Universidade de So Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

Estudo da formao de biofilmes de Listeria monocytogenes frente a diferentes condies encontradas em laticnios

Bruna Nicolosi Franzini Silva Travagin

Dissertao apresentada para a obteno do ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Cincia e Tecnologia de Alimentos

Piracicaba 2010

Bruna Nicolosi Franzini Silva Travagin Bacharel em Cincias dos Alimentos

Estudo da formao de biofilmes de Listeria monocytogenes frente a diferentes condies encontradas em laticnios

Orientador: Prof Dr. ERNANI PORTO

Dissertao apresentada para a obteno do ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Cincia e Tecnologia de Alimentos

Piracicaba 2010

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao

DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - ESALQ/USP

Travagin, Bruna Nicolosi Franzini Silva Estudo da formao de biofilmes de Listeria monocytogenes frente a diferentes

condies encontradas em laticnios / Bruna Nicolosi Franzini Silva Travagin. - - Piracicaba, 2010.

98 p. : il.

Dissertao (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2010. Bibliografia.

1. Bactrias patognicas 2. Biofilmes 3. Laticnios 4. Listeria I. Ttulo

CDD 637.1277 T779e

Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor

DEDICO

minha me Rosana e ao meu irmo Luiz

Gustavo, pelo amor e confiana.

AGRADECIMENTOS

Deus, pelas conquistas e por sempre iluminar meu caminho. minha me Rosana, pelo exemplo de vida, por todo o amor e dedicao, por sempre acreditar e apoiar as minhas decises. Ao meu irmo Luiz Gustavo, pelo companheirismo e carinho. minha av Maria Luiza e minha tia Luciana, por todo o apoio. Sarah, pelos momentos de descontrao e alegria proporcionados durante esta fase. toda a minha famlia pelo apoio, carinho e compreenso. Ao Professor Dr. Ernani Porto pela orientao, apoio e amizade. tcnica do Laboratrio de Higiene e Laticnios, Denise, pela pacincia, ajuda, disponibilidade, carinho e amizade. Aos colegas e amigos do Laboratrio de Higiene e Laticnios, em especial s estagirias Nicolle Ferraz de Arruda, Natlia Srgio Xavier, Natlia Salaro Grigol, Maira Oliveira Silva, Leilane de Bernardini e Paula Bortolotto Mendes Ramos pela ajuda na execuo deste trabalho. Aos colegas do Mestrado Bruno S. Rodriguez, Marina Marquezi, Jos Guilherme Prado Martin, Cristina Bani, Milla Santos e Tarsila Mendes. Aos amigos Danielle Thomazoni, Gabriela Alves Masserani, Bernardo Santos da Costa, Jos Otvio Matias, Felipe Pasquotto, Rodrigo Arajo, Henrique Rossitti, e Luiz Fernando Ruy Sachett Dias pela amizade sincera. s amigas Luciana Kimie Savay da Silva, Maria Fernanda Calil Angelini, Vanessa Cristina Nogueira e Brbara Belodi dos Santos por vibrarem por cada resultado obtido e ajuda nos momentos difceis, minha eterna amizade e gratido. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, pelo aprendizado de todos esses anos. Aos funcionrios do Departamento de Agroindstria, Alimentos e Nutrio pelo apoio, que de alguma forma colaborao para a execuo deste trabalho, em especial Regina e Fbio. BIOSAN pelo fornecimento do sanificante para a realizao deste trabalho. empresa SANI QUMICA pelo fornecimento dos detergentes para a realizao deste trabalho.

empresa GEA WESTFALIASURGE do Brasil, na pessoa de Dennys Pereira, pelo fornecimento das teteiras de borracha e silicone para a realizao deste trabalho. CAPES, pela bolsa concedida. Ao Professor Edwin M. Ortega pelo auxlio nas anlises estatsticas. Professora Gilma Lucazechi Sturion por todas as oportunidades, orientao e amizade durante esses anos. Ao Professor Francisco Andr Ossamu Tanaka, por disponibilizar o Laboratrio e todo o material necessrio para a realizao das anlises de Microscopia Eletrnica de Varredura. Aos demais colegas que no foram citados, mas que merecem igual respeito e agradecimento.

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RESUMO Estudo da formao de biofilmes de Listeria monocytogenes frente a diferentes

condies encontradas em laticnios

Os biofilmes, especialmente de bactrias patognicas como Listeria monocytogenes, tm chamado a ateno nos laticnios pelos riscos que implicam ao consumidor, devido aos repetidos surtos causados por ingesto de lcteos contaminados. A legislao brasileira apenas especifica L. monocytogenes em queijos. Alm disso, os biofilmes geram problemas econmicos para a indstria e diminuem a eficincia dos agentes sanificantes empregados. O objetivo do trabalho foi avaliar a formao de biofilmes de L. monocytogenes em diferentes tempos, temperaturas, superfcies e resduos lcteos, bem como a presena de Lactobacillus plantarum como competidor, assim como analisar a eficincia do processo CIP (Clean In Place) de um pasteurizador de leite com quaternrio de amnia. As populaes bacterianas dos biofilmes foram avaliadas atravs da tcnica do suabe e Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV). O modelo experimental foi baseado na formao de biofilmes de L. monocytogenes em cupons de ao inoxidvel 304, silicone e borracha. Os cupons permaneceram imersos por 10 horas, a 5C e 35C, em leite UHT integral, desnatado e creme de leite UHT, seguido da incubao em diferentes tempos (0, 18 e 114 horas) e temperaturas (5C e 35C) para a formao do biofilme. A competio foi realizada em ao inoxidvel a 35C, nos tempos 0 e 18 horas. O processo CIP teve sua eficincia avaliada na remoo de biofilmes de L. monocytogenes na presena de leite integral e desnatado, simulando a limpeza e sanificao de um pasteurizador de leite. A formao de biofilmes pro L. monocytogenes foi influenciada pela baixa temperatura (5C), podendo ocorrer em reas de refrigerao dos laticnios. O microrganismo capaz de sobreviver e formar biofilmes por longos perodos nas superfcies de ao inoxidvel, silicone e borracha na presena de resduos de leite integral, desnatado e creme de leite. O crescimento em competio por Lactobacillus plantarum no inibiu a formao de biofilmes por L. monocytogenes e crescimento de clulas planctnicas. O processo CIP foi eficiente em todas as condies estudadas, eliminando as clulas de L. monocytogenes.

Palavras-chave: Biofilmes, L. monocytogenes, Laticnios, MEV, CIP

ABSTRACT

Study os biofilm formation of Listeria monocytogenes to different conditions encountered in dairy industries

The biofilm, especially of pathogenic bacteria Listeria monocytogenes, have been getting

the attention in the dairy products for the risks that implicate the consumer, due to the repeated outbreaks caused by ingestion of milky polluted. The Brazilian legislation just specifies L. monocytogenes in cheeses. Besides, the biofilm generate economical problems for the industry and they reduce the agents used sanitizers efficiency. The objective of the work was to evaluate the formation of biofilms of L. monocytogenes in different times, temperatures, surfaces and milky residues, as well as the presence of Lactobacillus plantarum as competitor, as well as analyzing the efficiency of the process CIP (Clean In Place) of a milk pasteurize whit quaternary of ammonium. The bacterial populations of the biofilms were appraised through the technique of the swab and Scanning Electron Microscopy (SEM).The experimental model was based on the formation of biofilms of L. monocytogenes in coupons of stainless steel 304, silicon and rubber. The coupons stayed immersed by 10 hours, to 5C and 35C, in skim milk UHT, skimmed and cream of milk UHT, following by the incubation in different times (0, 18 and 114 hours) and temperatures (5C and 35C) for the formation of the biofilm. The competition was accomplished in stainless steel to 35C, in the times 0 and 18 hours. The process CIP had his efficiency appraised in the removal of biofilms of L. monocytogenes in presence of skim milk and skimmed, simulating the cleaning and sanitation of a milk pasteurizer. The biofilmes formation for L. monocytogenes was influenced by the low temperature (5C), could happen in areas of cooling of the dairy products. The microorganism is capable of to survive and to form biofilmes for long periods in the surfaces of stainless steel, silicon and eraser in the presence of residues of integral milk, skimmed and cream of milk. The growth in competition for Lactobacillus plantarum didn't inhibit the biofilms formation for L. monocytogenes and growth of cells. The process CIP it was efficient in all of the studied conditions, eliminating the cells of L. monocytogenes.

Keywords: Biofilm, L. monocytogenes, Dairy industries, SEM, CIP

1. INTRODUO

Zobell em 1943 formulou o problema dos biofilmes, mas foi na dcada de 1970 que se

verificou que biofilmes so um fenmeno comum na natureza (CRIADO et al., 1994). Contudo,

somente na dcada de 1980 os biofilmes comearam a ser estudados na indstria de alimentos

(ZOTTOLA, 1994). Zoltai et al. (1981) foram os primeiros a publicar pesquisa sobre a aderncia

de bactrias patognicas em superfcies de indstrias de alimentos.

Os biofilmes formados por microrganismos patognicos ou deteriorantes so indesejveis

em superfcies que mantm contato com alimentos (ZOTOLLA, 1994), os quais podem ser

formados em todos os tipos de superfcies, em diferentes ecossistemas onde nutrientes so

abundantes (POULSEN, 1999).

Formaes de biofilmes podem causar bloqueios nos sistemas mecnico, em sistemas de

manipulao de fluidos, impedir a transferncia de calor e promover a corroso das superfcies de

metal (KUMAR; ANAND, 1998; CHMIELEWSKI; FRANK , 2003).

As bactrias podem se aderir e colonizar vrias superfcies (MAFU et al., 1990) formando

biofilmes na forma tridimensional sobre superfcies como ao inoxidvel (CHAVANT et al.,

2002), amplamente utilizado na indstria de alimentos, pela facilidade de higienizao e

resistncia corroso.

Os biofilmes so responsveis por significantes perdas de eficincia de processos

tecnolgicos e danos em equipamentos. Durante o processamento de alimentos, a contaminao

do produto pode ser conseqncia de biofilmes formados nas superfcies de equipamentos

(CONSTERTON, 1987; GILBERT et al., 2003). As superfcies dos equipamentos empregados

para a manipulao de alimentos, armazenamento ou processamento so reconhecidas como a

maior fonte de contaminao microbiana (WONG, 1998).

No biofilme os microrganismos esto mais resistentes ao de agentes qumicos e fsicos

(MOSTELER; BISHOP, 1993; CHAE et al., 2006) do que as bactrias planctnicas (ZOTTOLA;

SASAHARA, 1994). Assim, sob a forma de biofilmes, os microrganismos sobrevivem por

perodos extensos, devido a sua natureza estrutural e aos atributos fisiolgicos (DONLAN;

COSTERTON, 2002), resistem tambm dessecao, luz UV, e tratamentos com agentes

antimicrobianos e sanificantes (COSTERTON 1987; BORUCKI et al, 2003), aumentando a

persistncia bacteriana em indstria de alimentos e conseqentemente aumentando as chances de

uma ps-contaminao (BARNES et al., 1999; CHAE et al., 2006; PAP; KISK, 2008).

Os objetivos deste trabalho foram:

a) Avaliar a formao de biofilmes de L. monocytogenes em diferentes superfcies: ao

inoxidvel, borracha e silicone encontradas em laticnios, na presena de resduo de

leite ultra pasteurizado (UHT) integral, desnatado e creme de leite;

b) Determinar a habilidade de cepas de L. monocytogenes em sobreviver e formar

biofilme na presena do competidor Lactobacillus plantarum;

c) Determinar a eficincia do processo CIP com sanificante quaternrio de amnio

QUATERCP DM-50 (BIOSAN), que possui Cloreto de Benzalcnio como princpio

ativo na remoo de biofilmes formados por L. monocytogenes em ao inoxidvel com

resduos de leite integral e desnatado.

2. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1. Biofilmes

Na indstria de alimentos os microrganismos podem aderir a superfcies slidas

condicionadas com nutrientes; tal condio suficiente para sua viabilidade e crescimento. Esses

microrganismos inicialmente depositam-se na superfcie e aderem sobre essa, multiplicando-se

pra formar colnias (KUMAR; ANAND, 1998; MACDO, 2007).

Biofilmes so freqentemente formados por diferentes espcies e gneros microbianos, os

quais esto associados superfcie e envolvidos dentro da matriz polimrica de origem

microbiana (GILBERT; ALLISON; McBAIN, 2002).

Uma vez formados, os biofilmes so de difcil remoo das superfcies de indstrias de

alimentos pela produo de substncias polimricas extracelulares e as dificuldades associadas

com a limpeza de complexos equipamentos e ambiente de processamento (WONG, 1998;

CHMIELEWSKI; FRANK, 2003).

A adeso da bactria com subseqente desenvolvimento de biofilmes em ambientes

processadores de alimentos uma fonte potencial de contaminao, podendo conduzir a

deteriorao de alimentos ou transmisso de doenas (WONG, 1998; REIJ; AANTREKKER,

2004). Por isso, a formao de biofilmes microbianos em superfcies de contato com alimentos

assunto de grande preocupao nas indstrias de alimentos. A aderncia a um substrato slido

usualmente seguida pela formao de microcolnias circundadas com polissacardeos

extracelulares ou glicoclix (JEYASEKARAN; KARUNASAGAR; KARUNASAGAR, 2000).

Na maioria dos casos, a formao de biofilme ocorre em ambientes onde a diversidade

microbiana alta, como ralos, mas outros biofilmes so formados em ambientes que so

dominados por uma nica ou poucas espcies microbianas, como placas de trocadores de calor

(CHMIELEWSKI; FRANK, 2003).

reas que so mais propensas ao desenvolvimento de biofilmes incluem tubulaes no

operantes, juntas, vlvulas e gaxetas (MAFU et al., 1990; MATTILA-SANDHOLM;

WIRTANEN, 1992; BLACKMAN; FRANK, 1996; WONG, 1998).

As superfcies comumente usadas para processamento de alimentos, como ao inoxidvel,

polietileno, polipropileno, policarbonato, ao-carbono, madeira, teflon e vidro, permitem o

$

crescimento microbiano, podendo originar processos de adeso bacteriana e formao de

biofilmes (ANDRADE, 2008).

2.2. Fatores que influenciam a adeso microbiana

Muitos fatores afetam o desenvolvimento do biofilme incluindo a superfcie e

propriedades de interface, disponibilidade de nutrientes, composio da comunidade microbiana,

hidrodinmica, interao entre as espcies, e o transporte celular (CHMIELEWSKI; FRANK,

2003).

Dentre os fatores que podem influenciar a adeso de microrganismos nas superfcies

encontram-se a fase metablica da clula, o tipo e propriedades do material, a presena de

matria orgnica, o pH e a temperatura do meio que envolve o microrganismo (MATTILA-

SANDHOLM; WIRTANEN, 1992; REINEMANN; WONG; RABOTSKI, 1993; WONG, 1998;

POMPERMAYER; GAYLARDE, 2000; CHMIELEWSKI; FRANK, 2003; PALMER et al.,

2007).

A hidrofobicidade est relacionada a componentes presentes na membrana externa do

microrganismo e so relevantes na sua adeso em superfcies. Os microrganismos podem

apresentar variaes na hidrofobicidade, dependendo do modo de crescimento bacteriano e das

condies de cultura (HOOD; ZOTTOLA, 1995). Essas diferenas, inclusive entre espcies e

sorotipos, influenciam a adeso (CHAE et al., 2006).

A presena de flagelo, pili ou glicoclix podem aumentar a taxa de fixao de

microrganismos. Isto se deve ao fato da clula microbiana, uma vez aderida superfcie, ter a

capacidade de superar a fora repulsiva comum a todos os materiais, assim, apndices habilitam a

clula a permanecer fixa (DONLAN, 2001). As propriedades aderentes da clula so

influenciadas pelo envelope celular cuja qumica se altera de acordo com estmulos ambientais.

Estudos com Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Staphylococcus epidermidis demonstram

que os genes responsveis pela protena de expresso da superfcie so ativadas, fixando e

produzindo exopolissacardeos (EPS) em resposta aos estmulos externos como densidade de

populao, tenso ou limite de nutrientes (CHMIELEWSKI; FRANK, 2003).

A superfcie celular considerada um significante fator na ligao bacteriana

superfcies. Muitos estudos sugerem que a carga da superfcie celular e a hidrofobicidade tm um

'

importante papel nos estgios iniciais de adeso microbiana. Numerosos mtodos tm sido

desenvolvidos com a tentativa de determinar as propriedades fsico-qumicas da superfcie celular

microbiana e o substrato (CHAE et al., 2006).

A disponibilidade de nutriente tem grande influncia na estrutura do biofilme e na

composio da comunidade microbiana (CHMIELEWSKI; FRANK, 2003). A aderncia em

superfcies durante a limitao de nutrientes pode ser uma tcnica de sobrevivncia da clula

microbiana (HOOD; ZOTTOLA, 1995). A limitao de nutrientes e gua, o design do

equipamento, e as temperaturas de controle so importantes na formao dos biofilmes

(CHMIELEWSKI; FRANK, 2003).

A microtopografia da superfcie importante, pois pode favorecer a reteno bacteriana,

particularmente, se a superfcie for constituda de canais fundos e fendas (KUMAR; ANAD,

1998).

2.3. Adeso microbiana e formao de biofilmes

Sob determinadas condies, os microrganismos aderem e interagem com as superfcies,

iniciando a reproduo celular (COSTERTON; MARRIE; CHENG, 1985). A adeso microbiana

ocorre devido deposio de microrganismos em uma superfcie de contato onde se fixam e

iniciam sua reproduo. Essa multiplicao celular d origem a colnias e, quando a massa

celular suficiente para agregar nutrientes, resduos e outros microrganismos, estabelece-se o

biofilme (ZOTOLLA; SASAHARA, 1994). O biofilme forma-se a partir da produo de uma

matriz de polmeros orgnicos, denominados glicoclix ou exopolissacardeos (EPS), que adere

s clulas (CRIADO et al., 1994).

Os EPS so compostos de carboidratos e protenas (ZOTTOLA; SASAHARA, 1994). So

altamente hidratados (POULSEN, 1999) (98% de gua), consistem principalmente de

polissacardeos, tendendo a ser a principal substncia que permite a fixao do microrganismo

superfcie e podem ser vistos por microscopia eletrnica (DONLAN, 2001). Segundo Costerton

et al. (1985) esses EPS expe-se aps membrana externa das clulas Gram-negativas e ao

peptdeoglicano das Gram-positivas.

Provem proteo aos habitantes do biofilme atravs da concentrao de nutrientes,

prevenindo o acesso de biocidas e dessecao (CHMIELEWSKI; FRANK, 2003). Esses

;

polmeros envolvidos na aderncia das clulas dentro dos biofilmes podem agir como receptores

para interaes de coagregaes, sendo importantes na adeso de colnias secundrias

(RICKARD et al., 2003).

A produo de EPS por biofilmes bacterianos possui muitas funes, como facilitar a

adeso inicial da bactria na superfcie; formao e manuteno de microcolnias e estrutura do

biofilme; aumento da resistncia do biofilme a ambientes de estresse e agentes microbianos

(POULSEN, 1999) e reteno de enzimas e outros compostos extracelulares (GILBERT;

ALLISON; McBAIN, 2002). A matriz do biofilme tem potencial de modificar a resposta das

clulas envolvidas ao tratamento antimicrobiano por sua ao como uma barreira de difuso

(MITTELMAN, 1998; GILBERT; ALLISON; McBAIN, 2002).

O desenvolvimento de uma extensiva matriz extracelular e o crescimento em

comunidades pode ser importante para manter uma tima condio ambiental do biofilme. As

fibras polimricas formam uma ponte entre a clula bacteriana e o substrato o que habilita a

associao irreversvel com a superfcie, sendo os polissacardeos extracelulares do biofilme

crticos para a persistncia e sobrevivncia em ambientes hostis, onde agem retendo nutrientes

para o crescimento da comunidade microbiana. (KUMAR; ANAND, 1998).

De acordo com Costerton et al. (1995), em ambientes naturais ou industriais, a adeso

bacteriana mediada pelo glicoclix, que uma matriz hidratada, produzida por polimerases,

ligada aos componentes lipopolissacardeos das clulas bacterianas. Seu papel constituir uma

barreira de proteo parcial ao biofilme contra, agentes antibacterianos (MORTON et al., 1998).

Assim, as bactrias resistem aos procedimentos de higienizao e continuam a crescer, formando

um cultivo puro ou uma associao com outros microrganismos (MOSTELER; BISHOP, 1993;

RICHARD et al, 2003).

Marshall et al., (1971), descrevem a formao do biofilme em duas fases: na primeira

ocorre adeso do microrganismo na superfcie por foras de Van der Walls e atrao eletrosttica,

onde o processo ainda reversvel; na segunda etapa, ocorre a interao fsica da clula com a

superfcie por meio de material extracelular de natureza polissacardea ou protica, produzida

pela bactria, que denominada matriz de glicoclix (ZOTTOLA, 1994). Essas fibras se tornam

mais grossas com o tempo, levando formao da matriz do biofilme, dentro da qual substncias

orgnicas e inorgnicas coexistem com microrganismos. Caso as clulas do biofilme sejam

reinoculadas, como clulas planctnicas, haver reduo na produo de exopolissacardeos

(KUMAR; ANAND, 1998).

O biofilme se desenvolve como resultado posterior da adsoro e aderncia de clulas

planctnicas novas, combinado com o crescimento continuado das que j se encontram aderidas

sobre uma superfcie (KALMOKOFF et al., 2001). A aderncia bacteriana baseada nas foras

de atrao fsico-qumica entre as clulas e o substrato. Quando os microrganismos se tornam

firmemente fixados a uma superfcie com a ajuda do material extracelular, a aderncia est

concluda, de acordo com Hood e Zottola (1995). Nessa situao so de difcil remoo e

requerem aplicao de fora mecnica forte ou ao qumica como detergentes e sanitizantes

(CHMIELEWSKI; FRANK, 2003).

Outra teoria prope a diviso do processo de adeso em trs etapas, sendo a primeira a

fixao da bactria, seguida da consolidao da bactria na superfcie e, por ltimo, a colonizao

da bactria (NORTEMANS et al., 1991).

Clulas em crescimento em biofilmes mostram diferenas em seus metabolismos e

fisiologia quando comparadas com clulas planctnicas. Essas clulas podem expressar diferentes

fentipos dependendo da sua localizao dentro biofilme (McLANDSBOROUGH et al., 2006).

Segundo os mesmo autores, o biofilme maduro possui uma estruturada matriz composta

de canais verticais e horizontais, os quais permitem o fluxo de lquidos que iro garantir o

suprimento de nutrientes para as clulas bacterianas e eliminao de resduos gerados como parte

dessa atividade celular.

2.4. Os biofilmes e as indstrias de alimentos

Biofilmes na indstria de alimentos podem apresentar grande quantidade de resduos

alimentares e minerais que so originados durante o processamento. Esses constituintes fornecem

proteo aos microrganismos dentro do biofilme (CHMIELEWSKI; FRANK, 2003).

Bloqueios mecnicos, impedncia de processos de transferncia de calor, biodeteriorao

de componentes de sistemas metlicos e polimricos resultam em bilhes de dlares de perdas a

cada ano. Deteriorao de produtos e possveis riscos sade da populao so tambm

conseqncias de contaminao por biofilmes (MITTELMAN, 1998).

A aderncia de bactrias na superfcie de contato de alimentos, com o subseqente

desenvolvimento de biofilmes, uma fonte potencial de contaminao em produtos processados

com microbiota deteriorante e patognica (ZOTTOLA, 1994; SHARMA; ANAND, 1998).

Indstrias de alimentos freqentemente encontram problemas de biofilmes bacterianos

persistentes em tubulaes e equipamentos de processamento (JANG et al, 2006). Um dos fatores

agravantes a corroso dos equipamentos pela idade, que acumulam sujidades (MATTILA-

SANDHOLM; WIRTANEN, 1992; WONG, 1998).

O ao inoxidvel um dos materiais ideais para indstria de alimentos por ser inerte e

resistente em uma variedade de temperaturas de processamento, de fcil limpeza, e apresenta

elevada resistncia corroso. A microtopografia do ao inoxidvel composta de ranhuras e

fendas, completamente ao contrrio de sua aparncia macroscpica (STONE; ZOTTOLA, 1985;

ZOTTOLA; SASAHARA, 1994).

Ao inoxidvel o material mais freqentemente usado em equipamentos de

processamento de alimentos, porm o polipropileno est se tornando mais popular na indstria

para a construo de tanques e acessrios (POMPERMAYER; GAYLARDE, 2000; OULAHAL

et al., 2008).

2.4.1. Biofilmes na indstria de laticnios Biofilmes em laticnios invariavelmente contm resduos de leite, particularmente

protenas e minerais como o fosfato e clcio. Com tendncias atuais para turnos de produo mais

longos, uso de equipamentos complexos, automao das plantas, e crescente aumento da

microbiota, a contaminao de produtos lcteos devido presena de biofilmes bacterianos se

tornou de grande interesse para os laticnios (BREMER et al., 2006).

Flach, Karnopp e Coro (2005), estudaram a relao entre a produo de fatores

virulncia de 101 isolados bacterianos, 46 pertencentes famlia Enterobacteriaceae e os demais

pertencentes ao gnero Staphylococcus, relacionados colonizao de superfcies de

polipropileno, ao inoxidvel e pano de algodo com resduos de leite e observaram uma relao

direta entre formao de biofilmes e produo de fatores relacionados adeso, pelos

microrganismos, principalmente produo de cpsula e hidrofobicidade celular, assim como

atividade citotxica e proteoltica, a ltima, relacionada degradao do leite.

Na indstria de laticnios a formao de biofilmes eleva a carga microbiana e pode

originar contaminaes por patgenos nas linhas de produo, o que se torna bastante

preocupante uma vez que o desprendimento de uma pequena quantidade de microrganismo pode

colocar em risco a sade do consumidor (ZOTTOLA, 1994).

Outro problema de presena de biofilmes est relacionado com a contaminao por

Enterobacter sakazakii durante a produo de frmulas de leite infantis. Scheepe-Leberkhne e

Wagner (1986) relataram que este microrganismo produz um material capsular viscoso, e

conseqentemente, gera biofilme em superfcies de contato com alimentos, alm de crescer sob

refrigerao. Infeces neonatais esto associadas com a colonizao do E. sakazakii de

equipamentos da preparao deste alimento tal como escovas, blenders e colheres (BAR-OZ et

al. 2001).

Biofilmes de bactrias termodricas, como Streptococcus thermophillus, por exemplo, so

capazes de sobreviver pasteurizao do leite e formam biofilmes resistentes nas placas dos

trocadores de calor utilizados neste processo (KNIGHT, 1993).

Alm do desprendimento de clulas bacterianas, durante a formao dos biofilmes, outro

problema nas linhas de produo a sobrevivncia de alguns desses microrganismos mesmo aps

o processo conhecido como CIP (Cleaning in Place). Sharma e Anand, 2002, demonstraram em

seus estudos, a presena de diversos microrganismos em equipamentos da linha de pasteurizao

de laticnio comercial e experimental, como gnero Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus,

Lactococcus e Staphylococcus, Micrococcus sp. e os Gram negativos como Shigella, E. coli,

Enterobacter aerogenes e espcies de Citrobacter, Flavobacterium e Proteus.

2.5. Listeria monocytogenes

L. monocytogenes um bacilo Gram-positivo, medindo de 1,0 a 2,0 por 0,5 , no

formador de esporos, anaerbio facultativo. Por apresentar crescimento na faixa de 2,5C a 44C

(FRANCO; LANDGRAF, 2002; GANDHI; CHIKINDAS, 2007), pH timo de 6,0 a 8,0 (JAY,

2005) e tolerar altas concentraes de sal (CHAE; SCHRAFT, 2001) torna-se de difcil controle

na indstria de alimentos. Tornou-se um dos mais importantes patgenos veiculados por

alimentos na dcada de 1980, devido ecloso de diversos surtos de listeriose humana

(FRANCO; LANDGRAF, 2002).

Ao contrrio de outras infeces alimentares, a listeriose no causa sintomas

gastrintestinais. Depois de ingeridas, as clulas colonizam o intestino, so fagocitadas por

macrfagos, onde se multiplicam, e espalham-se pelo organismo. O quadro resultante grave,

afetando o sistema nervoso central, causando meningite, abortos, septicemia e diversas

manifestaes (JAY, 1992).

Apesar de ser um microrganismo ambiental, os alimentos envolvidos em surtos de

listeriose sempre foram os industrializados. Segundo Fenlon; Wilson e Donachie (1996), a fonte

primria de L. monocytogenes o ambiente e, atravs da matria-prima (animal e vegetal), a

bactria introduzida na indstria, onde certas cepas se adaptam. Tal microrganismo tem sido

isolado de laticnios e frigorficos (WONG, 1998).

Est bem estabelecido que qualquer alimento fresco de origem animal ou vegetal pode

apresentar nmeros variados de L. monocytogenes. Em geral, o microrganismo tem sido

encontrado em leite cru, queijo mole, carnes frescas ou congeladas, frango, frutos do mar, frutas e

produtos vegetais. A prevalncia em leite e laticnios tem recebido maior ateno devido aos

primeiros surtos (JAY, 2005).

L. monocytogenes pode ser isolada de indstria de alimentos, especialmente nas reas nas

quais so inacessveis os processos de limpezas usuais (NELSON, 1990). Ao contrrio de outros

patgenos alimentares, L. monocytogenes cresce em ambiente de refrigerao (BORUCKI et al.,

2003; GANDHI; CHIKINDAS, 2007; LEMON et al., 2007). A ampla distribuio na natureza

(solo, gua, vegetais, insetos, seres humanos), combinado com sua resistncia desidratao

sobre superfcies slidas, sua persistncia em biofilmes, ampla faixa de temperatura e de pH para

desenvolvimento, alm de ser uma das clulas vegetativas de maior resistncia trmica

(FRANCO; LANDGRAF, 2002), explica porque da dificuldade de eliminar este patgeno do

ambiente de indstrias de alimentos.

No Brasil, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria estabeleceu a ausncia de L.

monocytogenes em 25 g para queijos de mdia, alta e muito alta umidade. Este o nico alimento

que contempla a determinao deste microrganismo (BRASIL, 2001).

2.5.1. Formao de biofilmes por Listeria monocytogenes L. monocytogenes capaz de aderir a superfcies de contato de alimentos e formar

biofilmes que impedem a eficincia do processo de sanificao (NORWOOD; GILMOUR, 2000;

2001), o que ir aumentar a persistncia bacteriana na indstria de alimentos, e conseqentemente

aumentar as chances da contribuio de contaminao ps-processo (CHAE et al., 2006). Este

microrganismo capaz de se ligar em ao inoxidvel e produzir EPS, formando biofilmes

(BLACKMAN; FRANK, 1996).

A ameaa desta bactria na indstria baseada na sua habilidade em crescer a largas

faixas de temperatura, principalmente sob refrigerao. Os trabalhos sobre aderncia de L.

monocytogenes em superfcies so realizados com um pequeno nmero de materiais, tipicamente

ao inoxidvel e a borracha, e no h grandes estudos comparativos reportados de sua adeso

para uma gama mais larga de materiais presentes no processamento de alimentos (BERESFORD

et al., 2001). Alm da borracha, Mafu et al. (1990) verificaram a aderncia de L. monocytogenes

em vidro e polipropileno.

A presena de altos nveis de nutrientes, depsitos macroscpicos e microscpicos de

resduos de alimentos, e o freqente estresse de processos de limpeza e sanificao iro

influenciar na estrutura de biofilmes de Listeria monocytogenes, que um patgeno com

capacidade de proliferao em temperaturas de refrigerao em ambientes midos que so ideais

para a formao de biofilmes (CHMIELEWSK; FRANK, 2003). reas de refrigerao na

indstria de alimentos, em particular, fornecem condies que permitem a sobrevivncia e

crescimento de L. monocytogenes na forma de biofilmes (AL-MAKHLAFI et al., 1994;

NORWOOD; GILMOUR, 2001).

A habilidade de L. monocytogenes em aderir e colonizar superfcies durante o

processamento e estocagem de alimentos importante na contaminao do produto antes do

consumo. Vrios estudos tm demonstrado que cepas dominantes ou persistentes de L.

monocytogenes isoladas de indstrias de alimentos tm uma maior taxa de aderncia em

superfcies do que cepas espordicas ou no persistentes (PALMER et al., 2007). Borucki et al.

(2003) concluiram que cepas persistentes de L. monocytogenes em laticnios, demonstraram alta

taxa inicial de aderncia e aumento na formao de biofilme. Palmer et al (2007) atriburam essa

persistncia de cepas de L. monocytogenes seleo natural dentro da indstria de alimentos,

com maior habilidade de aderir a superfcies slidas, resistir a sanificantes e formar extensos

biofilmes

Segundo Robbins et al. (2005), Listeria monocytogenes tem sido isolada em pisos,

freezers, salas de processamento e lubrificantes utilizados na indstria de laticnios. J Barancelli

e colaboradores (2009) isolaram L. monocytogenes na salmoura, piso e estrado de cmaras frias

de laticnios, alm das mos enluvadas dos manipuladores.

Muitos trabalhos tm descrito os efeitos de vrios parmetros ambientais sobre biofilmes

de L. monocytogenes, como sobrevivncia, patogenicidade e adeso. Os parmetros mais

freqentemente estudados que influenciam a formao de biofilmes so: temperatura de

crescimento (JEONG; FRANK, 1994; NORWOOD; GILMOUR, 2001; CHAVANT et al., 2002;

MOLTZ; MATIN, 2005; MAI; CONNER, 2007), acidificao do meio com cidos orgnicos

(BREMER et al., 2002; TRESSE et al., 2006; CATALDO et al., 2007), meio de crescimento

(MOLTZ; MARTIN, 2005; MAI; CONNER, 2007).

2.6. Biofilmes formados por espcies mistas de bactrias

Em um ambiente de processamento de alimentos existe uma ampla variedade de

microrganismos, os quais podem influenciar a formao de biofilmes puros ou biofilmes mistos

(MOSTELER; BISHOP, 1993; HOOD; ZOTTOLA, 1995). Sendo heterogneos, os

requerimentos nutricionais das clulas desses biofilmes sero diferentes (KUMAR; ANAND,

1998). Biofilmes dessa natureza so mais espessos e mais estveis ao estresse ambiental que

biofilmes de uma nica espcie (CHMIELEWSKI; FRANK, 2003).

L.monocytogenes capaz de sobreviver e crescer em biofilmes mistos (FRANK et al.,

1990; JEONG; FRANK, 1994). Segundo Chmielewsi e Frank (2003), bactrias patognicas como

Listeria monocytogenes podem co-existir dentro do biofilme com outra microflora ambiental, um

exemplo a Pseudomonas (CHMIELEWSI; FRANK, 2003).

Espcies iniciadoras de colonizao podem potencialmente favorecer a colonizao de

espcies que so fisiologicamente compatveis, enquanto inibem a aderncia de outras. O

biofilme formado por comunidades microbianas diferentes so freqentemente mais espessos e

mais estveis que biofilmes de uma nica espcie (KUMAR; ANAD, 1998).

L. monocytogenes freqentemente isolada de superfcies midas de equipamentos de

indstria de alimentos (NELSON, 1990) e, nessas superfcies, existe uma variedade de

microbiota competidora presente (FRANK et al., 1990), geralmente estando associadas com

outros microrganismos, como Pseudomonas spp. (CHAVANT et al., 2002).

Alguns autores sugerem que L. monocytogenes em biofilmes cresce mais lentamente na

presena de uma microbiota competidora do que em monocultura (JEONG; FRANK, 1994,

ZHAO et al., 2004).

Wong (1998) e Farrag e Marth (1991) verificaram que L. monocytogenes era capaz de

formar biofilmes, sobre cupons de ao inoxidvel, na presena da microbiota natural do leite cru

e de bactrias psicrotrficas.

Segundo Carpentier e Chassaing (2004) o gnero Pseudomonas favorece a colonizao de

superfcies por L. monocytogenes e Listeria innocua. Em contraste, Norwood e Gilmour (2001)

mostraram que L. monocytogenes apresenta contagem de clulas mais altas em biofilmes de

monocultura do que em biofilmes que tambm contm Staphylococcus xylosus e Pseudomonas

fragi.

Bactrias lticas so comuns no leite e produzem metablitos tais como cido lctico,

actico, propinico e frmico, diacetil, perxido de hidrognio, pH baixo, condies anaerbias e

produo de bacteriocinas como nisina, pediocina, diplococina e plantacina, que impedem a

colonizao por outras espcies patognicas, Assim, as bactrias lcticas criam ambientes

adversos sobrevivncia de patgenos em alimentos (MASSAGUER, 2005).

Bactrias cido-lticas tm sido utilizadas no controle de L. monocytogenes em alimentos,

na forma de culturas probiticas e de proteo (MORETRO; LANGSRUD, 2004).

Lactobacillus plantarum uma bactria ltica frequentemente usada como cultura starter

em alimentos (JOHANSON et al., 1995), na produo de vegetais fermentados, produtos de

salsicharia e silagem animal (DAESCHEL et al., 1990). Estudos revelam que cepas do tal

microrganismo so produtoras de bacteriocinas, como a plantaricina A (DAESCHEL, et al.,

1990) e a plantaricina C (GONZLEZ et al., 1994).

Bacteriocinas fazem parte de um grupo heterogneo de protenas e peptdeos

antibacterianos que podem variar no espectro de atividade, modo de ao, massa molecular,

$

origem gentica e propriedades bioqumicas. Apresentam efeito inibitrio no desenvolvimento de

algumas espcies de bactrias Gram-positivas (NIKU-PAAVOLA et al., 1999).

2.7. Processos de higiene e sanificao

Limpeza e sanificao so etapas essenciais na preveno de contaminao de alimentos

por bactrias patognicas e deteriorantes. A eficcia de produtos de limpeza e desinfeco

depende do microrganismo e tipo de sujidade (GRAM et al., 2007).

A reduo do nmero de microrganismos fundamental em indstrias de alimentos, onde

superfcies midas favorecem o crescimento de microrganismos (MASSAGUER, 2005).

O controle de biofilmes representa um dos desafios mais persistentes dentro de ambientes

industriais onde comunidades microbianas so problemticas. Os biofilmes na indstria de

alimentos podem ser eliminados pela adoo de diferentes estratgias como mtodos fsicos e

qumicos (KUMAR; ANAND, 1998).

O processo de higienizao deve ser escolhido de acordo com os equipamentos, utenslios

e condies da indstria de alimentos. A escolha do processo importante para se obter um

resultado eficiente dentro do sistema de higienizao disponvel (ANDRADE; MACEDO, 1996).

A higienizao divide-se em duas etapas muito bem definidas: a limpeza e a sanificao.

A limpeza tem como objetivo principal a remoo de resduos orgnicos e minerais aderidos s

superfcies. A sanificao, objetiva eliminar microrganismos patognicos e reduzir o nmero de

deteriorantes a nveis considerados seguros. A limpeza consegue reduzir a carga de

microrganismos das superfcies, mas no a nveis considerados satisfatrios, o que transforma a

sanificao em etapa indispensvel (MACDO, 2007).

Limpeza e sanificao de superfcies de contato com alimentos so realizadas pela

combinao de processos fsicos, trmicos e qumicos. A circulao de volume suficiente de

soluo de limpeza em concentrao, temperatura e velocidade adequadas so requeridas para

uma limpeza adequada de superfcies de contato com leite. Fracassos de sistemas clean-in-place

(CIP) frequentemente resultam de uma inadequada velocidade ou tempo de contato de soluo de

limpeza. Uma pequena quantidade de resduo alimentar suficiente para facilitar a adeso

bacteriana, sobrevivncia e crescimento. Caso estes resduos no sejam inativados ou removidos

'

durante a limpeza, o microrganismo pode eventualmente aderir e contaminar o leite, afetando a

qualidade, e se patgenos esto presentes, segurana do leite (REINEMANN, 1993).

O sistema, clean-in-place (CIP) a prtica mais comum de limpeza e sanificao

utilizado em equipamentos de processamento da indstria de laticnios (SHARMA; ANAND,

2002). Ele utilizado no controle de biofilme nos laticnios, segundo DUFOUR, et al, 2004, que

o qual o definem como o processo de limpeza completa de itens da indstria como tubulaes

sem, desmantelar ou provocar a abertura do equipamento, e com pouco ou nenhum envolvimento

manual por parte do operador (BREMER et al., 2006). O sistema CIP envolve solues qumicas

selecionadas por sua habilidade de remover material orgnico (protenas e gorduras) e inorgnico

(fosfato de clcio e outros minerais), presentes em laticnios. Para aumentar o controle da

contaminao microbiana, sistemas CIP podem ser complementados com sanificantes, como

iodforos, compostos quaternrios de amnio, cidos aninicos, e cloro (DUFOUR et al.,

2004).A efetiva limpeza depende tambm do produto e das variveis especficas da indstria,

como a otimizao do regime CIP, que varia entre laticnios e, com o passar do tempo, mesmo

dentro de um mesmo laticnio (BREMER et al., 2006). Mesmo com sistemas eficientes de

higienizao como o CIP, as bactrias podem permanecer nas superfcies (AUSTIN;

BERFERON, 1995).

Muitos agentes desinfetantes ou sanificantes frequentemente usados na indstria de

alimentos, como compostos de amnia quaternria (CQAs), cloro e iodforos, tm tido sua

efetividade demonstrada contra clulas em suspenso de L. monocytogenes (AARNISALO et al,

2000; 2007).

A ao dos sanificantes afetada pelas caractersticas da superfcie; pelo tempo e pela

temperatura de contato, pela concentrao de uso e pelos tipos de resduos presentes na

superfcie, pelo pH, pela propriedades fsico-qumicas da gua e por substncias inativadoras

(ANDRADE, 2008).

2.7.1. Compostos quaternrios de amnio (CQAs) Compostos quaternrios de amnio (CQA) so inodoros, incolores, no corrosivos

(ANDRADE, 2008), no txicos e so frequentemente usados na indstria de alimentos como

;

parte do protocolo de limpeza (McLANDSBOROUGH et al. 2006; CHMIELEWSKI; FRANK,

2003).

So substncias tensoativas catinicas que contm em sua estrutura um tomo de

nitrognio ligado covalentemente a quatro grupos alquil ou aril (ANDRADE, 2008). Por serem

catinicos so incompatveis com sanificantes base de cloro e por causa de sua carga positiva

podem no combinar com detergentes carregados negativamente (McLANDSBOROUGH et al.,

2003).

Segundo Massaguer (2005), estes compostos so mais efetivos em Gram-positivos do que

em Gram-negativos. No so esporicidas; so efetivos contra vrus lipoflicos, mas no contra os

hidroflicos que possuem alta resistncia, sendo mais efetivos a altas temperaturas. Sobre fagos

de bactrias lcticas so ativos, e so mais eficientes em pH alcalino. (MASSAGUER, 2005). So

pouco eficientes contra coliformes e psicrotrficos e ineficientes contra esporos (ANDRADE,

2008).

Compostos quaternrios de amnio so bacteriostticos em baixas concentraes,

bactericidas em altas concentraes e baixas concentraes desse agente podem favorecer o

desenvolvimento de resistncia adaptativa (MANGALAPPALLI-ILLATHU; KORBER, 2006).

Por ter atividade antimicrobiana, CQAs so utilizados para limpeza e desodorizao de

superfcies (McDONNELL; RUSSELL, 1999), sanitizao de pisos, paredes e no controle

microbiolgico do ar de ambientes de processamento de alimentos (ANDRADE, 2008).

A estrutura de um tomo de nitrognio ligado covalentemente a 4 grupos alquil ou aril,

resulta na formao de uma carga positiva no tomo de nitrognio. Independente do pH o

quaternrio de amnio mantm a carga positiva, o que diferencia dos tensoativos anfotricos

(MACDO, 2007). A frmula geral dos quaternrios de amnio se encontra a seguir:

R1= radicais alquil, alquilaril ou derivados (cadeia longa)

R2, R3 e R4 = hidrognio, alquil, aril, ou radicais heteroclclicos

X= nion inorgnico, usualmente cloreto ou brometo

FONTE: MACDO, 2007.

A modificao desses radicais d origem a um grande nmero de derivados que possuem

atividade germicida. Estes derivados se dividem em quatro classes: sais de

alquilbenzildimetilamnio, de heterocclicos alifticos ou compostos aromticos; de

tetraalquilamnio e alquil betanas, cujos principais representantes so mais utilizados em

cosmticos (RIEGER, 1993).

Os sais alquilbenzildimetilamnio so formados da alquilao entre alquilmetilaminas

com cloreto de benzila. Embora sejam substncias slidas, so encontradas comercialmente na

forma de solues aquosas. O principal germicida dessa classe o cloreto de belzalcnio

(MACDO, 2007).

A ao bactericida de um CQA est associada a vrios mecanismos de ao, como:

inibio enzimtica, desnaturao protica e leso da membrana citoplasmtica, com vazamento

dos constituintes celulares (MASSAGUER, 2005; MACDO, 2007).

Um dos compostos mais utilizados nas indstrias de alimentos o cloreto de benzalcnio,

um CQA comumente usado como surfactante e desinfetante catinico para linhas de

processamento e superfcies da indstria de alimentos (MANGALAPPALLI-IILLATHU;

KORBER, 2006). So usados extensivamente nas indstrias processadoras de alimentos para

prevenir a persistncia de patgenos como Listeria monocytogenes na microflora ambiental

(GILBERT; MOORE, 2005).

F

H

I

A diferena de ao dos CQAs para os compostos iodados e clorados est na formao de

um filme bacteriosttico sobre as superfcies que sofreram a aplicao de um quaternrio de

amnio. Ressalta-se que, em concentraes menores que 50mg/L de CQA e em baixas

temperaturas, sua ao bactericida alterada e se torna mais seletiva (MACDO, 2007).

2.8. Adaptao de microrganismos aos agentes antimicrobianos

Apesar da base da resistncia bacteriana a antibiticos ser bastante conhecida, a

resistncia a antisspticos, sanificantes e preservativos de alimentos, menos conhecida

(CLOETE, 2003).

O uso de determinados sanificantes exerce uma presso seletiva e contribuem para a

emergncia de microrganismos resistentes a estes compostos em ambientes onde se processam

alimentos. A resistncia combinada a sanificantes e a outros tipos de agentes antimicrobianos

pode se tornar um grande desafio no futuro, para as indstrias processadoras de alimentos

(LANGSRUD et al., 2003).

Em muitos casos, L. monocytogenes provavelmente encontra concentraes subletais de

sanificantes em locais de difcil acesso para higienizao nas indstrias de alimentos. Nessas

condies possvel que a resistncia do organismo para o agente antimicrobiano aumente

(AARNISALO et al., 2007). Outro fator que gera resistncia a adeso microbiana, a pesquisa de

Hood e Zottola (1995) sugeriu que microrganismos aderidos podem ser mais resistentes que

clulas livres aos compostos de sanificao .

Frank e Koffi (1990) relataram que L. monocytogenes capaz de produzir biofilmes

resistentes aos sanificantes como cloro, iodo, cido aninico e quaternrio de amnio nas

superfcies de vidro, ao inoxidvel e borracha.

O uso de sanificantes pode levar seleo de linhagens de bactrias resistentes ao agente

antibacteriano aplicado. Inmeros relatos indicam que a exposio bacteriana a concentraes

subletais de sanificantes pode ter como conseqncia um aumento de resistncia (LANGSRUD et

al., 2003).

possvel que a resistncia dos microrganismos de um biofilme a sanificantes possa ser

conseqncia da exposio a doses subletais destes compostos (JOSEPH et al., 2001;

DAVIDSON; HARRISON, 2002). Consequentemente, biofilmes podem representar um

reservatrio para a disseminao de genes resistentes a agentes antimicrobianos (LINDSAY;

VON HOLY, 2006). No h evidncias que o uso apropriado de sanificantes nos equipamentos

utilizados no processamento de alimentos ir desencadear o desenvolvimento de microrganismos

resistentes. No entanto, com o aumento do uso de sanificantes nos equipamentos, nos ambientes

de processamento de alimentos e em produtos crus, o potencial de surgimento de tais

microrganismos resistentes existe de fato. Portanto, o potencial de desenvolvimento de linhagens

resistentes deve continuar a ser investigado (DAVIDSON; HARRISON, 2002).

2.9. Avaliao de biofilmes

Os biofilmes bacterianos podem ser avaliados por mtodos no visuais como o suabe e

por mtodos visuais, como a microscopia de contraste, de epifluorescncia, microscopia

eletrnica de varredura (MEV) e de transmisso (MET) (MACDO, 2007).

A microscopia de contraste de fase recomendada para acompanhar o desenvolvimento

do biofilme em tempo real, numa superfcie transparente. A microscopia de epifluorescncia

(EPF) uma alternativa excelente na quantificao de clulas aderidas s superfcies. Para

visualizar a adeso bacteriana, usam-se substncias fluorescentes como o alaranjado de acridina

para colarao direta das clulas, ou anticorpos fluorescentes que se ligam s clulas, permitindo

sua observao (COSTA, 1999).

J a microscopia eletrnica mais indicada para a avaliao da interao microbiana na

matriz do biofilme. A fixao das amostras realizada utilizando agentes qumicos, como

glutaraldedo, o paraformaldedo e o smio ou crio-fixadas, onde a amostra rapidamente

congelada para evitar danos s clulas pelos cristais de gelo (COSTA, 1999).

2.9.1. Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) O desenvolvimento e aperfeioamento da microscopia eletrnica esto intimamente

associados ao progresso alcanado pela Biologia, nos ltimos 100 anos. O microscpio eletrnico

possibilitou a observao direta de aspectos ultraestruturais das clulas at ento desconhecidos

(ZOLTAI et al., 1981; GALLETI, 2003).

Na microscopia eletrnica a radiao empregada a de feixe de eltrons, sendo ele

refratado por meio de lentes eletrnicas. O microscpio eletrnico produz aumentos teis de

200.000 a 400.000X, sendo seu poder resolvente cerca de 100 vezes maior que o do microscpio

ptico

O MEV tem grande profundidade de foco. Como consequncia, a topografia superficial

de objetos slidos pode ser examinada com grande facilidade, e as micrografias tm aspecto

tridimensional (GALLETI, 2003).

Deve-se considerar que, apesar de tcnicas microscpicas terem levado a uma grande

quantidade de informaes sobre os processos de adeso microbiana e a formao de biofilme,

elas apresentam alguns problemas que devem ser considerados. Por exemplo, os

exopolissacardeos, que geralmente envolvem as comunidades microbianas, podem secar,

aparecendo cordes finos que podem ser interpretados como estruturas fibrosas que prendem os

microrganismos a si mesmos (ANDRADE, 2008).

Microscopia eletrnica de varredura tem sido utilizada para mostrar que bactrias

patognicas e deteriorantes em alimentos aderem igualmente sobre ao inoxidvel, alumnio,

vidro, borracha e teflon, superfcies encontradas em ambientes processadores de alimentos

(MAFU et al., 1990; BLACKMAN; FRANK, 1996).

3. MATERIAIS E MTODOS

O experimento foi realizado no Laboratrio de Higiene e Laticnios, do Departamento de

Agroindstria, Alimentos e Nutrio da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

(ESALQ-USP), Piracicaba-SP. Todas as etapas do experimento e anlises microbiolgicas foram

conduzidas em Cabine de Segurana Biolgica (PACHANE), Classe II tipo A1 com 70% de

recirculao e 30% de renovao de ar servido atravs de um filtro HEPA para o ambiente. Todos

os ensaios foram desenvolvidos em triplicata, utilizando-se amostras em triplicata. O estudo

consistiu de 3 fases:

a) Avaliao da capacidade de L. monocytogenes em formar biofilme em diferentes

condies de temperaturas, tempo, substratos e superfcies, encontradas em laticnios;

b) Capacidade de L. monocytogenes em formar biofilmes sobre ao inoxidvel em co-

cultura com Lactobacillus plantarum;

c) Estudo da eficincia do processo simulado CIP de um pasteurizador de leite na

remoo de biofilmes de L. monocytogenes formados sobre ao inoxidvel na

presena de resduo de Leite UHT integral e desnatado;

3.1. Ensaio preliminar para a determinao do tempo ideal de adeso de L. monocytogenes

3.1.1 Obteno da cepa de Listeria monocytogenes e preparo da suspenso

A cepa de L. monocytogenes utilizada no experimento foi obtida da coleo de culturas do

Laboratrio de Higiene e Laticnios, do Departamento de Agroindstria, Alimentos e Nutrio da

ESALQ-USP. Foram preparadas culturas estoques do microrganismo, as quais foram mantidas

sob refrigerao a 4C em tubos inclinados com gar Triptona Soja (TSA) + 0,6% Extrato de

Levedura (YE) e cobertas de vaselina estril, at o momento de uso. Para o uso nos experimentos,

a cultura foi reativada com duas transferncias sucessivas, sendo a primeira para tubos contendo

Caldo Triptona Soja (TSB) + 0,6% de YE, com incubao a 35C/24 horas e a segunda

transferncia para tubos inclinados contendo TSA+0,6% de YE, tambm com incubao a

35C/24 horas com o uso de alas microbiolgicas descartveis calibradas (10L). Durante estas

etapas foram realizados teste de colorao de Gram e teste de catalase para controle das culturas.

Para a preparao da suspenso bacteriana, o inculo foi suspenso em soluo salina

0,85%, agitado em vrtex (Phoenix Modelo AP56) e a turbidez obtida foi comparada e ajustada a

um tubo de Padro McFarland 0,5. Para a comparao da turbidez foi utilizado um carto de

fundo branco e linhas pretas, em um ambiente de luz intensa (SILVA et al., 2007; ROSSI, 2008;

SANTOS, 2009). Desta forma foi obtida uma suspenso bacteriana com cerca de 108 UFC de L.

monocytogenes por mL. Para aferir a contagem real das clulas em suspenso, foi realizado o a

contagem por plaqueamento em profundidade em TSA+0,6% de YE, com incubao a 35C/48

horas (DOWNES; ITO, 2001).

3.1.2. Preparo da Soluo Padro McFarland 0,5

Foi preparada uma Soluo de Sulfato de Brio (BaSO4), equivalente a um Padro

McFarland 0,5. Atravs do uso de um espectrofotmetro (SCHIMADZU UV mini 1240) foi

medida a absorbncia da soluo, com comprimento de onda ajustado a 625nm; a leitura deveria

estar no intervalo de 0,08 a 0,10. Em seguida, foram transferidos cerca de 5 mL para tubos com

rosca, protegidos da luz com auxlio de papel alumnio e armazenados em local escuro. Antes do

uso, os tubos foram agitados vigorosamente em vrtex (Phoenix Modelo AP56) at obteno de

uma soluo trbida uniforme (NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY

STANDARDS/NCCLS, 2003; ROSSI, 2008; SANTOS, 2009).

3.1.3. Preparo dos cupons de ao inoxidvel

No estudo preliminar o modelo escolhido foi a formao de biofilmes sobre ao

inoxidvel tipo 304, com dimenses de 5,0 x 2,0 cm e com polimento sanitrio. A superfcie

amostrada para a anlise da formao de biofilme foi aquela que apresentava polimento sanitrio.

Na extremidade de cada cupom foram feitos um orifcio para a passagem de um anzol

unido a um arame, ambos sendo de ao inoxidvel, os quais foram pendurados em uma lingueta

de ao inoxidvel unida em forma de cruz, que sustentava os cupons imersos no bquer com o

lquido a ser testado.

Os materiais utilizados (cupons, lingueta, arames e anzis) foram previamente

higienizados da seguinte maneira: imerso em soluo de hidrxido de sdio a 1% durante 30

minutos; enxgue em gua destilada; imerso em lcool 70%; enxgue em gua destilada. A

secagem foi realizada em estufa a 35C e cada cupom e cada conjunto arame e anzol,

esterilizados em embalagem de papel individual, a 121 C por 15 minutos em autoclave (ROSSI,

2008; RIBEIRO-FURTINI, 2005; SANTOS, 2009).

3.1.4. Condicionamento dos cupons de ao inoxidvel

Com o objetivo de obter uma superfcie coberta por um filme de condicionamento

semelhante ao encontrado no ambiente industrial, cupons de ao inoxidvel foram imersos

durante uma hora em bqueres contendo 1.800mL de leite UHT integral (3% de gordura),

1.800mL de leite UHT desnatado (0,5% de gordura) e 1.800mL de creme de leite UHT (20% de

gordura), mantidos a 35C sob agitao constante em Cabine de Segurana Biolgica

(PACHANE). O leite integral, desnatado e creme de leite foram incubados a 35/24 horas para

verificar a esterilidade comercial.

Para a agitao e manuteno da temperatura dos leites foi utilizado agitador magntico

(VEP CIENTIFICA) dotado de aquecimento, enquanto que para o creme de leite, por ser mais

denso, utilizou-se o aparelho Turrax, com o auxlio de um agitador magntico com aquecimento

(VEP CIENTIFICA).

Em seguida, os cupons foram acondicionados em placas de Petri estreis forradas com

papel filtro, levados estufa para secagem a 35C por 24 horas, com a superfcie de polimento

sanitrio voltadas para cima.

3.1.5. Determinao do melhor tempo de adeso do biofilme de Listeria monocytogenes Esse ensaio preliminar foi feito com cupons de ao inoxidvel e o inculo obtido

conforme o descrito em 3.1.1. Foram testados diferentes substratos na formao de biofilmes:

leite UHT integral e desnatado assim como creme de leite UHT. Nove cupons condicionados com

cada substrato descrito no item 3.1.4. foram imersos em 3 bqueres distintos, cada um contendo

1.800 mL do substrato em questo. Em cada bquer foi adicionado 10 mL do inculo padro para

$

a realizao da adeso microbiana. O processo de adeso ocorreu por 6, 10 e 12 horas a 35C, em

Cabine de Segurana Biolgica (PACHANE), com trs cupons sendo retirados de cada bquer

para anlise nos tempos de 6, 10 e 12 horas de adeso, incubados em estufa a 35C por 18 horas

em placas de Petri estreis forradas com papel filtro e realizada a contagem das clulas

bacterianas.

3.1.6. Contagem de clulas de L. monocytogenes aderidas aos cupons

Para a contagem de clulas aderidas aos cupons, aps o tempo de adeso e incubao por

18h/35C, os cupons foram lavados com Tampo Fosfato pH 7,2 (PB) para a remoo de clulas

no aderidas, a superfcie foi amostrada por suabes umedecidos com gua Salina Peptonada

Tween 80 (H2Osp-TWEEN). Os suabes foram transferidos para tubos de ensaio contendo 10 mL

do mesmo diluente e o contedo homogeneizado em vrtex (Phoenix Modelo AP56) durante 1

minuto. Destas suspenses contendo os suabes (100), foram retiradas alquotas para preparo das

diluies seriadas (10-1 a 10-8) em tubos contendo 9 mL de gua Salina Peptonada (H2Osp). Para

avaliar a contagem de L. monocytogenes dos cupons, foi empregada a tcnica de plaqueamento

em profundidade em gar TSA+0,6% YE, em triplicata, sendo as placas foram incubadas

invertidas a 35C/48 horas (DOWNES; ITO, 2001; RIBEIRO-FURTINI, 2005; ROSSI, 2008;

SANTOS, 2009).

Foi determinado o nmero de UFC/cm atravs da seguinte frmula (1):

UUFC/cm2= UFC/mL da suspenso x

rea amostrada

Volume de diluente da coleta

24

Fonte: SILVA et al., 2007.

Aps a realizao deste teste preliminar, determinou-se que o tempo de adeso para todos

os substratos e superfcies utilizadas seria de 10 horas.

'

3.2. Avaliao da influncia do tempo, temperatura, substratos e superfcies na formao de biofilmes de L. monocytogenes Uma vez estabelecidos os parmetros de tempo ideal sobre a superfcie de ao inoxidvel,

outras variveis foram estudadas. Para este experimento foram utilizadas como superfcies de

contato o ao inoxidvel 304, borracha e silicone. Os cupons de borracha e silicone foram

confeccionados a partir de teteiras (GEA Farm Technologies) desses materiais, possuindo as

mesmas dimenses dos cupons de ao inoxidvel (5,0 x 2,0 cm).

Os cupons passaram pelo mesmo tratamento de higienizao prvio descrito no item

3.1.3.

Os substratos estudados foram leite integral UHT, leite desnatado UHT e creme de leite

UHT.

O preparo do inculo e contaminao com L. monocytogenes foi feito conforme item

3.1.1, apenas que nesse caso os bqueres foram mantidos a 5C e 35C para o estudo da adeso

em diferentes temperaturas. Os conjuntos permaneceram por 10 horas sob agitao constante para

que ocorresse o processo de adeso bacteriana, conforme previamente determinado em 3.2

3.2.1. Condicionamento das superfcies dos cupons de borracha e silicone e ao inoxidvel O condicionamento das superfcies dos cupons de ao inoxidvel, borracha e silicone com

leite UHT integral, desnatado e creme de leite foi realizado da mesma maneira descrita no item

3.1.4.

Aps o processo de condicionamento, os cupons foram acondicionados em placas de Petri

estreis forradas com papel filtro, levados estufa para secagem a 35C por 24 horas, com a

superfcie de polimento sanitrio (ao) ou superfcies de contato com o leite durante a ordenha

(borracha e silicone), voltadas para cima; conforme a Figura 1.

;

Figura 1 - Processo de condicionamento dos cupons de ao inoxidvel, borracha e silicone (a); Cupom de

silicone (b); Cupom de borracha (c); Cupom de ao inoxidvel (d) 3.2.2. Avaliao da temperatura e do tempo na maturao de biofilmes de L. monocytogenes Foram avaliadas as temperaturas de 5 e 35 C na maturao de biofilmes, contemplando

variaes encontradas em laticnios. Os cupons obtidos no item 3.2.1., foram incubados por 0, 18

e 114 horas a 5C e 35C, em placas de Petri estreis forradas com papel de filtro, com a

finalidade de verificar a influncia dessas temperaturas na maturao do biofilme. A contagem de

clulas de L. monocytogenes foi feita conforme 3.1.6.

3.2.3. Avaliao da superfcie de ao inoxidvel, silicone e borracha pela Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) O preparo dos cupons foi conforme o descrito no item 3.1.3. para as superfcies de ao

inoxidvel, borracha e silicone. Foram realizadas anlises para a avaliao da interao

microbiana na matriz do biofilme.

a) b)

c) d)

Sendo assim, o condicionamento e o processo de adeso se deram em meio TSB-YE a

35C/10 horas e a 5C/10 horas, e as anlises realizadas nos tempos de 18h, 42h, 66h, 90h e 114

horas (SANTOS, 2009).

Os cupons em processo de adeso e, aps os tratamentos foram fixados em soluo

Karnovsky modificada, por uma semana, sob refrigerao; submetidos a lavagem com trs

passagens de 10 minutos em tampo cacodilato 0,05M e desidratao com acetona em

concentraes crescentes (25%, 50%, 75%, 90%, 100%) permanecendo 10 minutos em cada e, na

ltima concentrao, por trs vezes. Para retirar a acetona foi feita a secagem ao ponto crtico

com CO2, depois, os cupons foram montados em stub (suportes) e identificados antes de serem

colocados no metalizador para o banho de ouro. Aps este procedimento as amostras estavam

prontas para serem levadas ao microscpio eletrnico de varredura (RIBEIRO-FURTINI, 2005;

SANTOS, 2009).

3.3. Avaliao da formao de biofilme de L. monocytogenes em co-cultura com Lactobacillus plantarum

3.3.1 Estudo do comportamento das clulas em leite integral UHT

Este estudo foi conduzido com a finalidade de avaliar o comportamento de clulas

planctnicas de L. monocytogenes na presena do competidor Lactobacillus plantarum, cepa

produtora de bacteriocina.

A cepa de Lactobacillus plantarum foi fornecida pelo Instituto de Tecnologia de

Alimentos de Campinas (ITAL/Tecnolat, ATCC 8014). O preparo da cultura desse

microrganismo seguiu o mesmo procedimento descrito no item 3.1.1., porm foi utilizado o gar

e Caldo Man, Rogosa e Sharpe (MRS) ao invs do TSA+0,6% YE.

Em um bquer contendo 1.800mL de leite UHT integral foram inoculados 10 mL da

suspenso padro de L. monocytogenes e 10 mL de Lactobacillus plantarum, conforme descrito

em 3.1.1. O conjunto experimental permaneceu sob agitao pelo perodo de 10 horas a 35C.

Curvas de crescimento de culturas puras de cada microrganismo foram feitas em paralelo, nas

mesmas condies de tempo e temperatura descritas acima, para dar o referencial de crescimento.

Foram coletados 1 mL de leite de cada bquer no tempo inicial (0 horas) e final (10 horas)

e feitas as diluies decimais em gua salina peptonada para a contagem da populao

bacteriana. Para tanto foi realizada a tcnica de inoculao em profundidade em gar TSA+YE

para L. monocytogenes e gar MRSA com sobrecamada para Lactobacillus plantarum, quando

em culturas puras. No caso de culturas mistas a contagem de L. monocytogenes foi feita em

superfcie de Listeria Selective gar (OXFORD). As placas foram incubadas a 35C/48 horas

(DOWNES; ITO, 2001).

Como a produo de cido no leite caracterstica comum de bactrias lticas como o L.

plantarum, nesses ensaios foi acompanhado o desenvolvimento e evoluo da acidez no leite por

titulao com NaOH 0,1N (PREGNOLATO, 1985).

3.3.2. Formao de biofilmes por L. monocytogenes em co-cultura com Lactobacillus plantarum Esse estudo foi conduzido somente sobre superfcie de ao inoxidvel e na presena de

leite integral UHT. As culturas e o condicionamento dos cupons foram realizados como descrito

nos itens 3.1.1 e 3.1.4.. Seguiu-se o processo de adeso onde os cupons foram imersos nos

bqueres preparados conforme o item acima (3.3.1.), permanecendo sob agitao constante a

35C por 10 horas. Em seguida, os cupons foram incubados em estufa a 35C e realizadas

anlises no tempo de 0 e 18 horas de formao do biofilme.

A estimativa da populao de L. monocytogenes nos cupons foi feita atravs da tcnica de

plaqueamento em superfcie em meio Oxford, onde as placas foram incubadas em estufa regulada

a 35C/48h, conforme o item 3.3.1.

Tambm de acordo com o mesmo item (3.3.1.), para a contagem de L. plantarum,

utilizou-se a tcnica de inoculao em profundidade, em gar MRS. Para garantir condies

microaerfilas, as placas receberam uma sobrecamada do mesmo meio e foram incubadas

invertidas em estufa a 35C/ 48h.

A contagem das colnias foi expressa em UFC/cm (DOWNES; ITO, 2001).

3.4. Avaliao da formao de biofilmes de L monocytogenes sobre ao inoxidvel na presena de resduos de leite UHT integral e desnatado, e sua resistncia frente ao processo de higienizao CIP (Clean-in-Place)

Neste ensaio foi avaliada a eficincia do processo CIP sobre biofilmes de L.

monocytogenes na superfcie de ao inoxidvel. A formao dos biofilmes ocorreu conforme o

descrito nos itens 3.1.3. e 3.2.1.. O processo foi aplicado sobre biofilmes formados a 5C e 35C,

conforme 3.2.2.

3.4.1. Higienizao dos cupons O processo de higienizao dos cupons simulou o processo CIP realizado na limpeza de

pasteurizador de leite. Todo o processo foi realizado inteiramente na Cabine de Segurana

Biolgica (PACHANE). Os detergentes foram os utilizados normalmente em laticnios (NaOH e

cido fosfrico) e o sanificante empregado foi um composto a base de quaternrio de amnio,

com 50% de substncia ativa (QUATERCAP DM-50 - cloreto de alquil amidopropil dimetil

benzil amnio - BIOSAN).

Foram preparados sete bqueres contendo as solues de detergentes, sanificantes e gua

de enxge. Os cupons foram divididos em grupos: (a) Controle, (b) Limpeza e (c)

Limpeza+Sanificao. Com o auxlio de uma grade de ao inoxidvel, os cupons (b) e (c) foram

transferidos de bquer para bquer, respeitando os tempos e temperaturas de um processo

simulado CIP. Aps a passagem pelo bquer n5 (gua de enxge), os cupons do grupo (b)

foram retirados para a anlise e o grupo (c) continuou no processo, passando pela etapa de

sanificao. Todas as solues permaneceram sob agitao durante a realizao do experimento e

aquelas que necessitavam de controle de temperatura foram monitoradas com auxlio de

termmetros. Foi utilizada gua destilada estril para o preparo de todas as solues e gua de

enxge, as quais foram preparadas com o auxlio de vidraria volumtrica (ROSSI, 2008;

SANTOS, 2009).

O esquema do processo simulado CIP foi o seguinte:

Bquer n1: gua destilada a 30C. A grade permaneceu acoplada a este bquer por um

minuto para realizao da pr-lavagem, sob agitao.

Bquer n2: soluo de detergente alcalino (ALCA CF SANI QUMICA) base de

agente alcalinizante com concentrao determinada pelo fabricante a 70C. A grade permaneceu

acoplada a este bquer por sete minutos, sob agitao.

Bquer n3: gua destilada a temperatura ambiente para enxgue. A grade permaneceu

acoplada a este bquer por um minuto, sob agitao.

Bquer n4: soluo de detergente cido (ACID CF SANI QUMICA) base de

cido inorgnico com concentrao determinada pelo fabricante temperatura ambiente. A grade

permaneceu acoplada a este bquer por trs minutos, sob agitao.

Bquer n5: gua destilada a temperatura ambiente para enxgue. A grade permaneceu

acoplada a este bquer por um minuto, sob agitao.

Bquer n6: soluo de sanificante quaternrio de amnio (QUATERCAP DM-50 -

cloreto de alquil amidopropil dimetil benzil amnio - BIOSAN), com concentrao de 0,1%

(477g/ml), por 10 minutos temperatura ambiente.

Bquer n7: gua destilada a temperatura ambiente para enxgue. A grade permaneceu

acoplada a este bquer por um minuto, sob agitao.

Para anlise dos cupons foram seguidos os mesmos procedimentos descritos no item

3.1.6., utilizando-se do gar TSA+0,6% de YE na tcnica do plaqueamento em profundidade.

3.4.2. Contagem de clulas de L. monocytogenes nos cupons de ao inoxidvel aps o

processo de higienizao

Os cupons submetidos ao processo de limpeza + sanificao tiveram sua superfcie

amostrada por suabes, porm, os suabes foram transferidos para tubos de ensaio contendo 10mL

de soluo neutralizante, composta por 2% de lecitina, 2% de Tween 80 e 0,5% de tiossulfato de

sdio, dissolvidos em gua destilada (OKAZAKI, 2003; ROSSI, 2008). A contagem de clulas

viveis seguiu o procedimento descrito no item 3.1.6.

3.4.3. Avaliao da eficincia do processo CIP na remoo de biofilmes de L. monocytogenes atravs de Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) O preparo dos cupons de ao inoxidvel ocorreu como descrito no item 3.1.3.

Foram avaliados os cupons de ao inoxidvel controle, aqueles que passaram somente

pelo processo de limpeza por detergentes e aqueles que passaram por todo o processo CIP,

contendo resduos de leite UHT integral e desnatado.

A etapa de fixao do material seguiu a mesma do item 3.2.5.

3.5. Anlise estatstica

A anlise estatstica, mdia aritmtica e o desvio padro, foi determinada atravs de uma

anlise de varincia (ANOVA) com o SAS software (2002-2003). Diferenas no nmero de

bactrias em cada tratamento de cada um dos experimentos foram analisadas estatisticamente

pelo Teste t-LSD com significncia expressa ao nvel de 95% de confiana ou maior (p < 0,05).

;

$

diferena significativa (p

'

;

;

4.2.2. Adeso de L. monocytogenes a 5 e 35 C nas superfcies de ao inoxidvel, borracha e silicone observadas pela MEV Os biofilmes formados por L. monocytogenes em diferentes superfcies foram observados

por Microscopia Eletrnica de Varredura. Com o intuito de se obter uma melhor visualizao das

clulas, o processo de adeso se deu em meio TSB-YE, por 1h, 5h e 10 horas de adeso sob

agitao constante.

No foram observadas clulas em ao inoxidvel, borracha e silicone em 1h e 5 horas de

adeso, tanto a 5C quanto a 35C e aps 10 horas a 5C.

Como pode ser observado na Figura 4, aps 10 horas de adeso, so visveis clulas nas

superfcies analisadas. Embora na borracha o nmero de clulas observadas seja maior, deve-se

lembrar que as anlises MEV so qualitativas.

Figura 4 - Cupom de ao inoxidvel (a), silicone (b) e borracha (c) aps 10 horas de adeso da L. monocytogenes a 35C. Magnitude: 5.000x; 2 cm=2m

Segundo Hood e Zottola (1995), o processo de adeso bacteriana em superfcies ocorre

durante a limitao de nutrientes, por se tratar de uma tcnica de sobrevivncia.

Wong (1998) afirma que a aderncia bacteriana na presena de leite ou em superfcies

pr-condicionadaspossa ser reduzida, resduos de leite podem abrigar bactrias em reas que no

so adequadamente limpas ou de difcil limpeza, como juntas e fendas.

O trabalho realizado por Mai e Conner (2007), apresentou que aps 3 horas de adeso em

meio BHI, foi possvel notar clulas aderidas a superfcie de ao inoxidvel, porem sem a

presena de polmeros extracelulares nas temperaturas de 4C, 20C, 30C, 37C e 42C.

b)

c)

4

Gianotti et al. (2008) verificaram que a adeso de L. monocytogenes acontecia no

intervalo entre 2 h e 20 horas, dependendo da natureza das cepas e composio dos meios de

cultura utilizados.

J em um estudo realizado por Folsom et al. (2006), o tempo de adeso de 4 horas foi

suficiente para as cepas de L. monocytogenes testadas. De acordo com Beresford et al. (2001), L.

monocytogenes capaz de aderir a diferentes superfcies em apenas 2 horas.

Segundo Flach (2006), biofilmes formados por bactrias Gram-positivas e negativas

presentes no leite so capazes de aderir em superfcies em apenas 2 horas a 10C e 25C.

A cepa de L. monocytogenes utilizada no presente estudo no apresentou adeso em 1h e

5 horas em meio TSB-YE, no estando em concordncia com os autores acima citados, mas a

adeso ocorreu no perodo de 10 horas com esse substrato nos meios estudados.

Oulahal et al. (2008) mostraram que L. innocua e S. aureus aderiram em ao inoxidvel e

polipropileno aps 5 horas de adeso em contato com resduos lcteos.

4.2.3. Formao de biofilmes de Listeria monocytogenes em superfcies de ao inoxidvel, borracha e silicone, a 5 e 35 C, na presena de diferentes resduos lcteos

4.2.3.1. Estudo 1: substrato leite integral na adeso e formao de biofilmes de L. monocytogenes em diferentes superfcies. Tabela 1- Formao de biofilmes de L. monocytogenes em diferentes temperaturas e superfcies, na presena

de resduos de leite UHT integral 1Contagem de L. monocytogenes (log UFC/cm) 0 Horas 18 Horas 114 Horas Ao inoxidvel 35C 4,39A 5,32A 4,11A Borracha 35C 5,15A 5,60A 4,12A Silicone 35C 4,80A 5,28A 4,10A Ao inoxidvel 5C 2,57Ab 3,67Ab 4,71Ab Borracha 5C 2,20Ab 4,11Ab 4,30Ab Silicone 5C 3,16Ab 3,11A b 4,18Ab

(1) Mdias seguidas pela mesma letra na coluna no diferem entre si, pelo teste t (LSD), a 5% de significncia.

De acordo com a Tabela 1, nas trs superfcies estudadas, as maiores taxas de adeso

inicial foram sempre obtidas na temperatura de 35C. Em relao s superfcies, a borracha teve

uma maior taxa de adeso a 35C e o silicone a 5C. Contudo, as diferenas de adeso entre

temperaturas iguais no foram significativas (p< 0,05), no havendo influncia entre superfcies,

somente entre temperaturas nas taxas de adeso. Porm, do ponto de vista microbiolgico, o

silicone a 5C apresentou uma diferena importante em relao s demais superfcies, pois

apresentou uma contagem de clulas aderidas sensivelmente maior do que as outras superfcies.

A 35C, a evoluo dos biofilmes nas trs superfcies foi semelhante: um aumento da

contagem nas primeiras 18h, seguida de um declnio aps 114h. Aps 18 horas, a contagem

obtida nas trs superfcies estudadas foi de cerca de 5 log UFC/cm e em 114 horas houve uma

reduo na populao de 1 log UFC/cm, no apresentando diferena significativa, conforme

mostra a Tabela 1.

Na temperatura de 5C, ao contrrio do ocorrido a 35C, a populao dos biofilmes

aumentou continuamente aps as 18 e 114h, em todas as superfcies estudadas, tendo uma

diferena significativa (p

entre as mesmas temperaturas, porm do ponto de vista microbiolgico, houve diferena na taxa

de adeso a 35C na superfcie de ao inoxidvel e a 5C em borracha, quando comparados com

as demais superfcies.

Em uma mesma temperatura houve influncia significativa entre as superfcies estudadas

(p

4.2.3.3. Estudo 3: substrato creme de leite Tabela 3- Formao de biofilmes de L. monocytogenes em diferentes temperaturas e superfcies, na presena

de resduos de creme de leite UHT 1Contagem de L. monocytogenes (log UFC/cm) 0 Horas 18 Horas 114 Horas Ao inoxidvel 35C 5,16A 7,20A 6,31A Borracha 35C 5,70A 8,21A 7,17A Silicone 35C 5,85A 8,21A 6,14A Ao inoxidvel 5C 3,75Ab 5,76Ab 5,77Ab Borracha 5C 3,81Ab 5,03Ab 5,78Ab Silicone 5C 3,74Ab 5,21Ab 5,55Ab

(1) Mdias seguidas pela mesma letra na coluna no diferem entre si, pelo teste t (LSD), a 5% de significncia.

Os resultados do ensaio com creme de leite so apresentados na Tabela 3. Novamente a

35C ocorreram as maiores taxas de adeso em todas as superfcies estudadas, assim como nos

experimentos anteriores com leite integral e desnatado. Sobre o silicone houve uma maior taxa de

adeso a 35C e borracha a 5C. Houve diferena significativa na adeso (p

biofilmes por L. monocytogenes, confirmando que temperaturas de refrigerao so de extrema

importncia na formao de biofilmes por este microrganismo.

Avaliando os mesmos parmetros de temperatura, tempos de 18h e 114 horas e tendo

como substrato leite integral, Santos (2009) verificou que a populao de L. monocytogenes na

superfcie de ao inoxidvel a 35C passou de 4 log UFC/cm para 3 log UFC/cm. Na

temperatura de 5C, houve um aumento da populao de 3 log UFC/cm nos biofilmes formados,

concordando com os resultados do presente estudo.

DiBonaventura et al. (2008), mostraram que a 4C L. monocytogenes forma um biofilme

com maior populao sobre vidro, seguido daquele formado por ao inoxidvel e poliestireno, o

mesmo ocorrendo para 12C e 22C. Porm, a 37C, o biofilme formado em vidro e ao

inoxidvel apresentou a mesma contagem, quando comparado com poliestireno. Ao contrrio

deste, no presente estudo no houve diferena significativa entre materiais.

Com o intuito de avaliar as temperaturas de 4C e 10C, Somers e Wong (2004)

verificaram que a contagem de clulas de L. monocytogenes na superfcie de ao inoxidvel 304,

borracha e silicone, apresentaram uma reduo com o aumento da temperatura. Sendo que a

superfcie de silicone apresentou maior contagem microbiana com o aumento da temperatura.

Resultados obtidos por Poimenidou et al. (2009), revelaram que biofilmes podem ser

formados por L. monocytogenes em ao inoxidvel a 5C, na presena de resduos de leite e

creme de leite (3 log ufc/cm). A contagem obtida no biofilme formado a 20C com resduos de

creme de leite e leite foram de 5 log UFC/cm e 4 log UFC/cm, respectivamente, revelando que a

temperatura de 20C favoreceu a formao de biofilmes quando comparado com 5C, ao

contrrio do que pode ser observado neste estudo.

Moltz e Martin (2005) verificaram que a formao de biofilmes por L. monocytogenes,

sobre a superfcie de PVC a 32C, foi maior em 48 horas do que a 24 horas em meio TSB-YE ou

caldo Welshimer modificado (MWB). O mesmo estudo revelou que a 20C e 37C ocorreu um

aumento na populao do biofilme sobre a superfcie de ao inoxidvel com o decorrer do tempo,

num perodo de 96 horas. Nesse caso, ao contrrio dos resultados do presente estudo,

temperaturas elevadas exerceram um fator positivo sobre a populao dos biofilmes.

Segundo Mai e Conner (2007), o aumento da populao de L. monocytogenes em ao

inoxidvel em meio BHI dependente do aumento da temperatura, ao contrrio dos biofilmes

formados em meio com pouca concentrao de nutrientes, com 90% de gua destilada

esterilizada e 10% de BHI.

Folsom et al. (2006) verificaram que em diferentes concentraes de nutrientes (TSB e

TSB diludo em gua), L. monocytogenes foi capaz de formar biofilmes em ao inoxidvel a

32C. Da mesma maneira, no presente trabalho, as diferentes concentraes de nutrientes

encontradas nos resduos de leite integral, desnatado e creme de leite acabaram proporcionando

diferentes taxas de formao de biofilme.

Blackman e Frank (1996) observaram que L. monocytogenes sobrevive por at 7 dias em

ao inoxidvel, teflon, nylon e poliester a 21C em TSB , e a 10C nas mesmas superfcies a

sobrevivncia foi menor, ocorrendo uma reduo da populao no mesmo tempo de estudo. Tais

resultados no esto de acordo com o encontrado no presente estudo, onde a populao de L.

monocytogenes maior em temperaturas baixas como 5C do que a 35C, com o decorrer do

tempo.

Segundo Beresford et al. (2001), cepas de L. monocytogenes podem aderir e formar

biofilme em diferentes superfcies, como ao inoxidvel, silicone, alumnio, polipropileno,

borracha, poliuretano e policarbonato. Tais dados so confirmados no presente trabalho, uma vez

que a cepa de L. monocytogenes utilizada foi capaz de formar biofilmes nas superfcies de ao

inoxidvel, borracha e silicone.

De acordo com Chavant et al. (2003), a taxa adeso de L. monocytogenes em ao

inoxidvel e plstico diminuiu com o aumento da temperatura. Tal resultado discorda do presente

estudo, onde a adeso de L. monocytogenes foi maior em altas temperaturas (35C), reduzindo

com a diminuio da temperatura (5C).

Flach (2006) avaliou a formao de biofilmes na presena de leite integral na superfcie

de pano, polipropileno, vidro e ao inoxidvel a 10C e 25C, mostrando que tais temperaturas

so favorveis para a formao de biofilmes.

Atravs dos dados obtidos no presente trabalho possvel afirmar que L. monocytogenes

tem maior habilidade em sobreviver e formar biofilmes a 5C do que a 35C, por ser uma bactria

psicrotrfica, e que o teor de gordura influenciou a adeso e sobrevivncia de L. monocytogenes

em biofilmes, uma vez que sobre resduos de creme de leite houve uma maior evoluo da

populao do patgeno.

$

4.2.3.4. Anlise do envelhecimento dos biofilmes sobre diferentes superfcies por MEV Com a finalidade de verificar a estrutura celular e a formao de exopolissacardeos nos

biofilmes formados por L. monocytogenes, nas superfcies de ao inoxidvel, borracha e silicone,

nas temperaturas de 35C e 5C foi utilizada a Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV).

Essa parte do experimento foi conduzida utilizando-se do meio de cultura TSB-YE para a

formao dos biofilmes, uma vez que os resduos lcteos impedem a visualizao das estruturas

extracelulares. As anlises foram feitas nos seguintes tempos de maturao: 18h, 42h, 66h, 90h e

114horas.

Figura 5 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 18 horas de formao a 5C sobre a superfcie de ao inoxidvel, magnitude: 2.000x; 2cm=5m

'

Figura 6 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 18 horas de formao a 35C sobre a superfcie de ao inoxidvel, magnitude: 2.000x; 2cm=5m

Figura 7 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 18 horas de formao a 5C sobre a superfcie de silicone

com magnitude: 3.000x; 3cm=5m

;

Figura 8 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 18 horas de formao a 35C sobre a superfcie de silicone,

com magnitude: 3.000x; 3cm=5m

Figura 9 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 18 horas de formao a 5C sobre a superfcie de borracha,

com magnitude: 3.000x; 3cm=5m

Figura 10 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 18 horas de formao a 35C sobre a superfcie de borracha, com magnitude: 3.000x; 3cm=5m

As imagens da Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) revelam que aps 18 horas de

formao de biofilmes, no foi possvel observar clulas de L. monocytogenes sobre a superfcie

de ao inoxidvel a 5C (Figura 5), apenas a presena de estruturas com aspecto que lembram

algodo, provavelmente sendo substncias polimricas extracelulares (EPS). J nos cupons de

silicone e borracha (Figura 7 e 9), ao contrrio, foram observadas clulas aderidas, porm sem a

presena de EPS. Em todas as superfcies analisadas, a 35C, no mesmo tempo de formao, 18h,

(Figuras 6, 8, 10), so visualizadas clulas de L. monocytogenes, com maior quantidade em ao

inoxidvel.

Segundo Andrade (2008), os exopolissacardeos, que geralmente envolvem as

comunidades microbianas, podem secar durante o preparo da amostra, aparecendo cordes finos

que podem ser interpretados como estruturas fibrosas que prendem os microrganismos a si

mesmos.

Santos (2009) tambm verificou a presena de EPS nos biofilmes de 18 horas formados

por L. monocytogenes na superfcie de ao inoxidvel a 5C, enquanto que a 35C somente

clulas foram visualizadas nesta superfcie.

O estudo realizado por DiBonaventura et al. (2008) demonstrou que biofilmes formados

em 24 horas por L. monocytogenes sobre a superfcie de vidro, poliestireno e ao inoxidvel

apresentaram poucas clulas aderidas e EPS produzidos a 4C e a 12C. J a 22C e 37C, houve

um aumento na produo de EPS na superfcie de vidro, enquanto nas mesmas condies houve

um aumento de clulas aderidas sobre os cupons de ao inoxidvel e poliestireno.

Figura 11 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 42 horas de formao a 5C sobre a superfcie de ao inoxidvel, magnitude: 2.000x; 2 cm=5m

Figura 12 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 42 horas de formao a 35C sobre a superfcie de ao inoxidvel, magnitude: 2.000x; 2 cm=5m

Figura 13 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 42 horas de formao a 5C sobre a superfcie de silicone, com magnitude: 3.000x; 3cm=5m

Figura 14 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 42 horas de formao a 35C, sobre a superfcie de silicone, com magnitude: 3.000x; 3cm=5m

Figura 15 - Biofilmes de L. monocytogenes aps 42 horas de formao a 5C, sobre a superfcie de borracha, com magnitude: 3.000x; 3