Doutoranda em Fitotecnia ESALQ/USP melhoramento... · Indução de Mutação "in vitro" em Aster sp. OBJETIVOS E ATIVIDADES - Obter flores de Aster com novas colorações e novos

Melhoramento de plantas ornamentais

Lívia Mendes de Castro

Doutoranda em Fitotecnia ESALQ/USP

As necessidades do setor de ornamentais

a) Novidades como mola propulsora para manter e estimular o interesse dos consumidores de flores e plantas ornamentais; b) Modernas técnicas de melhoramento genético levam a variedades de: mais fácil cultivo maior apelo ao público maior durabilidade;

c) novas variedades selecionadas mais adequadas ao cultivo intensivo e de baixo custo; d) aprimoramento das características desejadas pelos consumidores: cor da moda, durabilidade, altura, perfume

As necessidades do setor de ornamentais

Melhoramento Genético

TRADICIONAL X BIOTECNOLOGIA

Cultura de Tecidos Vegetais Seleção

Introduções

Cruzamentos

Também pode utilizar

cultura de tecidos

Melhoramento Genético Tradicional

Gladíolo (Gênero Gladiolus)

FATORES DE SELEÇÃO (cormos)

Alta taxa de propagação,

Cormo deve ter bom crescimento,

Resistência a pragas/doenças,

Condições climáticas adversas,

Adaptação à mecanização

FATORES DE SELEÇÃO (flores)

Alta qualidade comercial (potencial ornamental) sob grande variação de temperatura e luminosidade,

Sejam fáceis de manusear, embalar e armazenar,

Capacidade para a antese após 2-3 dias de armazenamento a seco das hastes cortadas.

COLETA E CONSERVAÇÃO DE PÓLEN POLINIZAÇÃO:

Melhoramento Gladíolo


1

4 3

2


5 6


Melhoramento Bromélia




A Experiência da Bromélias Rio

Introdução

Início das atividades 1993 Local Campinas, SP Início programa de Melhoramento Genético 1995

A Experiência da Bromélias Rio

Principais Gêneros

Guzmania

Aechmea

Vriesea

Principais Gêneros

Neoregelia Tillandsia

Área de Genética – 5000 m²

Objetivos

Obtenção de novas cultivares que possuam: Valor comercial

Competitividade no mercado

Novidade

Vantagens culturais

Processo de polinização

Fig 1: Retirada do pólen do parental masculino

Fig 2: Preparação da flor do parental feminino

Fig 3: Processo de Polinização

Formação de Sementes

Fig 4: Detalhe das cápsulas formadas após a polinização

Fig 5: Cápsulas maduras

Fig 6: Detalhe da cápsula madura já colhida

Fig 7: Sementes prontas para semeadura

Germinação das Sementes

Fig 8: Germinação das sementes

Fig 9: Transplante para vaso comunitário

Fig 10: Transplante para bandejas de células individuais

Colocadas em ambiente especial para germinação e crescimento

Transplantes

Fig 11: Mudas transplantadas para pote intermediário

Fig 12: Mudas transplantadas para

Avaliação das Plantas

Fig 13: Plantas resultantes de cruzamentos prontas para avaliação

Fig 14: Plantas resultantes de cruzamentos escolhidas após avaliação

Etapas do processo de melhoramento e lançamento de novas cultivares

ETAPA INICIAL – TEMPO (meses)

Polinização até formação das

sementes

Maturação das sementes

Semeadura 1º transplante

1º transplantes até multivaso

AECHMEA 3 3 2,5 2,5

VRIESEA 3 3 6 3,5

GUZMANIA 3 3 3 3

NEOREGELIA 3 3 2,5 2,5


ETAPA INTERMEDIÁRIA – TEMPO (meses)

MT para PI PI para PF PF até Indução

Indução até auge flor

Formação Matrizeiro

AECHMEA 3 4 8 2,5 1,5

VRIESEA 4 4,2 14 3,5 2

GUZMANIA 4 5 10 3 2

NEOREGELIA 3,5 4 8 2 1,5


ETAPA FINAL – TEMPO (meses)

Isolamento e micropropagação

Cultivo Comercial

Tempo Total (meses)

Tempo Total (anos)

AECHMEA 18 18 66 5,5

VRIESEA 24 24 91 7,6

GUZMANIA 24 20 80 6,7

NEOREGELIA 20 20 70 5,8

Resultado dos cruzamentos

Tempo total para obtenção de uma nova cultivar >> 7 anos

Aproveitamento: máx. 1% das plantas obtidas

Cruzamentos realizados: 1500 Guzmania; 1500 Vriesea; 500 demais gêneros

Exemplo de uma nova cultivar obtida por cruzamento - Aechmea

Mãe: Aechmea chantinii x Aechmea tesmanii loreto

Pai: Aechmea fasciata sem espinho

Filho: Aechmea 416C

Exemplo de uma nova cultivar obtida por cruzamento - Guzmania

Pai: Guzmania lingulata amarela

Filho: Guzmania 509

Mãe: Guzmania Hilda

Exemplo de melhoramento

Aechmea com espinho original

Aechmea sem espinho melhorada

Ferramenta Auxiliar no Melhoramento

Cultura de Tecidos Vegetais

Cultura de Tecidos Vegetais

Micropropagação de ornamentais

Variação Somaclonal em Diversos Sistemas de Cultura de Tecidos

Variação Somaclonal : variação genotípica e/ou fenotípica ocorrida em plantas regeneradas

Variação Somaclonal em Diversos Sistemas de Cultura de Tecidos

Variantes Somaclonai de Heliconia bihai obtidas in vitro

A B

A ) VCL – Variação da clorofila na folha B) LSV – Variante de porte baixo

Variantes Somaclonai de Heliconia bihai obtidas in vitro

D C

C ) VCPP – Variante da coloração do pseudocaule e pecíolo D) Haste floral normal

Inovações Tecnológicas

no Melhoramento Genético

de Plantas Ornamentais

BIOTECNOLOGIA

Inovações Tecnológicas no

Melhoramento Genético de Plantas

Ornamentais

Porque usar? Características Genéticas

propagação vegetativa

juvenilidade

alta heterozigozidade

cruzamentos com grande segregação

ausência de características de interesse no “pool” gênico

ex. flôres azuis, resistência à doenças, etc.

Tecnologias Complementares no

Melhoramento Genético de Plantas

Ornamentais

Cruzamento e seleção

Indução de mutação

Técnicas biotecnológicas micropropagação variação somaclonal limpeza de vírus

Transgenia Marcadores moleculares (melhoramento assistido)

Micropropagação de plantas ornamentais

Finalidades:

propagação intensiva de novas variedades e espécies e redução do tempo de lançamento

redução do tempo de lançamento

limpeza de vírus – indexação (limpeza clonal)

manutenção de germoplasma e identidade genética

manutenção do vigor híbrido ou heterose

Micropropagação de plantas ornamentais

Indução de Mutações em Ornamentais: ampliação da variabilidade genética

Mutações são mudanças na seqüência de nucleotídeos do material genético de um organismo.

Citoplasmática ou nucleares.

Pode ser natural ou induzidas.

Induzidas de forma química ou física.

Mutantes espontâneos em trevo (Trifolium repens L.)

MUTANTE

ORIGINAL

http://www.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Clover/WT.html

http://www.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Clover/EP.html

http://www.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Clover/AD.html

http://www.cropsoil.uga.edu/~parrottlab/Clover/DD.html

Métodos de obtenção de novas cultivares

Cruzamento : X

INDUÇÕES DE MUTAÇÕES

OBJETIVO: Aumento da variabilidade.

IMPORTÂNCIA EM ORNAMENTAIS Cultivares mutantes liberados

ornamentais - 552

culturas - 1700

INDUÇÕES DE MUTAÇÕES

Mutagênicos físicos e Mutagênicos químicos

PRINCÍPIOS BÁSICOS:

A ocorrência é ao acaso

Método eficaz de seleção

A mutação é um evento unicelular

A maioria das mutações são deletérias

Usar grandes populações

TRATAMENTOS E PARTES DAS PLANTAS

IN VIVO IN VITRO

Sementes Sementes

Estacas Estacas

Folhas Folhas

Pólen Pólen

Plantas Plantas

Ápices

Brotos axilares

Pecíolo

Raiz

Suspensões celulares

Protoplastos

AGENTES MUTAGÊNICOS

Radiações mutagênicas ionizantes

Raios-X,

Raios-gama;

Nêutrons, U.V

Alta penetração nos tecidos (Acidente Césio 137)

Doses: energia absorvida: Gray (Gy)

Raio X

Centro de Energia Nuclear na Agricultura - CENA

Centro de Energia Nuclear na Agricultura - CENA

Mutação in vitro

Mutação in vivo

AGENTES MUTAGÊNICOS

Mutagênicos Químicos:

Agentes alquilantes:

EMS – metanossulfonato de etila PM 124

Uso: concentração, tempo, pH Ex.: EMS 0,1 M (12,4 g/l), 5 horas pH 7.0

AÇÃO ALVO EFEITOS

DIRETA

RADIAÇÃO

INDIRETA

IONIZAÇÃO

RADICAIS

LIVRES

HORMÔNIOS

ENZIMAS

DNA

PROTEÍNAS ●

●

●

FISIOLÓGICOS

(V1M1; M1)

GENÉTICOS

(V2M1; M2)

EFEITOS FISIOLÓGICOS (M1; V1M1)

EFEITOS GENÉTICOS

(M2; M3… V2M1; V3M1…)

Redução: Na germinação

Na sobrevivência Na altura da planta

No número de brotos

Mutações gênicas

Mutações cromossômicas

Aumento da esterilidade

Importância Seleção da dose:

LD e /ou GR 30 – 50

Seleção da Dose

Escolha do material a ser tratado e ocorrência do quimerismo

QUIMERISMO Existência na mesma planta de dois ou mais tecidos somáticos geneticamente distintos.

Organização túnica-corpo

TIPOS DE QUIMERISMO

• Podem ser divididas quanto ao arranjamento das células que lhe

deu origem em: setorial, mericlinal e periclinal.

ORIGEM DO QUIMERISMO

• Quimeras surgem quando uma ou mais células do meristema sofre mutação.

IDENTIFICAÇÃO DO QUIMERISMO

Se a célula mutada fica no meristema , em seguida, todas as outras células que são produzidas pela divisão desta será também mutada.

O resultado será a células de diferentes genótipos em crescimento adjacentes em um tecido vegetal.

Se a localização da célula no momento da mutação está em uma região onde a divisão celular é pouco, então a probabilidade de detectar esta mutação é baixa.

Além disso, se os resultados da mutação em um genótipo não são muito diferentes morfologicamente do resto da planta, então a probabilidade de identificação da planta como uma quimera também é baixa.

Indução de mutações pode ser feita tanto em estacas (ou partes propagativa) como em sementes.

Indução de mutações pode ser feita tanto in vitro como in vivo.

Indução de mutações pode ser feita tanto de forma química como de forma física.

Indução de mutações somáticas em gemas in vivo

Indução de mutações somáticas em gemas in vitro






Exemplos de programas de melhoramento com indução de mutações envolvendo ornamentais

Calathea Aster spp. Chrysanthemum

Gladíolos

Stromanthe Bromélias

INDUÇÃO DE MUTAÇÃO IN VIVO, NO MELHORAMENTO DE CRISÂNTEMO






Indução de mutação em crisântemo de vaso

SELEÇÃO DOS MUTANTES

•Coloração

•Morfologia

•Cor e Morfologia

• Realizada no período de florescimento

Empresa: Dekker de Wit

EXEMPLOS

08

63 36

22

110

13

Cherry Dark

Indução de Mutação "in vitro" em Aster sp.

OBJETIVOS E ATIVIDADES

- Obter flores de Aster com novas colorações e novos formatos no cultivar The king (cor roxa)

1) cultivo de plantas "in vitro“;

2) determinação da sensitividade de plantas "in vitro" a raios- gama (aster cv. the king) LD 50

3) Irradiação de plantas "in vitro" com doses de 15,20,25 e 30 gy de raios-gama;

4) Multiplicação das plantas irradiadas (3 subcultivos);

5) Plantio em estufas comerciais, seleção dos mutantes no florescimento.


Dose (Gy)

Taxa de Crescimento: Média de Plantas

(cm) %

0 2,185 a 100,0

10 1,860 ab 85,2

15 1,785 abc 81,7

20 1,347 bcd 61,7

25 1,440 bcd 65,9

30 1,263 cd 57,8

35 1,194 d 54,6


Indução de Mutação "in vitro" em mini-rosa

Indução de Mutação em Rosa de Vaso

Indução de Mutação em Gladíolo

• Esquema

Irradiação de bulbilhos com diferentes dosagens de raios-gama: 10,20 e 30 Gy.

Plantio 1° ano.

Colheita do bulbo pequeno.

Beneficiamento e armazenamento dos bulbos.

Plantio 2° ano .

Avaliação dos mutantes durante o florescimento

Seleção e propagação dos mutantes de interesse


Variedade Está Bonita


Variedade Red Beauty

Métodos de transformação

genética de plantas:

exemplos em ornamentais

Fundamentos da Biotecnologia

• Identificação e isolamento de genes – bactérias são excelente fontes • Manipulação e modificação dos genes • Transferência de gene para plantas • Avaliação das plantas modificadas

Transformação de Plantas

Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou

regeneração,

Método de transferência de gene,

Identificação de células transformadas por seleção,

Regeneração de plantas de células transformadas,

Plantas transgênicas analisadas para confirmar presença do

transgene,

Plantas transgênicas avaliadas para performance.

Métodos de Transformação Genética

Métodos diretos

• Os métodos diretos são aqueles que provocam modificações nas paredes e membranas celulares para introdução de DNA exógeno, através de processos físicos ou químicos.

Eletroporação de protoplastos.

A transformação mediada por PEG (polietilenoglicol).

Bombardeamento de partículas.

Métodos de Transformação Genética

Métodos indiretos

• O método indireto requer a utilização de um vetor biológico para a introdução do DNA na planta.

Vetores:Agrobacterium

tumefaciens e A. rhizogenes.

Eletroporação de protoplastos ou uso de PEG

• Os plasmídeos são incorporados aos protoplastos, pelo processo de endocitose.

• A freqüência de assimilação dos plasmídeos é normalmente baixa, mas pode ser elevada com a adição de PEG (polietileno glicol) ou pela eletroporação.

• maior problema a dificuldade de regeneração do protoplasto

Os protoplastos são expostos a pulsos curtos de corrente contínua e alta voltagem, em presença do DNA exógeno (Fromm et al., 1985).

Transformação mediada por PEG

Polietilenoglicol (PEG), usado em combinação com Ca+2, Mg+2 e pH alcalino, promove a ligação do DNA exógeno à superfície dos protoplastos.

O DNA é absorvido pela célula por endocitose.

O tratamento com PEG pode danificar grande número de células, reduzindo a capacidade de regeneração.

Bombardeamento de partículas

• Esse método consiste na aceleração de micropartículas de metal, que atravessam a parede celular e a membrana plasmática, carreando DNA para o interior da célula (Sanford, 1988).

• Também chamado de aceleração de microprojéteis ou método biolístico.

• Um microprojétil é definido como qualquer partícula capaz de ser acelerada, de maneira que penetre nas células (Sanford, 1990).

Agrobacterium

• Agrobacterium é uma bactéria de solo, Gramnegativa, aeróbica, pertencente à Família Rhizobiaceae (Zambrisky, 1988).

A. tumefaciens

A. rhizogenes

• As bactérias possuem plasmídeos que recebem denominações de acordo com a alteração de desenvolvimento vegetal que provocam: Ti, indutor de tumores, e Ri, indutor de raízes.

Desarmamento da bactéria.

• a inclusão de genes marcadores no T-DNA:

(uidA- β-glucuronidase)

ou genes de resistência a antibióticos hpt II (higromicina) ou npt II (canamicina).

Exemplo de espécies ornamentais transformadas

Rosa

Cravo

Gérbera

Tulipa

Crisântemo

Lírio

Etapas da transformação genética de plantas



Aplicações de transgênicos

• Características de Produção -”Input” – visam redução de custo de produção

• resistência à doenças, pragas, herbicidas

• “performance” - produtividade e eficiência

• Características de Consumo -”Output” – acrescentam valor - “value added”

• novas cores, formas, tamanho, conservação, fragrância

Riscos Associados a Transgênicos

• Vazamento de Informação Genética • resistência à pragas, doença, herbicidas para ervas

daninhas aparentada

• Efeitos Ambientais Adversos • invasão de habitats naturais

• Alergia • resistência a degradação digestiva

• estabilidade ao calor e ácido

– consumidores mais confiantes com ornamentais transgênicos do que alimentos transgênicos

Aplicações de Transgênicos para Produção - “Input”

• Resistência à insetos *

– uso de toxina de Bacillus thurigiensis - Bt

• Resistência à viroses * – introdução de gene da capa protéica

• Resistência à fungos e bactérias – introdução de quitinase e glucanase

• Fusarium oxysporium f.sp. dianthii

Resistência a Insetos

• Genes codificando para proteínas inseticidas (cry1, cry2, cry3) isolados de Bacillus thuringiensis - toxinas Bt

• Genes de toxinas de Bt modificados e introduzidos em plantas

– milho, algodão, batata, crisântemo.

Resistência a Vírus

Planta manipuladas para expressar proteínas virais podem ser resistentes aquele vírus.

Isolar gene codificando capa protéica do vírus.

Adicionar promotor constitutivo para expressar esse gene na planta.

Produzir plantas transgênicas.

Avaliar para resistência ao vírus

gene da capa protéica do vírus promotor 35 S

Aplicações de Transgênicos para Consumo - “Output”

• Novas cores * – alteração da biossíntese de antocianinas

• Redução da senescência - “longa vida” * – inibição da síntese/ação de etileno

• Alteração de Tamanho e Forma de Plantas e Flores * – alteração sensibilidade à fitohormônios, genes homeóticos

• Alteração da fragrância – biossíntese de monoterpenos

Pigmentação de Flores

• Função: – atração de polinizadores

– repelir herbívora

– proteção contra UV

• Mutação de cor afeta isolamento genético e especiação na natureza

• Estudos em Petúnia e Antirrhinum (boca de

leão)

Rota de Biossíntese de Antocianinas

O

OOH

OHHO

OH

Dihidroxikaempeferol

F3’H

F3’5’H

O

OOH

OHHO

OH

Dihidroxikaempeferol

OHO

OHO

OH

OH

OH

dihidroquercitina OH

HOOH

OHO

O

Dihidromiricetina OH

OH

DFR AS 3GT

DFR AS 3GT

Rota de Biossíntese de Antocianinas

O

OH

OHHO

O-Gluc

Pelargonidina-3-glucose

OH

OH

OH

HO O

Cianidina-3-glucosídeo

O-Glucose

OH

OH

O

OH

OH HO

O-Glucose

Delfinidina-3-glucosídeo

Alteração da Cor por Introdução de Gene-Enzima

1. baixa atividade de DFR de Petunia

ausência de flor laranja (pelargonidina)

2. ausência de F3’5’H em rosa e cravo

ausência de flores azuis (delfinidinas)

3. introdução de chalcone redutase

> formação de cor amarela

Expressão de dfr de milho em Petúnia

sem F3’5’H

com F3’5’H

Introdução de F3’5’H em cravo

Alteração da Cor por Antisenso ou Senso

• Antisenso de CHS - inibe síntese de antocianina e flavonóis

Co-supressão por introdução de CHS (cópia extra)

normal normal transgênico

transgênico transgênico transgênico



Produtos Transgênicos Comerciais

• Florigene - Austrália

– A partir de cravo branco - gene F3’5’H • Cravo “Moondust” - 1996

• Cravo “Moonshadow” – 1998

• Novartis

– introdução de Dfr de gérbera em petúnia • Petúnia laranja

Modificando Qualidade na Pós-Colheita

• Etileno regula amadurecimento e senescência de flores e frutos

• Biossíntese e resposta ao etileno são alvos para engenharia genética

SAM ACC Etileno Expressão

Gênica

Senescência

Maturação

Controlando a Senescência

SAM ACC Etileno Expressão

Gênica

Maturação

Senescência

Métodos de controle de senescência incluem: – Desligando genes responsáveis pela síntese de etileno

– Bloqueando a ação de etileno

– Desligando genes expressos durante a maturação/senescência

Crisântemo com gene cryA controle

Cravo “White Sim” 8 dias pós-colheita

35S-antisenso aco controle

PROTEÇÃO E REGISTRO DE CULTIVARES

Vantagens de uma proteção efetiva para ornamentais

a) amplo acesso via licenciamento aos produtos de vanguarda no mercado internacional. b) maior satisfação do consumidor, maior competitividade e maior absorção de mão-de-obra. • Consumo interno per capita hoje de US$ 7,00 • Consumo potencial pelo menos equivalente ao dobro.


c) Consolidação do Brasil como exportador de ornamentais no mercado internacional de flores (avaliado em US$ 48 bilhões anuais) e abertura de novos mercados. • Participação nacional neste mercado é de apenas 0,22% , mas o potencial do país permite um crescimento para cerca de 1,5% nos próximos anos.

d) Mais fácil acesso de nossas exportações crescentes de ornamentais aos mercados preferenciais dos países desenvolvidos pela maior credibilidade da floricultura nacional;


e) Desenvolvimento de empresas nacionais de melhoramento genético em floricultura, que utilizem nossa diversidade natural para pesquisas de variedades novas brasileiras; f) Auto-sustentação, via royalties, dos setores de pesquisa governamentais ligados ao agro-negócio, (Embrapa, EPAGRI, IAC, ESALQ, FAPESP, entre outras Universidades).

Situação atual : Ornamentais passíveis de proteção

A Lei nº 9.456 de 25 de abril de 1997, promulgada juntamente com o Decreto nº 2366 de 5 de Novembro de 1997,

criou o Sistema de Proteção de Cultivares no Brasil. No sistema atual brasileiro de proteção de cultivares uma flor ou planta só pode ser protegida se tiver seus descritores (características diferenciadoras de cada espécie ou gênero) publicados pelo Ministério de Agricultura, via órgão de proteção, no caso SNPC - Serviço de Proteção de Cultivares.


Somente em 2002 foi publicado os descritores da primeira ornamental: a ROSA. Até o momento são protegíveis e dispõem de formulários com descritores publicados no site do MAPA link SNPC as seguintes espécies vegetais e/ou gêneros:

1. Amarílis ( Hippeastrum Herbl) 2. Antúrio (Anthurium Schott) 3. Aster (Aster L) 4. Begônia elator ( Begonia x Helmatis Forsch)


5. Bromélia (Guzmania spp) 6. Calanchoe (Kalanchoe Adans) 7. Cimbídio (Cymbidium Sw.) 8. Cravo ( Dianthus L) 9. Crisântemo (Chrysanthemun spp) 10. Estatice (Limonium Mill.,Goniolimon Boiss. E Psythostachys (Jausb e Spach) Nevski). 11. Gérbera ( Gerbera Cass) 12. Grama Esmeralda e Santo Agostinho (Zoysia japonica Stend e Slenolaphrumn Secundatum (Walt) Rutze) 13. Gipsofila (Gypsophila spp) 14. Hibisco ( Hibiscus rosa-sinensis) 15. Hipérico ( Hypericum L) 16. Lírio (Lilium L) 17. Poinsetia (Euphorbia pulcherrima Willd.Exklotzsch) 18. Rosa (Rosa L) 19. Solidago ( Solidago virgaurea L) 20. Violeta ( Saintpaulia H. Wendl)

Quantidade de ornamentais protegidas hoje por espécie ou gênero:

15 variedades de ROSA 3 variedades de GRAMA 1 variedade de CRISÂNTEMO Em andamento atualmente processos de proteção para cerca de 40 novas variedades de ornamentais, incluindo crisântemos, rosas, bromélia, violeta e begônia.

Não é muito se considerarmos que no mundo, 60 % das proteções concedidas são de ornamentais.

Perigo ! Syngonathus chrisanthus (Sempre viva) Campo, rupestre (Santa Catarina)

OBRIGADA!

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