DISSERTAÇÃO DE MESTRADO AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA ... · ALMEIDA, Andréa Farias – Avaliação Preliminar da Viabilidade de Produção in vitro de um Isolado Brasileiro de Baculovírus

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE – UFRN

CENTRO DE TECNOLOGIA – CT

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA - DEQ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA - PPGEQ

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA VIABILIDADE DE PRODUÇÃO IN VITRO DE UM ISOLADO

BRASILEIRO DE BACULOVÍRUS SPODOPTERA FRUGIPERDA MNPV

Andréa Farias de Almeida

Orientadora: Profª Drª Gorete Ribeiro de Macedo Co-Orientadora: Drª Márcia Regina da Silva Pedrini

NATAL/RN ABRIL/2005

ALMEIDA, Andréa Farias – Avaliação Preliminar da Viabilidade de Produção in vitro de um Isolado Brasileiro de Baculovírus Spodoptera frugiperda MNPV. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Engenharia de Processos, Natal/RN, Brasil. Orientadora: Profª Drª Gorete Ribeiro de Macedo Co-Orientadora: Drª Márcia Regina da Silva Pedrini ___________________________________________________________________________

RESUMO:A produção in vivo de biopesticidas virais é a maior fonte destes inseticidas

presentes no mercado atualmente. Entretanto, o sistema in vivo apresenta limitação em

relação ao escalonamento de produção. No caso do vírus Spodoptera frugiperda

nucleopoliedrovirus (SfMNPV), o inseto usado para sua multiplicação tem características

canibais, o que dificulta ainda mais a sua produção in vivo. As células de inseto são

comumente utilizadas para produção in vitro de baculovírus. Várias linhagens destas células

são derivadas principalmente da espécie Lepidoptera. A linhagem Sf21 é derivada do tecido

ovariano da lagarta Spodoptera frugiperda e um clone isolado da linhagem original,

denominado Sf9, tem sido utilizado para produção de biopesticidas, por apresentar fácil

crescimento em cultivo em suspensão. Neste trabalho, foi testada a viabilidade de produção in

vitro de um isolado viral brasileiro de SfMNPV obtido em lavouras de milho. A produção de

poliedros, em células Sf21 e Sf9, foi determinada com base na avaliação comparativa da

produtividade volumétrica e específica destes poliedros. Ambas as linhagens celulares foram

cultivadas, em suspensão, em meio HyClone suplementado com diferentes concentrações de

soro fetal bovino (2,5 e 5%). A célula Sf9 suplementada com 5% de soro apresentou os

melhores resultados de produção. Os resultados foram confirmados quantitativamente através

dos parâmetros cinéticos estimados para as duas linhagens e diferentes concentrações de soro.

O sistema demonstrou, após sete passagens sucessivas, uma alta produção específica de

poliedros.

Palavras-chaves: Produção in vitro; baculovírus; Spodoptera frugiperda

BANCA EXAMINADORA:

Presidente:

Profª Drª Gorete Ribeiro de Macedo (UFRN)

Membros:

Drª Márcia Regina da Silva Pedrini (DCR/UFRN)

Profª Drª Magarida Maria dos Anjos Magalhães (UFRN)

Prof. Dr. José Luiz Caldas Wolff (UMC)

DATA DA DEFESA: 29 de abril de 2005

ii

Abstract

In vivo production of viral biopesticides is the major source of viral insecticides

currently in the marketplace. However, this system presents limitations during production

scale-up. For the Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), the insect used for

replication has cannibalistic characteristics, thus production is even more difficult. Insect cells

are commonly used for in vitro baculovirus production. Most of these cell lines are derived

from Lepidoptera species. The Sf21 cell line is derived from Spodoptera frugiperda

caterpillar ovarian tissue, and its clonal isolate Sf9 has been used for biopesticide production

due to its ease of growth in suspension cultures. In this work, the in vitro production

capabilities of a Brazilian SfMNPV isolate obtained from cornfields was evaluated.

Comparison of polyhedra production was carried out using both Sf21 and Sf9 cells, based on

volumetric and specific yields. Both cell lines were cultivated in Hyclone medium

supplemented with different fetal bovine serum concentrations (2,5 and 5%). The best results

were obtained using Sf9 cells supplemented with 5% serum. These results were further

confirmed quantitively through kinetic parameter estimation for both cells lines and different

serum concentrations. After seven successive passages, this system still presented high

specific polyhedra production.

Key-words: in vitro production; baculovirus; Spodoptera frugiperda

iii

Dedico esta dissertação à minha família

pelo amor, apoio e a compreensão de

sempre.

iv

Agradecimentos

Agradeço antes de tudo à minha mãe, presente em todos os momentos da minha vida,

sempre.

Pela realização deste trabalho, agradeço imensamente:

Às minhas orientadoras, professora Gorete pela orientação e apoio que vêm desde a

minha graduação e, principalmente, pelo incentivo constante às minhas atividades. Agradeço

ainda, pela parceria com Márcia Pedrini que teve participação importantíssima desde

elaboração do plano de trabalho até os momentos finais desta dissertação. Em especial,

agradeço a Márcia Pedrini pela oportunidade de trabalhar com cultivo de células animais, que

me proporcionou um enorme aprendizado na área.

Aos companheiros do LEB que de alguma forma ajudou-me na realização da parte

experimental do meu trabalho, em especial, agradeço a Sanderson pela ajuda incondicional e

Danielle pela ajuda na parte final dos experimentos.

Às pesquisadoras Maria Elita B. de Castro e Zilda Maria B. Ribeiro, ambas do

Laboratório de Genética Molecular de Microorganismos e Invertebrados (LGM) - Núcleo de

Controle Biológico da Embrapa/Cernagen, por terem cedido as linhagens de Spodoptera

frugiperda.

Ao pesquisador Fernando Valicente por ter cedido o Isolado 18 do baculovírus de

Spodoptera frugiperda (SfMNPV).

Aos professores Everaldo Silvino e Paulo Marinho pela colaboração na escrita da

dissertação.

Ao Laboratório de Metrologia do departamento de Engenharia Mecânica da UFRN,

em especial, a Henrique e Marcelo pela manipulação e utilização do microscópio na fase de

adaptação das células.

Aos colegas das disciplinas da Pós-graduação sempre compartilhando os momentos de

estudos e descontração.

Agradeço ainda aos funcionários Mazinha e Medeiros pelo apoio administrativo e

burocrático.

Finalmente, agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química e ao

CNPq pela bolsa concedida no mestrado.

v

SUMÁRIO

Lista de figuras ...................................................................................................viii

Lista de tabelas ..................................................................................................... ix

Nomenclatura ........................................................................................................ x

Lista de variáveis.................................................................................................xii

Capítulo 1. Introdução Geral................................................................................. 1

Capítulo 2. Aspectos teóricos................................................................................ 5

2.1. Cultura de células de inseto............................................................................ 6

2.1.1. Cinética para o cultivo de células de inseto............................................. 7

2.2. Baculovírus..................................................................................................... 8

2.3. Modo de ação dos baculovírus..................................................................... 10

2.4. Produção de baculovírus .............................................................................. 10

2.4.1. Produção in vivo..................................................................................... 10

2.4.2. Produção in vitro.................................................................................... 11

2.4.2.1. Processo de infecção in vitro........................................................... 13

2.4.2.2. Parâmetros de infecção: MOI e TOI ............................................... 14

2.4.3. Passagem seriada ................................................................................... 14

Capítulo 3. Estado da arte ................................................................................... 16

Capítulo 4. Metodologia experimental................................................................ 21

4.1. Lavagem das vidrarias.................................................................................. 22

4.2. Meio de cultura de células............................................................................ 22

4.2.1. Preparação do meio de cultura de células (HyClone) ........................... 23

4.3.Linhagens de células ..................................................................................... 23

4.3.1. Adaptação e manutenção das células..................................................... 24

vi

4.3.2. Contagem de células .............................................................................. 25

4.3.2.1. Cálculos da contagem...................................................................... 25

4.4. Cinética de crescimento celular, consumo de substrato e produção de poliedros .............................................................................................................. 26

4.5. Vírus ............................................................................................................. 27

4.5.1. Obtenção da hemolinfa .......................................................................... 27

4.5.2. Multiplicação viral in vivo do SfMNPV................................................ 27

4.5.3. Multiplicação viral in vitro do SfMNPV............................................... 28

4.6. Infecção in vitro com SfMNPV ................................................................... 29

4.6.1. Preparação do estoque de vírus.............................................................. 29

4.6.2. Infecção com vírus derivado de poliedro (VDP)................................... 29

4.7. Liberação e quantificação de poliedros das células infectadas.................... 30

4.8. Passagem seriada com SfMNPV.................................................................. 30

4.9. Bioensaios para teste de virulência .............................................................. 31

Capítulo 5. Resultados e discussão ..................................................................... 32

5.1. Adaptação das células Sf9 e Sf21 ................................................................ 33

5.2. Teste preliminar de infecção ........................................................................ 38

5.3. Produção de poliedros em células Sf9 e Sf21 .............................................. 45

5.4. Produção de poliedros em diferentes concentrações de SFB....................... 49

5.5. Cinética de crescimento das células Sf9 e Sf21........................................... 53

5.6. Passagem seriada com SfMNPV.................................................................. 58

Capítulo 6. Conclusões........................................................................................ 61

Capítulo 7. Referências bibliográficas ................................................................ 63

Anexos................................................................................................................. 74

vii

Lista de figuras

Figura 2.1. Taxonomia dos baculovírus (Kalmakoff & Ward, 2004) ........................................ 8

Figura 2.2. Infecção de um inseto hospedeiro (Kalmakoff & Ward, 2004)............................. 11

Figura 2.3. Estrutura do virion (Kalmakoff & Ward, 2003) .................................................... 12

Figura 2.4. Ciclo de infecção dos baculovírus (Rohrmann, 1999). .......................................... 13

Figura 4.1. Câmara de Neubauer – hemocitômetro (Invitrogen, 2002). .................................. 25

Figura 5.1. Células Sf9 adaptadas ao cultivo em suspensão .................................................... 34

Figura 5.2. Adaptação e manutenção das células Sf9 .............................................................. 35

Figura 5.3. Adaptação e manutenção das células Sf21 ............................................................ 37

Figura 5.4. Teste preliminar de infecção com VDP em células Sf9 (HyClone + 5%SFB)...... 39

Figura 5.5. Células Sf9 infectadas com Isolado SfMNPV a 72 h.p.i ....................................... 39

Figura 5.6. Produção de poliedros em células Sf9 (HyClone + 5% SFB) ............................... 40

Figura 5.7. Infecção, em células Sf9, com VDP (SfMNPV) de poliedros multiplicados in vivo.

.................................................................................................................................................. 42

Figura 5.8. Infecção, em células Sf9, com VDP (SfMNPV) de poliedros multiplicados in vitro

.................................................................................................................................................. 44

Figura 5.9. Produção de poliedros com VEC (Passagem 2)..................................................... 46

Figura 5.10. Produção de poliedros com VEC (Passagem 3) em células Sf9 .......................... 51

Figura 5.11. Curva de crescimento e consumo de glicose das células Sf9 (HyClone + 5%SFB)

.................................................................................................................................................. 53

Figura 5.12. Curva de crescimento e consumo de glicose das células Sf9 (HyClone +

2,5%SFB) ................................................................................................................................. 55

Figura 5.13. Curva de crescimento e concentração de glicose das células Sf21 em meio

HyClone + 5%SFB................................................................................................................... 56

Figura 5.14. Passagem seriada em células Sf9 (HyClone + 5%SFB) ...................................... 58

Figura 5.15. Produção específica de poliedros em células Sf9 (HyClone + 5%SFB) ............. 60

viii

Lista de tabelas

Tabela 2.1. Produtos comerciais produzidos a partir de baculovírus. ........................................9

Tabela 5.1. Resultados dos ajustes a curva de produção de poliedros (células Sf9 e Sf21).....47

Tabela 5.2. Resultado da ANOVA para a produção volumétrica de poliedros........................47

Tabela 5.3. Resultado da ANOVA para a produção especifica de poliedros...........................48

Tabela 5.4. Resultados dos ajustes a curva de produção de poliedros (5% e 2,5%SFB) .........52

Tabela 5.5. Resultado da ANOVA para a produção volumétrica de poliedros........................52

Tabela 5.6. Resultado da ANOVA para a produção específica de poliedros...........................52

Tabela 5.7. Resultado da regressão linear para as células Sf9 controle (HyClone + 5% SFB)54

Tabela 5.8. Resultado da regressão linear para as células Sf9 infectadas (HyClone + 5% SFB)

..................................................................................................................................................54

Tabela 5.9. Resultado da regressão linear para as células Sf9 controle (HyClone + 2,5% SFB)

..................................................................................................................................................55

Tabela 5.10. Resultado da regressão linear para as células Sf9 infectadas (HyClone + 2,5%

SFB)..........................................................................................................................................55

Tabela 5.11. Resultado do ajuste linear para as células Sf21 controle (HyClone + 5% SFB) .56

Tabela 5.12. Resultado do ajuste linear para as células Sf21 infectadas (HyClone + 5% SFB)

..................................................................................................................................................57

Tabela 5.13. Parâmetros cinéticos para as células Sf9 e Sf21..................................................57

ix

Nomenclatura

AcMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Autographa californica

AfMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Anagrafa falcifera

AgMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Anticarsia gemmatalis

AsMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Agrotis segetum

ANOVA Análise de variância

BCIRL-HA-AM1 Linhagem de célula de Helicoverpa armigera

BCIRL-HA-AM3 Linhagem de célula de Helicoverpa zea

BCIRL-HV-AM1 Linhagem de célula de Heliothis virescens

BEVS Sistemas de expressão que utilizam baculovírus como vetor

BmNPV Nucleopoliedrovirus de Bombyx mori

CENARGEN Recursos Genéticos e Biotecnologia

CNPMS Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo

CvMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Condylorrhiza vestigialis

DIP Partículas interferentes defectivas

DjjNPV Nucleopoliedrovirus de Dione juno juno

DNS Ácido dinitro-salicílico

dpi Dias de pós-infecção

DSS Dodecil sulfato de sódio

EeGV Granulovírus de Erinnyis ello

EMBRAPA Empresa brasileira de pesquisa agropecuária

FP Mutantes poucos poliedros (few polyhedra)

GmMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Galleria mellonella

GV Granulovírus

HaSNPV Nucleopoliedrovirus de simples capsídeo de Helicoverpa armigera

hpi Horas de pós-infecção

IPLB-LdEp Linhagem de célula Lymantria dispar

LdMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Lymantria dispar

LGM Laboratório de Genética Molecular de Microorganismos e Invertebrados

MbMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Mamestra brassicae

MET Microscopia eletrônica de transmissão

MNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos

________________________________________________________________________ xAndréa Farias de Almeida, abril/2005

MOI Multiplicidade de infecção (ufp/mL)

MP Muitos poliedros

NaCl Cloreto de sódio

NaHCO3 Bicarbonato de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

NPV Nucleopoliedrovirus

NsSNPV Nucleopoliedrovirus de simples capsídeo de Neodiprion sertifer

OpMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Orgyia pseudotsugata

PfMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Panolis flammea

SeMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Spodoptera exigua

SFB Soro fetal bovino

Sf9 Clone 9 da linhagem de célula Spodoptera frugiperda

Sf21 Clone 21 da linhagem de célula Spodoptera frugiperda

SfMNPV Nucleopoliedrovirus de múltiplos capsídeos de Spodoptera frugiperda

SNPV Nucleopoliedrovirus de simples capsídeo

TN-CL1 Linhagem de célula Trichoplusia ni

TN-368 Linhagem de célula Trichoplusia ni

TOI Tempo de infecção (célula/mL)

ufp Unidades formadoras de placa

VEC Vírus extracelular

VDP Vírus derivado de poliedro

________________________________________________________________________ xiAndréa Farias de Almeida, abril/2005

Lista de variáveis

C Concentração de células viáveis (células/mL)

D Fator de diluição

N Número de células

µxmáx Velocidade específica máxima de crescimento de células não infectadas (h-1)

µxmáx* Velocidade específica máxima de crescimento de células infectadas (h-1)

µsmáx Velocidade específica máxima de consumo de substrato de células não infectadas (h-1)

µsmáx* Velocidade específica máxima de consumo de substrato de células infectadas (h-1)

µpmáx Velocidade específica máxima de produção de poliedros (h-1)

td Tempo de duplicação celular (h)

R Coeficiente de correlação

________________________________________________________________________ xiiAndréa Farias de Almeida, abril/2005

Capítulo 1

Introdução Geral

________________________________________________________________________ xiiiAndréa Farias de Almeida, abril/2005

__________________________________________________________________________________________ Introdução geral

O Brasil, por sua grande extensão territorial, é um país com uma grande vocação

agrícola, por isto, a preocupação com o controle de pragas. O uso constante e muitas vezes

indiscriminado dos agrotóxicos provoca uma redução da população de organismos benéficos e

cada vez mais se cria dependência de produtos químicos, causando assim, resistência da praga

em relação ao pesticida químico utilizado para o seu controle. A redução do uso destes

agrotóxicos na agricultura é interesse de países produtores e exportadores de alimentos devido

a questões comerciais e ambientais.

Por outro lado, os biopesticidas, por serem altamente seletivos, mais seguros ao

aplicador e por não poluírem o ambiente, como os agrotóxicos, são uma alternativa

verdadeiramente ecológica e sustentável, que contribuem para o equilíbrio ecológico. Além

das vantagens ecológicas, evidenciou-se uma vantagem econômica ao redor de 70% nos

custos de utilização de baculovírus, quando compara-se com pesticidas químicos

convencionais (Embrapa, 2004).

A lagarta-do-cartucho do milho, Spodoptera frugiperda J.E. Smith (Lepidoptera:

Noctuidae), também conhecida por lagarta do milharal ou lagarta militar, é a principal praga

da cultura do milho, responsável por grandes prejuízos. No Brasil, onde as perdas de produção

giram em torno de 30%, em nenhuma época do ano as plantações estão a salvo do ataque do

inseto. A lagarta-do-cartucho afeta as culturas de milho não só do Brasil, mas em todo o

continente americano (Guia Rural, 1990).

A preferência da Spodoptera frugiperda pelo cartucho do milho, não exclui o ataque

às folhas e aos grãos nas espigas, o que explica o tamanho do prejuízo causado às plantações.

O controle desta praga é realizado mediante aplicações freqüentes de pesticidas químicos, que

apesar de eficientes e apresentarem baixos custos, o uso destes produtos de alta toxicidade e

de amplo espectro pode provocar graves danos ambientais.

A partir de uma lagarta-do-campo, um baculovírus foi identificado como

nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (SfMNPV) e purificado (Valicente et al.,

1989). Conseqüentemente, metodologias para o controle biológico da lagarta-do-cartucho

pelo SfMNPV foram estabelecidas (Valicente & Cruz, 1991), e estudos de caracterização

biológica e bioquímica foram conduzidos (Gerk; Kitajima; Souza, 1997). Até o ano de 1999,

aproximadamente 5.000 hectares de milho foram tratados com esse vírus produzido em

lagartas criadas com dieta artificial e formulado como pó molhável para distribuição aos

agricultores (Castro et al., 1999).

A alternativa do biopesticida, produzido a partir do baculovírus (extraído de lagartas

infectadas), é recebida com grande entusiasmo, já que os agrotóxicos têm sido, até o

________________________________________________________________________ 14Andréa Farias de Almeida, abril/2005


momento, o principal recurso utilizado. Segundo testes realizados por pesquisadores do

Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo, da Embrapa, o biopesticida mostrou-se 100%

eficiente no controle da praga (Embrapa, 2004).

A produção in vivo de biopesticidas virais é a maior fonte desses pesticidas atualmente

presentes no mercado. Neste sistema, insetos criados em laboratório e alimentados com dieta

artificial, geralmente resultam em um produto final de custo elevado, muitas vezes não

competitivo com o custo dos produtos químicos disponíveis (Moscardi, 1999; Moscardi &

Souza, 2002). Além disso, existe uma limitação em relação à ampliação de produção. No caso

do vírus SfMNPV, o inseto usado para a multiplicação deste vírus tem características

canibais, o que dificulta ainda mais a sua produção in vivo.

A produção de baculovírus pode ser aumentada utilizando-se processo in vitro de

infecção de células de inseto. Em tal abordagem, podem-se obter metodologias de maior

facilidade de ampliação de escala, controle de produção e, principalmente, um custo mais

baixo que as adotadas atualmente.

O objetivo principal de um processo in vitro, para produzir baculovírus como

biopesticida, é gerar uma alta produção de poliedros com alta patogenicidade a insetos e que

ofereça baixo custo, por exemplo, minimizando custos do meio de cultura. O produto também

deverá ser eficaz quando aplicado no campo contra insetos específicos (Chakraborty et al.,

1999).

A maior parte dos estudos de produção in vitro é realizada em cultivo de

monocamadas de células dificultando assim a obtenção de baculovírus em escala industrial. Já

o cultivo de células em suspensão facilita a produção de baculovírus em grande escala e como

conseqüência sua produção em biorreatores (Weiss et al., 1994; Chakraborty et al., 1999)

A produção in vitro de baculovírus por cultura de células é realizada normalmente

com o vírus extracelular da hemolinfa de insetos infectados ou do sobrenadante das células

previamente infectadas (King & Possee, 1992).

A necessidade de um controle seguro da praga Spodoptera frugiperda, despertou o

interesse na produção in vitro deste biopesticida viral. O tema desta dissertação de mestrado

foi trabalho inicial na implantação de uma nova linha de pesquisa, cultura de células animais,

especificamente células de inseto, no Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). O sucesso na cultura de células de

inseto requer o estabelecimento de práticas e métodos adequados para seu cultivo.

Considerando que culturas de células de invertebrados são extremamente sensíveis às

condições ambientais de cultivo, cada laboratório de cultura de células desenvolve métodos e



protocolos de acordo com as instalações e ambiente disponíveis. Os métodos aqui

estabelecidos foram foco para o desenvolvimento de técnicas na produção in vitro de

baculovírus como biopesticida.

Neste trabalho propõe-se a avaliação do potencial de produção de poliedros através da

infecção de células Spodoptera frugiperda com o baculovírus SfMNPV. Na etapa inicial,

desenvolveu-se a adaptação e manutenção das células Sf9 e Sf21 em cultivos em suspensão

utilizando o meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM). A adaptação inicial tinha o objetivo de

proporcionar às linhagens de células Sf9 e Sf21 condições de crescimento em suspensão, já

que as mesmas estavam adaptadas ao cultivo de monocamadas. Em seguida estudou-se a

adaptação das células ao meio de cultura HyClone (HyQ SFX-InsectTM) em diferentes

concentrações de soro fetal bovino (SFB).

Realizada a adaptação das células, os experimentos de infecção celular foram

conduzidos em cultivo submerso, onde se utilizou como inóculo vírus derivado de poliedro

(VDP) liberado do SfMNPV (Isolado 18) por um combinado de solução alcalina e tripsina.

As duas linhagens de célula, Sf9 e Sf21, foram comparadas quanto à produção de

poliedros. A melhor linhagem foi escolhida para realizar os demais experimentos de infecção

celular. A partir destas infecções foram estimadas as produções volumétrica e específica do

baculovírus SfMNPV em diferentes concentrações de soro (2,5 e 5%).

Alguns experimentos foram realizados para obtenção dos seguintes parâmetros

cinéticos: velocidade específica máxima de crescimento celular (µxmáx); velocidade específica

máxima de consumo de substrato (µsmáx); velocidade específica máxima de produção de

poliedros (µpmáx) e o tempo de duplicação (td), tanto do crescimento celular como da

replicação viral das linhagens citadas.

Na produção de SfMNPV, como biopesticida, é necessário um certo número de

passagens deste vírus em cultura de células de inseto para obter inóculo suficiente para

produção em larga escala. Portanto, a passagem seriada do SfMNPV foi realizada para

verificar a produtividade deste baculovírus quando passado sucessivamente em cultura de

células.


Capítulo 2

Aspectos teóricos

___________________________________________________________________________ Aspectos teóricos

2.1. Cultura de células de inseto

A utilização de células de insetos visando a produção in vitro de proteínas

recombinantes e de biopesticidas intensificou-se nas últimas décadas. Os sistemas de

expressão tendo baculovírus como vetores (BEVS) constituem-se em uma tecnologia

relativamente nova quando comparada aos sistemas de expressão em células de mamíferos

(Chan, 1998). A maioria das pesquisas é voltada à expressão de uma grande variedade de

proteínas (Chan; Greenfield; Reid, 1998). Avanços tecnológicos originaram meios sintéticos,

completos e padronizados, para cultivo de células animais que suprem as necessidades

nutricionais proporcionando um elevado crescimento celular (Batista et al., 2003).

Várias linhagens de células de inseto são derivadas principalmente da espécie

Lepidoptera. A linhagem de célula Sf21 é derivada do tecido ovariano da lagarta Spodoptera

frugiperda, um clone isolado da linhagem original, Sf9, tem sido comumente utilizado para

produção de biopesticidas, devido ao fato de facilmente crescer em cultivo submerso (King &

Possee, 1992).

O estabelecimento de culturas de células de inseto permitiu o estudo detalhado in vitro

do ciclo infeccioso de vários baculovírus. Estas células de inseto são facilmente cultivadas in

vitro e sua manutenção é relativamente simples. A maioria delas pode ser cultivada em uma

faixa de temperatura de 25-30°C, todavia, a temperatura ótima durante o crescimento celular e

infecção para células Sf9 é considerada ao redor de 27-28°C (King & Possee, 1992).

Para se obter um bom crescimento das células de inseto é necessário que o meio

escolhido satisfaça às exigências, ambientais e nutricionais, da linhagem em questão. Os

pontos principais na seleção deste meio são pH, osmolaridade, quantidade e razão dos sais

inorgânicos. Componentes como aminoácidos, vitaminas e uma fonte de carbono tipo glicose

são comumente encontrados nos meios clássicos de formulação (Lynn, 1996). Os meios de

cultura que não contêm glicose, nutrientes alternativos podem ser consumidos, resultando no

entanto, na redução na taxa de crescimento celular (Drews et al., 2000).

Estas formulações básicas regularmente não favorecem o crescimento celular, mas a

suplementação com soro animal, normalmente soro fetal bovino (SFB) a uma concentração de

5–20%, favorecem o crescimento celular (Lynn, 1996). Embora o SFB tenha importância para

o crescimento das células, sua utilização apresenta desvantagens, por ser caro, sua adição

eleva substancialmente o custo total do meio de cultura. Além disso, a qualidade deste soro

pode variar de lote para lote, provocando alteração dos seus componentes o que pode afetar o

crescimento celular e replicação do vírus (Schlaeger, 1996). Conseqüentemente, o

_______________________________________________________________________ 6Andréa Farias de Almeida, abril/2005


crescimento celular e a produção de baculovírus são dificultados em um processo de

ampliação de escala.

Outra estratégia é utilizar o meio de cultura com uma quantidade reduzida de SFB. A

redução da concentração de soro no sistema de cultivo pode ser desejável por razões técnicas

ou econômicas (Invitrogen, 2004).

O desenvolvimento de meio de cultura sem soro é de grande valor para o processo de

produção em larga escala. Novas formulações não usam mais soro, como é o caso dos meios

SF900II e ExCell 401 que são os mais comumente utilizados (Schlaeger, 1996).

A adição da mistura complexa de aminoácidos e lipídeos ao meio sem soro pode

recuperar o pico de produtividade atingindo altas concentrações de célula (Chan; Greenfield;

Reid, 1998), a utilização de extratos obtidos pelo processamento de leveduras oriundas de

processos de fermentação alcoólica e de concentrados protéicos resultantes da produção de

derivados de leite também são alternativas de suplementação de meios de cultura para células

animais (Batista et al., 2003).

2.1.1. Cinética para o cultivo de células de inseto

O estudo cinético do cultivo de células de inseto consiste inicialmente na análise dos

valores de concentração celular. A concentração celular é a variável mais importante em todo

o cultivo de células de inseto, porque dela depende a estimativa das velocidades especificas de

crescimento, consumo de substrato e produção.

As células de inseto possuem velocidade de crescimento muito baixa variando entre

0,01 e 0,05h-1 (Tonso, 2000). Em particular, as velocidades de crescimento para as células Sf9

e Sf21 estão na faixa de 0,029 – 0,034 h-1, que correspondem ao tempo de duplicação de 20 a

25h (Schmid, 1996).

Os meios de cultura são constituídos por vários nutrientes: aminoácidos, carboidratos,

vitaminas e o carboidrato mais frequentemente consumido pelas células de inseto é a glicose.

A concentração de glicose pode ser determinada a fim de estimar a velocidade específica de

consumo de substrato.



2.2. Baculovírus

Baculovírus são vírus da família Baculoviridae, Figura 2.1, que contêm DNA circular

de fita dupla como material genético e são caracterizados pelos nucleocapsídeos de vírus

infeccioso que se encontram dentro de uma matriz protéica ajudando este vírus a sobreviver

fora de seu hospedeiro (King & Possee, 1992).

Há dois gêneros distintos na família dos baculovírus; os nucleopoliedrovirus (NPVs) e

os granulovírus (GVs), que são diferenciados pelo tamanho das partículas de vírus e a

natureza da proteína do corpo de oclusão (King & Possee, 1992).

Os nucleopoliedrovirus apresentam forma poliédrica e podem ser do tipo múltiplo

(MNPV) ou simples (SNPV), de acordo com o número de capsídeos por virion, esta diferença

está ilustrada na Figura 2.1. (Souza et al., 2002).

Figura 2.1. Taxonomia dos baculovírus (Kalmakoff & Ward, 2004)

Uma divisão mais recente tem sido proposta para distinguir os baculovírus em dois

grupos, grupo I e II, que é uma subdivisão dos NPVs pela análise filogenética das proteínas.

Estas proteínas são poliedrina/granulina (Zanotto; Kessing; Maruniak, 1993), Ecdisteróide

UDP-glicosil transferase (EGT) (Chen et al., 1997), fator de expressão tardia 2 (LEF-2) (Chen

et al., 1999), DNA polimerase (Bulach et al., 1999) e do envelope de fusão gp64/67 (Pearson;

Groten; Rohrmann, 2000). Os baculovírus Autographa californica MNPV (Ayres et al.,

1994), Bomyx mori MNPV (Gomi; Majima; Maeda, 1999), Orgyia pseudotsugata MNPV _______________________________________________________________________ 8Andréa Farias de Almeida, abril/2005


(Ahrens et al., 1997), Anticarsia gemmatalis MNPV (Zanotto; Kessing; Maruniak, 1993) e o

Lonomia obliqua MNPV (Wolff et al., 2002) são membros do grupo I, enquanto que

Spodoptera frugiperda MNPV (Zanotto; Kessing; Maruniak, 1993), Spodoptera exigua

MNPV (Ijkel et al., 1999), Lymantria dispar MNPV (Kuzio et al., 1999), Helicoverpa

armigera SNPV (Chen et al., 2001), Plutella xyslostella GV (Yoshifumi et al., 2000), e a

Xestia c-nigrum GV (Hayakawa et al., 1999) pertencem ao grupo II.

O uso de baculovírus como alternativa aos inseticidas químicos é devido às suas

características que conferem total segurança à saúde humana e ao meio ambiente. Eles

compreendem o maior grupo de vírus de inseto e possuem grande potencial como agentes de

controle biológico de insetos-praga em agricultura e áreas florestais (Martignoni, 1984;

Moscardi, 1999). Sua proteção em cristais protéicos (poliedros) permite a formulação de

biopesticidas com fácil tecnologia de aplicação, representando economia e biossegurança em

relação aos inseticidas químicos.

A Tabela 2.1 mostra os produtos feitos com base em baculovírus, os insetos

hospedeiros e os cultivos atacados pela praga.

Tabela 2.1. Produtos comerciais produzidos a partir de baculovírus.

Cultivos Praga

dos Insetos Vírus usados Nome

comercial Maçã, pêra,

ameixa e noz Cydia pomonella Granulovírus de C. pomonella. Cyd-X

Algodão, milho e tomate Spodoptera littoralis Nucleopoliedrovirus

de S. littoralis. Spodopterin

Algodão e hortaliças

Helicoverpa zea e Heliothis virescens

Nucleopoliedrovirus de H. zea.

Gemstar LC, Biotrol,

Hortaliças e flores Spodoptera exigua

Nucleopoliedrovirus de S. exigua. Spod-X

Alfafa e outros cultivos Autographa californica Nucleopoliedrovirus de

A. californica.

Gusano Inseticida Biológico

Espécies florestais

Orgyia pseudotsugata

Nucleopoliedrovirus de O. pseudotsugata.

TM Biocontrole

Espécies florestais Lymantria dispar Nucleopoliedrovirus de L.

dispar. Gypchek

Soja Anticarsia gemmatalis Nucleopoliedrovirus de A. gemmatalis

Baculoviron, Baculovirus

Nitral Fonte: Tabela adaptada (Moscardi, 1999)



2.3. Modo de ação dos baculovírus

A larva é a única fase susceptível (quanto mais precoce o ínstar mais susceptível) à

infecção pelo vírus. Em condições naturais a praga pode ser contaminada através dos ovos,

dos orifícios de respiração do corpo (espiráculos), através de insetos contendo o vírus ou mais

comumente pela via oral, ingerindo o vírus juntamente com o alimento. Uma vez ingerido, o

vírus começa a se multiplicar, espalhando-se por todo o corpo do inseto e provocando sua

morte, que ocorre geralmente de 6 a 8 dias após a ingestão (Valicente & Cruz, 1991).

O tempo de aparecimento dos primeiros sintomas da doença, bem como para a morte

do inseto infectado é influenciado por diferentes fatores, como a espécie do inseto, o ínstar em

que ocorreu a infecção, a quantidade ingerida, a virulência e as condições climáticas durante o

período em que o inseto ficou infectado. Como consequência, esses fatores têm efeitos

marcantes sobre a rapidez da ação do vírus, quando ele é aplicado no campo. Além disso,

outros fatores também influenciam a eficiência e a estabilidade do vírus antes de ser ingerido

pela praga. Entre eles estão: a irradiação solar, a temperatura, a umidade, o hábito da praga, os

equipamentos e a tecnologia para a sua aplicação (Valicente & Cruz, 1991).

2.4. Produção de baculovírus

A produção de baculovírus pode ser realizada por dois sistemas: produção in vivo que

é a forma mais empregada e a produção in vitro onde se concentra a maioria dos estudos,

estes relacionados com a biologia do baculovírus e o processo de infecção em células de

inseto.

2.4.1. Produção in vivo

No sistema de produção in vivo, insetos são criados em laboratório e alimentados com

dieta artificial, geralmente resultando em um produto final de custo elevado, muitas vezes não

competitivo com o custo dos produtos químicos disponíveis (Moscardi, 1999; Moscardi &

Souza, 2002). Os baculovírus produzidos in vivo são a única fonte de biopesticida viral

atualmente encontrada no mercado (Moscardi & Souza, 2002).



O processo de infecção, utilizando poliedros, é possível devido ao conteúdo do trato

digestivo dos insetos susceptíveis pois possui um pH alto e a matriz protéica destes poliedros

(poliedrina) é solúvel nesta condição. Assim, o processo de infecção é iniciado quando o

inseto susceptível consome os poliedros que contaminam a sua dieta. Ao alcançar o ambiente

alcalino do intestino do inseto, estes poliedros se dissolvem, liberando as partículas virais.

Após o ajuste na parede da membrana do intestino, o vírus então se funde com a membrana

plasmática das células da parede do intestino e libera os nucleocapsídeos (envelope do vírus

que contém uma nucleoproteína no centro) dentro do citoplasma, como mostrado na Figura

2.2. Os nucleocapsídeos servem para transportar o vírus de DNA para o núcleo da célula

(King & Possee, 1992).

O vírus extracelular (VEC) liberado atinge a hemolinfa espalhando-se e provocando

infecção secundária em outras células do inseto, disseminando assim a infecção de célula para

célula do hospedeiro. As células infectadas no segundo estágio da replicação do vírus na larva

do inseto também produzem VEC.

Figura 2.2. Infecção de um inseto hospedeiro (Kalmakoff & Ward, 2004)

2.4.2. Produção in vitro

A produção in vitro é relativamente mais fácil, quando comparada à produção in vivo,

para estabelecer cultivos contínuos de células. As células de inseto mais comumente usadas

são a Sf9 e a Sf21 (King & Possee, 1992).



A produção de vírus em cultura de células de inseto oferece várias vantagens: podem

ser selecionadas cepas específicas, preservadas e armazenadas em meios criogênicos para uso

futuro; podem ser testadas para assegurar que estejam livres de contaminantes indesejáveis,

que certamente afetariam o produto final (King & Possee, 1992).

O estudo para replicação de baculovírus in vitro simplificou enormemente os

experimentos para a compreensão da cinética do vírus e sua replicação. A infecção do vírus

deve ser estabelecida in vitro normalmente pela coleta da hemolinfa de larvas infectadas,

contendo partículas infecciosas de vírus (VEC), e utilizada para inocular cultura de células

susceptíveis. As partículas de vírus (virions), Figura 2.3, que subseqüentemente brotam da

membrana plasmática destas células, dentro do meio de cultura, podem ser usadas para

multiplicar o estoque de vírus (Chan; Greenfield; Reid, 1998).

Figura 2.3. Estrutura do virion (Kalmakoff & Ward, 2003)

A Figura 2.3 ilustra, também, a forma morfológica do vírus importante para a

expansão horizontal do baculovírus no ambiente (poliedros).

Com os avanços da tecnologia de cultura de células de insetos e análise ultra-estrutural

por microscopia eletrônica, tornou-se possível um estudo mais detalhado do processo de

infecção in vitro e o desenvolvimento de uma série de investigações sobre os mecanismos

moleculares envolvidos na replicação dos baculovírus (Castro et al., 1999).



2.4.2.1. Processo de infecção in vitro

Em cultura de células, a infecção ocorre em três fases: a) nas primeiras seis horas após,

as células de inseto são reprogramadas, com ação dos vírus, para replicar mais vírus; b) entre

seis e 24 horas após a infecção, novos vírus são produzidos e liberados para o meio de cultivo;

c) após 24 horas são produzidos vírus que ficam armazenados no núcleo das células, envoltos

na matriz de poliedrina, esperando a morte e a desintegração celular para se espalhar no meio

de cultivo e infectar outras células (Rohrmann, 1999). Estas fases estão ilustradas na Figura

2.4.

A primeira indicação da infecção por vírus é o inchaço do núcleo celular e a formação

de um material granular no centro do núcleo (Lua & Reid, 2000). Estas indicações de

alterações morfológicas que podem ser visualizadas ao microscópio óptico recebem o nome

de efeito citopático. O efeito citopático in vitro a ser observado fundamenta-se na análise de

formação de poliedros virais.

A próxima fase da infecção (tardia), compreende o período de 6 a 24 h.p.i., quando

uma estrutura elétron-densa (estroma virogênico) é formada e ocorre a intensa produção de

vírus extracelular (VEC) e replicação do DNA viral. A formação de poliedro é detectada por

volta de 18 h.p.i. e é continuada até a sua deposição completa na membrana em 48 h.p.i.

(Knudson & Harrap, 1975)

Na terceira fase da infecção (muito tardia), há a síntese de novo da membrana que vai

interagir com os nucleocapsídeos para a formação do envelope viral e a posterior oclusão de

virions na matriz protéica, no núcleo da célula.

_______________________________________________________________________ 13

Figura 2.4. Ciclo de infecção dos baculovírus (Rohrmann, 1999).

Poliedro VEC

Andréa Farias de Almeida, abril/2005


2.4.2.2. Parâmetros de infecção: MOI e TOI

Toda a infecção de vírus deriva de uma única partícula infecciosa e assim, esta se

replica dando origem a uma população de vírus. Este vírus infeccioso pode ser usado então

como o inóculo para geração de um estoque puro de vírus. O número de partículas de vírus

infecciosas contidas na solução (meio de cultivo) é o título do vírus. A multiplicidade de

infecção (MOI) é a relação das partículas virais infecciosas com as células viáveis, enquanto

que o tempo de infecção (TOI) refere-se à densidade celular a qual as células são infectadas

(células/mL).

A relação da concentração do produto final e a MOI é altamente dependente do

crescimento das células. Desta forma, um fator importante para obtenção de bons vírus é a

condição das células. Elas devem ser saudáveis e crescendo ativamente no tempo de infecção

onde esta concentração de célula é de importância indiscutível (O'Reilly; Miller; Luckow,

1994; Chakraborty et al., 1999).

A MOI usual para infectar cultura de células está entre 5 e 50, para o estudo da

replicação viral, isto é feito para assegurar que todas as células são infectadas

simultaneamente e que ocorra sincronismo dos eventos da replicação de vírus (King &

Possee, 1992).

O rendimento final do produto para células infectadas na metade da fase exponencial

de crescimento é geralmente maior do que para células infectadas no final da fase exponencial

de crescimento para uma MOI até 10, então é melhor infectar células com baixa MOI na

metade da fase exponencial para obter ótimos rendimentos (O'Reilly; Miller; Luckow, 1994).

2.4.3. Passagem seriada

A passagem seriada de baculovírus em cultura de células de inseto pode resultar uma

variedade de mutações (Chakraborty & Reid, 1999). As mutações mais freqüentes são:

mutantes FP (Few Polyhedra) e partículas interferentes defectivas (DIPs) .

O mutante FP é caracterizado por um decréscimo na formação de poliedros e um

aumento na formação de vírus extracelular. Os poliedros produzidos praticamente não contêm

partículas virais possuindo baixa ou nenhuma infectividade. Outro tipo freqüente de alteração

genética é a produção de DIPs (Souza et al., 2003).



Quando o vírus é submetido a longos períodos de ciclos múltiplos de infecção, a

habilidade de infectar as culturas de células diminui devido à formação dos DIPs.

A geração destes mutantes durante a passagem seriada é conhecida como efeito

passagem. Os virions encontrados no Autographa californica nucleopoliedrovirus (AcMNPV)

têm cerca de 44% de perda do seu genoma, incluindo os genes da poliedrina e da DNA

polimerase (Kool et al., 1991; Wickham et al., 1991). Estas partículas contêm apenas parte do

genoma viral, replicando mais rápido que o vírus padrão, conseqüentemente sua quantidade

aumenta rapidamente com a passagem seriada contínua.

A maneira de evitar a formação de DIPs no estoque de vírus é infectar a cultura de

células com baixa MOI, assim minimizando a probabilidade da entrada de DIPs na célula

(Wickham et al., 1991).


Capítulo 3

Estado da arte

___________________________________________________________________________ Estado da arte

Vários fatores contribuem para a replicação in vitro de baculovírus em cultivo de

células, tais como cinética de infecção do vírus, tempo de infecção, consumo de nutrientes e

efeito de passagem. Para uma produção in vitro de alta qualidade e biologicamente ativa é

preciso ter conhecimento da replicação do vírus.

A maioria das pesquisas em relação à replicação in vitro de baculovírus tem se

concentrado no estudo do Autographa californica nucleopoliedrovirus (AcMNPV) devido a

sua fácil propagação em cultura de células e a seu amplo espectro de hospedeiro (Volkman &

Summers, 1977; Lee & Miller, 1978; Weiss et al., 1981; Carstens, 1982; Fraser; Smith;

Summers, 1983; Carstens; Krebs; Gallerneault, 1986; Kumar & Miller, 1987; Beames &

Summers, 1988; 1989; 1990; Elam; Vail; Schreiber, 1990; Kool et al., 1991; Morales;

Moscardi; Gravena, 1993; Ayres et al., 1994; Harrison & Summers, 1995a; 1995b; Braunagel

et al., 1999; Pijlman et al., 2001; Rosas-Acosta; Braunagel; Summers, 2001; Spenger et al.,

2002; Bull; Godfray; O'Reilly, 2003).

No entanto, no que se refere aos aspectos de produção e estabilidade durante a

passagem seriada em cultura de células, os vírus Helicoverpa armigera nucleopoliedrovirus

(HaSNPV) (Chakraborty, 1997; Chen et al., 1997; Chakraborty et al., 1999; Chakraborty &

Reid, 1999; Chen et al., 1999; Chen et al., 2000; Lua & Reid, 2000; Chen, 2001; Chen et al.,

2001; Lua et al., 2002; Lua & Reid, 2003; Lua; Nielsen; Reid, 2003; Pedrini, 2003; Pedrini et

al., no prelo) e Lismantria dispar nucleopoliedrovirus (LdMNPV) (Slavicek, 1991; Lynn,

1994; Slavicek; Hayes-Plazolles; Kelly, 1995; Bischoff & Slavicek, 1997; Riegel & Slavicek,

1997; Slavicek et al., 1998; Bischoff & Slavicek, 1999; Slavicek; Popham; Riegel, 1999;

Popham; Bischoff; Slavicek, 2001; Slavicek; Hayes-Plazolles; Kelly, 2001; Slavicek &

Hayes-Plazolles, 2003) também estão sendo bastante explorados.

Apesar do grande sucesso do uso do baculovírus Anticarsia gemmatalis

nucleopoliedrovirus no controle de pragas da soja no Brasil (Moscardi & Corso, 1981;

Moscardi, 1989; 1999; Moscardi & Souza, 2002; Embrapa-Soja, 2005), este vírus ainda é

produzido utilizando-se a coleta de lagartas no campo. Em vista da exigência de padronização

de produção e demanda por grandes quantidades de biopesticida, há a necessidade de

desenvolvimento de tecnologias modernas de culturas celulares para a produção dos

baculovírus. Desta forma, estudos têm sido realizados com intuito de desenvolver o processo

de produção in vitro deste vírus (Claus et al., 1993; Castro et al., 1997; Castro; Souza;

Bilimoria, 1999; Maruniak et al., 1999).

Vários outros baculovírus já foram identificados no Brasil, tais como: Spodoptera

frugiperda nucleopoliedrovirus (SfMNPV) que infecta a lagarta do cartucho do milho


___________________________________________________________________________ Estado da arte

(Valicente & Cruz, 1991; Pedrini; Wolff; Reid, 2004), Dione juno juno nucleopoliedrovirus

(DjjNPV) que infecta a lagarta-do-maracujazeiro (Boiça Júnior; Lara; Oliveira, 1999; Ribeiro

et al., 1997), Condylorrhiza vestigialis nucleopoliedrovirus (CvMNPV) que infecta a lagarta

do álamo (Castro et al., 2003), Bombix mori nucleopoliedrovírus (BmMNPV) que infecta o

bicho-da-seda da amoreira (Brancalhão; Souza; Soares, 2002), Lonomia obliqua

nucleopoliedrovirus que infecta a lagarta Lonomia obliqua (Wolff et al., 2002) e Erinnyis ello

granulovirus (EeGV) que infecta a lagarta da mandioca (Farias, 1991; Smitt, 1988)

Ao contrário do que acontece com o controle da lagarta da soja, onde cerca de 10% da

área cultivada com soja é tratada com baculovirus AgMNPV, o controle da lagarta do

cartucho do milho é realizado normalmente utilizando-se pesticidas químicos. Apesar de

existirem diversos parasitóides e predadores que são inimigos naturais da praga Spodoptera

frugiperda, mas são poucos os que realmente têm sido estudados no Brasil, visando o controle

biológico dessa praga (Cruz, 1995). Entretanto, o baculovírus SfMNPV é utilizado em escala

experimental nas culturas de milho para o controle da lagarta-do-cartucho, Spodoptera

frugiperda (J.E. Smith) (Embrapa, 2004). A eficiência do baculovírus SfMNPV no controle

desta praga foi demostrado por Valicente & Cruz (1991) em condições laboratoriais e por

Valicente & Costa (1995) utilizando sistemas de irrigação.

Além do Brasil, o vírus SfMNPV foi isolado e caracterizado em vários outros países

da América, tais como Argentina (Barretta; Rios; De Cap, 1998), Nicarágua (Simon et al.,

2004), Venezuela (Agudelo et al., 1983) e Estados Unidos (Loh; Hamm; Huang, 1981; Loh et

al., 1982; Maruniak; Brown; Knudson, 1984). Esses isolados, geralmente, apresentam

diferentes perfis de restrição enzimática e características biológicas distintas (Maruniak;

Brown; Knudson, 1984; Escribano et al., 1999; Simon et al., 2004; Barreto et al., 2005).

No estudo feito por Barreto et al. (2005) foi avaliado o efeito de 22 isolados do

baculovírus SfMNPV em lagartas Spodoptera frugiperda. Estes isolados foram coletados em

plantações de milho em diferentes regiões do Brasil. Os autores observaram que existiam

diferenças significativas entre todos os isolados, no entanto, todos foram eficientes em relação

à mortalidade das lagartas quando a concentração de poliedros era igual ou superior a 106

poliedros/ml. Os melhores resultados foram obtidos com isolados obtidos no estado do Paraná

(Isolado 3, Melissa, PR e Isolado 19, Sertaneja, PR).

Existem poucos estudos sobre a sua replicação in vitro, e não há dados sobre a

produção volumétrica e específica de poliedros deste baculovírus (Harrap, 1972; Knudson &

Tinsley, 1974; Knudson & Harrap, 1975; Knudson & Tinsley, 1978; Maruniak; Brown;


___________________________________________________________________________ Estado da arte

Knudson, 1984; Mcintosh; Ignoffo; Andrews, 1985; Liu & Maruniak, 1995; Liu & Bilimoria,

1997; Levy; Maruniak; Maruniak, 2002; Pedrini; Wolff; Reid, 2004).

Os nucleopoliedrovírus de múltiplos capsídeos possuem um maior espectro de

hospedeiros do que os nucleopoliedrovírus de simples capsídeo. No entanto, no estudo

realizado por McIntosh et al. (1985), o vírus SfMNPV somente obteve um título viral

significativo para a célula homóloga Spodoptera frugiperda (IPLB-SF-21), dentre as cinco

células testadas (Trichoplusia ni, TN-CL1; Heliothis virescens, BCIRL-HV-AM1;

Helicoverpa zea, BCIRL-HA-AM3; e Helicoverpa armigera, BCIRL-HA-AM1).

Estudos microscópios da seqüência dos eventos morfogênicos da infecção com

SfMNPV em cultivo contínuo de células de Spodoptera frugiperda apresentaram a ordem da

seqüência da replicação deste vírus. Os autores observaram que a formação do poliedro foi

detectada em 18 h.p.i. e continuada até sua membrana ser formada em 48 h.p.i. Este estudo da

microscopia da seqüência dos eventos morfogênicos da infecção do SfMNPV em células de

Spodoptera frugiperda definiu a natureza e o tempo da morfogênese viral (Knudson &

Harrap, 1975).

A passagem seriada de baculovírus em linhagens de células pode resultar em uma

variedade de mutações ou populações de partículas virais defectivas predominantes nos

cultivos. A geração destes mutantes durante as passagens do cultivo de células, pode

comprometer o sistema in vitro para produção de baculovírus em larga escala. Características

morfogênicas aberrantes do vírus em passagens sucessivas do SfMNPV em cultura de células

foram registradas por Kundson & Harrap (1975). No trabalho realizado por Pedrini; Wolff;

Reid (2004), foi detectada uma rápida geração do fenótipo FP após somente duas passagens

do isolado SfMNPV em culturas de células Sf9. O isolado viral utilizado no trabalho realizado

por Pedrini; Wolff; Reid. (2004) foi coletado em Sete Lagoas em 1989 e denominado SL-

SfMNPV.

O efeito passagem não é meramente um produto do cultivo in vitro. Os mutantes FP

são selecionados mesmo in vivo, desde que a técnica de propagação utiliza VEC como inóculo

(Potter; Jaques; Faulkner, 1978).

As linhagens de células geralmente não são infectadas utilizando-se poliedros, pois os

virions não são liberados em pH neutro ou levemente ácidos do meio de cultura, portanto, não

disponíveis para infecção (Elam; Vail; Schreiber, 1990). Em contraste, é relativamente fácil

estabelecer infecções in vitro com isolados virais em culturas de células utilizando-se vírus

extracelular derivado da hemolinfa de inseto infectado ou sobrenadante de células

previamente infectadas (King & Possee, 1992). Em um estudo comparativo entre a


___________________________________________________________________________ Estado da arte

infectividade de VEC e VDP, Volkman et al.(1976) estimaram que VEC é entre 1700 a 1900

vezes mais infeccioso do que o VDP. Assim, o uso de VEC é usualmente a primeira escolha

para a propagação viral em cultura de células (King & Possee, 1992).

É possível a utilização de vírus derivados de poliedro (VDP) como fonte de virions

infeciosos, porém estes devem ser liberados dos poliedros utilizando-se soluções alcalinas. No

entanto, quando poliedros são dissolvidos em soluções alcalinas antes de serem usados para

infectar linhagens de células de inseto, o nível de infecção é baixo (Vail; Romine; Vaughn,

1979; Elam; Vail; Schreiber, 1990). Porém, utilizando-se proteinases este processo pode ser

melhorado. McIntosh et al (1988) obtiveram melhores resultados de infectividade quando

utilizaram um tratamento com proteinase K para dissolver poliedros de Helicoverpa zea

nucleopoliedrovírus (HzSNPV) para infectar células homólogas. O mesmo resultado foi

obtido por Lynn (1994) utilizando tripsina na dissolução de poliedros de Lymantria dispar

nucleopoliedrovirus (LdMNPV).

O modo de ação da tripsina ainda não foi elucidado. Em um novo trabalho, Lynn

(2003) verificou que, apesar do tratamento com tripsina aumentar a infectividade dos

baculovírus, este aumento não acontece para todos os sistemas de célula e vírus. A

infectividade do baculovírus AcMNPV para a linhagem de células TN-368 aumentou 4750

vezes com o tratamento com tripsina. Para o vírus Anagrapha falcifera nucleopoliedrovirus

(AfMNPV), este aumento foi 77000 vezes. Por outro lado, a infectividade destes dois vírus

para a linhagem de célula IPLB-LdEp foi levemente reduzida.


Capítulo 4

Metodologia experimental

___________________________________________________________________________Metodologia experimental

4.1. Lavagem das vidrarias

O cultivo de células animais exige uma série de cuidados no que se refere ao material

utilizado para a sua manipulação, por tratar-se de uma cultura extremamente sensível, deve-se

ter um cuidado excessivo quanto à presença de resíduos na vidraria, a fim de se evitar

qualquer tipo de contaminação indesejada.

Deixa-se toda a vidraria de molho, por pelo menos 24 horas, em uma solução de 20L

de água de torneira com 250mL de água sanitária (hipoclorito de sódio 2,5%) e 2L de

detergente (Detertec – Vetec). A partir daí, lava-se 5 vezes em água de torneira, 3 vezes em

água destilada e por fim, 2 vezes em água purificada a 18,3 MΩ-cm, esta lavagem é feita de

modo a certificar ausência de resíduos de detergente na vidraria. Seca-se esta vidraria

naturalmente em escorredor.

Colocam-se as pipetas em recipiente com 10L de água de torneira e 50mL de água

sanitária (hipoclorito de sódio a 2,5%) e 1L de detergente (Detertec – Vetec) deixando-as

nesta solução por pelo menos 24h. Após este período, lava-se 10 vezes em água de torneira, 5

vezes em água destilada e 5 vezes em água purificada a 18,3 MΩ-cm.

Para as pipetas contaminadas com vírus, coloca-se uma quantidade maior de água

sanitária (hipoclorito de sódio a 12%), 200mL/10 L de água. Após este procedimento, lava-se

10 vezes em água de torneira, 5 vezes em água destilada e 5 vezes em água purificada a 18,3

MΩ-cm para retirada de qualquer resíduo de detergente e hipoclorito existentes e deixando-se

secar naturalmente em seguida.

Esteriliza-se todo este material, antes do uso, em autoclave (Sercon) a uma

temperatura de 130°C e 1,5 atm de pressão, por 20 minutos.

4.2. Meio de cultura de células

O meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) suplementado com 5% e 2,5% SFB era

utilizado na manutenção das células e nos experimentos de infecção em cultivo de células em

suspensão.



4.2.1. Preparação do meio de cultura de células (HyClone)

Para o preparo de 2000 mL de meio de cultura (HyQ SFX-InsectTM – HyClone) é

necessário um volume inicial de 1500 mL de água purificada a 18,3 MΩ-cm (Easyure RF -

Barnstead) colocados em béquer de 3000mL (Ilmabor, Germany) e pesam-se 82,64g de meio

de cultura em balança analítica (Explorer-Ohaus, Suíça).

A partir deste preparo inicia-se a agitação em um agitador magnético (Tecnal –

TE089) e, após 2h de agitação, retira-se uma alíquota desta suspensão para a medir o pH em

potenciômetro (Digimed). Adicionam-se 0,7g de NaHCO3 (QEEL) e 3mL de glicerina P.A

(Cromato) e após a dissolução completa mede-se novamente o pH. Para ajustar o pH entre 6 –

6,2 adiciona-se gradativamente NaOH (Cromato) a 5M, logo depois deste ajuste completa-se

os 2000mL de meio.

Ao final de 5h de agitação mede-se o pH final e, após este procedimento, filtra-se esta

solução, em ambiente estéril, câmara de fluxo laminar (Purifier Class II Biosafety Cabinet –

Labconco), em sistema de filtração (Millipore) com membranas estéreis (0,45 e 0,22µm,

respectivamente). Este meio é armazenado em frascos estéreis (Scott) com tampa, mantendo-

os em temperatura ambiente, por 3 a 4 dias, para verificar se há alguma contaminação.

Comprovada a não contaminação suplementa-se o meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) com

5% e 2,5% de SFB e posteriormente, conservando-os em geladeira (4°C).

4.3. Linhagens de células

As células mais comumente utilizadas são linhagens derivadas de células epiteliais do

ovário da lagarta, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). As linhagens

de células utilizadas neste trabalho foram Sf9 e Sf21 (American Type Culture Collection,

MD) cedidas gentilmente pela Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen), já

adaptadas ao meio de cultura TNMFH suplementado com 10% de SFB e ao cultivo em

monocamada.



4.3.1. Adaptação e manutenção das células

As linhagens de células Sf9 e Sf21 (American Type Culture Collection, MD) foram

gradualmente adaptadas ao cultivo em suspensão e ao meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM)

suplementado com diferentes concentrações de SFB, Figura A.1 (Anexo).

A adaptação inicial para o cultivo em suspensão foi realizada a partir das células

cultivadas em monocamada. Estas células foram transferidas dos frascos de cultura de tecidos

(Frascos-TC) para um Erlenmeyer de 125mL (Schott), quando atingiam 50% de confluência,

ou seja, ocupavam cerca de 50% de toda a superfície destinada para o crescimento celular. O

volume utilizado foi 20mL, com agitação inicial de 70 rpm e temperatura de 28°C, a agitação

em shaker (Certomat MO II – B. Braun) era aumentada gradualmente até atingir a agitação de

120 rpm.

Depois de adaptadas, as células foram mantidas em culturas de suspensão com 20mL

colocados em frascos Erlenmeyers de 125mL (Schott) agitados a 120 rpm, 28°C, em shaker

(Certomat MO II – B. Braun), e cultivadas por 3 a 4 dias, onde amostras eram coletadas para

contagem e diluídas a uma concentração de 1x106 células/mL com meio fresco TNMFH +

10% SFB. Esta diluição era realizada para as células não entrarem na fase estacionária e de

declínio, mantendo-as, assim, na fase de crescimento logarítmico.

Realizada a adaptação ao cultivo em suspensão, iniciou-se a adaptação ao meio de

cultura HyClone (HyQ SFX-InsectTM) em diferentes concentrações de SFB (5% e 2,5%,

respectivamente). Para esta adaptação, as células foram mantidas inicialmente em meio

combinado com TNMFH + 10% SFB e HyClone (HyQ SFX-InsectTM) (75%, 50% v/v,

respectivamente).

Realizava-se contagem diária das células e, após atingirem a concentração de 3x106

células viáveis/mL, em 72/96 horas de cultivo, eram diluídas a uma concentração de 1x106

células viáveis/mL e, ao atingirem a viabilidade igual ou superior a 90% indicava a adaptação

ao meio de cultura estabelecido.

Após a adaptação ao cultivo de suspensão e ao meio de cultura HyClone (HyQ SFX-

InsectTM), as células eram readaptadas ao meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) com diferentes

concentrações de SFB (5 e 2,5%, respectivamente). Os resultados da adaptação estão descritos

no item 5.1.



4.3.2. Contagem de células

A concentração celular era estimada utilizando um microscópio fase-contraste

(Olympus, Japão) e um hemocitômetro, modelo Neubauer (Bright-Line Hemacytometer,

Sigma), como mostrado na Figura 4.1. A contagem em triplicada era realizada em cada

amostra, conforme a Equação (1), a fim de obter um erro de 15%, com 200 células contadas

em ambos os lados do hemocitômetro (Nielsen; Smyth; Greenfield, 1991).

A concentração de células viáveis e a viabilidade eram determinadas pela contagem

em volume conhecido da suspensão previamente diluído, através da técnica de exclusão, pela

coloração com azul de tripan (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 0,1%. As células

que permitem a entrada do corante e tornam-se azuladas, não apresentam a membrana intacta,

e devem ser consideradas não-viáveis, enquanto que as células transparentes são consideradas

viáveis.

Figura 4.1. Câmara de Neubauer – hemocitômetro (Invitrogen, 2002).

A viabilidade é definida como a porcentagem de células viáveis em relação à

quantidade total de células viáveis e não viáveis, e a concentração celular é expressa em

células por mililitro (células/mL).

4.3.2.1. Cálculos da contagem

A concentração celular era calculada da seguinte forma:



1018 trohemacitôme do lados 2 de volume

4→

−×⋅

=⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ DN

mLcélulasC células (1)

Onde: C: concentração de células

: número de células contadas célulasN

: fator de diluição D

4.4. Cinética de crescimento celular, consumo de substrato e produção de

poliedros

O crescimento celular foi determinado por contagem de células viáveis, como descrito

no item 4.3.2. O consumo de glicose foi determinado pelo método do ácido dinitro-salicílico

(DNS), que consiste na redução do ácido 3,5 dinitro-salicílico a ácido 3-amino-5-

nitrosalicílico ao mesmo tempo em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a grupo

carboxílico, com o desenvolvimento de uma coloração avermelhada, lida em

espectrofotômetro (Genesys, série 10) a 600nm. Esta leitura nos fornece a quantidade de

monossacarídeos existente no meio. A partir deste método, estimou-se a glicose consumida

nos experimentos utilizando-se uma curva padrão de glicose, Figura A.5 (Anexo). A

concentração de poliedros produzidos foi determinada pela contagem de poliedros, descrita no

item 4.7.

As velocidades específicas máximas de crescimento específico (µxmáx), de consumo de

substrato (µsmáx) e de produção de poliedros (µpmáx) foram determinadas pelos coeficientes

angulares das retas ajustadas para a variação do logaritmo neperiano das concentrações, com

o tempo. Ajustes feitos com auxílio do software Origin 6.0. (Anexo)

O tempo de duplicação celular (td) é o intervalo de tempo necessário para dobrar o

valor da concentração celular, este foi determinado conforme Equação 2:

dx t

Lnmáx

2=µ (2)



4.5. Vírus

O vírus de NPV da Spodoptera frugiperda (SfMNPV) isolado pelo Dr. Fernando

Hercos Valicente foi cedido pelo Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo (CNPMS) da

Embrapa de Sete Lagoas (MG), e a hemolinfa, do Isolado 18, foi obtida no Laboratório de

Genética Molecular de Microorganismos e Invertebrados (LGM) - Núcleo de Controle

Biológico – Embrapa/Cenargen.

4.5.1. Obtenção da hemolinfa

As lagartas Spodoptera frugiperda, cedidas pela Embrapa/Cenargen, foram infectadas

através de dieta artificial contendo o inóculo viral do SfMNPV com concentração de

1x107poliedros/dieta. Após 4 dias pós-infecção (d.p.i), retirou-se a hemolinfa das larvas com

uma micro-seringa. Após a retirada, diluiu-se esta hemolinfa em um tubo (eppendorf) com

450 µL de meio de cultura sem soro (TNMFH) e 50µL de cisteína a 0,1 M. Em seguida,

filtrou-se com membrana de 0,45µm.

Utilizou-se 0,2 mL da hemolinfa para infectar 20 mL da cultura de células em

suspensão, com 1,0x106células/mL em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) + 5% SFB, mas

esta infecção foi contaminada, portanto não utilizada nos experimentos posteriores.

4.5.2. Multiplicação viral in vivo do SfMNPV

A amplificação viral foi realizada a partir do Isolado 18 (macerado de lagartas do

campo infectadas) onde se utilizou cerca de 300 lagartas do tipo Spodoptera frugiperda do

terceiro para o quarto instar cedidas gentilmente pela Embrapa/Cenargen e mantidas em dieta

artificial.

A concentração do SfMNPV (Isolado 18) foi de 3,5x109 poliedros/mL, foram

utilizados 3µL deste isolado adicionando-se 27µL de água destilada estéril, correspondendo

30µL do inóculo viral em cada dieta (1x107poliedros/dieta).

As lagartas Spodoptera frugiperda foram colocadas individualmente (por serem

canibais) com suas respectivas dietas em copos plásticos descartáveis e vedados com tampas



de acrílico. Estas lagartas foram mantidas em ambiente com temperatura e umidade

controladas.

Depois de 9 d.p.i, as lagartas foram coletadas e maceradas em liquidificador por 3

minutos. O macerado foi filtrado através de uma camada de gaze com lã de vidro, para

remoção de partes da cutícula do inseto. Este filtrado foi centrifugado a 1000xg por 15

minutos, a 4°C, em rotor SS34, descartou-se o sobrenadante, coletou-se o pellet e este foi

ressuspenso em 1mL de dodecil sulfato de sódio (DSS) a 0,5% por inseto.

A suspensão foi centrifugada novamente a 1000xg por 15 minutos, a 4°C, em rotor

SS34, o sobrenadante foi descartado e o pellet formado foi novamente ressuspendido em igual

volume de NaCl 0,5M, a suspensão formada foi centrifugada, posteriormente, a 1200xg por

10 minutos, a 4°C, em rotor SS34, o novo pellet foi ressuspendido, e por fim, em água

destilada estéril (na proporção de 0,5 mL por inseto), sendo esta suspensão conservada a

temperatura de –20°C.

4.5.3. Multiplicação viral in vitro do SfMNPV

A multiplicação viral in vitro foi realizada a partir dos poliedros produzidos em cultura

de células. A infecção original para obtenção destes poliedros foi realizada por VDP do

Isolado 18, onde se utilizaram 300µL deste isolado, com concentração de

3,5x109poliedros/mL, para a liberação das partículas virais pelo método Lynn (1994), esta

suspensão de vírus foi utilizada como inóculo para infectar 20mL de suspensão de células a

uma concentração de 1x106células viáveis/mL, Figura A.2 (Anexo).

Após 10 d.p.i., obteve-se uma concentração de poliedros de 2,5x108 poliedros/mL. 10

mL da suspensão foram centrifugados a 100xg por 10 minutos, para separar células do meio

de cultura. O sobrenadante contendo os poliedros foi centrifugado a 1400xg por 30 minutos, o

pellet formado foi resuspendido com água destilada estéril e quantificado por contagem em

hemocitômetro.



4.6. Infecção in vitro com SfMNPV

Duas diferentes formas de vírus foram utilizadas neste estudo. O poliedro produzido

pela amplificação viral in vitro e o vírus extracelular produzido em cultivo de células em

suspensão.

4.6.1. Preparação do estoque de vírus

O estoque de vírus foi preparado segundo o método de Lynn (1994), 450µL de

poliedros produzidos, a uma concentração de 1x109poliedros/mL, foram utilizados para

liberação do VDP, e este foi o inóculo utilizado para infecção de 30 mL da suspensão de

células com o tempo de infecção (TOI) de 5x105 células viáveis/mL, Figura A.3 (Anexo).

4.6.2. Infecção com vírus derivado de poliedro (VDP)

Para infecção com VDP, 30mL do cultivo em suspensão de células Spodoptera

frugiperda eram infectados com 3mL de VDP com concentração final de células de 5,0x105

células viáveis/mL. Para obtenção do vírus extracelular a ser utilizado como inóculo nos

demais experimentos, a metade do volume da suspensão celular foi coletada com 72 h.p.i,

permanecendo os outros 50% da suspensão celular para a produção de poliedros.

Após 96 h.p.i, uma amostra de 1mL da suspensão das células infectadas era coletada e

centrifugada a 100xg por 10 min, o sobrenadante era retirado e utilizado como inóculo. O

pellet foi fixado com 3% de gluteraldeído (Sigma) em tampão fosfato, pH 7.2, para futura

análise em microscopia eletrônica de transmissão (MET). As concentrações e viabilidades das

células infectadas de todos os cultivos eram determinadas diariamente utilizando-se o método

de contagem, descrito no item 4.4. Ao final de 10 d.p.i, a produção de poliedros era

determinada também pela contagem em hemocitômetro, descrito no item 4.7. Todos estes

experimentos eram realizados em triplicata.



4.7. Liberação e quantificação de poliedros das células infectadas

Adicionava-se 100µL de uma solução de 1% de DSS (Cromato) em 100µL da

suspensão de células infectadas, esta mistura é mantida a 28°C por pelo menos uma hora para

proporcionar a total dissolução da membrana celular e consequentemente a liberação dos

poliedros das células, Figura A.4 (Anexo).

Diluia-se a suspensão, contendo os poliedros, com água purificada (18,3 MΩ-cm)

permitindo a contagem de 100 a 150 poliedros no quadrante central de cada lado do

hemocitômetro. Os poliedros eram contados com auxílio do microscópio de fase-contraste

800x (Olympus, Japão) após 10 minutos do carregamento, para fixação na superfície do

hemocitômetro (Bright-Line Hemacytometer, Sigma). A contagem era realizada em triplicata.

Calculava-se a produção volumétrica (poliedros/mL) e específica (poliedro/célula)

dividindo a concentração de poliedro pelo pico total da concentração celular do cultivo, após a

infecção.

A função de Boltzmann produz uma curva sigmoidal, representativa para a produção

de poliedros:

Valor inicial: A1=0 Valor final: A2=1 Ponto central: x0=0 Tempo constante: dx=1

4.8. Passagem seriada com SfMNPV

O vírus SfMNPV era sucessivamente replicado de 1 até 7 passagens utilizando a

linhagem de célula Sf9 em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) suplementado com 5% de

SFB, na passagem seriada era realizada utilizando cultivo em suspensão em frascos

Erlenmeyers de 125 mL agitados a 120rpm e temperatura de 28°C.

A primeira passagem foi realizada utilizando como inóculo viral o VDP do SfMNPV

produzido in vitro. Este VDP foi liberado através de soluções alcalinas (Lynn, 1994) que

infectou uma suspensão com 30 mL de células na concentração inicial de 5x105 células

viáveis/mL. Após o estabelecimento da infecção, retirava-se metade do seu volume para ________________________________________________________________________ 30Andréa Farias de Almeida, abril/2005


centrifugação (100xg, por 10 minutos), onde o sobrenadante (vírus extracelular) obtido era o

inóculo para passagem subseqüente.

Em cada passagem, a infecção era estabelecida utilizando 3 mL de VEC obtido da

passagem anterior (após 72/96h.p.i) e 27mL da suspensão, com uma concentração final de

células de 5x105células viáveis/mL. O VEC foi obtido por centrifugação (100xg, por 10

minutos) da suspensão infectada. As células não infectadas (controle) também possuíam uma

concentração final celular de 5x105 células viáveis/mL. Em cada passagem da cultura

infectada era retirada amostra após 72h.p.i. para análise de microscopia eletrônica de

transmissão (resultados não apresentados neste trabalho), contagens diárias eram realizadas

para quantificar a produção volumétrica de poliedros e após 10 d.p.i. era estimada a produção

específica máxima, dividindo o pico de produção volumétrica pelo pico de concentração das

células infectadas.

4.9. Bioensaios para teste de virulência

As amostras de poliedros produzidos in vitro, coletadas a 10 d.p.i, foram enviadas para

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia para realização de testes de virulência a fim de

verificar a bioatividade do biopesticida produzido. Os resultados não farão parte deste

documento e serão parte de publicações futuras.


Capítulo 5

Resultados e discussão

___________________________________________________________________________ Resultados e discussão

5.1. Adaptação das células Sf9 e Sf21

As linhagens de células Sf9 e Sf21 foram adaptadas ao meio HyClone (HyQ SFX-

InsectTM) suplementado com diferentes concentrações de SFB, Figura 5.1.

A Figura 5.2 mostra as curvas de adaptação e manutenção das células Sf9 em meio

HyClone (HyQ SFX-InsectTM) suplementado com 5% e 2,5% SFB, respectivamente.

A adaptação ao meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) + 5% SFB foi realizada com uma

concentração celular inicial de 1x106 células viáveis/mL. Esta concentração foi utilizada

inicialmente, para garantir um bom número células na fase inicial deste processo, já que as

células não estavam adaptadas a este meio. As células eram diluídas em cada 72/96 horas de

cultivo (perfil zig-zag do gráfico). Como esperado, as concentrações celulares após 3 dias de

cultivo, são menores que as presentes após 4 dias. Após 24 passagens, esta concentração foi

reduzida a 5x105 células viáveis/mL, Figura 5.2A, concentração tal utilizada nos experimentos

de infecção celular. Dez passagens após a redução da concentração inicial, as células já

estavam adaptadas à nova condição estabelecida para a concentração inicial de cultivo.

Depois de 15 passagens, as viabilidades das células atingiram valores acima de 90% e, desta

forma, foram consideradas adaptadas. Além disso, houve um aumento na concentração obtida,

passando de aproximadamente 4x106 células viáveis/mL para valores superiores a 7x106

células viáveis/mL.

As células Sf9 em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) + 5% SFB atingiram picos de

concentração celular de 7-8,5x106 células viáveis/mL entre as passagens 33 e 55,

apresentando um ótimo desempenho no crescimento celular, Figura 5.2A.

Para as células Sf9 em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) + 2,5% SFB, a adaptação

foi realizada com uma concentração inicial de 5x105 células viáveis/mL, Figura 5.2B. Esta

concentração foi utilizada devido à adaptação prévia destas células ao mesmo meio

suplementado com 5% SFB.

Observa-se na Figura 5.2B que as células Sf9 cultivadas em meio com 2,5% de SFB

atingiram picos de concentração de 7-9,5x106 células viáveis/mL entre as passagens 11 - 25,

indicando um período bem menor de adaptação ao meio suplementado com 2,5% de SFB do

que ao meio suplementado com 5% de SFB. Um melhor desempenho quanto ao crescimento

celular foi destacado, comparando com as células desenvolvidas em meio HyClone (HyQ

SFX-InsectTM) + 5%SFB.

Alguns pontos próximos a 80% de viabilidade foram observados, mesmo após a

________________________________________________________________________ Andréa Farias de Almeida, abril/2005 33


adaptação. Estes declínios correspondem aos períodos onde houve falta de energia elétrica,

portanto, agitação e temperatura não poderiam ser controladas, afetando assim, a viabilidade

das células.

A adaptação das células Sf9 em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) em ausência de

soro foi tentada, mas não houve sucesso. Este resultado foi inesperado, pois este meio

HyClone (HyQ SFX-InsectTM) foi desenvolvido para ser utilizado sem presença de soro.

Figura 5.1. Células Sf9 adaptadas ao cultivo em suspensão



A

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Concentração celular Viabilidade celular

Número de passagens

Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

B

0 5 10 15 20 25 30 35 400

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10



Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

Figura 5.2. Adaptação e manutenção das células Sf9

A) Adaptação e manutenção das células Sf9 em meio HyClone + 5% de SFB. B) Adaptação e manutenção das células Sf9 em meio HyClone + 2,5% de SFB



O mesmo método foi utilizado para a adaptação das células Sf21. Para esta célula, o

crescimento celular apresentou-se mais elevado quando comparado ao crescimento das

células Sf9.

A Figura 5.3 mostra as curvas de adaptação e manutenção das células Sf21 em meio

HyClone (HyQ SFX-InsectTM) suplementado com 5% e 2,5% de SFB, respectivamente.

A adaptação no meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) +5% SFB foi iniciada com uma

concentração de 1x106 células viáveis/mL, Figura 5.3A. Após 15 passagens, esta

concentração foi reduzida a 5x105 células viáveis/mL, como citado anteriormente,

concentração na qual foram realizados os experimentos de infecção. Cinco passagens após

esta diminuição de concentração inicial, as células já apresentavam uma viabilidade igual ou

superior a 90%, indicação de adaptação à nova condição estabelecida.

As células Sf21 cultivadas em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) + 2,5% SFB,

Figura 5.3B, atingiram picos de concentração de 8-9,5x106 células viáveis/mL a partir da

quinta passagem, podendo atingir 1,1x107 células viáveis/mL, indicando também um período

bem menor de adaptação ao meio suplementado com 2,5% de SFB.

Apesar do bom rendimento no crescimento celular das células Sf21, escolheu-se para

os experimentos de infecção a linhagem Sf9, devido ao seu bom desempenho quanto à

produção de poliedros, que é o foco principal deste trabalho, resultados estes comentados no

item 5.3.



A

0 5 10 15 20 25 300123456789

10111213141516



Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

B

0 5 10 15 20 25 30 35 400

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12



Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

Figura 5.3. Adaptação e manutenção das células Sf21

A) Adaptação e manutenção das células Sf21 em meio Hyclone + 5% de SFB. B) Adaptação e manutenção das células Sf21 em meio Hyclone + 2,5% de SFB



5.2. Teste preliminar de infecção

A Figura 5.4 mostra a curva de crescimento celular do teste preliminar da infecção

com o VDP do Isolado 18 vírus SfMNPV em células Sf9, adaptadas ao cultivo em suspensão

e com concentração inicial de 1x106 células viáveis/mL.

Inicialmente a preocupação não foi a otimização do tempo de infecção (TOI), mas

verificar a viabilidade de se obter bons resultados de infecção.

Nas primeiras 48 h.p.i., o crescimento celular foi equivalente tanto para as células não

infectadas (controle) como para as infectadas. Após 48 h.p.i., houve uma diferenciação no

crescimento das células controle e infectadas, indicando assim o estabelecimento da infecção.

As células infectadas com VDP (SfMNPV) em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM)

suplementado com 5% SFB estão representadas na Figura 5.5, onde se pode observar que 100

% das células foram infectadas após 72 h.p.i. Após este período, os efeitos citopatológicos

característicos de infecção celular por baculovírus são evidentes, o aumento do volume das

células e a presença de poliedros em seu núcleo. Após 10 dias de cultivo, obteve-se uma

produção volumétrica de 2,5x108 poliedros/mL, correspondente a uma produção específica de

110 poliedros/célula. A Figura 5.6 mostra a produção de poliedros nas células Sf9 em meio

HyClone (HyQ SFX-InsectTM) + 5% SFB.

Diante destes resultados, constata-se uma potencial viabilidade de produção in vitro do

vírus SfMNPV em cultivo em suspensão, a partir do Isolado 18. No entanto, a quantidade

deste Isolado era insuficiente para a realização dos demais experimentos. Então, este Isolado

foi multiplicado in vivo para obtenção de mais inóculo viral.

A ampliação viral in vivo foi realizada na Embrapa/Cenargen, com a colaboração das

pesquisadoras Maria Elita B. de Castro e Zilda Maria B. Ribeiro, ambas do Laboratório de

Genética Molecular de Microorganismos e Invertebrados (LGM) - Núcleo de Controle

Biológico.



0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 2400

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Concentração de células não infectadas Concentração de células infectadas Viabilidade das células não infectadas Viabilidade das células infectadas

Tempo (h)

Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilildade (%

)

Figura 5.4. Teste preliminar de infecção com VDP em células Sf9 (HyClone + 5%SFB)

Figura 5.5. Células Sf9 infectadas com Isolado SfMNPV a 72 h.p.i



24 48 72 96 120 144 168 192 216 2400,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Produção volumétrica de poliedros Produção específica de poliedros

Tempo (h)Prod

ução

vol

umét

ica

de P

olie

dros

x 1

08 (pol

iedr

os/m

L)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Produção específica de poliedros (poliedros/célula)

Figura 5.6. Produção de poliedros em células Sf9 (HyClone + 5% SFB)

Os poliedros produzidos in vivo foram utilizados como fonte de inóculo para os

demais experimentos, mas, os resultados não foram representativos, pois não foi obtida uma

produção significativa de poliedros.

A Figura 5.7 mostra um dos resultados obtidos da infecção com o VDP de poliedros

produzidos in vivo. Pode-se observar, Figura 5.7A, que houve crescimento tanto nas células

controle como nas células infectadas, estas atingindo uma concentração de 3,5x106 células

viáveis/mL e uma viabilidade de 90%, indicando que a infecção não foi bem sucedida.

A produção de poliedros, mostrada na Figura 5.7B, foi de 65 poliedros/célula, menor

que a obtida no teste preliminar já apresentado, cerca de 110 poliedros/célula.

O baixo desempenho desta infecção pode ser devido ao método de purificação de

poliedro utilizado, onde se empregou DSS na limpeza de cutículas de inseto existentes no

macerado. O DSS pode ter rompido o envelope dos poliedros e, conseqüentemente, a

partícula viral foi retirada do interior deste poliedro, prejudicando assim a infecção (Lua;

Nielsen; Reid, 2003).

Diante destes resultados, foram utilizados para os demais experimentos os poliedros



produzidos in vitro do teste preliminar de infecção. O VDP utilizado foi obtido a partir do

poliedro através da liberação utilizando-se soluções alcalinas (Lynn, 1994).



A

0 24 48 72 96 120 144 1680

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10


Tempo (h)

Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (Cél

ulas

viá

veis

/mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

B

24 48 72 96 120 144 168 192 2160

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Tempo (h)Prod

ução

vol

umét

rica

de p

olie

dros

x 1

06 (Pol

iedr

os/m

L)

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Produção específica de poliedros (Poliedros/célula)

Figura 5.7. Infecção, em células Sf9, com VDP (SfMNPV) de poliedros multiplicados in vivo.

A) Curva de crescimento das células controle e infectadas com VDP (SfMNPV) B) Curva de produções volumétrica e específica de poliedros



A Figura 5.8 mostra a curva de crescimento das células Sf9 infectadas e a produção de

poliedros, utilizando VDP proveniente do cultivo de células como fonte de inóculo para a

infecção.

Pode-se observar, Figura 5.8A, que as células cresceram ao redor de 2x106 células

viáveis/mL, em 72 h.p.i., sem diferenciação do crescimento das células controle. Então, para

evitar a limitação de nutrientes, a suspensão foi diluída a 1x106 células viáveis/mL. Em 96

h.p.i., a indicação da infecção viral foi observada através da diferenciação no crescimento das

células controle e infectadas, estabelecendo assim a infecção após 72 h.p.i.. Observou-se

ainda, que 100% das células foram infectadas. O vírus extracelular foi coletado, após estas 72

h.p.i., e utilizado como inóculo para o experimento seguinte.

A produção de poliedros está representada na Figura 5.8B. Após 10 dias de infecção,

observou-se uma produção volumétrica de 6x108 poliedros/mL, correspondente a uma

produção específica de 190 poliedros/célula. Como descrito na seção anterior, estes poliedros

produzidos in vitro foram utilizados com fonte de baculovírus para a primeira passagem,

através da infecção das células Sf9 com VDP (SfMNPV) liberado utilizando-se soluções

alcalinas (Lynn, 1994). É possível que, adotando-se a diluição aplicada neste experimento, a

infecção com VDP provenientes dos poliedros obtidos na amplicação in vivo, realizada na

Embrapa Cenargen, tenha um resultado semelhante. Porém, como a produção dos poliedros

neste experimento foi de aproximadamente 60% superior à obtida com o VDP do Isolado 18

proveniente de Sete Lagoas, tomou-se a decisão de considerar esta infecção como fonte de

vírus para as infecções subsequentes deste trabalho.



0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 2400

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10


Tempo (h)

Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

A

B

72 96 120 144 168 192 216 240 264 2883,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5


Tempo (h)

Prod

ução

vol

umét

rica

de p

olie

dros

x 1

08 (pol

iedr

os/m

L)

100

125

150

175

200

225


Figura 5.8. Infecção, em células Sf9, com VDP (SfMNPV) de poliedros multiplicados in vitro

A) Curva de crescimento das células controle e infectadas com VDP (SfMNPV) B) Curva de produções volumétrica e específica de poliedros



5.3. Produção de poliedros em células Sf9 e Sf21

As células Sf21 e Sf9 foram testadas com relação à produção de poliedros. Apesar das

células serem originadas da mesma linhagem, IPLB-SF-21 (Vaughn et al., 1977) diferentes

níveis de produção podem ser observados entre estes dois clones de célula (King & Possee,

1992; O'Reilly; Miller; Luckow, 1994)

A Figura 5.9 mostra as curvas de produção de poliedros das células Sf9 e Sf21

infectadas com o vírus extracelular (VEC) da segunda passagem da infecção com VDP.

As curvas foram ajustadas para obtenção da produção máxima de poliedros nas células

Sf9, Figura 5.9A, e Sf21, Figura 5.9B. Este ajuste foi realizado pelo software Origin 6.0,

utilizando a Equação de Boltzman, que melhor se ajustou aos pontos experimentais,

resultados apresentados na Tabela 5.1.

Os valores da produção de poliedros obtidos da infecção das células Sf9 foram 2 vezes

maiores para a produção volumétrica e 1,3 vezes para a produção específica quando

comparados aos valores obtidos da infecção com as células Sf21, conforme a Tabela 5.1.

Para confirmar este resultado foi realizada uma análise de variância (ANOVA),

Tabelas 5.2 e 5.3, onde se mostra que as médias são significativamente diferentes para

produção volumétrica e específica de poliedros, com nível de confiança de 95%.

Uma razão da diferenciação poderia ser o estado da célula, se ela está bem adaptada às

condições de operação utilizadas (O'Reilly; Miller; Luckow, 1994). As células Sf21, na

realidade, apresentaram melhores resultados de crescimento celular, demonstrando está bem

saudável e adaptada, mostrados no item 5.1. Apesar do crescimento celular das células Sf21

ter sido superior ao crescimento das células Sf9, conforme se mencionou anteriormente, o

objetivo deste trabalho é a produção de poliedros, assim a célula Sf9 foi escolhida para os

demais experimentos.



72 96 120 144 168 192 2160

1

2

3

4

5

6


Tempo (h)

Prod

ução

vol

umét

rica

de p

olie

dros

x 1

08 (pol

iedr

os/m

L)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450 Produção específica de poliedros (poliedros/célula)

A

B

72 96 120 144 168 192 2160,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5


Tempo (h)

Prod

ução

vol

umét

rica

de p

olie

dros

x 1

08 (pol

iedr

os/m

L)

0

50

100

150

200

250

300


Figura 5.9. Produção de poliedros com VEC (Passagem 2).

A) Produção de poliedros em células Sf9 (HyClone + 5%SFB) B) Produção de poliedros em células Sf21 (HyClone + 5%SFB)



Tabela 5.1 – Resultados dos ajustes a curva de produção de poliedros (células Sf9 e Sf21)

Células Sf9

Produção Volumétrica de Poliedros Produção Específica de Poliedros

R2 = 0,99985 R2 = 0,99988 *A1 = -0,00022 ± 0,05845 *A1 = 1,22789 ± 4,0767 *A2 = 5,00658 ± 0,03415 *A2 = 399,63782 ± 2,36968 *X0 = 129,29468 ± 0,70899 *X0 = 129,0107 ± 0,61954 *dx = 20,45171± 0,70236 *dx = 20,06974 ± 0,60911

Células Sf21


R2 = 0,99596 R2 = 0,99181 *A1 = 0,0574 ± 0,15746 *A1 = 16,71736 ± 18,77961 *A2 = 2,50065 ± 0,06524 *A2 = 299,89875 ± 6,13494 *X0 = 118,38515 ± 3,40264 *X0 = 117,93496 ± 3,43472 *dx = 17,12589 ± 3,00047 *dx = 14,70963 ± 2,87298

*Parâmetros ajustados da Equação de Boltzmann,

Tabela 5.2. Resultado da ANOVA para a produção volumétrica de poliedros

Células Média Variância N

SF9 4,69852x108 8,13091x1014 3

SF21 2,42083x108 5,62994x1013 4

F = 247,71767 p= 1,88282 x10-5

As médias são significativamente diferentes,

com 95% de confiança



Tabela 5.3. Resultado da ANOVA para a produção especifica de poliedros

Célula Média Variância N

SF9 376,23667 469,90243 3

SF21 300,89330 54,55563 3

F = 32,47134 p= 0,00469


com 95% de confiança.



5.4. Produção de poliedros em diferentes concentrações de SFB

A Figura 5.10 mostra a produção de poliedros das células Sf9 infectadas, com o VEC

da terceira passagem, em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) suplementado com 5% e 2,5%

de SFB, respectivamente.

Os resultados demonstraram, para a infecção de cultivos contendo 5% de SFB, Figura

5.10A, uma produção volumétrica de poliedros de 2,4x108 poliedros/mL. Não se observando

diferença significativa em relação à obtida com 2,5% de soro, Figura 5.10B. Pode-se destacar

que a produção volumétrica foi elevada quando comparada com outros sistemas: Lua & Reid,

(2000) com o sistema Helicoverpa armigera NPV em células Helicoverpa zea obtiveram uma

produção máxima de 1,1x108 poliedros/mL; Claus et al.,(1993) com o sistema Anticarsia

gemmatalis NPV em células Spodoptera frugiperda (SF21), atingiram uma produção de

3x107 poliedros/mL; Kariuki; McIntosh, Goodman, (2000) utilizando o sistema Plutella

xylostella MNPV em células Plutella xylostella obtiveram a produção de 2,8x106

poliedros/mL.

A produção específica obtida em meio contendo 5% de SFB foi de 397,79 (± 7,453)

poliedros/célula. Em meio contendo 2,5% de SFB, obteve-se uma produção específica de

264,72 (± 7,721) poliedros/célula, resultados apresentados na Tabela 5.4. Com base nestes

resultados, a produção específica de poliedros utilizando meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM)

+ 5% SFB atingiu uma produtividade superior ao meio suplementado com 2,5% SFB, Tabela

5.4.

No trabalho de Claus et al.(1993), os autores também obtiveram uma produção de

poliedros superior quando utilizaram uma concentração maior de soro adicionado ao meio. Já

no estudo realizado por Chakraborty et al. (1999), os autores analisaram a produção de

poliedros em três diferentes concentrações de SFB e obtiveram resultados diferentes dos

observados neste trabalho. A produção específica de poliedros em meio suplementado com

10% de SFB foi menor do que as produções obtidas em meio com 1% de SFB e no meio

isento de soro. A produção volumétrica de poliedros para o meio isento soro foi superior

quando comparada com a produção volumétrica de poliedros em meio com a adição de soro.

No entanto, a produção volumétrica para 1% e 10% não apresentaram diferenças, atingindo

valores em torno de 4 x 107 poliedros/ml.

Pode-se concluir, que no caso do sistema usado por Chakraborty et al. (1999)

(HaSNPV em células Helicoverpa zea), a adição de soro, independente da concentração, inibe



a produção de poliedros. A maioria dos autores considera a produção específica mais

importante do ponto de vista de produção, provavelmente devido ao fato das células

consumirem mais substrato e, em consequência, o custo de produção seria maior.



A

48 72 96 120 144 1680

1

2

3

4


Tempo (h)

Prod

ução

vol

umét

rica

de p

olie

dros

x 1

08 (pol

iedr

os/m

L)

50

100

150

200

250

300

350

400


B

48 72 96 120 144 168 1920,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0


Tempo (h)

Prod

ução

vol

umét

rica

de p

olie

dros

x 1

08 (pol

iedr

os/m

L)

0

50

100

150

200

250

300


Figura 5.10. Produção de poliedros com VEC (Passagem 3) em células Sf9

A) Produção de poliedros em meio HyClone + 5% SFB B) Produção de poliedros em meio HyClone + 2,5% SFB



Tabela 5.4 – Resultados dos ajustes a curva de produção de poliedros (5% e 2,5%SFB)

HyClone + 5% SFB


R2 = 0.99753 R2 = 0.99724 *A1 = 0.32282 ± 0.14189 *A1 = 49.9056 ± 25.66869 *A2 = 2.43321 ± 0.0428 *A2 = 397.79439 ± 7.47534 *X0 = 76.20365 ± 2.50726 *X0 = 76.05112 ± 2.76678 *dx = 12.29002 ± 2.05993 *dx = 12.58274 ± 2.24645

HyClone + 2,5% SFB


R2 = 0.99527 R2 = 0.99495 *A1 = -0.06521 ± 0.19753 *A1 = -6.35608 ± 22.94554 *A2 = 2.29856 ± 0.06544 *A2 = 264.7257 ± 7.72114 *X0 = 89.79827 ± 4.27426 *X0 = 89.98243 ± 4.32043 *dx = 18.10855 ± 3.5258 *dx = 17.8751 ± 3.58084

*Parâmetros ajustados da Equação de Boltzmann:

Tabela 5.5. Resultado da ANOVA para a produção volumétrica de poliedros

Meio Média Variância N

2,5% SFB 2,40033x108 8,03333x1013 3

5% SFB 2,17750x108 1,79583x1014 4

F = 6,25019 p= 0,05449

As médias não são significativamente

diferentes, com 95% de confiança

Tabela 5.6. Resultado da ANOVA para a produção específica de poliedros

Meio Média Variância N

2,5% SFB 251,13 227,59593 3

5% SFB 392,47 240,11890 4

F = 147,22925 p= 6,71772x10-5


com 95% de confiança



5.5. Cinética de crescimento das células Sf9 e Sf21

Os parâmetros cinéticos tais como: velocidade específica máxima de crescimento das

células não infectadas (µxmáx), velocidade específica máxima de crescimento das células

infectadas (µxmáx*), velocidade específica máxima de consumo de substrato das células não

infectadas (µsmáx), velocidade específica máxima de consumo de substrato das células

infectadas (µsmáx*) e velocidade específica máxima de produção de poliedros (µpmáx) foram

estimados com base nas infecções realizadas com as duas linhagens de células (Sf9 e Sf21) e

em diferentes concentrações de SFB (2,5 e 5%).

A Figura 5.11 apresenta a curva de crescimento das células Sf9 adaptadas ao meio

HyClone suplementado com 5% SFB e variação da concentração de substrato durante o

cultivo, tanto para as células controle, como para as infectadas. Percebe-se que no cultivo das

células controle, estas atingiram um pico de concentração celular de 7,4x106 (± 0,37) células

viáveis/mL e uma concentração final de substrato correspondente de 0,61 (±0,03054) g/L.

Para as células infectadas foi observada uma concentração praticamente constante de 8,5x105

(±0,0425) células viáveis/mL e, como esperado, uma superior concentração final de substrato

de 1,4 (±0,07163) g/L devido à menor quantidade de células viáveis para consumir todo o

substrato (glicose) disponível no meio de cultivo.

0 24 48 72 96 120 144

0

2

4

6

8

Concentração de células não infectadas Concentração de células infectadas Concentração de substrato - glicose das células não infectadas Concentração de substrato - glicose das células infectadas

Tempo (h)

Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0,5

1,0

1,5

2,0

Concentração de substrato - glicose (g/L)

Figura 5.11. Curva de crescimento e consumo de glicose das células Sf9 (HyClone + 5%SFB)



Tabela 5.7. Resultado da regressão linear para as células Sf9 controle (HyClone + 5% SFB)

Parâmetros Valor Erro R

µx (h-1) 0,03264 ±0,00353 0,98293

µs (h-1) -0,00747 ± 0,00176 0,9733

td (h) 21,23613

Tabela 5.8. Resultado da regressão linear para as células Sf9 infectadas (HyClone + 5% SFB)


µx* (h-1) -0,00544 ±0,00233 0,85525

µs* (h-1) 0,00036 ± 8,8527x10-8 1,0

µp (h-1) 0,02926 ±0,00317 0,99419

As Tabelas 5.7 e 5.8 apresentam os resultados das velocidades específicas máximas de

crescimento e de consumo de substrato das células não infectadas e infectadas, como também,

a velocidade específica máxima de produção de poliedros e o tempo de duplicação celular.

Os cálculos das velocidades específicas máximas de crescimento celular, consumo de

substrato e produção de poliedros estão expressos na regressão linear, utilizando o software

Origin 6.0, dos pontos experimentais obtidos da infecção das células Sf9 em meio HyClone

(HyQ SFX-InsectTM) + 5% SFB, Figuras A.10, A.11 e A.12, respectivamente (Anexo).

A Figura 5.12 apresenta os resultados obtidos com uma concentração de 2,5 % SFB.

Nota-se que o crescimento das células controle e infectadas e o consumo de substrato foram

equivalentes ao observado nas células cultivadas em meio contendo 5% de SFB. Atingiu-se

um pico de concentração celular de 6,8x106 (±0,34) células viáveis/mL e concentração final

de substrato de 0,62 (±0,03103) g/L. Para as células infectadas os valores foram 1,8x106

(±0,09) células viáveis/mL para concentração celular e 1,3 (±0,06365) g/L para a

concentração final de substrato.



0 24 48 72 96 120 144

0

2

4

6

8

10


Tempo (h)

Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0,5

1,0

1,5

2,0


Figura 5.12. Curva de crescimento e consumo de glicose das células Sf9 (HyClone +

2,5%SFB)

Tabela 5.9. Resultado da regressão linear para as células Sf9 controle (HyClone + 2,5% SFB)


µx (h-1) 0,03229 ± 0,00444 0,98162

µs (h-1) -0,00632 ± 0,00164 0,96804

td (h) 21,46631

Tabela 5.10. Resultado da regressão linear para as células Sf9 infectadas (HyClone + 2,5%

SFB)


µx* (h-1) -0,00252 ± 0,00307 0,63407

µs* (h-1) -0,00186 ± 0,00153 0,77409

µp (h-1) 0,02405 ± 0,0022 0,99583

Os ajustes para os cálculos das velocidades específicas de crescimento, consumo de



substrato, produção de poliedros para as células Sf9 (não infectadas e infectadas) cultivadas

em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) com 2,5% de SFB estão apresentados nas Figuras

A.13, A.14 e A15 (Anexo).

Para a linhagem de célula (Sf21) foi observado, conforme a Figura 5.13, um pico de

concentração celular de 1x107 (±0,5) células viáveis/mL e concentração final de substrato

igual ao apresentado na célula Sf9, 0,64 (±0,03223)g/L. Para as células infectadas observou-

se uma concentração de 9,4x105 (±0,047) células viáveis/mL e uma concentração final de

substrato de 1,4 (±0,07078) g/L.

0 24 48 72 96 120 144

0

2

4

6

8

10


Tempo (h)

Con

cent

raçã

o ce

lula

r x 1

06 (cél

ulas

viá

veis

/mL)

0,5

1,0

1,5

2,0


Figura 5.13. Curva de crescimento e concentração de glicose das células Sf21 em meio

HyClone + 5%SFB

Tabela 5.11. Resultado do ajuste linear para as células Sf21 controle (HyClone + 5% SFB)


µx (h-1) 0,03582 ±0,00316 0,99232

µs (h-1) -0,00496 ± 0,00262 0,80134

td (h) 19,35084



Tabela 5.12. Resultado do ajuste linear para as células Sf21 infectadas (HyClone + 5% SFB)


µx* (h-1) -0,00329 ±0,00609 0,35677

µs* (h-1) -0,00107 ± 0,00294 0,2495

µp (h-1) 0,01962 ±0,00265 0,99097

Com base na regressão linear foram ajustados os parâmetros cinéticos para a infecção

das células Sf21 com o VEC da terceira passagem em meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM) +

5% SFB, Figuras A.16, A.17 e A.18 (Anexo).

Os resultados apresentados nas Tabelas 5.8 e 5.11 mostraram que as velocidades

máximas específicas de crescimento celular são equivalentes, portanto, o crescimento e o

tempo de duplicação celular estão de acordo como o crescimento das células Sf9 e Sf21,

citado anteriormente no item 2.1.1, demonstrando a adaptação das células às condições de

cultivo.

Tabela 5.13. Parâmetros cinéticos para as células Sf9 e Sf21.

Células SFB

(%)

µxmáx

(h-1)

µsmáx

(h-1)

µpmáx

(h-1)

Sf9 5 0,03264 -0,00747 -

Sf9* 5 -0,00544 0,00036 0,02926

Sf9 2,5 0,03229 -0,00632 -

Sf9* 2,5 -0,00252 -0,00186 0,02405

Sf21 5 0,03582 -0,00496 -

Sf21* 5 -0,00329 -0,00107 0,01962 * Célula infectada

A velocidade específica máxima de crescimento das células Sf9 infectadas em meio

contendo 5% de soro obteve um valor superior aos apresentados pelas células Sf9 infectadas

em meio contendo 2,5% de soro e Sf21 infectadas em meio contendo 5% de soro. Nota-se que

os valores para as velocidades específicas máximas de crescimento das células infectadas são

negativos, pois as células não conseguem entrar na fase exponencial. A dinâmica de

crescimento é invertida, ao invés de produzir proteínas necessárias para o seu crescimento, as

células são utilizadas para expressar as proteínas necessárias para a replicação viral.



A velocidade específica máxima de produção de poliedros (µpmáx) das células Sf9 e

Sf21 apresentou valores distintos, resultados que podem ser comparados pela Tabela 5.13. As

células Sf9 apresentaram uma velocidade máxima específica de produção de poliedros maior

do que as células Sf21, confirmando que as células Sf9 são melhores produtoras de poliedros

que a Sf21.

5.6. Passagem seriada com SfMNPV

A Figura 5.14 mostra as curvas de crescimento das células controle e infectadas, assim

como os dados de viabilidade destas células das passagens 1 a 7.

A primeira passagem já foi descrita anteriormente, item 5.2. Nas demais passagens, o

vírus extracelular foi coletado após 72/96 h.p.i., tempo no qual houve um decréscimo na

concentração celular, indicando uma alta MOI que é ideal para passagem subsequente.

Figura 5.14. Passagem seriada em células Sf9 (HyClone + 5%SFB)

A Figura 5.15 apresenta a produção específica de poliedros (poliedros/célula).Os

resultados mostram um pico de produção específica de 399 poliedros/célula, esta

produtividade é superior quando comparada a outros sistemas de produção in vitro de

baculovírus, tais como: Helicoverpa armigera SNPV em células de Helicoverpa zea– 222



poliedros/célula (Lua et al., 2002); Trichoplusia ni NPV em células Trichoplusia ni – 70

poliedros/célula (Potter; Faulkner; Mackinnon, 1976) e Lymantria dispar MNPV em células

Lymantria díspar – 57 poliedros/célula (Slavicek et al., 1996).

Durante a passagem do vírus em cultivo de células, várias alterações podem ocorrer no

genoma viral e acumular em cada passagem (Chakraborty & Reid, 1999). Uma destas

alterações é o acúmulo de mutantes FP (Few Polyhedra). A característica mais marcante do

fenótipo FP é o rápido declínio na produção de poliedros (Pedrini et al., no prelo)

No sistema utilizado neste estudo, foi observado o efeito de passagem devido à

redução de 399 a 109 no número de poliedros produzidos durante sete passagens do SfMNPV

(Isolado 18) em células Sf9. Mesmo assim, apresentou uma elevada produtividade em relação

aos sistemas citados anteriormente, onde apresentaram as seguintes reduções: Helicoverpa

armigera SNPV em células de Helicoverpa zea– 222 a 2 poliedros/célula em seis passagens

(Lua et al., 2002) e Lymantria dispar MNPV em células Lymantria díspar – 57 a 35

poliedros/célula em cinco passagens (Slavicek et al., 1996).

Além da performance em relação à produtividade, o SfMNPV (Isolado18) parece

apresentar uma maior estabilidade. No trabalho realizado por Pedrini; Wolff; Reid, (2004) foi

utilizado um isolado de SfMNPV (SfMNPV – SL) onde mostrou uma rápida geração de

mutantes FP. Após somente duas passagens em cultura de células, os autores observaram que

a maioria das células já demonstrava o fenótipo FP. Como foi citado anteriormente, e apesar

dos autores não apresentarem dados de produtividade, a geração de mutantes FP é um

indicativo da diminuição desta produtividade. Já para o Isolado 18 esta redução foi observada

a partir da quarta passagem. Isto pode ser explicado pela variação genotípica existente entre

isolados de um mesmo baculovírus que é causado pela recombinação destes vírus. A

recombinação é um importante mecanismo no aumento da variabilidade genotípica do vírus

no campo (Pereira et al., 2002; Ribeiro; Pavan; Muotri, 1997).

Observa-se ainda, Figura 5.15, um aumento na produção específica de poliedros (190

para 400 poliedros/célula) entre a primeira e a segunda passagens e uma redução (400 para

250 poliedros/célula) entre a terceira e quarta passagens do baculovirus SfMNPV. O aumento

foi devido à forma viral utilizada na infecção em cultivo de células. Para a primeira passagem

utilizava-se o VDP do baculovirus SfMNPV, enquanto a segunda passagem utilizava-se o

VEC retirado da primeira passagem, confirmando que o virus extracelular é mais eficiente em

cultivo de células do que o virus derivado de poliedros. A redução observada a partir da

quarta passagem foi devido à formação de mutantes FP ou DIPs.



1 2 3 4 5 6 70

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Polie

dros

/cél

ula

Número de passagens Produção específica de poliedros

Figura 5.15. Produção específica de poliedros em células Sf9 (HyClone + 5%SFB)

Para obter-se uma boa produção de virus é necessário uma concentração celular de

1x107células/mL como descrito por Greenfield et al. (1999), concentrações superiores a esta,

o custo de substrato para produzir as células se torna excessivo.

Considerando a concentração celular de 1x107 células/mL e a produção de 400

poliedros/célula obtidos na terceira passagem do virus SfMNPV, Figura 5.15, obtêm-se 4x109

poliedros/mL, ou seja, 4x1012 poliedros por litro de suspensão. Para pulverizar 1 hectare são

necessários 8,75x1011 poliedros de SfMNPV (Valicente & Cruz, 1991), ou seja, 0,22 litros de

baculovírus por hectare de cultura de milho. Portanto, com um litro de baculovirus pode-se

tratar 4 hectares de área cultivada.

O custo de produção do baculovírus SfMNPV não se pode estimar pois o mesmo foi

utilizado somente experimentalmente no campo. Mas, admitindo as mesmas condições de

produção que foram utilizadas para o HaSNPV (Greenfield et al., 1999), este produto pode ser

produzido por US$15-20/ha.


Capítulo 6

Conclusões

___________________________________________________________________________ Conclusões

As linhagens Sf9 e Sf21 adaptaram-se ao meio HyClone (HyQ SFX-InsectTM)

suplementado com 5 e 2,5% de SFB em 50 passagens. A adaptação ao meio HyClone (HyQ

SFX-InsectTM) sem suplementação de SFB não foi bem sucedida, pois, estas linhagens não

conseguiram atingir a fase exponencial de crescimento celular.

A infecção preliminar realizada constatou uma potencial viabilidade na produção in

vitro do vírus SfMNPV em cultivo submerso a partir do Isolado 18. Diante deste resultado, a

realização da comparação de produção de poliedros em células Sf9 e Sf21 foi oportuna para o

andamento dos demais experimentos.

As células Sf9 produziram 2 vezes mais poliedros por mL de suspensão e 1,3 vezes

mais poliedros/célula do que as células Sf21. As células Sf9 foram escolhidas para os

experimentos de infecção celular, conseqüentemente, para a produção in vitro dos vírus

SfMNPV.

A comparação da produção de poliedros de SfMNPV em meio HyClone (HyQ SFX-

InsectTM) com concentrações de 5 e 2,5% SFB obteve uma resposta contrária à maioria dos

sistemas de produção in vitro de baculovírus estudados. Neste estudo, a produção de poliedros

foi maior em cultivos com maior concentração de SFB, ou seja, o cultivo onde se utilizou 5%

de SFB obteve-se uma produção de 397 poliedros/célula e 2,5x108 poliedros/mL enquanto

que no cultivo com 2,5% de SFB obteve-se 264 poliedros/célula e 2,3x108 poliedros/mL.

Alguns parâmetros cinéticos foram estimados para os cultivos com as células Sf9 e

Sf21 contendo 5 e 2,5% de SFB no meio. As velocidades específicas máximas de crescimento

celular para as duas linhagens de células cultivadas foram equivalentes: µxmáx = 0,03264 h-1

para Sf9 em 5% SFB, µxmáx = 0,03229 h-1 para Sf9 em 2,5% SFB e µxmáx = 0,03582 h-1 para

Sf21. Porém, apresentaram diferentes velocidades especificas máximas de produção de

poliedros: µpmáx = 0,02926h-1 para Sf9 em 5% SFB, µpmáx = 0,02405h-1 para Sf9 em 2,5% SFB

e µpmáx = 0,01962 h-1 para Sf21. O que justifica a melhor produção de poliedros pela linhagem

Sf9.

No sistema utilizado neste estudo, observou-se, através da passagem seriada do

SfMNPV, uma elevada produtividade em relação a outros sistemas de produção in vitro de

baculovírus, mesmo após sete passagens sucessivas. Verificada esta produtividade, é

conveniente otimizar o processo de produção in vitro deste baculovírus.


Capítulo 7

Referências bibliográficas

___________________________________________________________________________ Referências bibliográficas

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Anexos

__________________________________________________________________________________________ Anexos

Figura A.1. Fluxograma para a adaptação das células ao cultivo em suspensão.

Figura A.2. Fluxograma para infecção preliminar com SfMNPV.

_______________________________________________________________________________________ 75Andréa Farias de Almeida, abril/2005

__________________________________________________________________________________________ Anexos

Figura A.3. Fluxograma para infecção com VDP do SfMNPV.

Figura A.4. Fluxograma para a contagem de poliedros.


__________________________________________________________________________________________ Anexos

Tabela A.1 – Pontos experimentais da infecção das células Sf9 com a 2ª passagem SfMNPV

(HyClone + 5% SFB)

Infecção em

triplicata

Pico de concentração das células infectadas x 106

(células/mL)

Produção volumétrica de poliedros x 108

(poliedros/mL)


1 1,3 (± 0,195)* 3,6 (± 0,756) ** 276,9 (± 58,149) **

2 1,1 (± 0,165)* 5,4 (± 1,134) ** 490,9 (± 103,1) **

3 1,3 (± 0,195)* 5,8 (± 1,218) ** 446,2 (± 93,7) **

média 1,2 (± 0,180)* 4,9 (± 1,029) ** 404,7 (± 60,7) **

*Erro relativo ± 15% **Erro relativo ± 21%


(HyClone + 5% SFB)

Infecção em

triplicata


(células/mL)


(poliedros/mL)


1 1,0 (± 0,150)* 2,6 (± 0,546) ** 260 (± 54,6) **

2 0,75 (± 0,1125)* 2,6 (± 0,546) ** 347 (± 52,0) **

3 0,7 (± 0,105)* 2,1 (± 0,441) ** 300 (± 63,0) **

média 0,82 (± 0,1225)* 2,4 (± 0,365) ** 292,2 (± 61,5) **



(HyClone + 5% SFB)

Infecção em

triplicata


(células/mL)


(poliedros/mL)


1 0,61 (± 0,0915)* 2,6 (± 0,546) ** 426,2 (± 89,5) **

2 0,56 (±0,084)* 2,4 (± 0,504) ** 428,6 (± 90,0) **

3 0,66 (± 0,099)* 2,4 (± 0,504) ** 363,6 (± 76,4) **

média 0,61 (± 0,0915)* 2,5 (± 0,518) ** 409,8 (± 86,1) **



__________________________________________________________________________________________ Anexos


(HyClone + 2,5% SFB)

Infecção em

triplicata


(células/mL)


(poliedros/mL)


1 0,91 (± 0,1365)* 2,3 (± 0,483) ** 252,7 (± 53,1) **

2 0,85 (± 0,1275)* 2,4 (± 0,504) ** 282,4 (± 59,3) **

3 0,85 (± 0,1275)* 2,1 (± 0,441) ** 247,1 (± 51,9) **

média 0,87 (± 0,1305)* 2,3 (± 0,476) ** 264,4 (± 55,5) **



(HyClone + 5% SFB)

Infecção em

duplicata


(células/mL)


(poliedros/mL)


1 0,75 (± 0,1125) * 2,1 (± 0,441) ** 280 (± 58,8) **

2 0,81 (± 0,1215) * 2,0 (± 0,420) ** 246,9 (± 51,9) **

média 0,78 (± 0,1700) * 2,05 (± 0,4305) ** 262,8 (± 55,2) **



(HyClone + 5% SFB)

Infecção em

duplicata


(células/mL)


(poliedros/mL)


1 1,5 (± 0,225) * 2,5 (± 0,525) ** 166,7 (± 35,0) **

2 1,4 (± 0,21) * 2,5 (± 0,525) ** 178,6 (± 37,5) **

média 1,45 (± 0,2175) * 2,5 (± 0,525) ** 172,4 (± 36,2) **



__________________________________________________________________________________________ Anexos


(HyClone + 5% SFB)

Infecção em

duplicata


(células/mL)


(poliedros/mL)


1 0,79 (± 0,1185) * 1,4 (± 0,294) ** 177,2 (± 37,21) **

2 0,72 (± 0,108) * 1,5 (± 0,315) ** 208,3 (± 43,75) **

média 0,76 (± 0,11325) * 1,45 (± 0,3045) ** 190,8 (± 40,07) **



(HyClone + 5% SFB)

Infecção em

duplicata


(células/mL)


(poliedros/mL)


1 1,8 (± 0,27)* 1,3 (± 0,273)** 72,22 (± 15,17) **

2 1,6 (± 0,24)* 1,2 (± 0,252) ** 75 (± 15,75) **

média 1,7 (± 0,255)* 1,25 (± 0,2625) ** 73,53 (± 15,4) **


Tabela A.9 – Pontos experimentais para a construção da curva de calibração da glicose

ABS 1

ABS 2

ABS (Med)

Conc (mg/mL)

0,019 0,02 0,0195 0,1 0,073 0,072 0,0725 0,2 0,123 0,127 0,1250 0,3 0,179 0,168 0,1735 0,4 0,233 0,244 0,2385 0,5 0,267 0,266 0,2665 0,6 0,325 0,328 0,3265 0,7 0,377 0,363 0,3700 0,8 0,428 0,414 0,4210 0,9 0,463 0,416 0,4395 1


__________________________________________________________________________________________ Anexos

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,50,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Curva de Calibração da Glicose

Abs

orbâ

ncia

(AB

S)

Concentração de Glicose (mg/mL)

Figura A.5 – Curva de Calibração da Glicose

Regressão Linear : Y = A + B * X Parâmetro Valor Erro ------------------------------------------------------------ A 0,04263 0,01539 B 2,06877 0,05464 ------------------------------------------------------------ R = 0,99722


__________________________________________________________________________________________ Anexos

Tabela A.10 – Pontos experimentais para o cálculo dos parâmetros cinéticos das células Sf9

(HyClone + 5% SFB)

tempo (h)

Abs 1

Abs 2

Abs média

Glicose g/L diluição C. glic

g/L 0 0,409 0,319 0,364 0,155344 10 1,55343524 0,395 0,394 0,395 0,170087 10 1,70086648 0,32 0,312 0,316 0,132141 10 1,32141372 0,292 0,285 0,289 0,118848 10 1,18848496 0,241 0,236 0,239 0,094679 10 0,946794120 0,233 0,234 0,234 0,092263 10 0,922626C

élul

as C

ontro

le

144 0,168 0,17 0,169 0,061085 10 0,610846

tempo (h)

Abs 1

Abs 2

Abs média


g/L 0 0,336 0,339 0,338 0,142534 10 1,42534024 0,458 0,388 0,423 0,183863 10 1,83862948 0,316 0,335 0,326 0,136733 10 1,36733472 0,395 0,347 0,371 0,158727 10 1,58727296 0,361 0,332 0,347 0,146884 10 1,468844120 0,357 0,366 0,362 0,154135 10 1,541351C

élul

as In

fect

adas

144 0,347 0,331 0,339 0,143259 10 1,432590


(HyClone + 2,5% SFB)

tempo (h)

Abs 1

Abs 2

Abs média


g/L 0 0,342 0,342 0,342 0,144709 10 1,44709224 0,399 0,416 0,408 0,176371 10 1,76370548 0,339 0,332 0,336 0,141567 10 1,41567272 0,315 0,309 0,312 0,130208 10 1,30207896 0,245 0,25 0,248 0,09903 10 0,990299120 0,235 0,241 0,238 0,094438 10 0,944378C

élul

as c

ontro

le

144 0,171 0,171 0,171 0,062051 10 0,620514

tempo (h)

Abs 1

Abs 2

Abs média


g/L 0 0,336 0,347 0,342 0,144467 10 1,44467524 0,394 0,392 0,393 0,169362 10 1,69361548 0,292 0,326 0,309 0,128758 10 1,28757772 0,348 0,378 0,363 0,15486 10 1,54860196 0,327 0,323 0,325 0,136492 10 1,364917120 0,332 0,339 0,336 0,141567 10 1,415672C

élul

as In

fect

adas

144 0,304 0,308 0,306 0,127308 10 1,273075


__________________________________________________________________________________________ Anexos


(HyClone + 5% SFB)

tempo (h)

Abs 1

Abs 2

Abs média


g/L 0 0,35 0,338 0,344 0,145676 10 1,45675924 0,389 0,397 0,393 0,169362 10 1,69361548 0,274 0,324 0,299 0,123924 10 1,23923972 0,349 0,33 0,340 0,143501 10 1,43500796 0,261 0,273 0,267 0,108456 10 1,084557120 0,227 0,231 0,229 0,090087 10 0,900873C

élul

as C

ontro

le

144 0,173 0,179 0,176 0,064468 10 0,644683

tempo (h)

Abs 1

Abs 2

Abs média


g/L 0 0,344 0,36 0,352 0,149543 10 1,49543024 0,38 0,395 0,388 0,166703 10 1,66702948 0,268 0,33 0,299 0,123924 10 1,23923972 0,369 0,374 0,372 0,158969 10 1,58968996 0,332 0,336 0,334 0,140842 10 1,408421120 0,299 0,363 0,331 0,139392 10 1,393920C

élul

as In

fect

adas

144 0,349 0,323 0,336 0,141809 10 1,418089

0 24 48 72 96 120 144 168 192 2160

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Concentração das células não infectadas Concentração das células infectadas Viabilidade das células não infectadas Viabilidade das células infectadas

Tempo (h)

Cél

uas

viáve

is x

106 (c

élul

as/m

L)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Curva de Crescimento Celular - Sf9 - P2 (HyClone + 5% SFB)

Viabilidade (%)

Figura A.6. Curva de crescimento das células Sf9 infectadas com VEC – P2 (SfMNPV)


__________________________________________________________________________________________ Anexos

0 24 48 72 96 120 144 168 192 2160

2

4

6

8

10

12



Tempo (h)

Cél

ulas

viá

veis

x 1

06 /mL

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

Figura A.7. Curva de crescimento das células Sf21 infectadas com VEC – P2 (SfMNPV)

0 24 48 72 96 120 144 1680

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Curva de Crescimento Celular - Sf9 - P3 (HyClone + 2,5% SFB)


Tempo (h)

Cél

ulas

viá

veis

x 1

06 /mL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

Figura A.8. Curva de crescimento das células Sf9 infectadas com VEC – P3 (SfMNPV) –

(HyClone + 2,5%SFB)


__________________________________________________________________________________________ Anexos

0 24 48 72 96 120 1440

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10



Tempo (h)

Cél

ulas

viá

veis

x 1

06 /mL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Viabilidade (%)

Figura A.9. Curva de crescimento das células Sf9 infectadas com VEC – P3 (SfMNPV) –

(HyClone + 5% SFB)


__________________________________________________________________________________________ Anexos

Tabela A.6 - Ajustes para a curva de produção específica de poliedros em células Sf21 (HyClone + 5% SFB)

72 28,66118 75,25424 31,46461 78,50847 34,88198 81,76271 39,02545 85,01695 44,0167 88,27119 49,98231 91,52542 57,0461 94,77966 65,31818 98,0339 74,88062 101,2881 85,77068 104,5424 97,96351 107,7966 111,3577 111,0509 125,7676 114,3051 140,9261 117,5593 156,5003 120,8136 172,1183 124,0678 187,4043 127,322 202,0134 130,5763 215,6617 133,8305 228,1439 137,0848 239,3395 140,339 249,2071 143,5932 257,7712 146,8475 265,1049 150,1017 271,3133 153,3559 276,5182 156,6102 280,8463 159,8644 284,421 163,1186 287,3568 166,3729 289,7568

_______________________________________________________________________________________ 85

169,6271 291,7115 172,8814 293,2985 176,1356 294,5839 179,3898 295,6228 182,6441 296,4611 185,8983 297,1368 189,1525 297,6806 192,4068 298,1181 195,661 298,4697 198,9153 298,7522 202,1695 298,979 205,4237 299,1611 208,678 299,3072 211,9322 299,4244 215,1864 299,5184 218,4407 299,5938 221,6949 299,6543 224,9492 299,7028 228,2034 299,7416 231,4576 299,7728 234,7119 299,7978 237,9661 299,8178 241,2203 299,8339 244,4746 299,8468 247,7288 299,8571 250,9831 299,8654 254,2373 299,872 257,4915 299,8773 260,7458 299,8816

264 299,885


__________________________________________________________________________________________ Anexos

Tabela A.7 - Ajustes para a curva de produção volumétrica de poliedros em células Sf21 (HyClone + 5% SFB)

72 0,21004 74,44068 0,23176 76,88136 0,25629 79,32203 0,28393 81,76271 0,31496 84,20339 0,3497 86,64407 0,3884 89,08475 0,43134 91,52542 0,47874 93,9661 0,53077 96,40678 0,58754 98,84746 0,64908 101,2881 0,7153 103,7288 0,78602 106,1695 0,86092 108,6102 0,93956 111,0509 1,02137 113,4915 1,10567 115,9322 1,19169 118,3729 1,27859 120,8136 1,36549 123,2542 1,45153 125,6949 1,53585 128,1356 1,61769 130,5763 1,69636 133,017 1,7713 135,4576 1,84206 137,8983 1,90833 140,339 1,96991 142,7797 2,02674

______________________________________________________________________________________ 86

145,2203 2,07881 147,661 2,12626 150,1017 2,16924 152,5424 2,20799 154,9831 2,24276 157,4237 2,27383 159,8644 2,3015 162,3051 2,32607 164,7458 2,3478 167,1864 2,36699 169,6271 2,3839 172,0678 2,39876 174,5085 2,4118 176,9492 2,42323 179,3898 2,43323 181,8305 2,44197 184,2712 2,4496 186,7119 2,45626 189,1525 2,46206 191,5932 2,46712 194,0339 2,47152 196,4746 2,47535 198,9153 2,47868 201,3559 2,48157 203,7966 2,48409 206,2373 2,48628 208,678 2,48818 211,1186 2,48983 213,5593 2,49126

216 2,4925


__________________________________________________________________________________________ Anexos


72 23,20697 74,44068 25,87334 76,88136 28,83946 79,32203 32,13303 81,76271 35,78286 84,20339 39,81846 86,64407 44,26962 89,08475 49,16579 91,52542 54,53538 93,9661 60,40486 96,40678 66,79781 98,84746 73,73379 101,2881 81,22712 103,7288 89,28562 106,1695 97,90939 108,6102 107,0896 111,0509 116,8077 113,4915 127,0342 115,9322 137,7288 118,3729 148,8403 120,8136 160,3069 123,2542 172,0575 125,6949 184,0132 128,1356 196,0892 130,5763 208,1973 133,017 220,2481 135,4576 232,1542 137,8983 243,8322 140,339 255,2053 142,7797 266,2048

______________________________________________________________________________________ 87

145,2203 276,7718 147,661 286,8582 150,1017 296,4267 152,5424 305,4511 154,9831 313,9155 157,4237 321,8139 159,8644 329,1486 162,3051 335,9294 164,7458 342,1722 167,1864 347,8978 169,6271 353,1308 172,0678 357,8982 174,5085 362,2289 176,9492 366,1524 179,3898 369,6986 181,8305 372,8967 184,2712 375,7753 186,7119 378,3618 189,1525 380,6821 191,5932 382,7607 194,0339 384,6204 196,4746 386,2824 198,9153 387,7661 201,3559 389,0895 203,7966 390,2689 206,2373 391,3193 208,678 392,2542 211,1186 393,0858 213,5593 393,8251

216 394,482


__________________________________________________________________________________________ Anexos


72 0,28639 74,44068 0,3204 76,88136 0,35813 79,32203 0,39992 81,76271 0,44611 84,20339 0,49707 86,64407 0,55313 89,08475 0,61466 91,52542 0,68198 93,9661 0,7554 96,40678 0,83519 98,84746 0,92159 101,2881 1,01474 103,7288 1,11474 106,1695 1,22158 108,6102 1,33514 111,0509 1,45519 113,4915 1,58139 115,9322 1,71326 118,3729 1,85018 120,8136 1,99142 123,2542 2,13615 125,6949 2,28343 128,1356 2,43226 130,5763 2,58159 133,017 2,73036 135,4576 2,87754 137,8983 3,02211 140,339 3,16316 142,7797 3,29984

145,2203 3,43143 147,661 3,55733

150,1017 3,67707 152,5424 3,7903 154,9831 3,8968 157,4237 3,99645 159,8644 4,08926 162,3051 4,17532 164,7458 4,25479 167,1864 4,3279 169,6271 4,39492 172,0678 4,45616 174,5085 4,51196 176,9492 4,56267 179,3898 4,60864 181,8305 4,65022 184,2712 4,68775 186,7119 4,72157 189,1525 4,752 191,5932 4,77934 194,0339 4,80387 196,4746 4,82585 198,9153 4,84553 201,3559 4,86312 203,7966 4,87885 206,2373 4,89289 208,678 4,90542

211,1186 4,9166 213,5593 4,92656

216 4,93543

______________________________________________________________________________________ 88Andréa Farias de Almeida, abril/2005

__________________________________________________________________________________________ Anexos


48 83,70201 50,0339 88,96552 52,0678 94,93125 54,10169 101,6555 56,13559 109,1873 58,16949 117,565 60,20339 126,811 62,23729 136,9282 64,27119 147,8951 66,30508 159,6626 68,33898 172,1519 70,37288 185,2547 72,40678 198,8349 74,44068 212,7338 76,47458 226,7767 78,50847 240,7815 80,54237 254,5682 82,57627 267,9677 84,61017 280,83 86,64407 293,0303 88,67797 304,4722 90,71186 315,0896 92,74576 324,8452 94,77966 333,7281 96,81356 341,7498 98,84746 348,94 100,8814 355,3419 102,9153 361,0081 104,9492 365,9968 106,9831 370,3686

109,017 374,1842 111,0509 377,5026 113,0848 380,3796 115,1186 382,8673 117,1525 385,0134 119,1864 386,861 121,2203 388,4491 123,2542 389,8119 125,2881 390,98 127,322 391,98 129,3559 392,8355 131,3898 393,5666 133,4237 394,1911 135,4576 394,7242 137,4915 395,179 139,5254 395,5668 141,5593 395,8975 143,5932 396,1793 145,6271 396,4194 147,661 396,6239 149,6949 396,7981 151,7288 396,9465 153,7627 397,0728 155,7966 397,1803 157,8305 397,2718 159,8644 397,3497 161,8983 397,416 163,9322 397,4724 165,9661 397,5204

168 397,5613


__________________________________________________________________________________________ Anexos


48 0,51603 50,0339 0,5471 52,0678 0,5825 54,10169 0,6226 56,13559 0,66773 58,16949 0,71818 60,20339 0,77412 62,23729 0,83561 64,27119 0,90254 66,30508 0,97465 68,33898 1,05146 70,37288 1,1323 72,40678 1,2163 74,44068 1,30246 76,47458 1,38964 78,50847 1,47667 80,54237 1,56236 82,57627 1,64561 84,61017 1,72545 86,64407 1,80107 88,67797 1,87184 90,71186 1,93734 92,74576 1,99735 94,77966 2,05182 96,81356 2,10083 98,84746 2,14459 100,8814 2,1834 102,9153 2,21761 104,9492 2,2476 106,9831 2,27377

_______________________________________________________________________________________ 90

109,017 2,29651 111,0509 2,31621 113,0848 2,33321 115,1186 2,34784 117,1525 2,36041 119,1864 2,37119 121,2203 2,38041 123,2542 2,38829 125,2881 2,39502 127,322 2,40075 129,3559 2,40564 131,3898 2,4098 133,4237 2,41333 135,4576 2,41634 137,4915 2,4189 139,5254 2,42107 141,5593 2,42291 143,5932 2,42447 145,6271 2,4258 147,661 2,42693 149,6949 2,42788 151,7288 2,42869 153,7627 2,42938 155,7966 2,42996 157,8305 2,43046 159,8644 2,43088 161,8983 2,43123 163,9322 2,43153 165,9661 2,43179

168 2,432


__________________________________________________________________________________________ Anexos

Tabela A.12 - Ajustes para a curva de produção específica de poliedros em células Sf9 (HyClone + 2,5% SFB)

48 17,27487 50,44068 20,391 52,88136 23,86784 55,32203 27,73359 57,76271 32,01501 60,20339 36,73637 62,64407 41,91815 65,08475 47,57564 67,52542 53,7174 69,9661 60,34374 72,40678 67,44535 74,84746 75,00209 77,28814 82,9822 79,72881 91,34197 82,16949 100,0261 84,61017 108,9687 87,05085 118,0951 89,49153 127,3238 91,9322 136,5697 94,37288 145,7473 96,81356 154,7732 99,25424 163,5698 101,6949 172,0674 104,1356 180,2061 106,5763 187,9376 109,017 195,2254 111,4576 202,0446 113,8983 208,3818 116,339 214,2335 118,7797 219,6051

______________________________________________________________________________________ 91

121,2203 224,5095 123,661 228,9652 126,1017 232,995 128,5424 236,625 130,9831 239,8828 133,4237 242,797 135,8644 245,3961 138,3051 247,7083 140,7458 249,7603 143,1864 251,5777 145,6271 253,1843 148,0678 254,6023 150,5085 255,8521 152,9492 256,9521 155,3898 257,9193 157,8305 258,7689 160,2712 259,5146 162,7119 260,1685 165,1525 260,7416 167,5932 261,2435 170,0339 261,683 172,4746 262,0675 174,9153 262,4039 177,3559 262,698 179,7966 262,9551 182,2373 263,1798 184,678 263,3761 187,1186 263,5476 189,5593 263,6974

192 263,8282


__________________________________________________________________________________________ Anexos

Tabela A.13 - Ajustes para a curva de produção volumétrica de poliedros em células Sf9 (HyClone + 2,5% SFB)

48 0,14858 50,44068 0,17628 52,88136 0,20711 55,32203 0,24131 57,76271 0,27909 60,20339 0,32066 62,64407 0,36617 65,08475 0,41575 67,52542 0,46945 69,9661 0,52726 72,40678 0,58908 74,84746 0,65473 77,28814 0,72393 79,72881 0,79629 82,16949 0,87134 84,61017 0,94852 87,05085 1,02719 89,49153 1,10666 91,9322 1,18623 94,37288 1,26517 96,81356 1,34279 99,25424 1,41843 101,6949 1,49151 104,1356 1,56155 106,5763 1,62812 109,017 1,69093 111,4576 1,74976 113,8983 1,80449 116,339 1,8551 118,7797 1,90163

______________________________________________________________________________________ 92

121,2203 1,94417 123,661 1,98289 126,1017 2,01797 128,5424 2,04962 130,9831 2,07808 133,4237 2,10359 135,8644 2,12638 138,3051 2,1467 140,7458 2,16476 143,1864 2,18079 145,6271 2,19499 148,0678 2,20755 150,5085 2,21863 152,9492 2,22841 155,3898 2,23703 157,8305 2,24461 160,2712 2,25127 162,7119 2,25713 165,1525 2,26227 167,5932 2,26679 170,0339 2,27075 172,4746 2,27422 174,9153 2,27726 177,3559 2,27992 179,7966 2,28226 182,2373 2,2843 184,678 2,28609 187,1186 2,28765 189,5593 2,28902

192 2,29022


__________________________________________________________________________________________ Anexos

0 20 40 60 80 10012,5

13,0

13,5

14,0

14,5

15,0

15,5

16,0

Ln (c

once

ntra

ção

celu

lar)

Tempo (h) Ln (concentração de células não infectadas) Ln (concentração de células infectadas)

Figura A.10. Ln (concentração celular) versus tempo (HyClone+5%SFB)

0 24 48 72 96

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

Ln (c

once

ntra

ção

de s

ubst

rato

)

Tempo (h) Ln (concentração de substrato - células não infectadas) Ln (concentração de substrato - células infectadas)

Figura A.11. Ln (concentração de substrato) versus tempo (HyClone + 5% SFB)


__________________________________________________________________________________________ Anexos

48 72 96 12017,6

17,8

18,0

18,2

18,4

18,6

18,8

19,0

19,2

Ln(C

once

ntra

ção

de p

olie

dros

)

Tempo (h)

Figura A.12. Ln (concentração de poliedros) versus tempo (HyClone+5%SFB)

24 48 72 96 120

13,5

14,0

14,5

15,0

15,5

16,0

Ln (c

once

ntra

ção

celu

lar)

Tempo (h)

Ln (concentração de células não infectadas) Ln (concentração de células infectadas)

Figura A.13 Ln (concentração celular) versus tempo (HyClone + 2,5%SFB)


__________________________________________________________________________________________ Anexos

0 24 48 72 96

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

Ln (c

once

ntra

ção

de s

ubst

rato

)

Tempo (h)

Ln (concentração de substrato - células não infectadas) Ln (concentração de substrato - células infectadas)

Figura A.14. Ln (concentração de substrato) versus tempo (HyClone + 2,5%SFB)

72 96 12017,0

17,5

18,0

18,5

19,0

19,5

Ln(C

once

ntra

ção

de p

olie

dros

)

Tempo (h)

Figura A.15. Ln (concentração de poliedros) versus tempo (HyClone + 2,5%SFB)


__________________________________________________________________________________________ Anexos

0 24 48 72 96 12013,0

13,5

14,0

14,5

15,0

15,5

16,0

Ln (c

once

ntra

ção

celu

lar)

Tempo (h) Ln (concentração de células não infectadas) Ln (concentração de células infectadas)

Figura A.16. Ln (concentração celular) versus tempo (HyClone + 5%SFB)

24 48 72 96 1200,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Ln (c

once

ntra

ção

de s

ubst

rato

)

Tempo (h) Ln (concentração de substrato - células não infectadas) Ln (concentração de substrato - células infectadas)

Figura A.17. Ln (concentração de substrato) versus tempo (HyClone + 5%SFB)


__________________________________________________________________________________________ Anexos

72 96 120 14418,0

18,5

19,0

19,5

Ln(C

once

ntra

ção

de p

olie

dros

)

Tempo (h)

Figura A.18. Ln (concentração de poliedros) versus tempo (HyClone + 5%SFB)


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