Listeria monocytogenes : OCORRÊNCIA NA CARNE BOVINA ... Barrros.pdf · dos principais pontos de contaminação em plantas de processamento e relação com ... ARTIGO 1 - Listeria

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

DOUTORADO EM SANIDADE ANIMAL

Listeria monocytogenes: OCORRÊNCIA NA CARNE

BOVINA, IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS PONTOS

DE CONTAMINAÇÃO EM PLANTAS DE

PROCESSAMENTO E RELAÇÃO COM A MICROBIOTA

ACOMPANHANTE.

Márcia de Aguiar Ferreira Barros

Londrina

2005

II

MÁRCIA DE AGUIAR FERREIRA BARROS


BOVINA, IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS PONTOS


PROCESSAMENTO E RELAÇÃO COM A MICROBIOTA

ACOMPANHANTE.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciência Animal da Universidade Estadual de

Londrina como requisito parcial para obtenção do

título de DOUTOR.

Área de Concentração: Sanidade Animal

Orientadora: Profa. Dra. Vanerli Beloti

Londrina

UEL

2005

Ficha catalográfica

III

CANDIDATA:

MÁRCIA DE AGUIAR FERREIRA BARROS

TÍTULO DA TESE: Listeria monocytogenes: Ocorrência na carne bovina, identificação

dos principais pontos de contaminação em plantas de processamento e relação com

a microbiota acompanhante.

Comissão examinadora:

__________________________________________________________

Profa. Dra. Vanerli Beloti

Depto. de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina

__________________________________________________________

Dr. Ernesto Hofer

Depto. de Bacteriologia, Instituto Oswaldo Cruz

__________________________________________________________

Prof. Dr. Luís Augusto Nero

Depto. de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa

__________________________________________________________

Prof. Dr. Ernst Eckehardt Müller


__________________________________________________________

Prof. Dr. Italmar Teodorico Navarro


Londrina, 10 de novembro de 2005.

IV

DEDICATÓRIA

AOS MEUS PAIS

(in memorium)

Aos meus amados pais, Vicente Ferreira e

Maria aparecida Nogueira Ferreira, pelo amor

incondicional que sempre me dedicaram, e que

ultrapassa qualquer tipo de distância aquecendo

o meu coração em todos os momentos.

V

AGRADECIMENTOS

Desde que iniciei meus estudos na Universidade Estadual de Londrina, tive o

privilégio de conhecer pessoas que de uma forma ou de outra, contribuíram para o meu

crescimento profissional e meu amadurecimento pessoal. E algumas dessas pessoas

talvez nem tenham noção disso porque muitas vezes, um simples sorriso, um

cumprimento, uma atenção ou um abraço, fazem toda a diferença e têm o poder de

mudar completamente a perspectiva de um dia!

Portanto, não pretendo aqui, classificar o grau de contribuição das pessoas que

fizeram e continuarão a fazer parte do meu dia a dia, pois todas são muito importantes

para mim! Uma frase, contida no livro “O Pequeno Príncipe” resume um dos princípios

básicos que procuro manter na minha vida: “És responsável por quem cativas”.

Assim, a todos os amigos, professores, colegas de pós-graduação, colegas

médicos veterinários responsáveis técnicos, funcionários do Depto. de Medicina

Veterinária Preventiva, residentes e estagiários do LIPOA, alunos, “agregados” e é claro

aos meus três filhos muito amados: MUITO OBRIGADA! E que eu consiga

corresponder às expectativas daqueles que acreditaram em mim!

VI

SUMÁRIO

REVISÃO DA LITERATURA - Listeria monocytogenes e Listeriose....................................1

RESUMO ...................................................................................................................................... 2

ABSTRACT .................................................................................................................................. 3

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 4

2. MICROBIOLOGIA DE Listeria SPP. ................................................................................... 5

2.1. IDENTIFICAÇÃO ................................................................................................................ 5

2.2. CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS .................................................................................... 5

2.3. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS ..................................................................................... 6

2.4. SOROTIPOS ....................................................................................................................... 7

3. PATOGÊNESE ...................................................................................................................... 8

3.1. MECANISMOS DE INVASÃO E ESCAPE............................................................................... 8

3.2. FATORES DE VIRULÊNCIA ................................................................................................. 9

4. EPIDEMIOLOGIA............................................................................................................... 10

4.1. HABITAT ......................................................................................................................... 10

4.2. FORMAS DE TRANSMISSÃO ............................................................................................. 11

Origem não alimentar........................................................................................................... 11

Origem alimentar ................................................................................................................. 11

5. OCORRÊNCIA .................................................................................................................... 12

6. PATOGENIA ....................................................................................................................... 14

6.1. LISTERIOSE NOS ANIMAIS .............................................................................................. 14

6.2. LISTERIOSE EM HUMANOS ............................................................................................. 14

Forma invasiva..................................................................................................................... 14

Forma não invasiva .............................................................................................................. 15

7. DIAGNÓSTICO ................................................................................................................... 15

7.1. ANÁLISES EM ALIMENTOS .............................................................................................. 15

7.2. ANÁLISES CLÍNICAS........................................................................................................ 16

8. TRATAMENTO E PROFILAXIA....................................................................................... 16

9. SITUAÇÃO ATUAL............................................................................................................ 17

VII

10. CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 19

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 20

OBJETIVOS.............................................................................................................................. 28

OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 28

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 28

ARTIGO 1 - Listeria monocytogenes : OCORRÊNCIA NA CARNE BOVINA E

IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS PONTOS DE CONTAMINAÇÃO EM PLANTAS

DE PROCESSAMENTO.......................................................................................................... 29

RESUMO .................................................................................................................................... 30

ABSTRACT ................................................................................................................................ 31

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 32

2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 34

2.1. AMOSTRAS ..................................................................................................................... 34

2.2. PONTOS DE AMOSTRAGEM E PROCEDIMENTOS DE COLHEITA ........................................ 34

Produtos ............................................................................................................................... 34

Equipamentos....................................................................................................................... 35

Instalações............................................................................................................................ 35

2.3. DETECÇÃO DA PRESENÇA DE L. monocytogenes ............................................................ 35

2.4. IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA DAS ESPÉCIES.................................................................... 36

2.5. IDENTIFICAÇÃO DOS SOROTIPOS DE L. monocytogenes.................................................. 36

3. RESULTADOS .................................................................................................................... 38

4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ........................................................................................... 43

5. AGRADECIMENTOS ......................................................................................................... 48


ARTIGO 2 - MICRORGANISMOS INDICADORES NA CARNE BOVINA E

IDENTIFICAÇÃO DOS PONTOS DE CONTAMINAÇÃO NO PROCESSAMENTO ... 56

RESUMO .................................................................................................................................... 57

ABSTRACT ................................................................................................................................ 58

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 59

VIII


2.1. AMOSTRAS ..................................................................................................................... 62

2.2. PONTOS DE AMOSTRAGEM E PROCEDIMENTOS DE COLHEITA ........................................ 62

Produtos ............................................................................................................................... 62

Equipamentos....................................................................................................................... 63

Instalações............................................................................................................................ 63

2.3. ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS INDICADORES ..................................................... 63

2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................... 63

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................... 64

4. CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 80


ARTIGO 3 - RELAÇÃO ENTRE A PRESENÇA DE LISTERIA SPP. E OS NÍVEIS DE

CONTAMINAÇÃO DA MICROBIOTA ACOMPANHANTE NA CARNE BOVINA,

PRODUTOS CÁRNEOS E EM PLANTAS DE PROCESSAMENTO.

RESUMO .................................................................................................................................... 85

ABSTRACT ................................................................................................................................ 86

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 87


2.1. ORIGEM DAS AMOSTRAS E ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS.............................................. 89

2.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS ............................................................................................ 89

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................... 90

4. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 105

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 106

IX

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Características bioquímicas de Listeria spp. .................................................. 7

Tabela 2. Surtos e casos esporádicos suspeitos e comprovados de listeriose alimentar

(JAY, 2000) ................................................................................................................ 13

Tabela 1.1. Pontos de amostragem, origem, total de amostras colhidas e área de

superfície amostrada. .................................................................................................. 37

Tabela 1.2. Freqüência de Listeria spp. em amostras de equipamentos, instalações,

carnes e produtos cárneos provenientes de plantas de processamento de 11

estabelecimentos localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.................... 40

Tabela 1.3. Freqüências das diferentes espécies de Listeria spp. identificadas de

amostras de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos provenientes de

plantas de processamento de 11 estabelecimentos localizados na região norte do estado

do Paraná, Brasil. ........................................................................................................ 41

Tabela 1.4. Principais pontos de contaminação por Listeria spp. e L. monocytogenes em

equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos identificados em 11

estabelecimentos processadores de carne localizados na região norte do estado do

Paraná, Brasil.............................................................................................................. 42

Tabela 1.5. Ocorrência de sorotipos de L. monocytogenes em amostras colhidas de

equipamentos, instalações e produtos provenientes de 11 estabelecimentos

processadores de carne bovina da região norte do estado do Paraná, Brasil. ................ 42

Tabela 2.1. Pontos de amostragem, total de amostras colhidas e área de superfície. .... 63

Tabela 2.2. Médias das contagens de aeróbios mesófilos (log UFC/cm2 ou g.) de

amostras de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas

de carnes e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. .... 72

Tabela 2.3. Médias das contagens de coliformes totais (log UFC/cm2 ou g.) de amostras

de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes

e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil..................... 73

Tabela 2.4. Médias das contagens de Escherichia coli (log UFC/cm2 ou g.) de amostras


e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil..................... 74

Tabela 2.5. Médias das contagens de bolores (log UFC/cm2 ou g.) de amostras de

equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes e

01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. ...................... 75

X

Tabela 2.6. Médias das contagens de leveduras (log UFC/cm2 ou g.) de amostras de


01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. ...................... 76

XI

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema de ciclo intracelular de Listeria monocytogenes (fonte: VÁZQUEZ-

BOLAND, J.A. et al., 2001).......................................................................................... 9

Figura 2. Evolução entre 6 horas e 2 dias na formação de biofilme de Listeria

monocytogenes (fonte: CHAVANT, P. et al, 2002). .................................................... 11

Figura 2.1. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)

em amostras de equipamentos de 10 casas de carnes, localizadas na região norte do

estado do Paraná, Brasil. ............................................................................................. 77


em amostras de equipamentos de abatedouro, localizado na região norte do estado do

Paraná, Brasil.............................................................................................................. 77


em amostras de instalações de 10 casas de carnes localizadas na região norte do estado

do Paraná, Brasil. ........................................................................................................ 78


em amostras de instalações de abatedouro localizado na região norte do estado do

Paraná, Brasil.............................................................................................................. 78


em amostras de produtos de 10 casas de carnes localizadas na região norte do estado do

Paraná, Brasil.............................................................................................................. 79


em amostras de produtos de abatedouro localizado na região norte do estado do Paraná,

Brasil. ......................................................................................................................... 79

Figura 3.1. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em

relação a três níveis de contaminação por aeróbios mesófilos, isoladas de equipamentos,

instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores

de situados na região norte do estado do Paraná, Brasil. .............................................. 95


relação a três níveis de contaminação por coliformes totais, isoladas de equipamentos,




relação a três níveis de contaminação por E. coli isoladas de equipamentos, instalações,

XII

carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de situados

na região norte do estado do Paraná, Brasil. ................................................................ 97


relação a três níveis de contaminação por bolores isoladas de equipamentos, instalações,

carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de situados

na região norte do estado do Paraná, Brasil. ................................................................ 98


relação a três níveis de contaminação por leveduras isoladas de equipamentos,



Figura 3.6. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria,

em relação a três níveis de contaminação por aeróbios mesófilos, isoladas de

equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos

processadores de situados na região norte do estado do Paraná, Brasil....................... 100


em relação a três níveis de contaminação por coliformes totais, isoladas de

equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos

processadores de situados na região norte do estado do Paraná, Brasil....................... 101


em relação a três níveis de contaminação por E. coli, isoladas de equipamentos,

instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de situados

na região norte do estado do Paraná, Brasil. .............................................................. 102


em relação a três níveis de contaminação por bolores, isoladas de equipamentos,




em relação a três níveis de contaminação por leveduras, isoladas de equipamentos,



XIII

ANEXOS

1. ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO.............................................................. 112

BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; HAGA, M.M.; CAVALETTI, L.; d’OVIDIO, L.;

AMORIM, F.A.; NERO, L.A. Listeria spp.: ocorrência em equipamentos e ambientes

de processamento de carne bovina. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 25, n.4, p.

341-48, out./dez., 2004

2. ARTIGO TÉCNICO PUBLICADO ................................................................... 120

BARROS, M.A.F. Listeria monocytogenes: ocorrência na carne bovina e em plantas de

processamento. Revista do Conselho Regional de Medicina Veterinária-PR, n.15, ano

III, Abr./Mai./Jun/, p.19, 2005

3. DIVULGAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS. ............................................. 122

3.1. BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; HAGA, M.M.; CAVALETTI, L.; D’OVÍDIO, L.;

MONTEIRO, F.A.; SILVA, L.H.C. Detecção de Listeria spp. em carne in natura e

embutidos comercializados na região norte do Paraná. In: XXII Congresso Brasileiro de

Microbiologia, Novembro de 2003, Florianópolis, SC, Brasil................................123

3.2. BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; HAGA, M.M.; CAVALETTI, L.; D’OVÍDIO, L.;

MONTEIRO, F.A.; VILLAS-BÔAS, A.M. Listeria spp.: ocorrência em equipamentos e

ambientes de processamento da carne bovina. In: XXII Congresso Brasileiro de

Microbiologia, Novembro de 2003, Florianópolis, SC, Brasil......................................124

3.3. CAVALETTI, L.; BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; D’OVÍDIO, L.; MONTEIRO,

F.A.; HAGA, M.M.; VILLAS-BÔAS, A.M. Enumeração de Microrganismos Aeróbios

Mesófilos em Carcaças Bovinas e Cortes Comerciais Provenientes da Região Norte do

Paraná. In: III Mostra Acadêmica de Trabalhos Científicos do Curso de Medicina

Veterinária-UEL-Graduação/Pós-Graduação e XXV Ciclo de Estudos em Medicina

Veterinária, 01 a 05 de dezembro de 2003, Londrina, PR, Brasil.................................126

3.4. HAGA, M.M.; BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; CAVALETTI, L.; D’OVÍDIO, L.;

MONTEIRO, F.A.; VILLAS-BÔAS, A.M. Enumeração de Bolores e Leveduras em

Equipamentos Instalações Utilizados no Processamento da Carne Bovina. In: III Mostra

Acadêmica de Trabalhos Científicos do Curso de Medicina Veterinária-UEL-

Graduação/Pós-Graduação e XXV Ciclo de Estudos em Medicina Veterinária, 01 a 05

de dezembro de 2003, Londrina, PR, Brasil................................................................. 128

3.5. D’OVÍDIO, L.; BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; CAVALETTI, L.; MONTEIRO,

F.A.; HAGA, M.M.; VILLAS-BÔAS, A.M. Enumeração de Escherichia coli em Meias

XIV

Carcaças, Cortes Comerciais e Embutidos de Origem Bovina em Estabelecimentos da

Região Norte do Paraná. In: III Mostra Acadêmica de Trabalhos Científicos do Curso

de Medicina Veterinária-UEL-Graduação/Pós-Graduação e XXV Ciclo de Estudos em

MedicinaVeterinária, 01 a 05 de dezembro de 2003, Londrina, PR, Brasil................. 129

3.6. BARROS, M.A.F.; BELOTI, V. ; NERO, L.A.; TAMANINI, R.; VILLAS-BÔAS,

A.M. Principais Fontes de Contaminação de Listeria spp. no Processamento de

Lingüiça Tipo Frescal em Londrina, PR. In: II Congresso Latino-americano de

Higienistas de Alimentos/VIII Congresso Brasileiro de Higienistas de Alimentos/ I

Encontro Nacional de Centros de Controle de Zoonoses. 12 a 15 de abril de 2005,

Búzios,RJ, Brasil .........................................................................................................130

3.7. BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; NERO, L.A.; TAMANINI, R.; VILLAS-BÔAS,

A.M.; FAGNANI, R. Microrganismos Indicadores de Higiene no Processamento de

Carne moída Bovina em Casas de Carnes de Londrina, PR. In: II Congresso Latino-

americano de Higienistas de Alimentos/VIII Congresso Brasileiro de Higienistas de

Alimentos/ I Encontro Nacional de Centros de Controle de Zoonoses. 12 a 15 de abril

de 2005, Búzios, RJ, Brasil. ...................................................................................... 133

3.8. BARROS, M.A.F.; D’OVÍDIO, L.; CAVALETTI, L.; BELOTI, V.; NERO, L.A.;

TAMANINI, R.; FAGNANI, R. Identificação de Espécies de Listeria spp. Isoladas de

Plantas Processadoras de Carne Bovina por Testes Bioquímicos Tradicionais e pelo

Sistema API Listeria. In: XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 22 a 25 de

novembro de 2005, Santos, SP, Brasil. ...................................................................... 136

3.9. BARROS, M.A.F.; CAVALETTI, L.; D’OVÍDIO, L.; CAVALETTI, L.; BELOTI,

V.; NERO, L.A.; TAMANINI, R.; FAGNANI, R. Avaliação da Contaminação de

Carcaças Bovinas por Microrganismos Indicadores pela Utilização de Placas

Petrifilm™. In: XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 22 a 25 de novembro de

2005, Santos, SP, Brasil. ........................................................................................... 137

REVISÃO DA LITERATURA

Listeria monocytogenes e Listeriose

2

RESUMO

Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram positiva, aeróbica, intracelular e

anaeróbica facultativa, amplamente distribuída no meio ambiente e agente etiológico da

listeriose humana e de animais. Em humanos, a doença pode manifestar-se de forma

grave e fatal em indivíduos susceptíveis como gestantes, recém nascidos, idosos e

imucomprometidos, causando meningite e septicemia. A patogênese da listeriose

consiste na internalização da bactéria por fagócitos profissionais e por células não

fagocíticas de diferentes tecidos e órgãos. A estratégia de invasão, célula a célula,

permite a sua disseminação no interior dos tecidos hospedeiros e a formação de focos

infecciosos ficando assim protegida das defesas do hospedeiro, como os anticorpos

circulantes. Cada etapa do parasitismo intracelular por L. monocytogenes dependerá da

produção de fatores de virulência, exercidos por diversas proteínas que estão envolvidas

nas fases do ciclo intracelular. Em relação às outras doenças de origem alimentar a

listeriose apresenta uma baixa incidência, mas com índices de mortalidade superiores a

50%. Apesar das outras formas de transmissão, os alimentos têm sido claramente

identificados como a mais importante fonte de infecção. Os produtos cárneos estão

envolvidos em diversos surtos e casos esporádicos de listeriose humana e pesquisas têm

comprovado a ocorrência de contaminação da carne e de plantas de processamento por

L. monocytogenes. A alta ocorrência do patógeno em diversos alimentos associada aos

altos índices de mortalidade, tornam L. monocytogenes um importante e complexo

problema de saúde pública que tem provocado perdas para a indústria de alimentos

devido aos inúmeros recolhimentos, voluntários e obrigatórios, realizados

principalmente nos Estados Unidos e Canadá. Diversos países têm estabelecido critérios

rígidos para a presença de L. monocytogenes em diversos alimentos prontos para o

consumo, como o de tolerância zero adotado nos Estados Unidos. No Brasil, nenhum

caso de listeriose foi associado ao consumo de alimentos contaminados, havendo

necessidade de mais pesquisas sobre o complexo Listeria-listeriose.

Palavras-chave: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; listeriose.

3

ABSTRACT

LISTERIA MONOCYTOGENES AND LISTERIOSIS

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterium, anaerobic and facultative

intracellular, widely distributed in the environment. It is the etiological agent of the

human and animal listeriosis. In humans the disease could occur in a serious and fatal

form in susceptible population as pregnant, neonate, elderly and immunosuppressed

causing meningitis and sepsis. The pathogenicity of listeriosis implicates in the

internalization of the bacterium for phagocytic and nonphagocytic cells. The invasion

strategy, cell to cell, allows the spread of infectious focuses that protects the bacterium

against the host defenses as circulating antibodies. Each stage of L. monocytogenes

intracellular parasitism will depend on the virulence factors production, used by several

proteins in the intracellular cycle. In relation to the other foodborne diseases listeriosis

presents a low incidence but high mortality rate, almost 50%. Foods have been clearly

identified the most important source of infection despite the other forms of

transmission. Meat and meat products have been involved in several outbreaks and

sporadic cases of listeriosis and researches has demonstrated that L. monocytogenes can

contaminate meat and processing plants. The high occurrence of L. monocytogenes in

several foods associated to the high mortality rate became L. monocytogenes an

important and complex problem of public health. It has been caused losses for the food

industry due to regular recalls, volunteers and obligatory, mainly in the United States

and Canada. Several countries have been establishing rigid criteria for the presence of L.

monocytogenes in ready-to-eat foods, just as the tolerance zero adopted in the United

States. In Brazil, listeriosis was not associated with the consumption of contamined

foods and more researches are neded to elucidate the complex Listeria-listeriosis.

Key words: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; listeriosis.

4

1. INTRODUÇÃO

A emergência de L. monocytogenes como patógeno alimentar data de 1980

com a ocorrência de diversos surtos e casos esporádicos de listeriose ligados ao

consumo de alimentos contaminados e tem provocado inúmeras discussões em todo o

mundo, o que por sua vez, tem estimulado pesquisadores a buscar respostas para as

várias questões que têm surgido sobre a relação entre Listeria ssp. e listeriose

(SCHLECH et al, 1983; LINNAN et al, 1988; BULA et al, 1988; FARBER e

PETERKING, 1991; FENLON, et al., 1996; SILVA et al., 1998).

Diferentemente da maioria dos outros patógenos, apresenta características

psicrotróficas podendo desenvolver-se e multiplicar-se em alimentos mantidos sob

temperaturas de refrigeração (MEMBRÉ et al., 1999; DYKES, 2003). Ainda, a

resistência do microrganismo a agentes antimicrobianos (DYKES e MOORHEAD,

2001), a substâncias químicas como ácidos e álcalis e a capacidade de formação de

biofilmes sobre várias superfícies torna difícil sua eliminação (HOOD e ZOTTOLA,

1995; FENLON et al., 1996; BLOM et al., 1997; CHEROUTRE-VIALETTE et al.,

1998; LERICHE e CARPENTIER, 2000; TAKHISTOV e GEORGE, 2004).

Após um surto de listeriose ocorrido em 1985 na Califórnia, avaliou-se a

participação de produtos cárneos como veículos da infecção e o envolvimento desses

alimentos em surtos e casos esporádicos de listeriose humana ficou comprovado em

diversos países (KERR et al., 1988; CANTONI et al., 1989; FARBER e PETERKIN,

1991; BADER, 1993; GOULET et al., 1995; JACQUET et al., 1995). Embora exista

uma margem de risco para todos os consumidores, este patógeno pode causar abortos,

septicemia, encefalite e meningite com altas taxas de mortalidade entre neonatos, idosos

e imunocomprometidos (ROCOURT, 1994; HOFER, 1998).

No Brasil, pesquisas publicadas relatam a ocorrência de Listeria spp. em

alimentos como vegetais (HOFER, 1975a), camarão (HOFER e RIBEIRO, 1990;

DESTRO et al., 1996), carnes, leite e derivados (DESTRO et al.,1991; CASAROTTI et

al., 1994; SILVA et al., 1998; SILVA et al., 2004) e ambientes como esgotos (HOFER,

1975b) e solo (HOFER e PÓVOA, 1984) mas, até o momento, nenhum caso clínico foi

associado ao consumo de alimentos.

5

1. MICROBIOLOGIA DE LISTERIA SPP.

1.1. Identificação

O gênero Listeria está relacionado filogenéticamente aos gêneros

Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus e Brochotrix. Esta posição

filogenética é consistente com seu baixo conteúdo de mol % G+C (36 a 42) e

atualmente compreende seis espécies: L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii

(subespécies ivanovii e londoniensis), L. welshimeri, L. seeligeri e L. grayi, mas apenas

duas espécies são reconhecidamente patogênicas, assim L. monocytogenes pode infectar

uma variedade de espécies animais, incluindo o homem e L. ivanovii apresenta

patogenicidade restrita aos ruminantes (ROCOURT e COSSART, 1997; VÁZQUEZ-

BOLAND et al., 2001).

1.2. Características fisiológicas

Listeria spp. é um bacilo Gram positivo, com diâmetro de 0,4 a 0,5µm e

comprimento de 0,51 a 2,0µm (Seeliger e Jones, 1986), aeróbico e facultativamente

anaeróbico, não formador de esporos, e que apresenta motilidade característica em

forma de “guarda chuva” quando incubado em meio de cultura próprio entre 20 a 25oC.

As colônias formadas são acinzentadas brilhantes sob iluminação normal e de coloração

azul esverdeada quando observadas sob iluminação oblíqua (SCHUCHAT et al.,1991).

São microrganismos catalase positiva, oxidase negativa, sendo a faixa ótima

de pH para seu crescimento de 6 a 8, mas diversas pesquisas demonstraram seu

crescimento quando as faixas de pH variaram de 4,1 até 9,6. São capazes de crescer em

diferentes temperaturas, tempos de incubação e concentrações salinas (COLE et al.,

1990; CONNER et al., 1986; BUCHANAN e KLAWITTER, 1990). A temperatura

ótima de crescimento situa-se na faixa de 30 a 37oC, embora temperaturas extremas

como 1oC e 45oC permitam o crescimento de Listeria spp., e congelamentos a -18oC e

descongelamentos sucessivos parecem não promover a sua inativação (SCHUCHAT et

al., 1991).

O isolamento do microrganismo em de ambiente anaeróbico foi

demonstrado em pesquisa que avaliou amostras comerciais de carne processada e

embalada à vácuo, na qual 53% das amostras testadas estavam contaminadas com

6

L. monocytogenes e 4% apresentaram contagens superiores a 103UFC/g (GRAU e

VANDERLINE, 1990). Em pesquisa realizada com embutidos e presunto cozidos

adicionados em diferentes concentrações de lactatos e acetatos e embalados à vácuo,

Blom e colaboradores (1997) concluíram que a inibição do crescimento de L.

monocytogenes ocorreu quando as concentrações foram de 2,5% de lactato e de 0,25%

de acetato.

As exigências nutricionais para o crescimento de Listeria são praticamente

as mesmas das outras bactérias Gram positivas, crescendo bem em meios comuns como

Brain Heart Infusion (BHI) e Ágar Tripticase de Soja (TSA). Apesar da maioria das

descrições terem sido baseadas em L. monocytogenes, as exigências para as outras

espécies parecem ser as mesmas. Listeria spp. é capaz de hidrolisar a esculina e crescer

na presença de 10% ou até 40% de bile e em concentrações salinas a 10% . Embora o

ferro seja importante para o seu crescimento in vivo, L. monocytogenes aparentemente

não possui compostos específicos de ligação e esse íon seria obtido, quando necessário,

a partir da redução do ferro livre que se liga a receptores de superfície (JAY, 2000).

1.3. Características bioquímicas

A diferenciação bioquímica entre as diferentes espécies é baseada na

fermentação de alguns açucares como D-glucose, D-xilose, D-manitol e L-rhamnose e

na reação de hemólise que diferencia as espécies patogênicas da espécie não patogênica

L. innocua, mais frequentemente encontrada. L. monocytogenes apresenta reação de

β hemólise quando semeada em ágar sangue ovino ou equino formando uma estreita

zona de hemólise ao redor da colônia, já L. ivanovii forma uma acentuada zona de

hemólise. L seeligeri pode ou não apresentar reação de hemólise fraca, e as outras

espécies não são hemolíticas (SEELIGER e JONES, 1986) (Tabela 1).

A diferenciação entre as espécies hemolíticas, e entre L. innocua e

L. monocytogenes é feita através do teste Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP

teste), já que essas duas espécies apresentam reações bioquímicas similares. O CAMP

teste detecta reações sinergéticas de hemolisinas de Listeria spp. com a beta toxina de

Staphylococcus aureus e com exofator de Rhodococcus equi. L. monocytogenes

apresenta reação positiva com S. aureus, mas negativa com R. equi; L. ivanovii

apresenta reação inversa e L. innocua apresenta reação negativa ao CAMP teste

(McKELLAR, 1994) (Tabela 1).

7

Tabela 1. Características bioquímicas de Listeria spp.

Espécies

L.

monocytogenes

L.

ivanovii

L.

innocua

L.

welshimeri

L.

seeligeri

L.

grayi

β-hemólise em ágar sangue + ++ - - (+) - Redução do nitrato a nitrito - - - - - -

CAMP teste com Staphylococcus aureus + - - - (+) -

CAMP teste com Rhodococcus equi - + - - - - Produção de ácido a partir de:

D-manitol - - - - - + L-rhamnose + - V V - - D-xilose - + - + + - α-metil D-manosídeo + - + + V NE

+ = reação positiva ++ = reação positiva forte (+) = reação positiva fraca ( -) = reação negativa NE = não estabelecido

1.4. Sorotipos

L. monocytogenes está subdividida em sorotipos baseados em antígenos

somáticos (O) e flagelares (H). Atualmente treze sorotipos (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c,

4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e,7) de L. monocytogenes têm sido identificados mas, apenas três

(1/2a, 1/2b e 4b) estão relacionados a casos de listeriose humana (SCHUCHAT et al.,

1991; SLADE, 1992; ROCOURT e COSSART, 1997).

8

2. PATOGÊNESE

2.1. Mecanismos de invasão e escape

L. monocytogenes é capaz de invadir macrófagos e uma variedade de células

não fagocíticas, como as endoteliais e os hepatócitos. Em todos estes tipos celulares, a

bactéria desenvolve um ciclo de vida intracelular característico. No caso de células não

fagocíticas o processo é disparado pela bactéria e denominado de fagocitose induzida.

Estudos realizados com L. monocytogenes em cobaias indicaram que a invasão de

enterócitos e/ou das células M das placas de Peyer, constitui a primeira etapa para

atravessar a barreira intestinal. As bactérias são então internalizadas por macrófagos da

lâmina própria alcançando a corrente linfática, a circulação sanguínea e atingindo o

fígado e o baço. Em camundongos, a infecção do fígado começa por uma fase inicial

durante a qual as bactérias são rapidamente fagocitadas pelas células de Kupffer, os

macrófagos do fígado, sendo que em menos de 6 horas são eliminadas 90% das

bactérias. Os microrganismos que sobrevivem infectam os hepatócitos adjacentes

iniciando uma infecção sistêmica (IRETON e COSSART, 1997).

Após a invasão da célula hospedeira e internalização em um fagossomo, em

cerca de 30 minutos ocorre a ruptura da membrana e liberação da bactéria para o

citoplasma, duplicando-se em cerca de uma hora; em seguida a bactéria se torna

progressivamente recoberta por uma camada de filamentos derivados da polimerização

de actina da célula hospedeira, que se arranjam no pólo posterior formando uma

estrutura semelhante a uma “cauda de cometa”, com cerca de 40µm de comprimento e

permitindo uma movimentação da bactéria em velocidade que varia de 0,1 a 1µm/s até a

extremidade da membrana interna da célula hospedeira. Nessa etapa formam-se longas

protusões, que são então, internalizadas pelas células vizinhas, originando um

fagossomo com dupla membrana que, após lisadas permitirão o reinício de um novo

ciclo. Cada ciclo bacteriano é completado em cerca de cinco horas (ROCOURT e

COSSART, 1997; MERZ e HIGGS, 2003). (Figura 1).

9

Figura 1. Esquema de ciclo intracelular de Listeria monocytogenes (fonte: VÁZQUEZ-

BOLAND et al., 2001)

2.2. Fatores de virulência

Cada etapa do parasitismo intracelular por L. monocytogenes dependerá da

produção de fatores de virulência. Diversas proteínas estão envolvidas nas fases do ciclo

intracelular desta bactéria, e seu papel como fatores de virulência tem sido estudado e

identificado nos últimos quinze anos pela biologia molecular. A entrada em células de

mamíferos é mediada por duas proteínas bacterianas de superfície, as internalinas InlA e

InlB. O mecanismo de escape do fagossoma primário envolve a ação de uma toxina

formadora de poros denominada de listeriolisina O (LLO) e de duas fosfolipases C

fosfatidilinositol (PI-PLC) (IRETON e COSSART, 1997; CABANES et al., 2002).

No citosol da célula hospedeira a proteína ActA é responsável pela formação

da cauda de actina e pela motilidade intracelular e a dupla membrana do fagossoma

secundário é rompida pela ação de LLO e uma lecitinase (PC-PLC) (SHEEHAN et al.,

1994; IRETON e COSSART, 1997; CABANES et al., 2002). A expressão dos genes

que codificam essas proteínas é modulada pelas condições ambientais, sendo reprimida

às baixas temperaturas e expressadas no máximo a 35oC. Ainda, esses fatores são

regulados pelo gene prfA, mas seu mecanismo de termoregulação para expressão ainda

não estão totalmente esclarecidos (ROCOURT e COSSART, 1997).

10

Assim a patogênese de L. monocytogenes implica na internalização pelos

fagócitos profissionais e pelas células não fagocíticas de diferentes tecidos e órgãos. A

estratégia de invasão célula a célula, permite a sua disseminação no interior dos tecidos

hospedeiros e a formação de focos infecciosos ficando assim protegida das defesas do

hospedeiro, como os anticorpos circulantes. Isto pode explicar porque os anticorpos não

exercem um papel importante na recuperação a partir de uma infecção, ou proteção

contra infecções secundárias (CABANES et al., 2002).

3. EPIDEMIOLOGIA

3.1. Habitat

L. monocytogenes pode ser encontrada na matéria orgânica em

decomposição, no solo, águas tratadas e residuais, forragens, fertilizantes, superfícies de

equipamentos e alimentos de origem animal e vegetal, já tendo sido isolada de mais de

40 espécies de mamíferos e 17 de aves (KONEMAN, 2001). Diferentemente da maioria

dos outros patógenos, apresenta características psicrotróficas podendo desenvolver-se e

multiplicar-se em alimentos mantidos sob temperaturas de refrigeração (DYKES, 2003).

A resistência do microrganismo a agentes antimicrobianos substâncias

químicas como ácidos e álcalis e a sua capacidade de adesão e formação de biofilmes

sobre várias superfícies, como plástico e aço inoxidável, torna difícil sua eliminação

(HOOD e ZOTTOLA, 1995; DYKES e MOORHEAD, 2001; TAKHISTOV e

GEORGE, 2004). Biofilmes são geralmente, comunidades multiespécies nas quais

diferentes microrganismos estão integrados em estruturas complexas. Estudos têm

demonstrado a capacidade de L. monocytogenes de formar biofilmes sobre materiais

comumentemente utilizados em indústrias de alimentos inclusive na presença de outros

microrganismos (BERESFORD et al., 2001) (Figura 2).

11

Figura 2. Evolução entre 6 horas e 2 dias na formação de biofilme de Listeria

monocytogenes em superfície de aço inoxidável (fonte: CHAVANT, P. et al, 2002).

3.2. Formas de transmissão

Origem não alimentar

A listeriose pode ser transmitida pelo contato direto com animais infectados,

mas essa via de transmissão é considerada rara. Nesta forma de doença surgem lesões

cutâneas, especialmente sobre os braços de pessoas que manipulam animais como

médicos veterinários e magarefes. McLauchlin (1996) relata a ocorrência de 17 casos na

literatura mundial.

Outra forma de transmissão é por contaminação cruzada durante o período

neonatal, com casos de infecção nosocomial descritos (HOF e LAMPIDIS, 2001;

COLODNER et al., 2003). Na maioria dos episódios relatados, as salas de parto, as

enfermarias, os equipamentos e o pessoal médico envolvido foram relacionados aos

casos de listeriose como fontes de infecção (SCHUCHAT et al., 1991; McLAUCHLIN,

1996).

Origem alimentar

Atualmente é aceito que a principal forma de transmissão da listeriose é o

consumo de alimentos contaminados (WHO Working Group, 1988). Diversos

alimentos, de origem animal e vegetal, têm sido relacionados a casos esporádicos e a

surtos de listeriose no mundo. L. monocytogenes é capaz de crescer e sobreviver tanto

12

em alimentos crus, quanto em alimentos processados (McLAUCHLIN e GILBERT,

1990).

4. OCORRÊNCIA

O primeiro surto de listeriose de origem alimentar comprovado na América

do Norte, aconteceu em 1981 em Nova Escócia, Canadá, com 41 doentes e 11 mortes.

Este surto foi relacionado com a ingestão de salada contendo repolho contaminado a

partir de adubo in natura proveniente de ovinos (SCHLECH et al., 1983). Em 1983

ocorreu um surto em Boston, nos Estados Unidos, (49 casos e 14 mortes) e

epidemiologicamente ligado ao leite pasteurizado, mas o microrganismo não foi isolado

do produto (FLEMING et al., 1985). Em 1985 um grande surto ocorreu no sul da

Califórnia, Estados Unidos, (142 casos e 48 mortes) e foi causado por um tipo de queijo

mole, denominado Mexican-style, produzido a partir de leite cru ou proveniente de

processo de pasteurização inadequada (LINNAN et al., 1988).

Com relação à listeriose causada por ingestão de produtos cárneos

contaminados, o primeiro surto comprovado envolveu um tipo de patê importado pelo

Reino Unido com 366 doentes e 63 mortes (McLAUCHLIN et al., 1991) e o primeiro

relato nos Estados Unidos foi de um caso esporádico relacionado ao consumo de

embutido de carne de peru, por uma paciente com câncer (MMWR, 1989). Uma grande

variedade de carnes e produtos cárneos, além de plantas de processamento, tem sido

associada à contaminação por L. monocytogenes (NG e SEAH, 1995; NESBAKKEN et

al., 1996; OJENIYI et al., 1996; NØRRUNG et al.,1999; PICCHI et al., 1999;

CORDANO e ROCOURT, 2001; PECCIO et al., 2003; BARBALHO et al., 2005;

GUDBJÖRNSDÓTTIR et al., 2004). Na Tabela 2 são apresentados casos de listeriose

relatados por Jay (2000) e associados a alimentos de diversas origens.

13

Tabela 2. Surtos e casos esporádicos suspeitos e comprovados de listeriose alimentar

(JAY, 2000).

Ano Origem Casos/Mortes Localização

1953 Leite cru 2/1 Alemanha

1959 Carne bovina/frango* 4/2 Suécia

1960-61 Vários/desconhecido 81/? Alemanha

1966 Leite/derivados 279/109 Alemanha

1979 Vegetais/leite† 23/3 Boston

1980 Mariscos 22/6 Nova Zelândia

1981 Repolho 41/18 Canadá

1983 Leite pasteurizado 49/14 Boston

1983-87 Queijo tipo Vacherin 122/34 Suíça

1985 Queijo Mexican style 142/48 Califórnia

1986-87 Vegetais† 36/16 Filadélfia

1987-89 Patê 366/63 Reino Unido

1987 Queijo 1 Reino Unido

1988 Queijo de leite de cabra 1 Reino Unido

1988 Frango assado 1 Reino Unido

1988 Frango assado 2 Reino Unido

1988 Embutido de peru 1 Oklahoma

1989 Embutido de porco 1 Itália

1988 Alfafa 1 Canadá

1989 Cogumelos salgados 1 Finlândia

1989 Camarão 9/1 Estados Unidos (Conn.)


1990 Leite cru 1 Vermont


1990 Patê 11/6 Austrália

1991 Mexilhão defumado 3/0 Austrália

1992 Mexilhão defumado 4/2 Nova Zelândia

1992 Carne de ovinos 1 Canadá

1992 Língua de porco 279/85 França

1993 Filetes de porco 39/0 França

1994 Achocolatado 52/0 Estados Unidos

1994 Azeitonas em conserva 1 Itália

1995 Queijo Brie 17/0 França

1998-99 Salsicha tipo hot-dog 101/21 Estados Unidos

*suspeito † epidemiologicamente relacionados (microrganismo não detectado)

14

5. PATOGENIA

5.1. Listeriose nos animais

As infecções por L. monocytogenes têm sido relatadas em mais de 40

espécies de animais domésticos e silvestres. Abortos esporádicos têm sido atribuídos à

infecção por L. ivanovii. A listeriose em ruminantes pode apresentar-se como encefalite,

aborto, septicemia ou endoftalmite e geralmente apenas uma forma da doença ocorre em

determinado grupo de animais afetados. Relatos de casos de mastite listerial em bovinos

são raros e geralmente ocorre na forma subclínica (GITTER et al., 1980; JENSEN et al.,

1996). Em ruminantes, a listeriose está associada à ingestão de silagem contaminada.

Em animais recém-nascidos frequentemente observa-se septicemia. Em cães, gatos,

eqüinos e suínos a listeriose pode provocar abortos além de encefalite (QUINN, 2005).

5.2. Listeriose em humanos

Forma invasiva

A listeriose na forma invasiva é caracterizada por apresentar quadros graves

em pessoas pertencentes aos grupos de risco. Em gestantes, a infecção é mais freqüente

no terceiro trimestre, geralmente assintomática ou com sintomas de gripe, já para o feto

ou recém nascido as conseqüências são extremamente graves, incluindo aborto, morte

fetal, parto prematuro, septicemia, meningite (ROCOURT e COSSART, 1997;

CRESPO et al., 1999; Di MAIO, 2000; COLODNER et al., 2003) e hidrocefalia

(LACIAR et al., 2000).

Em adultos L. monocytogenes apresenta tropismo pelo sistema nervoso

central, causando meningite e meningoencefalite. Em pacientes imunocomprometidos a

ocorrência de bacteremia é mais freqüente, e pode ser precedida por infecções focais

como endocardites, pneumonias, osteomielite, hepatite e peritonite além de outras

patologias (KERR et al., 1988; HOFER, 1998; HOFER et al., 1999; CRESPO et al.,

1999).

15

Forma não invasiva

Em indivíduos imunocompetentes L. monocytogenes pode causar uma

gastroenterite febril caracterizada por febre, diarréia, dor muscular e cefaléia com um

período de incubação que pode variar de 11horas a 1 semana. Em alguns casos, na

ausência de sintomas gastrintestinais, pode assemelhar-se a uma gripe. Surtos de

listeriose não invasiva têm envolvido uma série de alimentos prontos para o consumo

(SIM et al., 2002).

6. DIAGNÓSTICO

6.1. Análises em alimentos

As metodologias oficiais para análise microbiológica utilizadas para

detecção de L. monocytogenes em alimentos, são preconizadas pela Food and Drug

Administration (FDA, 1998) e pelo United States Department of Agriculture-Food

Safety and Inspection Service (USDA-FSIS, 1996), que são agências federais

regulamentadoras para alimentos. O USDA-FSIS é o órgão responsável pela

regulamentação de carnes, produtos cárneos, aves e ovos. A FDA é responsável pelos

outros alimentos, incluindo pescado. Ambas as agências desenvolvem metodologias e

estratégias de controle da qualidade em alimentos, que são adotadas em diversos países

(KLIMA e MONTVILLE, 1995; SILVA et al., 1997).

A metodologia para detecção de Listeria spp em amostras de carnes,

produtos cárneos e ambientes utiliza duas fases de enriquecimento em caldo, com

agentes seletivos como acriflavina, ácido nalidíxico e ciclohexamida. A acriflavina em

combinação com outros agentes seletivos como tiocianato de potássio e polimixina B

interrompe a síntese de RNA e mitocondriogênese inibindo o crescimento de

microrganismos Gram positivos. O ácido nalidíxico inibe a síntese de DNA e o

crescimento de microrganismos Gram negativos; a ciclohexamida (actidiona) inibe a

síntese protéica em células eucarióticas e previne o crescimento de bolores e leveduras

(SLADE, 1992; BEUMER e HAZELEGER, 2003).

Na fase de plaqueamento seletivo em meio sólido, não há diferenciação

entre as espécies, devendo-se selecionar cinco colônias para confirmação e identificação

das espécies, e essa seleção pode resultar na detecção apenas das espécies não

16

patogênicas, especialmente L. innocua que ocorre em maior frequência, em detrimento

da espécie patogênica em questão, L. monocytogenes (BEUMER e HAZELEGER,

2003). Esses autores sugerem o uso de meios de plaqueamento cromogênicos e de

meios à base de sangue para diferenciação das espécies hemolíticas.

Para identificação das espécies realiza-se uma série de testes bioquímicos

baseados nas características do gênero (Tabela 1), além da verificação de reação de

hemólise, motilidade a 25oC, coloração de Gram e catalase. Como alternativa,

apresentando maior praticidade na execução e rapidez nos resultados, podem ser

utilizados kits comerciais como o sistema miniaturizado de identificação bioquímica

API Listeria (bioMérieux) ( FDA, 1998). L. monocytogenes é subdividida em treze

sorotipos baseados em antígenos somáticos (O) e flagelares (H). A determinação

antigênica dos sorotipos de amostras positivas para L. monocytogenes amplamente

utilizada é a preconizada Seeliger e Höhne,(1979), que utiliza antissoros somáticos e

flagelares policlonais (ROCOURT, 1989; OJENIYI et al., 1996; HOFER et al., 2000;

HOFER e REIS, 2005).

6.2. Análises clínicas

O diagnóstico microbiológico clínico é feito a partir do cultivo de amostras

de sangue, de líquor ou de algum outro local normalmente estéril. O isolamento deve

ser feito preferencialmente em ágar sangue para verificação da reação de β-hemólise e a

identificação por provas bioquímicas, avaliando-se também a motilidade. O isolamento

de Listeria spp. de sítios não estéreis como placenta e líquido amniótico, em associação

com sintomas clínicos pode sugerir listeriose neonatal. Culturas de L. monocytogenes a

partir de fezes não auxiliam no diagnóstico já que o microrganismo pode ser eliminado

por portadores sadios. Da mesma forma, os testes sorológicos não contribuem para o

diagnóstico da listeriose, porque a reação dos anticorpos pode não ser específica (HOF

et al., 1997; JAY, 2000).

7. TRATAMENTO E PROFILAXIA

O ciclo intracelular e a capacidade de crescimento em diversos tipos

celulares, conferem à L. monocytogenes durante o curso da infecção, uma proteção

contra os mecanismos de defesa humoral e também contra a ação de antibióticos nos

17

fluídos extracelulares. Portanto, durante a listeriose, o antibiótico deve ser transportado

para o interior da célula hospedeira, por difusão passiva ou por transporte ativo (HOF et

al., 1997).

L. monocytogenes é susceptível in vitro, a uma série de antibióticos

incluindo penicilina G, ampicilina, eritromicina, sulfametoxazol-trimetoprim,

cloranfenicol, rifampicina, tetraciclinas e aminoglicosídeos. A associação de um

aminoglicosídeo, como a gentamicina, com um beta lactâmico produz sinergismo com

efeito bactericida, in vivo, sobre a bactéria e esta combinação tem sido a terapia de

escolha. Para pacientes alérgicos aos beta-lactâmicos, o co-trimoxazol representa uma

terapia alternativa (SCHUCHAT et al., 1991; HOF et al., 1997; KONEMAN, 2001).

As recomendações profiláticas são especialmente direcionadas para pessoas

pertencentes aos grupos de risco como gestantes, idosos e imunocomprometidos, no

sentido de evitar o consumo de produtos crus ou mal cozidos e relacionados a surtos de

listeriose. Tanto a FDA, USDA-FSIS e os Centers for Disease Control and Prevention

(CDC) têm conduzido estudos de avaliação de risco e estratégias para redução dos casos

de listeriose, especialmente para as populações de risco (SCHUCHAT et al., 1991;

FDA/USA/CDC, 2005).

Na produção de alimentos o monitoramento constante dos produtos e das

plantas de processamento, com a implantação de sistemas de Análises de Perigos e

Pontos Críticos de Controle (APPCC), tem sido obrigatório em países como Estados

Unidos, Canadá, Nova Zelândia e Austrália. O setor privado tem desenvolvido e

aperfeiçoado métodos de gerenciamento de perigos e controle, particularmente em

resposta aos incentivos e à constante e crescente regulação do mercado (UNNEVEHR e

ROBERTS, 2002).

8. SITUAÇÃO ATUAL

A dose mínima infectante de L. monocytogenes para humanos é

desconhecida. Os relatos de contagens do patógeno em alimentos contaminados

associados a surtos e casos esporádicos de listeriose, não fornecem muitas evidências de

que um baixo número de células de L. monocytogenes em alimentos cause doença.

Alguns países têm estabelecido limites legais e estabelecido padrões para a quantidade

do patógeno em alimentos, especialmente os prontos para consumo (LAHELLEC,

1995; KLIMA e MONTVILLE, 1995; FARBER e HARWIG, 1996).

18

O governo dos Estados Unidos tem a política mais rígida considerando

L. monocytogenes um “adulterante” e isto significa que, quando é detectada a presença

do patógeno em um alimento o mesmo é considerado adulterado e, portanto sujeito a

recall e/ou apreensão. É a política conhecida como “tolerância zero” determinada pela

ausência do patógeno em 25gr de amostra, que é equivalente a n=5, c=0 em um plano

de amostragem (KLIMA e MONTVILLE, 1995; JAY, 2000).

A diretiva da Comunidade Européia sobre leite e derivados determina o

padrão de “tolerância zero” para queijos moles e ausência de L. monocytogenes em 1gr

dos outros produtos. Na Grã Bretanha determinou-se padrões para alguns alimentos

prontos para o consumo estabelecendo grupos baseados no número de L.

monocytogenes presentes. Quando o microrganismo não é detectado em 25 g. o

alimento é considerado satisfatório; entre 102 e 103UFC/25g. é considerado

insatisfatório e acima de 103UFC/25g. o alimento é considerado inaceitável (JAY,

2000).

O Canadá adotou uma política regulatória baseada na redução do risco de

contaminação, já que o microrganismo nem sempre será erradicado do produto final ou

do meio ambiente. Essa política está direcionada para a inspeção e o cumprimento de

ações principalmente para alimentos prontos para o consumo que possam permitir ou

favorecer o crescimento de L. monocytogenes. Para tanto três categorias foram

estabelecidas, incluindo na categoria I alimentos geralmente relacionados a surtos e com

alta prioridade na inspeção e rigor nas ações, como recolhimento e alerta público; na

categoria II estão os alimentos com vida de prateleira maior do que 10 dias, os quais se

detectada a presença de L. monocytogenes, serão recolhidos e considerada a

possibilidade de alerta público e na categoria III estão aqueles alimentos com vida de

prateleira menor do que 10 dias (FARBER e HARWIG, 1996).

No Brasil, a legislação brasileira não prevê limites de tolerância para a

presença do microrganismo em carnes e produtos cárneos e a Resolução da Diretoria

Colegiada, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA-RDC no. 12/2001)

aprovou o Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos, e

somente estabeleceu a pesquisa de L. monocytogenes (ausência em 25g) para queijos de

média a muito alta umidade (BRASIL, 2001).

O United States Department of Health and Humans Services Healthy People

2010 objetiva reduzir a incidência de casos de listeriose, até o final desta década, para

2,5 casos em 1 milhão de pessoas. De acordo com dados da Foodborne Diseases Active

19

Surveillance Network (FoodNet) a incidência de casos confirmados de listeriose em

2004 foi de 2,7 em 1 milhão de pessoas, o que representou um decréscimo de 40% no

período entre 1996 a 2004. Em 2004 foram 15.806 casos confirmados de doenças

transmitidas por alimentos nas regiões abrangidas pela FoodNet, e destes 120 foram

casos de listeriose responsáveis pelo maior índice de hospitalizações (91%) e pela maior

taxa de mortalidade (17%), confirmando que apesar da baixa incidência apresenta uma

alta taxa de mortalidade quando comparada com outras enfermidades transmitidas por

alimentos, como salmonelose e campilobacteriose (MMWR, 2005).

9. CONCLUSÃO

A emergência da listeriose é o resultado de complexas interações de

diferentes fatores, como o avanço na área médica que tem aumentado a expectativa de

vida das populações incluindo os imunocomprometidos, a expansão da indústria

alimentícia e sistemas de estocagem a frio, assim como dos hábitos alimentares

verificado pelo aumento na demanda por alimentos prontos para o consumo.

A partir dos primeiros relatos associando a listeriose ao consumo de

alimentos, observou-se uma intensa busca por conhecimentos mais profundos sobre o

microrganismo Listeria e a doença listeriose, confirmado pelo volume de pesquisas

realizadas no mundo todo, principalmente nos países desenvolvidos.

Investigar o complexo Listeria–listeriose requer uma íntima colaboração de

profissionais de diversas áreas como epidemiologistas, clínicos, veterinários e

microbiologistas entre outros e dos órgãos governamentais responsáveis por assegurar a

qualidade dos alimentos e a saúde pública, sendo fundamental também o envolvimento

do setor privado.

20

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BADER, J.M. Source of listeriosis outbreaks in France. Lancet, 341-487, 1993.

BARBALHO, T.C.F.; ALMEIDA, P.F.; ALMEIDA, R.C.C.; HOFER, E. Prevalence of Listeria spp. at a

poultry processing plant in Brazil and a phage test for rapid confirmation of suspect colonies. Food

Control, v.16, p. 211-216, 2005.

BERESFORD, M.R.; ANDREW, P.W.; SHAMA, G. Listeria monocytogenes adheres to many materials

found in food-processing environments. Journal of Applied Microbiology, v.90, p.1000-1005, 2001.

BEUMER, R.R.; HAZELEGER, W.C. Listeria monocytogenes: diagnostic problems. Immunology and

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28

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

- Avaliar a ocorrência de Listeria monocytogenes no processamento da carne

bovina.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar a ocorrência das diferentes espécies de Listeria em plantas de

processamento de carnes e identificar os principais pontos de contaminação e

incorporação do patógeno.

- Identificar os principais sorotipos de L. monocytogenes envolvidos na

contaminação da carne bovina e em plantas de processamento.

- Identificar os principais pontos de contaminação e incorporação de

microrganismos indicadores no processamento da carne bovina, visando implantação

das boas práticas de fabricação nos estabelecimentos.

- Avaliar a microbiota presente na carne bovina e possíveis interferências no

isolamento de L. monocytogenes.

ARTIGO 1


BOVINA E IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS PONTOS


PROCESSAMENTO

Márcia de Aguiar Ferreira Barros*1, Luís Augusto Nero2, Lívia Cavalletti

da Silva1, Loredana d’Ovídio1, Ronaldo Tamanini1, Rafael Fagnani1,

Ernesto Hofer3, Vanerli Beloti1

*Autor para correspondência: M.A.F. Barros, Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal,

DMVP, Universidade Estadual de Londrina. Caixa Postal 6001, 86051 990, Londrina, PR. Tel.: (43) 3371

4708, Fax: (43) 3371 4714. E-mail: [email protected] 1 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina, Londrina PR. 2 Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa MG. 3 Departamento de Bacteriologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro RJ.

30

RESUMO

Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram positiva, patogênica, cuja transmissão

ocorre principalmente pela ingestão de alimentos contaminados. Os principais relatos de

surtos e de casos esporádicos envolvem imunocomprometidos, gestantes e seus fetos,

recém-nascidos e idosos. Os perigos microbiológicos existentes na carne bovina in

natura são razoavelmente conhecidos, mas não se dispõe de dados epidemiológicos

seguros sobre a origem da contaminação por L. monocytogenes na carne bovina

brasileira. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a ocorrência de Listeria spp.,

especialmente de L. monocytogenes e dos principais sorotipos, na carne bovina in

natura e em plantas de processamento. Foram colhidas 443 amostras de equipamentos,

instalações e de produtos como meias carcaças, cortes comerciais, carne moída e

embutidos provenientes de estabelecimentos processadores de carne (10 casas de carnes

e 01 abatedouro) localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. Para a

pesquisa de L. monocytogenes utilizou-se a metodologia preconizada pelo United States

Department of Agriculture. A ocorrência de Listeria spp. nas amostras analisadas foi de

37,7% (167) e destas 51,4% (76) foram de equipamentos, 35,4% (23) de instalações e

29,6% (68) de carcaças, cortes comerciais e produtos cárneos. As espécies detectadas

foram L. monocytogenes (12,6%), L. innocua (78,4%), L. seeligeri (1,2%), L.

welshimeri (7,2%) e L. grayi (0,6%). Os sorotipos de L. monocytogenes identificados

foram 1/2a e 4b, sendo importante ressaltar que o sorotipo identificado no moedor

(1/2a) foi do mesmo grupo identificado na carne moída, o mesmo acontecendo com o

misturador (4b) e duas amostras de embutidos. A análise dos resultados permite

concluir que diversos equipamentos (moedores, amaciadores, misturadores,

embutideiras, mesas, caixas plásticas, serras e balanças) e instalações, especialmente

pisos, ralos e balcões representaram importantes pontos de incorporação do patógeno à

carne e aos produtos finais.

Palavras chaves: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; carne bovina; planta de

processamento.

31

ABSTRACT

Listeria monocytogenes: occurrence in red meat and identification of the main

contamination points in processing plants.

Listeria monocytogenes is a pathogenic microorganism, Gram positive, which

transmission occurs mainly by ingestion of contaminated foods. The most of outbreaks

and sporadic cases of listeriosis involve immune-depressed patients, new born, pregnant

and elderly people. The microbiological hazards in raw meat are reasonably known, but

there is no consistent epidemiological data concerning the origin of L. monocytogenes

contamination in the red meat processing plant in Brazil. The goal of this work was

establish the occurrence of Listeria spp., especially L. monocytogenes and its main

serotypes, in bovine raw meat and in red meat processing plants. It was collected 443

samples of several equipments, installations, and products, such as carcasses,

commercial cuts, ground beef and sausages, in 11 meat processing establishments (10

meat retailers and 1 slaughterhouse), located at north region of Paraná state, Brazil. All

samples were submitted to detection of L. monocytogenes, according United States

Department of Agriculture Methodology. The occurrence of L. monocytogenes in the

samples were 37.7% (167), which 51.4% (76) were from equipments and transport

samples, 35.4% (23) from installations and 29.6% (68) from products. Considering all

Listeria spp. isolated, the following species were identified: L. monocytogenes (12.6%),

L. innocua (78.4%), L. seeligeri (1.2%), L. welshimeri (7.2%) and L. grayi (0.6%). The

L. monocytogenes serotypes identified were 1/2a and 4b. The serotype detected in

grinder (1/2a) was the same detected in the ground beef; the same relation occurred in

mixer and sausages, where the serotype 4b was isolated. The analysis of results allows

the conclusion that several equipments (grinders, smothers, mixers, packing machines,

tables, plastic boxes, saws and balances) and installations sites (floors, spouts,

balconies) are important points of L. monocytogenes incorporation in meat and final

meat products.

Key words: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; red meat; meat processing plant.

32

1. INTRODUÇÃO

Listeria monocytogenes é um bacilo gram positivo, mesófilo, não

esporulado, aeróbio, e facultativamente intracelular e anaeróbio, patogênico para os

animais e seres humanos, podendo ser encontrado na matéria orgânica em

decomposição, no solo, águas tratadas e residuais, forragens, fertilizantes, superfícies de

equipamentos e alimentos de origem animal e vegetal, já tendo sido isolado de mais de

40 espécies de mamíferos e 17 de aves (KONEMAN, 2001).

Diferentemente da maioria dos outros patógenos, apresenta características

psicrotróficas podendo desenvolver-se e multiplicar-se em alimentos mantidos sob

temperaturas de refrigeração (DYKES, 2003). A resistência do microrganismo a agentes

antimicrobianos, substâncias químicas como ácidos e álcalis e a capacidade de formação

de biofilmes sobre várias superfícies torna difícil sua eliminação (HOOD e ZOTTOLA,

1995; DYKES e MOORHEAD, 2001; TAKHISTOV e GEORGE, 2004). Biofilmes são

geralmente, comunidades multiespécies nas quais diferentes microrganismos estão

integrados em estruturas complexas. Estudos têm demonstrado a capacidade de L.

monocytogenes de formar biofilmes sobre materiais comumentemente utilizados em

indústrias de alimentos inclusive na presença de outros microrganismos (BERESFORD

et al., 2001).



consumo de alimentos contaminados (SCHLECH et al, 1983; LINNAN et al, 1988;

BULA et al, 1988; FARBER e PETERKING, 1991; MOURA et al., 1993). Após um

surto de listeriose ocorrido em 1985 na Califórnia, envolvendo 142 pessoas com 48

mortes, avaliou-se a participação de produtos cárneos como veículos da infecção, e o

envolvimento desses alimentos em surtos e casos esporádicos de listeriose humana ficou

comprovado em diversas pesquisas realizadas em diversos países (KERR et al., 1988;

(SCHWARTZ et al., 1988; CANTONI et al., 1989; BADER, 1993; GOULET et al.,

1995; JACQUET et al., 1995).

A listeriose assume grande importância entre as doenças de origem

alimentar, porque embora exista uma margem de risco para todos os consumidores, em

indivíduos pertencentes a grupos de risco como as gestantes, os recém nascidos, os

idosos e os imunocomprometidos, na forma invasiva essa doença está associada com

33

septicemia, encefalite, meningite, abortos e altos índices de mortalidade (ROCOURT,

1994; HOFER, 1998; HOFER et al., 1999).

Apesar de muitos indivíduos consumirem alimentos contaminados com o

microrganismo, a incidência de listeriose é relativamente baixa (HOF, 2003; OKUTANI

et al., 2004). Diversos fatores parecem estar envolvidos na ocorrência da doença, como

imunocompetência do hospedeiro e particularidades da cepa envolvida relacionadas

principalmente com a virulência dos diversos sorotipos (BUNCIC et al., 2001; AQUAJ

et al., 2002). L. monocytogenes é subdividida em sorotipos baseados em antígenos

somáticos (O) e flagelares (H). Treze sorotipos têm sido identificados, mas a maioria

dos casos de doenças em humanos tem sido causada por apenas três (1/2a, 1/2b e 4b)

(ROCOURT, 1989; OJENIYI et al., 1996).

No Brasil, pesquisas publicadas relatam a ocorrência de Listeria spp. em

alimentos como vegetais (HOFER, 1975a), camarão (HOFER e RIBEIRO, 1990;

DESTRO et al., 1996), carnes, leite e derivados (DESTRO et al.,1991; CASAROTTI et

al., 1994; SILVA et al., 1998; SILVA et al., 2004) e ambientes como esgotos (HOFER,

1975b) e solo (HOFER e PÓVOA, 1984). Até o momento, nenhum caso clínico de

listeriose foi associado ao consumo de alimentos contaminados, provavelmente devido

aos laboratórios clínicos não incluírem a pesquisa do patógeno na rotina.

Devido à gravidade das infecções, nas quais a taxa de mortalidade em

indivíduos pertencentes aos grupos de risco pode alcançar até 50%, e por não ser ainda

conhecida a dose mínima infectante (Di MAIO, 2000; LACIAR et al., 2000;

CABANES et al., 2002), nos Estados Unidos a Food and Drug Administration (FDA)

estabeleceu a norma de “tolerância zero” para a presença de L. monocytogenes em

alimentos prontos para o consumo, sendo seguida pelo United States Department of

Agriculture (USDA). Alguns países da Europa têm sido mais tolerantes, admitindo a

presença de até 100 células de L. monocytogenes por grama ou por mililitro de alimento

(ARCHER, 1996).

A legislação brasileira não prevê limites de tolerância para a presença do

microrganismo em carnes e produtos cárneos (BRASIL, 2001). Apesar do grande

volume de trabalhos realizados sobre L. monocytogenes, não há estudos que

estabeleçam a real ocorrência do microrganismo na carne bovina brasileira e que

forneçam dados para efetivar medidas de controle específicas na obtenção e

processamento da carne.

34

Neste estudo objetivou-se avaliar a ocorrência de L. monocytogenes no

processamento da carne, identificar os sorotipos envolvidos e os principais pontos de

contaminação e incorporação do patógeno, visando a implantação de práticas adequadas

de fabricação nos estabelecimentos, que contribuam para a redução e/ou eliminação do

microrganismo.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Amostras

As amostras foram colhidas em 11 estabelecimentos processadores de carne

(10 casas de carnes e 01 abatedouro) localizados na região norte do estado do Paraná, no

período de julho de 2003 a fevereiro de 2005, totalizando 443 amostras.

2.2. Pontos de amostragem e procedimentos de colheita

Para as colheitas utilizou-se, a técnica do esfregaço de superfície (ABNT,

1988) com swabs e moldes estéreis sendo as amostras resuspensas em 45mL de água

peptonada 0,1% (OXOID) e mantidas sob refrigeração até o seu processamento. Na

Tabela 1.1 são descritos todos os pontos analisados assim como as áreas amostradas

Produtos

- Meias carcaças refrigeradas: foram realizados swabs de meias carcaças

refrigeradas, selecionando-se 5 pontos de 10cm2. Os 5 swabs foram colocados em

bags estéreis contendo o diluente.

- Cortes comerciais: foram amostrados cortes que comercialmente são destinados

ao preparo de alimentos consumidos crus ou mal passados. O procedimento de

colheita foi o mesmo utilizado para as meias carcaças, mas utilizando-se dois

moldes de 25cm2.

- Embutidos e carnes moídas: 5g de cada amostra foram homogeneizados em

45mL de água peptonada 0,1%.

35

Equipamentos

Foram amostrados equipamentos como amaciadores, balanças, caixas

plásticas, cubas de aço inoxidável, embutideiras, estrados, facas, ganchos, mesas,

misturadores, moedores, serras e caminhões transportadores (paredes internas e piso).

Os pontos demarcados variaram de 2 a 3 conforme o tipo de equipamento, com exceção

dos ganchos, dos quais foi amostrada toda a área de superfície.

Instalações

Foram amostrados balcões refrigeradores, paredes, pisos, plataformas, ralos

e sistemas de refrigeração e os pontos demarcados variaram de 2 a 3 conforme o

tamanho do equipamento, com exceção dos ralos em que toda a área de superfície foi

amostrada.

2.3. Detecção da presença de L. monocytogenes

As amostras foram analisadas no Laboratório de Inspeção de Produtos de

Origem Animal (LIPOA) da Universidade Estadual de Londrina. A metodologia

utilizada para detecção de Listeria spp. foi a recomendada para carnes e equipamentos

pelo United States Department of Agriculture (USDA,1996), com modificação quanto

ao volume utilizado no enriquecimento primário que foi realizado em caldo base

seletivo Listeria – formulação Universidade de Vermont (UVM) (CM863-OXOID)

incubando 5mL das amostras em 45mL de UVM a 30oC/ 24h. Após essa fase procedeu-

se o enriquecimento seletivo secundário semeando 0,1mL do caldo UVM para tubos

contendo 10mL de caldo Fraser (CM 895-OXOID) e incubando a 35oC/24-48h. A partir

dos tubos positivos (escurecimento do meio) procedeu-se ao plaqueamento seletivo

diferencial em Ágar Oxford Modificado (OXM) (DIFCO) e incubação a 35oC/24-48h

para verificação de crescimento de colônias típicas (pequenas, cinzentas, rodeadas por

halo escuro devido à hidrólise de esculina).

Para a confirmação, cinco colônias típicas foram selecionadas

aleatóriamente e estriadas em placas de Ágar Tripticase de Soja (DIFCO) suplementado

com 0,6% de extrato de levedura (TSA-YE) e incubação a 30oC/24-48h. Após formação

das colônias, as mesmas eram observadas sob luz oblíqua (Sistema de Henry), e

36

selecionada colônia azulada típica. Essa colônia era então novamente estriada em TSA-

YE e incubada a 30oC/24h para realização das provas de identificação das espécies.

2.4. Identificação fenotípica das espécies

Todas as amostras positivas para Listeria spp. foram submetidas às análises

de coloração de Gram, prova da catalase, verificação de hemólise em ágar sangue

eqüino 7%, fermentação de carbohidratos (manitol, rhamnose, xilose e dextrose) e

motilidade a 25oC (PAGOTTO et al., 2004). Ainda, todas as culturas isoladas de

amostras identificadas como positivas para L. monocytogenes, L. welshimeri, L.

seeligeri, L. grayi e 17 de L. innocua, num total de 53 culturas, foram identificadas pelo

sistema API Listeria (bioMérieux).

2.5. Identificação dos sorotipos de L. monocytogenes

As amostras identificadas como positivas para L. monocytogenes foram

enviadas ao Laboratório de Zoonoses Bacterianas, do Departamento de Bacteriologia,

do Instituto Oswaldo Cruz, para determinação antigênica dos sorotipos conforme

descrito por Seeliger e Höhne,(1979) utilizando-se antissoros somáticos e flagelares

policlonais.

37

Tabela 1.1. Pontos de amostragem, origem, total de amostras colhidas e área de

superfície amostrada de equipamentos, instalações e produtos de 10casas de carnes e 01

abatedouro frigorífico situados na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Descrição das amostras Casas de carnes

Abatedouro Total Área / quantidade amostrada

n n n cm2/ g Equipamentos

Amaciadores 8 - 8 30 cm2 Balanças 9 - 9 30 cm2 Caixas plásticas 26 2 28 30 cm2 Serras 10 - 10 30 cm2 Cubas de aço inoxidável 10 - 10 30 cm2 Embutideiras 2 1 3 30 cm2 Estrados 10 - 10 30 cm2 Facas 15 6 21 30 cm2 Ganchos 7 3 10 Área de superfície Mesas 20 1 21 60 cm2 Misturadores 3 1 4 30 cm2 Moedores 9 1 10 30 cm2 Caminhões 4 - 4 60 cm2

Instalações

Balcões refrigeradores 11 - 11 60 cm2 Paredes 10 - 10 60 cm2 Pisos 9 1 10 60 cm2 Plataformas - 5 5 60 cm2 Ralos 18 7 25 Área de superfície Sistemas de refrigeração 4 - 4 60 cm2

Produtos

Carcaças bovinas 142 9 151 50 cm2 Carcaças suínas - 3 3 50 cm2 Carnes Moídas 12 - 12 5 g Cortes comerciais 51 1 52 50 cm2 Embutidos - 2 2 5 g Lingüiças tipo frescal 10 - 10 5 g

Total 400 43 443

(-) não amostrados n = número de amostras

38

3. RESULTADOS

Na Tabela 1.2, verifica-se que a freqüência de Listeria spp. nas 443

amostras analisadas foi de 37,7% (167), e deste total 51,4% (76) foram isoladas de

equipamentos, 35,4% (23) de instalações e 29,6% (68) de produtos.

A análise individual dos estabelecimentos evidenciou maiores taxas de

freqüência de Listeria spp. em equipamentos (54,1%), instalações (36,5%) e produtos

(31,6%) das casa de carnes, enquanto que nas amostras do abatedouro as freqüências

foram de 26,7%, 30,8% e 0%, respectivamente.

As espécies identificadas (Tabela 1.3) nas casas de carnes foram:

L. monocytogenes (13,2%), L. innocua (77,4%), L. welshimeri (7,5%), L. seeligeri

(1,3%) e L. grayi (0,6%). No abatedouro detectou-se apenas L. innocua em 08 amostras

sendo 04 (50%) de equipamentos e 04 (50%) de instalações. Os sorotipos de

L. monocytogenes identificados foram 1/2a e 4b (Tabela 1.5).

Com exceção dos ganchos, em todos os tipos de equipamentos das casas de

carnes, detectou-se Listeria spp. com freqüência de 54,1% (72). No abatedouro, das 15

amostras de equipamentos colhidas foi detectada a presença de Listeria spp. em uma

caixa plástica, uma embutideira, um misturador e em um moedor, o que correspondeu a

uma freqüência total de 26,7% (Tabela 1.2). As freqüências observadas para as espécies

identificadas foram de 9,2% para L. monocytogenes (07), 75,% para L. innocua (57),

2,6% para L. seeligeri (02), 11,8% para L. welshimeri (09) e frequência de 1,3% para L.

grayi (01) isolada de amostras de equipamentos (Tabela 1.3).

Os principais pontos de contaminação são descritos na tabela 1.4 e pode-se

observar que as caixas plásticas, embutideiras, misturadores e moedores representaram

importantes fontes de contaminação por L. monocytogenes tanto no abatedouro quanto

nas casas de carnes, nas quais ainda detectou-se a contaminação em amaciador. Os

sorotipos identificados das amostras positivas para L. monocytogenes em equipamentos

foram 1/2a e 4b (Tabela 1.5).

A freqüência geral de Listeria spp. detectada em amostras de instalações foi

de 35,4% (23); quando analisados individualmente os resultados das casas de carnes e

do abatedouro as freqüências foram de 36,5% e 30,8% respectivamente (Tabela 1.2).

As espécies identificadas foram: L. monocytogenes em 02 amostras (8,7%),

L. innocua em 18 (78,3%) e L. welshimeri em 03 (13%). As amostras positivas para L.

39

monocytogenes foram provenientes de pisos de casas de carnes. L. innocua não foi

detectada nas amostras de plataformas do abatedouro e de sistemas de refrigeração das

casas de carnes (Tabela 1.3). Observando-se a Tabela 1.4 verifica-se que os balcões

refrigeradores, os pisos e os ralos constituíram os principais pontos de contaminação das

casas de carnes. No abatedouro, pelas amostras analisadas, as instalações não

representaram fontes de contaminação por L. monocytogenes. Os sorotipos identificados

nas amostras de pisos foram dos grupos 1/2a e 4b (Tabela 1.5).

A análise da Tabela 1.2 permite verificar que não foi detectada a presença

de Listeria spp. nas amostras de produtos colhidas no abatedouro. Nas casas de carnes,

19% (27) de amostras de meias carcaças bovinas, 47,1% (24) de cortes comerciais,

66,7% (08) de carnes moídas e 90% (09) de lingüiças do tipo frescal foram positivas

para Listeria spp. As espécies identificadas foram L. monocytogenes (17,6%) e L.

innocua (82,4%). Deste total, L. monocytogenes foi detectada em 25,9% (07) das

amostras de meias carcaças bovinas, em 4,2% (01) de corte comercial, em 25% (02) de

carnes moídas e em 22,2% (02) amostras de lingüiças do tipo frescal (Tabela 1.3). Os

sorotipos identificados nas amostras positivas para L. monocytogenes foram 1/2a (30%)

e 4b (70%) (Tabela 1.5).

40

Tabela 1.2. Freqüência de Listeria spp. em amostras de equipamentos, instalações,

carnes e produtos cárneos provenientes de plantas de processamento de 11

estabelecimentos localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Número de amostras Amostras analisadas Positivas para Listeria spp. (%)

Amostras

I II Total I II Total Equipamentos

Amaciadores 8 - 8 4 (50,0) - 4 (50,0) Balanças 9 - 9 5 (55,6) - 5 (55,6) Caixas plásticas 26 2 28 20 (76,9) 1 (50,0) 21 (75,0) Serras 10 - 10 3 (30,0) - 3 (30,0) Cubas de aço inoxidável 10 - 10 7 (70,0) - 7 (70,0) Embutideiras 2 1 3 2 (100,0) 1 (100,0) 3 (100,0) Estrados 10 - 10 6 (60,0) - 6 (60,0) Facas 15 6 21 4 (26,7) 0 (0,0) 4 (19,0) Ganchos 7 3 10 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) Mesas 20 1 21 12 (60,0) 0 (0,0) 12 (57,1) Misturadores 3 1 4 2 (66,7) 1 (100,0) 3 (75,0) Moedores 9 1 10 6 (66,7) 1 (100,0) 7 (70,0) Caminhões frigoríficos 4 - 4 1 (25,0) - 1 (25,0) Subtotal 133 15 148 72 (54,1) 4 (26,7) 76 (51,4)

Instalações

Balcões 11 - 11 3 (27,3) - 3 (27,3) Paredes 10 - 10 1 (10,0) - 1 (10,0) Pisos 9 1 10 5 (55,6) 1 (100,0) 6 (60,0) Plataformas - 5 5 - 0 (0,0) 0 (0,0) Ralos 18 7 25 10 (55,6) 3 (42,9) 13 (52,0) Sistemas de refrigeração 4 - 4 0 (0,0) - 0 (0,0) Subtotal 52 13 65 19 (36,5) 4 (30,8) 23 (35,4)

Produtos

Carcaças bovinas 142 9 151 27 (19,0) 0 (0,0) 27 (17,9) Carcaças suínas - 3 3 - 0 (0,0) 0 (0,0) Carne Moída 12 - 12 8 (66,7) - 8 (66,7) Cortes comerciais 51 1 52 24 (47,1) 0 (0,0) 24 (46,2) Embutidos - 2 2 - 0 (0,0) 0 (0,0) Lingüiças frescais 10 - 10 9 (90,0) - 9 (90,0) Subtotal 215 15 230 68 (31,6) 0 (0,0) 68 (29,6)

Total 400 43 443 159 (39,8) 8 (18,6) 167 (37,7)

I: Casas de carnes II: Abatedouro

(-) não amostrado

41

Tabela 1.3. Freqüências das diferentes espécies de Listeria spp. identificadas de amostras de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos

provenientes de plantas de processamento de 11 estabelecimentos localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Número de amostras (%) Positivas para Listeria spp. Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria seeligeri Listeria welshimeri

Amostras

I II Total I II Total I II Total I II Total I II Total Equipamentos

Amaciadores 4 - 4 1 (25,0) - 1 (25,0) 2 (50,0) - 2 (50,0) 0 - 0 1 (25,0) - 1 (25,0)

Balanças 5 - 5 0 - 0 4 (80,0) - 4 (80,0) 0 - 0 1 (20,0) - 1 (20,0)

Caixas plásticas* 20 1 21 4 (20,0) 0 4 (19,0) 11 (55,0) 1 (100,0) 12 (57,1) 2 (10,0) 0 2 (9,5) 2 (10,0) 0 2 (9,5)

Serras 3 - 3 0 - 0 2 (66,7) - 2 (66,7) 0 - 0 1 (33,3) - 1 (33,3)

Cubas de aço inoxidável 7 - 7 0 - 0 6 (85,7) - 6 (85,7) 0 - 0 1 (14,3) - 1 (14,3)

Embutideiras 2 1 3 0 0 0 2 (100,0) 1 (100,0) 3 (100,0) 0 0 0 0 0 0

Estrados 6 - 6 0 - 0 6 (100,0) - 6 (100,0) 0 - 0 0 - 0

Facas 4 0 4 0 - 0 4 (100,0) - 4 (100,0) 0 - 0 0 - 0

Mesas 12 0 12 0 - 0 10 (83,3) - 10 (83,3) 0 - 0 2 (16,7) - 2 (16,7)

Misturadores 2 1 3 1 (50,0) 0 1 (33,3) 1(50,0) 1 (100,0) 2 (66,7) 0 0 0 0 0 0

Moedores 6 1 7 1 (16,7) 0 1 (14,3) 4 (66,7) 1 (100,0) 5 (71,4) 0 0 0 1 (16,7) 0 1 (14,3)

Caminhões frigoríficos 1 - 1 0 - 0 1 (100,0) - 1 (100,0) 0 - 0 0 - 0

Subtotal 72 4 76 7 (9,7) 0 7 (9,2) 53 (73,6) 4 (100,0) 57 (75,0) 2 (2,8) 0 2 (2,6) 9 (12,5) 0 9 (11,8)

Instalações

Balcões 3 - 3 0 - 0 2 (66,7) - 2 (66,7) 0 - 0 1 (33,3) - 1 (33,3)

Paredes 1 - 1 0 - 0 1 (100,0) - 1 (100,0) 0 - 0 0 - 0

Pisos 5 1 6 2 (40,0) 0 2 (33,3) 2 (40,0) 1 (100,0) 3 (50,0) 0 0 0 1 (20,0) 0 1 (16,7)

Ralos 10 3 13 0 0 0 9 (90,0) 3 (100,0) 12 (92,3) 0 0 0 1 (10,0) 0 1 (7,7)

Subtotal 19 4 23 2 (10,5) 0 2 (8,7) 14 (73,7) 4 (100,0) 18 (78,3) 0 0 0 3 (15,8) 0 3 (13,0)

Produtos

Carcaças bovinas 27 0 27 7 (25,9) - 7 (25,9) 20 (74,1) - 20 (74,1) 0 - 0 0 - 0

Carnes Moídas 8 - 8 2 (25,0) - 2 (25,0) 6 (75,0) - 6 (75,0) 0 - 0 0 - 0

Cortes 24 0 24 1 (4,2) - 1 (4,2) 23 (95,8) - 23 (95,8) 0 - 0 0 - 0

Lingüiças frescais 9 - 9 2 (22,2) - 2 (22,2) 7 (77,8) - 7 (77,8) 0 - 0 0 - 0

Subtotal 68 0 68 12 (17,6) - 12 (17,6) 56 (82,4) - 56 (82,4) 0 - 0 0 - 0

Total 159 8 167 21 (13,2)

0

21 (12,6)

123 (77,4)

8 (100,0)

131 (78,4)

2 (1,3)

0

2 (1,2)

12 (7,5)

0

12 (7,2)

* Detecção de Listeria grayi em 01 amostra de caixa plástica proveniente de casas de carnes (5,0%). Outras freqüências: 4,8% (total de caixas plásticas positivas); 1,4% (total de amostras positivas de equipamentos de casas de carnes); 1,3% (total de amostras positivas de equipamentos); 0,6% (total de amostras positivas de casas de carnes); 0,6% (total de amostras positivas).

I: Casas de carnes II : Abatedouro ( - ) não amostrado

42

Tabela 1.4. Principais pontos de contaminação por Listeria spp. e L. monocytogenes em

equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos identificados em 11

estabelecimentos processadores de carne localizados na região norte do estado do

Paraná, Brasil.

Origem Principais pontos de contaminação Listeria spp. Listeria monocytogenes

Equipamentos

I Amaciadores, balanças, caixas plásticas, cubas de aço inoxidável, embutideiras, mesas, misturadores, moedores e serras.

Amaciadores, caixas plásticas, misturadores e moedores.

II Caixas plásticas, embutideiras, misturadores e moedores.

--

Instalações

I Balcões refrigeradores, pisos e ralos.

Pisos

II Pisos e ralos. --

Produtos

I Carcaças bovinas, carnes moídas, cortes comerciais e lingüiças frescais.

Carcaças bovinas, carnes moídas e lingüiças frescais.

II -- --

I: Casas de carnes II: Abatedouro

Tabela 1.5. Ocorrência de sorotipos de L. monocytogenes em amostras colhidas de

equipamentos, instalações e produtos provenientes de 11 estabelecimentos

processadores de carne bovina da região norte do estado do Paraná, Brasil.

Origem N. de culturas testadas Sorotipos Equipamentos

Amaciador 1 4b Caixas plásticas 4 4b Misturador 1 4b Moedor 1 1/2a

Instalações

Pisos 2 1/2a, 4b Produtos

Carcaças bovinas 7 1/2a, 4b Carne Moída 1 1/2a Lingüiças frescais 2 4b

43

4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

Para alguns autores a presença de L. monocytogenes em carcaças é

usualmente atribuída à contaminação por matéria fecal durante o abate, sendo estimada

uma alta porcentagem (11 a 52%) de animais portadores sadios (ROCOURT, 1994). Em

recente pesquisa, Hofer e Reis (2005) relatam freqüência de 57,6% (142) amostras

positivas para L. innocua, resultante principalmente de fezes de bovinos normais, e de

41,4% (102) positivas para L. monocytogenes das quais 30,4% (75) foram provenientes

de fezes e secreção nasal de bovinos normais do estado do Rio de Janeiro.

Nesbakken et al. (1996) consideram o meio ambiente das plantas de

processamento como importante fonte de contaminação, e citam pesquisa realizada por

Van den Elzen e Snijders (1993) em abatedouro de suínos que mostra uma maior

incidência de L. monocytogenes no ambiente das salas de cortes do que no início do

abate. Diversas pesquisas sobre a ocorrência desse microrganismo em plantas de

processamento de carnes também apontam o meio ambiente e os equipamentos como

fontes de contaminação de carnes e produtos cárneos (SLADE, 1992; PICCHI et al.,

1999; SUIHKO et al., 2002; PECCIO et al., 2003; BARBALHO et al., 2005; BARROS

et al., 2004; GUDBJÖRNSDÓTTIR et al., 2004).

Os resultados obtidos nessa pesquisa indicaram que a contaminação da

carne por Listeria spp. originou-se principalmente, do ambiente de processamento das

casas de carnes, e a contaminação do ambiente pode ter ocorrido a partir de carcaças

contaminadas e por manipuladores. Nas meias carcaças das casas de carnes verificou-se

a presença de L. monocytogenes e L. innocua. Como apenas um caminhão transportador

apresentou contaminação e nas casas de carnes foram identificados vários pontos

contaminados por diversas espécies de listeria, acreditamos que o ambiente tenha

favorecido essa contaminação já nas câmaras frias.

As caixas plásticas, nas quais ficam acondicionados diversos tipos de

produtos como cortes específicos, embutidos e até carnes moídas foram os

equipamentos que apresentaram as maiores freqüências de contaminação por

L. monocytogenes e por outras espécies. Esse tipo de equipamento é particularmente

difícil de ser higienizado adequadamente, pela própria natureza do material e formato

com várias reentrâncias resultando no acúmulo de matéria orgânica que favorece o

crescimento de microrganismos e a formação de biofilmes. O crescimento em biofilmes

pode conferir uma proteção contra a ação de desinfetantes com conseqüente

44

manutenção do microrganismo no ambiente e em equipamentos como fatiadores,

moedores e embutideiras que também são considerados de difícil higienização

(MØRETRØ e LANGSRUD, 2004).

Considerando os resultados obtidos, equipamentos similares (amaciadores,

moedores, embutideiras e misturadores) representaram importantes pontos de

contaminação por Listeria spp. e L. monocytogenes, principalmente os moedores que

participam da etapa final do processamento de embutidos e da carne moída que em

diversas regiões é adquirida e consumida na forma in natura. Todos os equipamentos,

com exceção dos ganchos apresentaram contaminação por Listeria spp. e com relação

às instalações, apenas nas plataformas do abatedouro e nos sistemas de refrigeração das

câmaras frias das casas de carnes o microrganismo não foi detectado. Evans et al.

(2004) avaliando a contaminação de sistemas de refrigeração de câmaras frias de 15

estabelecimentos processadores de diversos alimentos no Reino Unido, também não

detectaram a presença de Listeria spp. nesses equipamentos.

As carcaças suínas e os embutidos foram provenientes do abatedouro, sendo

que as primeiras estavam congeladas e os embutidos eram processados termicamente, o

que pode explicar a ausência do patógeno. De acordo com Nesbakken et al. (1996)

poucos, ou até nenhum, isolados de L. monocytogenes são recuperados a partir de

carcaças suínas. As freqüências para a presença de Listeria spp. (74,1%) e L.

monocytogenes (25,9%) em carcaças bovinas estabelecidas em nossa pesquisa foram

superiores às relatadas por outros pesquisadores.

Madden et al. (2001) não detectaram a presença do microrganismo em 200

amostras de carcaças na Irlanda do Norte. Fenlon et al. (1996) em pesquisa realizada no

Reino Unido encontraram 7% de amostras de carcaças positivas para L. monocytogenes.

Nos Estados Unidos, na análise de 2089 carcaças a freqüência de L. monocytogenes foi

de 4,1% (Mc NAMARA, 1995) e na Austrália foi de 0,77% (n=130) em carcaças

provenientes de abatedouros exportadores (VANDERLINDE et al., 1998). Na Itália,

Peccio et al. (2003) utilizando técnica de número mais provável (NMP) para análise

quantitativa em carcaças bovinas, encontraram 19% (n=26) positivas para L.

monocytogenes e em níveis abaixo de 50NMP/g.

No Brasil, Picchi et al.(1999) relatam a ocorrência de 96% (n=25) de

Listeria spp. e 20% de L. monocytogenes em amostras de quartos dianteiros de bovinos

desossados provenientes de abatedouros sob Inspeção Federal no estado de São Paulo.

Todos os estabelecimentos que fizeram parte do presente estudo recebem carcaças e

45

cortes prontos de abatedouros/frigoríficos sob serviço de Inspeção Federal e possuem

Médicos Veterinários como responsáveis técnicos.

Pesquisas avaliando a ocorrência do patógeno em carnes cruas e em

produtos cárneos em vários países enfatizam a questão da contaminação dos produtos

finais e prontos para o consumo (NG e SEAH, 1995; UYTTENDAELE et al., 1999;

NØRRUNG et al., 1999; GILLESPIE et al., 2000; OJENIYI et al., 2000; CORDANO et

al., 2001; RØRVIK et al., 2003; MENA et al., 2004; SILVA et al., 2004; VITAS et al.,

2004).

Neste trabalho, os cortes comerciais foram selecionados dentre aqueles que

são geralmente destinados ao preparo de alimentos consumidos crus, como o kibe cru e

o carpaccio, assim como os que por hábitos e preferências são consumidos mal

passados, como picanha e filé mignon. No Brasil, deve-se considerar a carne moída

como um produto cárneo e até como um alimento pronto para o consumo, já que serve

de base para pratos de origem árabe, muito apreciado nas regiões Sul e Sudeste.

Portanto, as freqüências observadas para Listeria spp. (75%) e para L. monocytogenes

(25%) nesse produto, devem ser consideradas importantes assim como os resultados

obtidos nas análises das lingüiças mistas do tipo frescal, que apresentaram

contaminação por L. monocytogenes (22,2%) e L. innocua (77,8%).

Mena et al. (2004) relatam que as freqüências do patógeno observadas em

produtos crus como carnes bovinas e de aves (17,7% e 60% respectivamente), em leites

crus (16,7%), em peixes crus (12%) e vegetais (12,9%) avaliados em Portugal, não são

considerados de risco já que esses alimentos geralmente são submetidos a tratamentos

térmicos antes do consumo. Na Dinamarca, estudo realizado por Nørrung et al. (1999)

mostrou que produtos cárneos não submetidos a tratamentos térmicos apresentavam

contagens maiores do que 100 células de L. monocytogenes/g, tornando o alimento

inaceitável para o consumo. Ng e Seah (1995) em Singapura analisaram diversos

alimentos, de origens animal e vegetal (n=606) e encontraram 14 amostras positivas

para L. monocytogenes, sendo 02 de saladas vegetais e 12 de produtos cárneos como

presuntos, salsichas, peixes, moluscos e sanduíches de carnes.

As freqüências das diferentes espécies de listeria estabelecidas nesse estudo

estão de acordo com as observadas por outros autores, especialmente sobre a

predominância de L. innocua sobre L. monocytogenes e outras espécies (SLADE, 1992;

PICCHI et al., 1999; CAPITA et al., 2001; BARBALHO et al., 2005;

GUDBJÖRNSDÓTTIR et al., 2004; SILVA et al., 2004; HOFER e REIS, 2005). Ainda,

46

L. welshimeri, L. seeligeri e L. grayi foram isoladas de amostras de equipamentos e

instalações, enquanto Hofer et al. (2000) destacam o isolamento de L. welshimeri e

L. seeligeri em amostras de alimentos de origem animal (lácteos e cárneos)

Diversos autores têm ressaltado que a presença das espécies de listeria não

patogênicas para o homem, em particular de L. innocua, não deve ser subestimada. Em

1988, autores como Seeliger, Feresu e Jones, citados por Slade (1992) afirmaram que a

presença de uma espécie, em um ambiente específico, poderia ser indicativa da presença

de outras espécies, inclusive de L. monocytogenes, e que L. innocua seria um excelente

indicador para esse patógeno.

Duffy et al. (2001), realizaram estudo para investigar se a maior freqüência

de recuperação de L. innocua em amostras de carnes poderia ser devida às metodologias

que utilizam meios seletivos de enriquecimento preconizados por diversos órgãos

internacionais, que resultariam em detecções “artificialmente” mais baixas da espécie

patogênica. Os autores concluíram que não houve diferença significativa na recuperação

das duas espécies em meios seletivos e não seletivos, e ainda argumentam que, o uso de

várias etapas em alguns procedimentos para isolamento do microrganismo pode ser

desnecessário.

Nessa pesquisa procedeu-se a uma alteração no protocolo referente ao

volume do diluente em que as amostras foram resuspensas, ou quantidade de alimento

amostrada, e do volume de caldo UVM reduzindo de 25mL ou g. de amostra em 225mL

de caldo UVM, para 5mL ou g. de amostra em 45mL de caldo mantendo-se, no entanto

a proporção entre amostra e meio de cultura utilizado. Essa alteração parece não ter

interferido na detecção de Listeria spp. nas amostras avaliadas tendo em vista as

freqüências obtidas. Outros pesquisadores comparando metodologias para isolamento e

identificação de L. monocytogenes efetuaram redução nas quantidades de amostras e

meios de enriquecimento utilizados não observando alterações na detecção do patógeno

(LEWIS e CORRY, 1991; DUFFY et al., 2001).

Kamat e Nair (1996) sugerem a utilização de L. innocua como um indicador

biológico para o controle de L. monocytogenes, em indústrias processadoras de produtos

cárneos, já que as duas espécies apresentaram respostas similares aos diversos

tratamentos físicos químicos a que foram submetidas, como o aquecimento à 75oC,

diferentes doses de irradiação, diversas concentrações de ácido lático e Cloreto de sódio.

Para os autores, L. innocua seria um indicador de higiene e de segurança apropriado

47

para ser utilizado no desenvolvimento de programas de Análise de Perigos e Pontos

Críticos de Controle (APPCC).

Os sorotipos identificados nessa pesquisa pertenceram aos grupos 1/2a

(35%) e 4b (65%) e a distribuição destes foi equivalente para amostras de carnes e

produtos assim como para equipamentos e instalações. Hofer et al. (2000) em estudo de

identificação de espécies e sorotipos de 3112 amostras de diferentes origens e estados

brasileiros mantidas em coleção durante 26 anos, relatam que os sorotipos mais

prevalentes de L. monocytogenes em amostras humanas e de produtos cárneos foram 4b,

1/2a e 1/2b e em amostras ambientais houve predomínio do sorotipo 1/2b.

Os mesmos autores apontam ainda a identificação do sorotipo 1c em

carcaças, carne de frango e produtos fatiados, mas com discreta ocorrência. Já Vitas et

al. (2004) identificaram em produtos cárneos da Espanha, além dos sorotipos 1/2a, 1/2b

e 4b, o sorotipo 1/2c que inclusive foi o de maior freqüência, salientando que o mesmo

não está relacionado a casos de listeriose.

A Resolução da Diretoria Colegiada, da Agência Nacional de Vigilância

Sanitária (ANVISA-RDC no. 12/2001) que aprovou o Regulamento Técnico sobre

Padrões Microbiológicos para Alimentos, somente estabeleceu a pesquisa de

L. monocytogenes (ausência em 25g) para queijos de média a muito alta umidade

(BRASIL, 2001). Com relação à carne e aos produtos cárneos, não há parâmetros para a

presença do patógeno e talvez isso se deva à idéia de que a carne seja um produto que

será consumido após cozimento, não se levando em consideração, como já mencionado,

que vários pratos têm como base de preparo a carne crua. Mesmo aqueles que são

termicamente preparados, não estão livres das contaminações cruzadas pela

manipulação inadequada e processamento com equipamentos e utensílios que, quando

não higienizados adequadamente, atuam como importantes fontes de contaminação do

produto final.

Como conclusão, ficou demonstrado que Listeria spp. e L. monocytogenes

estão amplamente distribuídas em equipamentos e instalações das plantas de

processamento, na carne bovina e nos produtos cárneos analisados. Os resultados

indicaram claramente que equipamentos e instalações como moedores misturadores,

embutideiras, amaciadores, caixas plásticas, cubas e pisos requerem atenção especial

com relação aos procedimentos de higienização e sanitização.

Neste estudo, os principais pontos de contaminação por Listeria spp. foram

identificados nas casas de carnes. Ainda, a freqüência do patógeno em produtos finais

48

como a carne moída e a lingüiça do tipo frescal podem representar risco à saúde do

consumidor, principalmente para as populações consideradas de risco, como os idosos,

as gestantes e os imunocomprometidos. A identificação dos sorotipos 1/2a e 4b de

L. monocytogenes identificados em amostras de equipamentos e instalações, sugere uma

contaminação ambiental persistente que pode comprometer a segurança alimentar de

todos os outros produtos comercializados nesses estabelecimentos, como carnes de

aves, de pescado e de outras espécies não avaliadas nessa pesquisa.

É necessária a implantação de práticas de higienização e sanitização

realmente eficientes, principalmente nas casas de carnes, e a adoção de uma política

regulatória quanto aos limites permitidos do patógeno na carne e produtos cárneos que

garantam a segurança alimentar.

5. AGRADECIMENTOS

A Dra. Cristhiane Moura Falavina dos Reis, do Laboratório de Zoonoses

Bacterianas do Departamento de Bacteriologia do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de

Janeiro, Brasil, pela identificação dos sorotipos das culturas de Listeria monocytogenes.

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2004.

ARTIGO 2

MICRORGANISMOS INDICADORES NA CARNE

BOVINA E IDENTIFICAÇÃO DOS PONTOS DE

CONTAMINAÇÃO NO PROCESSAMENTO



Douglas Magnani1, Vanerli Beloti1



4708, Fax.: (43) 3371 4714. E-mail: [email protected] 1 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina, Londrina PR. 2 Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa MG.

57

RESUMO

A pesquisa de microrganismos indicadores como aeróbios mesófilos, coliformes totais,

Escherichia coli, bolores e leveduras, é uma ferramenta útil no controle da qualidade da

carne. Nesta pesquisa objetivou-se avaliar a qualidade microbiológica da carne bovina

in natura e de produtos cárneos, além da identificação dos principais pontos de

contaminação em plantas de processamento de 10 casas de carnes e 01 abatedouro de

bovinos, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. Para as análises

utilizou-se o sistema Petrifilm™ AC, EC e YM para aeróbios mesófilos (AM),

coliformes totais (CT) e E. coli (EC), bolores e leveduras, respectivamente. Os

resultados obtidos foram convertidos em log10 e as médias analisadas em níveis de

contaminação. Os equipamentos e dos estabelecimentos avaliados apresentaram médias

de contaminação por AM de 4,77 log UFC/cm2, por CT de 2,59 log UFC/cm2, por EC

de 1,84 log UFC/cm2, por bolores de 3,27 log UFC/cm2 e leveduras de 3,29 log

UFC/cm2. Os amaciadores, as caixas plásticas, as cubas de aço inoxidável, as

embutideiras, as facas, os ganchos, os misturadores e os moedores foram os

equipamentos que apresentaram os maiores níveis de contaminação. As médias de

contaminação das instalações para AM foram de 5,12 log UFC/cm2, para CT de 3,10

log UFC/cm2, para EC de 2,41 log UFC/cm2, para bolores e leveduras de 3,74 log

UFC/cm2 e 3,84 log UFC/cm2 respectivamente. Com exceção dos sistemas de

refrigeração, todos os tipos de instalações apresentaram altos níveis de contaminação

por todos os microrganismos pesquisados. Nos produtos verificaram-se médias para

AM de 3,93 log UFC/cm2 ou g., para CT de 1,73 log UFC/cm2 ou g., para EC de 1,13

log UFC/cm2 ou g., para bolores de 2,51 log UFC/cm2 ou g. e leveduras de 2,35 log

UFC/cm2 ou g. Os produtos que apresentaram as maiores contaminações foram as

amostras de carne moída e de lingüiças do tipo frescal indicando incorporação de uma

microbiota indesejável ao produto. Esta pesquisa identificou os principais pontos de

incorporação de microrganismos na carne e os resultados indicam a necessidade da

implantação de práticas de higienização e sanitização realmente eficientes nesses

estabelecimentos.

Palavras chaves: carne bovina; contaminação da carne; microrganismos indicadores;

processamento da carne; Escherichia coli.

58

ABSTRACT

Indicators microorganisms in red meat and identification of contamination points.

The research of indicators microorganisms (such as mesophilic aerobes - MA, total

coliforms - TC, Escherichia coli - EC, moulds and yeasts) is a useful tool in

microbiological quality control of food and meat, especially concerning the presence of

pathogens and spoilage microorganisms. In this work, the microbiological quality of red

raw meat and meat products was evaluated in 10 meat retailers and 1 slaughterhouse,

located in north of Paraná state, Brazil. The main contamination points of these

indicators microorganisms were also detected in the processing plants. Petrifilm™

plates (AC, EC and YM) were used to enumerate MA, TC, EC, moulds and yeasts. The

obtained counts were converted in log10 and the mean values were calculated,

considering each sample and sample class (equipments and transport, installations,

products). Equipments and transport samples showed the following contamination

means: 4.77 log UFC/cm2 MA, 2.59 log UFC/cm2 TC, 1.84 log UFC/cm2 EC, 3.27 log

UFC/cm2 moulds, 3.29 log UFC/cm2 yeasts. The smothers, plastic boxes, stainless steel

boxes, packing devices, knifes, hooks, mixers and grinders were the equipments that

showed the most contaminations levels. Installation samples showed: 5.12 log UFC/cm2

MA, 3.10 log UFC/cm2 TC, 2.41 log UFC/cm2 UFC, 3.74 log UFC/cm2 moulds, 3.84

log UFC/cm2 yeasts. All samples showed high contamination levels, except

refrigeration systems. Products samples showed: 3.93 log UFC/cm2 or g. MA, 1.73 log

UFC/cm2 or g. TC, 1.13 log UFC/cm2 or g. UFC, 2.51 log UFC/cm2 or g. moulds, 2.35

log UFC/cm2 or g. yeasts. Ground beef and fresh sausages showed the highest levels of

contamination indicating incorporation of undesirable microorganisms to these

products. This work identified the main points of contamination of microorganism in

red meat processing, showing the necessity of efficient cleaning and disinfection

practices in meat establishments.

Key words: red meat; meat contamination; indicators microorganisms; meat

processing; Escherichia coli;

59

1. INTRODUÇÃO

A carne é considerada uma importante fonte de proteínas, aminoácidos

essenciais, vitaminas especialmente as do complexo B e minerais como o ferro (PARDI

et al., 1993). Devido a essa composição rica em nutrientes constitui-se em um excelente

meio de cultura para o desenvolvimento de microrganismos, deteriorantes e patogênicos

(LANDGRAF, 1996; BORCH e ARINDER, 2002).

Embora não seja de consenso geral, admite-se que a carne de carcaças

provenientes de animais sadios pode ser considerada estéril (GILL, 1979). Na

transformação de carcaças em cortes comerciais e produtos cárneos, a contaminação

microbiana é um resultado indesejável e inevitável. A contaminação externa pode

ocorrer pela incorporação de microrganismos em diversas operações que são executadas

na sua obtenção, como no abate, desossa, processamento, armazenamento e distribuição

(GILL, 1998).

De acordo com Borch e Arinder (2002), a rota da contaminação cruzada

ocorre por deposição de matéria fecal em carcaças, pelo contato entre carcaças

contaminadas com não contaminadas, pelo ambiente de processamento, por meio de

equipamentos, operadores, instalações e ar. Os mesmos autores relataram a ocorrência

de Escherichia coli verotoxigênica em carcaças não refrigeradas e em amostras de fezes

dos bovinos, indicando contaminação direta das carcaças pelas fezes, e indireta a partir

dos equipamentos e dos operadores.

As carnes em geral, vermelhas e brancas, são reconhecidas como

deterioradas se alterações organolépticas as tornam inaceitáveis para o consumo. Os

fatores associados com a deterioração podem incluir as alterações na coloração ou na

textura, o desenvolvimento de sabores e odores estranhos e a formação de limosidade,

ou qualquer outra característica que torne o alimento indesejável para o consumidor

(LANDGRAF, 1996).

De acordo com a literatura, níveis de contaminação de até 105 UFC/cm2

indicariam que o abate ocorreu em condições higiênicas, e superiores que as condições

teriam sido insatisfatórias (GILL, 1998). Contaminações da carne em torno de 106

UFC/cm2 indicam processo de deterioração com odor desagradável e comprometimento

da vida de prateleira, e a partir de 107 UFC/cm2 a limosidade já é evidente

(LANDGRAF, 1996; GILL, 1998).

60

A carne pode tornar-se contaminada com uma grande variedade de

microrganismos patogênicos, como Clostridium botulinum e Staphylococcus aureus,

Salmonella, E. coli verotoxigênica, Campylobacter, Yersinia enterocolitica, Listeria

monocytogenes e Aeromonas hydrophila (FENLON et al., 1996; VANDERLINDE et

al., 1998; MADDEN et al., 2001). Os microrganismos do gênero Pseudomonas

geralmente estão associados à deterioração da carne vermelha (KOTULA e KOTULA,

2000)

A forma mais eficiente de reduzir a contaminação e o desenvolvimento

microbiano em alimentos é estabelecer programas de controle de qualidade como as

Boas Práticas de Manipulação (BPM) e a Análise de Perigos e Pontos Críticos de

Controle (APPCC). Com a impossibilidade de monitorar de forma eficiente a

contaminação da carne por todos os microrganismos, utiliza-se a pesquisa dos

microrganismos denominados indicadores, extremamente úteis no controle de qualidade

da carne quanto à presença de microrganismos patogênicos e deteriorantes (JAY,

2000).

Para produtos à base de carne in natura, a segurança e a qualidade podem

ser estimadas com o uso da contagem de microrganismos indicadores que incluem a

contagem de aeróbios mesófilos (AM), de coliformes totais (CT) e de E. coli (EC). A

contagem de AM fornece uma estimativa da população microbiana total e altas

contagens usualmente estão relacionadas à baixa qualidade e reduzida vida de prateleira

dos produtos (GILL, 1998; JAY, 2000).

A partir das contagens de CT e EC podem-se estimar falhas na higiene e

contaminação de origem fecal, sendo que altas contagens destes grupos de

microrganismos geralmente estão relacionadas a níveis significativos de

enteropatógenos (JAY, 2000; GILL et al., 1996a; EISEL et al., 1997). De acordo com

normas do USDA Pathogen Reduction Act (1996), entre os regulamentos para inspeção

de carnes bovina e de frango, a avaliação da E. coli em carcaças passa a ser obrigatória.

Bolores e leveduras são importantes organismos oportunistas deteriorantes

de carnes vermelhas e produtos cárneos e a rota de contaminação parece ser a mesma

das bactérias, sendo originários do meio ambiente e contaminando as plantas de

processamento durante o abate (DILLON, 1998).

A contagem de bolores em equipamentos tem sido usada como indicadora

da qualidade da sanitizacão em plantas de processamento de alimentos. Esses bolores

crescem rapidamente em resíduos de alimentos que aderem às superfícies dos

61

equipamentos e contaminam os alimentos que passam por esse local contaminado

(LANDGRAF, 1996). Diversos bolores, e possivelmente algumas leveduras podem

representar perigo para a saúde humana e animal por produzirem metabólitos tóxicos,

denominados de micotoxinas, que em sua maioria são compostos termoestáveis

mantendo-se ativas após tratamentos térmicos (DILLON, 1998).

Estudos sobre a ocorrência de bolores e leveduras na carne são

relativamente raros quando comparados com os referentes às bactérias. Contaminações

de alimentos por bolores e leveduras podem resultar em substanciais perdas econômicas

para os produtores, as indústrias e para os consumidores.

A legislação brasileira aprovou a regulamentação de parâmetros para a

contaminação por Salmonella spp. em carcaças bovinas e carnes moídas (ausência em

25g); para produtos cárneos crus refrigerados ou congelados, (hambúrguer, almôndegas,

quibe e similares) e embutidos frescais os padrões estabelecidos são para coliformes a

45oC (5 x 102UFC/g), estafilococos coagulase positiva (103UFC/g), clostrídios sulfito

redutores (5 x 102UFC/g) e ausência de Salmonella spp. em 25 g (BRASIL, 2001).

O Brasil atingiu em 2004 um novo recorde na exportação de carne, com um

volume de 1.156.770 toneladas de carne bovina, que correspondeu a uma participação

de 26,3%, de todo o volume exportado (4.392.252 toneladas). Entre as causas desse

desempenho favorável estão as mudanças nos fluxos de comércio motivadas pela

ocorrência de casos de Encefalopatia Espongiforme Bovina, no Canadá e nos Estados

Unidos, em maio e dezembro de 2003, respectivamente (Anônimo, 2005).

No Brasil são necessários estudos mais detalhados sobre as condições de

produção e processamento da carne bovina brasileira, que permitam a adoção de

medidas de controle específicas, que garantam a segurança e possam contribuir com a

melhoria da qualidade da carne visando uma maior valorização nos mercados nacional e

internacional.

O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a qualidade microbiológica da carne

bovina in natura e as condições higiênico-sanitárias das plantas de processamento, pela

pesquisa de microrganismos indicadores na carne, em equipamentos e instalações de

estabelecimentos processadores. Ainda, pretendeu-se identificar os principais pontos de

contaminação e incorporação desses microrganismos, visando a implantação de boas

práticas de fabricação nos estabelecimentos, e conseqüente melhoria da qualidade

microbiológica do produto.

62


2.1. Amostras

As amostras foram colhidas em 11 estabelecimentos processadores de carne

(10 casas de carnes e 01 abatedouro) localizados na região norte do estado do Paraná,

totalizando 443 amostras, no período de Julho de 2003 a Fevereiro de 2005, sendo as

análises realizadas no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal (LIPOA)

da Universidade Estadual de Londrina. Nas casas de carnes foram colhidas 185

amostras de equipamentos e instalações, 142 de meias carcaças bovinas, 51 de cortes

comerciais, 10 de embutidos do tipo frescal e 12 de carnes moídas totalizando 400

amostras. No abatedouro/frigorífico foram colhidas 28 amostras de equipamentos e

instalações, 12 de meias carcaças bovinas e suínas e 03 de cortes e embutidos

totalizando 43 amostras. Na tabela 2.1 estão descritos todos os pontos analisados assim

como as áreas amostradas

2.2. Pontos de amostragem e procedimentos de colheita

Para as colheitas utilizou-se a técnica do esfregaço de superfície (ABNT,

1988) com swabs e moldes estéreis. As amostras foram diluídas em 45mL de água

peptonada 0,1% e processaram-se diluições seriadas em salina 0,85%.

Produtos

- Meias carcaças refrigeradas: foram realizados swabs de meias carcaças

refrigeradas, utilizando-se a técnica do esfregaço de superfície que consiste em

selecionar 5 pontos demarcados com moldes estéreis de 10cm2. Os 5 swabs foram

colocados em uma mesma bag estéril contendo 45mL de diluente (água peptonada

0,1%) formando um pool da amostra.

- Cortes comerciais: foram amostrados cortes que comercialmente são

destinados ao preparo de alimentos consumidos crus ou mal passados (lagarto, filé

mignon, picanha e cortes dianteiros) e o procedimento de colheita foi o mesmo utilizado

para as meias carcaças, mas utilizando dois moldes de 25cm2.

- Embutidos e carnes moídas: 5g de cada amostra foram homogeneizados

em stomacher, com 45 mL de água peptonada 0,1% .

63

Equipamentos

Consistiram de amaciadores, balanças, caixas plásticas, cubas de aço

inoxidável, embutideiras, estrados, facas, ganchos, mesas, misturadores, moedores,

serras e caminhões frigoríficos (paredes laterais internas e piso) e os pontos demarcados

variaram de 2 a 3 conforme o tamanho do equipamento, com exceção dos ganchos em

que toda a área de superfície foi amostrada.

Instalações

Consistiram dos balcões refrigeradores, paredes, pisos, plataformas, ralos e

sistemas de refrigeração e os pontos demarcados variaram de 2 a 3 conforme o tamanho

do equipamento, com exceção dos ralos em que toda a área de superfície foi amostrada.

2.3. Enumeração de microrganismos indicadores

Na pesquisa de microrganismos indicadores, utilizou-se o sistema

PetrifilmAC para aeróbios mesófilos (AM), Petrifilm EC para coliformes totais

(CT) e E. coli (EC) e Petrifilm YM para bolores e leveduras, conforme orientação do

fabricante. As contagens obtidas foram inicialmente padronizadas de acordo com a

diluição considerada e a área amostrada e expressos em UFC/cm2 ou g.

2.4. Análise estatística

Os resultados das contagens dos microrganismos pesquisados foram

convertidos em log10, e vários parâmetros estatísticos foram calculados considerando o

tipo de amostra, as classes e origem, utilizando-se o programa Statistica 6.0.

Tabela 2.1. Pontos de amostragem, total de amostras colhidas e área de superfície.

64

Descrição das amostras Casas de carnes

Abatedouro Total Área / quantidade amostrada

n n n cm2/ g Equipamentos

Amaciadores 8 - 8 30 cm2 Balanças 9 - 9 30 cm2 Caixas plásticas 26 2 28 30 cm2 Cubas de aço inoxidável 10 - 10 30 cm2 Embutideiras 2 1 3 30 cm2 Estrados 10 - 10 30 cm2 Facas 15 6 21 30 cm2 Ganchos 7 3 10 Área de superfície Mesas 20 1 21 60 cm2 Misturadores 3 1 4 30 cm2 Moedores 9 1 10 30 cm2 Serras 10 - 10 30 cm2 Caminhões frigoríficos 4 - 4 60 cm2

Instalações Balcões refrigeradores 11 - 11 60 cm2 Paredes 10 - 10 60 cm2 Pisos 9 1 10 60 cm2 Plataformas - 5 5 60 cm2 Ralos 18 7 25 Área de superfície Sistemas de refrigeração 4 - 4 60 cm2

Produtos

Carcaças bovinas 142 9 151 50 cm2 Carcaças suínas - 3 3 50 cm2 Carne Moída 12 - 12 5 g Cortes comerciais 51 1 52 50 cm2 Embutidos - 2 2 5 g Lingüiças tipo frescal 10 - 10 5 g

Total 400 43 443

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A média logarítmica das contagens de AM em amostras de equipamentos

das casas de carnes e do abatedouro foi de 4,68 log UFC/cm2 com níveis mínimos de

contaminação de 1,52 log UFC/cm2 e máximos de 8,56 log UFC/cm2. O desvio padrão

obtido foi de 1,61. Os ganchos, as cubas de aço inoxidável, as embutideiras, os

misturadores, os moedores e as caixas plásticas apresentaram médias de contaminação

superiores à geral para AM em equipamentos (Tabela 2.2).

A análise da Tabela 2.3 indica que a média dos níveis de contaminação por

CT dos equipamentos foi de 2,55 log UFC/cm2 com valores mínimos abaixo de 1 log

UFC/cm2 e máximos de 7 log UFC/cm2. O desvio padrão dessas médias foi 1,28. Os

65

ganchos, as cubas de aço inoxidável, os moedores, as embutideiras, os misturadores e as

caixas plásticas foram os equipamentos que apresentaram as maiores médias de

contaminação por CT (maiores do que 2,5 log UFC/cm2).

A média das contagens de contaminação por EC foi de 1,80 log

UFC/cm2, com níveis mínimos de -0,48 log UFC/cm2 e máximos de 5,72 log UFC/cm2.

Os equipamentos com as maiores médias de contaminação por EC foram os ganchos, os

misturadores, os moedores, as facas e as cubas de aço inoxidável (Tabela 2.4).

Nas Tabelas 2.5 e 2.6 são demonstradas as médias logarítmicas obtidas nas

contagens de bolores (3,20 log UFC/cm2) e leveduras (3,21 log UFC/cm2). Os ganchos,

as caixas plásticas e as cubas de aço inoxidável foram os equipamentos com maiores

médias de contaminação por esses microrganismos.

Pela análise das figuras 2.1 e 2.2 observa-se que visualmente, as

contaminações dos equipamentos por AM, bolores e leveduras foram superiores às de

CT e EC nas casas de carnes. No abatedouro, visualmente a média observada para CT

foi semelhante à observada para bolores. Os níveis de contaminação dos equipamentos

observados nessa pesquisa foram superiores aos relatados por outros pesquisadores.

Gill (1998) e Eisel et al. (1997) consideram que superfícies visivelmente

limpas ainda podem apresentar contagens totais de 10 a 103UFC/cm2. Hood e Zottola

(1995) consideram contagens a partir de 104UFC/cm2 como suficientes para iniciar a

formação de biofilmes. No presente estudo, com exceção dos sistemas de refrigeração,

todos os tipos de equipamentos apresentaram médias de níveis de contaminação por

AM superiores a esta. Há evidências de que os microrganismos quando aderidos às

superfícies de contato, representam um risco em potencial, pois durante o

processamento do alimento pode ocorrer deslocamento desses microrganismos para o

produto (HOOD e ZOTTOLA, 1995). Ainda, a presença de matéria orgânica reduz

significativamente a ação de compostos sanitizantes.

Siqueira et al. (2004) avaliando a contaminação por AM, CT, fungos

filamentosos, leveduras e Salmonella spp. em seis tipos de equipamento para

processamento de embutidos, relatam que as contagens foram abaixo de 2UFC/cm2 para

AM e CT e que 23,3% das amostras apresentaram contagens superiores a 2UFC/cm2

para fungos filamentosos e leveduras.

Eisel et al. (1997) avaliaram a contaminação de caminhões e consideraram

os mesmos adequadamente limpos e sanitizados, e concluíram que para produtos

cárneos crus, o contato com equipamentos de processamento provavelmente não

66

represente uma forma significativa de contaminação microbiana geral, exceto quando as

superfícies estão contaminadas por patógenos como E. coli O157:H7, que em baixos

níveis de contaminação pode causar doença.

Os resultados obtidos demonstraram exatamente o contrário, pois

observamos que as carcaças, mesmo apresentando médias de contaminação expressivas,

essas ainda foram menores quando comparadas com as dos produtos finais como os

cortes comerciais, as carnes moídas e os embutidos sugerindo incorporação de

microrganismos a partir dos equipamentos, caminhões e instalações.

Todos os equipamentos apresentaram altos níveis de contaminação pelos

microrganismos pesquisados, mas destacam-se as caixas plásticas, os amaciadores, as

embutideiras, os misturadores e os moedores. Esses equipamentos são de difícil

higienização e acumulam grande quantidade de matéria orgânica, favorecendo o

crescimento microbiano e diminuindo a eficácia da sanitização. Observamos, durante as

visitas, que em alguns estabelecimentos a limpeza desses equipamentos não era

realizada diariamente, apesar das recomendações dos responsáveis técnicos.

Borges André et al. (1999) em pesquisa avaliando os aspectos higiênicos

sanitários de quatro tipos de utensílios de matadouros de Goiânia, também observaram

níveis de contaminação por AM, CT e bolores e leveduras inferiores aos nossos. Os

autores constataram que as caixas plásticas apresentaram as maiores médias de

contaminação por AM (730UFC/cm2), por CT (140UFC/cm2) e por bolores e leveduras

(2UFC/cm2).

As cubas de aço inoxidável, apesar do formato retilíneo, também

apresentaram altas contagens, mesmo sendo de fácil limpeza. Portanto, ocorreram falhas

básicas nos procedimentos de higienização desses equipamentos.

Em nenhuma das dez casas de carnes visitadas observou-se, a higienização

das facas em uso durante os procedimentos de desossa e preparo de cortes. No

abatedouro somente em algumas plataformas (sangria, evisceração e linha de inspeção)

era realizada a imersão das facas em água quente.

Os ganchos amostrados foram os que mantêm as meias carcaças

armazenadas suspensas nas câmaras frias das casas de carnes e na linha de abate. Foi

observado que vários são mantidos nos pisos, tanto das câmaras frias quanto na linha de

abate, não tendo sido verificado nenhum procedimento de limpeza desses equipamentos.

Apesar de terem sido os equipamentos que apresentaram as maiores médias de

67

contaminação, o contato restringe-se à área de membros posteriores das carcaças, ao

contrário dos outros equipamentos.

A maioria dos estrados amostrados era de madeira, que por sua natureza

porosa permite infiltração de água e acúmulo de matéria orgânica nas reentrâncias, além

da proximidade com os pisos favorecendo a contaminação.

Nas amostras das instalações observou-se que a média logarítmica para

contagens de AM foi de 5,38 log UFC/cm2, com níveis mínimos de contaminação de

1,75 log UFC/cm2 e máximos de 8,95 log UFC/cm2. O desvio padrão foi 2,10 (Tabela

2.2). Os ralos, as plataformas e os pisos foram os pontos que apresentaram as maiores

médias de contaminação (7,26 log UFC/superfície; 6,60 log UFC/cm2; 4,76 log

UFC/CM2, respectivamente).

Com relação aos CT, a média do nível de contaminação foi de 3,28 log

UFC/cm2, com valores mínimos de -0,48 log UFC/cm2 e máximos de 7 log UFC/cm2. O

desvio padrão das médias foi 1,97 (Tabela 2.3). Também as plataformas, os ralos e os

pisos apresentaram as maiores médias de contaminação (5,30 log UFC/cm2, 4,90 log

UFC/ área de superfície e 2,26 log UFC/cm2, respectivamente).

A média logarítmica das contaminações por EC obtida das amostras de

instalações foi 2,59 log UFC/cm2 com níveis mínimos de -0,48 log UFC/cm2 e máximos

de 6,30 log UFC/cm2. Todos os tipos de instalações avaliados apresentaram médias de

contagens acima de 1 log UFC/cm2. As plataformas e os ralos foram os pontos que

apresentaram as maiores médias de contagens: 3,94 log UFC/cm2 e 3,88 log UFC/ área

de superfície, respectivamente (Tabela 2.4).

Para instalações as médias observadas para bolores e leveduras foram de

4,01 log UFC/cm2 e 4,10 log UFC/cm2 respectivamente. As plataformas, os ralos e os

pisos foram os pontos com as maiores médias de contagens para bolores e leveduras e

com exceção dos sistemas de refrigeração todos os tipos de instalações apresentaram

médias de contaminação, para esses microrganismos, maiores que 2 log UFC/cm2

(Tabelas 2.5 e 2.6). Nas figuras 2.3 e 2.4 as médias de contagens de AM, bolores e

leveduras são visualmente superiores às de CT e EC.

Eisel et al. (1997) analisaram amostras de superfícies de equipamentos, de

pisos e paredes utilizando as placas Petrifilm™ AC e EC para pesquisa de AM, CT e

EC, mas diferentemente dos nossos resultados, as contagens de CT e EC não foram

significativas, e esses microrganismos raramente foram isolados das amostras. Em

relação às contagens de AM, também relatam médias inferiores as nossas, assim, as

68

maiores contagens foram para pisos (5UFC/cm2) e para paredes (3UFC/cm2),

ressaltando que os autores consideraram as áreas que apresentaram essas contagens

como altamente contaminadas (câmara fria para cortes empacotados e área de recepção,

respectivamente).

A contaminação dos pisos deve ser considerada importante, pois a partir

destes tornam-se mais contaminados os calçados (botas de borracha) dos funcionários e

o trânsito interno é inevitável. Ainda, em diversos estabelecimentos, inclusive no

abatedouro, verificaram-se caixas armazenando cortes, em contato direto com o piso

nos diferentes ambientes (câmaras frias, salas de desossa, de corte e área de atendimento

para venda).

Os ralos, assim como os pisos, podem representar além de ambientes

propícios para o desenvolvimento microbiano, importantes fontes de propagação e

manutenção de microrganismos, principalmente se a higienização é realizada com água

sob pressão, o que pode provocar a suspensão dos microrganismos em gotículas e

disseminar a contaminação para outras áreas.

Na análise dos produtos verificou-se que, a média logarítmica para

contagens de AM foi de 3,93 log UFC/cm2 ou g. com níveis de contaminação mínimos

de 1,26 log UFC/cm2 ou g. e máximos de 8,81 log UFC/cm2 ou g. O desvio padrão foi

1,55. As lingüiças do tipo frescal e as carnes moídas foram os produtos com as maiores

médias (5,85 log UFC/g e 6,49 log UFC/g, respectivamente). As carcaças bovinas e os

cortes comerciais apresentaram médias de contagens de 3,6 log UFC/cm2 e 3,81 log

UFC/cm2, respectivamente (Tabela 2.2).

Para CT, observou-se média logarítmica de 1,73 log UFC/cm2 ou g., com

níveis mínimos abaixo de 1 log UFC/cm2 ou g. e máximos de 6 log UFC/cm2 ou g. O

desvio padrão dessas médias foi 1,28. Nas amostras de carne moída e lingüiça frescal

verificou-se a ocorrência das maiores médias (3,32 log UFC/g e 3,27 log UFC/g). As

amostras de carcaças bovinas e de cortes comerciais apresentaram médias de

contaminação de 1,49 log UFC/cm2 e 1,69 log UFC/cm2, respectivamente. Já, as

amostras de carcaças suínas congeladas apresentaram média de contaminação de 2,78

log UFC/cm2 (Tabela 2.3).

Para EC a média logarítmica de contaminação dos produtos foi de 1,13 log

UFC/cm2 ou g. As amostras de carcaças suínas congeladas apresentaram a maior média

de contaminação que foi de 2,78 log UFC/cm2; nas amostras de carne moída a média

69

verificada foi 2,13 log UFC/g. Todos os tipos de produtos avaliados apresentaram

médias de contagens de EC superiores a 1 log UFC/cm2 ou g.(Tabela 2.4).

A média logarítmica dos produtos para contagens de bolores foi de 2,51 log

UFC/cm2 ou g., e 2,35 log UFC/ cm2 ou g., para leveduras. As amostras de carne moída

apresentaram as médias mais altas de contagens tanto para bolores (4,3 log UFC/g)

quanto para leveduras (4,11 log UFC/g). Em todos os tipos de produtos pesquisados

observaram-se médias de contagens acima de 2 log UFC/cm2 ou g, para esses

microrganismos (Tabelas 2.5 e 2.6). As médias de contaminação dos produtos, por tipo

de estabelecimento, pelos microrganismos pesquisados podem ser visualizadas nas

figuras 2.5 e 2.6, verificando-se que as contagens de AM, bolores e leveduras foram

superiores às de CT e EC.

A literatura fornece poucos parâmetros e a maioria propostos para outros

países, que podem auxiliar na interpretação dos resultados das análises efetuadas, como

por exemplo, o de que contagens totais superiores a 105 UFC/cm2 na carne bovina

seriam indicativas de condições de obtenção não higiênicas. Contagens totais acima de

106UFC/cm2 seriam suficientes para provocar processo de deterioração (LANDGRAF,

1996; GILL, 1998; JACKSON et al., 1997).

Em estudo realizado em carcaças bovinas ao final do processamento em

10 estabelecimentos, Gill et al. (1997) estimaram médias de contagens para AM de 3,30

log UFC/cm2; para CT médias de 2 log UFC/100cm2 e para EC de 1,18 log

UFC/100cm2. Ainda, Gill (1998) preconiza que contagens abaixo de 1 log UFC/100cm2

seriam um critério aceitável e possível para EC, em carcaças bovinas obtidas em

condições higiênicas. Eisel et al. (1997) relatam que as contagens de EC observadas em

diversos pontos amostrados de carcaças bovinas foram em média de 1 log UFC/g.

A legislação brasileira não estabelece padrões para a contaminação por

AM, CT, EC e por bolores e leveduras, em carcaças bovinas e carnes moídas. Para

produtos cárneos crus refrigerados ou congelados (hambúrguer, almôndegas, quibe e

similares) e embutidos frescais, o padrão estabelecido é para coliformes a 45oC (5 x

102UFC/g) (BRASIL, 2001).

Os resultados das contagens obtidas nos produtos amostrados indicaram

níveis de contaminação por esses microrganismos, especialmente nos produtos finais

como os cortes comerciais, a carne moída e os embutidos, superiores aos encontrados

em outros estudos. Sumner et al. (2003) em pesquisa realizada em 159 carcaças bovinas,

de abatedouros de diferentes portes na Austrália, encontraram médias logarítmicas para

70

contaminação por AM de 1,82 log UFC/cm2, e por EC de 0,33 log UFC/cm2 também

utilizando o sistema Petrifilm para as análises microbiológicas. Phillips et al. (2001)

também avaliando carcaças bovinas (n=1268) em abatedouros australianos encontraram

médias logarítmicas de contaminação por AM de 2,42 log UFC/cm2 e de 0,41 log

UFC/cm2 por EC.

Um das principais fontes de contaminação das carcaças é o couro que

usualmente está associado com significativos níveis de contaminação e uma grande

variedade de microrganismos (HUDSON et al., 1998). Armstrong et al. (1996) afirmam

que o trato gastrointestinal de bovinos é considerado o principal reservatório de E. coli

O157, e a contaminação da carne pode ser atribuída à contaminação de carcaças quando

ocorre ruptura do intestino, contato com os pelos, o couro e patas dos animais durante o

abate. Small et al. (2005) realizaram trabalho que avaliou os níveis de contaminação de

couro de bovinos e métodos de descontaminação. A média de contaminação inicial foi

de 6,14 log UFC/cm2 de bactérias totais e o método de descontaminação mais eficiente

apresentou redução de 2 log em média.

Na Alemanha, em 1998 foi desenvolvido um programa governamental para

melhoria da higiene dos procedimentos de abate de bovinos, com o objetivo de eliminar

a contaminação por E. coli O157 VTEC em produtos cárneos instituindo o padrão de

“tolerância zero” para contaminação fecal durante o abate. A redução do microrganismo

em carcaças foi constatada já a partir do ano seguinte (HEUVELINK et al., 2001).

Gill et al. (1999) em pesquisa que avaliou a contaminação da carne bovina

de quatro plantas de processamento de abatedouros, consideraram os equipamentos

contaminados por bactérias aeróbicas, incluindo EC, como principais fontes de

contaminação das carcaças. Os autores alertam para a possibilidade da presença de

E. coli O157:H7 ou de outras amostras patogênicas de EC contaminar os produtos

durante o processo.

Neste estudo, as contaminações observadas nas amostras de carne moída e

lingüiça do tipo frescal foram superiores às relatadas por Gill et al. (1996b) que

avaliaram as condições higiênicas da carne processada para hambúrguer, constatando

que as médias de AM variaram de 3,5 a 4,9 log UFC/g, de CT variaram de 07 a 3,0 log

UFC/g e de EC de 0,2 a 2,6 log UFC/g.

Eisel et al. (1997) relatam médias de contaminação por AM em carne moída

de 4,6 log UFC/g, para CT contagens que variaram de 1,4 a 3,2 log UFC/g e para EC

contagens de 1 a 2 log UFC/g. Em pesquisa realizada com diferentes produtos cárneos

71

(n=3494) prontos para o consumo, Gillespie et al. (2000) relatam que 8% apresentaram

contagens de AM ≥ 107UFC/g, e 3% das amostras apresentaram contagens de

enterobactérias ≥104 UFC/g e de EC ≥ 102 UFC/g.

Pérez Chabela et al. (1999) analisaram cortes de carnes de cinco espécies

animais (bovina, ovina, frango, coelho e cavalo) comercializadas em açougues da

cidade do México e relatam que as amostras de carne bovina apresentaram médias de

contaminação por AM de 4,75 log UFC/cm2, por enterobactérias de 4,74 log UFC/cm2 e

por bolores e leveduras de 4,04 log UFC/cm2 atribuindo esses níveis à contaminações

cruzadas e práticas inadequadas de manipulação.

Gill et al. (2003) atribuem a contaminação de produtos finais como a carne

moída, à higienização inadequada de equipamentos utilizados na desossa. Schlegelová

et al. (2004) observaram a contaminação de carcaças bovinas durante o abate por

amostras poliresistentes de E. coli, sugerindo que a contaminação secundária, a partir

dos equipamentos das plantas de processamento seja a fonte dessa contaminação.

A análise das médias das contagens de todos os microrganismos

pesquisados nos produtos permite verificar que as contaminações aumentaram na

medida em que a carne foi sendo processada. As contaminações das carcaças e dos

cortes foram menores que as contaminações da carne moída e dos embutidos, indicando

incorporação destes microrganismos ao longo do processamento.

Identificar as fontes, os níveis e a distribuição da contaminação microbiana

durante os procedimentos de obtenção e processamento da carne bovina é fundamental

para o estabelecimento de programas que tenham por objetivos a qualidade e a

segurança alimentar (EISEL et al., 1997), e o uso de microrganismos indicadores pode

ser uma ferramenta extremamente útil na monitoração de pontos considerados críticos.

Os procedimentos de segurança alimentar precisam ser aplicados a toda a

cadeia alimentícia, desde a produção na propriedade até o consumidor. Para isso, é

fundamental a integração das ferramentas de qualidade: as boas práticas de fabricação e

de higiene, a análise de perigos e pontos críticos de controle, a avaliação de risco

microbiológico e o gerenciamento da qualidade.

72

Tabela 2.2. Médias das contagens de aeróbios mesófilos (log UFC/cm2 ou g.) de

amostras de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas

de carnes e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Aeróbios Mesófilos Amostras

Média n Desvio padrão

Variância Erro padrão

Mínimo Máximo

Equipamentos

Amaciadores 4,60 8 1,86 3,47 0,66 2,18 8,48 Balanças 3,65 9 1,75 3,06 0,58 1,52 7,48 Caixas plásticas 5,01 28 0,99 0,99 0,19 2,64 6,82 Cubas de aço inoxidável 5,97 10 1,08 1,16 0,34 4,60 7,48 Embutideiras 5,43 3 2,43 5,89 1,40 2,64 7,05 Estrados 3,63 10 1,62 2,61 0,51 2,18 6,72 Facas 4,06 21 1,07 1,14 0,23 2,52 6,15 Ganchos 7,11 10 1,20 1,45 0,38 4,77 8,56 Mesas 4,42 21 1,06 1,13 0,23 2,87 7,06 Misturadores 5,24 4 2,83 8,03 1,42 2,18 8,48 Moedores 5,15 10 1,73 2,99 0,55 2,18 8,48 Serras 3,40 10 0,90 0,82 0,29 2,18 4,73 Caminhões frigoríficos 3,51 4 1,46 2,15 0,73 2,30 5,26 Subtotal 4,68 148 1,61 2,59 0,13 1,52 8,56

Instalações

Balcões 4,16 11 1,48 2,20 0,45 1,75 6,62 Paredes 3,25 10 0,73 0,54 0,23 2,18 4,67 Pisos 4,76 10 1,15 1,32 0,36 3,17 6,60 Plataformas 6,60 5 0,00 0,00 6,60 6,60 Ralos 7,26 25 1,33 1,76 0,27 4,00 8,95 Sistemas de refrigeração 2,29 4 0,29 0,09 0,15 1,92 2,52 Subtotal 5,38 65 2,10 4,40 0,26 1,75 8,95

Produtos

Carcaças bovinas 3,60 151 1,27 1,63 0,10 1,26 6,80 Carcaças suínas 4,85 3 1,02 1,04 0,59 3,78 5,80 Carnes moídas 6,49 12 1,73 2,99 0,50 4,44 8,81 Cortes comerciais 3,81 52 1,51 2,29 0,21 1,26 7,30 Embutidos 5,78 2 0,16 0,03 0,11 5,67 5,90 Lingüiças frescais 5,85 10 1,19 1,43 0,38 3,79 8,30 Subtotal 3,93 230 1,55 2,40 0,10 1,26 8,81

Total 4,39 443 1,74 3,02 0,08 1,26 8,95

73

Tabela 2.3. Médias das contagens de coliformes totais (log UFC/cm2 ou g.) de amostras


e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Coliformes Totais Amostras



Mínimo Máximo

Equipamentos

Amaciadores 2,50 8 0,79 0,63 0,28 1,18 3,31 Balanças 1,49 9 0,93 0,87 0,31 0,52 3,08 Caixas plásticas 2,60 28 1,03 1,07 0,20 0,37 5,52 Cubas de aço inoxidável 3,34 10 0,92 0,84 0,29 1,78 4,92 Embutideiras 3,04 3 2,86 8,20 1,65 -0,18 5,30 Estrados 1,52 10 0,64 0,40 0,20 0,52 2,52 Facas 2,36 21 1,25 1,55 0,27 -0,48 4,87 Ganchos 4,07 10 1,77 3,13 0,56 2,65 7,00 Mesas 2,50 21 0,90 0,80 0,20 -0,48 3,48 Misturadores 3,03 4 1,77 3,12 0,88 1,18 4,89 Moedores 3,11 10 1,29 1,66 0,41 1,18 5,30 Serras 1,95 10 0,99 0,97 0,31 0,52 3,70 Caminhões frigoríficos 1,89 4 1,38 1,92 0,69 1,00 3,95 Subtotal 2,55 148 1,28 1,65 0,11 -0,48 7,00

Instalações

Balcões 1,96 11 1,39 1,92 0,42 -0,48 3,81 Paredes 1,29 10 0,83 0,69 0,26 0,12 2,52 Pisos 2,26 10 1,23 1,52 0,39 0,90 5,30 Plataformas 5,30 5 0,00 0,00 5,30 5,30 Ralos 4,90 25 1,33 1,78 0,27 3,00 7,00 Sistemas de refrigeração 1,75 4 0,57 0,33 0,29 1,18 2,52 Subtotal 3,28 65 1,97 3,87 0,24 -0,48 7,00

Produto

Carcaças bovinas 1,49 143 1,15 1,33 0,10 -0,05 4,95 Carcaças suínas 2,78 3 0,00 0,00 2,78 2,78 Carnes moídas 3,32 12 0,98 0,96 0,28 2,54 6,00 Cortes comerciais 1,68 50 1,28 1,64 0,18 -0,05 5,58 Embutidos 0 Lingüiças frescais 3,27 10 1,13 1,29 0,36 1,00 4,88 Subtotal 1,73 218 1,28 1,64 0,09 -0,05 6,00

Total 2,25 431 1,52 2,30 0,07 -0,48 8,95

74

Tabela 2.4. Médias das contagens de Escherichia coli (log UFC/cm2 ou g.) de amostras


e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Escherichia coli Amostras Média n Desvio

padrão Variância Erro

padrão Mínimo Máximo

Equipamentos

Amaciadores 1,57 8 0,99 0,97 0,35 -0,48 2,52 Balanças 0,89 9 0,56 0,31 0,19 -0,48 1,18 Caixas plásticas 1,79 28 0,97 0,94 0,18 -0,48 4,82 Cubas de aço inoxidável 1,92 10 0,92 0,85 0,29 1,18 4,18 Embutideiras 1,60 3 2,33 5,41 1,34 -0,48 4,11 Estrados 1,52 10 0,64 0,40 0,20 0,52 2,52 Facas 1,93 21 0,89 0,79 0,19 -0,48 3,43 Ganchos 3,30 10 1,12 1,25 0,35 2,65 5,72 Mesas 1,73 21 0,98 0,96 0,21 -0,48 3,00 Misturadores 2,31 4 1,18 1,40 0,59 1,18 3,96 Moedores 1,94 10 1,32 1,75 0,42 -0,48 4,60 Serras 1,29 10 0,88 0,77 0,28 -0,48 2,52 Caminhões frigoríficos 1,46 4 0,77 0,59 0,38 0,70 2,52 Subtotal 1,80 148 1,07 1,14 0,09 -0,48 5,72

Instalações

Balcões 1,38 11 0,96 0,92 0,29 -0,48 3,00 Paredes 1,23 10 0,94 0,88 0,30 -0,48 2,52 Pisos 1,79 10 1,21 1,45 0,38 -0,48 3,51 Plataformas 3,94 5 0,50 0,25 0,22 3,26 4,60 Ralos 3,88 25 1,23 1,51 0,25 1,00 6,30 Sistemas de refrigeração 1,54 4 0,70 0,49 0,35 0,92 2,52 Subtotal 2,59 65 1,61 2,58 0,20 -0,48 6,30

Produtos

Carcaças bovinas 1,01 143 0,86 0,74 0,07 -0,05 3,48 Carcaças suínas 2,78 3 0,00 0,00 2,78 2,78 Carnes moídas 2,13 12 0,94 0,88 0,27 1,00 4,85 Cortes comerciais 1,01 50 0,94 0,89 0,13 -0,05 4,76 Embutidos 0 Lingüiças frescais 1,73 10 0,75 0,57 0,24 1,00 3,48 Subtotal 1,13 218 0,93 0,87 0,06 -0,05 4,85

Total 1,58 431 1,22 1,49 0,06 -0,48 8,95

75

Tabela 2.5. Médias das contagens de bolores (log UFC/cm2 ou g.) de amostras de


01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Bolores Amostras



Mínimo Máximo

Equipamentos

Amaciadores 2,86 7 0,69 0,47 0,26 2,18 4,08 Balanças 1,91 9 0,84 0,71 0,28 0,52 2,95 Caixas plásticas 3,64 25 1,26 1,60 0,25 1,67 6,30 Cubas de aço inoxidável 3,42 10 0,96 0,92 0,30 2,18 4,95 Embutideiras 3,18 3 1,84 3,37 1,06 1,29 4,95 Estrados 3,25 9 1,16 1,35 0,39 2,18 4,99 Facas 2,78 19 0,56 0,32 0,13 2,00 3,52 Ganchos 5,21 10 1,25 1,56 0,39 3,65 7,78 Mesas 3,19 19 0,80 0,64 0,18 1,70 4,39 Misturadores 2,85 4 0,51 0,26 0,25 2,18 3,30 Moedores 3,04 9 0,98 0,97 0,33 1,64 4,67 Serras 2,30 9 0,85 0,72 0,28 0,52 3,44 Caminhões frigoríficos 3,19 4 1,03 1,07 0,52 2,60 4,73 Subtotal 3,20 137 1,20 1,43 0,10 0,52 7,78

Instalações

Balcões 2,63 11 0,86 0,73 0,26 1,07 3,78 Paredes 2,71 9 1,59 2,52 0,53 0,12 5,30 Pisos 3,42 9 1,36 1,84 0,45 1,83 6,08 Plataformas 5,50 5 1,23 1,52 0,55 3,30 6,08 Ralos 5,32 24 1,54 2,36 0,31 2,00 7,78 Sistemas de refrigeração 1,74 3 1,06 1,13 0,61 0,52 2,48 Subtotal 4,01 61 1,88 3,53 0,24 0,12 7,78

Produtos

Carcaças bovinas 2,24 134 1,13 1,28 0,10 -0,05 4,73 Carcaças suínas 3,78 3 0,00 0,00 3,78 3,78 Carnes moídas 4,30 12 0,95 0,91 0,28 3,00 5,78 Cortes comerciais 2,48 48 1,15 1,31 0,17 0,56 4,73 Embutidos 2,85 2 0,21 0,05 0,15 2,70 3,00 Lingüiças frescais 3,69 10 0,50 0,25 0,16 3,00 4,78 Subtotal 2,51 209 1,22 1,50 0,08 -0,05 5,78

Total 2,97 407 1,43 2,05 0,07 -0,48 8,95

76

Tabela 2.6. Médias das contagens de leveduras (log UFC/cm2 ou g.) de amostras de


01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Leveduras Amostras



Mínimo Máximo

Equipamentos

Amaciadores 2,53 7 1,53 2,35 0,58 -0,48 4,08 Balanças 1,72 9 0,97 0,94 0,32 -0,18 2,88 Caixas plásticas 3,80 25 1,31 1,72 0,26 0,60 6,52 Cubas de aço inoxidável 3,75 10 1,13 1,28 0,36 2,18 5,18 Embutideiras 3,45 3 3,41 11,63 1,97 -0,48 5,66 Estrados 3,03 9 1,00 1,00 0,33 2,18 4,64 Facas 2,62 19 0,83 0,68 0,19 0,92 3,52 Ganchos 5,91 10 1,28 1,63 0,40 3,65 8,00 Mesas 2,63 19 1,09 1,18 0,25 -0,48 4,15 Misturadores 3,46 4 1,41 1,99 0,71 2,18 5,42 Moedores 3,67 9 1,40 1,95 0,47 2,18 6,34 Serras 2,08 9 0,94 0,89 0,31 0,52 3,44 Caminhões frigoríficos 3,01 4 1,30 1,69 0,65 2,30 4,95 Subtotal 3,21 137 1,54 2,37 0,13 -0,48 8,00

Instalações

Balcões 2,68 11 1,29 1,68 0,39 -0,48 4,00 Paredes 3,11 9 1,45 2,11 0,48 0,92 5,52 Pisos 3,37 9 1,27 1,61 0,42 2,34 6,30 Plataformas 6,20 5 0,15 0,02 0,07 5,97 6,30 Ralos 5,26 24 1,36 1,84 0,28 3,08 8,00 Sistemas de refrigeração 1,64 3 0,97 0,94 0,56 0,52 2,22 Subtotal 4,10 61 1,82 3,32 0,23 -0,48 8,00

Produtos

Carcaças bovinas 2,16 134 1,29 1,67 0,11 -0,05 6,51 Carcaças suínas 3,78 3 0,00 0,00 3,78 3,78 Carnes moídas 4,11 12 1,55 2,41 0,45 2,00 6,00 Cortes comerciais 2,07 48 1,63 2,65 0,23 -0,05 6,94 Embutidos 2,85 2 0,21 0,05 0,15 2,70 3,00 Lingüiças frescais 3,52 10 1,37 1,87 0,43 1,00 5,00 Subtotal 2,35 209 1,48 2,19 0,10 -0,05 6,94

Total 2,90 407 1,68 2,81 0,08 -0,48 8,95

77

Média

±SD

±1,96*SD

Aeró

bio

s m

esófilo

s

Colif

orm

es t

ota

is

E.

coli

Bolo

res

Levedura

s

Microrganismo indicador

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Média

s (

log U

FC

/cm

2)


em amostras de equipamentos de 10 casas de carnes, localizadas na região norte do estado do Paraná, Brasil.

Média

±SD

±1,96*SD

Aeró

bio

s m

esófilo

s

Colif

orm

es t

ota

is

E.

coli

Bolo

res

Levedura

s


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Média

s (

log U

FC

/cm

2)

Figura 2.2. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.) em amostras de equipamentos de abatedouro, localizado na região norte do estado do

Paraná, Brasil.

78

Média

±SD

±1,96*SD

Aeró

bio

s m

esófilo

s

Colif

orm

es t

ota

is

E.

coli

Bolo

res

Levedura

s


-2

0

2

4

6

8

10

Média

s (

log U

FC

/cm

2)

Figura 2.3. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.) em amostras de instalações de 10 casas de carnes localizadas na região norte do estado

do Paraná, Brasil.

Média

±SD

±1,96*SD

Aeró

bio

s m

esófilo

s

Colif

orm

es t

ota

is

E.

coli

Bolo

res

Levedura

s


2

3

4

5

6

7

8

9

10

Média

s (

log U

FC

/cm

2)


em amostras de instalações de abatedouro localizado na região norte do estado do Paraná, Brasil.

79

Média

±SD

±1,96*SD

Aeró

bio

s m

esófilo

s

Colif

orm

es t

ota

is

E.

coli

Bolo

res

Levedura

s


-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Média

s (

log U

FC

/cm

2 o

u g

r.)

Figura 2.5. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.) em amostras de produtos de 10 casas de carnes localizadas na região norte do estado do

Paraná, Brasil.

Média

±SD

±1,96*SD

Aeró

bio

s m

esófilo

s

Colif

orm

es t

ota

is

E.

coli

Bolo

res

Levedura

s


1

2

3

4

5

6

7

8

Média

s (

log U

FC

/cm

2 o

u g

r.)

Figura 2.6. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.) em amostras de produtos de abatedouro localizado na região norte do estado do Paraná,

Brasil.

80

4. CONCLUSÃO

A carne bovina comercializada na região estudada não apresentou qualidade

higiênico-sanitária satisfatória, havendo possibilidade de veiculação de microrganismos

patogênicos e redução da vida de prateleira da carne in natura e dos produtos cárneos.

Desde a obtenção da carne, ainda durante o abate, ocorrem falhas no

processamento, relacionadas à higienização dos equipamentos e instalações, que se

agravam quando o produto chega ao estabelecimento de comercialização direta ao

consumidor.

Os níveis de contaminação detectados nos equipamentos e instalações são

suficientes para a formação de biofilmes, que quando não são removidos

adequadamente constituem-se em ambientes propícios para a manutenção de uma

microbiota indesejável que pode ser incorporada à carne.

Os principais pontos de contaminação nas casas de carnes foram cubas de

aço inoxidável, amaciadores, moedores, facas, misturadores, embutideiras, caixas

plásticas, pisos e ralos. No abatedouro, os principais pontos de contaminação foram os

equipamentos destinados à fabricação de embutidos, plataformas, pisos e ralos.

Os ganchos, apesar de apresentarem os maiores níveis de contaminação, não

representam pontos importantes de incorporação de microrganismos por apresentarem

um contato restrito à região de membros inferiores das carcaças no abatedouro e das

meias carcaças nas casas de carnes.

Os produtos mais contaminados foram a lingüiça frescal e a carne moída, e

com relação a esta última, indica sérios riscos à saúde do consumidor por ser

usualmente consumida in natura.

As altas contagens de E. coli indicam possível contaminação por outros

enteropatógenos.

81


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ARTIGO 3

RELAÇÃO ENTRE A PRESENÇA DE LISTERIA SPP. E OS

NÍVEIS DE CONTAMINAÇÃO DA MICROBIOTA

ACOMPANHANTE NA CARNE BOVINA, PRODUTOS

CÁRNEOS E EM PLANTAS DE PROCESSAMENTO.



Douglas Magnani1, Vanerli Beloti1



4708, Fax.: (43) 3371 4714. E-mail: [email protected] 1 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina, Londrina PR. 2 Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa MG.

85

RESUMO

As baixas freqüências de isolamento de patógenos em alimentos de origem animal

relatadas por alguns autores podem ser atribuídas, principalmente, à presença de uma

microbiota multiespécies com potencial inibitório ou capaz de interferir nas

metodologias de isolamento. As plantas de processamento de alimentos geralmente

abrigam diversos tipos de microrganismos, que podem ser incorporados aos alimentos.

Pesquisas avaliando, experimentalmente, a interferência de alguns microrganismos

sobre o crescimento de Listeria monocytogenes, têm apresentado resultados

conflitantes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interferência da microbiota presente

em amostras de carcaças bovinas, cortes comerciais, lingüiça frescal, carne moída e de

equipamentos e instalações de processamento da carne, na detecção de Listeria spp.

Foram determinados os níveis de contaminação por aeróbios mesófilos, coliformes

totais, E. coli, bolores e leveduras, utilizando o sistema Petrifilm™ e a presença de

L. monocytogenes pela metodologia preconizada pelo United States Department of

Agriculture. Os resultados obtidos nessa pesquisa indicam que a microbiota encontrada

em amostras de equipamentos, instalações e produtos, não interferiu de forma evidente

na detecção das diferentes espécies (L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri,

L. welshimeri e L. grayi). Observou-se que mesmo em altos níveis de contaminação por

todos os microrganismos indicadores pesquisados, foi possível a detecção de

L. monocytogenes e das outras espécies. A metodologia recomendada para isolamento

do patógeno em carnes e superfícies de equipamentos mostrou-se adequada permitindo

o isolamento de diferentes espécies de Listeria spp.

Palavras chaves: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; microrganismos indicadores;

interferência microbiana; microbiota; carne bovina.

86

ABSTRACT

Relation among the presence of Listeria spp. and contamination levels of the

associated microbiote in red meat, meat products and processing plants.

Several authors explain the low incidence of pathogens in animal origin food due

microbial competition and isolation methodologies interference. Usually food

processing plants have several types of microorganisms, which can be incorporated to

food and in equipments and installations surfaces. Some researches show divergences in

results concerning the interference of food microbiote on the development of Listeria

monocytogenes. This work has the objective to evaluate if the natural microbiote from

bovine carcasses, commercial cuts, fresh sausage, ground beef meat and surface samples

of meat processing equipments and installations, has interference on Listeria spp.

detection. The contamination levels of indicators microorganisms (mesophilic aerobes,

total coliformes, Escherichia coli, moulds and yeasts) all using Petrifilm™ plates, and

the presence of Listeria spp. (according United States Department of Agriculture) was

evaluated in several samples from the described points. The results showed that

microbiote detected in the sampled points did not influence evidently the detection of

Listeria spp., independently of the specie detected. It was observed a tendency of

detection of Listeria spp. in samples that showed high levels of indicators

microorganisms contamination. The recommended methodology for Listeria spp.

isolation in meat and equipments, used in his study, showed adequacy and allowed the

isolation of the different species of the pathogen, even in samples with high levels of

microbial contamination.

Palavras chaves: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; indicators microorganisms;

microbial interference; microbiote; red meat.

87

1. INTRODUÇÃO



consumo de alimentos contaminados (SCHLECH et al., 1983; LINNAN et al., 1988;

BULA et al., 1988; FARBER e PETERKING, 1991). Embora exista uma margem de

risco para todos os consumidores, este patógeno na forma invasiva, está associado a

quadros clínicos graves como septicemia, encefalite, meningite e a altos índices de

mortalidade entre neonatos, idosos, imunocomprometidos e ainda a abortos

(SCHUCHAT et al., 1992; HOFER, 1998; HOFER et al., 1999).

Alguns autores têm relatado uma baixa freqüência de isolamento de

patógenos em alimentos, especialmente os de origem animal, que seria atribuída

principalmente à presença de uma microbiota com potencial inibitório e conseqüente

interferência nas metodologias de isolamento (FRANCO et al., 2003; NERO et al.,

2004).

As plantas de processamento de alimentos geralmente abrigam diversos

tipos de microrganismos (FRANK et al., 1990; BAGGE-RAVN et al., 2003), que

podem ser incorporados aos alimentos. Quando esta contaminação é alta, esses

microrganismos podem interferir na multiplicação do patógeno alvo da pesquisa pela

produção de condições insatisfatórias para a sua multiplicação, e de substâncias que

afetem de forma específica o seu crescimento (SUH e KNABEL, 2001).

Portanto nas análises microbiológicas de alimentos, são incluídas fases

seletivas de pré-enriquecimento com o objetivo de eliminar a microbiota competidora e

favorecer a multiplicação do patógeno em questão. Estudos têm avaliado o desempenho

de diferentes métodos de isolamento na detecção de baixos níveis de L. monocytogenes

em alimentos, assim como de células injuriadas (RYSER et al., 1996).

Um dos meios de enriquecimento seletivos mais utilizados para detecção de

Listeria spp. é o caldo Universidade de Vermont (UVM), recomendado pelo United

States Department of Agriculture (USDA, 1996) para amostras de carnes e

equipamentos que contém ácido nalidíxico, que inibe o crescimento de bactérias Gram

negativas, suplementado com acriflavina, para inibição de bactérias Gram positivas. De

acordo com diversos autores, a metodologia preconizada pelo USDA é a mais adequada

para a maioria das situações, especialmente quando há expectativa de uma microbiota

em altos níveis de contaminação (NØRRUNG et al., 1991; SLADE, 1992).

88

A hipótese de que uma microbiota em níveis elevados (>106 UFC/g.) em

alimentos exerceria efeito inibitório sobre microrganismos patogênicos, e que o

contrário, alimentos com baixos níveis de contaminação permitiriam a multiplicação de

patógenos é defendida por Jay (1995 e 1996).

As interações microbianas em alimentos têm sido estudadas em relação à

produção de agentes antimicrobianos, como ácidos, bacteriocinas e peróxidos

(KENNEDY et al., 2000). A atividade antagonista de bactérias ácido lácticas sobre

L. monocytogenes em leite foi verificada por NERO (2005) e a utilização destes

microrganismos em produtos cárneos fermentados têm efetivamente controlado a

multiplicação de patógenos (HAMMES e KNAUF, 1994; PRADO et al., 2000).

Ainda, diversos estudos têm demonstrado a capacidade de L.

monocytogenes de formar biofimes sobre materiais comumentemente utilizados em

indústrias de alimentos (MAFU et al., 1990; BERESFORD et al., 2001) inclusive na

presença de outros microrganismos (MIDELET e CARPENTIER, 2002). Biofilmes são

geralmente formados por comunidades multiespécies, nas quais diferentes

microrganismos estão integrados em estruturas complexas.

O conhecimento da interação entre L. monocytogenes e outros

microrganismos, patogênicos ou deteriorantes, isolados de alimentos e plantas de

processamento é escasso e mais pesquisas são necessárias para identificar essas

associações (MØRETRØ e LANGSRUD, 2004). A interferência de microrganismos dos

gêneros Pseudomonas e Staphylococcus sobre multiplicação e formação de biofilmes

por L. monocytogenes também têm sido avaliada em estudos experimentais

(BUCHANAN e BAGI, 1999; LERICHE e CARPENTIER, 2000)

Um fator adicional sobre o qual existem poucos trabalhos é o impacto

exercido por uma microbiota constituída por microrganismos denominados indicadores,

como aeróbios mesófilos, coliformes totais, Escherichia coli, bolores e leveduras sobre

a detecção de L. monocytogenes. Esses microrganismos normalmente são isolados de

alimentos e plantas de processamento, em vários níveis de contaminação.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a interferência da microbiota

naturalmente presente em amostras de carne bovina, de produtos cárneos, de

equipamentos e instalações de processamento da carne, na detecção de Listeria spp. pela

metodologia preconizada pelo USDA.


89

2.1. Origem das amostras e análises microbiológicas

Foram avaliadas 443 amostras provenientes de estabelecimentos

processadores de carne bovina (10 casas de carnes e 01 abatedouro) localizados na

região norte do estado do Paraná, no período de Julho de 2003 a Fevereiro de 2005.

Deste total, 167 amostras foram positivas para Listeria spp. (76 de equipamentos, 23 de

instalações e 68 de produtos). As amostras foram analisadas pela metodologia

preconizada pelo United States Department of Agriculture (1996). Das amostras

positivas identificaram-se as espécies: L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri,

L. seeligeri e L. grayi pela análise das características bioquímicas como coloração de

Gram, prova da catalase, verificação de hemólise em ágar sangue eqüino 7%,

fermentação de carboidratos (manitol, rhamnose, xilose e dextrose) e motilidade a 25oC

(PAGOTTO et al., 2004).

Para a pesquisa de microrganismos indicadores, utilizou-se o sistema

PetrifilmAC para aeróbios mesófilos, Petrifilm EC para coliformes totais e E. coli e

Petrifilm YM para bolores e leveduras, conforme orientações do fabricante. As

contagens obtidas foram padronizadas de acordo com as diluições consideradas e

expressas em UFC/cm2 ou g., sendo posteriormente convertidas em log10. As análises

microbiológicas foram realizadas no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem

Animal (LIPOA) da Universidade Estadual de Londrina.

2.2. Análise dos resultados

Os resultados das contagens dos microrganismos indicadores de higiene

obtidos foram agrupados de acordo com a presença ou não de Listeria spp. A partir

disso, as freqüências foram calculadas considerando o tipo de amostra (equipamentos,

instalações e produtos), utilizando-se o programa Excell 2003 (Microsoft).

90

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As freqüências de níveis de contaminação pelos microrganismos

indicadores pesquisados para amostras positivas e negativas para Listeria spp. são

demonstrados nas Figuras de 3.1 a 3.5. Considerando todas as amostras positivas para

Listeria spp, observou-se que a microbiota acompanhante apresentou predomínio de

níveis de contaminação por AM maiores do que 5 log UFC/cm2 ou g.; para CT os níveis

de contaminação predominantes foram de 2 a 4 log UFC/cm2 ou g., e por EC foram

menores do que 2 log UFC/cm2 ou g. Para bolores e leveduras, entre as amostras

positivas para Listeria spp. observou-se níveis de contaminação mais freqüentes entre

3 a 4 log UFC/cm2 ou gr (37,4% e 43, 2%, respectivamente).

Entre as amostras negativas para Listeria spp., observou-se que a microbiota

acompanhante apresentou maiores freqüências de níveis de contaminação por AM entre

3 e 5 log UFC/cm2 ou g. (43,1%); para CT e EC houve predominância de níveis de

contaminação menores do que 2 log UFC/cm2 ou g. Para bolores e leveduras os níveis

de contaminação mais freqüentes, entre as amostras negativas para Listeria spp., foram

menores do que 3 log UFC/cm2 ou g. (63,9% e 66,1%, respectivamente). Esses

resultados demonstram uma correspondência entre os níveis de contaminação pelos

microrganismos indicadores e a presença de Listeria spp.

As freqüências de níveis de contaminação pelos microrganismos

indicadores pesquisados nas amostras positivas para as diferentes espécies detectadas

(L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri e L. grayi) são demonstradas

nas Figuras de 3.6 a 3.10. As amostras positivas para L. monocytogenes (21) e L.

innocua (131) provenientes de equipamentos, instalações e produtos, apresentaram

níveis de contaminação pelos microrganismos indicadores avaliados, em faixas menores

do que 2 log UFC/cm2 ou g. a maiores do que 5 log UFC/cm2 ou g.

Considerando todas as amostras positivas para L. monocytogenes observou-

se que a microbiota acompanhante apresentou níveis de contaminação por aeróbios

mesófilos entre 3 a 5 log UFC/cm2 ou g. (52,4%) e maiores do que 5 log UFC/cm2 ou g.

(47,6%); por coliformes totais houve predomínio de níveis de contaminação entre 2 a 4

log UFC/cm2 ou g. (60,0%); por E. coli níveis menores do que 2 log UFC/cm2 ou g.

(80,0%). A microbiota constituída por bolores e leveduras apresentou freqüências

similares entre os três níveis de contaminação, assim nas amostras positivas para L.

monocytogenes, observou-se níveis de contaminação menores do que 3 log UFC/cm2 ou

91

g. (47,4% para bolores e 36,8% para leveduras) e maiores do que 4 log UFC/cm2 ou g.

(21,1% para bolores e 31,6% para leveduras).

Entre as amostras positivas para L. innocua observou-se que a microbiota

acompanhante apresentou níveis de contaminação por aeróbios mesófilos maiores do

que 5 log UFC/cm2 ou g. (49,6%) e entre 3 a 5 log UFC/cm2 ou g. (43,5%); em relação

a coliformes totais os níveis de contaminação predominantes foram entre 2 a 4 log

UFC/cm2 ou g. (54,3%); por E. coli menores do que 2 log UFC/cm2 ou g. (71,7%). Da

mesma forma como para a espécie patogênica, a microbiota constituída por bolores e

leveduras apresentou freqüências similares entre os três níveis de contaminação, assim

L. innocua foi freqüente em níveis de contaminação por bolores e leveduras menores do

que 3 log UFC/cm2 ou g. (32,2% para bolores e 40,5% para leveduras), a maiores do

que 4 log UFC/cm2 ou g. (27,3% para bolores e 29,8% para leveduras).

L. monocytogenes foi isolada de 07 amostras de equipamentos nas quais se

observou predomínio de níveis de contaminação por aeróbios mesófilos superiores a 5

log UFC/cm2 (71,4%). Da mesma forma, em relação a coliformes totais ocorreu

predomínio de contagens entre 2 a 4 log UFC/cm2 (71,4%) e por E. coli menores do que

2 log UFC/cm2 (57,1%). Por bolores e leveduras ocorreu predomínio de níveis de

contaminação entre 3 e 4 log UFC/cm2 (66,7% e 50,0 %, respectivamente).

L. innocua foi isolada de 57 amostras de equipamentos nas quais se

observou predomínio de níveis de contaminação por aeróbios mesófilos entre 3 a 5 log

UFC/cm2 (47,4%); por coliformes totais os níveis de contaminação mais freqüentes

foram entre 2 a 4 log UFC/cm2 (52,6%); por E. coli foram menores do que 2 log

UFC/cm2 (75,4%). Por bolores e leveduras, L. innocua foi mais frequentemente isolada

de amostras com níveis de contaminação menor do que 3 log UFC/cm2 (40% e 45,5%,

respectivamente).

As duas amostras positivas para L. monocytogenes provenientes de

instalações apresentaram níveis de contaminação por aeróbios mesófilos menores do

que 3 log UFC/cm2 (50%) e entre 3 a 5 log UFC/cm2 (50%); para coliformes totais

essas amostras apresentaram níveis de contaminação menores do que 2 log UFC/cm2

(50%) e entre 2 a 4 log UFC/cm2 (50%); para E. coli essas duas amostras apresentaram

níveis de contaminação menores do que 3 log UFC/cm2 (100,0%)e para bolores e

leveduras entre menores do que 3 log UFC/cm2 (50%) e maiores do que 4 log UFC/cm2

(50%).

92

Listeria innocua foi isolada de 18 amostras de instalações, nas quais se

observaram predomínio de níveis de contaminação por aeróbios mesófilos maiores do

que 5 log UFC/cm2 (83,3%); em relação a coliformes totais os níveis de contaminação

mais freqüentes, nessas amostras, foram maiores do que 4 log UFC/cm2 (66,7%). Da

mesma forma, L. innocua foi isolada de amostras de instalações nas quais se observou

predomínio de níveis de contaminação por E. coli acima de 3 log UFC/cm2 (50%), e

acima de 4 log UFC/cm2 para bolores (64,7%) e leveduras (70,6%). As freqüências dos

níveis de contaminação por microrganismos indicadores em amostras de equipamentos

e instalações positivas para L. welshimeri, L. seeligeri e L grayi são demonstradas nas

Figuras de 3.6 a 3.10.

Hood e Zottola (1995) consideram contagens a partir de 104 UFC/cm2 como

suficientes para iniciar a formação de biofilmes. A partir dos resultados obtidos

observou-se contagens superiores a essa, sugerindo o estabelecimento de biofilmes

sobre as superfícies de equipamentos, instalações e produtos analisados. Estudo

conduzido por Jeong e Frank (1994) avaliando o crescimento de L. monocytogenes a

21oC em biofilmes com diversos microrganismos isolados de plantas de processamento

de carne e de leite, verificou que nenhuma das culturas testadas foi capaz de eliminar o

patógeno e inclusive que a cultura de Flavobacterium spp. utilizada na pesquisa

estimulou ou o crescimento de L. monocytogenes.

A ampla distribuição de L. monocytogenes na natureza, a sua resistência a

condições adversas e sua persistência em biofilmes, podem explicar a dificuldade de

eliminar esse patógeno do ambiente de processamento de alimentos. A produção de

glicocálix pelas microcolônias aderidas às superfícies ocorre em torno de 48 horas, e

pode proteger as células da ação de substâncias inibitórias produzidas por culturas

competidoras, (HOYLE, 1990; WIRTANEN e MATTILA-SANDHOLM, 1992).

Assim, superfícies inadequadamente higienizadas e a presença de resíduos orgânicos

conferem proteção ao patógeno.

Diversos autores têm ressaltado que a presença das espécies de listeria não

patogênicas para o homem, em particular de L. innocua, não deve ser subestimada. Já

em 1988, autores como Seeliger, Feresu e Jones, citados por Slade (1992) afirmaram

que, a presença de uma espécie, em um ambiente específico, poderia ser indicativa da

presença de outras espécies, inclusive de L. monocytogenes, e que L. innocua seria um

excelente indicador para esse patógeno.

93

Pesquisas realizadas sugerem uma maior recuperação de L. innocua em

caldo UVM e em outros meios de enriquecimento em detrimento à espécie patogênica

(PETRAN e SWANSON, 1993; CURIALE e LEWUS, 1994; MacDONALD e

SUTHERLAND, 1994). A metodologia recomendada pelo USDA, para isolamento de

L. monocytogenes de amostras de carnes e de meio ambiente, tem sido considerada

significativamente melhor quando comparada com outras (LEWIS e CORRY, 1991;

SLADE, 1992). Os resultados obtidos nesse estudo confirmam que essa metodologia

promoveu eliminação da microbiota acompanhante permitindo o isolamento do

patógeno.

Nas amostras de produtos foram identificadas apenas L. monocytogenes (12)

e L. innocua (52). Nas amostras positivas para L. monocytogenes ocorreu predomínio de

níveis de contaminação por aeróbios mesófilos entre 3 a 5 log UFC/cm2 ou g. (66,7%);

por coliformes totais entre 2 a 4 log UFC/cm2 ou g. (54,5%). Por E. coli os níveis de

contaminação predominantes foram menores do que 2 log UFC/cm2 ou g. (90,9%) e

para bolores e leveduras menores do que 3 log UFC/cm2 ou g. nas freqüências de 63,6%

e 45,5%, respectivamente.

Nas amostras de produtos positivas para L. innocua ocorreu predomínio de

níveis de contaminação por aeróbios mesófilos entre 3 a 5 log UFC/cm2 ou g. (51,8%);

por coliformes totais os níveis de contaminação predominantes estiveram entre 2 a 4 log

UFC/cm2 ou g. (71,2%); para E. coli foram menores do que 2 log UFC/cm2 ou g.

(86,5%). Por bolores ocorreu predomínio dos níveis contaminação entre 3 a 4 log

UFC/cm2 ou g. (51,0%) e para leveduras menores do que 3 log UFC/cm2 ou g. (42,9%).

Jay (1995 e 1996) sustenta a hipótese de que carnes frescas com contagens

de aeróbios mesófilos em torno de 100.000 a 1.000.000 UFC/g não são, provavelmente,

veículos responsáveis por surtos de doenças de origem alimentar, ao contrário de carnes

“limpas”. O autor baseia sua hipótese no conceito de interferência microbiana publicado

por Sir Howard Florey em 1946 e proposto por R. Dubos em 1960. Ainda, cita estudo

realizado por Goepfert e Kim (1975) que “mostra que microrganismos perigosos são

incapazes de competir efetivamente com a flora natural de carne moída crua em

diversos limites de temperatura”.

Embora não seja de consenso geral, admite-se que a carne de carcaças

provenientes de animais sadios pode ser considerada estéril (GILL, 1979). Na

transformação de carcaças em cortes comerciais e produtos cárneos, a contaminação

microbiana é um resultado indesejável e inevitável. A contaminação externa pode

94

ocorrer pela incorporação de microrganismos em diversas operações que são executadas

na sua obtenção, como no abate, desossa, processamento, armazenamento e distribuição

(GILL, 1998). Gill et al. (2003) atribuem a contaminação de produtos finais como a

carne moída, à higienização inadequada de equipamentos utilizados na desossa.

Nesse estudo, a presença de L. monocytogenes e das outras espécies,

associada a altos níveis de contaminação da microbiota avaliada, indicam que esses

microrganismos provavelmente não inibiram a sua multiplicação na carne bovina.

Pesquisas avaliando, experimentalmente, a interferência de alguns microrganismos

sobre o crescimento de L. monocytogenes, têm apresentado resultados conflitantes. Em

produtos lácteos, carne de frango e meios de cultura microbiológicos, Pseudomonas

fluorescens estimulou o crescimento de L. monocytogenes (MARSHALL et al., 1992),

inibiu o crescimento (CHENG et al., 1995) ou não afetou o crescimento de L.

monocytogenes (FARRAG e MARTH, 1989). Essas diferenças de comportamento

também foram observadas por Buchanan e Bagi (1999).

9595

44,7

31,9

73,9

45,241,2

15,4

47,3

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17,4

38,154,4

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45,5

43,1

9,2

23,6

8,716,7

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40,7

7,2

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100%

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< 3 log UFC/cm2 ou gr.

3 - 5 log UFC/cm2 ou gr.

> 5 log UFC/cm2 ou gr.

Equipamentos Instalações Produtos Total

Figura 3.1. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por aeróbios mesófilos,

isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região

norte do estado do Paraná, Brasil.

9696

14,58,3

52,2

28,6

4,8 3,9

16,08,9

55,3

51,4

17,4

33,3

68,3

24,5

54,9

33,1

30,3

40,3

30,438,1

27,0

71,6

29,0

58,0

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100%

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min

ação

por

colif

orm

es

tota

is





Figura 3.2. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por coliformes totais,

isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região


9797

6,6 6,9

39,1

28,6

3,2 2,69,9 7,8

18,4

38,9

26,1

28,6

9,5 13,5

16,0 22,7

75,0

54,2

34,842,9

87,3 83,9

74,169,5

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100%

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min

ação

por

Esc

heric

hia

coli





Figura 3.3. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por E. coli isoladas de

equipamentos, instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte do

estado do Paraná, Brasil.

9898

20,5 23,4

54,5

35,9

20,0

2,0

25,2

12,7

35,623,4

22,7

28,2

45,0

22,1

37,4

23,4

43,8

53,1

22,7

35,9 35,0

75,8

37,4

63,9

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100%

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bo

lore

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Figura 3.4. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por bolores isoladas de



9999

24,7 25,0

59,1

35,9

21,7

3,4

28,4

13,9

27,420,3

13,6

33,3

35,0

18,1

28,4

21,0

47,954,7

27,3 30,8

43,3

78,5

43,2

65,1

0%

100%

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leved

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Figura 3.5. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por leveduras isoladas de



100100

71,4

45,6

11,1

100,0

0,0

50,0

83,3

33,3 33,3

42,947,6 49,6

16,7

100,0

0,0

28,6

47,4

55,6

0,0

100,0

50,0

5,6

66,7 66,751,8

52,443,5

58,3

0,0

100,0

0,07,0

33,3

0,0 0,0 0,0

11,1

0,0 0,05,4

0,06,9

25,0

0,0 0,0

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100%

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ão p

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rób

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esófil

os





Figura 3.6. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por aeróbios

mesófilos, isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região


101101

14,3 17,5

0,0 0,0 0,0 0,0

66,7

0,0 0,05,8 5,0

19,7

0,0 0,0 0,0

71,4

52,6

44,4

100,0 100,0

50,0

11,1

33,3

54,5

71,2

60,0

54,3

41,7

100,0 100,0

14,3

29,8

55,6

0,0 0,0

50,0

22,2

66,7

45,5

23,1

35,026,0

58,3

0,0 0,0

0%

100%

L.

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min

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colif

orm

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tais





Figura 3.7. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por coliformes

totais, isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte

do estado do Paraná, Brasil.

102102

0,08,8

0,0 0,0 0,0 0,0

50,0

0,0 0,03,8

0,0

12,6

0,0 0,0 0,0

42,915,8

0,0

100,0

0,0 0,0

33,3

0,09,1

9,6 20,0

15,7

0,0

100,0

0,0

57,1

75,4

100,0

0,0

100,0 100,0

16,7

100,090,9

86,580,0

71,7

100,0

0,0

100,0

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100%

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Esche

richia

co

li< 2 log UFC/cm2 ou gr.




Figura 3.8. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por E. coli,

isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte do


103103

16,721,8

0,0

100,0

0,0

50,0

64,7

0,0

18,2 20,4 21,127,3

0,0

100,0

0,0

66,7

38,2

11,1

0,0

0,0

0,0

17,6

66,7

18,2

51,0

31,6

40,5

25,0

0,0

0,0

16,7

40,0

88,9

0,0

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50,0

17,6

33,3

63,6

28,6

47,4

32,2

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0,0

100,0

0%

100%

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bolo

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Figura 3.9. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por bolores,



104104

33,325,5

0,0

100,0

0,0

50,0

70,6

0,0

27,320,4

31,6 29,8

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11,8

33,3

27,336,7

31,629,8

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88,9

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50,0

17,6

66,7

45,5 42,936,8

40,5

83,3

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or

leved

ura

s< 3 log UFC/cm2 ou gr.




Figura 3.10. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por leveduras,



105

4. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos sugerem que não houve interferência da microbiota

constituída pelos microrganismos indicadores pesquisados, na detecção de L.

monocytogenes, nas amostras analisadas, mesmo quando esta microbiota apresentou

contagens superiores a 5 log UFC/cm2 ou g.

A metodologia oficial para isolamento do patógeno em carnes e superfícies

de equipamentos mostrou-se adequada permitindo o isolamento de diferentes espécies

de Listeria spp., apesar da altas contagens da microbiota associada.

A presença do patógeno em associação com uma contaminação

multiespécies em níveis elevados, indica a necessidade de outros estudos sobre o

fenômeno da competição microbiana considerando-se a ecologia microbiana e as

características específicas do alimento e do ambiente de processamento envolvido.

São necessários estudos mais aprofundados que esclareçam a real

interferência da microbiota presente na carne e em outros alimentos sobre

microrganismos patogênicos, que gerem dados para viabilização de programas de

segurança alimentar.

106


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ANEXOS

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ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO

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ARTIGO TÉCNICO PUBLICADO

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DIVULGAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS

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Documents

Listeria monocytogenes : OCORRÊNCIA NA CARNE BOVINA ... Barrros.pdf · dos principais pontos de contaminação em plantas de processamento e relação com ... ARTIGO 1 - Listeria