dissert_VanessaAlbres.pdf

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO TECNOLGICO

Programa de Ps-Graduao em Engenharia de Alimentos

EESSTTUUDDOO EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL EE MMOODDEELLAAGGEEMM DDOO CCRREESSCCIIMMEENNTTOO DDEE FFUUNNGGOOSS FFIILLAAMMEENNTTOOSSOOSS

TTEERRMMOORRRREESSIISSTTEENNTTEESS EEMM SSUUCCOOSS TTRROOPPIICCAAIISS

Dissertao submetida ao Curso de Ps-Graduao em Engenharia de Alimentos como requisito parcial para obteno do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos.

VANESSA ALBRES BOTELHO DA CUNHA

Orientadora: Profa. Dra. Glucia M. F. Arago Co-orientadora: Profa. Dra. Pilar Rodriguez de Massaguer

Florianpolis, 24 fevereiro de 2003.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO TECNOLGICO

Programa de Ps-Graduao em Engenharia de Alimentos

VANESSA ALBRES BOTELHO DA CUNHA

EESSTTUUDDOO EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL EE MMOODDEELLAAGGEEMM DDOO CCRREESSCCIIMMEENNTTOO DDEE FFUUNNGGOOSS FFIILLAAMMEENNTTOOSSOOSS

TTEERRMMOORRRREESSIISSTTEENNTTEESS EEMM SSUUCCOOSS TTRROOPPIICCAAIISS

Florianpolis, 24 fevereiro de 2003.

Ningum to grande que no possa aprender, nem to pequeno que no

possa ensinar

AGRADECIMENTOS

Meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que de alguma forma

contriburam para a realizao deste trabalho.

Agradeo a Deus, por ter me dado sade e serenidade para cumprir mais

esta etapa da minha vida.

Ao longo deste trabalho aprendi que ao contrrio do que o ser humano pensa,

no temos controle total de nenhuma situao, e que os fungos mudam de

comportamento quando eles querem.

Em especial gostaria de agradecer:

professora Glucia M. F. Arago pela dedicao, amizade e demonstrao

diria de que o aprendizado muito maior quando ensinado com amor;

professora Pilar R. de Massaguer, que mesmo distncia, foi fundamental

para a realizao deste trabalho;

Cludia Alves Costa, pela amizade e responsabilidade com que

desempenhou o seu trabalho;

Ao meu marido Daniel J. da Cunha pelo apoio ao longo do caminho para que

eu pudesse chegar at aqui;

minha famlia, que me alimenta de foras para seguir a diante;

Aos colegas do ENGEBIO;

Aos colegas do ENGEBIO que se tornaram amigos e

Ao CNPq pelo suporte financeiro.

Dedico este trabalho a minha me, Cla Lima

Albres, que me ensina a cada dia uma lio que

no se aprende na escola: VIVER!

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................8 LISTA DE TABELAS .................................................................................................10 NOMENCLATURA ....................................................................................................12 RESUMO....................................................................................................................13 ABSTRACT ...............................................................................................................15 CAPTULO I - INTRODUO 1 INTRODUO .......................................................................................................17 CAPTULO II - REVISO BIBLIOGRFICA 1 MICROBIOLOGIA PREDITIVA ..............................................................................21

1.1 HISTRICO.................................................................................................................. 21 1.2 OBJETIVOS E APLICAES ...................................................................................... 23

2 MODELOS PREDITIVOS.......................................................................................25 2.1 MODELOS PRIMRIOS............................................................................................... 27 2.1.1 O Modelo de Gompertz ............................................................................................. 28 2.2 MODELOS SECUNDRIOS ........................................................................................ 29 2.3 MODELOS TERCIRIOS............................................................................................. 31

3 DETERMINAO DO CRESCIMENTO MICROBIANO.........................................32 3.1 DETERMINAO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS ............................................33

4 MICROBIOLOGIA PREDITIVA X FUNGOS...........................................................34 5 FUNGOS................................................................................................................36

5.1 FUNGOS TERMORRESISTENTES............................................................................. 37 5.1.1 Descrio dos Gneros Byssochlamys e Neosartorya.............................................. 38 5.1.2 Incidncia................................................................................................................... 39 5.1.3 Alimentos Susceptveis Contaminao .................................................................. 40 5.1.4 Conseqncias do Crescimento em Alimentos ......................................................... 41 5.1.5 Controle do Crescimento ........................................................................................... 44 5.1.6 Ativao de Esporos de Fungos................................................................................ 46

CAPTULO III - MATERIAL E MTODOS 1 FUNGOS TERMORRESISTENTES.......................................................................49

1.1 PREPARO DA SUSPENSO DE ASCSPOROS DE B. nivea .................................. 49 1.2 QUANTIFICAO DAS SUSPENSES DE ESPOROS ............................................. 50 1.3 MEIO DE CRESCIMENTO ........................................................................................... 50

2 AVALIAO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS TERMORRESISTENTES..........................................................................................52

2.1 AVALIAO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS TERMORRESISTENTES POR CONTAGEM DE COLNIAS. .......................................... 52 2.2 AVALIAO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS TERMORRESISTENTES POR FILTRAO. .................................................................... 53

3 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO DE N. fischeri e B. nivea .....................................................................................................................55

3.1 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO PELO MTODO GRFICO ........................................................................................................................... 55 3.2 ESTIMATIVA DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO PELO MODELO DE GOMPERTZ ....................................................................................................................... 56

3.3 ESTIMATIVA DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO PELO MODELO DE GOMPERTZ MODIFICADO ............................................................................................... 57 3.4 FRMULAS PARA CALCULAR O ERRO.................................................................... 57

CAPTULO IV - RESULTADOS E DISCUSSO 1 PADRONIZAO DOS SUCOS ............................................................................60 2 QUANTIFICAO DA SUSPENSO DE ESPOROS ............................................61 3 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO DE N. fischeri........62

3.1 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO DE N. fischeri EM SUCO DE ABACAXI, A 30C .....................................................................................62

4 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO DE B. nivea EM SUCOS TROPICAIS .................................................................................................68

4.1 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO DE B. nivea EM SUCO DE ABACAXI A 20C.......................................................................................................... 68 4.2 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO DE B. nivea EM SUCO DE ABACAXI, A 30C......................................................................................................... 73 4.3 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO DE B. nivea EM SUCO DE MARACUJ A 20C...................................................................................................... 79 4.4 DETERMINAO DOS PARMETROS DE CRESCIMENTO DE B. nivea EM SUCO DE MARACUJ A 30C...................................................................................................... 83 4.5 EFEITO DE FATORES AMBIENTAIS NO CRESCIMENTO DE B. nivea ................... 87 4.5.1 Efeito da Temperatura e do Meio de Crescimento na Durao da Fase lag............ 87 4.5.2 Efeito da Temperatura e do Meio de Crescimento na Velocidade Especfica Mxima de Crescimento................................................................................................................... 88 4.5.3 Efeito da Temperatura e do Meio de Crescimento no Aumento Logartmico da Populao........................................................................................................................... 89 4.6 MTODO RPIDO PARA DETERMINAO DO CRESCIMENTO DE B. nivea...................................................................................................................90 4.6.1 Avaliao do Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C pelo Mtodo de Filtrao .............................................................................................................................. 90 4.6.2 Avaliao do Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 20C pelo Mtodo de Filtrao .............................................................................................................................. 92 4.6.3 Avaliao do Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 30C pelo Mtodo de Filtrao ......................................................................................................................... 93 4.6.4 Comparao entre os Parmetros Biolgicos de Crescimento de B. nivea...............95 4.6.5 Determinao da Correlao entre os Mtodos de Contagem e Filtrao.................96

CONCLUSO..........................................................................................................102 SUGESTES..........................................................................................................106 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................107 ANEXO I...................................................................................................................106 ANEXO II..................................................................................................................115 ANEXO III.................................................................................................................11527 ANEXO IV.................................................................................................................11531

Lista de Figuras 8

LISTA DE FIGURAS

Figura 3. 1 - Esquema da Metodologia Utilizada para Avaliao do Crescimento de Fungos Filamentosos Termorresistentes.............................................................................................54 Figura 3.2 - Curva Tpica de Crescimento Microbiano...........................................................55 Figura 4.1 - Determinao Grfica dos Parmetros de Crescimento de N. fischeri em Suco de Abacaxi a 30C (A = Repetio 1, B = Repetio 2)........................63 Figura 4.2 - Modelo de Gompertz Modificado Ajustado s Curvas de Crescimento de N. fischeri em Suco de Abacaxi, a 30C.................................................................................63 Figura 4.3 - Determinao dos Parmetros de Crescimento de B. nivea, em Suco de Abacaxi, a 20C, pelo Mtodo Grfico (A = Repetio 1, B = Repetio 2)..........................69 Figura 4.4 - Modelo de Gompertz Modificado Ajustado s Curvas de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi, a 20C....................................................................................70 Figura 4.5 - Determinao dos Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C, pelo Mtodo Grfico (A - Repetio 1, B - Repetio 2, C - Repetio 3, D - Repetio 4) ...........................................................................................................................75 Figura 4.6 - Modelo de Gompertz Modificado Ajustado s Curvas de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C........................................................................................77 Figura 4.7 Determinao dos Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 20C, pelo Mtodo Grfico (A - Repetio 1, B - Repetio 2) ..........................79 Figura 4.8 - Modelo de Gompertz Modificado Ajustado s Curvas de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 20C......................................................................................80 Figura 4.9 - Determinao dos Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 30C pelo Mtodo Grfico (A - Repetio 1, B - Repetio 2) ...........................83 Figura 4.10 - Modelo de Gompertz Modificado Ajustado s Curvas de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 30C.......................................................................................84 Figura 4.11 - Ajuste do Modelo de Gompertz s Curvas de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C Obtidas por Filtrao.......................................................................91 Figura 4.12 - Ajuste do Modelo de Gompertz s Curvas de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 20C Obtidas por Filtraao.....................................................................93 Figura 4.13 - Ajuste do Modelo de Gompertz s Curvas de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuja a 30C Obtidas por Filtraao.....................................................................94 Figura 4.14 - Ajuste do Modelo de Gompertz aos Dados de log(N/N0) X log (B/B0).............97

Lista de Figuras 9

Figura 4.15 - Comparao entre os Valores de log (N/N0) Observados e Preditos, Contra o Tempo.....................................................................................................................................98 Figura 4.16 - Ajuste do Modelo de Gompertz Modificado aos Novos Dados de Aumento da Populao...............................................................................................................................99 Figura 4.17 - Valores de log (N/N0) Preditos versu Valores de log (N/N0) Observados.......100

Lista de Tabelas 10

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 - Condies para Determinao dos Parmetros de Crescimento de N. fischeri e B. nivea...................................................................................................................................51 Tabela 4.1 - Concentrao das Suspenses de Esporos de N. fischeri e de B. nivea...41 Tabela 4.2 - Parmetros da Curva de Crescimento de N. fischeri em Suco de Abacaxi a 30C (obtidos graficamente)...................................................................................................62 Tabela 4.3 - Parmetros de Crescimento de N. fischeri, em Suco de Abacaxi, a 30C, est imados pelo Modelo de Gompertz Modificado..........................................................64 Tabela 4.4 - Comparao entre os Valores de log (N/N0) de N. fischeri, em Suco de Abacaxi a 30C Preditos Pelo Modelo e os Observados Experimentalmente.................................... 65 Tabela 4.5 - Parmetros de Crescimento de N. fischeri em Suco de Abacaxi, a 30C, Obtidos Graficamente e Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado...........................66 Tabela 4.6 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi, a 20C...........69 Tabela 4.7 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi, a 20C, Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado..................................................................71 Tabela 4.8 - Parmetros de Crescimento de B. nivea, em Suco de Abacaxi, a 20C, Obtidos Graficamente e Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado.........................................71 Tabela 4.9 - Comparao entre os Valores de log (N/N0) de B. nivea em Suco de Abacaxi a 20C, Preditos pelo Modelo e os Observados Experimentalmente........................................72 Tabela 4.10 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C Obtidos Graficamente..........................................................................................................................74 Tabela 4.11 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C, Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado.................................................................77 Tabela 4.12 - Comparao entre os Valores de log (N/N0) de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C Preditos pelo Modelo e os Observados Experimentalmente......................................78 Tabela 4.13 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C Obtidos Graficamente e Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado.........................................79 Tabela 4.14 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 20C Obtidos Graficamente..........................................................................................................................80 Tabela 4.15 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 20C Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado..................................................................81 Tabela 4.16 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj d 20C Obtidos Graficamente e Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado.........................................81

Lista de Tabelas 11

Tabela 4.17 - Comparao entre os Valores de log (N/N0) de B. nivea em Suco De Maracuj a 20C Preditos pelo Modelo e os Observados Experimentalmente......................................82 Tabela 4.18 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 30C Obtidos Graficamente..........................................................................................................................84 Tabela 4.19 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 30C Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado..................................................................85 Tabela 4.20 - Comparao entre os Valores de log (N/N0) de B. nivea em Suco de Maracuj a 30C Preditos pelo Modelo e os Observados Experimentalmente......................................86 Tabela 4.21 - Parmetros de Crescimento de B. nivea, em Suco de Maracuj a 30C, Obtidos Graficamente e Estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado...........................87 Tabela 4.22 - Efeito da Temperatura e do Meio de Crescimento na Durao da Fase Lag, (h), de B. nivea em Sucos de Abacaxi e Maracuj.................................................................88 Tabela 4.23 - Efeito da Temperatura e do Meio de Crescimento na Velocidade Especfica Mxima de Crescimento, (h-1) de B. nivea nos Sucos de Abacaxi e Maracuj..................89 Tabela 4.24 - Efeito da Temperatura e do Meio de Crescimento no Aumento Logartmico da Populao de B. nivea nos Sucos de Abacaxi e Maracuj....................................................89 . Tabela 4.25 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Abacaxi a 30C Estimados pelo Modelo de Gompertz Ajustado s Curvas de Crescimento Obtidas por Filtracao..................................................................................................................................92 Tabela 4.26 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 20C Estimados pelo Modelo de Gompertz Ajustado s Curvas de Crescimento Obtidas por Filtrao..................................................................................................................................93 Tabela 4.27 - Parmetros de Crescimento de B. nivea em Suco de Maracuj a 30C Estimados pelo Modelo de Gompertz Ajustado s Curvas de Crescimento Obtidas por Filtrao..................................................................................................................................94 Tabela 4.28 - Parmetros Biolgicos de Crescimento de B. nivea em Sucos Tropicais Obtidos por Dois Diferentes Mtodos de Avaliao do Crescimento.....................................95 Tabela 4.29 - Valores de log (B/B0) Transformados em log(N/N0).........................................98

Tabela 4.30 - Comparao entre os Parmetros Obtidos Experimentalmente pelo Mtodo de Contagem e os Obtidos pela Correlao.............................................................................100

Nomenclatura 12

NOMENCLATURA

UFC Unidade formadora de colnia

MEA Agar extrato de malte

CYA Agar Czapek extrato de levedura

Velocidade especfica mxima de crescimento Durao da fase lag A Aumento logartmico da populao

D tempo necessrio para reduzir em 90% uma populao inicial de microrganismos

z intervalo de temperatura necessrio para reduzir o valor de D em um dcimo do

valor inicial

N Nmero de microrganismos no tempo t

N0 Nmero inicial de microrganismos

Std. Err. Erro padro

s2 Varincia

n Tamanho da amostra

x Mdia da amostra xm Valor mdio da varivel x

Desvio padro OBS Valor do parmetro microbiolgico observado

PRED Valor predito

Resumo 13

RESUMO

A crescente preocupao da populao com a qualidade de vida e com a sade fez

com que houvesse um aumento no consumo de sucos a base de frutas naturais e

sem conservantes. Os fungos filamentosos termorresistentes so um dos principais

contaminantes de sucos processados termicamente. Estudos sobre a incidncia de

fungos termorresistentes evidenciam que o solo a principal fonte de contaminao

das frutas por estes fungos. Conseqentemente, frutas e vegetais que estiverem em

contato ou prximos do solo so mais susceptveis contaminao por estes

microrganismos que, alm de produzirem enzimas que degradam as frutas e seus

produtos derivados, podem produzir micotoxinas. A elaborao de produtos de frutas

a partir de matria-prima contaminada por esporos termorresistentes compromete a

vida de prateleira do produto, uma vez que este ser deteriorado antes do prazo de

validade previsto, pois estes fungos sobrevivem s temperaturas normais de

pasteurizao e se desenvolvem no produto final. Neste contexto, a microbiologia

preditiva se apresenta como uma ferramenta importante no estudo do crescimento

de vrios microrganismos, como os fungos filamentosos termorresistentes, sendo

que um dos modelos mais utilizados o Modelo de Gompertz Modificado. Este

trabalho teve por objetivo avaliar o crescimento de Byssochlamys fulva e de

Neosartorya fischeri, fungos de reconhecida resistncia trmica, pelo mtodo de

diluio e plaqueamento, em sucos naturais de abacaxi e maracuj, s temperaturas

de 20 e 30C. Foi proposta ainda a avaliao do crescimento destes fungos pelo

mtodo de filtrao, como um mtodo alternativo. Uma comparao entre os

parmetros de crescimento velocidade especfica mxima de crescimento (), durao da fase lag () e aumento logartmico da populao (A) obtidos graficamente e estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado, demonstrou que,

em mdia, a diferena entre os valores obtidos para estes parmetros foi de 36,6%,

15,9% e 8,08%, respectivamente. O Modelo de Gompertz Modificado ajustou-se

bem aos dados experimentais, com coeficientes de correlao que variaram de 0,90

a 0,99. Durante a fase lag, foi observada uma diminuio da populao, o que

dificultou o ajuste do modelo, que no prev este comportamento. Os valores de

velocidade especfica mxima de crescimento e durao da fase lag, estimados para

Resumo 14

B. nivea, foram os mais afetados pela variao do meio e da temperatura de

crescimento, praticamente no havendo diferena na populao mxima atingida.

Somente o crescimento de B. nivea foi avaliado pelo mtodo de filtrao. Neste

mtodo, foi observada uma dificuldade na caracterizao da fase lag devido s

pequenas quantidades de biomassa a serem medidas nesta fase do crescimento.

Foi observado que o crescimento de B. nivea em suco de abacaxi ocorreu em 3 dias

quando estocado a 20C e em 1 dia e meio quando estocado a 30C. O crescimento

deste fungo em suco maracuj apresentou uma pequena variao crescendo em 4

dias quando estocado a 20C e em apenas um dia quando estocado a 30C. Os

resultados evidenciam a importncia da preveno da contaminao da matria-

prima de sucos de frutas por fungos filamentosos termorresistentes, uma vez que a

vida de prateleira destes sucos pode ser drasticamente diminuda.

Abstract 15

ABSTRACT

The increasing concern of the population with quality of life and health increased the natural

and without preservatives fruit juice consumption. The heat-resistant fungi are one of the

most important heat processes fruit juices contaminants. Studies on the incidence of heat-

resistant fungi show that the ground is the main source of contamination of the fruits by these

moulds. Consequently, fruits and vegetables that will be in contact or next to the ground are

supposed to be contaminated by these microorganisms that, besides producing enzymes

that degrade fruits products, can produce micotoxinas. The use of contaminated raw material

to elaborate fruit products compromises these products shelf life due to the survival of these

fungi to normal temperatures of pasteurization. In this context, predictive microbiology is an

important tool to study microorganisms growth as heat-resistant fungi and, the Modified

Gompertz Model is one of the most used one. The objective of this work was evaluate two

known heat-resistant fungi growth, Byssochlamys nivea and Neosartorya fischeri, by viable

counts in pineapple and passion fruit juices, at 20 and 30C. It was proposed yet the fungal

growth evaluation by filtration as an alternative method. A comparison between the biological

parameters maximum specific growth rate (), lag phase () and logarithmic increase of population (A) gotten graphically and estimated by the model demonstrated that, in average,

the difference between these parameters values was 36,6%, 15.9% and 8.08%,

respectively. Modified Gompertz Model presented a good fit, with correlation coefficients

varying from 0,90 to 0,99. During lag phase was observed a model fit difficulty as a result of

the population decrease occurred in this growth phase. B. nivea maximum specific growth

rate and lag phase were the parameters more affected by medium and temperature growth

variation. Practically was not observed any difference in the logarithmic increase of

population. Only B. nivea growth was evaluated by filtration. In this method was observed a

difficult to characterize the lag phase due to the low quantities of biomass to pound in this

period of growth. It was observed that B. nivea took 3 days to growth in pineapple juice

stored at 20C and 1,5 days when stored at 30C. This fungal growth in passion fruit juice

showed a little variation, growing in 4 days when stored at 20C and just in 1 days when

stored at 30C. The results demonstrate that its important to prevent fruit used in processed

juice contamination by heat-resistant fungi because these products shelf life can be

drastically decreased.

CAPTULO I INTRODUO

Captulo I: Introduo 17

1 INTRODUO

A deteriorao de derivados de frutas foi primeiramente atribuda aos fungos

filamentosos no incio dos anos 30, na Inglaterra, quando Byssochlamys fulva foi

identificado como o agente deteriorante de morangos enlatados (OLLIVER &

RENDLE, 1934). Neste mesmo perodo foi constatado que a principal fonte de

contaminao era o solo (HULL, 1939).

A termorresistncia conferida a poucas espcies que produzem

ascsporos que sobrevivem ao tratamento trmico de pasteurizao

(SPLITTSTOESSER, 1991). A pasteurizao, normalmente aplicada a produtos

vegetais cidos, ativa os ascsporos dormentes, que germinam e crescem no

produto deteriorando-o (BEUCHAT, 1986; ENIGL et al., 1993) durante o perodo de

estocagem, o que pode resultar em grandes perdas econmicas (VALIK &

PIECKOV, 2001).

Estudos mostram que os fungos filamentosos j foram encontrados, como

contaminantes de sucos, em muitos pases como Estados Unidos (MAUNDER,

1969; SPLITTSTOESSER et al., 1971), Dinamarca (JENSEN, 1960), Austrlia

(SPURGIN, 1964; RICHARDSON, 1965), Holanda (PUT & KRUISWIJK, 1964),

Canad (YATES & MOONEY, 1968), Alemanha (ECKARDT & ARHENS, 1977),

Sua (LTHI & HOCHSTRASSER, 1952), Nigria (UGWUANYI & OBETA, 1991),

Iugoslvia (MICKOVSKI, 1962), ndia (RAJASHEKHARA et al., 1996) e no Brasil

(EIROA & ALMSTADEN, 1985; BAGLIONI, 1998; ARAGO, 1989; SALOMO,

2002).

Nos ltimos anos, ocorreu um aumento no volume e na variedade de

produtos base de frutas disponveis no mercado. Novos processos de fabricao,

embalagens e tecnologias de preservao, bem como um aumento na demanda do

consumo, tm causado um incremento na quantidade e na variedade de sucos de

frutas e de outros produtos derivados de frutas. Os mtodos mais freqentes de

preservao destes produtos so a pasteurizao e os processos de ultra-alta

temperatura (UHT), sendo pouco freqente o uso de conservantes qumicos

(TOURNAS, 1994). Entretanto, o uso de altas temperaturas pode romper ascsporos


de fungos filamentosos termorresistentes que podem estar presentes e, demonstram

uma resistncia excepcionalmente alta ao calor. A resistncia trmica varia de

espcie para espcie e dependente de vrios fatores como, a natureza do meio de

aquecimento, o tratamento trmico aplicado, a idade dos ascsporos, o meio de

esporulao entre outros. As espcies comumente envolvidas na deteriorao de

alimentos so Byssochlamys nivea e Byssochlamys fulva, Neosartorya fischeri,

Talaromyces flavus, Talaromyces trachyspermus (ENIGL et al., 1993), e

Eupenicillium (TOURNAS, 1994).

Desde 1996, o mercado de suco pronto para beber vem se destacando na

rea de bebidas. Comparando-se o ano de 2001 com o ano de 1996, este segmento

cresceu 270%. No primeiro semestre de 2002, foram comercializados 26,3 milhes

de litros de suco pronto para beber contra 16,4 nos primeiros seis meses de 2001

(CONSUMIDOR MODERNO, 2002).

Pela avaliao do crescimento destes fungos em diferentes produtos,

possvel saber o quanto podem ou podero interferir na vida de prateleira dos sucos

e outros derivados de frutas. Esta avaliao pode ser feita atravs da microbiologia

preditiva que utiliza os modelos matemticos para descrever o comportamento dos

microrganismos sob diferentes condies de temperatura, pH, atividade de gua

(WHITING, 1995; ZWIETERING et al., 1991; CHEROUTRE-VIALETE et al., 1998).

Estes modelos podem predizer a segurana microbiolgica ou vida de prateleira dos

produtos perecveis sob condies comerciais, baseando-se na cintica do

crescimento microbiano, para encontrar pontos crticos do processo (ZWIETERING

et al., 1991; CHEROUTRE-VIALETE et al., 1998; LABUZA & FU, 1993; GIANNUZZI

et al., 1998; VAN IMPE et al., 1992). O uso dos modelos preditivos pode reduzir a

necessidade de anlises laboratoriais dispendiosas e, em longo prazo, pode ser

considerado um pr-requisito para o controle computacional de operaes, bem

como para a otimizao de processos (DAVEY, 1994).

Este trabalho teve como objetivo avaliar o crescimento de Neosartorya

fischeri em suco de abacaxi a 30C e o crescimento de Byssochlamys nivea em

sucos de abacaxi e maracuj s temperaturas de 20 e 30C, pelo mtodo de

contagem de colnias por diluio e plaqueamento. Foi proposta ainda a avaliao


do crescimento destes fungos pelo mtodo da filtrao, como um mtodo alternativo

mais rpido e simples que o mtodo de contagem de colnias por diluio e

plaqueamento. A viabilidade do uso de modelos preditivos na estimativa dos

parmetros de crescimento de fungos foi demonstrada comparando-se os valores de

velocidade especfica mxima de crescimento (), durao da fase lag () e aumento logartmico da populao (A) de N. fischeri e B. nivea obtidos graficamente com os

estimados pelo Modelo de Gompertz Modificado.

CAPTULO II REVISO BIBLIOGRFICA

Captulo II: Reviso Bibliogrfica 21

1 MICROBIOLOGIA PREDITIVA

1.1 HISTRICO

Considera-se que foi nos anos 20 que se iniciou o uso de modelos preditivos

microbiolgicos em alimentos, com o clculo do tempo de morte trmica; onde os

valores D (tempo necessrio para reduzir em 90% a populao inicial de

microrganismos) e Z (intervalo de temperatura necessrio para reduzir o valor de D

em um dcimo do valor inicial) foram usados satisfatoriamente para assegurar que

os alimentos enlatados estavam livres do risco de envenenamento por Clostridium

botulinum (McMEEKIN & ROSS, 2002; WHITING, 1995). ESTY & MEYER, em 1922,

desenvolveram um modelo preditivo para descrever um processo trmico suficiente

para destruir 1012 esporos de C. botulinum tipo A. A grande margem de segurana

deste modelo faz com que ainda seja utilizado e talvez pouco reconhecido como um

modelo microbiolgico preditivo (McMEEKIN & ROSS, 2002).

ROSS & McMEEKIN (1994) ressaltam que o uso de modelos matemticos

na microbiologia de alimentos no novidade, estando bem estabelecido o uso de

modelos para a destruio trmica de microrganismos pelo calor, tanto na indstria

quanto na literatura.

Segundo McMEEKIN & ROSS (2002) a origem da microbiologia preditiva

moderna est entre os anos de 1960 e 1970, quando modelos cinticos foram

utilizados para tratar de problemas na deteriorao de alimentos e os modelos

probabilsticos utilizados para tratar de problemas de envenenamento alimentar,

como o botulismo e outras intoxicaes.

A partir da dcada de 80, as aplicaes das tcnicas de modelagem

matemtica, que at ento no recebiam grande ateno, comearam a ser

utilizadas. A utilizao dos modelos ocorreu por duas razes. A primeira foi o

aumento de casos importantes de envenenamento alimentar, o que levou ao

aumento da conscientizao do pblico da necessidade da oferta de alimentos

sadios. A segunda razo foi a constatao, por muitos microbiologistas de alimentos,

de que os mtodos tradicionais para determinar qualidade e segurana, inclusive os


considerados rpidos, eram limitados pelo tempo na obteno de resultados e

tinham um pequeno valor preditivo (ROSS & McMEEKIN, 1994). Alm disso, com o

advento dos computadores pessoais (PCs), a modelagem microbiana se tornou uma

rea de interesse crescente, pois os modelos poderiam ser facilmente utilizados por

microbiologistas e tecnlogos de alimentos (WHITING, 1995). Segundo ROSS &

McMEEKIN (1994), a microbiologia preditiva surgiu como conseqncia de duas

linhas de pesquisas diferentes. Uma delas era o controle da deteriorao de

pescados e a segunda a preveno do botulismo e outras intoxicaes

microbiolgicas.

A partir de 1983, o potencial da microbiologia preditiva despertou o interesse

de pesquisas e de financiamentos, particularmente nos Estados Unidos, Reino

Unido, Austrlia e Europa. No Reino Unido, este interesse fez surgir o software,

patrocinado pelo governo, Food Micromodel (ROSS & McMEEKIN, 1994;

McMEEKIN & ROSS, 2002). Na Europa surgiu um programa que rene cerca de 30

laboratrios em dez pases da Comunidade Econmica Europia (CEE), o FLAIR

(Food Linked Agricultural and Industrial Research), que examina o crescimento de

microrganismos patognicos e deteriorantes em uma grande gama de produtos

naturais. Nos Estados Unidos, as pesquisas sobre microbiologia preditiva so feitas

pela USDA, na Pensilvnia, no Microbial Food Safety Research Unit que preparou e

licenciou um software chamado Pathogen Modeling Program, ou PMP (ROSS &

McMEEKIN, 1994).

Nos ltimos anos, a microbiologia preditiva se consolidou como uma

disciplina com mrito prprio e sua utilizao tem sido amplamente aceita

(McCLURE et al., 1994).


1.2 OBJETIVOS E APLICAES

Pode-se dizer que a microbiologia preditiva de alimentos multidisciplinar,

pois rene conhecimentos de microbiologia de alimentos, engenharia e estatstica

para fornecer prognsticos convenientes sobre o comportamento microbiano em

alimentos (SCHAFFNER & LABUZA, 1997).

O objetivo da microbiologia preditiva, segundo WHITING (1995), descrever

matematicamente o crescimento ou a diminuio de microrganismos presentes em

alimentos sob condies ambientais especficas. O autor diz ainda que, com a

habilidade de descrever, vem a habilidade de prever combinaes de condies

onde no existem dados experimentais, dentro de uma faixa apropriada de cada

condio.

A estimativa exata dos parmetros de crescimento, particularmente

velocidade especfica mxima de crescimento () e durao da fase lag (), essencial em muitas reas da microbiologia, como por exemplo na caracterizao de

efeitos de anti-microbianos, otimizao de meios microbiolgicos e no

desenvolvimento de modelos cinticos utilizados nas tecnologias de alimentos e de

fermentao (DALGAARD & KOUTSOUMANIS, 2001)

Os modelos matemticos so utilizados para descrever o comportamento

dos microrganismos sob diferentes condies de temperatura, pH e atividade de

gua (WHITING, 1995; ZWIETERING et al., 1991; CHEROUTRE-VIALETE et al.,

1998). Estes modelos podem predizer a segurana microbiolgica ou vida de

prateleira dos produtos perecveis sob condies comerciais, baseando-se na

cintica do crescimento microbiano, para encontrar pontos crticos do processo

(ZWIETERING et al., 1991; CHEROUTRE-VIALETE et al., 1998; LABUZA & FU,

1993; GIANNUZZI et al., 1998; VAN IMPE et al., 1992).

De acordo com ROSS & McMEEKIN (1994), as respostas microbianas so

medidas sob condies definidas e controladas e os resultados so ento

sumarizados na forma de equaes matemticas que, por interpolao, podem

prever respostas para novas condies que no foram verdadeiramente testadas.


A microbiologia preditiva pode ser usada para predizer a segurana de um

produto que no apresente uma barreira contra o crescimento de um patgeno e

avaliar o efeito de vrios fatores de barreira, incluindo composio, processamento e

embalagem, na estabilidade microbiolgica dos alimentos (LABUZA & FU, 1993).

A microbiologia preditiva tambm ajuda na elaborao de planos de Anlise

de Perigos e Pontos Crticos de Controle (APPCC), identificando perigos e pontos

crticos de controle, especificando limites e aes corretivas (McMEEKIN & ROSS,

2002).

O uso dos modelos preditivos pode reduzir a necessidade de anlises

laboratoriais dispendiosas e, a longo prazo, pode ser considerado um pr-requisito

para o controle computacional de operaes, bem como para a otimizao de

processos (DAVEY, 1994).

McCLURE et al. (1994), consideram que as aproximaes feitas pela

microbiologia preditiva esto sendo largamente aceitas, e que, o verdadeiro poder

destas aproximaes que, ao contrrio do processo tradicional de estocagem, os

modelos, uma vez validados, podem ser utilizados para predizer rapidamente e com

segurana a resposta dos microrganismos sob vrias condies. Isto faz com que

seja considerada uma ferramenta preciosa para os microbiologistas de alimentos na

tomada de deciso diria.


2 MODELOS PREDITIVOS

Inicialmente, poder-se-ia pensar nos modelos utilizados h muitos anos na

biotecnologia ou na engenharia qumica e aplic-los microbiologia preditiva.

Entretanto, BARANYI & ROBERTS (1994) ressaltam que so muitas as razes para

que a microbiologia preditiva de alimentos construa suas prprias ferramentas

estatstico-matemticas. Algumas destas razes so listadas abaixo:

Ao contrrio do que ocorre na biotecnologia, que visa a otimizao, o objetivo dos microbiologistas de alimentos minimizar ou prevenir o

crescimento microbiano, o que faz com que os fatores inibitrios sejam

investigados mais intensamente.

A concentrao de clulas de interesse bem menor que na biotecnologia, que geralmente maior que 106 ou 107clulas/mL.

Conseqentemente, alguns mtodos que so validados a altas

concentraes celulares, como turbidimetria e medidas de condutncia,

no podem ser diretamente aplicados, sendo necessrio estabelecer a

relao entre o nmero de clulas e medida na menor concentrao

celular.

A cintica da fase lag, que pouco importante em um biorreator, de grande importncia na microbiologia de alimentos.

Geralmente a quantidade de informaes sob a composio fsico-qumica do alimento menor e menos exata quando comparada a de um

biorreator, conseqentemente, os mtodos estattico-matemticos

aplicados envolvem vrias simplificaes e elementos empricos.

Segundo BARANYI & ROBERTS (1995), o termo modelo matemtico se

refere a uma srie de hipteses bsicas de um processo estudado, algumas das

quais, podem ser expressas por meio de funes ou de equaes (diferenciais). Do

ponto de vista mecanstico, os termos funo e modelo no so equivalentes. Os


autores definem funo como uma abstrao matemtica que facilita a descrio de

um modelo particular.

O processo de modelagem depende de tcnicas de regresso matemtica,

conseqentemente, um critrio padro para a anlise de regresso deve ser levado

em considerao, incluindo distribuies normais e varincias homogeneizadas. O

procedimento para desenvolver um modelo deve incluir as seguintes consideraes

(WHITING, 1995):

Exatido do ajuste Habilidade de predizer combinaes de fatores no testados Incorporao de todos os fatores relevantes Possuir um nmero mnimo de parmetros para facilitar o uso Especificao do termo de erro Os parmetros devem conter significado biolgico e valores realsticos Reparametrizao se isso melhorar as propriedades estatsticas

Os modelos preditivos so classificados de acordo com o comportamento da

populao que descrevem. Assim, existem modelos de crescimento, de inativao

(WHITING, 1995; McMEEKIN & ROSS, 2002) e de limites ou interface de

crescimento (modelos cresce-no cresce) (McMEEKIN & ROSS, 2002).

Os modelos podem ser chamados de cinticos, quando so baseados no

estudo do comportamento da populao microbiana em funo do tempo ou de

probabilstico, quando examinam a probabilidade de que um microrganismo

responda crescendo, morrendo ou produzindo um metablito num dado perodo de

tempo (McMEEKIN & ROSS, 2002; ROSS & McMEEKIN, 1994; WHITING, 1995).

McMEEKIN & ROSS (2002) classificam os modelos em mecansticos ou

empricos, dependendo se apresentam ou no um embasamento terico. Os

modelos, geralmente utilizados na microbiologia preditiva, no so puramente

mecansticos e alguns, que inclusive devem ser evitados, so simplesmente ajuste

de curvas e podem apresentar deficincias visveis, como conter um nmero de


graus de liberdade igual ou maior que o nmero de observaes. Modelos como

esses podem at apresentar um bom ajuste quando so graficados contra um

pequeno nmero de pontos experimentais

Uma outra classificao dos modelos matemticos utilizados na

microbiologia preditiva foi proposta por WHITING & BUCHANAN (1993), onde os

modelos so considerados primrios, secundrios ou tercirios. Segundo WHITING

(1995), os modelos primrios e secundrios podem ser lineares ou no lineares;

segregados, quando a populao definida por clulas heterogneas, ou no

segregados, quando a populao definida por clulas mdias; estruturado, quando

compostos por vrios componentes ou no estruturado, quando composto por

um nico componente.

2.1 MODELOS PRIMRIOS

Os modelos primrios descrevem mudanas no nmero de microrganismos

ou nas respostas microbianas (durao da fase lag, velocidade especfica mxima

de crescimento e aumento logartmico da populao) com o tempo, num ambiente

especfico. Estes modelos podem estimar a quantidade de unidades formadoras de

colnias por mililitro (UFC/mL), a formao de toxinas, os nveis de substratos e

produtos metablicos (que so medidas diretas da resposta). Uma equao ou

funo matemtica descreve a mudana da resposta com o tempo, fornecendo um

grupo caracterstico de valores dos parmetros.

Exemplos de modelos primrios so o modelo de primeira ordem de Monod

(LABUZA & FU, 1993), o modelo logstico, o modelo de Schunute (ZWIETERING

et al., 1990), o modelo de Boltzman (ERKMEN & ALBEN, 2002), o modelo de

inativao trmica de primeira ordem (WHITING, 1995) e os modelos de Baranyi e

de Gompertz, que so os mais utilizados (BUCHANAN et al., 1997).


2.1.1 O Modelo de Gompertz

O Modelo de Gompertz, amplamente utilizado (MASSON et al., 2002;

WHITINHG, 1995; BUCHANAN et al., 1997), foi introduzido na microbiologia de

alimentos por GIBSON et al., em 1987 (ROSS & McMEEKIN, 1994; GIANUZZI et al.,

1998; LABUZA & FU, 1993), que compararam a equao logstica e a de Gompertz

na parametrizao de uma curva de crescimento de Clostridium botulinum. O

Modelo de Gompertz, representada pela Equao 2.1 (ERKMEN & ALBEN, 2002),

foi selecionado devido ao melhor ajuste.

t)}*cexp(bexp{*ay = (2.1)

onde y a densidade da populao (logaritmo do nmero de unidades formadoras

de colnias/mL) num dado tempo t (h). Os parmetros a, b e c, so estimados pelo

modelo. Estes parmetros esto relacionados com os parmetros microbiolgicos de

crescimento (durao da fase lag), max (velocidade especfica mxima de crescimento) e A (aumento logartmico da populao) pelas seguintes equaes:

a = A (2.2)

A 1b *max+= (2.3)

Acmax= (2.4)

A funo ou Modelo de Gompertz foi modificado por ZWIETERING et al.

(1990). A reparametrizao do modelo foi feita para que os parmetros estimados

pudessem ter um significado biolgico. Assim, os parmetros, velocidade especfica

mxima de crescimento (max), durao da fase lag () e aumento logartmico da populao (A) foram introduzidos no modelo, o que facilitou o encontro de valores


iniciais e o clculo de intervalos de confiana durante o ajuste da curva (LABUZA &

FU, 1993; VAN IMPE et al., 1995). O Modelo de Gompertz Modificado dado pela

Equao 2.5

1t)(*)A*exp{(exp{*Ay += e (2.5)

Os valores dos parmetros podem ser determinados ajustando-se os dados

ao Modelo de Gompertz pelo mtodo de Gauss-Newton ou outro mtodo interativo

de estimao que determine o melhor ajuste de acordo com o critrio dos mnimos

quadrados (WHITING, 1995).

Segundo LABUZA & FU (1993), tanto o Modelo de Gompertz original quanto

o Modificado tm sido testados em muitas espcies de microrganismos com bons

ajustes. Entretanto, o ajuste do Modelo de Gompertz fortemente afetado pelo

nmero de observaes utilizado na construo da curva, como foi observado por

BRATCHELL et al. (1989), bem como pela qualidade estatstica destas observaes.

Para um bom ajuste da funo, necessrio pelo menos 15 pontos experimentais

distribudos uniformemente ao longo de toda curva de crescimento. Isto pode

caracterizar um problema se o crescimento muito rpido, se a durao da fase lag

muito curta ou se o experimento termina antes que se atinja a fase estacionria.

2.2 MODELOS SECUNDRIOS

Os modelos secundrios indicam como os parmetros dos modelos

primrios mudam com fatores ambientais como temperatura, pH e atividade de

gua, entre outros (WHITING, 1995). Muitos modelos secundrios tm sido

propostos na literatura, como os modelos polinomiais ou metodologia de superfcie

de resposta, equao de Arrhenius, modelo da raiz quadrada ou de Ratkowsky,


entre outros (SCHAFFNER & LABUZA, 1997; WHITING, 1995; McMEEKIN & ROSS,

2002; DAVEY & DAUGHTRY, 1995).

Sem dvida, a temperatura o fator mais importante nas reaes de

deteriorao de alimentos, principalmente na deteriorao microbiana, uma vez que

a velocidade especfica mxima de crescimento e a fase lag so altamente

dependentes da temperatura (GIANNUZZI et al., 1998). Mesmo estando diretamente

ligada estabilidade microbiolgica dos alimentos, nem sempre a temperatura de

refrigerao mantida constante durante a manipulao. Assim, muitos

pesquisadores estudaram, atravs de modelos computacionais baseados em

transferncia de calor e estimativas de crescimento microbiano, o efeito da

temperatura na estabilidade microbiana (GIANNUZZI et al., 1998). O modelo da raiz

quadrada, proposto por RATKOWSKY et al. (1983), pode ser citado como exemplo

de um modelo que descreve a influncia da temperatura na taxa de crescimento

especfico. Em 1991, ZWIETERING et al. modificaram o modelo estendido de

Ratkowsky para descrever o efeito da temperatura na fase lag. O efeito de

flutuaes da temperatura na fase lag e na taxa de crescimento especfico, em meio

lquido, tambm foi estudado por LI & TORRES (1993).

O pH e aw tambm so includos em alguns modelos, sendo necessrio

express-los, algumas vezes, como concentrao de on hidrognio ou contedo de

sal. Os fatores inclusos nos modelos variam de acordo com a finalidade a que se

propem. Quando o modelo desenvolvido para carnes curadas, por exemplo,

necessria a incorporao de um termo no modelo que descreva a influncia do

nitrito no crescimento microbiano. Embora seja raro, os modelos podem incluir

outros fatores alm de temperatura, pH, aw e nitrito, como o potencial redox, a

composio dos gases do headspace (oxignio, dixido de carbono, nitrognio) e

outros.

A influncia de uma microbiota competitiva ainda no foi explorada por

muitos modelos. Quando se tem uma mistura de microrganismos, a predominncia

de um ou de outro varia de acordo com a energia de ativao de cada um, sendo

que, aqueles que possuem maior energia de ativao, so predominantes a altas

temperaturas, enquanto que aqueles que possuem energias de ativao menores


devero ser predominantes a temperaturas mais baixas. Alm disso, pode ocorrer a

produo de substncias antimicrobianas por alguns contaminantes naturais, o que

pode afetar o crescimento de outros microrganismos presentes nos alimentos

(SCHAFFNER & LABUZA, 1997).

2.3 MODELOS TERCIRIOS

Os modelos tercirios so ferramentas, onde as rotinas dos softwares

computacionais transformam os modelos primrios e secundrios em programas

amigveis, como softwares e sistemas espertos. Estes programas podem calcular as

respostas microbianas de acordo com as mudanas nas condies ambientais,

comparar o efeito das diferentes condies ou contrastar o comportamento de vrios

microrganismos.

Alguns softwares comerciais, que podem ser adquiridos livres de encargos,

fornecem predies do crescimento microbiano ou da taxa de crescimento ou da

fase lag, sob condies definidas (McMEEKIN & ROSS, 2002) . Entre eles esto:

USDAs Pathogen Modeling Program (BUCHANAN, 1993), disponvel no site http://www.arserrc.go/mfs/pathogen.htm;

Food MicroModel (McCLURE et al., 1994; PANCIELLO & QUANTICK, 1998), software desenvolvido por um grupo de empresas em conjunto com o

governo do Reino Unido, disponvel no site

http://www.lfra.co.uk/micromodel/index.html;

Seafood Spoilage Predictor (DALGAARD et al., 2002), desenvolvido para predizer a vida de prateleira de alimentos de origem marinha

estocados a temperatura constante ou sob flutuaes de temperatura. O

software disponvel no site http://dfu.min.dk/micro/ssp/.

Food Spoilage Predictor (NEUMEYER et al., 1997), software comercial que modela o efeito da atividade de gua e de flutuaes de temperatura no

crescimento de Pseudomonas psicrotolerantes.


3 DETERMINAO DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Quando o crescimento de um ou mais microrganismos estudado, uma

grande quantidade de dados necessria, uma vez que os parmetros de

crescimento (durao da fase lag, velocidade especfica mxima de crescimento e

aumento logartmico da populao) so obtidos com boa exatido quando um

nmero suficiente de repeties feito e, desde que, cada repetio contenha um

nmero suficiente e bem distribudo de pontos experimentais. Este problema ainda

maior se o crescimento for estudado em funo de diferentes condies, como

temperatura, pH ou atividade de gua (AUGUSTIN et al., 1999; BEGOT et al., 1996).

O desenvolvimento de modelos na microbiologia preditiva requer uma

grande quantidade de dados. Estes dados so geralmente obtidos pelo mtodo de

contagem de colnias por diluio e plaqueamento (AUGUSTIN et al., 1999). Este

mtodo, mesmo exigindo um grande consumo de tempo e no fornecendo

resultados imediatos, tem sido utilizado como um mtodo padro para mtodos

alternativos que vm sendo desenvolvidos como medidas de impedncia,

radiometria, determinao de ATP e citometria de fluxo.

O crescimento microbiano pode ser acompanhado, em tempo real, atravs

da Densidade tica (DO), um mtodo j estabelecido e chamado de turbidimetria

(BEGOT et al., 1996). A turbidimetria se tornou um mtodo atrativo, devido ao

advento de sistemas turbidimtricos automatizados (AUGUSTIN et al., 1999;

BEGOT et al, 1996), e, recentemente, foi utilizado por alguns autores para estimar

os parmetros de crescimento atravs do Modelo de Gompertz Modificado (BEGOT

et al., 1996; CHORIN et al., 1997; DALGAARD & KOUTSOUMANIS, 2001;

CHEROUTRE-VIALETTE et al., 1998). A estimativa dos parmetros de crescimento

por medidas de absorbncia tem a vantagem de ser rpido, no destrutivo, barato e

relativamente fcil de automatizar quando comparado com outras tcnicas e,

particularmente, quando comparado com a contagem de viveis clssica

(DALGAARD & KOUTSOUMANIS, 2001).


3.1 DETERMINAO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS

A avaliao do crescimento de fungos pela medida da taxa de extenso das

hifas, normalmente chamada de taxa de crescimento radial, expressa em m/h, provavelmente, a medida mais simples e direta, mas no necessariamente

representa a verdadeira natureza do crescimento do fungo. Contrariamente s

bactrias, que se reproduzem por cissiparidade e cujo crescimento normalmente

ocorre apenas na superfcie de meios slidos ou de forma homognea atravs de

um meio lquido, as hifas produzidas pelos fungos podem penetrar nos alimentos em

trs dimenses (GIBSON & HOCKING, 1997). Entretanto, este mtodo tem sido

utilizado para quantificar o crescimento de fungos, como o relatado por MOLINA &

GIANUZZI (1999), que estudaram o efeito da combinao de temperatura e de

concentraes de cido propinico no crescimento de Aspergillus parasiticus atravs

de medidas do dimetro da colnia. O efeito da atividade de gua no crescimento de

fungos termorresistentes tambm foi avaliado por medidas do dimetro da colnia

(VALK & PIECKOV, 2001).

Segundo LANGVAD (1999), o crescimento de fungos filamentosos em

cultura lquida pode ser medido atravs do aumento do peso seco de culturas

realizadas em frascos erlenmeyers de 500 mL estacionrios ou agitados. O autor

observou uma relao linear, entre a absorbncia (lida a 630 nm) e o peso seco,

similar para diferentes fungos com um coeficiente angular de 4,2 mg/mL de peso

seco por unidade de absorbncia.

AKPOMEDAYE & EJECHI (1998) estudaram o efeito de extratos de pimenta

associados ao efeito do calor no crescimento de Aspergillus flavus, Aspergillus niger

e Rhizopus stolonifer. A inibio do crescimento foi medida pela quantificao da

biomassa, que foi filtrada e seca at peso constante.


4 MICROBIOLOGIA PREDITIVA X FUNGOS

Segundo BARANYI et al. (1996), o uso dos modelos preditivos, amplamente

aceito no estudo do crescimento bacteriano, tambm tem se mostrado como uma

importante ferramenta no estudo do crescimento de fungos. Mas a modelagem

preditiva do crescimento de fungos filamentosos no tem recebido tanta ateno

quanto o crescimento bacteriano, provavelmente devido complexidade de se

quantificar o seu crescimento.

ERKMEN & ALBEN (2002) utilizaram diferentes modelos no-lineares para

estimar os parmetros (g/L), (dias) e A (g/L), na produo de cido ctrico e formao de biomassa, por Aspergillus niger em cultura submersa. A biomassa foi

quantificada por filtrao de uma amostra de 15 mL, retirada do fermentador a cada

15 dias. Depois de filtrado, o miclio foi seco a 105C at peso constante. Os

parmetros biolgicos foram estimados, com sucesso, pela equao de Gompertz

modificada.

CUPPERS et al. (1997) desenvolveram um modelo com a taxa de

crescimento em funo da temperatura e da concentrao de sal, para predizer o

tempo necessrio para que a colnia atinja um tamanho visvel (3 mm). A medida do

dimetro tambm foi utilizada por BARANYI et al. (1996) que modelaram o efeito da

atividade de gua na taxa de crescimento da colnia de quatro espcies de

Aspergillus. MOLINA & GIANNUZZI (1999) utilizaram o modelo de Arrhenius para

avaliar o efeito da temperatura e da concentrao de cido propinico no

crescimento de Aspergillus parasiticus. O crescimento foi medido atravs do

incremento do dimetro da colnia por unidade de tempo.

O efeito da aw no crescimento de Penicillium roqueforti foi estudado atravs

das tcnicas de microbiologia preditiva por VALK et al. (1999). O crescimento da

colnia, medido atravs do dimetro da colnia, foi modelado por uma funo

quadrtica ajustada aos valores de aw transformados.

VALK & PIECKOV (2001) consideraram que so poucos os trabalhos

publicados sobre os efeitos de fatores ambientais como atividade de gua (aw), pH,


temperatura, tenso de oxignio, luminosidade, conservantes e cidos orgnicos, no

crescimento de fungos termorresistentes, sendo que estes dados poderiam ser

modelados matematicamente.


5 FUNGOS

Estima-se que existam cerca de um milho e meio de espcies de fungos no

mundo, mas apenas sessenta e nove e mil espcies, foram descritas. Devido

capacidade dos fungos em utilizar substratos muito diferentes, eles so capazes de

atacar inmeros produtos utilizados pelo homem, incluindo tecidos, couro, produtos

derivados do petrleo como combustveis e lubrificantes, alm dos seres vivos.

Assim, vrios processos como secagem, salga, congelamento, aquecimento,

enlatamento, uso de irradiao ou de aditivos qumicos, so empregados para

proteger os alimentos dos fungos e tambm das bactrias. Alm de danificar os

alimentos certas espcies de fungos podem produzir substncias txicas,

conhecidas como micotoxinas (ALEXOPOULOUS, 1996).

Os fungos so organismos eucariticos, aclorofilados, imveis, aerbios e

obtm energia da oxidao de substncias orgnicas (SCHLEGEL, 1993). A maioria

dos fungos aerbia, apesar de que inmeras espcies, incluindo as leveduras,

serem anaerbias facultativas (ALEXOPOULOUS, 1996). O corpo vegetativo, ou

talo, consiste de filamentos chamados de hifas, que podem ser septadas ou no, e

se estendem sobre o meio nutriente (SCHLEGEL, 1993).

A reproduo efetua-se por germinao de esporos. Os esporos maduros

so liberados dos aparelhos esporferos e disseminados. Um esporo germina e

emite um filamento, ou hifa, que cresce, alonga-se e ramifica-se para dar um novo

miclio. Os esporos assexuados nascem da amputao de pequenos fragmentos

citoplasmticos uni ou multinucleados que se separam na extremidade das hifas. Na

reproduo sexuada, o zigoto ou uma clula vegetativa passa por uma diviso

meitica, seguida de uma ou vrias divises mitticas, que permitem a formao de

esporos sexuados haplides (SCRIBAN, 1985).

Os fungos so subdivididos, de acordo com as caractersticas estruturais e

reprodutivas, em vrios grupos: Zygomicetos, Oomicetos, Ascomicetos,

Deuteromicetos, Basidiomicetos (ALEXOPOULOUS, 1996)


Nos fungos pertencentes ao grupo dos Ascomicetos, a reproduo sexuada

efetuada por ascsporos. Os ascsporos so desenvolvidos dentro de uma

estrutura em forma de saco, chamada asco. Cada asco contm de 4 a 8 ascsporos

que so liberados quando h ruptura do asco (SCRIBAN, 1985).

5.1 FUNGOS TERMORRESISTENTES

A maioria dos fungos filamentosos possui limitada resistncia trmica e so

facilmente destrudos pela aplicao de calor. Entretanto, algumas espcies que

apresentam a caracterstica de produzir ascsporos (esporos da fase de reproduo

sexuada) como Byssochlamys, Neosartorya, e Talaromyces, entre outras,

demonstram uma alta resistncia trmica (HOCKING & PITT, 1984; TOURNAS,

1994).

A pasteurizao normalmente aplicada aos produtos de frutas ativa os

ascsporos dormentes que germinam e permitem o crescimento dos fungos

termorresistentes (BEUCHAT, 1986; SPLITTSTOESSER et al., 1972). Por

sobreviverem aos tratamentos trmicos utilizados no processamento de frutas, estes

fungos podem crescer e deteriorar os produtos estocados temperatura ambiente, o

que pode resultar em grandes perdas econmicas (TOURNAS, 1994).

As espcies comumente envolvidas na deteriorao de frutas e produtos de

frutas so Byssochlamys nivea e Byssochlamys fulva, Neosartorya fischeri,

Talaromyces flavus, Talaromyces trachyspermus (ENIGL et al., 1993) e

Eupenicillium brefeldianum (TOURNAS, 1994).


5.1.1 Descrio dos Gneros Byssochlamys e Neosartorya

Byssochlamys sp

Os fungos do gnero Byssochlamys (B. nivea e B. fulva) so caracterizados

pela ausncia de cleistotcio, gymnotcio ou qualquer outro corpo que envolva os

ascos durante o desenvolvimento ou maturao. Os ascos so produzidos em

cachos abertos, em associao com fragmentos de hifas, mas no envolvidos por

estas. Os ascos so compostos por oito ascsporos, estruturas transparentes,

habitualmente ovais e lisas, com dimenses que variam de 2,8-4,0 x 3,4-5,6 m. As formas anamorfas ou imperfeitas de B. nivea e B. fulva so Paecylomyces niveus e

Paecylomyces fulvus , respectivamente. As colnias de B. nivea geralmente so

brancas em Agar Extrato de Malte (MEA) ou Agar Czapeck Extrato de Levedura

(CYA) e apresentam ascos menores que de B. fulva, que apresentam colnias

marrons amareladas, nos mesmos meios de crescimento (BEUCHAT & RICE, 1979)

Neosartorya sp

Os fungos deste gnero apresentam cleistotcios, que envolvem os ascos

dando s colnias uma aparncia granular. N. fischeri a nica espcie significante e reconhecida como deteriorante de alimentos, e possui trs variedades: N. fischeri

var. fischeri, N. fischeri var. glabra e N. fischeri var. spinosa que se diferenciam entre

si pela ornamentao dos ascsporos, tipos de toxinas e outros metablitos

secundrios. Os ascos so biconvexos com diviso equatorial (NIELSEN, 1991). A

colorao das colnias varia entre branco e amarelo; o reverso varia de amarelo a

rosa plido ou marrom. O miclio branco e h grande produo de cleistotcio. Os

ascsporos so elipsoidais ou ovais, de 7 a 8 m de comprimento e apresentam duas cristas longitudinais. A fase anamorfa chamada Aspergillus fischeri,

entretanto estado teleomrfico o mais encontrado (TOURNAS, 1994).


5.1.2 Incidncia

A primeira investigao extensiva sobre a incidncia de Byssochlamys sp.

em frutas e ambientes associados foi feita por OLLIVER & RENDLE (1934), que

investigaram o amolecimento de frutas que eram embaladas em bom estado, mas,

depois de algumas semanas de estocagem, uma pequena porcentagem dos

produtos se desintegrava. No havia produo de gs visvel, alterao de odor ou

flavour e nenhuma mudana evidente na colorao. As pesquisas demonstraram

que o fungo filamentoso Byssochlamys fulva era o agente deteriorante e que o solo

era a fonte de contaminao inicial.

A incidncia de Byssochlamys em solos de pomares e vinhedos da Amrica

do Norte foi estudada por YATES (1974), que demonstrou a ocorrncia deste fungo

em amostras de uvas retiradas de caminhes de transporte utilizados por uma

vincola. SPLITTSTOESSER et al. (1971) constataram, em estudo sobre a incidncia

de fungos termoresistentes em pomares e hortas de Nova York, que no solo, bem

como nos materiais colhidos deste, se encontravam as maiores concentraes deste

tipo de fungo.

Vrios trabalhos sobre a incidncia de fungos termorresistentes mostram

que eles esto distribudos por vrios pases como Estados Unidos (MAUNDER,

1969; SPLITTSTOESSER et al., 1971), Dinamarca (JENSEN, 1960), Austrlia

(SPURGIN, 1964; RICHARDSON, 1965), Holanda (PUT E KRUISWIJK, 1964),

Canad (YATES & MOONEY, 1968), Alemanha (ECKARDT e ARHENS, 1977),

Sua (LTHI & HOCHSTRASSER, 1952), Nigria (UGWUANYI & OBETA, 1991),

Iugoslvia (MICKOVSKI, 1962) ndia (RAJASHEKHARA et al., 1996) e no Brasil

(EIROA & ALMSTADEN,1985; BAGLIONI, 1998; ARAGO, 1989; SALOMO,

2002).


5.1.3 Alimentos Susceptveis Contaminao

Os alimentos susceptveis deteriorao por fungos termorresistentes so

frutas e produtos a base de frutas como sucos, polpas, concentrados e frutas

enlatadas. Dentre os vrios tipos de frutas, aquelas que so colhidas diretamente do

solo ou que esto prximas dele, como morango, ameixa, maracuj, uva, abacaxi,

pssego e ma so as mais afetadas pela deteriorao por fungos

termorresistentes (TOURNAS, 1994).

A presena de fungos termorresistentes em certas frutas , sem dvida,

influenciada pela amplitude da exposio ao solo, bem como pela prevalncia do

fungo no solo onde as frutas crescem (BEUCHAT & RICE, 1979). Algumas linhagens

de Byssochlamys e de N. fischeri tm se tornado um problema industrial, devido

deteriorao dos produtos e a produo de micotoxinas (RICE et al., 1977;

PATTERSON et al., 1981).

Vrios trabalhos demonstram a contaminao de produtos comerciais por

fungos termorresistentes. N. fischeri j foi isolado de morangos enlatados (McEVOY

& STUART, 1970), drinks a base de frutas (SPLITTSTOESSER &

SPLITTSTOESSER, 1977), de suco concentrado de abacaxi e de maracuj

congelados (TOURNAS & TRAXLER, 1994) e Byssochlamys de drink de uva

termicamente processado (SPLITTSTOESSER et al., 1969), suco de ma (VAN

DER RIET & VAN DER WALT (1985), e suco de fruta concentrado (50Brix)

(PALOU et al., 1998).

Os fungos filamentosos termorresistentes foram isolados de polpa de tomate

com o objetivo de avaliar a eficincia da pasteurizao aplicada a produtos

enlatados comerciais. Foram isolados ascsporos de nove linhagens, sendo duas de

B. nivea, trs de B. fulva e quatro de N. fischeri (KOTZEKIDOU, 1997)

Na Austrlia, a deteriorao de alimentos por Byssochlamys foi reconhecida

no incio dos anos 60, em morangos enlatados. As matrias primas freqentemente

contaminadas por esporos de fungos termorresistentes so morangos e maracujs,


e, em menor grau abacaxi, e suco e polpa de manga. Sucos e produtos ctricos so

raramente implicados (TOURNAS, 1994).

No Brasil, ARAGO (1989) isolou 58 culturas de fungos filamentosos

termorresistentes a partir de 15 amostras de polpa de morango. Entre os gneros

isolados foram encontrados B. nivea, N. fischeri, Talaromyces flavus var. flavus e

Eupenicillium javanicum var. javanicum. BAGLIONI (1998), em estudo sobre a

ocorrncia de fungos filamentosos durante o processamento assptico de polpa de

tomate, encontrou cinqenta linhagens, sendo que o isolado mais termorresistente,

identificado como N. fischeri sobreviveu ao choque trmico a 100C por 25 minutos.

SALOMO (2002) isolou onze cepas de fungos termorresistentes de nctar de

ma, nove de polpas comerciais congeladas de morango e uva e uma, identificada

como B. fulva, de suco comercial pasteurizado e preservado com benzoato de sdio

e sorbato de potssio. As cepas isoladas foram identificadas N. fischeri, B. fulva e

Talaromyces sp., Eupenicillium sp. e Aspergillus sp.

Poucos trabalhos relatam a presena de fungos termorresistentes em outros

produtos alm de frutas e derivados de frutas. YATES & FERGUSON (1963)

isolaram B. nivea de pepinos em salmoura. Estes fungos tambm foram isolados de

leite cru (FREVEL et al., 1985), queijo fresco, leite cru e leite integral (ENGEL &

TEUBER, 1991).

5.1.4 Conseqncias do Crescimento em Alimentos

O primeiro sinal da ao de um fungo termorresistente um ligeiro

amolecimento da fruta, sugerindo um supercozimento ou o uso de frutas muito

maduras. Pode aparecer um mau cheiro e um gosto ranoso. Em seguida, h uma

total desintegrao da fruta. Em produtos solidificados, como gis de fruta, os fungos

termorresistentes crescem na superfcie, deteriorando o produto devido

solubilizao do substrato por ao da pectina (HOCHING & PITT, 1984).

Os fungos termorresistentes secretam vrias enzimas. Entre as mais

comuns esto as pectinases, amilases e proteinases. As enzimas pectinolticas


produzidas pelos fungos so responsveis pela hidrlise da pectina, e

conseqentemente, pelo amolecimento da textura das frutas. Alm de enzimas, os

fungos do gnero Byssochlamys podem produzir metablitos secundrios txicos,

como a patulina, cido bissoclmico, bissotoxina A, assimetrina e variotina, e os

fungos do gnero Neosartorya podem produzir as micotoxinas: fumitremorginas A e

C, verruculogena, fischerina e eupenifeldina (TOURNAS, 1994).

Algumas linhagens de N. fischeri so capazes de produzir terreina (MISAWA

et al., 1962), fumitremorginas A e B (HOIRE & YAHMAZAKI, 1981) e verruculogena

(PATTERSON et al., 1981). As ltimas trs micotoxinas so membros do grupo das

fumitremorginas, que inclui ainda fumitremorginas C e TR-2 (COLE et al., 1974).

Estas toxinas agem no sistema nervoso central causando tremores, convulses e a

morte de animais (PERERA et al., 1982; YAMAZAKI, et al., 1971; YAMAZAKI, et al.,

1979). A verruculogena a mais txica, causando tremores em sunos e ovelhas

numa concentrao de 5 a 10 mg/kg de peso corporal, administrado por meio

intravenal (PERERA et al., 1982).

As condies requeridas para a produo de enzimas pcticas por B. nivea

foram estudadas por YATES & MOONEY (1968). A produo mxima das enzimas

foi obtida em meio contendo glicose e pectina, aps cinco dias de incubao a 35C.

UGWUANYI & OBETA (1999) verificaram a atividade de enzimas pectinolticas e

celulolticas produzidas por Neosartorya spp., B. nivea e Paecilomyces varioti em

dois meios artificiais, um contendo pectina e outro contendo tecido de manga. A

desintegrao do tecido de manga por estas enzimas tambm foi avaliada. Foram

identificadas, para todos os isolados, em meio artificial, as atividades de hidrolases,

liases e pectinases, e para B. nivea uma grande atividade de celulases.

NIELSEN et al. (1988) demonstraram que as temperaturas timas para

produo de verruculogena e fumitremorginas A e C, em Agar Czapek Extrato de

Levedura (CYA) a pH 7,0, foram 25, 30 e 37C, respectivamente. A produo de

fumitremorgina foi retardada temperatura de 15C, mas uma extenso do perodo

de incubao resultou numa concentrao aproximadamente igual observada a

25C. O uso de luz aumentou a produo de fumitremorgina em CYA (pH 3,5, 25C),

mas no to drasticamente como quando foi adicionada glicose, frutose ou sacarose


no meio de crescimento (CYA, pH 3,5, 25C) . O crescimento e a produo de

fumitremorgina foi maior atividade de gua de 0,98 em CYA suplementado com

glicose ou frutose e atividade de 0,99 em CYA suplementado com sacarose. O

crescimento e a produo de fumitremorgina foram observados em atividades de

gua to baixas quanto 0,925 em CYA suplementado com glicose, mas no em

atividades de gua menores que 0,97 em CYA suplementado com sacarose.

Verruculogena foi produzida em grandes quantidades em todos os meios testados,

seguido de fumitremorgina A e fumitremorgina C.

Segundo LEGGOTT & SHEPHARD (2001), o controle da patulina em sucos

e derivados de frutas pode ser alcanado utilizando-se matria-prima sadia,

estocagem em atmosfera controlada, retirando-se frutas rompidas ou danificadas,

retirando-se os tecidos rompidos, filtrao com carvo ativado, fermentao do suco

de ma, adio de dixido sulfrico, adio de cido ascrbico, irradiao e

pasteurizao.

A capacidade de dez linhagens de B. fulva e trs de B. nivea quanto

produo de patulina, em meio sinttico, foi avaliada por RICE et al. (1977). Duas,

das trs linhagens de B. nivea, e, as dez de B. fulva, produziram patulina. Uma das

linhagens de B. fulva foi inoculada em treze sucos de frutas processados, que foram

ento incubados a 25C por 14 dias, para posterior quantificao de patulina. A

patulina foi encontrada em todos os sucos, com exceo do suco de ameixa seca e

de tomate.


5.1.5 Controle do Crescimento

O crescimento dos microrganismos influenciado por vrios fatores

normalmente divididos em intrnsecos (pH, atividade de gua, potencial de xido-

reduo, contedo de nutriente, compostos antimicrobianos e estrutura biolgicas) e

extrnsecos (temperatura de conservao, umidade relativa do ambiente, presena e

concentrao de gases no ambiente) (JAY, 1992).

Dentre os fatores extrnsecos, a temperatura um dos mais importantes no

controle do crescimento dos microrganismos. No entanto, a temperatura no pode

ser utilizada no controle do crescimento de fungos filamentosos termorresistentes

devido resistncia dos ascsporos. Para destruio dos ascsporos seria

necessrio um tratamento trmico severo que comprometeria a textura, as

caractersticas organolpticas, nutricionais e a qualidade do produto, portanto, outros

fatores devem ser manipulados para controle do crescimento de fungos

termorresistentes (TOURNAS, 1994).

O efeito da temperatura no crescimento de fungos termorresistentes foi o

primeiro parmetro estudado na tentativa de prevenir a deteriorao de frutas

processadas. OLLIVER & RENDLE (1934) verificaram que a temperatura tima para

crescimento de Byssochlamys estava entre 30 e 37C, e que estocando o produto

de -12 a -7C o crescimento era inibido, no significando no entanto, a morte do

microrganismo. BEUCHAT e TOLEDO (1977) mostraram que no houve

crescimento de B. nivea em sucos e nctares de frutas estocados a 7C e que a

estocagem de ascsporos a 7 e - 30C teve um efeito letal. Entretanto, adicionando-

se acar nos produtos observou-se um efeito protetor.

NIELSEN et al. (1988) relataram que N. fischeri cresceu de 10 a 52C, com

uma temperatura tima entre 26 e 45C. Segundo TOURNAS (1989), o crescimento

timo e a formao de ascsporos de Neosartorya fischeri ATCC 66781, em meio

CYA, se deu entre as temperaturas de 30 e 36C, e no foi observado o crescimento

a 10C e a temperaturas inferiores.

ECKARDT e ARHENS (1978) estudaram a sobrevivncia de condios e

ascsporos de B. fulva em gua destilada a -18C, por um perodo de 34 semanas,


e observaram um declnio dos condios viveis, mas uma sobrevivncia

relativamente constante do nmero de ascsporos sobreviventes. Estes resultados

indicam que, embora a inativao dos ascsporos no possa ser assegurada, o

crescimento de Byssochlamys e Neosartorya, pode ser controlado estocando-os em

temperaturas reduzidas (TOURNAS, 1994)

O efeito da atividade de gua no crescimento de fungos termorresistentes

tambm tem sido objetivo de muitos trabalhos. Segundo BEUCHAT & RICE (1979),

embora a baixa atividade de gua em concentrados de frutas parea aumentar a

preservao destes produtos, este fator no deve ser utilizado no controle da

deteriorao por fungos termorresistentes em latas de frutas processadas, pois as

concentraes de sacarose se encontram em uma faixa que permite a germinao

de ascsporos e crescimento de Byssochlamys. OBETA & UGWUANYI (1997) em

estudos sobre o crescimento de N. fischeri, N. fischeri var. spinosa e N. quadricincta,

em gar contendo sucos de frutas, tambm observaram que, embora a adio de

sacarose em concentraes da ordem de 30% resultou em uma diminuio do

nmero de colnias formadas, a adio de sacarose em nveis de 10% resultou em

um aumento destas.

Para Byssochlamys sp. a atividade de gua mnima para que ocorra a

germinao 0,84, segundo BEUCHAT & TOLEDO (1977). TOURNAS (1989)

demonstrou que espcies de Byssochlamys cresceram em substratos com pH entre

2,0 e 9,0, enquanto que o crescimento de N. fischeri foi observado entre os valores

de pH de 3,0 e 7,95. Poucos trabalhos trazem informaes sobre a faixa de pH ou o

pH timo de crescimento de outros fungos termorresistentes, mas sabe-se que

crescem muito bem em regies de acidez. Deste modo, a manipulao do pH para

restrio do crescimento seria impraticvel, pois seriam necessrios valores muito

baixos de pHs, inadequados para produtos alimentcios (TOURNAS, 1994).


5.1.6 Ativao de Esporos de Fungos

TOURNAS (1994) diz que, de acordo com GOTTLIEB (1964), germinao

o processo pelo qual o esporo transformado de um estgio de dormncia para um

estado de alta atividade metablica. Esta alta atividade refletida na ativao de

processos produtores de energia necessria na sntese de protenas e subseqente

formao do microrganismo. A ativao do processo produtor de energia,

caracterizado por altas taxas de respirao, pode ser iniciada por um choque

trmico, por aplicaes de compostos qumicos, presena e ausncia de luz e

outros.

Segundo RAJASHEKHARA et al. (1996), a ativao de uma linhagem de N.

fischeri, isolada de mamo papaia deteriorado, foi tima a 80C de 15 a 30 minutos.

SPLITTSTOESSER et al. (1972) mostrou que havia uma interao entre o

meio de aquecimento e a temperatura do choque quando a temperatura de 60C era

utilizada, sendo que, em temperaturas mais altas (70 a 80C), a influncia do meio

era menos pronunciada. Mais tarde, SPLITTSTOESSER & SPLITTSTOESSER

(1977), ainda estudando a relao entre a taxa de ativao e o meio de

aquecimento, verificaram que a ativao de N. fischeri era mais rpida em suco de

uva a 5Brix em relao a gua destilada. KOTZEIKIDOU (1997) tambm estudando

a ativao de N. fischeri, constatou que esta era maior em suco de tomate que em

tampo fosfato.

Curvas de ativao, a 85C, utilizando-se tampo fosfato (0,1M e pH 7,0)

como meio de aquecimento para trs linhagens de N. fischeri foram feitas por

BEUCHAT (1986). Para as trs linhagens, os ascsporos com 64 dias apresentaram

um comportamento semelhante, com um tempo timo de 15 minutos. ARAGO

(1989) obteve o tempo timo de 10 minutos, a 80C, para ativao para ascsporos

de N. fischeri em suco de morango (15Brix e pH 3,0). BAGLIONI (1998) depois de

selecionar o fungo filamentoso mais termorresistente, identificado como N. fischeri,

verificou que os tempos onde se obteve maior recuperao de ascsporos, a 85C,

foram 10 e 20 minutos, para ascsporos com 1 e 3 meses de idade,

respectivamente. Segundo SALOMO (2002), ascsporos de N. fischeri com 1 ms


de idade, ativados em suco de ma (11,3Brix) a diferentes valores de pH (2,5, 3,5

e 4,5), apresentaram o mesmo tempo de ativao tima de 10 minutos a 85C.

CAPTULO III

MATERIAL E MTODOS

Captulo III: Material e Mtodos 49

1 FUNGOS TERMORRESISTENTES

Foram avaliados os crescimentos de dois fungos filamentosos

termorresistentes: Neosartorya fischeri e Byssochlamys nivea.

Neosartorya fischeri

Uma suspenso de esporos de Neosartorya fischeri, isolada por BAGLIONI

(1998), foi fornecida pelo Laboratrio de Termobacteriologia da Faculdade de

Engenharia de Alimentos da UNICAMP. A suspenso fornecida se encontrava

pronta para uso e foi utilizada na avaliao do crescimento deste fungo.

Byssochlamys nivea

A partir de uma cepa de Byssochlamys nivea, isolada por ARAGO (1989)

no Laboratrio de Termobacteriologia da Faculdade de Engenharia de Alimentos da

UNICAMP, foi preparada uma suspenso de esporos.

1.1 PREPARO DA SUSPENSO DE ASCSPOROS DE B. nivea

A suspenso de B. nivea foi preparada em garrafas de Roux, seguindo a

metodologia descrita por SALOMO (2002). Um fragmento da colnia do fungo foi

transferido para 22 tubos com tampa rosquevel contendo 0,5 mL de soluo 0,05%

de Tween 80 cada, utilizada para disperso do fragmento.

O contedo dos tubos foi utilizado para inocular, com auxlio de uma pipeta

estril, 22 garrafas de Roux (1L), contendo aproximadamente 200 mL de Agar

Extrato de Malte (MEA), pH 5,4 (formulado conforme PITT & HOCKING, 1985), cada

uma. As garrafas foram incubadas a 30C, por um perodo de 30 dias para permitir a

esporulao e o desenvolvimento das estruturas produtoras de ascos e ascsporos.

Aps o perodo de incubao, os esporos de B. nivea foram recolhidos

adicionando-se vinte e cinco mililitros de gua destilada estril em cada garrafa, e

raspando-se levemente a superfcie de cada uma, com o auxlio de prolas de vidro

e uma bagueta de vidro estril. Para remoo de fragmentos de hifas, a suspenso


resultante foi filtrada atravs de camadas de gaze estril e centrifugada a 4000 rpm

por 30 minutos sob uma temperatura de 5C. Posteriormente, foi realizada a

lavagem do precipitado com mais uma centrifugao em gua estril. A ausncia de

hifas e a obteno de ascsporos e ascos livres foram verificadas

microscopicamente. A suspenso final foi preparada ressuspendendo-se o

precipitado em um pequeno volume de gua. A suspenso foi estocada sob

refrigerao em um recipiente de vidro estril.

1.2 QUANTIFICAO DAS SUSPENSES DE ESPOROS

Para a determinao da concentrao das suspenses de esporos de

N. fischeri e B. nivea, estas foram ativadas a 80C por 30 minutos

(RAJASHEKHARA et al., 1996). Aps permanecer 30 minutos a 80C, a suspenso

foi imediatamente resfriada em um banho de gelo. A partir das suspenses ativadas

foram feitas diluies decimais sucessivas, sendo cada diluio plaqueada por

profundidade, em duplicata, utilizando o meio gar Extrato de Malte (MEA),

formulado de acordo com PITT & HOCKING (1985). Aps trs dias de incubao a

30C, foi feita a contagem do nmero de unidades formadoras de colnia (UFC/mL)

de cada placa. A contagem foi confirmada no quinto dia.

1.3 MEIO DE CRESCIMENTO

Foram utilizados sucos comerciais de abacaxi e de maracuj, de um nico

fabricante. Para que as polpas dos sucos no interferissem na determinao da

biomassa, estas foram removidas por centrifugao, a 4500 rpm durante 20 minutos.

Os sucos foram centrifugados, em tubos de ensaio descartveis temperatura de

5C.

Como os valores de pH dos sucos se encontravam prximos de 3,5 (WTW

pH 330i/SET) aps a centrifugao, o que favorece o crescimento de fungos, este

valor foi selecionado para a padronizao dos mesmos. O pH do suco de abacaxi foi

ligeiramente diminudo utilizando-se uma soluo 0,5 N de cido clordrico e o pH do


suco de maracuj aumentado utilizando-se uma soluo de 0,1N de hidrxido de

sdio.

O crescimento de N. fischeri foi avaliado apenas em suco de abacaxi,

enquanto o crescimento de B. nivea foi avaliado em suco de abacaxi e de maracuj.

Os meios de crescimento, as temperaturas de incubao e o nmero de repeties

dos experimentos realizados para cada tipo de fungo esto na Tabela 3.1

Tabela 3.1 - Condies para Determinao dos Parmetros de Crescimento de N. fischeri e B. nivea Fungo Filamentoso Meio de crescimento Temperatura N de repeties

N. fischeri Suco de abacaxi 30C 2

20C 2 Suco de abacaxi 30C 7

20C 2 B. nivea

Suco de maracuj 30C 2


2 AVALIAO DO CRESCIMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS TERMORRESISTENTES

O crescimento dos fungos foi avaliado individualmente para cada tipo de

suco. Foram adicionados 18 mL de suco em frascos erlenmeyers de 100 mL. Os

frascos preenchidos foram aquecidos a 115C por 2 minutos para pasteurizao do

suco. Aps a pasteurizao, a quantidade de slidos solveis foi medida por um

refratme

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