Disciplina: Genética II

Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

O que são as hemoglobinopatias ?

Distúrbios das hemoglobinas humanas

Mutações nos genes das globinas

Doença monogênica mais comum

Anemia Hereditária

Caso Clínico 1

• Menino de raça negra, com 4 meses de idade;

• Terceiro filho de pais jovens, naturais de Luanda;

• O primeiro filho do casal faleceu aos 5 meses;

• Aparentemente saudável até 15 dias antes do internamento, com febre e tosse; desde então ficou prostrado e progressivamente mais pálido.

Foram realizados diversos exames complementares

de diagnóstico, como hemograma com os seguintes resultados:

Hemoglobina – 4,6g/dL (13 a 16g/dL)

N.º Glóbulos vermelhos – 1.400.000/mm3 (4,5 a 6 milhões)

N.º Glóbulos brancos – 8.000/uL (4.000 – 11.000)

N.º Plaquetas – 156.000/uL (150.000-450.000)

Qual o diagnóstico provável?

Qual tipo de anemia? Ferropriva ou hereditária?

Solicitar esfregaço de sangue e eletroforese de hemoglobinas

Esfregaço normalTeste de falcização positivo

Estrutura e funçãoFUNÇÃO:FUNÇÃO: transportador de oxigênio em hemácias de vertebrados.

ESTRUTURA: tetrâmero 2 cadeias tipo alfa ()

2 cadeias tipo beta ()

Cada subunidade :

-cadeia polipeptídica globina

-grupo prostético (cofator):

grupo Heme

-

Formação da estrutura

quaternária da hemoglobina.

4 cadeias são dobradas tetrâmero globular, com peso molecular de 64.500 D

CARACTERÍSTICAS DA ESTRUTURA DAS

GLOBINAS

- estrutura bem conservada ao longo da evolução

Estrutura terciária: quase todas as globinas possuem as 8 regiões

helicoidais A - H

2 aminoácidos histidina (resíduo F8) conservados fenilalanina (resíduo CD1)

sítios internos: resíduos apolares invólucro hidrofóbico.

superfície da molécula: resíduos polares (hidrofílicos)

Mutações conformação/

substituição aa. conservados/alteração

do invólucro hidrofóbico

Hemoglobinopatias

CARACTERIZAÇÃO DAS CADEIAS DE GLOBINA

Cadeias e : tamanhos semelhantes

cadeia 141aa cadeia 146 aa

-genes da cadeia : cromossomo 16 ; 2; 1

- genes da cadeia : cromossomo 11 ; G; A; ; e diferem em 10 aa

Genes das globinas, distribuídos em dois cromossomos.

 

Cluster Beta – LCR (REGIÃO CONTROLADORA DO LOCUS)

-responsável pela expressão em alto nível do gene da -globina nos tecidos

apropriados e durante o desenvolvimento:

- controla expressão dos genes da família beta globina: atividade de estimulação,

inibição interação de fatores de transcrição com o DNA e maquinaria da

RNA polimerase Atua como um SUPERACENTUADOR de transcrição

- LCR localizado ~20 kb do gene épsilon possui 5 sítios hipersensíveis (HS)

-deleções da LCR não expressam os genes do grupo da -globina- alvo para terapia gênica.

LCR

G A

LCR

G A

LCR

G A

Embrionário DNA

Fetal DNA

Adulto DNA

Strachan and Reald HMG2 1999

Ativação dos Genes Beta

http://www.med.yale.edu/obgyn/reproimmuno/courses/class3/sld007.htm

Como ocorre a ativação e silenciamento dos genes da globina durante o desenvolvimento?

ONTOGÊNIA – Tipos de globinas durante as fases do desenvolvimento

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=dbio&part=A736

Hb Gower 1

Hb Gower 2

HbF

HbA2

HbA

Expressão dos genes da globina durante o desenvolvimentoExpressão dos genes da globina durante o desenvolvimento

Mudanças temporais da síntese de globina alterações

no local da eritropoiese.

SÍNTESE DE GLOBINA EMBRIONÁRIA:

- 3a à 8a semanas de gestação: eritropoiese no saco vitelínico

Hb embrionárias globinas e (combinação com as

demais)

3 Hb embrionárias Hb Gower 1 (2 2 )

Hb Gower 2 (2 2 )

Hb Portland (2 2 )

SÍNTESE DA HEMOGLOBINA FETAL

5a semana gestação:

hematopoiese muda para o fígado fetal mudança na síntese

de para e de para Hb fetal 2 2 (Hb F).

-predominante (vida fetal)

-70% da Hb total ao nascimento, mas na idade adulta

1%.Cadeias :- detectáveis no início da gestação síntese significativa próximo ao nascimento.Cadeia : -síntese inicia no final da vida fetal, continuando após nascimento, não atinge + de 2% da Hb adulta.

Hb F

SÍNTESE DA HEMOGLOBINA ADULTA

-hematopoiese: medula óssea

-Recém-nascido: HbF (2 2 ): 70-90%

HbA (2 2): 0-10%

-Após 6 meses de vida: hemoglobinas do adulto

HbA (2 2): 95%

HbA2 (2 2): 2-3%

HbF (2 2 ): até 1%

DOSAGEM GÊNICA E DOENÇAS CLÍNICAS

-globina : 4 genes

-globina : 2 genes

-uma única mutação no gene -globina 25% das cadeias .

-mutações da -globina doença severa na vida fetal e pós-

natal.

- uma única mutação no gene -globina afeta 50% das cadeias

.

- mutações da -globina não trazem consequências pré-natais

(globina e a Hb F).

diplóide

DISTÚRBIOS GENÉTICOS DA HEMOGLOBINA

A. Variantes estruturais: alteram a globina (mudanças na

sequência de aminoácidos), sem afetar a taxa de síntese

B. Talassemias: alteração na síntese desequilíbrio nas

quantidades das cadeias do tipo alfa e beta

1. Variantes estruturais: maioria provém de mutações de

ponto.

- > 900 variantes descritas

- anemia hemolítica

- transporte de O2 alterado

- Brasil: mais comuns Hb S, Hb C e Hb D

HEMOGLOBINAS VARIANTES

Hemoglobina S: Hb S (primeira Hb anormal detectada)

alteração: 1 aa. dos 146 da -globina

6 Glu Val (A T)

Mutação em homozigose Anemia falciforme.

PATOLOGIA MOLECULAR DA HB S

•Pauling et al. (1949): Hb A e Hb S por eletroforese

•Ingram (1956): substituição de 1 dos 146 aa. na cadeia da -

globina.

Ac. Glutâmico: carga negativa

Valina: neutro → mobilidade eletroforética mais lenta da HbS

Eletroforese alcalina de hemoglobinas em gel de agarose. Diferenciação da mobilidade eletroforética dos genótipos SC, SF e AS.

Eletroforese ácida de hemoglobinas em gel de agarose. (1) Hb ASF em sangue de recém-nascido; (2) Hb AS; (3) Hb AA. Devido ao processo físico-químico de eletroendosmose a Hb Fetal migra com maior rapidez que a Hb A.

DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA

- África equatorial: 1/50 nascimentos

- Região do Mediterrâneo

- Índia e países onde essas pessoas migraram.

- incidência: 1/400 a 1/600 afro-americanos.

- hemácias: forma afoiçada ( tensão de O2)

http://cienciahoje.uol.com.br/114271

AFOIÇAMENTO E SUAS CONSEQUÊNCIAS

Hb com subunidades mutantes

-condições de tensão de O2 Hb S agregam-se em

polímeros que distorcem o eritrócito (insolubilidade)

- são menos flexíveis, não se comprimem nos capilares,

obstruindo o fluxo sanguíneo hipóxia local.

Como explicar a alta frequência do alelo

mutante (2S) em algumas regiões da África?

Duas explicações possíveis para a seleção contra

homozigotos mutantes:

1. Alta taxa mutação ou

2. Heterozigotos portadores mais adaptados

-certas situações ambientais: heterozigotos portadores (traço

falcêmico - HbAS) maior vantagem seletiva que os homozigotos

normais (HbAA).

(HbAS)

gene falcêmico : alta frequência em certas regiões da África heterozigotos são mais resistentes ao Plasmodium vivax (parte do ciclo evolutivo nas hemácias do hospedeiro)

http://www.assis.unesp.br/~egalhard/errmetab.htm

MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

•destruição prematura dos eritrócitos afoiçados

•anemia nos dois primeiros anos, •atraso crescimento e atraso da puberdade,• esplenomegalia, •infecções repetidas (hipofunção esplênica), •infartos nos tecidos (ulceração)•problemas osteoarticulares e

renais

http://www.ufv.br/dbg/BIO240/DG112.htm

HEMOGLOBINA C - HbC

•substituição na 6a posição da cadeia (GAG AAG): 6 Glu Lys

- menos solúvel que a Hb A cristaliza-se nas hemácias distúrbio hemolítico leve.- anemia sob estresse ou durante a gravidez -gene C frequente na África ocidental e em descendentes dessa região.

-Hb SC: indivíduos possuem alelo S no outro locus da -globina.-distúrbio hemolítico mais leve que a anemia falciforme

HEMOGLOBINA INSTÁVEL

HB HAMMERSMITH

mutação de ponto substituição na cadeia 42 Phe Ser

fenilalanina resíduo CD1 - aa conservados (alojar o

Heme)

-resíduo de serina é menor Heme

sai do lugar

- instabilidade ( hemoglobina

precipita formando inclusões)

- afinidade por O2 cianose.

http://www.ciencianews.com.br/hemoglobinopatias/hemoglobinopatias-index.htm

HEMOGLOBINAS COM ALTERAÇÕES FUNCIONAIS

TRANSPORTE DE O2 ALTERADO

-mutações que alteram a capacidade da Hb transportar O2

Metemoglobinas – Hb M•Oxihemoglobina: forma normal da Hb em que o ferro está

no estado reduzido (ferroso)•Metemoglobina: o ferro encontra-se na forma férrica

(oxidada) incapaz de transportar O2 cianose;

assintomática nos heterozigotos.

- Ex.: Hb Hyde Park - 92 His Tyr

- histidina: aa conservado (resíduo F8)http://www.hemoglobinopatias.com.br/hemoglobinopatias/listagem.htm

Hb Lepore

- alguns pacientes com fenótipo de -talassemia: - cadeias globínicas híbridas : metade N-terminal de uma cadeia fundida com a metade C-terminal de uma cadeia normal - Fusão da porção 5’ do gene com 3’ do gene

pareamento desigual na MEIOSE

crossing-over homólogo

(genes homólogos)

Pareamento normal

Pareamento anormal

Crossing-over desigual

Anti-Lepore

Lepore

Hb Lepore: cadeias fusionadas.

- mutação provoca redução ou ausência na síntese de

uma das cadeias ou , sem alterar a sequência de

aminoácidos

- cadeia produzida na taxa normal: excesso relativo

precipitação na célula lesando a membrana

destruição prematura da hemácia.

2 grupos talassemias

talassemias

TALASSEMIAS

Distribuição geográfica ao redor do Velho mundo: Mediterrâneo, Oriente Médio e partes da África, Índia e Ásia. Thalassa: mar

ALFA-TALASSEMIAS-distúrbios genéticos na produção da -globina afetam a formação das Hb fetal (HbF 2 2 ) e adulta (HbA 2 2)-Ausência de cadeia : talassemia 0

-Redução de cadeia : talassemia +

- ausência de cadeias de -globina: cadeias de -globina formam um tetrâmero. -maioria das -talassemias deleções

Recombinação homóloga desigual

Formas de Talassemia Alfa

•Deleção 4 genes alfa: formação de 4 Hb Barts forma major

hidropisia fetal

•Deleção de 3 genes alfa: tetrâmero 4 Doença da Hb H

precipitam na hemácia destruição e anemia hemolítica

•Deleção de 2 genes alfa: anemia leve (traço talassêmico)

•Deleção de 1 gene alfa:

portador silencioso

- -talassemia por deleção homozigota (ausência de cadeias )

restrita ao SE asiático.

- estado heterozigoto (2 genes normais e 2 mutantes).

2 genótipos —/ —

— —/

progênie — —/— —

Hidropisia fetal

Pais

Hidropisia Fetal

Pais

Traço -talassêmico: deleção de 2

genes (_ _/ ) :

- anemia leve.

- comum em orientais e SE asiático

Hemoglobina H

Doença da Hb H (4): deleção de 3 genes (_ _/ _ ) moderadamente grave.alteracões ósseas, esplenomegaliaafeta orientais e brancos

DOENÇA DA HB H

Precipitados da HbH

Traço -talassêmico

(_/_ )

SO Ásia, negros

americanos e

brasileiros

Pais

descendentes

TRAÇO ALFA-TALASSÊMICO

http://www.ciencianews.com.br/doencaeritro/Altera%E7%F5es%20Eritr.%20Nas%20Talassemias%20-%207/genfisioa.htm

DESEQUILÍBRIOS DAS GOBINAS ALFA

(4)

(4)

BETA-TALASSEMIAS-produção reduzida ou ausente de -globina anemia

microcítica hipocrômica.-Ausência de cadeia : talassemia 0

-Redução de cadeia : talassemia +

-desequilíbrio da síntese de -globinas precipitação das cadeias

danos na hemácia.

- cadeia é importante no período pós-natal síntese após o

nascimento (-globina substituiria a e a síntese de Hb A é ).

- maioria das -talassemias são decorrentes de mutações pontuais

síntese de RNA

- síntese de Hb F reduz a gravidade da doença.-indivíduos homozigotos para -talassemia talassemia major -indivíduos heterozigotos para -talassemia talassemia minor

http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm

1. Mutação nos promotores (TATA box)2. Mutação no splicing do mRNA3. Mutação da cobertura (cap) do mRNA4. Mutações sem sentido e de matriz de leitura

Normal Hipocrômica e microcítica

http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm

DESEQUILÍBRIOS DAS GOBINAS BETA

http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm

TIPOS DE TALASSEMIA BETA

Sinais Clínicos -anemia intensa antes dos 2

anos (Hb F pós-natal), -atraso do crescimento, -icterícia, -hepatoesplenomegalia, -alterações esqueléticas (expansão da medula óssea).

Tratamento- transfusão sanguínea- administração de agentes quelantes do ferro-transplante de medula óssea-Terapia gênica

TALASSEMIA MAJOR – ANEMIA DE COOLEY

TALASSEMIA MAJOR – ANEMIA DE COOLEY

Eletroforese de hemoglobinas em gel de agarose alcalina: (1) Hb AF de talassemia beta maior; (2) Hb S/beta talassemia ou SF, onde m indica o fracionamento da metaemoglobina S e a a globina alfa livre; (3) Hb AA2 e Fetal em tal. beta menor; (4) Hb AS (traço falciforme); (5) Hb AA (normal).

Cadeias normais em excesso precipitam-se formando

os corpúsculos de Heinz na hemácia em forma de

lágrima.

TALASSEMIA MINOR -

TRAÇO TALASSÊMICO

-portadores de um alelo

mutante (heterozigoto)

-Geralmente assintomáticos

- anemia leve

-diagnóstico: eletroforese

( Hb A2).

Risco para casamentos entre portadores de talassemia beta

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL•Eletroforese em acetato de celulose (pH alcalino ou ácido): rápida e baixo custo, mas sensibilidade limitada Hbs co-migram na mesma posição.

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL•Eletroforese de Focalização isoelétrica: técnica de alta precisão identifica Hbs com co-migração

•A Hb migra no gel e se precipita ao encontrar seu ponto isoelétrico (conforme o pH no gradiente do gel)

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

•HPLC (Cromatografia líquida de alta pressão): diagnóstico diferencial das hemoglobinopatias (dados quantitativos e qualitativos)

•Técnicas moleculares: identificação da mutação (PCR, sequenciamento)

5- Considerando que a amostra número 1 é o perfil adulto normal (HbAA) responda quais são os perfis das amostras 2 e 3 nas eletroforeses A e B.

Eletroforese A

-

+

AF

S e similares

A2; C e similares

1 2 3

-

+

AF

S e similares

A2; C e similares

1 2 3

Eletroforese B