IDENTIFICAO LABORATORIAL DE LEVEDURAS (Cap. 9, Sidrim)

INTRODUO- A identificao de leveduras ao nvel de espcie tem significncia prognstica e teraputica, e permitem o incio precoce de terapia antifngica nos casos de doena sistmica causada por Candida albicans ou por leveduras no-albicans.- Espcies de levedura fazem parte da microbiota normal da superfcie da pele e tambm de algumas mucosas como a cavidade oral, a vagina e o jejuno, o que torna ainda mais necessria a identificao da espcie isolada.- Isolamento de leveduras a partir de stios anatmicos estreis sinnimo de infeco fngica.- Indivduo normal geralmente no desenvolve infeces fngicas; os mecanismos de defesa podem ser, no entanto, desequilibrados por fatores intrnsecos ou extrnsecos (como doena de base, cateteres intravasculares e antibioticoterapia), tornando o indivduo suscetvel ao supercrescimento da populao residente de leveduras, seguido por invaso e leso dos tecidos vivos (infeco por fungos da microbiota normal, mesmo que estes sejam de baixa patogenicidade).- As leveduras geralmente crescem bem dentro de 48 horas, sob temperaturas entre 25 e 37C, em meios micolgicos e bacteriolgicos comuns, incluindo gar-sangue e gar Sabouraud dextrose (ASD). So fungos unicelulares, de reproduo assexuada (por meio de blastocondios) e cosmopolitas.- A maioria das leveduras produz colnias de colorao branca ou bege, textura cremosa e superfcie lisa; alguns isolados apresentam borda fina estrelada ou franjada nas margens da colnia.- Rhodotorula spp. podem produzir colnias de colorao alaranjada (imagem), Cryptococcus spp. em geral geram colnias mucoides, devido presena de cpsula, enquanto as de Trichosporon spp. apresentam-se com aspecto seco e superfcie rugosa, e as leveduras demceas produzem colnias negras; isso pode orientar quanto ao gnero em uma viso macroscpica.

- Quando se observa crescimento de uma colnia leveduriforme, deve-se proceder ao exame microscpico da mesma, atravs de preparaes com soluo salina, lactofenol azul de algodo ou corante de Gram (mais utilizado: suspenso da levedura em lmina com KOH 10%-20% e exame a fresco com adio de lactofenol). Observa-se a presena de estruturas arredondadas ou ovais em brotamento (blastocondios), associadas ou no presena de hifas e pseudo-hifas, o que d a certeza de que o isolado se trata de uma levedura.- As leveduras predominantes numa cultura, as provenientes de stios normalmente estreis e aquelas recuperadas repetidamente de pacientes imunossuprimidos devem ser identificadas.- A pureza do cultivo deve ser revalidada sempre que for necessrio, pois a identificao de espcie indefinida pode ser decorrente da presena de um contaminante.- Em relao s caractersticas morfolgicas, consideram-se aspectos (ou aspctos, segundo a tia) macroscpicos da colnia e microscpicos da levedura (aspecto micromorfolgico), fazendo-se uso tambm de metodologias especficas para detectar a presena de estruturas fngicas como tubo germinativo e cpsula.- Bioquimicamente, so investigadas a capacidade que as leveduras tm de utilizar determinados carboidratos e compostos nitrogenados como fontes de carbono e nitrognio (auxanograma utilizando meio C e meio N) e a capacidade de fermentar alguns carboidratos (zimograma). Podem ser pesquisadas tambm a produo de urease ou fenoloxidase.

PROVA DO TUBO GERMINATIVO- Mtodo simples de triagem que permite a distino presuntiva entre Candida albicans ou C. dubliniensis (tubo germinativo positivo) de outras espcies de levedura (tubo geminativo negativo).- O tubo germinativo uma projeo alongada, que emerge da levedura quando esta entra em contato com soro temperatura de 37C durante 2 a 3 horas. - Retira-se uma alquota da colnia de levedura inocula em um tubo contendo soro de coelho, fetal bovino ou de cavalo suspenso incubada a 37C durante 2 a 3 horas remoo de uma gora da suspenso, que examinada ao microscpio ptico.- No se pode confundir tubos germinativos com pseudo-hifas; o tubo germinativo asseptado, sem constrio no ponto de insero entre a projeo crescente e o blastocondio, enquanto a pseudo-hifa pode ser septada ou no, e apresenta ponto de constrio em sua base.- Resultados falso-negativos podem ocorrer em portadores de neoplasia submetidos a quimioterapia, ou no exame de pacientes tratados com antifngicos, ou quando o inculo pesado (alquota muito grande de levedura) ou, ainda, quando h refrigerao prolongada do soro.- O falso-positivo observado raramente, quando a incubao se prolonga por mais de 3 horas.

PROVA DO MICROCULTIVO (DALMAU, 1929)- Possibilita o estudo micromorfolgico das leveduras em meio gar-fub-Tween 80 ou gar-arroz-Tween 80 incubao das leveduras em meio com Tween 80 e sob baixa tenso de oxignio estimula a produo de condios e filamentao, sendo possvel sugerir o gnero, ou at mesmo a espcie, atravs do estudo da presena e disposio dos blastocondios, artrocondios, hifas verdadeiras e pseudo-hifas.- A presena de clamidocondios caracterstica de C. albicans ou de C. dubliniensis, sendo seu melhor desenvolvimento no extrato de arroz, enquanto o de blastocondios intensificado no fub.- Presena de blastocondios sem hifas ou pseudo-hifas Cryptococcus spp., Candida glabrata, Rhodotorula spp. ou Saccharomyces spp.- Presena de artrocondios, blastocondios e hifas Trichosporon spp.- Presena apenas de hifas e artrocondios Geotrichum candidum.- Em geral preciso realizar provas bioqumicas adicionais para confirmar a identificao.

USO DE MEIO CROMOGNICO- Meios de cultivo capazes de gerar o crescimento de colnias de cores distintas, segundo a espcie de levedura.- Dcada de 90 CHROMagar Candida meio capaz de fazer a identificao presuntiva das espcies de levedura mais comumente isoladas de material clnico e de facilitar o reconhecimento de culturas mistas de leveduras.- Princpio: produo de cor das colnias por reaes enzimticas espcie-especficas, com um substrato cromognico do meio.- Sensibilidade e especificidade do meio excede 99% para C. albicans, C. tropicalis e C. krusei (colnias verde, azul e rosa-plido, respectivamente).

IDENTIFICAO DE Cryptococcus spp.- Gnero caracterizado pela presena de cpsula de mucopolissacardeos.- C. neoformans o principal agente de meningite fngica (isolamento de clulas fngicas no lquor neurocriptococose).- Exame pode evidenciar a presena da capsula montagem da preparao entre lmina e lamnula, utilizando tinta nanquim como lquido de montagem na proporo de 1:1 em gua destilada nanquim no penetra na cpsula, que se apresenta como halo claro em torno da levedura, ressaltada contra o fundo preto do corante.- OBS: espcies de Rhodotorula ou de Sporobolomyces tambm apresentam cpsula!- Para discriminao do gnero pode-se utilizar tambm o teste de hidrlise da ureia, utilizando o meio de Christensen. Levedura produz urease que hidrolisa ureia, resultando em alcalinizao do meio de cultura, o que observado atravs de mudana da colorao do gar do amarelo para o rosa intenso.- Trichosporon spp., Rhodotorula spp. e Candida lipolytica tambm podem ser urease positivas, mas apresentam caractersticas morfolgicas e bioqumicas distintas de Cryptococcus.- C. neoformans fenoloxidase positiva sntese de pigmentos de melanina a partir do fenol produo de colnias de tonalidade castanho-escuras ou negras sobre meio de niger, de sementes de girassol ou de cido cafico.- Finalmente, o meio CGB empregado para a quimiotipagem das cepas de C. neoformans var. neoformans e C. neoformans var. gatti (??) var. gatti vira indicador de pH para azul-cobalto.

PRODUO DE ASCOS (LEVEDURAS ASCOSPORADAS)- Alguns gneros de leveduras produzem estruturas de reproduo sexuada (ascos) quando crescem em meio adequado Saccharomyces e Pichia em meios gar extrato de malte, gar acetato de sdio, meio V8 e outros.- Incubao por 7 dias submete colorao de Kinyoun ascsporos coram-se de vermelho enquanto as outras clulas leveduriformes coram-se de azul.

IDENTIFICAO DE Candida dubliniensis- Primariamente associada com a colonizao e infeco da cavidade oral de pacientes HIV-soropositivos, sendo relatada tambm em casos de infeco sistmica associada imunodeficincia.- Compartilha muitas caractersticas com C. albicans, o que torna difcil a distino.- Isolados de ambas as espcies crescem a 30 e 37C, produzem colnias de cor creme em ASD, produzem tubo germinativo e clamidocondios e apresentam perfil bioqumico semelhante; a discriminao baseia-se em mtodos moleculares como PCR, RAPD e PFGE.

ASSIMILAO DE CARBOIDRATOS- Testa a capacidade de crescimento da levedura em aerobiose frente a uma fonte de carbonos: glicose, lactose, maltose, trealose, xilose, dextrose (controle positivo) entre outros acares, fornecidos como nica fonte de energia (meio YNB ou meio C).- Assimilao em meio slido auxanograma ou tcnica auxanogrfica.- gar destitudo de qualquer fonte de carbono adiciona-se a suspenso da levedura, que distribuda na placa utilizao de discos de papel de filtro impregnados com os diferentes carboidratos positividade avaliada atravs da observao de halo de crescimento da levedura em presena do carboidrato fornecido.

ASSIMILAO DE NITROGNIO (T ACABANDO!)- Testa a habilidade que uma levedura tem de crescer aerobiamente na presena de um composto nitrogenado fornecido como nica fonte de energia.- Essa tcnica auxanogrfica emprega meio de gar YCB ou YNB destitudo de qualquer fonte de nitrognio, adicionado da suspenso da levedura e distribudo em placa depois so aliquotados compostos nitrogenados sobre o gar a positividade avaliada por meio do crescimento da levedura em presena do composto fornecido (geralmente peptona como controle positivo e nitrato de potssio).

ZIMOGRAMA OU FERMENTAO DE CARBOIDRATOS- Habilidade que uma levedura tem de crescer anaerobiamente na presena de determinado acar fornecido como nica fonte de energia, observada atravs da produo de gs carbnico e alterao de pH.- Classicamente realizada em meio lquido suspenso da levedura inoculada em tubo de ensaio contendo meio de cultura, soluo do acar desejado a 2% e um tubo de Durham invertido positividade observada atravs da produo de gs no interior do tubo de Durham e da mudana da colorao do meio, quando se utiliza um indicador de pH.

SISTEMAS MANUAIS E AUTOMATIZADOS PARA PROVAS DE ASSIMILAO DE CARBOIDRATOS- Os sistemas manuais mais utilizados so o API 20C, o ID 32C e o Auxacolor galerias plsticas contendo carboidratos desidratados, nas quais a suspenso da levedura inoculada provas positivas podem ser traduzidas pela turvao ou mudana de colorao.- Ainda assim so recomendadas provas adicionais como a macromorfologia colonial, a micromorfologia, pesquisa de cpsula, etc.- Mtodos automatizados mais difundidos so o Microscan Rapid Yeast Ident e o AutoMicrobic mesmo princpio, s que os sistemas so controlados e interpretados automaticamente por computadores.- ATB fungus 2 faz o antifungiograma (estudo de antifngicos).- Recomendaes: utilizar sempre microcultivo como teste adicional, cuidado para obter inculos puros e viveis, certificar-se sobre quais espcies so identificadas por cada mtodo, e observar protocolo.- OBS: laboratrios de pesquisa j investem no uso de anticorpos monoclonais ou de mtodos moleculares com a finalidade de resolver problemas de diagnstico ou de marcagem epidemiolgica.