

Figura 2: Proporção de células T regulatórias ativadas (a-Treg) Tregs, Tregs

inativas (r-Tregs) e não-Tregs (non-Tregs) entre as células T CD4+FoxP3+. (a)

Gráfico de pizza apresentando as proporções de a-Tregs, r-Tregs e non-Tregs

13

dentre as células T CD4+FoxP3+ forkhead box protein 3 (Foxp3)+ do grupo

controle (HC) (n=30), pacientes com diabetes tipo 1A (T1AD) (n=20), pacientes

com diabetes tipo 1 fulminante (FT1D) (n=15) e pacientes com T2D (n=20). (b) O

gráfico apresenta as proporções de a-Tregs entre as células T CD4+FoxP3+

quando foram divididas em 20 pacientes com T1AD em 2 grupos (níveis de

peptídeo C < 0·01 ng/dl; T1AD sem secreção de insulina residual, n=8 e ≥0·01

ng/dl; T1AD com capacidade de secreção de insulina, n=12). *P < 0,05; **P <

0,001; ***P < 0,0001. As barras representam a média ± do erro padrão [16].

Como mostrado na Figura 2 há uma maior proporção de a-Tregs em

pacientes diabéticos do tipo 1A ainda com secreção residual de insulina, podendo-

se concluir que esses Tregs estão em estado de anergia e que a secreção

residual de insulina indica que debris de células β pancreáticas funcionam como

auto-antígenos, aumentando o potencial de auto-destruição dessas células pelo

sistema imune.

Como a expressão do fator de transcrição Foxp3 afeta o desenvolvimento

de auto-tolerância e está intrinsecamente ligado à DM1, tem-se a demonstração

de que o CD4+CD25+ Treg expressando o fator de transcrição Foxp3 é

indispensável na manutenção da homeostasia imunológica pela regulação de

processos inflamatórios e prevenção de destruição autoimune. Isto foi

demonstrado pela ablação de Tregs em ratos NOD ainda não sintomáticos para o

diabetes, o que gerou em pouco tempo os sintomas de diabetes de forma bem

evidente [17][18].

A importante função do Foxp3+ Treg como uma ferramenta protetora contra

diabetes autoimune é bem definida quando há a deficiência de Foxp3 por deleção

gênica, ou espontaneamente, em ratos. Nesses casos, após 3-4 semanas de

idade, o animal morre de síndrome autoimune de múltiplos órgãos. Em humanos,

a deficiência de ação de Tregs devido à mutação no gene Foxp3 se manifesta na

síndrome IPEX, ligada ao cromossomo X (desregulação Imune,

Poliendocrinopatia, Enteropatia ligada ao X), sendo o DM1 a principal doença que

acomete os indivíduos com essa síndrome [17][19].

14

A interleucina-2 (IL-2) é uma citocina com um papel crucial na homeostasia

e função das células T regulatórias que expressam foxp3. Qualquer desregulação

em sua síntese é associada com um distúrbio funcional das células Tregs e,

portanto, ocasiona falhas no seu papel de desenvolvimento de tolerância

imunológica, o que pode vir a levar ao diabetes tipo I [20][21]. Tratamento com IL-

2 para supressão do ataque autoimune na diabetes já vem sendo testado, porém

a eficácia do tratamento está atrelada à especificidade da interleucina para com as

células Tregs. Como não há acurácia na seletividade da interleucina para com as

Tregs quando não usada localmente, há o risco de toxicidade sistêmica devido

aos efeitos colaterais dessa terapia. Para obter a seletividade desejada os

pesquisadores desenvolveram um adenovírus (AAV) como vetor de expressão

para a IL-2 específico para as células β pancreáticas, resultando na síntese de IL-

2 por essas células. Essa síntese local de IL-2 resultou, em camundongos NOD,

em um aumento local da quantidade de Tregs que expressam Foxp3 [22].

Figura 3: Expressão de Il-2 em células β in vivo após injeção de dsAAV8mIP-IL2.

Níveis de IL-2 em sobrenadantes de ilhotas isoladas de camundongos NOD

tratados com dsAAV8mIP-IL2 ou não tratados. **P < 0,01, ***P < 0,001, ANOVA ±

SEM [22].

15

Observa-se na figura 3 que os camundongos NOD tratados com o

adenovírus específico para células β pancreáticas tiveram a concentração de IL-2

aumentada significativamente em um extrato de células pancreáticas. Dessa

forma, demonstra-se que a utilização do vetor viral para síntese da interleucina

pelas células β pancreáticas foi um sucesso [22].

*PLN – Pancreatic Limph Node

Figura 4: A frequência e o número de Tregs Foxp3+ nas ilhotas são maiores

após um curto período de tratamento com dsAAV8mIP-IL2. Células T CD3+CD4+

foram bloqueadas e a frequência de células T Foxp3+CD25+CD4+ nos linfonodos

pancreático (PLN) e nas ilhotas dos grupo de 6-10 camundongos fêmeas NOD

após 4 semanas de tratamento com dsAAV8mIP-IL2, dsAAV8mIP-EGFP ou sem

tratamento (untreated). *P < 0.05, **P < 10−2, ***P < 10−3, duas vias ANOVA ±

SEM. [22].

Com esses dados demonstrou-se que a influencia da síntese local de IL-2

não afetou as células que não são células T (como NK, por exemplo), mas afetou

positivamente o bloqueio na destruição de células β pancreáticas, o que pode ser

usado, de forma bem sucedida, em paciente com DM1 recém-descoberta [22].

16

4.2. Papel dos linfócitos B no desenvolvimento da diabetes tipo I e suas

possíveis intervenções imunoterapêuticas

Normalmente, têm-se as células dendríticas como as mais relevantes

apresentadoras de antígenos para as células T linfocitárias (CTLs). Porém, os

linfócitos (ou células) B também podem exercer esse papel de apresentação de

antígenos às CTLs, que, sob condições de repouso, resultam na tolerância de

CTLs [23]. No entanto, em condições de inflamação ocorre a ativação de CTLs.

Esse é um ponto importante para explicar o porquê dos camundongos NOD

apresentarem uma enorme quantidade de linfócitos B exibindo um fenótipo

positivo para a apresentação de antígenos [24].

Linfócitos B em estado de repouso não conseguem ativar linfócitos T naive

pois alguns sinais coestimulatórios são necessários para essa ativação, e esses

sinais não se encontram nesses linfócitos B. Entretanto, quando linfócitos B

recebem antígenos-específicos apropriados via linfócitos T helper por meio de

ligação CD40-CD40L, ocorre interação entre as células e sinais como citocinas

(principalmente IL-4 e Il-5) ativam o linfócito B. Linfócitos B ativados expressam

sinais coestimulatórios e podem internalizar seus antígenos-específicos muito

mais eficientemente do que as células apresentadoras de antígenos (APC) não

antígeno-específicas como por exemplo as células dendríticas e os macrófagos

[25].

As células B apresentadoras de antígenos via MHC classe I complexam-se

com células T CD8+ auto-reativas. Essa apresentação de antígenos de ilhotas

pancreáticas pelas células B às células T CD8 (citotóxicas) resulta em ataque e

morte de células β pancreáticas. Demonstra-se assim, que as células B são

responsáveis pelo aparecimento do diabetes, que pode ser caracterizado, por

exemplo, pelo agravamento de uma insulite, por meio de uma expansão clonal e

desenvolvimento de linfócitos T citotóxicos (CTL), levando ao desenvolvimento do

diabetes. Esses dados foram corroborados quando se observou que a seletiva

perda de células B MHC classe I resultou na falha de expansão dos linfócitos T

citotóxicos e na proteção contra o desenvolvimento do diabetes [24], sendo assim

17

uma possível forma de bloqueio do avanço do diabetes em pacientes. Há, no

entanto, a necessidade de se averiguar os danos que essa potencial estratégia

terapêutica poderá trazer aos indivíduos tratados.

As células B apresentadoras de antígenos e as células dendríticas

apresentam papéis semelhantes, porém em diferentes etapas do desenvolvimento

do diabetes [24]. As primeiras (células B) funcionam como uma força motriz para o

diabetes por meio da ativação de CTLs, sendo a sua função mais proeminente

após o inicio da insulite. No entanto, as células dendríticas são as principais

contribuintes para os estágios iniciais de ativação de CTL, o que desencadeia a

insulite no paciente. Observa-se então que em diferentes etapas da doença

estratégias imunoterápicas distintas devem ser adotadas, seja para o bloqueio da

apresentação de antígenos pelas células dendríticas – fase inicial ou para o

bloqueio da apresentação de antígenos por linfócitos B – fase tardia/pós-insulite.

Além do papel de apresentador de antígenos das células B, outra função

importante dessas células no desenvolvimento do DM1 é a produção de diversas

citocinas. Por análise comparativa da produção de citocinas em pacientes

diabéticos com os não diabéticos, encontra-se uma elevada produção de IL-8

(citocina pró-inflamatória) e elevada expressão de receptores Toll-like (TLR) na

superfície das células B (mensurada por citometria de fluxo) nos pacientes

diabéticos [26]. Em contrapartida, a síntese de citocinas anti-inflamatórias, como a

IL-10, foi menor nos pacientes diabéticos [26]. A elevada expressão de TLR nas

células B mede o grau de ativação dessas células nos indivíduos. Logo, é possível

constatar que há uma maior atividade de linfócitos B em indivíduos diabéticos em

concomitância com o aumento na produção de citocinas inflamatórias, sugerindo

uma possível abordagem imunoterápica de indução de produção de IL-10,

bloqueio da síntese de IL-8 e desativação celular de linfócitos B nos pacientes

diabéticos, a fim de reverter o quadro de inflamação das ilhotas.

Outra forma de verificação de que os linfócitos B desempenham um papel

fundamental no desenvolvimento do DM1 é obtida quando foi verificado o sucesso

da terapia com anti-CD20 (rituximab) [27][28][29], que retardou o desenvolvimento

do DM1 em camundongos NOD [30].

18

A ideia de depleção total de linfócitos B antes da insulite constatada [31], ou

seja, depleção dessas células logo no primeiro sinal de aumento da glicemia (sinal

da diabetes), é muito testada em camundongos NOD. O problema dessa técnica é

o comprometimento imune dos indivíduos, o que inviabiliza o seu uso na prática

clínica. Porém, a eficácia do tratamento com relação ao não desenvolvimento da

DM1 é indubitável [30].

4.3. Outras abordagens para imunomodulação do diabetes tipo I

Os estudos desenvolvidos até hoje para conter o avanço do DM1 são

focados em intervenções para modular o sistema imune, como: plasmaferese,

modulação das citocinas e anticorpos.

Os estudos de intervenção ocorrem em 3 diferentes estágios da DM1 [32]:

1º) Prevenção nos indivíduos que estão sob risco para o desenvolvimento

de DM1, com o objetivo de modular a autoimunidade para que a doença não se

manifeste.

2º) Indivíduos que já apresentam autoanticorpos sinalizando o início do

processo autoimune. Nesse estágio se objetiva a prevenção do início dos

sintomas da doença. Logo, há um enfoque nos indivíduos em risco de desenvolver

DM1 pelos seguintes critérios: parentes próximos que desenvolveram a doença,

marcadores genéticos, controle anormal da glicemia (mas ainda não sintomático

para o DM1).

3º) Pacientes que já apresentam o quadro clínico de DM1, mas que ainda

apresentam um residual de células β pancreáticas funcionais. Caso haja uma

inibição do processo de destruição autoimune, tem-se uma chance de

regeneração de células β pancreáticas.

19

Tratamento Imunosupressor

Dentre os imunossupressores, os glicocorticoides são os mais utilizados no

tratamento de DM1. O efeito anti-inflamatório acontece de diferentes maneiras,

mas a principal é a inibição da ativação de granulócitos e linfócitos. O problema do

uso dessa terapia são os efeitos colaterais quando são utilizados a longo prazo

(incluem: dislipidemia, ganho de peso e até diabetes induzida por uso de

esteroides). A combinação de glicocorticoides para o tratamento de DM1 é

diversa, havendo estudos clínicos de uso associado com azatioprina, por exemplo,

o que induziu a uma melhora da funcionalidade das células beta pancreáticas [32]

[33].

A ciclosporina, em conjunto com tacrolimus, também foi utilizada em testes

clínicos para reduzir a secreção de IL-2 inibida por calcineurina. Porém, os efeitos

positivos não são duradouros e há riscos de potenciais danos aos rins, fígado e no

sistema nervoso [32][34][35].

Modulação do Sistema Imune

Na década de 80, a plasmaferese foi usada para manter o funcionamento

das células β pancreáticas em pacientes com DM1. Porém, recentemente, tem-se

mostrado uma maneira ineficiente de tratamento, assim como ocorreu com a

infusão intravenosa de imunoglobulinas, que a princípio foi interessante, mas

devido aos efeitos colaterais, se tornou obsoleta [32][36].

Mais recentemente, o foco de tratamento tem sido a administração de

citocinas da resposta T helper 2 (IL-4, IL-10, IL-13, IFN-α) e a inativação de

citocinas da resposta T helper 1( IL-2, IFN-γ) [32][37].

Em dois estudos clínicos, Deutsche Nicotinamide Intervention Study

(DENIS) [38] e European Nicotinamide Diabetes Intervention Trial (ENDIT) [39], a

iintervenção com nicotinamida foi utilizada para o tratamento de pacientes com

DM1, pois essa substância pode proteger as células da destruição mediada por IL-

1, além de diminuir a expressão do MHC–II. Em ambos os estudos citados, os

20

resultados concretos a respeito do tratamento com a nicotinamida não foram

satisfatórios.

Tratamento com anticorpos monoclonais

O uso de anti-CD3 para o tratamento de DM1, no intuito de diminuir o

número de células T ativadas, resultou em redução na administração de insulina e

do declínio nos níveis de peptídeo C [40][41]. O ensaio clínico com o anticorpo

anti-CD3 humanizado, otelixizumab, apresentou melhora no funcionamento das

células β pancreáticas com efeitos colaterais consideravelmente pequenos

(sintomas equivalentes ao de um resfriado comum) [32][42][43][44].

O anti-CD20, rituximab, usado para o tratamento de linfomas de células B,

foi utilizado para o tratamento de DM1 com o intuito de reduzir a produção de

anticorpos que atacam as células das ilhotas. O estudo foi conduzido em 87

pacientes recém-diagnosticados e, após um ano, os pacientes apresentaram

melhora significativa da doença com relação à redução dos níveis de hemoglobina

glicada e aumento expressivo dos valores de peptídeos C [28][32].

Tratamento baseado em antígenos: Estudos clínicos baseados em

reestabelecer a auto-tolerância antígeno específico.

A autoimunidade pode se desenvolver contra diversos autoantígenos. Ela

se desenvolve quando os autoantígenos não são corretamente apresentados no

timo no momento da maturação das células T. O sistema imune pode também ser

sensibilizado por mimetismo molecular, sendo essa uma das explicações da

patogênese da DM1, que pode ser explicada pela hipótese da infecção, assim

como a sua relação com a elevada incidência de casos na primavera e no outono.

A apresentação de autoantígenos às células T, sem coestimulação, pode

levar à inativação de células T autoreativas, o que pode ser utilizável na

prevenção de reações autoimunes. Outros antígenos podem apresentar

mimetismo molecular com as proteínas de membrana das células β pancreáticas

21

(heat shock proteins (HPS), insulina e GAD65), como proteína do leite e albumina

bovina [32][34]. Logo, uma das formas de se evitar o desenvolvimento de DM1

seria evitar a ingestão de leite, por exemplo. Outros estudos mostram que o uso

de anticorpos anti GAD65 e HPS65 foram utilizados para diminuir a destruição de

células beta pancreáticas [45][46].

A própria administração parenteral e oral de insulina preveniu o

desenvolvimento de diabetes em camundongos NOD. Um dos principais epítopos

de insulina está na cadeia B, entre os amino ácidos 9 e 23. Com apenas esse

oligopeptídeo pôde-se prevenir o aparecimento de diabetes nesses camundongos

[47]. Porém, quando esse tratamento foi aplicado em humanos, em um grande

estudo clínico (The Diabetes Prevention Trial, DPT), que foi iniciado em 1993 com

103.391 participantes, resultou em dados que não estabeleceram uma relação de

prevenção do aparecimento de DM1 em pacientes com risco para a doença [32].

Já em fase clínica, o tratamento utilizando a cadeia B da molécula da

insulina e adjuvante de Freund incompleto, baseia-se na hipótese de que a

administração intramuscular de um autoantígeno em combinação com o adjuvante

iria reestabelecer a tolerância no sistema imune em pacientes com DM1. A

formulação continha 2 mg de cadeia B da insulina com o adjuvante de Freund

incompleto em uma emulsão. Contando com 12 pacientes com DM1

diagnosticados há 3 meses, entre 18 e 35 anos e com teste positivo para auto-

anticorpos para o diabetes (estágio I), o estudo conduzido na clínica Joslin

Diabetes, Boston, EUA acompanhou os pacientes por 104 semanas. Concluiu-se

que os pacientes que receberam essa formulação tiveram mudanças imunológicas

positivas em relação ao DM1 e com ótimos resultados de eficácia. A resposta das

células T aumentou significativamente para a cadeia B da insulina no início, porém

houve um declínio dessa resposta nos 2 anos seguintes ao tratamento. Houve,

também, um excesso de síntese de fator beta de transformação do crescimento

(TGF-β), o qual é uma potente citocina reguladora. O desenvolvimento de células

T reguladoras específicas para insulina e que secretam grandes quantidades de

22

IL-10 e TGF-β, também foi ressaltado como um dado interessante no estudo. Há

grandes expectativas com relação ao uso dessa vacina em pacientes com DM1,

mas ainda se aguarda os resultados dos estudos clínicos em andamento [32][48].

Há ainda a preocupação de que diversas estratégias que são bem

sucedidas em camundongos NOD podem fracassar quando aplicadas em

humanos. Portanto, é possível constatar que a patogênese da DM1 em

camundongos é diferente da doença em humanos. Em camundongos, o fator

genético é muito mais determinante do que em humanos, assim como é a

inflamação das ilhotas, que é muito mais profunda nos murinos. Adicionalmente,

faz-se a ressalva com relação ao uso de modelos com outros animais, como

cachorros e macacos, que são limitados por razões éticas e financeiras [32].

Dentre os estudos de intervenção e prevenção, os mais promissores são os

baseados em reestabelecer a tolerância imune para os autoantígenos específicos

do DM1, porém a identificação dos autoantígenos ainda é questionável [32].

Outra estratégia interessante para o tratamento do DM1 é a combinação o

de terapias, como por exemplo, a supressão imunológica para reduzir a

autoagressão das células T às células beta das ilhotas, acompanhado de uma

terapia baseada em antígenos para aumentar a população das células T

regulatórias antígeno específicas [32][48].

Anticorpos anti-CD3 específicos não ligantes de Fc, são benéficos no

tratamento de diabetes, pois conseguem reverter a doença e ainda garantem

longo tempo de remissão. Porém, o uso desses anticorpos é questionável, pois

não se conhece completamente o mecanismo de ação. Apenas sabe-se que os

anticorpos agem modulando o complexo receptor CD3 das células T, induzindo

apoptose de células T ativas e anergia. Além disso, eles induzem a geração de

Tregs mediada por TGF-Beta, que são essenciais para a manutenção da

tolerância periférica e prevenção de doenças autoimunes [49][50][51].

Observou-se que o uso de anticorpos anti-CD3 em ratos NOD resultou em

prevenção de perda de produção de insulina no primeiro ano após o diagnóstico

de DM1, porém a eficácia a longo prazo foi limitada a poucos indivíduos. Logo,

surgiu a hipótese do uso de uma combinação de anti-CD3 com outro tratamento

23

tolerogênico. Como já existem estudos com rapamicina (um inibidor não

calcineurina dependente, que ativa e expande CD4+ CD25+ FOXP3+ Tregs e

CD4+CD25+FOXP3+ Tregs) sendo usada como monoterapia para pacientes com

DM1, utilizou-se esse medicamento em combinação com anticorpos anti-CD3. No

entanto, a rapamicina atua de forma contrária à esperada, pois acaba por bloquear

a ação dos anticorpos anti-CD3 além de reverter o efeito curativo já obtido pelo

uso da substância em monoterapia no DM1. Logo, constata-se que a combinação

de anticorpos anti-CD3 com rapamicina tem de ser rejeitada, além de levantar

suspeitas sobre qualquer outra combinação de anti-CD3 com outros

imunossupressores [51][52][53][54].

O DM1 é uma doença que provavelmente é iniciada por fatores ambientais,

assim como há uma predisposição genética dos indivíduos. Tomando-se como

base a fisiopatologia do DM1, é possível inferir algumas abordagens e

intervenções no processo imunopatológico que são possíveis de serem

explorados como imunoterapias.

Reiterando a função das células B no desenvolvimento do DM1, temos

como papéis principais as funções de apresentação de antígenos, expansão

clonal e diversificação das células T e síntese de citocinas pró-inflamatórias. A

importância das células B ao infundir anti-CD20 em indivíduos recém-

diagnosticados com DM1, ocasionou a depleção de linfócitos B, preservando as

funções das células das ilhotas pancreáticas (células β) por um ano sem sérios

efeitos colaterais [3]. Adicionalmente, a depleção de células B (com anti-

CD22/inotuzumab) em combinação com antígeno 4 de células T citotóxicas

(CTL4)-Ig prolongou a sobrevivência de células pancreáticas in vitro [55],

demonstrando o potencial de combinação de imunoterapias para o tratamento da

doença.[3]

Assim como as células B, as células T também tem papel decisivo no DM1,

isso se demonstra claramente quando crianças com sintomas iniciais de DM1

foram tratadas com imunossupressores de células T como a ciclosporina, o que

induziu um estado de remissão na DM1 dessas crianças [3].

24

Da mesma forma, estudos clínicos têm demonstrado que o tratamento com

anticorpos monoclonais humanos anti-CD3 (como teplizumab e otelixizumab)

objetivando alcançar a imunotolerância por meio de inativação das células T

patogênicas, têm alta probabilidade de ser eficaz. Os estudos utilizando

teplizumab e otelixizumab são Protégé Study [56] e o DEFEND study (Durable-

Response Therapy Evaluation For Early or New-Onset Type 1 Diabetes) [57],

respectivamente, não alcançaram os resultados esperados na preservação da

função das células B por um ano, aproximadamente, porém os financiadores dos

estudos prometem continuar as pesquisas com as respectivas substâncias [3].

Ainda sobre as células T, há uma relação entre os linfócitos T helper, em

que o Th1 está mais ligado à progressão do diabetes e o Th2 mais ligado às

respostas contra os diversos antígenos ligados à doença, sendo, portanto, um

supressor da DM1. Portanto, uma mudança de polarização de Th1 para Th2 na

diferenciação de linfócitos pode ser uma forma de proteção contra a progressão

do DM1, sendo o uso de citocinas específicas para a diferenciação de cada

subtipo uma etapa primordial nesse processo. Em contraposição a esse tipo de

tratamento, sugere-se que essa mudança entre Th1 e Th2 seria um efeito

secundário na supressão da doença e não o verdadeiro causador da supressão

[3].

Como já discutido em outros tópicos desse trabalho, o papel da

diferenciação de células T CD4+ em células T regulatórias é primordial para barrar

o avanço do diabetes. Em ambientes com presença de TGF-β, tem-se a

diferenciação de células T em Tregs Foxp3+ (forkhead box protein 3). A

importância das Tregs Foxp3+ demonstra-se válida quando temos o knock-out

gênico para essa diferenciação em camundongos, o que leva ao desenvolvimento

de patologias autoimunes fatais [3]. Outra estratégia proposta é usar células Treg

como imunossupressor na DM1 [3]. No entanto, esses estudos precisam ser

realizados com cuidados especiais quando em associações. Por exemplo, como já

comentado, o estudo que combinou rapamicina e IL-2 foi um fracasso, pois

resultou em destruição das células B pancreáticas, mesmo com o aumento

substancial de Tregs [51][58].

25

A significância das células T diferenciadas em T helper 17 foi também

relacionada às disfunções imunológicas, mesmo que não tenham sido

relacionadas ao DM1. O bloqueio de IL-17 com o intuito de barrar o

desenvolvimento de células Th17 não preveniu o desenvolvimento de DM1, porém

a transferência de células Th17 para camundongos NOD induziu insulite, mesmo

não levando ao desenvolvimento de DM1. Pode-se, portanto, relacionar essas

células a processos autoimunes mesmo não sendo essenciais para o

desenvolvimento de DM1 [3][59][60].

O uso de anticorpos anti-CD4+ e anti-CD8+ resultou na inibição da DM1,

demonstrando a importância dos linfócitos T no desenvolvimento da doença. Foi

encontrado também que no início do DM1 há alta concentração de células T CD8+

nas ilhotas, mas que desaparecem em estágios mais avançados da doença [3].

Portanto, a ablação de células T CD8+ no início do DM1 é uma estratégia

coerente de imunoterapia, sendo o uso de um complexo de toxina tetramérica

acoplada ao MHC-I uma forma de destruição dessas células no início do

desenvolvimento da doença cuja eficácia foi demonstrada em camundongos NOD

[3].

Há também a perspectiva do uso de células do sistema imune inato

isoladas do baço como estratégias para inibir o DM1. Essas células são os

macrófagos, as células dendríticas e as células Natural Killer (NK). Tem sido

observado que estas células tem participação direta no desenvolvimento do DM1,

também se propôs que a inativação das mesmas poderia se contituir em uma

estratégia para o tratamento da doença [3].

As células NK foram detectadas nas ilhotas antes da chegada de células T,

o que ocasiona o início da inflamação contribuindo para os danos nas células β

pancreáticas. Porém após o início da doença tem-se uma diminuição drástica da

atividade das células NK nas ilhotas. Além disso, as células NK se mostram

protetoras das células β pancreáticas, pois interagem com células dendríticas e

regulam o sistema imune adaptativo, aumentando a tolerância das células T. Esse

comportamento atípico das células NK pode ser interessante para o controle da

DM1. Adicionalmente, há uma maior quantidade de células NK circulantes nos

26

pacientes com DM1, além da concomitante secreção elevada de IL-4 por essas

células, o que lhes conferem um perfil de mudança de classe de células T para

Th2, contribuindo para a proteção autoimune. Portanto, é interessante a atuação

das células NK após o início da DM1, pois sugere-se que elas tenham papel

imunossupressor [3].

Os monócitos e macrófagos podem destruir as células β pancreáticas. Essa

destruição por monócitos ocorre antes mesmo da maturação de células B e T. A

secreção de IL-1β- e IL-6 por monócitos além de aumentar o grau de inflamação

do tecido, também estimula a expansão clonal de Th17, o que agrava o ataque às

células das ilhotas [3][61].

In-vitro, as células dendríticas têm alto potencial de uso na imunoterapia

contra o DM1, pois essas células, quando semi-maduras, expressam MHC-II e

moléculas co-estimuladoras como CD80/86 em alta quantidade, além de secretar

baixa quantidade de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α) [3].

Portanto, as células dendríticas agem como indutoras de tolerância, pois

secretam grande quantidade de IL-10, o que estimula a geração de células T

regulatórias. O uso das células dendríticas, como imunoreguladoras, também é

atribuído ao fato de induzirem, por meio de citocinas, a mudança de classe para

células Th2. Os mecanismos para geração de células dendríticas tolerogênicas

são diversos, e se concentram no uso de fármacos como eicosanoides/lipídios,

fatores de crescimento, corticosteroides, citocinas, entre outros.

Os estudos clínicos já realizados, ou em andamento, utilizando estratégias

imunoterapêuticas estão indicados nas tabelas 2 e 3.

Tabela 2: Estudos clínicos utilizando estratégias que empregam células do

sistema imune como alvos para o tratamento do DM1 [3].

Intervenção Tipo de Estudo Resultados Referências

Células imunológicos como alvos específicos

27

Estudo Protégé (anti-CD3 mAb (teplizumab)

Fase III Falhou ao cumprir os primeiros resultados

[56]

AbATE - Dose repetida anti-CD3 mAb (teplizumab)

Fase III Aumento da resposta peptídeo C em 2 anos

[62]

Anti-CD3 mAb (otelixizumab) Fase III Falhou ao cumprir os primeiros resultados

[57]

Globulina anti-timócito Fase II Em andamento [63]

Anti-CD20 mAb (rituximab) Fase II Preservou a resposta

peptídeo C; eventos adversos moderados

[28]

Transplante

Enxerto pancreático vascularizado + rim Prática clínica Normoglicemia; Diminui

mortalidade/morbilidade; imunossupressão

[64]

Apenas enxerto pancreático vascularizado

Prática clínica

Independência de insulina em 60% dos pacientes; diminui sobrevivência;

aumenta complicações; imunossupressão

[65]

Ilhotas Vários estudos em centros específicos

Imunossupressão; independência de insulina

em 60% dos pacientes [66]

Células imunológicas

Células dendríticas autólogas anti-senso oligo-modificadas

Fase I Seguro [67]

Ex-vivo células T regulatórias expandidas Fase I Recrutamento [68]

Tratamento com células tronco autólogas

Transplante de células tronco hematopoiéticas não mieloablativas

Fase I/II Preservou a resposta

peptídeo C [69]

Infusão do cordão umbilical Fase I Falhou ao preservar resposta

de peptídeo C [70]

Linfócitos condicionados por células derivadas do sangue do cordão umbilical

Fase I/II

Preservou a resposta peptídeo C; diminuiu insulina exógena; aumentou células T

regulatórias periféricas

[71]

Ex-vivo células tronco mensenquimais (Prochymal ®)

Fase II Em andamento [72]

Combinações

Globulina anti-timócitos + GCSF Fase I/II Recrutamento [73]

Células tronco hematopoiéticas + GCSF Fase I/II Recrutamento [74]

GCSF: fator estimulador de colônias de granulócitos; mAb: Anticorpo monoclonal; AbATE: Autoimmunity-Blocking Antibody for Tolerance in Recently Diagnosed Type 1 Diabetes study

28

Tabela 3: Estudos clínicos recentes

Nome do Estudo Estágio do Estudo Detalhes Referências

Papel das citocinas do T helper 1 no DM1 Finalizado

Foi relacionado os papéis de citocinas próinflamatórias no

ataque às células pancreáticas

[75]

Proliferação celular e biomarcadores humorais no DM1 (Lymphoscreen)

Finalizado Novos linfócitos T CD+

relacionados na fisiopatologia do DM1

[76]

Anti-CD3 MAb (teplizumab) para a prevenção do diabetes - sujeitos em alto

risco de desenvolvimento da doença

Fase II Em recrutamento [77]

SIMPONI® - Sequestramento de linfócitos

B em pacientes DM1

Fase II Em recrutamento [78]

Segurança e eficácia de células dendríticas imunoregulatórias autólogas

em pacientes DM1

Fase II Em recrutamento [79]

Monoterapia com rapamicina em pacientes com DM1 (MONORAPA)

Fase II Em recrutamento [80]

Preservação da função de células B com tocilizumab em pacientes recém

diagnosticados com DM1 (EXTEND) Fase II Em recrutamento [81]

Imunoterapia por adoção de Treg policlonais CD4+CD127-CD25+ com

interleucina-2 para o tratamento do DM1 Fase I Em recrutamento [82]

Ao analisar os estudos clínicos finalizados ou em andamento (Tabela 2),

excluindo-se os que englobam a terapia celular por meio de enxertos (transplantes

de órgãos), pode-se discerni-los em dois grupos: os que falharam (I) e os

promissores (II).

29

(I) Estudos com resultados negativos

Estudos com pequeno número de pacientes têm mostrado que tratamentos

com anticorpos monoclonais anti-CD3, por um período curto, resultam na

preservação da função das células β pancreáticas, diminuindo assim a

necessidade de injeções de insulina nos pacientes recentemente diagnosticados

com diabetes tipo 1. Porém, o medicamento teplizumab (anti-CD3) quando em

fase III do estudo clínico Protégé falhou ao cumprir os primeiros resultados, pois

não houve nenhum achado significante de diferença no tratamento dos grupos

primário e secundário quando comparados com o grupo placebo [56]. Sendo o

grupo primário, o composto por pacientes em uso de doses de insulina menores

que 0,5 U/kg por dia e hemoglobina glicada A1c (HbA1C) menor do que 6,5%, e o

grupo secundário, formado por pacientes em uso de quantidades de insulina

menores que 0,5 U/kg por dia e HbA1C menor que 7% [56]. Os parâmetros para a

condução do estudo (grupos primário e secundário), foram escolhidos baseados

em outro estudo do teplizumab [83] que se diferenciava em alguns aspectos do

estudo Protégé [56], como por exemplo, a idade da população do estudo (média

de 19 anos no Protégé vs 14 anos), assim como a etnia (Protegé englobava

populações dos Estados Unidos, índia, Israel e Europa vs Estados Unidos

apenas).

A dose do medicamento deveria ter sido aumentada para a obtenção de

resultados mais nítidos, assim como comprovado em outro estudo com anticorpos

anti-CD3 [83]. Outro achado que influenciou o resultado do estudo Protégé é que,

em média, os pacientes nos EUA apresentavam concentrações séricas mais

elevadas de peptídeo C, faziam menor uso de insulina e tinham níveis menores de

HbA1c, quando comparados com pacientes de outras regiões.

O estudo em fase III DEFEND-1 [57], planejado como um estudo

randomizado, placebo-controlado com 272 pacientes entre 12 e 45 anos com DM1

recém-diagnosticado foi conduzido na Europa e nos Estados Unidos. Nesse

estudo, realizou-se a administração de otelixizumab (anticorpo monoclonal anti-

30

CD3) (3,1 mg) em pacientes com não mais do que 90 dias de diagnóstico de DM1

e com secreção de insulina ainda preservada. Observou-se que a substância tem

alto potencial de aplicabilidade no tratamento do DM1 e que, provavelmente, o

estudo foi planejado com uma dose não conveniente para o tratamento dos

pacientes, o que explicaria a razão dos resultados negativos encontrados. Nesse

estudo, não houve diferença significativa entre os grupos em tratamento com o

anticorpo e o grupo placebo, não cumprindo os primeiros resultados esperados

[57].

O estudo clínico Transfusion of Autologous Umbilical Cord Blood to Reverse

Hyperglycemia in Children With Type 1 Diabetes - A Pilot Study [70] em fase I,

com um total de 24 pacientes com DM1 (com idade média igual a 5 anos de

idade), utilizou uma única infusão intravenosa de sangue autólogo de cordão

umbilical, seguida de testes metabólicos e imunológicos para avaliação da

progressão da doença. Nenhum evento adverso foi relatado e os pacientes

obtiveram um aumento na contagem de células T regulatórias após 6 meses da

infusão e um aumento das células T naive após 9 meses da infusão. No entanto,

houve uma diminuição na curva de peptídeo C, o que significa que o tratamento

não foi eficaz para o DM1 pois a produção de insulina endógena diminuiu após o

tratamento . O resultado não impede o uso de sangue autólogo de cordão

umbilical, pois é considerado seguro em crianças, como demonstrado nesse

estudo, porém os pesquisadores apontam a necessidade de maiores informações

a respeito do papel das células T regulatórias na imunopatologia do DM1, além de

utilização dessa terapia em combinação com outras comprovadamente eficazes.

(II) Estudos com resultados promissores

A administração de globulina anti-timócitos em associação com fator

estimulante de colônias de granulócitos (GCS-F) tem como objetivo primário a

preservação da atividade das células β pancreáticas em um prazo de 12 meses,

sendo essa atividade monitorada pela medição de peptídeo C no soro dos

pacientes. Já os objetivos secundários seriam vários, dentre eles o aumento da

31

porcentagem de células T regulatórias, diminuição da necessidade de insulina

exógena e alteração do padrão de auto-anticorpos. O estudo se iniciou em 2010 e

tem previsão para término em 2018. Dentre os fatores que mais afetam

negativamente estudos como esse, estão os eventos adversos severos, tais como

os episódios de hipoglicemia, que quando em grande freqüência, acabam por

finalizar o estudo antes do término. Nesse estudo não houve episódios de

hipoglicemia severa. Em 2015 foi realizada a coleta de dados para análise parcial

dos objetivos alcançados e constatou-se que houve de fato alteração na

concentração de peptídeo C nos pacientes (de acordo com o objetivo primário do

estudo), assim como se alcançou o esperado para o aumento na quantidade de

células T regulatórias, cumprindo-se com o esperado em relação à baixa

freqüência de eventos adversos severos [84].

Muitos estudos de imunoterapias têm se mostrado efetivos no tratamento

de pacientes com DM1 recém-diagnosticados, porém a variação interindivual das

respostas aos tratamentos é muito variada e a duração dessas respostas é curta.

Limitando a inclusão de pacientes aos dois primeiros anos após a descoberta da

doença, estipulou-se como objetivo primário do estudo [62] a redução do declínio

de peptídeo C utilizando-se o anticorpo teplizumab (anticorpo monoclonal anti-

CD3). Observou-se que de fato houve uma redução no declínio da concentração

de peptídeo C nos pacientes do grupo que utilizou o teplizumab em comparação

com o grupo que recebeu ibuprofeno, difenidramina e acetaminofeno

(paracetamol), além de ser observada uma mudança metabólica nos pacientes

que resultou em baixos níveis de HbA1c [62].

O uso de rituximab para tratamento de pacientes recém-diagnosticados

com DMI apresentou resultados de preservação de secreção de insulina (melhora

nas concentrações de peptídeo C) e diminuição da HbA1c, assim como

demonstrado com o anticorpo monoclonal anti-CD3 [62]. Esses resultados foram

obtidos a partir de uma análise comparativa com um grupo placebo, corroborando

a eficácia do tratamento com rituximab. Há ainda a ressalva de que é necessário

considerar a idade da população de pacientes, a data de diagnóstico do DM1

(tempo da doença) e a etnia dessa população para poder relacionar estudos

32

semelhantes. No caso do DM1, essas variáveis alteram, significantemente, o

resultado dos estudos [28].

O uso de células dendríticas para o tratamento do DM1 nunca havia sido

explorado em estudos clínicos anteriores. O estudo “Autologous Dendritic Cell

Therapy for Type 1 Diabetes Suppression: A Safety Study” é o pioneiro nessa

estratégia e já se encontra na fase I, tendo cumprido o objetivo programado. O

estudo em fase I é duplo cego e conduzido em um total de 10 pacientes entre 18 e

60 anos diagnosticados com DM1, sem qualquer outra enfermidade associada.

Injeções intradermicas de células dendríticas não manipuladas ou geneticamente

modificadas, foram administradas no abdômen dos pacientes uma vez a cada

duas semanas em um total de 3 administrações. O objetivo do estudo era não

obter nenhum evento adverso severo de qualquer natureza, o qual foi atingido em

um período de 12 meses. O resultado terapêutico obtido com as injeções de

células dendríticas foi o aumento na frequência de linfócitos B B220+ CD11c-

periféricos, relacionados na imunopatologia do DM1 e considerados benéficos

para a imunotolerância da doença[67]. Os resultados do estudo indicam que, pela

primeira vez, o uso de células dendríticas autólogas é seguro, tolerável e benéfico

para terapias de intervenção celular em doenças autoimunes, principalmente o

DM1.

(III) Ensaios clínicos recentes

O estudo Papéis das citocinas de células T helper do tipo 1 no diabetes

tipo I , foi financiado pela universidade de Istanbul e se encontra finalizado desde

novembro de 2014. Os mecanismos de destruição de linfócitos β no DM1 são

desconhecidos, porém o estudo se baseia na hipótese de que o interferon gama

(IFN-γ), a interleucina-2 (IL-2) e o fator de necrose tumoral (TNF α) têm papéis

importantes na destruição das células. Um significante aumento na produção de

IFN-γ pelos linfócitos Th1 são determinantes para o início do aparecimentos dos

sintomas do DM1. Os dados encontrados indicam que os mediadores

33

proinflamatórios servem como biomarcadores para o avanço da autoimunidade

[75].

O estudo proliferação celular e biomarcadores humorais no DM1

(Lymphoscreen), foi financiado pela Hospital Escola Nantes e se encontra

finalizado desde Setembro de 2015. O foco do estudo foi o de caracterizar

precisamente os fenótipos, citocinas e funções do linfócito T CD8+ no DM1 com o

intuito de identificar biomarcadores para a doença, pois, eles são utilizados no

diagnóstico, no prognóstico e na exploração de uma estratégia imunoterápica a

partir de suas detecções. Uma das estratégias pensadas é a identificação de

epítopos relevantes de linfócitos CD8 reativos a autoantígenos de células β

(GAD65 e IA-2). Outra estratégia, seria a identificação de padrões patogênicos de

células T CD8+ ou perfis de evolução da ação dessas células na patogênese do

DM1. E, por fim, houve a tentativa de correlacionar as células T autoreativas ou

marcadores humorais para a doença (como os micro RNAs séricos). Os

resultados do estudo foram ocultados, porém há a descoberta de caracterização

de novos linfócitos T CD8+ relacionados com a evolução do DM1, datados de

2012 em uma das atualizações do estudo no NIH [76].

O estudo anti-CD3 MAb (teplizumab) para a prevenção do diabetes em

sujeitos em alto risco de desenvolvimento da doença, está em fase de

recrutamento de participantes para fase II, e teve a sua última atualização em abril

de 2016 no NIH. O estudo objetiva analisar os efeitos da terapia do anticorpo

monoclonal anti-CD3 , teplizumab, no tratamento de indivíduos pré-diabéticos e

em risco de desenvolvimento do DM1. A meta é evitar a hiperglicemia nesses

indivíduos, assim como a descompensação metabólica aguda [77].

O estudo SIMPONI® para sequestramento de linfócitos B em pacientes

DM1, em fase de recrutamento de participantes para a fase II, é financiado pelo

centro de pesquisa e desenvolvimento Janssen (LLC) e teve sua última

atualização em março de 2017. Participantes em utilização de golimumab de

administração subcutânea por 52 semanas intermitentes, terão seus níveis de

peptídeo C analisados como parâmetro de análise de eficácia do tratamento. O

fármaco golimumab é um anticorpo monoclonal humanizado utilizado como

34

imunossupressor e será analisado quanto a sua eficácia no tratamento do DM1

[78].

O estudo randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, segurança e

eficácia de células dendríticas imunoregulatórias autólogas em pacientes DM1, é

financiado pela DiaVacs e teve a sua última atualização no NIH em fevereiro de

2015. Ainda em fase de recrutamento de indivíduos para fase II, o estudo tem

como objetivo primário a utilização de células dendríticas autólogas para aumento

da atividade de células β pancreáticas, sendo o parâmetro farmacocinético de

área sob a curva do peptídeo C o padrão adotado para controle [79].

O estudo Monoterapia com rapamicina em pacientes com DM1

(MONORAPA), está em estágio de recrutamento de participantes para a fase II, e

teve a sua última atualização em junho de 2016. O estudo tem como objetivo

analisar a eficácia de quatro semanas de tratamento com rapamicina com três

meses de vildagliptina em comparação a um grupo placebo. A análise de eficácia

também será baseada na medida da área sob a curva do peptídeo C [80].

O estudo preservação da função de células B com tocilizumab em

pacientes recém diagnosticados com DM1 (EXTEND), financiado pelo insituto de

alergia e doenças infecciosas (NIAID), está em estágio de recrutamento de

participantes para a fase II, e teve a sua última atualização junto ao NIH em março

de 2017, o estudo tem como objetivo a análise do comportamento da área sob a

curva (AUC) do peptídeo C em resposta à administração do imunossupressor

tocilizumab, que é um anticorpo monoclonal humanizado [81].

O estudo, recebido pelo NIH em maio de 2016, a Imunoterapia de Treg

policlonais CD4+CD127-CD25+ com interleucina-2 para o tratamento do DM1, se

encontra em fase recrutamento de participantes para realizar a sua primeira fase

clínica. Financiado pela universidade Yale na Califónia (EUA), tem como o objetivo

primário a analise dos eventos adversos das infusões de Tregs e as reações

sistêmicas da administração de IL-2, assim como analisar o grau de sobrevivência

das células Tregs utilizadas. Como objetivos secundários, se encontram a

diminuição dos níveis Hb1Ac, avaliação das alterações da formação de peptídeo

35

C, assim como a diminuição da utilização de insulina exógena pelos pacientes

[82].

5. CONCLUSÕES

Os estudos sobre imunoterapia do DM1 podem ser diferenciados em três

grandes grupos de estratégias imunoterápicas, a saber: i) modulação das células

T regulatórias que expressam Foxp3 como ferramenta protetora contra o diabetes

tipo I; ii) modulação das células B no desenvolvimento do diabetes tipo I e suas

possíveis intervenções imunoterapêuticas e iii) outras abordagens para

imunomodulação para o tratamento do diabetes tipo I.

Para as futuras estratégias imunoterápicas focadas em células T

regulatórias deve-se priorizar as a-Tregs, além das terapias que atuem no

importante fator de transcrição Foxp3, como, por exemplo, a indução de síntese

de IL-2.

Uma outra possível estratégia imunológica para controle do avanço do

diabetes, a partir do inicio da insulite, seria o bloqueio de apresentação de

antígenos por linfócitos B e atenuação de IL-8 e promoção da síntese de IL-10.

A combinação de duas intervenções imunoterápicas, como por exemplo, o

uso de anticorpos anti-CD3 com rapamicina (substância já usada em diversos

tratamentos) levou a um efeito antagônico ao esperado. A rapamicina não induziu

a melhora tolerogênica esperada nos indivíduos DM1, além de ter bloqueado o

papel inibitório do anti-CD3. Logo, a combinação descrita traz para discussão os

resultados de possíveis futuras combinações na imunoterapia, uma vez que, como

demonstrado, nem sempre o efeito das substâncias é sinérgico, sendo possível

um efeito deletério da interação entre elas dada a complexidade da fisiopatologia

do DM1.

Constatam-se, também, algumas dificuldades encontradas para se

estabelecer estratégias imunoterápicas no DM1, como por exemplo, os modelos

de testes in vivo a serem utilizados. Os testes pré-clínicos são dificultados por não

36

haver um modelo animal fidedigno de estudo, pois o modelo mais utilizado

(camundongos NOD) falha ao tentar reproduzir os efeitos dos tratamentos em

humanos, principalmente pelas diferenças entre as manifestações do DM1 em

camundongos e em humanos, mesmo ambos pertencendo à mesma classe

(mamíferos). Já os modelos animais que seriam mais fidedignos, quando

comparados aos humanos, como aqueles que utilizam primatas, apresentam

barreiras de razões éticas e financeiras que inviabilizam os testes em centros de

pesquisa menos desenvolvidos que não contam com biotérios de primatas.

O tratamento com telipzumab, que preservou a produção endógena de

insulina e reduziu a necessidade do uso de insulina exógena por pacientes recém-

diagnosticados com DM1, tambémalterou positivamente o padrão metabólico dos

pacientes em uso desse anticorpo. A utilização das células dendríticas, estudo

ainda em fase I, que tem sido um sucesso por 2 motivos: I) Alcançou o esperado

com relação à segurança do tratamento com células dendríticas exógenas sendo

a imunotolerância do tratamento medida em eventos adversos severos; II) Obteve

resultados quanto ao aumento de linfócitos B B220+ CD11c−, considerados

benéficos na imunotolerância do DM1.

Quanto aos estudos que falharam, há uma tendência ao não cumprimento

dos objetivos devido à dose incorreta do imunobiológico ou ao tempo de duração

do tratamento. Portanto, a problemática se encontra mais no desenho do estudo

do que no imunobiológico em si. Vale ressaltar que as imunoterapias inovadoras

contra o DM1 demonstram-se eficazes apenas em pacientes com o DM1 recém-

diagnosticado, além de serem terapias com curta expectativa de uso (usualmente

em torno de dois anos), não garantindo um tratamento eficaz no controle da

doença ao longo da vida do paciente.

37

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