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Disciplina: Bioquímica ClínicaCurso: Análises Clínicas
2º. MóduloDocente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini
Fundamentos da Espectrofotometria
“Uma maneira boa de cutucar moléculas, é com radiação eletromagnética (luz)”
A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos analíticos que baseiam-se na interação da matéria com a
energia radianteLuz
incidente
Luz
emergente
Luz absorvida
Perdas:- reflexões- dispersão-absorção
•Boa sensibilidade•Baixo custo de
análise•Fácil operação•Equipamentos
robustos
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
f= c/ λ
c = velocidade da luz no vácuo 3.1010 cm/s
Fundamentos da Espectrofotometria•Comprimento de onda (λ)
•Período (p) = tempo necessário para completar um ciclo
•Freqüência (f) = ciclos/s ou Hertz
unidades
nm = 10-9 m
A= 10 -10 m
Energia (E)
E = h.f => E = h.c/λ
h= constante de Planck
Fundamentos da Espectrofotometria
(a) (b)
Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma: (a) esquema e (b) fotografia.
Arco-Íris: exemplo de difração de luz produzida na natureza.
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia.
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia– TRANSIÇÕES ELETRÔNICAS– TRANSIÇÕES ELETRÔNICAS
• Níveis discretos de energia são absorvidos devido à vibrações e rotações das moléculas
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia– ROTACIONAL E VIBRACIONAL– ROTACIONAL E VIBRACIONAL
• Por este motivo não se observa uma linha de absorção nítida, mas sim uma banda de absorção
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia– ESPECTRO UV-VISÍVEL– ESPECTRO UV-VISÍVEL
Fundamentos da Espectrofotometria
• Porque ocorre o fenômeno da absorção?• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser
promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia– TRANSIÇÕES ELETRÔNICAS– TRANSIÇÕES ELETRÔNICAS
• Níveis discretos de energia são absorvidos devido à vibrações e rotações das moléculas– ROTACIONAL E VIBRACIONAL
• Por este motivo não se observa uma linha de absorção nítida, mas sim uma banda de absorção– ESPECTRO UV-VISÍVEL
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer
– Quando uma radiação monocromática passa através de uma solução, uma parte da energia é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é transmitida.
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer– Grandezas:
1- Transmitância:quantidade de energia radiante transmitida pela solução.A transmitância é dada pela relação entra a intensidade daradiação transmitida (I) e a intensidade da radiaçãoA transmitância é dada pela relação entra a intensidade daradiação transmitida (I) e a intensidade da radiaçãoincidente (Io), ou seja, T = I/Io.Seu valor varia de zero a 1 (ou 0 a 100%)T=O � toda a luz incidente é absorvida (I=O)T=1 � toda a luz incidente é transmitida (I=Io).
2- Absorbância
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer– Grandezas:
1- Transmitância:2- Absorbânciaquantidade de energia radiante absorvida pela solução. quantidade de energia radiante absorvida pela solução. A absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente proporcional à concentração da amostra. Para se determinar a concentração de uma determinada solução, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibração), o qual é obtido através da relação entre a concentração e a absorbância de uma solução padrão de concentração exatamente conhecida.
Teoria da Espectrofotometria
• Lei de Lambert-Beer• 2- Absorbância
Uma vez conhecido o Fator de Proporcionalidade, fica fácil se descobrir a concentração da solução teste. Basta realizar a seguinte equação:
Praticando:
1-Determine o Fator de Proporcionalidade de uma amostra, sabendo:
[padrão] = 12,4 g/dL
abs. padrão = 0,52abs. padrão = 0,52
Praticando:
2-Sabendo que o Fator de Proporcionalidade de uma amostra é 22,4. Qual o valor da [padrão] se a abs. padrão for de 0,33?
Lei de Lambert-BeerA espectroscopia de absorção molecular está baseada
na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que estão relacionadas através das equações:
T= I/Io (%T = 100x T)A = log (1/T) = log (I/Io)
Io I
A=0 � T= 1 � 100% TransmissãoA=1 � T=0,1 � 10 % transmissão
90% Absorção
Io
Lei de Lambert-Beer
A absorbância é muito importante porque ela é diretamente proporcional à concentração de espécies absorventes de luz na amostra.
Partes Essenciais de um Espectrofotômetro
• Fontes de radiação;
• Monocromador;
• Compartimento de amostra;amostra;
• Detector.
Fontes de RadiaçãoFonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda.
•Lâmpada de tungstênio: utilizada para região UV próximo e visível•Lâmpada de deutério: utilizada para a região do UV
Sistema Óptico
• Filtros de vidro: transmitem faixa ampla de comprimento de onda;•Prismas: transmitem •Prismas: transmitem pequena faixa de onda;•Redes de difração: transmitem pequena faixa de comprimento de onda.
DetectoresUtilizados para receber a energia radiante transmitida através da solução e transformá-la em energia elétrica.
Análise Qualitativa2,4
2
,6 2
,8 3,0
3
,2
Lo
g ε
A ou B
C
D
C5H11
OH
C5H11
R
OH OH
R
OH(A) (B)
240 250 260 270 280 290 300
Comprimento de onda (nm)
2,0
2,2
2,4
2
,6 2
,8 3,0
3
,2
Lo
g
A ou B
C5H11
OH OHOH
C5H11
OH
OH
OHOH
(A) (B)
(C) (D)
Espectro de absorção do canabidiol comparado com outros fenóis.