DISSERTAÇÃO_Efeito Do Óleo Essencial de Gengibre e Do Ph Sobre Crescimento e Indução de Tolerância Em Listeria Monocytogenes

7/25/2019 DISSERTAO_Efeito Do leo Essencial de Gengibre e Do Ph Sobre Crescimento e Induo de Tolerncia Em Listeri

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HELIO HADDAD FILHO

EFEITO DO LEO ESSENCIAL DE GENGIBRE

E DO pH SOBRE O CRESCIMENTO E

INDUO DE TOLERNCIA EMListeria

monocytogenes

LAVRAS MG

2014


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HLIO HADDAD FILHO

EFEITO DO LEO ESSENCIAL DE GENGIBRE E DO pH SOBRE OCRESCIMENTO E INDUO DE TOLERNCIA EMListeria

monocytogenes

Dissertao apresentada UniversidadeFederal de Lavras, como parte dasexigncias do Programa de Ps-Graduao em Cincia dos Alimentospara obteno do ttulo de Mestre.

OrientadoraDr. Roberta Hilsdorf Piccoli

LAVRAS MG2014


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Haddad Filho, Hlio.Efeito do leo essencial de gengibre e do ph sobre crescimento e

induo de tolerncia emListeria monocytogenes/ Hlio HaddadFilho. Lavras : UFLA, 2014.

85 p. : il.

Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Lavras, 2014.Orientador: Roberta Hilsdorf Piccoli.Bibliografia.

1. Adaptao cruzada. 2. Estresse cido. 3. Concentraomnima inibitria. 4. Tolerncia. 5. Gengibre.I. UniversidadeFederal de Lavras. II. Ttulo.

CDD 576.163

Ficha Catalogrfica Elaborada pela Coordenadoria de Produtos e

Servios da Biblioteca Universitria da UFLA


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HLIO HADDAD FILHO

EFEITO DO LEO ESSENCIAL DE GENGIBRE E DO pH SOBRE OCRESCIMENTO E INDUO DE TOLERNCIA EMListeria

monocytogenes

Dissertao apresentada UniversidadeFederal de Lavras, como parte dasexigncias do Programa de Ps-Graduao em Cincia dos Alimentospara obteno do ttulo de Mestre.

APROVADA em 31 de janeiro de 2014.

Dr. Disney Ribeiro Dias UFLA

Dr. Allan Kardec Carlos Dias Faculdade Inforium

Dra. Roberta Hilsdorf Picolli

Orientadora

LAVRAS MG2014


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AGRADECIMENTOS

A Deus, responsvel por tudo, que proporcionou as condies para a

realizao desse mestrado e que sempre esteve presente, amparando nos

momentos de fraqueza e dando fora para superar as dificuldades.

A minha esposa e amor da minha vida, Graziella, pela pacincia e amor

incondicionais e constantes diante de minha ausncia, assumindo funo de me

e de pai naqueles muitos momentos onde eu no me encontrava presente. Teamo muito. Muito obrigado por tudo!

Aos meus filhos, Bianca e Henrique. Gostaria tanto que soubessem a

importncia que tm na minha vida e a importncia que tiveram para a

concluso desse mestrado. Saibam que foi difcil demais ter que ficar tanto

tempo longe de vocs e que me cortava o corao as vezes que vinham gritando

papai e eu no podia permanecer junto de vocs. Vocs so tudo na minha

vida e por vocs que pretendo fazer muito e muito mais. Amo vocs mais que

tudo no mundo!

A toda minha famlia, pai, me e irmos e, especialmente, ao meu irmo

Felipe, que muito ajudou e participou diretamente em vrios aspectos desse

projeto. Valeu, Titi.

A minha orientadora Profa. Roberta Hilsdorf Picolli, por ter me aceitado

como mestrando. Muito obrigado pela sempre compreenso, alegria,

disponibilidade e por ter permitido a realizao desse sonho!

Aos professores que aceitaram fazer parte da minha banca, o meu muito

obrigado.

A todos os professores que participaram dessa minha formao,

ministrando disciplinas, dando orientaes ou conselhos. Todos foram muito

importantes.


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Ao professor de Estatstica, Paulo Csar Lima, pela incomensurvel

ajuda.

A todos os colegas de laboratrio e amigos. Todos. Sem exceo. Seria

injusto citar alguns e deixar de citar outros, por isso, agradeo a todos que, cada

um a sua maneira, com certeza, foram essenciais e muito importantes para a

concluso desse mestrado. Agradeo, em especial, ao Joo Paulo, que foi

fundamental na minha chegada ao laboratrio, ajudando muito, mas muito

mesmo, principalmente nas etapas iniciais, fundamentais para meu aprendizado.Muito obrigado!

Eliane, pela constante ajuda dentro do laboratrio.

Lucilene, que sempre me ajudou na resoluo dos assuntos

burocrticos, que foram muitos.

A todos do laboratrio de Fisiologia Vegetal, pela simpatia e ajuda nas

anlises realizadas.

Enfim, a todos que, de alguma forma, verdadeiramente, ajudaram na

concretizao desse projeto, acadmico e de vida.O meu muito obrigado!


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RESUMO

Listeria monocytogenes uma bactria Gram positivo, aerbiofacultativo e no formadora de endsporos, que apresenta grande capacidade decrescimento em condies adversas tornando-se, assim, um srio problemaenfrentado pela indstria de produo de alimentos e, consequentemente, pelosistema de sade, uma vez que a infeco causada por esse micro-organismoapresenta uma elevada taxa de mortalidade, principalmente em indivduosimunodeprimidos. Bactria reemergente em vrios pases, apresenta tolerncia aambientes adversos e capacidade de se adaptar a esses ambientes, podendo

tornar-se ainda mais tolerante frente a agentes nocivos diversos. O presentetrabalho teve o objetivo de avaliar o efeito do pH e do leo essencial de gengibresobre o crescimento e a induo de tolerncia emL. monocytogenes, assim comoavaliar a induo de tolerncia cruzada entre o leo essencial de gengibre e aacidez. Determinou-se o pH mnimo inibitrio (pHMI) e o pH mnimo decrescimento (pHMC) de L. monocytogenes, sendo que o valor acima deste foiutilizado para a induo de tolerncia cida na bactria. Determinou-se aconcentrao mnima inibitria (CMI) do leo essencial de gengibre pelomtodo de microdiluio e uma concentrao subletal (CMI/4) do leo essenciale de um composto quaternrio de amnio foram utilizadas para a induo detolerncia no micro-organismo. Por fim, a concentrao subletal do leoessencial de gengibre foi utilizada para a induo de tolerncia cruzada do leopara o pHMI. O pHMI, emL. monocytogenes, foi 4,5 e o pHMC foi 5,0. Houveinduo de tolerncia cida com o cido clordrico e no houve com o cidoctrico. A CMI do leo essencial de gengibre foi 3,12% e houve induo detolerncia ao leo quando a bactria foi exposta concentrao de CMI/4 porseis horas. No houve induo de tolerncia frente exposio concentraosubletal de composto quaternrio de amnio. Quanto tolerncia cruzada, L.monocytogenes exposta concentrao subletal de leo essencial de gengibreapresentou crescimento quanto exposta ao pHMI de 4,5, indicando aquisio detolerncia. Dessa forma, torna-se importante a continuidade dos estudos emrelao ao efeito antibacteriano dos leos essenciais, bem como pesquisas emrelao resistncia apresentada pelos micro-organismos diante de exposies aconcentraes subletais desses e de diversos mtodos de controle microbiolgicoutilizados na produo dos alimentos. Os leos essenciais apresentam utilidadepromissora, porm muitos estudos ainda precisam ser realizados, adequando aconcentrao, de modo que essa seja efetiva, no indutora de tolerncia e,sensorialmente, aceitvel.

Palavras-chave: Adaptao cruzada. Estresse cido. Concentrao mnimainibitria. Tolerncia. Gengibre.


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ABSTRACT

Listeria monocytogenes is a Gram positive and facultative aerobicbacterium, which dont generates endospores, and have a great ability to grow inhostile conditions. Thus becoming a serious problem faced by the foodproduction industry and therefore the health system, once the infection causedby this microorganism create a high mortality especially inimmunocompromised individuals. It is a reemerging bacteria in severalcountries, and showed tolerance and ability to adapt to adverse environments,becoming even more tolerant against many harmful agents. This study aimed toevaluate the effect of pH and gingers essential oil on growth and induction oftolerance in L. monocytogenes, as well as evaluating the induction of cross-tolerance between the gingers essential oil and acidity. It was determined theminimum inhibitory pH (MIpH) and the minimum pH for growth (MpHG) forL.monocytogenes, onde the next value above that was used to induce the acidtolerance. It was determined the minimum inhibitory concentration (MIC) ofgingers essential oil by the microdilution method and a sublethal concentration(MIC/4) of the essential oil and of a quaternary ammonium compound were usedto induce tolerance in the microorganism. Finally, gingers essential oilssublethal concentration was used for the induction of cross tolerance from oil toMIpH. The MIpH in L. monocytogeneswas 4,5 and MpHMG 5,0. There wasinduction of acid tolerance with hydrochloric acid and not with citric acid. MICof gingers essential oil was 3.12% and there was induction of tolerance to oilwhen the bacteria were exposed to concentrations of MIC/4 for six hours. Therewas no induction of tolerance after exposure to sublethal concentration ofquaternary ammonium compound. Regarding cross-tolerance,L. monocytogenesexposed to sublethal concentration of gingers essential oil has grown whenexposed to pHMI 4.5, indicating acquisition of cross-tolerance. Thus, it isimportant to continue the studies on the antibacterial effect of the essential oils,as well as research regarding resistance displayed by microorganisms againstexposure to sublethal concentrations and various methods of microbiologicalcontrol used in the production of food. Essential oils have promising utility, butmany studies still need to be performed adjusting the concentration to theeffectiveness and does not induce tolerance or sensory defects.

Keywords: Cross-adaptation. Acid stress. Minimum inhibitory concentration.Tolerance. Ginger.


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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Classificao de L. monocytogenesem linhagens e sorotipos e sua

associao com casos de infeco.......... ......................... ................. 18

Tabela 2 Os principais leos essenciais no mercado mundial. ......................... 34

Tabela 3 Relao entre o pH ajustado com cido ctrico e HCl e o

crescimento (Log UFC/mL) deL. monocytogenes............................50

Tabela 4 Valores mdios docrescimento (Log UFC/ mL) de L.monocytogenesem funo do pH, aps induo de tolerncia com

HCl.................................................................................................55

Tabela 5 Valores mdios do crescimento (Log UFC/mL) de L.

monocytogenesem funo do pH, aps induo de tolerncia com

cido ctrico ....................... ...................... ......................... .............. 57

Tabela 6 Efeito de diferentes concentraes de leo essencial de gengibre

sobre o crescimento (Log UFC/mL) deL. monocytogenes ...............60

Tabela 7 Valores mdios do crescimento (Log UFC/mL) de L.monocytogenes em diferentes concentraes de leo essencial de

gengibre..........................................................................................61

Tabela 8 Efeito do pH sobre o crescimento (Log UFC/ML) de L.

monocytogenes aps exposio CMI/4 de leo essencial de

gengibre..........................................................................................67


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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Datas, eventos e reas de pesquisas relacionacionadas Listeria

desde sua descoberta em 1926. ....................... ......................... ........ 16

Figura 2 Principais constituintes dos leos essenciais. ...................... .............. 33

Figura 3 Stios e mecanismos de ao dos leos essenciais na clula

bacteriana........................................................................................37

Figura 4 Equaes de regresso do crescimento (Log UFC/mL) de L.monocytogenesem funo do pH, aps induo de tolerncia. A:

com HCl; B: com cido ctrico. ...................... ......................... ........ 59


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SUMRIO

1 INTRODUO ...............................................................................12

2 REFERENCIAL TERICO ...........................................................15

2.1 Listeria sp. ........................................................................................15

2.1.1 Listeria monocytogenes: patgeno alimentar................................... 16

2.1.2 Anlise do proteoma deListeria monocytogenes .............................19

2.1.3 Listeriose ..........................................................................................21 2.2 Resistncia a agentes antibacterianos..............................................24

2.3 Agentes antimicrobianos..................................................................27

2.3.1 Desinfetantes qumicos ....................................................................28

2.3.1.1 Compostos quaternrios de amnio ................................................29

2.3.2 leos essenciais ................................................................................30

2.3.2.1 Definio e composio ....................................................................30

2.3.2.2 Biossntese ........................................................................................34

2.3.2.3 Propriedades dos leos essenciais ....................................................35 2.3.2.4 Mecanismos de ao antibacteriana................................................36

2.3.2.5 leo essencial de gengibre ...............................................................37

2.4 Resposta deL. monocytogenesao estresse cido .............................40

2.5 Adaptao cruzada ..........................................................................42

3 MATERIAL E MTODOS .............................................................44

3.1 Micro-organismo e cultura estoque .................................................44

3.2 leo essencial ...................................................................................44

3.3 Preparo e padronizao do inculo .................................................44 3.4 Determinao do pH mnimo de crescimento e mnimo inibitrio

deL. monocytogenes.........................................................................45

3.5 Induo da resposta de tolerncia cida .........................................46


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3.6 Determinao da Concentrao Mnima Inibitria (CMI) de leo

essencial de gengibre........................................................................46

3.7 Induo de tolerncia ao leo essencial de gengibre e ao

composto quaternrio de amnio ....................................................47

3.8 Induo de adaptao cruzada ........................................................48

3.9 Anlises estatsticas..........................................................................48

4 RESULTADOS E DISCUSSO......................................................50

4.1 Determinao do pH mnimo inibitrio e pH mnimo decrescimento deL. monocytogenes ....................................................50

4.2 Induo da resposta de tolerncia cida .........................................54

4.3 Concentrao Mnima Inibitria do leo essencial de gengibre .....60

4.4 Induo de tolerncia ao leo essencial de gengibre e ao

composto quaternrio de amnio ....................................................63

4.5 Induo de tolerncia cruzada ........................................................66

5 CONCLUSO..................................................................................71

REFERNCIAS...............................................................................72


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1 INTRODUO

Listeria monocytogenes uma bactria que possui grande capacidade de

crescimento em ambientes adversos tornando-se assim um grande problema para

as indstrias de alimentos e sade pblica. Em relao indstria de alimentos,

um micro-organismo capaz de resistir a medidas usuais de controle

microbiolgico, atravs de mecanismos de adaptao e aquisio de tolerncia

que as deixaram com maior capacidade de sobrevivncia a ambientes hostis. Noque tange sade, surtos de listeriose tm acontecido no mundo e a explicao

pode ser encontrada, entre outros fatores, nos mecanismos de adaptao

desenvolvidos por essa bactria, resultando em maior resistncia.

Ao passo que os micro-organismos vo adquirindo resistncia ou sendo

selecionados pelo uso indiscriminado de agentes antibacterianos, novas medidas

de controle vo sendo desenvolvidas e novas drogas so produzidas. Mas,

medida que as novas drogas surgem, os micro-organismos tambm desenvolvem

mecanismos de resistncia contra essas drogas, permitindo sua sobrevivncia. Oque sempre foi crucial para que tenham sobrevivido na natureza torna-se, para os

seres humanos, preocupao crescente quanto ao desenvolvimento de novas

medidas para combat-los.

A utilizao de leos essenciais ou seus compostos majoritrios,

isolados ou associados, como agentes antibacterianos, surgiu como alternativa

ao combate a esses micro-organismos, devido ao aumento crescente da

resistncia aos antimicrobianos usuais, fato que j se tornou um dos grandes

desafios encontrados pela cincia atualmente.Como os leos essenciais j vm sendo pesquisados e seu efeito

antibacteriano j foi comprovado, consiste em atual preocupao a possibilidade

de que os mesmos possam induzir mecanismos de adaptao nos micro-

organismos, se usados em doses subletais. Assim, o que seria uma medida de


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proteo sade humana, acabaria se tornando fator de risco, por aumentar a

tolerncia desses micro-organismos ao leo essencial.

Em relao aos desinfetantes qumicos utilizados na indstria de

alimentos, estudos mostraram a existncia de cepas de L. monocytogenes j

resistentes a alguns desses agentes, tais quais os compostos quaternrios de

amnio. Porm, em relao aos leos essenciais e aos seus compostos

majoritrios, necessrio avaliar a possibilidade de que bactrias, como L.

monocytogenes, possam desenvolver mecanismos de adaptao, caso os mesmossejam utilizados em doses subletais.

Na cadeia de produo de alimentos, micro-organismos presentes nos

equipamentos podem ser expostos a ambiente cido intracelular, como

determinado por alguns desinfetantes, como medida de combate a seu

crescimento. Acredita-se que condies cidas subletais possam induzir

tolerncia a alguns desses micro-organismos, deixando-os mais resistentes a

medidas posteriores de controle, tolerantes acidez mais severa e tambm a

outros agentes, como os prprios leos essenciais.Os mecanismos de adaptao cruzada so aqueles que conferem, aos

micro-organismos, resistncia a um fator de estresse diferente daquele ao qual

foram submetidos, constituindo, para os seres humanos, outro fator de enorme

preocupao no que concerne ao arsenal de combate desenvolvido contra esses

micro-organismos.

Assim, os leos essenciais constituem possvel meio a ser usado para

inibir o crescimento de micro-organismos contaminantes de alimentos, como L.

monocytogenes. Porm, de suma importncia definir como e em queconcentraes eles devem ser utilizados, afim de que no contribuam para

induo de tolerncia, tanto ao prprio leo essencial quanto cruzada a baixos

valores de pH, que poderiam ser medidas de controle posteriores incluindo, at

mesmo, a acidez encontrada pelos micro-organismos no trato gastrintestinal


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humano, que constitui etapa crucial entre os vrios mecanismos de defesa do

organismo perante a invaso microbiana.

O presente estudo objetivou avaliar o efeito do pH e do leo essencial de

gengibre sobre o crescimento e induo de tolerncia em L. monocytogenes,

assim como avaliar a ocorrncia de adaptao cruzada entre o leo essencial de

gengibre e baixos valores de pH.


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2REFERENCIAL TERICO

2.1Listeriasp.

A anlise taxonmica de Listeria demorou muitos anos para ser

concluda e foi realizada graas a tcnicas de taxonomia numrica, anlises

macromoleculares e, especialmente, estudos da homologia DNA-DNA e do

RNA ribossomal (rRNA) 16S. Baseado na combinao de resultados dediferentes estudos de vrios micro-organismos Grampositivos, utilizando-se a

sequncia do RNA ribossomal (rRNA) 16S,Listeriaest classificada prximo a

Brochothrix e esses dois gneros, juntamente com Staphylococcus e Kurthia,

ocupam uma posio entre o grupo dos Bacillus e dos Lactobacillus/

Streptococcus dentro da ramificao dos Clostridium- Lactobacillus- Bacillus,

sendo a porcentagem de G+C de todos esses membros inferior a 50% (JONES,

1988).

Bactrias do gnero Listeria so bastonetes Gram positivos, aerbiosfacultativos, no formadores de endsporos, que crescem entre temperatura de 0

a 42 C, podendo se multiplicar lentamente em temperatura de refrigerao.

Movimentam-se por flagelos, mas no em todas as temperaturas (FORSYTHE,

2010). Embora a faixa de temperatura de crescimento seja ampla, a temperatura

tima est entre 30 e 37 C. Medem 0,5 a 2,0m de comprimento e 0,5m de

dimetro (JAY, 2005).

De acordo com Jay (2005), so seis espcies caracterizadas pelos seus

antgenos, que determinam 17 sorovares. So elas: L. monocytogenes, L.seeligeri, L. ivanovii, L. welshimeri, L. inoccua e L.grayi (VOLOKHOV, 2002).

H relatos de outras espcies, comoL. marthii (GRAVES, 2010) e L.

rocourtiae (LECLERCQ et al., 2010), isoladas, respectivamente, nos EUA e na

ustria e tambmL. denitrificans(SKERMAN; McGOWAN; SNEATH, 1980),


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L. murrayi (SKERMAN; McGOWAN; SNEATH, 1980), L. fleischmannii

(BERTSCH et al., 2013), L. weihenstephanensis (LANG HALTER;

NEUHAUS; SCHERER, 2013), totalizando 12 espcies descritas.

L. monocytogenes a espcie patognica a humanos e animais.

Ocasionalmente, L. ivanovii patognica a animais, enquanto que as demais

espcies so consideradas no patognicas (BILLE; ROCOURT;

SWAMINATHAN, 1999).

A histria cronolgica deListeriasp. est ilustrada na figura 1.

Figura 1 Datas, eventos e reas de pesquisas relacionacionadas Listeria desdesua descoberta em 1926

Fonte: Cossart e Archambaud (2009)

2.1.1Listeria monocytogenes: patgeno alimentar

Dumont e Cotoni isolaram a bactria L. monocytogenes, pela primeira

vez, em 1918, porm ainda sem saber de qual espcie bacteriana se tratava. No

entanto, apenas em 1940, foi realmente identificada como sendo L.

monocytogenes, no Instituto Pasteur, em Paris (FARBER; PETERKIN, 2000).


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Antes disso, em 1926, Murray e seus colaboradores isolaram um micro-

organismo em forma de bacilo chamando-o de Bacterium monocytogenes e

alguns anos mais tarde, Pirie, isolando uma bactria no Norte da frica,

nomeou-a de Listerella hepatolytica. Em 1940, chegou-se concluso de que

Bacterium monocytogenes e Listerella hepatolytica eram o mesmo micro-

organismo, sendo assim, mudado seu nome para Listeria monocytogenes

(FARBER; PETERKIN, 1991).

Entretanto, passou a ser fonte de preocupao e problema para a sadepblica, indstria alimentar e agncias reguladoras quando, em 1985, foi

identificada como agente causadora de um surto de origem alimentar de grande

repercusso devido ao consumo de um tipo de queijo mexicano (FARBER;

PETERKIN, 2000).

O surgimento repentino da L. monocytogenescomo agente causador de

doena de origem alimentar foi assustador (JAY, 2005).

uma bactria capaz de crescer em ambientes com pH entre 5,6 e 9,6

preferindo, no entanto, pH aproximado de 7,5. capaz de se adaptar a meioscidos e, concomitantemente, desenvolver proteo relativa a outros fatores

adversos, como altas concentraes de sal, sendo que algumas estirpes toleram

uma concentrao de 10% de NaCl (PINTADO, 2009).

Sua mobilidade determinada por 2 a 5 flagelos que se desenvolvem

entre as temperaturas de 20 e 25 C e permitem que a bactria se movimente

para ambiente preferencial quando est sob algum estresse, como nutricional ou

ambiental (SEELIGER; JONES, 1987). A formao desses flagelos inibida a

37 C (FARBER; PETERKIN, 1991). Essas caractersticas e outras, como acapacidade de crescer em faixa ampla de temperatura, em ambientes cidos, na

ausncia ou em baixos nveis de oxignio e sua capacidade de formar biofilmes,

permitem a persistncia e a resistncia desse micro-organismo em ambientes

variados (FARBER; PETERKIN, 2000).


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um parasita intracelular facultativo que pode invadir e se replicar nas

clulas epiteliais e nos macrfagos (DUSSERGET; PIZARRO-CERDA;

COSSART, 2004).

Dos dezessete sorovares caractersticos do gnero, a espcie L.

monocytogenes a que apresenta a maior variedade antignica, totalizando treze

sorovares: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e e 7. Dentre esses

sorovares, alguns so compartilhados com L. inoccua(4ab) e L. seeligeri(1/2b,

4c e 4d). O sorovar 4b frequentemente isolado de produtos crneos e humanos,o 1/2a comum em produtos lcteos e o 1/2b comumente distribudo na

natureza (HOFER; RIBEIRO; FEITOSA, 2000). A tabela 1 representa a

classificao de acordo com as linhagens, sorotipos e associaes com casos de

infeco causada porL. monocytogenes.

Tabela 1 Classificao de L. monocytogenes em linhagens e sorotipos e suaassociao com casos de infeco

Grupos Surtos Potencial PatognicoSorotipos

predominantesLinhagem I Maior nmero de casos Alto 1/2b, 3b, 4b, 4d, 4e

Linhagem II Casos espordicos Mdio 1/2a, 1/2c, 3c

Linhagem III Casos raros Baixo 4a, 4cFonte: Adaptado de Bhunia (2008)

Onze genomas de L. monocytogenes esto, atualmente, disponveis no

National Center of Biotechnology Information - NCBI (2011).

A espcie L. monocytogenes pode sobreviver em condies extremas

encontradas na cadeia de produo de alimentos, como altas concentraes desal e condies extremas de pH e temperatura, caractersticas tambm comuns a

L. innocua, espcie no patognica e frequentemente associada L.

monocytogenes em alimentos e no meio ambiente (GLASER et al., 2001).


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L. monocytogenes ajusta seu metabolismo para resistir aos ambientes

estressantes. Nos alimentos possvel encontrar vrias situaes de estresse,

como frio, calor, acidez, alcalinidade, altas concentraes de sal e agentes

antimicrobianos. Clulas expostas mdia acidez so, subsequentemente,

capazes de resistir alta acidez. Resistncia cruzada tambm comum em

Listeria sp., sendo que a tolerncia cida adquirida pelas clulas aumenta a

resistncia ao calor, comparado s clulas no previamente expostas acidez

(NAJJAR; CHIKINDAS; MONTVILLE, 2009).Qualquer alimento fresco, seja de origem animal ou vegetal, pode

apresentar nmeros variados de L. monocytogenes, sendo que o gnero

amplamente distribudo na natureza e pode ser encontrado em vegetao que

est em decomposio, solos, fezes de animais, silagem, esgoto e gua (JAY,

2005).

Apresentam com maior frequncia a presena deL. monocytogenes: leite

cru, queijos, sorvetes, laticnios de uma forma geral, hortalias, frutas, carnes

frescas, cozidas ou congeladas de vrias espcies animais como aves, bovinos,sunos, caprinos, ovinos e frutos do mar, alm de alimentos prontos para

consumo (BILLE; ROCOURT; SWAMINATHAN, 1999).

2.1.2Anlise do proteoma deListeria monocytogenes

A anlise do genoma comparativo de L. monocytogenes e L. innocua

pelo European Listeria Consortium revelou diferenas considerveis entre as

duas espcies. A diversidade entre as duas espcies manifestou-se nosubproteoma das protenas secretrias e de superfcie. As duas espcies

transportam a mesma quantidade de protenas ao meio extracelular, cerca de 100

protenas para cada uma. Cerca de metade dessas protenas so compartilhadas

por ambas as espcies, sendo que um grupo especfico paraL. monocytogenes


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e outro especfico para L. innocua. Cerca de dezesseis protenas foram

encontradas no sobrenadante de L. monocytogenes, que no tinham genes

ortlogos emL. innocua, sendo essas as protenas de grande interesse, pois todos

os fatores de virulncia conhecidos pertencem a esses grupos (TROST et al.,

2005).

Em estudo realizado por Calvo et al. (2005), a anlise do genoma de L.

monocytogenes e L .innocua revelou grande nmero de genes que codificam

protenas de superfcie presentes na parede celular (41 e 43, respectivamente). Afuno dessas protenas at ento desconhecida e ainda no foram identificadas

bioquimicamente. O estudo realizou a primeira caracterizao do proteoma deL.

monocytogenes usando tcnica no eletrofortica (cromatografia nanolquida

bidimensional acoplada espectrofotometria de massa).

Para Trost et al. (2005),L. monocytogenesexpressa mais protenas para

adaptao a condies atpicas, como a sulfatase/fosfatase Lmo0644 e a suposta

protena especializada ao frio Lmo2016. Protenas da famlia Pur devem ser

melhor investigadas, uma vez que foram especficas de L. monocytogenes emseus estudos. Para esse mesmo autor, sete protenas envolvidas no metabolismo

de carboidratos foram especificamente encontradas no sobrenadante de L.

innocua e no no de L. monocytogenes. Assim, conseguiram mostrar que a

diferena entre as espcies patognicas e no patognicas est no secretoma.

Uma das caractersticas encontradas, exclusivamente, em L.

monocytogenes, a presena das protenas PbpA e MurA/Nam na parede

celular, uma vez que as protenas P60 e P45 so encontradas tanto emL. innocua

quanto em L. monocytogenes. Acredita-se que a presena dessas protenasexclusivas em L. monocytogenes tenha relao com o patogenicidade dessa

espcie aos humanos e a ocorrncia de surtos (CALVO, 2005).


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2.1.3Listeriose

Estima-se que nos EUA, patgenos conhecidos como sendo

transmissores de doenas alimentares sejam responsveis por 9,4 milhes de

casos de doenas anualmente (SCALLAN et al., 2011).

A doena causada pelaL. monocytogenes denominada de listeriose.

uma doena grave e a alta mortalidade, estimada em cerca de 30%, acrescida a

outras caractersticas, faz de L. monocytogenes um patgeno de grandepreocupao em sade e tambm de interesse na indstria de alimentos. Mais de

95% dos casos da doena em seres humanos so causados pelos sorovares 1/2a,

1/2b e 4b (KATHARIOUS, 2002).

Nos Estados Unidos, a listeriose corresponde a menos de 1% dos casos

de doenas alimentares, mas com cerca de 28% de mortalidade (MEAD et al,

1999). A doena pode manifestar-se como gastrenterite, encefalite, meningite,

aborto e infeco perinatal (DUSSURGET; PIZARRO-CERDA; COSSART,

2004). No ano de 2006, foram registrados 138 casos de listeriose nos EUA, comtaxa de incidncia (0,31) superior meta estabelecida pelo pas (0,28), um baixo

nmero se comparado aos 6.665 casos de salmonelose ocorridos no mesmo ano,

porm sempre preocupante devido alta mortalidade (SCALLAN, 2007).

O trato gastrintestinal a principal porta de entrada ao micro-organismo

e a gastroenterite a forma localizada da infeco causada por L.

monocytogenes, podendo ocorrer poucas horas aps a ingesto do alimento

contaminado, acometendo indivduos sadios. A listeriose invasiva, por sua vez,

cursando com comprometimento sistmico, pode ocorrer dias ou semanas aps aingesto e acomete, geralmente, indivduos imunocomprometidos como

gestantes e idosos, podendo causar aborto, bito intrauterino, meningite,

endocardite, pneumonia e septicemia (MONTVILLE; MATTHEWS, 2008).


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A anlise microscpica e o estudo imuno-histoqumico de dez placentas

provenientes de abortos e partos prematuros, coletadas no Hospital das Clnicas

de Porto Alegre em 2000, mostraram que 50% das amostras foram positivas para

L. monocytogenes, demonstrando ser essa bactria uma importante causa de m

evoluo gestacional e que se torna necessrio um eficaz diagnstico e um

rpido tratamento em gestantes, evitando-se as complicaes embrionrias e

fetais (SCHWAB; EDELWEISS, 2003).

Casos de listeriose tm aumentado em muitos pases europeus nosltimos anos, por motivos ainda no totalmente esclarecidos (ALLERBERGER;

WAGNER, 2010). Na Frana, a reemergncia da listeriose tem sido atribuda

maior susceptibilidade de indivduos idosos acima de 60 anos com alguma

comorbidade, tornando-os, assim, mais predispostos a desenvolver a infeco. O

ciclo de infeco e os fatores de virulncia so, hoje, bem caracterizados entre as

espcies, porm isso no tem diminudo ou impedido a reemergncia da

listeriose em muitos pases, nos ltimos anos (RENIER; HEBRAUD;

DESVAUX, 2011).Listeria monocytogenes possui vrias protenas relacionadas sua

patogenicidade, o que a torna um micro-organismo que resiste a vrios fatores

de estresse, facilitando a ocorrncia da listeriose. Cada protena est relacionada

a uma funo, desde sua entrada na clula do hospedeiro, passando pela fuga do

fagossomo, sua movimentao caracterstica dentro da clula, at a migrao de

uma clula a outra. Internalina A (InlA) e internalina B (InlB) foram os

primeiros fatores identificados na invaso de L. monocytogenes clula

hospedeira e assim como outras protenas, como Ami, p60 e FbpA, tm umimportante papel na adeso e invaso clula hospedeira. Listeriolisina O (LLO)

uma protena relacionada ao escape dos vacolos primrio e secundrio, que

funcionam como mecanismos de defesa da clula contra o micro-organismo. J a

protena polimerizadora de actina (ActA) proporciona um rpido movimento


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intracelular, permitindo com que L. monocytogenes se movimente dentro da

clula e migre de uma clula a outra. Assim, vrias so as protenas envolvidas

no ciclo de infeco dentro da clula hospedeira humana e que faz de L.

monocytogenesum micro-organismo capaz de se multiplicar e de crescer, com

eficincia, dentro do organismo hospedeiro (DUSSERGET; PIZARRO-

LACERDA; COSSART, 2004).

Estados Unidos, Frana, Inglaterra e Itlia so pases que j enfrentaram

surtos de listeriose. Entre 1983 e 1995, cerca de 1000 indivduos foramacometidos por listeriose devido ingesto de carne ou leite e seus derivados

contaminados (ROCOUT; COSSART, 1997). No Brasil, no h relatos de

surtos, embora vrias pesquisas j tenham evidenciado a presena de L.

monocytogenes em alimentos (MELLO et al., 2008).

Algumas cepas de L. monocytogenesisoladas de amostras de alimentos

e de ambientes so avirulentas ou fracamente virulentas, alm de apenas alguns

sorotipos serem responsveis pelas infeces ocorrentes. De acordo com vrios

estudos, a porcentagem de cepas no virulentas varia de 1,6 a 90%. Quanto virulncia, aquelas mais citotxicas so eliminadas mais rapidamente do

organismo, por provocar uma resposta imune mais rpida, enquanto as que

causam danos limitados s clulas do hospedeiro podem persistir por mais

tempo, tendo maior chance de atingir outros rgos e causar a doena. Acidez

estomacal, alta osmolaridade e presena de sais biliares no intestino delgado so

fatores que tentam impedir a colonizao do micro-organismo no trato

gastrintestinal humano (CRUZ; MARTINEZ; DESTRO, 2008).

A infeco porL. monocytogenestem sido estudada por mais de 80 anose tem sido paradigma que continua fornecendo novas e importantes percepes

tanto no campo da microbiologia, quanto no da biologia celular e imunologia.

Muitos avanos foram feitos e continuam sendo, principalmente no que

concerne a estudos genmicos e protemicos, para se tentar conhecer melhor a


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patogenicidade e os mecanismos de adaptao que permitem a aquisio de

tolerncia frente a ambientes adversos (STAVRU; ARCHAMBAUD;

COSSART, 2011). Porm, mesmo com os avanos recentes obtidos nos estudos

sobre a listeriose, no foi ainda possvel impedir a reemergncia dessa infeco,

como evidenciado em vrios pases europeus (RENIER; HBRAUD;

DESVAUX, 2011).

Dentre os sorovares deL. monocytogenes, o sorovar 1/2a, que pertence

linhagem filogentica I e os sorovares 1/2b e 4b, que pertencem linhagemfilogentica II, constituem os maiores causadores de infeco nos seres

humanos. Essas duas linhagens apresentaram diferenas quanto expresso dos

genes, mostrando diferenas metablicas importantes entre elas, revelando

formas e mecanismos distintos de interao com o hospedeiro (SEVERINO et

al., 2007).

2.2Resistncia a agentes antibacterianos

de conhecimento que alteraes no metabolismo das bactrias, como o

que ocorre na formao de biofilme e na adaptao frente a situaes de estresse,

modulam sua susceptibilidade s drogas antibacterianas, indicando que existe

ligao entre o metabolismo da bactria e a resistncia a drogas antimicrobianas

(MARTINEZ; ROJO, 2011).

De acordo com Forattini (2001), os milhes de anos de embate entre

micro-organismos e o homem influenciaram na evoluo da resistncia deste.

Assim, no hospedeiro, o sistema imunolgico, as mensagens enviadas aossensores moleculares e a atividade hormonal tenderam a minimizar a ao dos

parasitos, ao mesmo tempo em que os parasitas tambm sofreram mudanas com

o objetivo de torn-los mais resistentes aos ambientes hostis do hospedeiro.


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O determinismo da resistncia bacteriana a drogas e da virulncia pode

estar ligado variabilidade gentica e evoluo da espcie, favorecendo a

adaptao dos micro-organismos sobreviventes, podendo, assim, vencer as

barreiras do hospedeiro (MALMSTRO; MALMSTRO; AEBERSOLD, 2011).

Martinez e Rojo (2011) explicam que a susceptibilidade a

antibacterianos pode ser modulada pela inativao de genes envolvidos no

metabolismo bacteriano e tambm por reguladores globais do metabolismo do

carbono e do nitrognio.Em relao a mecanismos de adaptao e consequente evoluo, a

duplicao de genes um processo evolutivo normal em micro-organismos,

sendo o gene duplicado, geralmente, reduzido a pseudogene, desaparecendo do

genoma. Porm, alguns parlogos so retidos para beneficiar o organismo em

processo de adaptao a determinadas condies ambientais, sendo associados

sntese de energia, motilidade celular, transporte de ons e a mecanismos de

defesa (BRATLIE et al., 2010).

A resistncia, que tambm pode ser transferida entre espcies, pode sermediada por elementos genticos mveis, como plasmdeos e transposons

tambm por bombas de efluxo, como ocorre em L. monocytogenes. Assim, a

resistncia pode ocorrer por conjugao ou pelo mecanismo das bombas de

efluxo. O trato gastrintestinal humano mostrou-se local de transmisso de genes

de resistncia enterococos e estreptococos para L. monocytogenes (LUNGU et

al., 2011).

Shin et al. (2010) observaram que a atividade da protena sigma , emL.

monocytogenes, induzida aps adio do antibitico vancomicina (antibiticoglicopeptdeo que inibe a sntese de parede celular, podendo causar lise osmtica

da clula), sugerindo contribuio dessa protena na manuteno da integridade

da parede celular.


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Estudo publicado por Aarestrup, Knochek e Hasman (2007), avaliando a

concentrao inibitria mnima (CIM) de vrios antibiticos e agentes

sanitizantes sobre cepas de L. monocytogenes isoladas de alimentos, mostrou

possvel resistncia intrnseca da bactria ao antibitico ceftiofur, uma

cefalosporina de terceira gerao. Nove dos 114 isolados, todos de produtos

crneos, mostraram susceptibilidade reduzida ao cloreto de benzalcnio.

Lungu et al. (2011) relataram que o aumento da resistncia a antibiticos

em L. monocytogenes tem ocorrido no mundo, talvez devido ao seu usoindiscriminado na agricultura e ao uso indevido em seres humanos nos

tratamentos de processos infecciosos. Reduzindo-se o uso excessivo, reduz-se a

emergncia de mais bactrias resistentes, porm aquelas que j so resistentes

desaparecem em velocidade bem mais lenta do que a descoberta de novos

antibiticos. Novas alternativas precisam ser criadas para se impedir o aumento

das infeces causadas porL. monocytogenesde origem alimentar, uma vez que

a resistncia a antibiticos algo real e preocupante.

Em parte, como resposta ao aumento da resistncia antibacteriana nosmicro-organismos presentes nos alimentos, a Unio Europeia baniu o uso de

antibiticos como aditivos alimentares animais, com exceo dos

coccidiostticos, desde janeiro de 2006 (CASTANON, 2007).

2.3Agentes antimicrobianos

A emergncia de micro-organismos com resistncia combinada aos

antimicrobianos e aos desinfetantes um desafio tanto para a indstria dealimentos quanto para a rea mdica. A presena de determinantes de resistncia

aos antibiticos, intimamente ligados aos determinantes de resistncia aos

desinfetantes, pode levar cosseleo durante a desinfeco ou terapia com

antibiticos em hospital ou durante desinfeco na indstria de alimentos. Essa


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resistncia bacteriana aos desinfetantes pode ser intrnseca ou extrnseca por

adaptao (SIDHU; SORUM; HOLCK, 2002).

2.3.1Desinfetantes qumicos

Desinfetantes qumicos so usados, extensivamente, em indstrias de

alimentos, hospitais e residncias, fazendo parte essencial do controle de

crescimento microbiano e da ocorrncia de infeces. De acordo comMcDonnell e Russell (1999), do ponto de vista conceitual, biocida um termo

geral destinado a caracterizar um agente qumico de amplo espectro que objetiva

inativao de um micro-organismo, seja inibindo seu crescimento ou levando a

sua morte. Antisspticos so definidos como biocidas que destroem ou inibem o

crescimento de micro-organismos em tecidos vivos e desinfetantes so similares,

porm so utilizados, geralmente, em objetos ou superfcies. J os antibiticos

so definidos como substncias naturais ou substncias orgnicas sintticas que

agem inibindo ou destruindo, seletivamente, uma bactria ou outro micro-organismo.

Desinfetantes qumicos tm sido utilizados por mais de cem anos pela

sociedade, fornecendo inmeros benefcios no controle do crescimento de

micro-organismos, tanto no processamento de alimentos quanto na rea mdica.

So, geralmente, usados em altas concentraes, diferentemente dos antibiticos,

que so utilizados em concentraes prximas concentrao mnima inibitria

(KASTBJERG; GRAM, 2012).

A resistncia aos desinfetantes qumicos ocorre, principalmente, devido desinfeco inadequada que pode levar resistncia como o resultado do

processo de seleo ou devido exposio regular a concentraes subletais do

desinfetante (AASE, 2000). Estudos mostraram que bactrias Grampositivas,

comoL. monocytogenes,j apresentam resistncia a alguns desses agentes, tais


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quais os compostos quaternrios de amnio (AASE et al., 2000; HEIR et al.,

1995; SIDHU et al., 2001; SIDHU; LANGSRUD; HOLCK, 2001).

Quanto aos mecanismos de ao, pode-se citar a desestruturao da

membrana plasmtica, a dissipao da fora prton motiva, as interaes com

sistemas enzimticos, cidos nucleicos, ribossomos ou outros constituintes

celulares. A tolerncia bacteriana aos biocidas pode ser devido resistncia

intrnseca ou a fatores adquiridos (MORENTE, 2013).

2.3.1.1Compostos quaternrios de amnio

A atividade antimicrobiana dos compostos quaternrios de amnio foi

descoberta em 1935 e a partir da passaram a ter grande importncia comercial.

Os mais comumente utilizados como antisspticos e desinfetantes so os sais de

monoalquil trimetil amnio, monoalquil dimetil benzil amnio (cloreto de

benzalcnio) e o amnio heteroaromtico, entre outros. So amplamente

utilizados na indstria de alimentos como desinfetantes de uso geral, pela baixatoxicidade, baixa ao corrosiva e ao surfactante e tambm como sanificantes

de pisos, paredes, equipamentos e utenslios. Penetra bem em superfcies

porosas formando um filme bacteriosttico sobre a superfcie. aceito que

atuem principalmente na membrana citoplasmtica, causando alterao

estrutural e perda na sua integridade, junto ao extravasamento de componentes

celulares devido ao rompimento da membrana, alm de desnaturao de

protenas e de enzimas (MIYAGI; TIMENETSKY; ALTERTHUM, 2000).

A resistncia a compostos quaternrios de amnio j foi comprovada embactrias Grampositivas e negativas, determinada por alteraes na membrana

celular. EmL. monocytogenes, as bombas de efluxo MdrL e a Lde parecem estar

associadas resistncia a mltiplas drogas. Assim, quando presso seletiva

aplicada, mutantes com alta concentrao dessas bombas sero selecionados,


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reforando o processo adaptativo com aquisio de resistncia. Foi demonstrado

que mecanismo de bomba de efluxo similar pode ser induzido pelo cloreto de

benzalcnio em certas cepas deL. monocytogenes(ROMANOVA et al., 2006).

Vrios trabalhos evidenciaram resistncia a compostos quaternrios de

amnio em vrios micro-organismos associados aos alimentos, como L.

monocytogenes, estafilococos e lactobacilos (AASE et al., 2000; HEIR et al.,

2004; SIDHU et al., 2001, SIDHU; LANGSRUD; HOLCK 2001).

2.3.2leos essenciais

Devido ao atual problema da resistncia bacteriana a agentes

antimicrobianos, as empresas farmacuticas tm aumentado o interesse pela

busca de novas substncias a partir de produtos naturais, principalmente em

espcies de plantas utilizadas na medicina popular, no combate a diversas

doenas, tais como resfriados, bronquites, doenas respiratrias, gastrenterites,

diarreias, infeces urinrias, entre outras. Com base nesse interesse, vriosestudos e pesquisas com leos essenciais tm sido desenvolvidos (DIAS, 2009).

2.3.2.1Definio e composio

Os leos essenciais so compostos metablicos secundrios. Existem,

basicamente, dois tipos de compostos metablicos: queles originados do

metabolismo primrio e os originados do metabolismo secundrio. Os

compostos metablicos primrios so os relacionados, diretamente, com asobrevivncia do organismo, ou seja, com as funes vitais como crescimento e

reproduo. Os compostos metablicos secundrios so os relacionados,

principalmente, defesa do organismo, sendo assim ligados, de maneira indireta,

sobrevivncia. So utilizados, nesse contexto, para atrair outras espcies ou


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para se defender de predadores (SANTOS, 2007) e so produzidos em processos

como fotossntese, respirao, transporte de solutos, translocao, assimilao,

diferenciao ou sntese de carboidratos, protenas e lipdeos (GUIMARES,

2007).

A Resoluo RDC n 2, de 15 de janeiro de 2007, conceitua os leos

essenciais como produtos volteis de origem vegetal, obtidos por processo fsico

(destilao por arraste com vapor-dgua, destilao presso reduzida ou outro

mtodo adequado) (AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA -ANVISA, 2007). So definidos, pela International Standard Organization

(ISO), como produtos obtidos de partes das plantas, atravs da destilao por

arraste com vapor-dgua, bem como produtos obtidos pela expresso de

pericarpos de frutos ctricos. So citadas, na literatura, outras tcnicas de

extrao de compostos volteis como hidrodestilao, enflorao (enfleurage) e

utilizao de COsupercrtico.

De acordo com Simes et al. (2007), leos essenciais so misturas

complexas de compostos que conferem aromas agradveis e sabores

caractersticos. Em sua maioria, so instveis, especialmente na presena de luz,

calor, umidade, ar e metais. Sua sntese e composio em plantas so

influenciadas pelo gentipo, pelo estgio de desenvolvimento da planta e pelas

condies ambientais (GOBBO NETO; LOPES, 2007).

Os leos essenciais constituem-se de mistura de hidrocarbonetos,

lcoois, cetonas, aldedos, fenis, steres, teres, xidos, perxidos e outros

compostos, em maior ou menor proporo, de acordo com a parte da planta do


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qual foram extrados e de acordo com o mtodo de extrao (OUSSALAH et al.,

2007).

Condies ambientais como temperatura, umidade relativa, perodo de

exposio ao sol e regime de ventos exercem influncia direta sobre a

composio dos leos essenciais, sobretudo sobre as espcies que possuem

estruturas de estocagem de leo essencial em sua superfcie (SALGADO, 2005).

Os leos essenciais podem estar localizados em estruturas secretoras

especializadas, tais como pelos glandulares, clulas parenquimticasdiferenciadas, canais oleferos ou em bolsas lisgenas ou esquisolsigenas. Das

plantas, podem ser extrados do todo ou apenas de alguma parte, como raiz,

caule, casca, sementes, folhas ou frutos, sendo o mtodo de extrao utilizado

varivel de acordo com a parte em questo (OUSSALAH et al., 2007).

A composio do leo essencial varia em funo do mtodo de extrao

utilizado devido grande labilidade dos seus constituintes. So compostos

principalmente por terpenoides, destacando-se os mono e sesquiterpenos e por

fenilpropanoides, metablitos que conferem suas caractersticas organolpticas.Os terpenoides constituem o principal grupo encontrado na constituio dos

leos essenciais, sendo formados pela unio de unidades isoprnicas, que so

unidades formadas por cinco tomos de carbono (-C5H8). De acordo com o

nmero de unidades isoprnicas, os terpenos podem se classificar em hemi,

mono, di, tri, tetra e sesquiterpenos, principalmente. Os monoterpenos so

substncias volteis pela sua baixa massa molecular, podendo ocorrer nas

clulas parenquimticas diferenciadas, canais oleferos, pelos glandulares e

bolsas lisgenas (SIMES et al., 2007).Os monoterpenos, formados por duas unidades isoprnicas, possui 10

tomos de carbono e o composto encontrado em mais de 90% dos leos

essenciais (BAKKALI et al., 2008).

A figura 2 ilustra os principais componentes dos leos essenciais.


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Figura 2 Principais constituintes dos leos essenciaisFonte: Bakkali et al. (2008)


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Bizzo (2009) cita que h 300 leos essenciais de importncia comercial

no mundo. Os 18 principais podem ser vistos na Tabela abaixo:

Tabela 2 Os principais leos essenciais no mercado mundialleo essencial Espcie

Laranja (Brasil) Citrus sinensis (L.) Osbeck

Menta japonesa(ndia)

Mentha arvensis L. f.piperascens Malinv. ex Holmes

Eucalipto (tipo cineol)Eucalyptus globulus Labill.,E. polybractea R.T. Baker eEucalyptus spp.

Citronela Cymbopogon winterianus Jowitt e C. nardus (L.) Rendle

Hortel-pimenta Mentha xpiperita L.

Limo Citrus limon (L.) N.L. Burm.

Eucalipto (tipocitronela)

Eucalyptus citriodora Hook.

Cravo-da-ndia Syzygium aromaticum (L.) Merr. e L. M. Perry

Cedro (EUA) Juniperus virginiana L. eJ. ashei Buchholz

Lima destilada(Brasil)

Citrus aurantifolia (Christm. & Panz.) Swingle

Spearmint (nativa) Mentha spicata L.Cedro (China) Chamaecyparis funebris (Endl.) Franco

Lavandim Lavandula intermedia Emeric ex Loisel

Sassafrs (China) Cinnamomum micranthum (Hayata) Hayata

Cnfora Cinnamomum camphora (L.) J. Presl.

Coentro Coriandrum sativum L.

Grapefruit Citrus paradisi Macfady

Patchouli Pogostemon cablin (Blanco) Benth.

Fonte: Bizzo (2009)

2.3.2.2Biossntese

A origem de todos os metablitos secundrios pode ser resumida a partir

do metabolismo da glicose, via dos intermedirios principais: o cido


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chiqumico e o acetato. O cido chiqumico d origem aos aminocidos

aromticos, precursores da maioria dos metablitos secundrios aromticos, tais

como taninos hidrolisveis, alcaloides derivados dos aminocidos aromticos

(triptofano e fenilalanima/ tirosina) e os fenilpropanoides.

A combinao de uma unidade de cido chiqumico e uma ou mais

unidades de acetato origina as antraquinonas, flavonoides e os taninos

condensados. Os derivados do acetato podem ser produzidos pela via ciclo do

cido ctrico, dando origem aos alcaloides derivados dos aminocidos alifticos,ornitina e lisina, e aos glicosdeos e glicosinolatos; pela via do mevalonato,

originam os derivados do isopreno e, pela condensao da acetil CoA, formam-

se os cidos graxos e acetogeninas (SIMES et al., 2007).

2.3.2.3Propriedades dos leos essenciais

Pereira et al. (2004) relataram que plantas, condimentos e seus leos

essenciais tm sido estudados devido a suas propriedades antimicrobianas emmicro-organismos patognicos presentes em alimentos, sendo que os princpios

ativos antimicrobianos encontram-se no leo essencial e que o mecanismo

inibitrio sobre o micro-organismo depende da natureza do composto.

Em amplo trabalho de reviso sobre as propriedades dos leos

essenciais, Edris (2007) relatou o efeito benfico contra o cncer, aes

benficas no sistema cardiovascular, ao antibacteriana, antiviral, antioxidante

e antidiabetognica, alm do uso em aromaterapia e massagens.

Estudos mostram que os compostos majoritrios, grupo de um a trscomponentes principais dos leos essenciais (BAKKALI et al., 2008) tm,

geralmente, maior poder inibitrio se usado isoladamente, comparando-se ao

prprio leo essencial do qual faz parte, sobre determinados micro-organismos.

Isso ocorre devido ao uso em alta concentrao. Aldedo cinmico e eugenol,


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compostos majoritrios de leos essenciais de canela e cravo, respectivamente,

obtiveram melhor atividade antimicrobiana, em certos micro-organismos, do que

seus leos essenciais (DIAS, 2009).

2.3.2.4Mecanismos de ao antibacteriana

Os leos essenciais so lipoflicos, penetrando o envelope celular e

membrana citoplasmtica, destruindo a camada de polissacardeos, cidosgraxos e fosfolpides, alterando sua permeabilidade. Em bactrias, a alterao da

permeabilidade leva perda de ons com perda do potencial de membrana,

colapso da bomba de prtons e depleo de ATP, coagulao citoplasmtica e

clivagem de macromolculas. Essa citotoxicidade dos leos essenciais confere

ao antimicrobiana e tem uso promissor (SOLOMAKOS et al., 2008).

Moreira et al. (2005), afirmam que os compostos fenlicos dos leos

essenciais se ligam bicamada fosfolipdica da membrana celular aumentando

sua permeabilidade e extravasando os constituintes intracelulares ou danificandoo sistema enzimtico da clula. Souza et al. (2010) afirmam que mesmo

pequenas mudanas ocorridas na estrutura da membrana citoplasmtica podem

afetar o metabolismo, incluindo a sntese de macromolculas.

Estudos mostram que bactrias Grampositivas so mais susceptveis aos

leos essenciais do que as Gram negativas (BURT, 2004; HUSSAIN et al.,

2010; INOUYE; TAKIZAWA; YAMAGUCHI, 2001; SAHIN et al., 2004;

SMITH-PALMER; STEWART; FYFE, 1998) e essa menor atividade contra

Gram negativas pode ser devido estrutura de sua parede celular,principalmente devido presena de lipoprotenas e lipopolissacardeos, que

funcionam como barreira aos compostos hidrofbicos (INOUYE;

TAKIZAWA; YAMAGUCHI, 2001; MANN; COX; MARKHAM, 2000).


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Andrade et al. (2012) avaliaram a ao anti-bacteriana dos leos

essenciais de citronela, canela e gengibre sobre Staphylococcus aureus,Listeria

monocytogenes ATCC 19117, Escherichia coli, Salmonella cholerasuis e

Pseudomonas aeruginos, observando que o leo essencial de canela foi o mais

efetivo em inibir o crescimento bacteriano e essa alta atividade deve-se,

provavelmente, alta concentrao do composto majoritrio aldedo cinmico,

sendo o mecanismo de ao, talvez, semelhante ao de outros aldedos,

envolvendo danos a lipdeos e protenas.A figura 3 ilustra locais e mecanismos de ao dos leos essenciais na

clula bacteriana.

Figura 3 Stios e mecanismos de ao dos leos essenciais na clula bacterianaFonte: Modificado de Burt (2004)

2.3.2.5leo essencial de gengibre

O gengibre (Zingiber officinale), especiaria muito utilizada em

alimentos, reconhecido por suas propriedades curativas na medicina

tradicional. Tem ao comprovada em vrias doenas gastrintestinais, como


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nuseas, vmitos, desconfortos abdominais e diarreia, no tratamento de artrite,

reumatismo, dor, desconforto muscular e vrias doenas cardiovasculares e

metablicas. Alm dessas, estudos mostram que o gengibre apresenta ao

anticancergena em grande variedade de modelos experimentais

(TUNTIWECHAPIKUL et al., 2010).

Os chineses tm usado o gengibre por pelo menos 2500 anos para

tratamento de diversas desordens, principalmente do trato gastrintestinal, trato

respiratrio e tambm frente a afeces sanguneas. Na Malsia e Indonsia,sopa de gengibre dada s mulheres por cerca de um ms aps o parto, para

ajudar a aquec-las e eliminar as impurezas. Na medicina rabe utilizado como

afrodisaco e alguns pases africanos o usam como repelente de mosquito. Foi

distribudo pelos continentes na poca das grandes navegaes e com o

comrcio de especiarias (DUKE; AYENSU, 1985).

Os constituintes mais ativos do gengibre residem nos seus leos volteis,

que perfazem o total de 1-3% de seu peso seco. O leo essencial do gengibre

encontrado, principalmente, no rizoma. Os principais compostos qumicos ativosdo gengibre so os compostos fenlicos e sesquiterpenos, sendo tambm

constitudos por cetonas, cidos e vrios outros (NEWALL; ANDERSON;

PHILLIPSON, 1996). Cerca de 50 componentes presentes no leo j foram

caracterizados, sendo a maioria monoterpenos (EVANS; SAUNDERS, 2002).

Machado et al. (2003) observaram nos sistemas de produo orgnico e

convencional do gengibre produzido em Morretes, os seguintes constituintes,

respectivamente: -zingibereno (20,6%; 24,3%), geranial (21,6%; 17,7%), -

sesquifelandreno (8,5%; 11%), -farneseno (6,9%; 8%), cineol (6,0%; 7%),neral (8,2%; 4,9%), geraniol (4,5%; 6,9%) e -curcumeno (6,0%; 0,0%). Jolad

(2005), avaliando a composio do leo essencial de gengibre produzido no

Hava, verificou a presena de 63 constituintes, os quais tm sido utilizados

farmacologicamente com sucesso nos tratamentos de inflamaes crnicas,


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obstrues pulmonares, asma e artrites reumatoides. Segundo Sakamura (1987),

durante seu armazenamento ocorre cerca de 60% de aumento dos teores dos

constituintes neral e geranial e decrscimo de geraniol e acetato de geranila.

Dabague et al. (2011) concluram que o teor dos constituintes

majoritrios do leo essencial de rizomas de gengibre de diferentes procedncias

foram o geranial (23,6 a 30,3%); neral (10 a 14,8%); geraniol (5,8 a 7,6%);

acetato de geranila (3,5 a 4,5%); eucaliptol (3,6 a 5,9%); canfeno (2,8 a 5,8%),

zingibereno (2,3 a 5%); -felandreno (0,5 a 4%) e -bisaboleno (2,8-3,4%).Mostraram tambm que o teor de leos essenciais reduziu com o perodo de

secagem. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que altos teores de

citral (geranial e neral) so observados no leo essencial de rizomas aps

secagem. Maiores nveis desses constituintes so de interesse comercial para as

indstrias de aroma e fragrncia (WOHLMUTH et al., 2006) e, portanto, a

secagem de rizomas em temperatura ambiente pode aumentar o valor comercial

do leo essencial. Observaram que os teores de geranial e neral foram superiores

enquanto os teores de -zingibereno foram inferiores comparados aos resultadosobtidos por Machado et al. (2003).

Smith-Palmer, Stewart e Fyfe (1998) mostraram em trabalho o qual

avaliou a inibio do crescimento de cinco importantes patgenos alimentares

(Campylobacter jejuni, Salmonella Enteritidis, Escherichia coli, Staphylococcus

aureus eListeria monocytogenes), por leos essenciais de 21 plantas, que o leo

essencial de gengibre inibiu o crescimento de L. monocytogenes em

concentraes maiores que 1%, o que foi maior que as concentraes de cravo e

de canela necessrias inibio, as quais se mostraram eficazes entre 0-0,3%.


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2.4Resposta deL. monocytogenesao estresse cido

Juntamente com a desinfeco, a acidificao um importante

mecanismo de controle do crescimento de micro-organismos no processamento

de alimentos. No entanto, relatado que os microrganismos podem desenvolver

resistncia aumentada ao estresse cido quando expostos a condies cidas

subletais (LEENANON; DRAKE, 2001; TIWARI et al., 2004)

O estresse cido no qual a L. monocytogenes est envolvida inclui oscidos orgnicos usados como conservantes e desinfetantes na indstria de

alimentos e tambm os cidos inorgnicos encontrados no trato gastrintestinal de

hospedeiros (SONI; NANNAPANENI; TASARA, 2011).

Nas etapas de processamento de alimentos, desinfetantes qumicos so

usados em superfcies que entram em contato com o alimento em cozinhas,

centros de cuidados e em reas de preparao de frmulas alimentares em

hospitais (MARRIOTT; GRAVANI, 2006).

O mecanismo da resposta de tolerncia cida desenvolvido pordeterminadas bactrias constitui srio problema para a sade pblica, pois

aumenta a capacidade de sobrevivncia do micro-organismo sob condies

cidas letais em habitats naturais, alimentos e hospedeiros, aumentando dessa

forma, a virulncia dessas estirpes (BONNET; MONTVILLE, 2005).

Foi mostrado, por Lin, Lee e Chou (2011), que cepas de L.

monocytogenestiveram sua resistncia aumentada a agentes desinfetantes base

de cloro e composto quaternrio de amnio, quando expostas previamente a

ambientes cidos, mostrando resposta de adaptao acidez a qual foramsubmetidas.

O perfil das protenas do estresse cido indica que protenas envolvidas

na respirao, transporte de osmlitos, resistncia ao estresse, reparo de

protenas, sntese de flagelo e metabolismo so recrutados como parte da


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resposta ao estresse. A permeabilidade da clula a prtons envolve alterao da

composio da membrana citoplasmtica. A induo de desidrogenases,

redutases e enzimas respiratrias foram tambm associadas ao estresse cido,

como mecanismo adaptativo ao estresse que envolve o efluxo de prtons

(CACACE et al., 2010; COTTER; GAHAN; HILL, 2000).

O gene Sigma coordena a transcrio de genes relacionados resposta

ao estresse geral. Mutantes de L. monocytogenes que perderam o gene Sigma

tm variedade de fentipos de sensibilidade ao estresse como o baixo pH,estresse osmtico, salinidade, bacteriocinas, alta presso hidrosttica, limitao

de carbono e alta temperatura (ABRAM et al., 2008). O regulador de estresse

geral Sigma , presente em muitas bactrias Gram positivas, mostrou-se

responsvel pela sobrevivncia de cepas bacterianas aps exposio a situaes

de estresse cido, oxidativo e energtico (OLIVER et al., 2010).

O gene lmo0038est envolvido no crescimento deL. monocytogenesem

situaes de estresse, como em ambientes com acidez ou calor e tambm est

relacionado sua virulncia. Estudo feito por Chen et al. (2009) comprovou queo gene lmo0038 especfico para L. monocytogenes linhagens I e II e L.

ivanovii, que so patognicas, sendo ausentes emL. monocytogenes linhagem III

a qual, raramente, est associada a infeces nos seres humano.

Quando expostas mdia acidez (pH 5,5), clulas de L. monocytogenes

tornaram-se capazes de crescer em acidez severa (pH 3,5), devido ao mecanismo

denominado de resposta de tolerncia cida (Acid Tolerance Response: ATR).

Quando expostas a estresse cido, clulas de L. monocytogenes alteraram sua

fluidez de membrana e incorporaram mais cidos graxos de cadeia linear emenos cidos graxos de cadeia ramificada em sua bicamada lipdica, o oposto

acontecendo quando foram submetidas a condies alcalinas. Quando expostas

acidez tornaram-se, fenotipicamente, ATR (+) e tiveram aumento de sua


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resistncia ao calor relativo s clulas que no foram previamente expostas

acidez (NAJJAR; CHIKINDAS; MONTVILLE, 2009).

Em estudo feito por Mastronicolis et al. (2010), onde foi avaliado o

efeito do estresse cido sobre a composio lipdica deL. monocytogenes em pH

5,5, os mecanismos de adaptao da bactria ocasionaram aumento dos cidos

graxos de cadeia curta saturados e aumento da porcentagem de lipdeos neutros,

com consequente reduo da permeabilidade da membrana. Na presena de

cido benzoico, em pH neutro, alterao similar ocorreu com os cidos graxos enenhuma alterao com os lipdeos neutros, porm, houve reduo na

quantidade relativa de fosfolpides o que determinou diminuio da

permeabilidade de membrana.

Estudos mostram que o cido lctico, quando usado para induzir a

resposta de tolerncia cida em bactrias em meio BHI (Brain Heart Infusion),

reduz a densidade celular medida que se reduz o pH. O pH de 5,5 foi o valor

mais baixo de viabilidade, no havendo crescimento em pH 5 nas clulas que

no foram submetidas ao estresse cido, sendo chamadas ATR (-). Houveviabilidade em pH de 3,5 apenas naquelas expostas a um pH anterior de 5,5,

tendo sido induzida, nessas clulas, a resposta de tolerncia cida (NAJJAR;

CHIKINDAS; MONTVILLE, 2009).

2.5Adaptao cruzada

Foi mostrado, em estudos, que a exposio de L. monocytogenes a

estresse subletal induz o desenvolvimento e crescimento do micro-organismocondicionado ao estresse, que fisiologicamente mais tolerante a nveis

aumentados do mesmo ou de diferentes fatores estressantes. Como exemplo,

clulas bacterianas de L. monocytogenes expostas a estresse cido subletal

apresentam resistncia aumentada a nveis maiores de estresse cido e tornam-se


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mais tolerantes ao estresse trmico e osmtico (GAHAN; O DRISCOLL; HILL,

1996).

Resistncia cruzada pode ocorrer quando diferentes agentes

antimicrobianos atacam o mesmo alvo na clula, atingem rota comum de acesso

aos respectivos alvos ou iniciam via comum para a morte celular, ou seja, o

mecanismo de resistncia o mesmo para mais de um agente antibacteriano. J

a corresistncia ocorre quando os genes que especificam fentipos resistentes

esto localizados juntos em plasmdeo ou em outro elemento gentico mvel,como transposon ou integron, sendo assim, mais de um mecanismo de

resistncia esto envolvidos na determinao da resistncia aos antibacterianos

(CHAPMAN, 2003).

Listeria monocytogenes isoladas da cadeia de produo de alimentos

apresentaram resistncia ou susceptibilidade antibacteriana diminuda a

antibiticos para os quais a bactria apresenta, normalmente, sensibilidade.

Apesar de no ter sido observado resistncia aos antibiticos, normalmente

usados no tratamento da listeriose, algumas cepas isoladas, incluindo ossorovares 1/2a e 4b, relacionados listeriose, apresentaram resistncia a

determinados antibiticos. Algumas cepas tiveram a concentrao mnima

inibitria de cloreto de benzalcnio aumentada quando expostas, previamente,

ao antibitico ciprofloxacin (KOVACEVIC, 2013).

Desinfetantes qumicos so muito usados na indstria de alimentos. Os

mecanismos de resistncia cruzada a antibiticos, nas bactrias resistentes a

desinfetantes, so alvo de inmeros estudos. Os desinfetantes mais estudados so

os compostos quaternrios de amnio e o perxido de hidrognio, sendo que aresistncia aos quaternrios de amnio acompanhada pela expresso de

bombas de efluxo e outros mecanismos menos especficos (CHAPMAN, 2003).


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3MATERIAL E MTODOS

3.1Micro-organismo e cultura estoque

As cepas bacterianas utilizadas foram Listeria monocytogenes ATCC

19117 sorotipo 4d e Listeria monocytogenes ATCC 7644 sorotipo 1/2c,

adquiridas da Seo de Coleo de Culturas da Diviso de Biologia Mdica do

Instituto Adolfo Lutz (So Paulo-SP).A cultura estoque foi mantida congelada em caldo triptona de soja

acrescentado de 0,6% (m/v) de extrato de levedura (TSB-YE) e 20% de glicerol.

3.2leo essencial

O leo essencial de gengibre (Zingiber officinale) foi adquirido na

empresa FERQUIMA Indstria e Comrcio Ltda.

3.3Preparo e padronizao do inculo

A reativao da cepa foi realizada inoculando-se alquota de 1 mL da

cultura estoque em tubo de ensaio contendo 10 mL de TSB-YE, sendo incubado

a 37C por 24 horas.


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Aps esse perodo, alquota de 100L da cultura foi transferida para

150mL de TSB-YE e incubada a 37C at a obteno de cerca de 10UFC/mL

(D0 nm= 0,305).

A padronizao do inculo foi realizada por meio da elaborao de

curva de crescimento. O crescimento do micro-organismo foi monitorado por

espectrometria por meio da densidade tica a 600nm e contagem direta em

placas contendo gar triptona de soja acrescido de 0,6% de extrato de levedura

(TSA-YE).

3.4Determinao do pH mnimo de crescimento e mnimo inibitrio de L.

monocytogenes

A influncia do pH no crescimento deL. monocytogenes foi avaliada em

microplacas de poliestireno de 96 cavidades. Em cada cavidade, foram

dispensados 140L de TSB-YE, com pH ajustado com cido clordrico para 7,0;

6,5; 6,0; 5,5; 5,0; 4,5; 4,0 e 3,5. O mesmo procedimento foi realizado, em outra

microplaca, porm, ajustando-se o pH com cido ctrico. Aps adio do meio

de cultura e ajustados os valores de pH, 10L de cultura padronizada foram

adicionadas em cada poo. Foi lida a absorbncia a 600nm em leitor de

microplacas (Anthos 2010) antes e depois da incubao por 24 horas, a 37C. O


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pH mnimo inibitrio foi o menor valor capaz de inibir, completamente, o

crescimento bacteriano. O pH mnimo de crescimento foi aquele imediatamente

acima do pH mnimo inibitrio.

3.5Induo da resposta de tolerncia cida

Aps ser determinado o pH mnimo de crescimento, o pH 5,5 (valor

acima do mnimo de crescimento) foi utilizado para avaliar a induo daresposta de tolerncia cida. Em tubo tipo Falcon contendo TSB-YE com pH

5,5, foi adicionado alquota de cultura padronizada, obtendo-se a concentrao

final de 10UFC/mL. A cultura foi incubada a 37C por uma hora (NAJJAR;

CHIKINDAS; MONTVILLE, 2009). Aps esse perodo, alquotas de 1 mL

foram transferidas para microtubos e centrifugadas (10000xg/ 10 minutos) e as

clulas recuperadas. Essas foram ressuspendidas em TSB-YE e foi lida a

absorbncia.

Utilizando-se microplacas, em cada cavidade foram dispensados 140Lde TSB-YE, com pH ajustado com cido clordrico para 7,0; 6,5; 6,0; 5,5; 5,0;

4,5; 4,0 e 3,5. O mesmo procedimento foi realizado, em outra microplaca,

porm, ajustando-se o pH com cido ctrico. Aps adio do meio de cultura e

ajustados os valores de pH, 10L da cultura previamente exposta ao pH 5,5

foram adicionados em cada poo. Foi lida a absorbncia a 600nm em leitor de

microplacas (Anthos 2010) antes e depois da incubao por 24 horas, a 37C.

3.6 Determinao da Concentrao Mnima Inibitria (CMI) de leoessencial de gengibre

Foi utilizada a tcnica de microdiluio em caldo TSB-YE, em

microplacas de poliestireno de 96 cavidades com concentraes padronizadas de


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25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78 e 0,39% de leo essencial de gengibre. A

homogeneizao do leo essencial de gengibre com o meio de cultivo foi

realizada pela adio de 0,5% (v/v) de Tween 80, atingindo-se o volume de

140L em cada cavidade. Alquota de 10L da cultura padronizada (10

UFC/mL) foi adicionada a cada cavidade. Para cada concentrao, cavidades

contendo o meio de cultura e o agente antibacteriano foram preparadas sem

adio do inculo bacteriano. As microplacas foram incubadas a 37C por 24

horas. A absorbncia a 600nm em leitor de microplacas (Anthos 2010) foi lida

antes e depois da incubao. A CMI foi a menor concentrao de leo essencial

de gengibre capaz de inibir, completamente, o crescimento bacteriano.

Como controle negativo, foi utilizado o composto quaternrio de amnio

com CMI de 1%, segundo recomendao do fabricante.3.7 Induo de tolerncia ao leo essencial de gengibre e ao composto

quaternrio de amnio

Para se induzir a tolerncia ao leo essencial de gengibre e ao composto

quaternrio de amnio, a dose subletal foi calculada utilizando-se medida

proporcional CMI de leo essencial de gengibre e do composto quaternrio de

amnio, respectivamente, 0,78% e 0,25%, equivalentes CMI/4 (LUDN et al.,

2003). Os antimicrobianos, nas doses subletais, foram adicionados a 10 mL de

TSB-YE para quaternrio de amnio e TSB-YE acrescido de Tween 80 para

leo essencial de gengibre, em tubos de ensaio, sendo homogeneizadas.

Posteriormente, foi adicionado o inculo bacteriano, obtendo-se a concentrao

de 10UFC/mL. Os tubos de ensaio foram incubados a 37C por 6 horas.


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Aps a incubao por 6 horas, foram retiradas alquotas de 1 mL das

culturas e centrifugadas (10000 x g/ 10 minutos) em microtubos. As clulas

foram recuperadas, ressuspendidas em meio TSB-YE, sendo a suspenso

padronizada em 10UFC/mL. Em microplacas de 96 cavidades contendo o meio

de cultivo e o agente antibacteriano, sendo o leo essencial de gengibre

homogeneizado com Tween 80 a 0,5% (v/v), alquota de 10L da cultura

padronizada (10 UFC/mL) exposta CMI dos agentes antibacterianos foi

adicionada a cada cavidade. Para cada concentrao, cavidades contendo o meiode cultura e o agente antibacteriano foram preparadas sem o inculo bacteriano.

As microplacas foram incubadas a 37C por 24 horas. A absorbncia a 600nm

em leitor de microplacas (Anthos 2010) foi lida antes e depois da incubao.

3.8Induo de adaptao cruzada

Aps a exposio concentrao subletal de leo essencial de gengibre

de 0,78%, correspondente CMI/4, por seis horas, as clulas bacterianas foramrecuperadas por centrifugao (10000xg/ 10 minutos) e ressuspendidas em meio

TSB-YE. Alquotas de 10L da suspenso padronizada (10 UFC/mL) foram

adicionadas microplaca de 96 cavidades contendo 140L de TSB-YE com pH

ajustado com HCl para 4,5; 4,0 e 3,5. A microplaca foi incubada a 37C por 24horas e medidas as absorbncias, a 600nm, antes e aps a incubao.

3.9 Anlises estatsticas


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Para avaliar os efeitos dos tratamentos, foi realizado um experimento

segundo o delineamento inteiramente casualizado. Os resultados obtidos para pH

mnimo inibitrio e mnimo de crescimento, induo da resposta de tolerncia

cida, determinao da CMI de leo essencial de gengibre, induo de tolerncia

ao leo essencial de gengibre e ao composto quaternrio de amnio e induo de

tolerncia cruzada, foram submetidos anlise de varincia. Para comparao

das mdias foi utilizado o teste de Scott-Knott, a 5% de significncia. Para a

induo de tolerncia cida, foi utilizada tambm a anlise de regresso linear.Para as anlises de varincia, anlise de regresso e testes de mdias, foi

utilizado o software R.


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4RESULTADOS E DISCUSSO

4.1Determinao do pH mnimo inibitrio e pH mnimo de crescimento de

L. monocytogenes

Para L. monocytogenesATCC 19117, tanto para o HCl quanto para o

cido ctrico, o pH mnimo inibitrio, ou seja, o menor valor de pH capaz de

inibir, completamente, o crescimento bacteriano, foi 4,5. O pH mnimo decrescimento, ou seja, aquele valor imediatamente acima do pH mnimo inibitrio

foi 5,0.

Houve um efeito muito semelhante entre o cido clordrico e o cido

ctrico quanto inibio do crescimento de L. monocytogenes, havendo

crescimento bacteriano a partir de pH 5,0.

A tabela 3 representa a relao entre o pH ajustado com cido ctrico e

HCl e o crescimento (Log UFC/mL) deL. monocytogenes.

Tabela 3 Relao entre o pH ajustado com cido ctrico e HCl e o crescimento(Log UFC/mL) deL. monocytogenes

Log UFC/mLpH

cido Ctrico HCl

3,5 - - *

4,0 - - *

4,5 - - *

5 9,62 9,68

5,5 9,68 9,70

6 9,81 9,70

6,5 9,85 9,81

7 9,89 9,88*Ausncia de crescimento


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Na literatura, encontram-se valores de pH mnimo de crescimento de L.

monocytogenes de 4,3 (RYSER; MARTH, 2007), 4,5 (SEVERINO, 2007), 4,4

(FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED

NATIONS - FAO / WORLD HEATH ORGANIZATION - WHO, 2004) e 5,5

(NAJJAR; CHIKINDAS; MONTVILLE, 2004), valores bem prximos aos

testados no presente estudo. Valores como 4,3 e 4,4 no foram testados e

poderiam at ser encontrados caso intervalos pequenos de pH fossem sido

utilizados.Tanto o pH mnimo de crescimento quanto o pH mnimo inibitrio deL.

monocytogenes podem ter relao com o meio utilizado, a temperatura de

incubao, a natureza do cido e a cepa bacteriana. cidos diferentes, sejam

orgnicos ou inorgnicos, por mecanismos de ao ou intensidades de ao

diferentes, promovem variados nveis de estresse no micro-organismo inibindo,

em maior ou menor intensidade, o seu crescimento.

Wang e Johnson (1997) verificaram que as maiores taxas de crescimento

de L. monocytogenes ocorreram em valores de pH iguais ou superiores a 6,0,verificando-se desenvolvimento em escala muito menor, ou a sua ausncia, em

ambientes com pH inferior a 5,0. Observaram ainda que em produtos

alimentcios cidos (pH< 4,5),L. monocytogenes no sobrevivia.

O mesmo valor de pH 4,5 foi encontrado no presente estudo, sendo esse

o mnimo valor capaz de inibir, totalmente, o crescimento de L. monocytogenes.

Verificou-se, ainda, que medida que os valores de pH foram aumentados,

aproximando-se de 7,0 foi maior o crescimento bacteriano. Isso pode ser

explicado, pois o pH timo de crescimento de L. monocytogenes encontra-seprximo neutralidade, conforme trabalhos de FAO/WHO (2004), Ryser e

Marth (2007) e Severino (2007).

Najjar, Chikindas e Montville (2009) avaliaram o crescimento de quatro

cepas de L. monocytogenes em meio com valores de pH ajustados com cido


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ltico entre 3,5 e 7,0 e detectaram ausncia de crescimento para todas as cepas

em valores de pH 5,0. A diferena entre o pH mnimo inibitrio de 5,0

encontrado por esse autores e o pH 4,5 encontrado no presente trabalho pode ser

explicada pela natureza do cido utilizado e tambm pela cepa estudada. No

presente estudo, tanto o cido ctrico quanto o cido clordrico inibiram o

crescimento deL. monocytogenesem valores de pH4,5.

Vrios estudos mostram a efetividade dos cidos orgnicos, cuja ao

devido dissociao intracelular sofrida por esses cidos, causando maioresdanos clula (BUCHANAN; GOLDEN, 1998; HIRSHFIELD; TERZULLI;

OBYRNE, 2003; KOUASSI; SHELEF, 1996) e tambm ao da forma no

dissociada em alterar as atividades metablicas do micro-organismo (VASSEUR

et al., 1999).

Ita e Hutkins (1991) observaram que o baixo pH intracelular no foi o

fator mais importante na inibio do crescimento de L. monocytogenesem meio

cido, uma vez que clulas tratadas com cido ltico em meios com pH 3,5

mantiveram seu pH intracelular em torno de 5,0, mostrando que a forma nodissociada do cido tem efeito inibitrio no crescimento de L. monocytogenes,

assim com o efeito de acidificao do meio intracelular causado pelos ons H+.

A susceptibilidade de diferentes cepas de L. monocytogenes a meios

cidos ajustados com cidos de diferentes naturezas, entre eles, orgnicos

(cidos ltico e actico) e inorgnico (HCl) foi estudada por Vasseur et al.

(1999). A sensibilidade entre cada uma das cinco cepas avaliadas foi diferente

em relao ao cido utilizado. Todas as cepas tiveram reduo da taxa de

crescimento proporcional reduo do pH, ou seja, em meios mais cidos, ataxa de crescimento foi menor. O cido actico foi o mais efetivo e o HCl, o

menos efetivo. Segundo os autores, a maior efetividade do cido actico na

inibio do crescimento de L. monocytogenes pode ser explicada pela maior

capacidade em transpor a membrana plasmtica na sua forma no dissociada e


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lipolfica, levando ao acmulo de cido no citoplasma com acidificao do meio,

desintegrao da fora prton motiva e alterao do transporte de substratos.

De acordo com trabalho de Young e Foegeding (1993), a inibio de

crescimento deL. monocytogenescom vrios cidos orgnicos foi maior com o

cido actico, seguida do cido ltico e por fim, com o cido ctrico. Ita e

Hutkins (1991) mostraram que o cido ctrico apresentou a maior capacidade em

reduzir o pH intracelular, entretanto apresentou a menor capacidade de inibir o

crescimento deL. monocytogenes, entre vrios cidos orgnicos testados, sendoo cido actico o que melhor inibiu o crescimento.

A inibio do crescimento de L. monocytogenes por cido orgnico

depende de fatores como o pH, o tipo de cido e sua concentrao, sendo que

cidos orgnicos em baixa concentrao tiveram o efeito inibitrio atribudo ao

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DISSERTAÇÃO_Efeito Do Óleo Essencial de Gengibre e Do Ph Sobre Crescimento e Indução de Tolerância Em Listeria Monocytogenes