EFEITO DO RAMNOLIPÍDEO SOBRE A HIDROFOBICIDADE DOS BIOFILMES DE

Listeria monocytogenes

S.S. Silva1, J. F. Ferreira

1, M. Nitschke

1

1-Departamento de Físico- Química- Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos- CEP:

13566-590- São Carlos- SP- Brasil, Telefone: +55 (16) 3373-9951 - Fax: +55 (16) 3373-9952- e-mail:

(sumariasousa@iqsc.usp.br; jakeline.ferreira@usp.br; nitschke@usp.br)

RESUMO – Listeria monocytogenes é um patógeno oportunista que forma biofilmes em superfícies

bióticas e abióticas. Os biofilmes representam uma fonte crônica de contaminação, pois as células

tornam-se mais protegidas e difícil remoção. O uso de ramnolipídeo, um biossurfatante produzido por

Pseudomonas aeruginosa pode ser uma estratégia eficiente para controle de biofilmes, pois apresenta

potencial antimicrobiano, anti-adesivo e dispersivo. Este estudo analisou o efeito do ramnolipídeo

sobre a hidrofobicidade de biofilmes de L. monocytogenes estabelecidos em superfície de poliestireno,

em diferentes condições de concentração de ramnolipídeo, temperatura e meio de cultivo. A

hidrofobicidade foi avaliada através da medida do ângulo de contato. Os resultados mostraram que os

biofilmes formados nos diferentes meios de cultura apresentaram característica hidrofílica, e após o

tratamento com ramnolipídeo tornam-se muito hidrofílicos, o que facilita a remoção. Estes resultados

demonstram que a investigação de agentes tensoativos de origem biológica é promissora quanto ao

controle e combate aos biofilmes.

ABSTRACT – Listeria monocytogenes is an opportunistic pathogen that form biofilms on biotic and

abiotic surfaces. Biofilms are a chronic source of contamination, as the cells become more difficult to

remove. The use of rhamnolipid, a biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa can be an

effective strategy to biofilm control once it has potential as antimicrobial, anti-adhesive and

dispersive agent. This study was to investigate the effect of rhamnolipid on the hydrophobicity of

biofilms of L. monocytogenes established in polystyrene surfaces, under different conditions of

rhamnolipid concentration, temperature and culture medium. The hydrophobicity was evaluated by

contact angle measurements. The results showed that biofilms formed in different culture medium

have hydrophilic character, and after treatment with rhamnolipid, biofilms become more hydrophilic,

which may facilitates their removal. These results demonstrate that the use of surface-active agents of

biological origin is promising to control and combating biofilms.

PALAVRAS-CHAVE: Listeria monocytogenes, biossurfatante, hidrofobicidade; poliestireno.

KEYWORDS: Listeria monocytogenes, biosurfactant; hydrophobicity; polystyrene.

1. INTRODUÇÃO

Biofilmes microbianos são comunidades dinâmicas e complexas formadas em superfícies e/ou

interfaces ar-líquido na forma de agregados multicelulares envoltos por uma camada polimérica

(Donlan, 2002; Bower e Daeschel, 1999). Este tipo de organização é extremamente vantajoso a todas

as espécies de microrganismos por fornecer proteção contra adversidades como: desidratação,

colonização por bacteriófagos e resistência a antimicrobianos e sanitizantes (Araújo et al. 2013; Hall-

Stoodle et al. 2004).

A formação de um biofilme permite um estilo de vida diferente do estado planctônico

(Flemming e Wingender, 2010). Existem vários fatores relacionados ao estabelecimento de biofilmes,

dentre eles os principais são: características físico-químicas da superfície e da célula, expressão de

proteínas denominadas adesinas, fatores de virulência dos microrganismos, como produção de cápsula

e fímbrias (Tortora et al. 2005; Donlan, 2002). No entanto, as interações precisas dos diferentes

componentes em nível molecular ainda não sejam bem definidas (Flemming e Wingender, 2010).

Listeria monocytogenes é um cocobacilo curto, Gram-positivo, possuem crescimento em faixa

de temperaturas 0°C (mínima), 25° a 30°C (ótima) e 45°C (máxima), não formador de endósporos

(Hoffmann, 2001). Um patógeno oportunista de origem alimentar, com características psicrotróficas

(crescimento < 7°C), anaeróbio facultativo que pode estar envolvido em vários surtos de doenças

transmitidas por alimentos. Os alimentos mais comumente envolvidos na contaminação por essa

bactéria são: as carnes prontas para o consumo, queijos frescos, laticínios não pasteurizados e/ou leite

pasteurizado inadequadamente (Madigan et al. 2010). Esse microrganismo é único pela sua capacidade

de crescer em temperatura de refrigeração, diferentes faixas de pH e de concentrações salinas. Dessa

forma, torna-se uma ameaça às indústrias de alimentos que produzem produtos com vida útil

prolongada e mantido a uma temperatura baixa (Pan et al., 2006). Além disso, suas células podem se

fixar sobre uma grande variedade de superfícies, como polipropileno, poliestireno, borracha, aço

inoxidável, plástico e vidro (Weiler et al. 2013).

Estudos evidenciam que a resistência apresentada por L. monocytogenes a agentes

antimicrobianos ou sanitizantes em ambientes de processamento de alimentos seja resultante da

capacidade de suas células em formar biofilmes. Essa forma de vida bacteriana demonstra ser muito

mais resistente ao stress e higienização que as suas células planctônicas (livres). Os biofilmes

apresentam resistência devido à formação de uma camada polimérica extracelular, e com isso,

promovem resistência a sanitizantes como o cloro, podendo persistir por anos no ambiente de

processamento de alimentos (Weiler et al. 2013; Srey et al. 2014).

Os ramnolipídeos (RLs) são glicolipídeos extracelulares produzidos principalmente por

Pseudomonas aeruginosa formados em sua maioria por uma ou duas unidades de L-ramnose ligadas a

um ou dois β-hidroxi ácidos graxos sendo classificados como mono-ramnolipídeo e di-ramnolipídeo

(Müller et al. 2012). Estes compostos representam uma das classes de biossurfatantes mais

importantes, pois apresentam propriedades que possibilitam inúmeras aplicações em diversas áreas da

indústria, incluindo emulsificação, detergência, formação de espuma, solubilização, biorremediação

entre outras (Reis et al. 2011). Além disso, podem ser utilizados no controle de fungos, algas, vírus e

bactérias além de apresentar atividade anti-adesiva e de dispersão de biofilmes (Irfan-Maqsood e

Seddiq-Shams, 2014). Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo analisar o efeito do

ramnolipídeo sobre a hidrofobicidade de biofilmes de Listeria monocytogenes estabelecidos em

superfície de poliestireno, em diferentes condições de concentração, temperatura e meio de cultivo.

2. MATERIAL E MÉTODOS

A cepa selecionada para este estudo foi Listeria monocytogenes ATCC 19112 relacionada com

contaminação alimentar. O biossurfatante utilizado foi o ramnolipídeo comercial com 99 % de pureza

produzido por P. aeruginosa. Este composto consiste na mistura de dois homólogos majoritários:

mono (R1) e di-ramnolipídeo (R2), cujo as fórmulas moleculares e massas molares são C26H48O9 (504

g mol-1

) e C32H58O13 (650 g mol-1

), respectivamente.

2.1 Formação e Tratamento dos Biofilmes com Ramnolipídeo

Os biofilmes foram formados em cupons de poliestireno, com dimensões de 2,4 x 7,6 cm que

foram mergulhados em suspensão bacteriana (109

UFC mL-1

) preparada em meios de cultivo (caldo

triptona de soja extrato de levedura TSYEB) e leite, em volume total de 40 mL. As amostras foram

mantidas em estufa bacteriológica de forma estática para o crescimento do biofilme a 37 °C por 48 h.

Após esse período os cupons foram lavados com água destilada estéril e transferidos para soluções de

ramnolipídeo ou água (controle) deixando-se em imersão por 2 h, em temperaturas de 37°C e 4°C,

(condições pré-determinadas em que houve maior remoção de biofilme). Decorrido esse tempo, os

cupons foram lavados novamente com água destilada, secos em temperatura ambiente e analisados

quanto a hidrofobicidade.

2.2 Avaliação da Hidrofobicidade

As medidas de ângulo de contato com a água foram realizadas com o objetivo de determinar a

característica hidrofílica/hidrofóbica das superfícies dos biofilmes. Para tanto, utilizou-se o

goniômetro CAM200 (KSV) operado pelo método da gota séssil, utilizando gotas de 3 µL. O ângulo

entre a gota e a superfície foi determinado a partir da média de no mínimo 6 repetições.

2.3 Microscopia Eletrônica de Varredura

Para avaliar qualitativamente a arquitetura e a presença de matriz polimérica extracelular

(MPE) antes e após o tratamento com o ramnolipídeo, os biofilmes foram observados em microscópio

eletrônico de varredura. Assim, as amostras controles e tratamentos foram submetidas a desidratação

através de imersão em soluções de álcool etílico em concentrações crescentes (10%, 25%, 40%, 50%,

70%, 80% 90% e 95%) e secas por 24h, em temperatura ambiente. Após secagem, as amostras foram

metalizadas (banho de ouro) e levadas para a observação no microscópio eletrônico de varredura

(ZEISS LEO 440), com detector OXFORD (modelo 7060)

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A medida do ângulo de contato dos biofilmes em superfície de poliestireno foi realizada para

verificar se houve alteração da hidrofobicidade com e sem tratamento com o ramnolipídeo. As

medidas dos ângulos de contato em diferentes meios de cultivo, temperatura e concentração de RL

estão apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1- Medidas de ângulo de contato dos biofilmes de Listeria monocytogenes antes e após o tratamento com

o ramnolipídeo. Amostras Meio de

cultivo Temperatura de tratamento (°C)

Concentração de RL (%)

Ângulo de contato (°)*

Poliestireno - - - 83,51±2,94

Controle TSYEB 37 0** 7,67 ± 1,24 Tratamento TSYEB 37 0,5 3,79± 1,21

Controle Leite 4 0** 43,23± 7,97

Tratamento Leite 4 0,5 5,82± 2,62 *Média de no mínimo 6 gotas ± desvio padrão

**Os controles foram tratados com água destilada esterilizada

A superfície de poliestireno foi considerada hidrofóbica por apresentar um ângulo de contato

entre a água e a superfície maior que 65°. Segundo Vogler (1998), a medida utilizando-se a água é

considerada um método qualitativo sendo a superfície classificada como hidrofóbica aquela que

apresenta um ângulo de contato superior a 65º, enquanto valores inferiores a este, indica um perfil

hidrofílico da superfície.

A superfície do biofilme formado em meio de cultura TSYEB reduziu os ângulos de contato

do poliestireno (Tabela 1). A superfície passou a ser classificada como hidrofílica sendo que o

tratamento com RL aumentou o caráter hidrofílico do biofilme. Já os biofilmes formados em leite

desnatado reduziram a ângulo de contato de 83,5° para 43,2°, e o tratamento com RL também tornou o

biofilme muito hidrofílico.

A hidrofobicidade é uma propriedade importante e representa a molhabilidade, ou seja, a

capacidade de um líquido (água) manter contato com uma superfície. Se duas superfícies são

hidrofóbicas, torna-se mais fácil eliminar a camada de água porque as moléculas de superfícies têm

menos atração pelas moléculas de água e maior interação entre elas mesmas, entretanto se essas

superfícies são hidrofílicas ocorre o contrário (Teixeira et al. 2005). Portanto, superfícies hidrofílicas

desfavorecem o processo de adesão microbiana. De fato, Teixeira et al. (2005) confirmaram que a

adesão de isolados de P. aeruginosa foi favorável no aço inoxidável e borracha, que são considerados

hidrofóbicos e desfavorável em superfícies de vidro e polimetilacrilato, definidos como hidrofílicos.

A Figura 1 mostra o biofilme de L. monocytogenes formado em TSYEB (Figura 1A e B) e em

leite (Figura 1B e C) antes e após tratamento com 0,5% de ramnolipídeo à 37° e 4°C, respectivamente.

Após um período de incubação por 48 h observou-se a formação de um biofilme com grande produção

de polímero extracelular, na presença do substrato TSYEB e não em leite. Com a adição do

ramnolipídeo sobre o biofilme foi possível observar a redução da matriz polimérica e de grande parte

das bactérias aderidas, demonstrando sua eficiente ação. Esses resultados sugerem que a composição

dos meios de cultivos são fatores importantes para formação de biofilmes em superfícies de

poliestireno.

Figura 1- Eletromicrografias dos biofilmes de L. monocytogenes (ATCC 19112) em TSYEB (A) Controle, (B)

Tratado com 0,5% de RL à 37°C e em leite (C) Controle e (D) Tratado com 0,5% de RL à 4°C.

A B

C D

A formação de biofilme é um processo complexo regulado por diversos fatores, incluindo o

meio de crescimento e ainda pouco estudado em matriz alimentar (Marchand et al. 2012). O leite é um

meio bastante heterogêneo, compreende uma mistura de vários tipos de proteínas, gorduras, minerais e

outros. Neste caso, a adsorção de proteínas do leite na superfície de estudo, podem ter contribuído para

alterar a hidrofobicidade da superfície. Apesar de algumas controvérsias, a maioria dos estudos

indicam que leite ou seus componentes individuais, tais como caseína, β-lactoglobulina, α-

lactolbumina são capazes de adsorver em superfícies abióticas, reduzindo a eficiência de fixação de

uma variedade de patógenos, incluindo S. aureus, L. monocytogenes e S.marcescens (Barnes et al.

1999). Os resultados obtidos podem ser importantes subsídios para futuras investigações sobre as

interações físico-químicas entre ramnolipídeo e a camada de biofilme visando aplicação como agentes

sanitizantes em indústria de alimentos.

4. CONCLUSÕES Os resultados obtidos neste estudo mostraram que o estabelecimento de biofilmes de L.

monocytogenes em meio TSYEB e em leite torna a superfície do poliestireno hidrofílica, porém em

leite essa característica é menos pronunciada. No entanto, após o tratamento com ramnolipídeos ambas

as superfícies tornam-se muito hidrofílicas sugerindo que esta alteração pode favorecer a remoção

desses biofilmes.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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