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Dr. Edilson Ramos Gomes
Dr. Enrique Alonso Zuñiga
Drª Luz Maria Ruiz Machuca
(Orgs.)
O ESTRESSE DAS PLANTAS
CULTIVADAS
&
PROTOCOLOS DE ANÁLISE
CONSELHO EDITORIAL ACADÊMICO
RESPONSÁVEL PELA PUBLICAÇÃO DESTA OBRA
Prof. Dr. JOÃO CARLOS CURY SAAD FCA/UNESP – Campus de Botucatu
Prof. Dr. WILLIAN FERNANDO ZAMBUZZI IBB/UNESP – Campus de Botucatu
Prof. Dr. GUSTAVO DA ROCHA DE CASTRO IBB/UNESP – Campus de Botucatu
© 2018 Editora Fepaf
Fundação de Estudos e Pesquisas Agrícolas e Florestais
Rua Dr. José Barbosa de Barros, 1780
Fazenda Experimental Lageado - Botucatu - SP.
Cep.: 18610-307
Fone/Fax: 14 3880-7127
www.fepaf.org.br
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO
– DIRETORIA TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP)
O estresse das plantas cultivadas & protocolos de aná-
E82 lise / Organizadores: Edilson Ramos Gomes; Enrique
Alonso Zuñiga; Luz Maria Ruiz Machuca - Botucatu: FEPAF,
2018
110 p.: fots. color., grafs., ils. color., tabs.
1 livro digital
Disponível em: http://www.fepaf.org
ISBN 978-85-7170-000-0
Inclui bibliografia
1. Estresse - Plantas. 2. Produção vegetal. 3. Bioquí-
mica. 4. Métodos analíticos. I. Gomes, Edilson Ramos. II.
Alonso Zuñiga, Enrique. III. Machuca, Luz Maria Ruiz. IV.
Fundação de Estudos e Pesquisas Agrícolas e Florestais. V.
Júlio de Mesquita Filho. Faculdade de Ciências Agronômicas.
CDD 23. ed. (632.1)
Sumário
CAPÍTULO 1 ................................................................................................................................... 1
CARACTERIZAÇÃO E PROCESSO DE ANÁLISE DE ÁGUA RESIDUÁRIA ............................................ 1
1. Introdução ................................................................................................................................. 1
2. Metodologia de coleta e análise de água residuária ................................................................ 2
2.1 Diagnóstico físico-químico da água residuária .................................................................... 3
2.2 Processo de filtragem e ozonização da água residuária ..................................................... 5
2.2.1 Filtragem ...................................................................................................................... 5
2.2.2 Ozonização ................................................................................................................... 6
2.3 Análise microbiológica da água residuária .......................................................................... 7
2.3.1 Coliformes totais e coliformes termotolerantes .......................................................... 7
2.3.2 Contagem de ovos de helmintos na água residuária ................................................... 9
Referências .................................................................................................................................. 11
CAPÍTULO 2 ................................................................................................................................. 12
ETAPAS PARA DIMENSIONAMENTO DE EXPERIMENTO COM DÉFICE HÍDRICO ......................... 12
1. Introdução ............................................................................................................................... 12
2. Etapas cronológicas de execução ............................................................................................ 13
2.1 Determinação de delineamento experimental ................................................................. 13
2.2 Características químicas e físicas ...................................................................................... 13
2.2 Análises hídricas ................................................................................................................ 14
2.2.1 Curva de retenção de água do solo ............................................................................ 14
2.2.2 Etapas para determinação da curva de retenção ...................................................... 14
2.2.3 Ajuste da curva de retenção de água no solo ............................................................ 16
2.3 Instalação dos tensiômetros de punção e monitoramento da tensão de água do solo ... 17
2.4 Manejo da irrigação (irrigação por gotejamento) ............................................................. 17
Referências .................................................................................................................................. 19
CAPÍTULO 3 ................................................................................................................................. 21
REUSO DE ÁGUA NA AGRICULTURA: ASPECTOS AMBIENTAIS E AGRONÔMICOS ...................... 21
1. Introdução ............................................................................................................................... 21
2. Potencial agrícola das águas residuárias ................................................................................. 22
3. Tratamento dos efluentes ....................................................................................................... 23
4. Aplicação das águas residuárias em culturas agrícolas ........................................................... 24
5. Considerações finais ................................................................................................................ 25
Referências .................................................................................................................................. 26
CAPÍTULO 4 ................................................................................................................................. 29
ASPECTOS QUALITATIVOS DA ÁGUA PARA IRRIGAÇÃO .............................................................. 29
1. Introdução ............................................................................................................................... 29
2. Principais critérios para estabelecer a qualidade da água para irrigação ............................... 30
2.1 Salinidade .......................................................................................................................... 30
2.2 Sodicidade ......................................................................................................................... 31
2.3 Concentração de íons específicos ..................................................................................... 32
2.4 Interpretação da qualidade de água para irrigação .......................................................... 33
Referências .................................................................................................................................. 34
CAPÍTULO 5 ................................................................................................................................. 36
CONTEXTUALIZAÇÃO ECONÔMICO-FINANCEIRA SOBRE O USO DO LODO DE ESGOTO NA
AGRICULTURA ............................................................................................................................. 36
1. Introdução ............................................................................................................................... 36
2. O potencial do lodo de esgoto para economia ....................................................................... 37
Referências .................................................................................................................................. 40
CAPÍTULO 6 ................................................................................................................................. 42
LODO DE ESGOTO: CARACTERISTICAS NUTRICIONAIS E EFEITOS DA UTILIZAÇÃO NO SOLO ..... 42
1. Introdução ............................................................................................................................... 42
2. Lodo de esgoto ........................................................................................................................ 43
2.1 Características nutricionais do lodo de esgoto ................................................................. 45
2.2 Efeitos da utilização de lodo de esgoto no solo ................................................................ 46
Referências .................................................................................................................................. 49
CAPÍTULO 7 ................................................................................................................................. 51
USO DO LODO DE ESGOTO EM PLANTAS .................................................................................... 51
1. Introdução ............................................................................................................................... 51
2. Lodo de esgoto na nutrição de plantas ................................................................................... 52
Referências .................................................................................................................................. 56
CAPÍTULO 8 ................................................................................................................................. 59
PIGMENTOS FOLIARES ................................................................................................................ 59
1. Introdução ............................................................................................................................... 59
2. Clorofilas .................................................................................................................................. 59
3. Antocianinas ............................................................................................................................ 61
4. Extração e análise dos teores de pigmentos ........................................................................... 61
4.1 Preparo da amostra ........................................................................................................... 61
4.2 Ensaio ................................................................................................................................ 62
Referências .................................................................................................................................. 64
CAPÍTULO 9 ................................................................................................................................. 65
PROTEÍNAS SOLÚVEIS TOTAIS ..................................................................................................... 65
1. Introdução ............................................................................................................................... 65
2. Material e reagentes ............................................................................................................... 66
2.1 Determinação de Proteína solúvel total pelo método Bradford (Bradford, 1976) ........... 66
2.1.1 Ensaio ......................................................................................................................... 66
2.1.2 Preparo das soluções ................................................................................................. 66
2.1.3 Curva padrão .............................................................................................................. 67
2.2 Determinação de Proteína pelo método do amido negro (Popov, 1975) ........................ 67
2.3 Protocolo ........................................................................................................................... 68
Referências .................................................................................................................................. 70
CAPÍTULO 10 ............................................................................................................................... 71
RAZÃO ISOTÓPICA DE 13C/12C E 15N/14N ..................................................................................... 71
1. Introdução ............................................................................................................................... 71
2. Aplicação dos isótopos δ 13C e δ 15N em plantas sob estresse ................................................ 72
2.1 Coleta e processamento do material vegetal ................................................................... 73
2.2 Análises da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N ......................................................... 75
2.3 Determinação da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N ............................................... 75
Referências .................................................................................................................................. 76
CAPÍTULO 11 ............................................................................................................................... 77
FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a: ASPECTOS GERAIS E PROTOCOLO DE MEDIDA PARA LI-
6400/LI-6400XT ........................................................................................................................... 77
1. Introdução ............................................................................................................................... 77
2. Testes básicos de funcionamento da câmara de fluorescência da folha (LCF) ....................... 82
2.1 Calibração do flash retangular .......................................................................................... 85
2.2 Definição da intensidade ótima da luz de medidas (Meas) .............................................. 86
2.3 Definição da intensidade do flash de saturação ............................................................... 87
2.4 Protocolo para flash multifásico (MultiPhase Flash) ......................................................... 89
2.5 Medida da fluorescência da clorofila ................................................................................ 91
Referências .................................................................................................................................. 94
CAPÍTULO 12 ............................................................................................................................... 96
CURVA FOTOSSINTÉTICA DE RESPOSTA À LUZ (CURVA A-Q): CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS E
PASSO A PASSO PARA EXECUÇÃO ............................................................................................... 96
1. Introdução ............................................................................................................................... 96
2. Considerações operacionais .................................................................................................... 97
2.1 Curva rápida ...................................................................................................................... 97
2.2 Curva lenta ........................................................................................................................ 98
2.3 Luz ..................................................................................................................................... 98
2.4 CO2 ..................................................................................................................................... 98
2.5 Temperatura...................................................................................................................... 99
2.6 Umidade ............................................................................................................................ 99
2.7 Passo a passo da curva de luz rápida automática (Autoprogram) .................................... 99
Referências ................................................................................................................................ 102
CAPÍTULO 13 ............................................................................................................................. 103
CURVA FOTOSSINTÉTICA DE RESPOSTA AO CO2 (CURVA A-CI): CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS E
PASSO A PASSO PARA EXECUÇÃO ............................................................................................. 103
1. Introdução ............................................................................................................................. 103
2. IRGA LI-6400XT ...................................................................................................................... 105
2.1 Luz ................................................................................................................................... 105
2.2 CO2 ................................................................................................................................... 105
2.3 Temperatura.................................................................................................................... 105
2.4 Controle da umidade ....................................................................................................... 106
2.5 Match .............................................................................................................................. 106
2.6 Passo a passo da curva automática (Autoprogram)........................................................ 106
Referências ................................................................................................................................ 109
PREFÁCIO
Esta obra reúne temas relacionados a estresse em plantas, com ênfase em diferentes
aspectos na aplicação de água de reúso e lodo na agricultura. Versa também sobre
técnicas de estudo do estresse, desde o dimensionamento de ensaios de deficiência
hídrica a técnicas de avaliação bioquímica de plantas submetidas. Por fim, capítulos
específicos da avaliação fotossintética, ferramenta muito útil para estudo de plantas
cultivadas sob estresse. A obra é coletiva e recebeu contribuições de acadêmicos da
FCA e do IBB da UNESP-Campus de Botucatu e de profissionais das ESALQ/USP –
Piracicaba, SP. Espera-se que a publicação desperte interesse em acadêmicos da área
biológica que se dedicam a estudar estresse em plantas cultivadas.
Prof. Dr. Fernando Broetto
Botucatu, Novembro de 2018.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
1
CAPÍTULO 1
CARACTERIZAÇÃO E PROCESSO DE ANÁLISE DE
ÁGUA RESIDUÁRIA
Edilson Ramos Gomes1, Fernando Broetto2, Osvaldir Feliciano dos
Santos3, João de Jesus Guimarães3, Ícaro Monteiro Galvão3,
Dayanne Fabricio Bressan4
1Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de
Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,
CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. e-mail: [email protected]; 2Professor Associado
– Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de
Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dr
a. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n
0, CEP:
18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. 3Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e
Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José
Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 4Doutora em Agronomia
(Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.
Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
Os recursos naturais são de suma importância para a sobrevivência de
animais e planta. Com a limitação de recursos como a água potável, surgem
procedentes que interferem no desenvolvimento e evolução das plantas. As
plantas utilizam água durante o processo fotossintético, sendo que parte se
perde durante a transpiração. A água na forma líquida permite a difusão e
fluxo de massa de solutos tornando-se essencial para o transporte e
distribuição de nutrientes e metabólitos, além disso, exerce importantes
funções no protoplasma e na parede celular, mantendo a turgescência nos
órgãos das plantas (TAIZ; ZEIGER, 2013).
O Brasil se destaca por apresentar elevada disponibilidade hídrica em seu
território, onde estão situadas grandes reservas de água do planeta. Contudo,
a distância entre as bacias hidrográficas dos centros urbanos, faz com que
esse recurso seja mal aproveitado. Assim, o uso eficiente da água é
indispensável e necessário para manutenção do ambiente. Com o crescimento
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
2
populacional em regiões de baixa disponibilidade hídrica, observa-se acréscimo
na contaminação de mananciais, ineficiência na distribuição hídrica, má
gerenciamento dos recursos hídricos e zonas com épocas de estiagem
prolongadas. O fornecimento da água com qualidade promove a preservação
ambiental e desenvolvimento sustentável, além de induzir a busca de
alternativas para o uso racional dos recursos hídricos (HESPANHOL, 2015).
Uma das alternativas para minimizar a escassez hídrica seria o
aproveitamento de águas residuárias, previamente tratadas para fins agrícolas.
Mancuso e Santos (2003), destacam que a água residuária proporciona ganhos
econômicos quando utilizada para fins agrícolas, pois traz benefícios como
menor proporção de efluentes de esgotos lançados em corpos de água. Além
disso, apresenta alta carga de nutrientes, favorece a conservação do solo,
maior acúmulo de matéria orgânica, dentre outros.
A água residuária previamente tratada é rica em nutrientes básicos para o
crescimento e desenvolvimento das plantas, destacando-se os macronutrientes
N, P, K e elementos como As, Cd, Cr, Hg, Mo, Ni, Pb, Se e Zn, sendo que
alguns destes são imprescindíveis ao crescimento e outros potencialmente
tóxicos (LEAL et al. 2010). No entanto a utilização da água residuária via
sistema de irrigação pode ser empregada para a produção de grãos, frutas,
plantas medicinais e outros tipos de alimentos, por oferecer boa quantidade de
nutrientes, embora possa existir certo risco de contaminação (CAMARA, 2012).
Portanto, o uso de água residuária previamente tratada possibilita seu uso
na irrigação de plantas e esse efluente deve ser de origem principalmente
doméstica, pois apresenta menores riscos, bem como baixos teores ou até
ausência de metais pesados, complexos orgânicos e fitotóxicos (BAÑON et al.
2011). Segundo Leal et al. (2010), a água residuária além de suprir
parcialmente a adubação mineral, pode proporcionar acréscimo da produção
das culturas. Entretanto, esta prática dependerá da origem do efluente
(doméstico ou industrial), forma de tratamento, técnica de irrigação utilizada e o
período de coleta da água residuária, pois esses fatores podem influenciar no
acúmulo de compostos, minerais tóxicos, orgânicos, inorgânicos e até mesmo
salinizando o solo (HESPANHOL, 2015).
2. Metodologia de coleta e análise de água residuária
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
3
A água residuária é originária da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE-
SABESP), Botucatu-SP. A ETE recebe todo o esgoto doméstico da cidade o
qual passa por sistema misto de tratamento composto por um desarenador,
seguido de tanque de equalização, reator anaeróbico de fluxo ascendente e
decantadores (tratamento primário). Após passar pelo sistema de tratamento
primário o efluente ainda deverá passar por tratamento secundario com
filtração e ozonização, para que atenda os critérios do Decreto nº 10.755 de
22/11/1977 (enquadra-se sobre os corpos da água). O transporte deve ser feito
em caminhão pipa ou via sistema pressurizado em tubulações especificas.
Quando distante da ETE a água residuária, deve ser armazenada em caixa de
água com tampa. Em seguida, deve-se coletar amostra do efluente para
realizar analises físico-químicas.
2.1 Diagnóstico físico-químico da água residuária
Para a análise físico-química de água residuária, amostras são divididas
em duas partes, uma relacionada ao tratamento primário (antes de passar pelo
filtro de areia e ozonizador) e outro com tratamento secundário Figura 1B (após
passar pela filtragem e ozonização). Deve-se coletar um volume de 2 L para
cada amostra a ser analisada quanto ao teor de minerais e metais pesados
(Figura 1A). A análise do efluente com tratamento primário (ECTP) e
secundário (ECTS) segue o protocolo do Standard Method para esse fim
(Tabela 1 e 2).
Figura 11. Amostras coletadas para análise (A) e (B) ponto de coleta após
tratamento secundário. ECTP, Efluente com tratamento primário; ECTS,
Efluente com tratamento secundário.
A B
ECTP ECTS
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
4
Para análises Físico-Químicas e metais pesados (Tabela 1 e 2), a água
residuária recebeu classificação como C2S1 com média salinidade e baixo teor
de sódio, sendo de boa qualidade para irrigação de plantas (CORDEIRO,
2001).
Tabela 1. Análise Físico-Química da água residuária de Botucatu (*), com
tratamento primário e com tratamento secundário em três épocas de coletas.
Parâmetros Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3
Unidades C.T.P C.T.S C.T.P C.T.S C.T.P C.T.S
Aspecto Amarelo Amarelo Am./Turva Amarela Esc. c/ precip.
Amarelada -
Odor Objetável Objetável Objetável Objetável Objetável Objetável - Cor 40 15 24,5 10 >70 10 Mg Pt-Col L
-1
Turbidez 8,78 2,77 3,04 1,04 7,44 1,44 NTU pH 7,36 7,77 6,56 6,52 6,11 5,11 - Dureza total 68 60 56 50 82 68 mg CaCO3 L
-1
Dureza cálcica 58 50 34 26 34 32 mg CaCO3 L-1
Dureza de magnésio
33,6 28,4 30 20,2 40,32 30,24 mg CaCO3 L-1
Ferro 0,057 0,056 0,046 0,035 0,037 0,031 mg L-1
Cloreto 64,42 63,04 27,6 27,14 28,923 28,09 mg L
-1
Sulfato 43,18 39,18 18 15,301 22,152 16,967 mg L-1
Fluoreto 1,22 0,76 2,74 0,337 0,253 0,292 mg L
-1
Cond. Elétrica 734,4 729,4 314,5 279,5 298,4 211,6 μS cm-1
Fósforo total 2,15 1,98 2,004 1,606 ND 0,404 mg L
-1
Nitrato 2,01 2,59 3,26 4,28 7,44 7,52 mg L-1
Nitrito 2,22 2,1 3,1 2,1 2,2 1,365 mg L
-1
TOC 19,1 19,1 17,44 32,06 9,507 8,216 mg L-1
TN 20 33,33 15 14,89 11,22 13,39 mg L
-1
Óleos e graxas 11 4 4,6 5,1 3,9 61 mg L-1
DQO 31,84 27,15 0,426 ND ND 0,272 mg L
-1
Sulfeto 0,213 0,213 0,12 0,12 0,213 0,213 mg L-1
Sódio 2,138 2,048 2,018 1,945 2,03 1,943 mg L
-1
Cloro Residual Total
0,41 0,07 0,04 0,03 0,0012 ND mg L-1
(*) analise de água coletada em 2015.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
5
Tabela 2. Análise de metais pesados da água residuária de Botucatu (*), com
tratamento primário (C.T.P) e com tratamento secundário (C.T.S) em três
épocas de coletas.
Parâmetros Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3
Unidades C.T.P C.T.S C.T.P C.T.S C.T.P C.T.S
Bário ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0017 ≤ 0,0009 mg L-1
Cádmio ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Chumbo ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Cobre ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0000 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Crômio Total ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0000 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Estanho ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0000 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Mercúrio ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 0,0005 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Níquel ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 0,0003 ≤ 0,0001 ≤ 0,0004 ≤ 0,0001 mg L-1
Prata ≤ 0,0017 ≤ 0,0001 0,0008 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Selênio ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Zinco 0,0057 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,00017 0,0007 0,0085 mg L-1
Arsênio ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0000 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1
Manganês 0,444 0,377 0,251 0,141 0,503 0,456 mg L-1
(*) analise de água coletada em 2015.
2.2 Processo de filtragem e ozonização da água residuária
2.2.1 Filtragem
A água residuária deve passar por filtro de areia com 0,70 m de altura
composto por uma coluna mista de areia com granulometria grossa e fina de
0,60 m, uma cama de 0,01 m de material esponjoso e por último uma camada
de 0,09 m de brita n° 0. A finalidade deste procedimento é a remoção física de
ovos de helmintos remanescentes na água residuária, pois o sistema
convencional de tratamento de esgoto não remove estes ovos de parasitas
(WHO, 2006). O processo de filtragem da água residuária deve ocorrer por
gravidade (Figura 2). A cada 1500 L de água filtrada deve-se trocar todos os
componentes do filtro. A areia a ser utilizada no filtro deve ser lavada em água
corrente por 12 h e autoclavada.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
6
Figura 2. Sistema de filtragem de água residuária por gravidade. Fonte: Gomes
(2016)
2.2.2 Ozonização
Após a água residuária passar pelo filtro de areia, a mesma deve ser
transferida via tubo até o reator de ozônio, visando a eliminação da carga
microbiana (Figura 3). O ozonizador apresentado na figura abaixo tem
capacidade de processar uma vazão média de 1 L min-1 de água residuária.
Após a ozonização a água será armazenada em caixa de água.
Figura 3. Esquema do ozonizador utilizado no processo de eliminação da
carga microbiana na água residuária (A e B). Fonte: Gomes (2016).
Resumo do tratamento secundário da água residuária, onde, o ozonizador
está ajustado com 100% de intensidade de liberação de ozônio (O3) e o filtro
Chave Geral
Fonte Mat.
40 kv
A B
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
7
com fluxo de 100% de água (Figura 4). Ao final dos tratamentos, a água
residuária a ser empregada na irrigação de plantas tem que atender os critérios
estabelecidos pela Portaria do Ministério da Saúde, N° 2.914 de 12 de
dezembro de 2011.
Figura 4. Resumo do sistema de tratamento secundário de água residuária.
Fonte: Gomes (2016).
2.3 Análise microbiológica da água residuária
2.3.1 Coliformes totais e coliformes termotolerantes
Para a determinação do número mais provável (NMP) de coliformes totais
(CTo) e termotolerantes (CTe) na água residuária, deve-se coletar duas
amostras, sendo uma com tratamento primário e outra com tratamento
secundário (após passar pelo filtragem e ozonização). O volume mínimo a ser
coletado deve ser 125 mL para cada amostra que, em seguida, será
acondicionada em gelo (Figura 5).
Reservatório
3000 L
Filtro de
Areia
Ozonizador
Reservatório
1000 L
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
8
Figura 5. Amostra de água residuária acondicionada em gelo (A) e (B) saco
plástico estéril 125 mL. Fonte: Gomes (2016).
Para analisar a água residuária deve-se utilizar 10 mL de cada amostra e
homogeneizar em 90 mL de água tamponada esterilizada e, a partir desta
diluição inicial a 10-1, organizar uma série de diluições decimais, empregando-
se o mesmo diluente. A diluição da amostra deve ser armazenada em volumes
de 1 mL, em cada fileira de três tubos por diluição, englobando 10 mL de caldo
lauril sulfato (Difco) com um tubo de Durham invertido. Após incubação a 35 ºC
por 24-48 horas, realizar a leitura dos tubos e os inóculos positivos
expressaram-se na presença de gás no tubo de Durham.
Em seguida, três fragmentos de cada tubo positivo deve-se repicar em
tubos de ensaio incluindo 10 mL de caldo lactose bile verde brilhante (CLBVB)
e Difco ara a confirmação da presença de CTo, mais três fragmentos eram
recriados em tubos de 5 mL de caldo EC (Difco) para a confirmação de CTe.
Todos os tubos de CLBVB e de EC apresentavam tubos de Durham invertidos.
O CLBVB incubado a 35 ºC por até 48 horas e o caldo EC, a 45 ºC/24 horas.
Após o período de incubação, realizar a leitura pela observação da presença
de gás no tubo de Durham invertido. Na Tabela 2, consta o NMP onde foram
calculados os CTo e CTe por mL de amostra analisada de acordo com (RACE,
2012).
A B
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
9
Tabela 21. Análise microbiológica de água residuária utilizado na irrigação de
plantas. A técnica utilizada para as contagens foi a dos Tubos Múltiplos, de
acordo com a Portaria do Ministério da Saúde, Nº 2.914 de 12/12/2011. Fonte:
Gomes (2016).
Coleta
A.R.C.T.P A.R.C.T.S
Coliformes
Totais
Coliformes
Termotolerantes
Coliformes
Totais
Coliformes
Termotolerantes
(NMP mL-1) (NMP mL-1) (NMP mL-1) (NMP mL-1)
1 1,1 x 105 1,5 x 104 460 21
2 1,1 x 105 1,5 x 104 93 21
3 2,4 x 105 9,5 x 104 150 93
Água residuária com tratada primário (ARCTP); água residuária com tratada secundário
(ARCTS); NMP: número mais provável.
2.3.2 Contagem de ovos de helmintos na água residuária
A verificação da presença de ovos de helmintos na água residuária deve
seguir a metodologia de AYRES et al. (1991) com algumas modificações
realizado por Gomes (2016). Deve-se realizar uma coleta composta para cada
tipo de água, sendo dividido em duas amostras, uma com tratamento primário
(antes de passar pelo filtro de areia e ozonizador) e outra com tratamento
secundário (após passar pela filtragem e ozonização). Deve-se coletar 1L de
água residuária para cada amostra e levadas ao Laboratório.
Para a análise parasitária, deve-se seguir a seguinte metodologia
modificada por Gomes (2016) para água residuária (Figura 6).
a) As amostras devem ser colocadas em cálice de 500 e 250 mL para
sedimentar por 2 horas;
b) Retirar aproximadamente 90% do sobrenadante usando um sifão,
garantindo um volume de aproximadamente 100 mL de água residuária tratada
e não tratado. Ter o cuidado para não ressuspender o sedimento;
c) Transferir cuidadosamente o sedimento para tubos Falcon de 15 mL e
ajustar o peso de todos os tubos;
d) Levar os tubos para a centrifugação a 1000 G por 15 minutos. Após a
primeira centrifugação, descartar o sobrenadante; transferir todos os
sedimentos para um único tubo e centrifugar novamente a 1000 G por mais 15
minutos;
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
10
e) Rejeitar todo o sobrenadante com um único movimento firme e rápido,
deixando no tubo apenas o sedimento. Acrescentar um volume de solução de
sulfato de zinco igual a 5 vezes o volume do sedimento. Em seguida
homogeneizou-se a amostra com equipamento tipo vortex;
f) Remover uma alíquota da amostra final com o auxílio de uma pipeta de
Pasteur e transferir para a câmara de McMaster. Deixar a câmara de contagem
em repouso por 5 minutos para permitir que os ovos flutuarem e atingirem a
superfície do retículo de contagem;
g) Observar no microscópio com lentes objetivas de 10x e 40x se haverá
a presença de ovos de helmintos e realizar a contagem.
Para a água residuária de Botucatu, não constatou a presença de ovos
de helmintos na água residuária tratada e não tratada em ensaios no qual
utilizou-se essa água na irrigação de planta em diferentes anos por Bressan
(2015) e Gomes (2016).
Figura 6. Análise da contagem de ovos de helmintos na água residuária com
tratada primário e com tratamento secundário (A) sedimentação em cálice de
500 e 250 mL, (B) Tubos Falcon após centrifugação, (C) transferência de
alíquota final para câmara de McMaster, (D) Observação no microscópio em
objetivas de 10x e 40x. Fonte: Gomes, 2016.
A B
C D
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
11
Referências
AYRES, R.; STOTT, R.; LEE, D. L.; MARA, D. D.; SILVA, S. A. Comparison of techniques for the enumeration of human parasitic helminth eggs in treated wastewater. Environmental Technology. 12, p. 617-623, 1991. BAÑÓN, S. et al. Effects of diluted and undiluted treated wastewater on the growth, physiological aspects and visual quality of potted lantana and polygala plants. Scientia Horticulturae, v. 129, n. 4, p. 869–876, jul. 2011. BRESSAN, F. D. Água de reuso e seu efeito sobre parâmetros fisiológicos em manjericão (Ocimum basilicum L.). Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 129 p. 2015. CAMARA, H. Bioágua Familiar: Reuso de água cinza para produção de alimentos no Semiárido/ Fábio dos Santos Santiago... [et al.]. 2012. Recife, 2012. CORDEIRO, G. G. Qualidade de água para fins de irrigação (conceitos básicos e práticas). Petrolina, PE: Embrapa Semi Árido, 2001. 32 p. (Documentos; 167). GOMES, E. R. Aplicação de água residuária e deficiência hídrica em espécies de interesse agronômico. Botucatu, SP, 2016. 161p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Agronômicas / Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. HESPANHOL, I. A inexorabilidade do reúso potável direto. Revista DAE, v. 63, n. 198, p. 63–82, 2015. LEAL, R. M. R.; FIRME, L. P.; HERPIN, U.; FONSECA, A. F.; MONTES, C. R.; DIAS, C.T.S; MELF, A. J. Carbon and nitrogen cycling in a tropical Brazilian soil cropped with sugarcane and irrigated with wastewater. Agricultural Water Management, n° 97, p. 271–276, 2010. MANCUSO, P. C. S.; SANTOS, H. F. dos. A escassez e o reúso de água em âmbito mundial. In: Reúso de água. Mancuso, P. C. S.; Santos, H. F. dos; Philippi Jr., A. (coord.). Barueri: Manole, 2003. 18p. RICE, E.W.; BAIRD, R.B.; EATON, A.D.; CLESCERI, L.S. Standard Methods for the examination of water and wastewater. American Public Health organization, Washington, DC., 22th, 2012. TAIZ, L; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 5.ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. 918p. WHO - WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Guidelines for the safe use of wastewater, excreta and greywater: Wastewater use in agriculture, Geneva. v. 2, 2006.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
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CAPÍTULO 2
ETAPAS PARA DIMENSIONAMENTO DE
EXPERIMENTO COM DÉFICE HÍDRICO
Osvaldir Feliciano dos Santos1, Fernando Broetto2, Edilson Ramos
Gomes3, Ícaro Monteiro Galvão1, João de Jesus Guimarães1
1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas,
Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu
– SP, Brasil, e-mail: [email protected]. 2Professor Associado – Departamento de
Química e Bioquímica, Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto
de Biociências, Rua Profa. Dra. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu,
São Paulo, Brasil. 3
Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) –
Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de
Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
O défice hídrico é tido como um dos principais precursores da queda de
produtividade em diversas culturas agrícolas, o que ocorre devido ao fato deste
recurso alterar o metabolismo da planta, além de ocorrer em vastas extensões
de áreas cultiváveis (Nogueira et al., 2001). Dentre os processos fisiológicos
afetados pode-se destacar alterações na respiração, condutância estomática,
captura da radiação solar, fotossíntese e transporte de elétrons, ocasionando
redução de seu crescimento (Parry et al., 2002; Lawlor & Cornic, 2002).
Todavia, é valido ressaltar que este efeito sobre a planta é complexo, pois
a mesma pode responder de formas distintas através de processos
adaptativos, no intuito de mitigar este estresse, como por exemplo, a redução
do potencial hídrico foliar (Nogueira et al., 2005). Isto ocorre devido ao tempo
de exposição que a planta permanece submetida a estas condições, ao estágio
fenológico e a frequência de ocorrência (Chaves et al., 2009).
Neste sentido, o estudo da tolerância ou alternativas que visem reduzir
e/ou mitigar este tipo de estresse em culturas agrícolas são cruciais na adoção
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
13
de novas estratégias de irrigação, elevando assim, o potencial produtivo destas
culturas.
2. Etapas cronológicas de execução
2.1 Determinação de delineamento experimental
A primeira etapa a ser definida é a delimitação do delineamento
estatístico a ser adotado, pois, com base nisto será possível reorganizar e
definir os tratamentos de défice hídrico assim como os possíveis sub-
tratamentos, além de toda a parte cronológica das análises a serem definidas,
como: biométricas, fisiológicas, bioquímicas e nutricionais dentre outras. É
importante ressaltar a importância desta etapa visto que, será baseado nela
que as demais etapas deverão ocorrer.
2.2 Características químicas e físicas
Após definição prévia do delineamento a ser adotado, procede-se para a
coleta do solo, cuja quantidade de amostras a serem obtidas devem ser
definidas com base nos requisitos pré-estabelecidos no projeto. Salienta-se
que quanto maior a quantidade de amostras utilizadas para determinação dos
quesitos químicos, físicos e hídricos, maior a precisão e acurácia dos
resultados obtidos.
A análise do solo (Tabela 1) é imprescindível por ser a única metodologia
capaz de conhecer as características prévias que um determinado solo possui,
em suprir nutrientes bem como reter água para as plantas. Sendo este,
considerado simples, prático e econômico cuja eficiência é bastante elevada,
tornando-o precursor para recomendação de quantidades adequadas de
corretivos e fertilizantes (Cardoso et al., 2009).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
14
Tabela 1. Análise química hipotética de um determinado solo.
pH M.O P(resina) Al3+
H+Al K Ca Mg SB CTC V B Cu
CaCl2 g dm-3
mg dm-3
-----------------mmolc dm-3
---------------- % --mg dm-3
-
5,2 13,5 1,1 14 60 0,5 1,0 1,0 2,5 58 4 0,59 1,1
Com base nos resultados provenientes da análise de solo deve-se corrigir
e aduba-lo seguindo as recomendações de manuais e/ou boletins pré-
estabelecidas, para que a cultura atinja seu potencial máximo produtivo na
região de implantação do estudo.
2.2 Análises hídricas
2.2.1 Curva de retenção de água do solo
A retenção de água no solo, expressa a relação entre o conteúdo de água
presente no solo em base de volume ou massa, além do potencial matricial do
mesmo, tornando esta caracterização importante ferramenta para a descrição
da mecânica do solo não saturado e de seu comportamento físico-hídrico
(Cichota & Jong van Lier, 2004) geralmente efetuadas utilizando a Câmara de
pressão de Richards. Cujas etapas para sua determinação são realizadas
seguindo a metodologia adaptada de Andrade júnior et al., (2007) descritas a
seguir.
2.2.2 Etapas para determinação da curva de retenção
2.2.2.1 Coleta de amostras
As amostras devem ser coletadas da área de estudo, utilizando anéis
cilíndricos cujo volume seja conhecido em uma profundidade pré-estabelecida,
no intuito de preservar as características do solo.
Obs: Caso o experimento seja executado em vasos, alocar o solo para estes
recipientes e realizar o “molhamento” dos mesmos periodicamente durante 7
dias, após este período retirar as amostras conforme relatado no passo
anterior.
2.2.2.2 Saturação das amostras
Alocar as amostras juntamente com a membrana porosa (Figura 1) dentro
de um recipiente contendo água destilada (metade da altura do cilindro), no
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
15
intuito de saturar o meio, o tempo de permanência é variável dependendo da
textura do solo. Depois de constatada a saturação das mesmas, efetuar a
pesagem no intuito de determinar o conteúdo de água no ponto de saturação.
Figura 1. Amostras de solo previamente preparadas. Fonte: Andrade júnior et
al., (2007).
2.2.2.3 Alocação das amostras na câmara de Richards
Após a saturação, as amostras devem ser encaminhadas para a câmara
de Richards (Figura 2) o qual posteriormente devem-se aplicar os pontos de
pressão dos quais comumente são utilizadas as: 6, 10 (capacidade de campo),
30, 100, 300 e 1.500 (ponto de murcha permanente) kPa. Ao atingir a pressão
requerida, retira-se a amostra da câmara e efetua-se a sua pesagem (após a
drenagem do excedente da umidade), sendo que em seguida a mesma deve
ser colocada na câmara com posterior ajuste do próximo ponto de tensão.
Figura 2. Amostras de solo alocadas dentro da câmara de pressão de
Richards. Fonte: Andrade Júnior et al. (2007).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
16
Ao final da coleta de todos os pontos de pressão, as amostras devem ser
encaminhadas para uma estufa com circulação de ar forçado a 105 ºC por 48
horas, no intuito de determinar a densidade aparente além do peso seco da
amostra.
2.2.3 Ajuste da curva de retenção de água no solo
Para a determinação dos parâmetros de ajustes (θr, θs, α, m, n, ρ), utiliza-
se o software Soil Water Retention Curve versão 3.0 proposto por Dourado
Neto et al., (1995) os quais são gerados baseados nos pontos de pressão
obtidos na câmara de pressão de Richards. Em posse de tais dados utiliza-se o
modelo proposto por Van Genuchten (1980) equação (1), para ajuste da curva
de retenção (Figura 3).
𝜃 = 𝜃𝑟 𝜃𝑠− 𝜃𝑟
[1+ (𝛼 ⌊Ψ𝑚⌋)𝑛]𝑚 (1)
Em que:
θ (ѱm) - umidade volumétrica em função do potencial mátrico, cm3 cm3;
θr - umidade volumétrica residual do solo, em cm3 cm3;
θs - umidade volumétrica do solo saturado, em cm3 cm3;
n e m - parâmetros de regressão da equação, adimensionais;
α - parâmetros com dimensão igual ao inverso da tensão, em KPa-1; e
ѱm - potencial matricial de água no solo, em KPa.
Figura 3. Curva de retenção de água do solo hipotética.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
17
2.3 Instalação dos tensiômetros de punção e monitoramento da tensão de
água do solo
Antes da instalação dos tensiômetros na área experimental, os mesmos
devem permanecer durante 24h submersos em água deionizada no intuito de
saturar as capsulas porosas. Após este período as mesmas devem ser
alocadas próximas a planta e preenchidas com água (Figura 4a), a
profundidade a ser adotada será relativa em função a cultura a ser implantada.
Com o auxílio de um tensímetro digital deve-se efetuar o monitoramento da
água no solo diariamente, de preferência no período da manhã (entre 8 e 10h)
cujos valores obtidos serão utilizados para determinação da lâmina de irrigação
(Figura 4b).
Figura 4. Alocação do tensiômetro de punção próximo a planta (a) e aferição
da tensão de água no solo com o auxílio de um tensímetro digital (b). Fontes:
Bressan (2015); Gomes (2016).
2.4 Manejo da irrigação (irrigação por gotejamento)
Neste tipo de manejo a irrigação é efetuada com base na capacidade de
água disponível no solo (CAD), onde os valores da capacidade de campo (CC
– geralmente 10 kPa), o ponto crítico para a cultura (PC – varia de acordo com
os tratamentos empregados) e a profundidade do sistema radicular (Z) são
estipulados mediante os tratamentos empregados, onde tais variáveis serão
empregadas conforme a equação 2 (Gomes, 2016).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
18
CAD = (CC − PC) x Z (2)
Onde:
CAD - capacidade de água disponível (mm);
CC - teor de água volumétrico na capacidade de campo (cm3 cm-3);
PC - teor de água volumétrico atual (cm3 cm-3);
Z - profundidade efetiva do sistema radicular (mm).
Com base nos valores obtidos de CAD emprega-se os mesmos na
equação 3 no intuito de estimar a lâmina de irrigação (mm) o qual
posteriormente será utilizada para se determinar o tempo (em minutos) de
irrigação para cada tratamento conforme a Equação 4.
La = CAD
Ef (3)
Onde:
La - lâmina aplicada (mm);
CAD - capacidade de água disponível (mm);
Ef - eficiência de irrigação.
𝑇i = [La x A
n x q] x 60 (4)
Onde:
Ti - tempo de irrigação (minuto);
La - lâmina aplicada (mm);
A - área ocupada por planta (m²);
n - número de emissores por planta;
q - vazão do gotejador.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
19
Referências
ANDRADE JÚNIOR, A. S.; BASTOS, E. A.; MASCHIO, R.; SILVA, E. M. Determinação da curva de retenção de água no solo em laboratório. Teresina: EMBRAPA, 2007, 6p. BRESSAN, D. F. Água de reuso e seu efeito sobre parâmetros fisiológicos em manjericão (Ocimum basilicum L.). Botucatu, SP, 2015. 149p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Agronômicas / Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. CARDOSO, E. L.; FERNANDES, A. H. B. M.; FERNANDES, F. A. Análise de Solos: Finalidade e Procedimentos de Amostragem. Corumbá: EMBRAPA, 2009. (Comunicado técnico n. 79). CHAVES, M. M.; FLEXAS, J.; PINHEIRO, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of botany, v. 103, p 551-560, 2009. CICHOTA, R. & JONG van LIER, Q. Análise da variabilidade espacial de pontos amostrais da curva de retenção de água no solo. Revista brasileira de ciência do solo, 28:585-596, 2004. DOURADO NETO, D.; NIELSEN, D. R.; HOPMANS, J. W.; REICHARDT, K.; BACCHI, O. O. S. Programa SWRC (Version 3.0): Soil-Water Retention Curve (Software). Piracicaba: ESALQ; Davis: University of Califórnia, 1995. GOMES, E. R. Aplicação de água residuária e deficiência hídrica em espécies de interesse agronômico. Botucatu, SP, 2016. 161p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Agronômicas/Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. LAWLOR, D. W.; CORNIC, G. Photosynthetic carbono assimilation and associated metabolism in relation to water deficits in higher plants. Plant Cell Environmental, v. 25, p. 275-294, 2002. NOGUEIRA, R. J. M. C.; ALBUQUERQUE, M. B.; SILVA, E. C. Aspectos ecofisiológicos da tolerância à seca em plantas da caatinga. In: NOGUEIRA, R. J. M. C.; ARAÚJO, E. L.; WILLADINO, L. G.; CAVALCANTE, U. M. T.; (Ed.). Estresses ambientais: danos e benefícios em plantas. Recife: UFRPE, Imprensa Universitária, 2005. p.22-31. NOGUEIRA, R. J. M. C.; MORAES, J. A. P. V.; BURITY, H. A.; BEZERRA NETO, E. Alterações na resistência à difusão de vapor das folhas e relações hídricas em aceroleiras submetidas a déficit de água. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, Campinas, v. 13, p. 75-87, 2001. PARRY, M. A. J.; ANDROLOJC, P. J.; KHAN, S.; LEA, P. J.; KEYS, A. J. Rubisco activity: effects of drought stress. Annals of botany, v. 89, p. 833-838, 2002.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
20
VAN GENUCHTEN, M. T. A Closed-form Equation for Predicting the Hydraulic Conductivity of Unsaturated Soils1. Soil Science Society of America Journal, v. 44, n. 5, p. 892, 1980.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
21
CAPÍTULO 3
REUSO DE ÁGUA NA AGRICULTURA: ASPECTOS
AMBIENTAIS E AGRONÔMICOS
João de Jesus Guimarães1, Fernando Broetto2, Edilson Ramos
Gomes3, Osvaldir Feliciano dos Santos1, Ícaro Monteiro Galvão1,
Dayanne Fabricio Bressan4
1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas,
Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu
– SP, Brasil, e-mail: [email protected]. 2Professor Associado – Departamento de
Química e Bioquímica, Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto
de Biociências, Rua Profa. Dra. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu,
São Paulo, Brasil. 3
Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) –
Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de
Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 4
Doutora em Agronomia (Irrigação e
Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José
Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
A agricultura é uma das principais atividades desenvolvidas no mundo,
bem como, responsável por atender a grande demanda de alimentos. A água é
um insumo primordial para a obtenção dos alimentos. Estudos apontam que a
agricultura utiliza cerca de 70 a 80% da água do planeta (KHURANA & SINGH,
2012; WHO, 2013).
De acordo com a FAO (2013) em 2050 a agricultura sofrerá drasticamente
com a crise dos recursos hídricos, onde ocorrerá a diminuição de
aproximadamente 40% da água utilizada para os fins agrícolas. Mas, nos dias
atuais a escassez dos recursos hídricos já afeta vários locais do mundo.
A escassez dos recursos hídricos e as projeções para o futuro tem levado
os agricultores, e principalmente os irrigantes a reavaliar as práticas de manejo
da água (URBANO, 2013). Além disso, tem despertado a atenção de
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
22
pesquisadores, com intuito de desenvolver técnicas para o tratamento de
efluentes e seu devido reuso na agricultura (GUIMARÃES et al., 2018).
O reuso de água na agricultura surge com uma alternativa para a
diminuição dos impactos causados ao meio ambiente, ocasionados pelo
lançamento inadequado e sem conscientização de efluentes, ou seja, águas
residuárias nos cursos d´água que contaminam os mananciais superficiais e os
subterrâneos (SANTOS et al., 2010; SOUZA & DUARTE, 2014; MENDES,
2014), além disso, disponibiliza água e fertilizantes para as culturas, promove a
ciclagem de nutrientes e aumento na produção agrícola (MATOS, 2016).
Segundo Cabral et al. (2011) & Filho (2013) as águas residuárias contém
em sua composição macro e micronutrientes que podem ser utilizados como
biofertilizante, se usado adequadamente (MAGGI et al., 2013) e assim
economizar, ou até mesmo substituir a aplicação de fertilizantes químicos nas
lavouras.
Todavia, o reuso de água sem critérios pode causar problemas de
contaminação do solo e da água, degradação das caracteristicas fisicas do
solo, diminuição da capacidade de absorção de água pelas plantas, promover
toxicidade e estresse salino às plantas (ERTHAL et al., 2010; VARALLO et al.,
2010). Com isso, Matos (2016) cita a importancia de se conhecer o nutriente
com maior concentração relativa na água residuária e, também, a necessidade
nutricional da cultura para que os níveis exigidos não sejam suplantados.
2. Potencial agrícola das águas residuárias
As águas residuárias apresentam um grande potencial agrícola.
Diversos autores na literatura citam a presença de macro e micronutrientes nas
águas residuárias, sendo eles: nitrogênio, fosforo, potássio, cálcio, magnésio,
ferro, zinco e cobre (CABRAL et al., 2011; MAGGI et al., 2013; MA et al., 2016).
Em decorrência da presença de macro e micronutrientes, as águas
residuárias podem ser utilizadas como biofertilizantes agrícolas (DOBLINSKI et
al., 2010), reduzindo o uso de fertilizantes químicos URBANO (2013),
proporcionar incrementos na produtividade em solos com baixa fertilidade
(DEON et al., 2010; VARALLO et al., 2010), ganhos econômicos, além de
promover a sustentabilidade do setor agrícola (SINGH et al., 2012).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
23
Diversos trabalhos na literatura confirmam o potencial agrícola das águas
residuárias quando utilizadas na agricultura. Taxas de aplicações de água
residuária da bovinocultura aumentou a CTC e a saturação de bases nas
camadas superficiais de um argissolo (ERTHAL et al. 2010). Fertirrigação com
água residuária da piscicultura apresentou resultados positivos para as
variáveis: largura de folha e altura de plantas de tomate (NASCIMENTO et al.,
2016), com água residuária proveniente do esgoto doméstico na cultura da
cana-de-açúcar promoveu maiores crescimento de colmo (FREITAS et al.,
2012), ganhos na produtividade e redução de adubação mineral com nitrogênio
(DEON et al., 2010), além disso, Silva et al. (2010) verificou o efeito de
correção da acidez do solo.
Além disso, o uso de fertirrigação com água residuária da suinocultura
promoveu aumento da área foliar e crescimento do tomateiro (SOUZA et al.,
2010), melhor desenvolvimento de mudas de eucalipto (BATISTA et al., 2014)
e Corymbia citriodora (COELHO et al., 2017), melhorias nos atributos físicos,
físicoquímicos, químicos e biológicos do solo (BRUNETTO et al., 2012).
3. Tratamento dos efluentes
Dada a importância e aos benefícios que as águas residuárias podem
proporcionar ao meio ambiente e a agricultura, é importante que se realize o
tratamento dos efluentes antes de qualquer reutilização e/ou disposição.
Salienta-se o fato de que o tipo de tratamento dependerá das condições físicas
e químicas do efluente, estruturais, financeiras, mão de obra e conhecimento.
Segundo Nuvolari & Costa (2010) e Souza & Duarte (2014) os sistemas
de tratamento são divididos em: preliminar, primário; secundário e terciário. De
acordo com os mesmos autores os tratamentos constituem-se e objetivam-se
da seguinte forma:
Tratamento preliminar: corresponde a etapa inicial do tratamento. Para
esse tratamento são utilizadas grades, telas, peneiras, caixa de areia (a
granulometria da areia dependerá da quantidade de sólidos presentes no
efluente) e caixa de remoção de óleos e graxas. Objetiva-se com esse
tratamento remover partes solidas, como galhos, restos de materiais, detritos
minerais, além de materiais insolúveis, como óleos e graxas. Ressalta-se ainda
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
24
que este tratamento não apresenta eficiência na remoção de DBO – Demanda
Bioquímica de Oxigênio, mas proteger sistema de irrigação contra
entupimentos.
Tratamento primário: corresponde a etapa intermediária, onde se utiliza
tanques de sedimentação, clarificadores, reatores anaeróbios ou filtros
aeróbios. Objetiva-se com este tratamento a remoção de materiais não
grosseiros que se encontra em suspensão, solutos flutuantes e redução de
carga orgânica. Salienta-se que, a eficiência de remoção é 60 a 70 % para
sólidos que se encontram suspensos, 30 a 40 % de DBO e 30 a 40 % de
coliformes.
Tratamento secundário: corresponde a remoção de matéria orgânica
biodegradável presente nos sólidos em suspensão. Utiliza-se neste tratamento
lagoas de estabilização, facultativas, anaeróbias, biodigestores, reatores
anaeróbios e wetlands. Objetiva-se com este tratamento a remoção de material
orgânico (DBO em suspensão) através de ações bioquímicas promovidas por
bactérias, vírus e protozoários, que se alimentam do material orgânico, como
também nutrientes como o nitrogênio e o potássio. A eficiência da remoção de
DBO e coliformes é de 60 a 99 % e nutrientes é de 10 a 50 %.
Tratamento terciário: representa o tratamento de efluentes mais
avançado, como também o mais caro. Neste tratamento utiliza-se radiação
ultravioleta, ozonização, osmose reversa etc. Objetiva-se a remoção e/ou
redução de nutrientes como: nitrogênio e potássio, remoção de metais
pesados, substâncias com alto nível de toxidade e agentes patogênicos.
4. Aplicação das águas residuárias em culturas agrícolas
A fertirrigação surge nesse cenário como uma alternativa eficiente para a
aplicação de água residuária nas culturas agrícolas. A fertirrigação traduz na
técnica de aplicação de fertilizantes, fungicidas, herbicidas via sistema de
irrigação localizada, aspersão ou superfície.
O aproveitamento desta técnica contribui para a redução de custos de
produção com fertilizantes químicos, promove uma maior eficiência de
aplicação, pois disponibiliza nutrientes no volume de solo explorado pelo
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
25
sistema radicular da cultura, reduz a mão de obra e o mais importante,
economia de água (SOUZA et al. 2010; PINTO & BRITO, 2010).
Matos (2014) destaca o uso da fertirrigação, mas salienta a importância
de se controlar e definir a taxa de aplicação em níveis adequados para as
culturas, visto que a fertirrigação trata-se da aplicação de nutrientes junto a
água de irrigação. Deste modo, Matos (2016) afirma que a taxa de aplicação de
águas residuárias via fertirrigação deve ser baseada no nutriente com maior
presença na água residuária e nas exigências nutricionais das culturas.
A literatura confirma o uso da fertirrigação como técnica para aplicação de
águas residuarias, como: bovinocultura (ERTHAL et al., 2010), suinocultura
(BOLZANI et al., 2012; BRUNETTO et al., 2012; BATISTA et al., 2014;
COELHO et al., 2017), piscicultura (NASCIMENTO et al., 2016), lavagem e
despolpa de café Conilon (FARIA et al., 2015) e agroindústria (GONÇALVES,
2016), das quais apresentou resultados favoráveis quanto a técnica e a
resposta das culturas.
5. Considerações finais
Na agricultura, a água se destaca por ser um importante insumo agrícola,
o qual é responsável por promover o crescimento e desenvolvimento das
culturas. Entretanto, nos últimos anos a má gestão deste recurso, manejo sem
critério e a falta de conscientização dos usuários tem contribuído para a sua
escassez, tornando um fator limitante para o desenvolvimento deste setor.
O reuso de água surge como uma alternativa interessante no cenário
mundial, visto que, ameniza os danos causados pela disposição inadequada de
águas residuárias no solo e nas águas, e também, disponibiliza água e
fertilizantes para as culturas agrícolas promovendo incrementos de
produtividade.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
26
Referências
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O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
29
CAPÍTULO 4
ASPECTOS QUALITATIVOS DA ÁGUA PARA
IRRIGAÇÃO
Ícaro Monteiro Galvão1, Fernando Broetto2, Edilson Ramos Gomes3,
Osvaldir Feliciano dos Santos1, João de Jesus Guimarães1
1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas,
Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu
– SP, Brasil, e-mail: [email protected]. 2Professor Associado – Departamento de
Química e Bioquímica, Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto
de Biociências, Rua Profa. Dra. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu,
São Paulo, Brasil. 3Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) –
Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de
Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
A agricultura lidera o ranking de consumo hídrico com aproximadamente
67,1% da água doce no Brasil (ANA, 2017), sendo a irrigação o principal meio
de uso. Apesar de elevado consumo, a maior parte da água captada para
irrigação volta ao ciclo hidrológico através do processo de evapotranspiração
pelas culturas e infiltração no solo, alimentando o lençol freático.
O uso da água na agricultura provém de diferentes fontes, sendo de
origem superficial, subterrânea ou águas de reuso. Essas apresentam
características diversas, dependendo da origem e do grau de contaminação
antes do uso, conferindo diferentes níveis de qualidade e capacidade de uso.
Qualidade da água é um termo difícil de conceituar, pois leva em
consideração diversos fatores. Ayres e Westcot (1999) comentam que se refere
às características de um suprimento de água e sua relação com um uso
específico, ou seja, uma água para ser caracterizada como de boa qualidade
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
30
deverá ser analisada física, química e biologicamente e levada em
consideração sua finalidade de uso.
Quanto as características que determinam a sua qualidade para uso em
irrigação, de maneira geral segundo Bernardo et al. (2013) deve-se levar em
consideração alguns parâmetros básicos como: concentração totais de sais
solúveis ou salinidade; proporção relativa de sódio; concentração de íons
tóxicos; concentração de bicarbonatos; aspecto sanitário e capacidade de
contaminação; potencial de corrosão dos equipamentos e entupimento de
emissores em sistemas de irrigação.
A análise da água de irrigação e sua avaliação periódica quanto a
qualidade é de extrema importância para garantir a sustentabilidade da
produção e deve ser adotado por parte dos produtores e técnicos
responsáveis, uma vez que a utilização de fontes inadequadas pode acarretar
grandes prejuízos, como redução da produção devido ao estresse às plantas e
inviabilização do solo para cultivo, ocasionada principalmente pela salinização.
2. Principais critérios para estabelecer a qualidade da água para irrigação
Os principais critérios para inferir sobre a qualidade da água para
irrigação estão baseados naqueles que afetam principalmente o rendimento e a
qualidade dos produtos colhidos e relacionados com a conservação do solo.
2.1 Salinidade
O processo de degradação dos solos está presente em muitas regiões
agricultáveis em todo mundo e a salinização constitui um dos grandes
problemas enfrentados pela agricultura (FAO, 2015). A salinização dos solos
pode ocorrer naturalmente durante o processo de formação dos solos, ou de
forma antrópica através principalmente do uso de água de elevado teor salino
na irrigação (PEDROTTI, et al., 2015).
No Brasil ocorre predomínio desses solos em regiões de clima árido e
semiárido como no Nordeste do país. A precipitação pluviométrica reduzida
nessas regiões e alta de demanda evapotranspirométrica local, são fatores
determinantes que associados a baixa drenagem, levam à formação de solos
com alta concentração de sais (HOLANDA et al., 2007).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
31
A salinidade além de se caracterizar como um grande problema
ambiental, ocasiona perdas consideráveis para a pois altas concentrações de
sais na zona das raízes podem reduzir o potencial hídrico do solo, causando
estresse osmótico (ABREU et al., 2013) que induzirá um estresse através da
superprodução de espécies reativas de oxigênio, afetando o crescimento e
desenvolvimento das plantas (ALVES et al., 2018). Além disso o aumento do
potencial osmótico do solo dificulta a absorção de água pelas plantas (ABREU
et al., 2013, GONÇALVES, et al., 2011) resultando em um estresse hídrico por
um período de tempo significativo. As intensidades dos efeitos negativos
dependem da cultura, da variedade e do seu estágio fenológico.
Existem alguns parâmetros utilizados para determinar a salinidade da
água e seu potencial de salinização dos solos, que são as medidas de
condutividade elétrica (CE) e a quantidade de Sais Dissolvidos Totais (SDT). A
condutividade elétrica devido a sua facilidade de medição por meio de
aparelhos amplamente disponíveis no mercado é mais utilizada e considera
basicamente a quantidade total de sais presentes sem especifica-los. No
sistema internacional (SI) a unidade adotada é deciSiemens por metro (dS m-1).
A medida de SDT é feita através da soma da concentração de todos os íons
analisados em uma amostra de água e expressos em mg L-1 ou g L-1...
Existem algumas classificações para água de irrigação quanto ao risco de
salinização dos solos. A seguir é apresentada a classificação proposta pelo
Laboratório de Salinidade dos Estado Unidos baseada em valores da CE
(BERNADO et al., 2013):
C1 – salinidade baixa - (CE 0 – 0,25 dS m-1 a 25°C)
C2 – salinidade média - (CE 0,25 – 0,75 dS m-1 a 25°C)
C3 – salinidade alta - (CE 0,75 – 2,25 dS m-1 a 25°C)
C4 – salinidade muito alta- (CE 2,25 – 5,00 dS m-1 a 25°C)
2.2 Sodicidade
A sodicidade é dada pelo conteúdo de sódio na água e sua relação com
os demais íons presentes. Seu uso como um importante parâmetro de
qualidade é principalmente devido ao seu efeito sobre a capacidade de
infiltração dos solos e toxidade às plantas (ALMEIDA, 2010). As principais
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
32
medidas relacionadas com a sodicidade dos solos são a Porcentagem de
Sódio (Na+) na água e Razão de Adsorção de Sódio (RAS).
A RAS é o parâmetro atualmente recomendado para classificação da
água de irrigação quanto à sodicidade. Este índice leva em consideração a
proporção relativa entre os íons sódio (Na+) e os cátions bivalentes cálcio
(Ca2+) e magnésio (Mg2+) e é expresso pela equação a seguir:
RAS =Na+
√Ca2+ + Mg2+
2
Solos com elevada RAS terá sua capacidade de infiltração reduzida, por
efeito da dispersão das partículas coloidais, obstruindo os poros do solo (PAES
et al., 2013), principalmente nos primeiros centímetros podendo provocar um
efeito de déficit hídrico às culturas (SILVA, et al., 2011b) e em estado crítico,
inundação do terreno aumentando a susceptibilidade a erosão e limitando a
capacidade de uso do terreno (MIRANDA et al., 2008).
Assim como para a CE o Laboratório de Salinidade dos Estados Unidos
propôs uma classificação da água de irrigação baseado na nos valores da RAS
(ALMEIDA, 2010):
S1 – baixa concentração; RAS ≤ 18,87 - 4,4 log CE
S2 – média concentração: 18,87 - 4,4 log CE < RAS ≤ 31,31- 6,6 log CE
S3 – alta concentração; 31,31 - 6,6 log CE < RAS ≤ 43,75 - 8,87 log CE
S4 – muito alta; RAS > 43,75 - 8,87 log CE
2.3 Concentração de íons específicos
Diversos são os íons presentes na água e o conhecimento da
concentração de cada um deles é extrema importância, uma vez que em altas
concentrações passarão a se tornar tóxicos as plantas, imprimindo uma
condição de estresse com consequências negativas ao crescimento e
desenvolvimento das culturas. A magnitude do problema depende
principalmente da concentração e da sensibilidade da cultura ao elemento
(BERNARNDO et al., 2013).
Os íons sódio, cloro e boro são os principais causadores de toxidez entre
os elementos comumente encontrados nas águas de irrigação (SILVA, et al.,
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
33
2011b). Esses íons acumulam-se nas folhas, onde causam problemas de
clorose e queima dos tecidos, levando a distúrbios fisiológicas que podem
evoluir reduzindo a produção ou até a morte das plantas. Outros íons de
importância secundária devem também ser avaliados principalmente quanto a
sua capacidade de causar danos ao sistema de irrigação, como os íons
bicarbonatos, ferro, manganês e enxofre (SILVA et al., 2011a; ALMEIDA,
2010).
2.4 Interpretação da qualidade de água para irrigação
Na Tabela 1 estão apresentados os parâmetros para interpretação da
qualidade de água para irrigação levando em consideração os potenciais
problemas que podem causar e os graus gerais de restrição de uso para a
maioria das condições.
Tabela 1: Diretrizes gerais para interpretação da qualidade de água para
irrigação. Fonte: Adaptado de Ayres e Westcot (1999)
Problema Potencial Unidade
Graus de Restrição de Uso
Nenhum Moderado Severo
Salinidade
CE dS m-1 < 0.7 0.7 – 3.0 > 3.0
SDT mg L-1 < 450 450 – 2000 > 2000
Infiltração (avaliar utilizando RAS e CE)
RAS = 0 – 3 CE = dS m-1 > 0.7 0.7 – 0.2 < 0.2
= 3 – 6
= dS m-1 > 1.2 1.2 – 0.3 < 0.3
= 6 – 12
= dS m-1 > 1.9 1.9 – 0.5 < 0.5
= 12 – 20
= dS m-1 > 2.9 2.9 – 1.3 < 1.3
= 20 – 40
= dS m-1 > 5.0 5.0 – 2.9 < 2.9
Toxidade de íons específicos
Sódio
Irrigação por superfície RAS < 3 3 – 9 > 9 Irrigação por aspersão mmolc/L < 3 > 3
Cloro
Irrigação por superfície mmolc/L < 4 4 – 10 > 10
Irrigação por aspersão mmolc/L < 3 > 3
Boro
mg L-1 < 0.7 0.7 – 3.0 > 3.0
pH Amplitude normal 6.5 - 8.4
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
34
Referências
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O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
35
SILVA, I. N., FONTES, L. O., TAVELLA, L. B., OLIVEIRA, J. B., OLIVEIRA, A. C. Qualidade de água na irrigação. Agropecuária Científica no Semi-Árido, v.07, n.3, p. 01-15, jul/set. 2011b.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
36
CAPÍTULO 5
CONTEXTUALIZAÇÃO ECONÔMICO-FINANCEIRA
SOBRE O USO DO LODO DE ESGOTO NA
AGRICULTURA
Tamiris Cristina Oliveira de Andrade1, Fernando Broetto2,
Alessandro Reinaldo Zabotto1, Irineu Eduardo Kühn1, Dariane
Priscila Franco de Oliveira1, Anny Mery Marcon Ruiz3, Mara Lúcia
Cruz De Souza1
1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem e Energia na Agricultura) – Faculdade
de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,
CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil, e-mail: [email protected]. 2Professor Associado –
Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de
Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dr
a. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP:
18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. 3
Engenheira Florestal, Mestranda em Ciência Florestal
- Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de
Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
O aumento da população junto ao desenvolvimento urbano e econômico
são fatores que evidenciam o crescimento da geração do lodo de esgoto
(CASTRO, 2015). A disposição adequada desses resíduos se tornou um
desafio para as empresas de saneamento (BITTENCOURT, 2018).
No Brasil o destino mais comum para o lodo de esgoto é o aterro
sanitário, visto que outras opções para destinação ainda são pouco utilizadas.
Em outros países o reuso agrícola é o método mais aplicado para o
aproveitamento desse resíduo (DE GODOY, 2013).
O crescimento gradativo dos custos operacionais das implantações dos
aterros e o desprovimento da disponibilidade de áreas para esta implantação
causou a promoção de diferentes estudos de análises técnicas e econômicas
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
37
das alternativas não prejudiciais à saúde pública e também ao meio ambiente
(SAMPAIO, 2013).
Segundo o estudo Cenário da Disposição do Lodo de Esgoto: uma
revisão das publicações ocorridas no Brasil de 2004 a 2014, dentro do período
de 11 anos, é predominante na literatura os estudos voltados ao uso agrícola
para afins de produção vegetal e restauração de áreas degradadas como uma
alternativa para melhor alocação do lodo de esgoto, sendo estes representados
por 91,7% (CASTRO, 2015).
O interesse voltado ao uso do lodo de esgoto no meio agrícola, tem se
destacado por ser uma alternativa que evita a sua disposição sobre opções de
alto custo e de grande impacto para meio ambiente e para a sociedade.
2. O potencial do lodo de esgoto para economia
As frequentes práticas de disposição de lodo de esgoto como a alocação
em aterros sanitários e despejo a céu aberto, são opções de custo elevado e
ainda potencialmente impactantes ao meio ambiente, uma vez que fomentam
os problemas de saúde pública (NETO; JÚNIOR; MURAOKA, 2007).
A utilização do lodo de esgoto como fertilizante, vem sendo apontada
como alternativa benéfica, quando comparada a essas opções já existentes
(QUINTANA, 2011).
Dentro da orçamentação operacional de um sistema de tratamento, o
destino correto para o lodo de esgoto pode chegar a custar até 50% de todo o
processo (BETTIOL e CAMARGO, 2000).
A destinação do lodo de esgoto para fins agrícolas é favorável aos
agricultores, ao passo que diminui custos de produção e ainda melhora ou
mantém a produtividade de uma lavoura (TRANNIN et al., 2005), vindo a ser
um complemento que reduz o uso de fertilizantes químicos e consecutivamente
reduz os custos com a adubação (QUINTANA, 2011).
O lodo de esgoto processado, do qual se faz uso como fertilizante e
condicionador de solo pelo fato de possuir nutrientes e matéria orgânica, é
denominado biossólido (LIRA et al., 2008). Quando tratado adquire aspectos
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
38
que são permitidos para a utilização agrícola de forma ambientalmente segura
(OLIVEIRA, 2017).
O uso como fertilizante na substituição da adubação química, evita perdas
econômicas e energéticas específicas do exercício de fertilização de solo. Com
a disposição em aterros sanitários de alto custo de manutenção, se desperdiça
a energia que conseguiria ser aplicada adequadamente de outras formas
(QUINTANA, 2011).
O estudo de Análise da Viabilidade Econômico-Financeira da Utilização
Agrícola de Biossólido em Unidade de Gerenciamento de Lodo demonstra que
existe viabilidade econômica tanto para investimentos no empreendimento
privado, quanto para autarquia municipal. Observa-se no estudo que o
gerenciamento privado pode apresentar atratividade ao investimento, contudo,
a autarquia municipal denota maiores retornos do capital investido. Tal
observação é justificada pelo fato de que o gerenciamento privado requer de
mais recursos, quando comparado à autarquia, que apenas tem a necessidade
de complementar o sistema de um serviço de saneamento pré-existente
(CARVALHO, 2017).
De acordo o estudo Análise Econômica da Produção de Lodo de Esgoto
Compostado Para o Uso na Agricultura, realizado na cidade de Botucatu-SP, o
processamento do lodo representa meramente cerca de 27% do custo de
alocação em aterro sanitário. A Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) da
SABESP de Botucatu produz 16 toneladas de lodo por dia, gerando um custo
diário de aproximadamente R$4.073,44 em transporte e disposição em aterros
(MARTINS, 2016).
As dificuldades encontradas na literatura para utilização dos biossólidos
estão diretamente ligadas ao teor de umidade e os custos com movimentação
e transporte (DE GODOY, 2013; SAMPAIO, 2013).
O custo com transporte é um dos critérios significativos para a viabilidade
econômica da aplicação do lodo de esgoto para fins agrícola, pois quanto maior
o volume transposto por caminhão, menor o custo unitário da viagem (VON
SPERLING, 2001).
Um dos fatores decisivos no custo de operação é a distância entre
estação de tratamento de esgoto e o campo no qual o lodo será empregado,
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
39
além do teor de sólidos que definirá o transporte mais apropriado (DE GODOY,
2013).
Não é adequado dizer que haja uma distância limite que inviabilize
economicamente o transporte, uma vez que essa distância está sujeita a
particulares condições como: existência e tipo de estrada de acesso,
quantidade e preço de pedágios no percurso, dentre outros (SAMPAIO, 2013).
No campo, o emprego do lodo de esgoto tem se mostrado como a melhor
alternativa de viabilidade técnica-financeira para a silvicultura. Contudo, é
necessário o aprimoramento dos estudos voltados para o processamento deste
resíduo nas estações de tratamento, determinação das formas de aplicação,
lixiviação dos nutrientes, dentre outras (NETO; JÚNIOR; MURAOKA, 2007).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
40
Referências
BETTIOL, W.; CAMARGO, O. A. Lodo de esgoto: impactos ambientais na agricultura. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2006. 349 p.
BITTENCOURT, S. Gestão do uso agrícola do lodo de esgoto: estudo de caso do estado do Paraná, Brasil. Engenharia Sanitária e Ambiental, v. 22, n. 6, p. 1129-1139, 2018.
CARVALHO, L. C. do C. S. et al. Análise da viabilidade econômico-financeira da utilização agrícola de biossólido em unidade de gerenciamento de lodo. In: CONGRESSO ABES FENASAN 2017, 1, 2017, São Paulo. Anais... São PAULO, SP.
CASTRO, A. L. F. G.; SILVA, O. R.; SCALIZE, P. S. Cenário da disposição do lodo de esgoto: uma revisão das publicações ocorridas no Brasil de 2004 a 2014. Multi-Science Journal, v. 1, n. 2, p. 66-73, 2015.
DE GODOY, L. C. A logística na destinação do lodo de esgoto. Revista Científica on-line-Tecnologia, Gestão e Humanismo, v. 2, n. 1, p. 70-90, 2013.
LEMAINSKI, J.; SILVA, J. E. da. Avaliação agronômica e econômica da aplicação de biossólido na produção de soja. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 41. n. 10, p. 1477-1484, 2006.
LIRA, A. C.; GUEDES, M. C.; SCHALCH, V. Reciclagem de lodo de esgoto em plantação de eucalipto: carbono e nitrogênio. Engenharia Sanitária e Ambiental, v.13, n. 2, p. 207-216, 2008.
MARTINS, S. F. Análise econômica da produção de lodo de esgoto compostado para uso na agricultura. 2016. 59f. Dissertação (Mestrado em Agronomia/Energia na agricultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2016.
NETO, S. P.; JÚNIOR, C. H.; MURAOKA, T. Uso de Biossólido em Plantios Florestais. 1. ed. Planaltina DF: Embrapa Cerrado, 2007. 26 p.
OLIVEIRA, R. L. Viabilidade do lodo de esgoto na agricultura. Exatas & Engenharia, v. 7, n. 17, p. 80-87, 2017.
QUINTANA, N. R. G.; DO CARMO, M.S.; DE MELO, W. J. Lodo de esgoto como fertilizante: produtividade agrícola e rentabilidade econômica. Nucleus, v. 8, n. 1, 183-191. 2011.
SAMPAIO, A. O. Afinal, queremos ou não viabilizar o uso agrícola do lodo produzido em estações de esgoto sanitário? Uma avaliação crítica da Resolução CONAMA 375. Revista DAE, n. 193, p. 16-27. 2013.
TRANNIN I. C. B. Avaliação agronômica de um biossólido industrial e de seus efeitos sobre atributos do solo. 2004. 171p. Tese (Doutorado em Agronomia/ Solos e Nutrição de Plantas) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2004.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
41
VON SPERLING, M. Lodo de esgotos: tratamento e disposição final. Belo Horizonte: Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental – UFMG; Companhia de Saneamento do Paraná, 2001. 484 p.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
42
CAPÍTULO 6
LODO DE ESGOTO: CARACTERISTICAS
NUTRICIONAIS E EFEITOS DA UTILIZAÇÃO NO SOLO
Alessandro Reinaldo Zabotto1; Irineu Eduardo Kühn1, Fernando
Broetto2, Dariane Priscila Franco de Oliveira1, Anny Mery Marcon
Ruiz3, Tamiris Cristina Oliveira de Andrade1, Enrique Alonso Zuñiga4
1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem e Energia na Agricultura) – Faculdade
de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,
CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil, e-mail: [email protected], [email protected]. 2Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual
Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dr
a. Irina Delanova
Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. 3
Engenheira Florestal,
Mestranda em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual
Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 4Doutor
em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade
Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
O destino final do lodo de esgoto é uma preocupação em quase todas as
cidades brasileiras. Por se tratar de um resíduo poluente, se faz necessário o
seu descarte de maneira correta e apropriada, evitando a contaminação do
meio ambiente. Na maioria das cidades, o lodo de esgoto é descartado em
aterros sanitários, o que diminui a capacidade dos aterros e eleva os custos
operacionais das estações de tratamento. O lodo de esgoto necessita de
tratamento que, depois de higienizado, pode ser utilizado como adubo ou
condicionador de solo na agricultura, na recuperação de áreas degradadas e
na silvicultura, sendo estas as formas apropriadas de utilização deste resíduo,
principalmente pelo fato de ser um excelente fertilizante orgânico.
Devido ao crescimento populacional, a demanda por alimentos é
crescente, assim surge uma oportunidade para a reciclagem do lodo de esgoto,
e consequentemente, redução de custos com fertilizantes para os agricultores.
Nos países desenvolvidos, o lodo de esgoto já é utilizado por décadas. Nos
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
43
EUA, por exemplo, metade do lodo de esgoto produzido é aplicado na
agricultura (Khai, 2007).
A resolução do CONAMA nº 375 de 2006 regulamenta e define critérios
para o uso do lodo de esgoto em áreas agrícolas, visando os benefícios a
agricultura e evitando os riscos à saúde pública e ao meio ambiente. Por conter
patógenos, o Art 3º da resolução obriga o seu tratamento para posterior
utilização na agricultura (CONAMA, 2006).
Diversos estudos têm sido realizados no Brasil, principalmente nos
estados do Paraná e São Paulo, a fim de adequar a sua utilização e conhecer
os efeitos do seu uso sobre diversas culturas.
Figura 1. Composição de lodo doméstico (Adaptado de Melo & Marques,
2000).
2. Lodo de esgoto
O lodo de esgoto é considerado um material isolado de estações de
tratamento de efluentes domésticos ou não, após a passagem pelos processos
primário e secundário. Esses procedimentos visam enquadrar os efluentes aos
padrões normatizados pela legislação. Além disso, podem ser decisivos para
remover ou diminuir a concentração de muitos compostos potencialmente
tóxicos ou impactantes ao meio ambiente. Segundo Saito (2007), o volume e
destino do lodo têm preocupado pesquisadores, órgãos ambientais,
legisladores e as empresas de tratamento do esgoto em todo o mundo.
O lodo de esgoto é classificado como resíduo orgânico gerado pelo
processamento de efluentes urbanos, sendo que seu volume é fator
preponderante para sua destinação. Segundo Oliveira et al. (1995) o lodo de
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
44
esgoto possui altos teores de matéria orgânica e nutrientes fazendo com que
seu uso potencial seja promissor para fins agrícolas.
A utilização do lodo de esgoto possui duplo benefício, pois contribui
ecologicamente na devolução dos nutrientes ao solo e do carbono orgânico,
além do benefício social pela redução do impacto ao meio ambiente (Chiba,
2005). Entre os benefícios potenciais do uso do lodo de esgoto, Saito (2007)
argumenta que o mesmo aporta grande quantidade de nutrientes minerais.
Quando aplicado ao solo pode melhorar suas propriedades físicas, químicas e
biológicas e globalmente, a produtividade agrícola. No entanto, o autor discute
ainda que, como o lodo pode conter altas concentrações de contaminantes,
essa prática pode resultar em adição direta de patógenos diversos e
substâncias químicas indesejáveis ao solo e consequentemente na cadeia
alimentar (Saito, 2007).
A aplicação de lodo de esgoto na agricultura é a alternativa mais utilizada
no Brasil, sendo que 91,7% é utilizado na produção vegetal ou na
recomposição de áreas degradadas, e destas, 82,1% estão relacionados com a
agricultura, silvicultura e produção de plantas ornamentais. O estado de São
Paulo possui o maior número de pesquisas relacionadas ao tema, com 61,8%
do total de pesquisas publicadas (Castro et al., 2015).
Figura 2. Lodo de esgoto em processo de compostagem. Fonte: Mateus, 2017.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
45
2.1 Características nutricionais do lodo de esgoto
O lodo de esgoto possui macronutrientes essenciais para as plantas como
N, P, Ca, Mg e S, e diversos estudos têm demonstrado o potencial da utilização
do lodo de esgoto como fertilizante e condicionador de solo, além de
reciclagem da matéria orgânica (Saito, 2007). Em sua composição, em torno de
40% é matéria orgânica, 3% nitrogênio, 2% fósforo e 1% de potássio (Munhoz
& Berton, 2001).
O lodo de esgoto possui potencial para ser utilizado como fertilizante
nitrogenado, pois possui alto teor de N em sua composição (Backes et al.,
20017). O processo de liberação do N para as plantas ocorre lentamente e de
forma continua, pois a maior parte do N presente no lodo se encontra na forma
orgânica, entre 70 a 90%, variando de acordo com o tipo de solo e o lodo
utilizado (Colodro, 2005; Boeira et. al., 2002).
Estudos sugerem um aumento na produtividade em várias culturas
quando utilizados lodo de esgoto como fertilizante, superando inclusive, em
alguns casos culturas fertilizadas com adubação mineral. O lodo de esgoto é
pobre em K, portanto, em determinadas culturas, pode ser necessária
adubação complementar (Silva et al., 2001). O lodo de esgoto aumenta o teor
disponível de P no solo, o que pode ocorrer, devido a matéria orgânica
presente no lodo de esgoto favorecer a disponibilidade de P (Ribeirinho et al.,
2012).
Apesar dos benefícios para as plantas e para o solo, o lodo de esgoto
apresenta restrições, pois pode conter metais pesados que são tóxicos para as
plantas (Bettiol & Camargo, 2000). As concentrações de metais pesados porem
variar dependendo da origem do lodo. Normalmente, os metais pesados
presentes nos lodos de esgoto são o cobre, zinco, níquel, cádmio, chumbo
dentre outros. A disponibilidade destes metais para as plantas depende da
forma química encontrada no solo, sendo que diversos estudos mostraram que
estes metais estão presentes em quantidades não toxicas ao ambiente, não
causando, portanto, toxidez nos vegetais (Silva et al., 2001; Fytili & Zabaniotou,
2008).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
46
Tabela 2. Características químicas do lodo de esgoto gerado pela Estação de
Tratamento de Efluentes / Fazenda Lajeado – Botucatu (SP).
N P2O5 K2O Ca Mg S U-65oC MO C
----------------------------------------- ** porcentagem ao natural ------------------------
2,5 3,2 0,1 1,2 0,2 2,4 29 33 18
Na B Cu Fe Mn Zn
C/N pH
-----------------**mg kg ao natural ------------------
ao natural
568 145 159 33465 315 870
7/1 6,4
2.2 Efeitos da utilização de lodo de esgoto no solo
Conhecendo as propriedades do lodo de esgoto e a necessidade de
destinar de maneira correto este resíduo, tem se realizado uma série de
estudos quanto a capacidade de recuperação e condicionamento de solos em
áreas degradadas, buscando reestruturar e aumentar a fertilidade, com intuito
de tornar estes, novamente produtivos.
Sabe-se que solos desestruturados, são aqueles que naturalmente ou por
má utilização, se tornam ácidos, pobre em nutrientes e gradativamente chegam
ao ponto de se tornarem totalmente improdutivos. A utilização do lodo de
esgoto, enquanto fonte de material orgânico tem a capacidade de formar
agregados do solo, que reduzem o potencial erosivo, promove povoação
microbiana, aumento da fertilidade e capacidade de armazenamento de água,
além de favorecem o desenvolvimento de raízes (Tsutiya, 2001).
O lodo de esgoto melhora as condições físicas do solo, densidade,
porosidade e a retenção de água e por possuir alto teor de matéria orgânica,
eleva o pH, aumenta a CTC e a capacidade de fornecer nutrientes para as
plantas, e promove a ciclagem de nutrientes no solo (Malta, 2001).
Uma das importantes atribuições do solo é armazenar água e manter
disponível para que as plantas consigam se nutrir, desenvolver, reproduzir e
completar seu ciclo. Porém, solos desestruturados apresentam menor
capacidade de armazenamento e consequentemente menor disponibilidade
hídrica, que compreende a quantidade de água entre a capacidade de campo e
o ponto de murcha permanente (Klein, 2014). Em estudo sobre as
características físicas de solos, os resultados mostraram que a utilização do
lodo de esgoto proporcionou alterações nos macro e microporos e,
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
47
consequentemente, na porosidade total de um Latossolo vermelho distrófico,
espaços estes responsáveis por reter água e ar (Campos & Alvez, 2008).
A capacidade de armazenamento de nutrientes em solos degradados é
extremamente baixa, e tem se percebido que o uso do lodo proporciona
aumento da matéria orgânica destes, que está diretamente ligada a capacidade
de troca de cátions do solo (Seki, 1995), estes responsáveis por armazenar
nutrientes essenciais às plantas, como macro e micronutrientes, em seus
coloides.
Nas Tabelas 1 e 2, do estudo de Bonini et al., (2015), pode-se verificar a
melhora dos atributos químicos, na profundidade de 0-0,40 m, do solo
submetido aos tratamentos com lodo de esgoto.
Tabela 1. Bonini et al., (2015) adaptado - Valores médios de teor de fósforo
(P), potássio (K), cálcio (Ca) e magnésio (Mg), matéria orgânica (MO),
potencial hidrogeniônico (pH), acidez potencial (H + Al), soma de bases (SB),
capacidade de troca catiônica (CTC) e saturação por bases (V%) nas camadas
de 0-0,05 e 0,05-0,10 m em solos cultivados com eucalipto e braquiária,
submetidos aos tratamentos testemunha, 30 ou 60 Mg ha-1 de lodo de esgoto.
Tratamentos P resina MO pH
K Ca Mg H+Al SB CTC V%
mg dm-3 mg dm-3 mmolc dm-3
0-0,05
Testemunha 1c 6b 5,6b 0,5c 6b 8b 11d 14,5b 25,5c 57a
30 Mg ha-1 55b 9b 5,9a 0,7b 9ab 13a 16c 22,7a 38,7b 57a
60 Mg ha-1 97a 13a 5,2b 0,7b 13a 14a 21b 22,7a 48,7a 57a
0,05-0,10
Testemunha 1c 8b 5,8b 0,4bc 7b 6b 11c 13,4b 24,4b 55b
30 Mg ha-1 39b 9b 5,1b 0,5b 7b 8b 15b 15,5b 30,5a 51b
60 Mg ha-1 98a 10b 4,8b 0,5b 11a 10a 19b 21,5a 40,5a 53b
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
48
Tabela 2. Bonini et al., (2015) adaptado - Valores médios de teor de fósforo
(P), potássio (K), cálcio (Ca) e magnésio(Mg), matéria orgânica (MO), potencial
hidrogeniônico (pH), acidez potencial (H + Al), soma de bases (SB),
capacidade de troca catiônica (CTC) e saturação por bases (V%) nas camadas
de 0,10-0,20 e 0,20-0,40 m em solos cultivados com eucalipto e braquiária,
submetidos aos tratamentos testemunha, 30 ou 60 Mg ha-1 de lodo de esgoto.
Tratamentos P resina MO pH
K Ca Mg H+Al SB CTC V%
mg dm-3 mg dm-3 mmolc dm-3
0,10-0,20
Testemunha 1b 5bc 6,2a 0,3c 8ab 6a 10d 14,3a 24,3ab 59a
30 Mg ha-1 6b 6bc 5,4ab 0,3c 5b 4ab 12d 9,3a 21,3b 44a
60 Mg ha-1 35a 6b 5,1bc 0,2c 10a 8bc 14bc 18,2a 32,2a 57a
0,20-0,40
Testemunha 1c 3b 5a 0,2c 5a 3a 12bc 8,2a 20,2ab 41a
30 Mg ha-1 3b 3b 4,7b 0,1c 4b 2b 12bc 6,1b 22,1a 34b
60 Mg ha-1 4b 3b 4,9b 0,1c 7a 3a 12bc 10,1a 23,5a 46a
Estudos sugerem que o lodo de esgoto pode desempenhar um papel
importante como condicionador de solo, que a aplicação eleva a CTC e SB, e
por consequência, aumento significativo do teor de nutrientes do solo.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
49
Referências
BACKES, C., DE LIMA, C. P., FERNANDES, D. M., DE GODOY, L. J. G., KIIHL, T. A. M., & BÔAS, R. L. V. Efeito do lodo de esgoto e nitrogênio na nutrição e desenvolvimento inicial da mamoneira. Bioscience Journal, 25(1), 2009.
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51
CAPÍTULO 7
USO DO LODO DE ESGOTO EM PLANTAS
Dariane Priscila Franco de Oliveira1, Anny Mery Marcon Ruiz2,
Fernando Broetto3, Alessandro Reinaldo Zabotto1, Irineu Eduardo
Kühn1, Tamiris Cristina Oliveira de Andrade1, Luz Maria Ruiz
Machuca4
1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem e Energia na Agricultura) – Faculdade
de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,
CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil, e-mail: [email protected],. 3Engenheira
Florestal, Mestranda em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade
Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 3Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual
Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dr
a. Irina Delanova
Gemtchujnicov, s/n0, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil.
4Doutor em Agronomia
(Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.
Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
O crescimento populacional promoveu o aumento do volume de efluentes
(QADIR et al., 2010) e resíduos sólidos domésticos gerados pelas estações de
tratamento de esgoto - ETEs (TASSO JÚNIOR et al., 2007). A administração
inadequada referente ao descarte ou uso desses resíduos pode causar graves
problemas ambientais ao contaminar corpos hídricos e conflitos sociais por
oferecer riscos à saúde pública.
O lodo de esgoto é um resíduo sólido, gerado ao fim do processo
realizado em ETEs (AFÁZ et al., 2017). O material coletado pelas redes de
esgoto passa por procedimentos de coagulação, floculação,
sedimentação, decantação e filtração (BITTENCOURT et al., 2012;
ANDREOLI, 2001), cujo objetivo é purificação e devolução da água aos corpos
hídricos ou seu reuso para irrigação (QUINTANA et al., 2011; JELIC et al.,
2011). Quando tratado e estabilizado através de processos químicos e
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
52
biológicos, o lodo é chamado de biossólido (OLIVEIRA, 2017; DORES-SILVA,
2011). Esta estabilização visa atenuar seus odores e seu conteúdo de
microrganismos patogênicos (ANDREOLI, 2001).
É possível preparar o lodo, resultante do processo de purificação da água,
antes de sua utilização para cumprir normas legais e também adequá-lo quanto
ao uso final desejado, por diferentes procedimentos tecnológicos (SUTHAR,
2010). O lodo gerado pode ser incinerado, descartado em aterros sanitários,
disposto em oceanos e reutilizado na agricultura e silvicultura como adubo e
condicionador do solo (LIRA et al., 2008; JELIC et al., 2011; QUINTANA et al.,
2011; VIEIRA et al., 2011). Ocorrem muitas variações físicas e químicas do
lodo de esgoto de modo que tais fatores podem definir se o material em
questão será classificado como seguro ou inseguro. Portanto, é importante que
o material resultante desses procedimentos seja submetido a análises químicas
abrangentes precedentes à sua utilização (CIÉSLIK et al., 2015).
O Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) na Resolução no 375,
proíbe o uso do lodo e seus derivados em pastagens, cultivo de olerícolas,
tubérculos e raízes, culturas inundadas e culturas cuja parte comestível entre
em contato com o solo. Em contrapartida, a resolução permite seu uso em
cultivos de café, silvicultura, culturas para produção de fibras e óleos ou em
outras culturas após 48 meses perante determinadas restrições (CONAMA,
2006). Esta aplicação traz como benefícios a redução do descarte de lodo em
aterros sanitários, incineradores, mares e corpos hídricos, ciclagem de
nutrientes, maior teor de matéria orgânica no solo e redução de custos com o
uso de fertilizantes minerais (AFÁZ et al., 2017), contribuindo assim para a
redução do lançamento de resíduos no meio ambiente.
2. Lodo de esgoto na nutrição de plantas
O tratamento de efluentes municipais resulta na produção de grandes
quantidades de lodo de esgoto, o que requer uma gestão adequada e
ambientalmente correta antes da disposição final (KELESSIDIS e
STASINAKIS, 2012). Em estimativas do Instituto Trata Brasil (2017), referentes
às capitais brasileiras, um volume aproximado de 1,2 bilhão de m3 de esgoto foi
lançado nos corpos hídricos em 2013 sem nenhum tratamento. Visando mitigar
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53
este efeito ambiental nocivo e incentivar a utilidade deste material, o uso do
lodo de esgoto como fertilizante tem sido praticado como alternativa à
incineração e seu depósito em aterros, esta forma de alocação tem
evidenciado vantagens econômicas e ambientais (ROCHA et al., 2016).
O lodo apresenta decomposição lenta, disponibilizando gradualmente os
nutrientes no solo (SILVA et al., 2012), por isso torna-se um material
interessante em nutrição de plantas uma vez que os nutrientes são
disponibilizados mais lentamente quando comparados a fertilizantes químicos
comerciais que apresentam elementos na forma imediata de absorção pela
planta podendo ser perdidos por volatilização, lixiviação e percolação.
Altamente rico em nutrientes, o lodo apresenta compostos orgânicos,
macronutrientes e micronutrientes como N, P, K, Ca, Mg e Fe (MARTINEZ et
al., 2003), micro poluentes orgânicos, microrganismos (KULLING, 2001) e alto
teor de metais pesados (DEDE e OZDEMIR, 2016), como o cobre (Cu), um dos
metais pesados em maior proporção no lodo (MOSQUERA-LOSADA et al.,
2016). Para a reciclagem segura do lodo devem ser consideradas as condições
do solo, a qualidade do lodo e a cultura pretendida (OLIVEIRA, 2017).
Os efeitos do lodo de esgoto em plantas perpassam pela germinação,
desenvolvimento inicial, crescimento, fenologia, acúmulo de matéria seca e de
metais pesados (SINGH e AGRAWAL, 2008).
Estudos relatam efeitos benéficos à produtividade de plantios florestais
sob efeito da aplicação de lodo de esgoto. A fertilização com aplicação de lodo
em plantas de Corymbia citriodora promoveu incremento de biomassa foliar,
óleo essencial e biomassa lenhosa (SILVA et al., 2012). Plantas de Eucalyptus
urograndis adubadas com fertilizante comercial como as plantas adubadas com
lodo de esgoto apresentaram taxa relativa de crescimento semelhante,
corroborando o potencial de substituição do fertilizante comercial pelo lodo de
esgoto (AFÁZ et al., 2017). No cultivo de Eucalyptus camaldulensis sob
aplicação do lodo obtiveram parâmetros biométricos aproximadamente 20%
superiores às plantas adubadas convencionalmente, o mesmo estudo
evidenciou que o tratamento com o lodo implicou em um aumento de 40% no
número de folhas das plantas (SOUDANI et al., 2017).
Em culturas agrícolas o efeito do lodo de esgoto também tem sido
avaliado. Um estudo conduzido em Varanasi, Índia, plantas de arroz (Oryza
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
54
sativa L.) apresentaram redução do comprimento das raízes, enquanto que o
comprimento das folhas, número de folhas, área foliar e a biomassa total
aumentaram significativamente quando cultivadas sob várias taxas de lodo de
esgoto. O rendimento de arroz aumentou de 60%, a 137% de acordo com o
aumento da quantidade de lodo incorporada ao solo. Todavia estas plantas
apresentaram contaminação por metais pesados (SINGH e AGRAWAL, 2010).
Em gramíneas a aplicação de lodo de esgoto favoreceu o crescimento de
biomassa (ARAÚJO et al., 2009; BACKES et al., 2010). Em um experimento
desenvolvido na China, a biomassa de duas espécies de gramíneas (Zoysia
japonica e Poa annua) aumentou e a estação de crescimento destas foi mais
longa, as concentrações de metais pesados mantiveram-se dentro do permitido
com exceção do Cádmio (Cd) que ultrapassou a recomendação vigente no país
(WANG et al, 2008).
Plantas de milho nutridas via lodo de esgoto (Zea mays L.) se
desenvolveram de maneira semelhante às plantas do tratamento controle, no
mesmo estudo, teores de Cr, Pb e Zn nos grãos, quando detectados,
permaneceram abaixo dos limites máximos estabelecidos para o consumo
humano conforme a legislação brasileira (NOGUEIRA et al., 2008).
Em de plantas de alfafa (Medicago sativa L) a aplicação de lodo melhorou
a fotossíntese líquida, resultando em maior crescimento e produtos
fotossintéticos (açúcares solúveis) necessários para o metabolismo de nódulos
(ANTOLÍN et al., 2010), indicando alterações do uso de lodo de esgoto em
níveis fisiológicos da planta.
Em um estudo realizado com a cultura da cana de açúcar, o tratamento
que recebeu o lodo de esgoto como fertilizante apresentou maior quantidade
de sacarose acumulada expressa em termos de açúcar total (CHIBA et al,
2008). Outro estudo concluiu que uso do lodo de esgoto em comparação às
plantas de cana de açúcar cultivadas com fertilização mineral, não alterou a
qualidade da matéria-prima, destacando o expressivo potencial desse material
no aspecto nutricional (CÓ JUNIOR et al. 2008).
Em plantas de feijão o aumento da dose de lodo de esgoto promoveu o
incremento no número de vagens, rendimento de matéria seca, rendimento de
grãos e na massa de 1000 grãos (LOBO et al., 2011). Em uma pesquisa
realizada na Índia, todas as concentrações de metais acumulados em plantas
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55
de feijão cultivadas em solos com aplicação de logo de esgoto, exceto Cd no
grão, estavam abaixo dos limites padrão da Organização das Nações Unidas
para Alimentação e Agricultura (FAO) / Organização Mundial da Saúde (OMS)
(KUMAR e CHOPRA, 2014).
Diante deste contexto, o uso de lodo de esgoto na nutrição de plantas
pode apresentar efeitos benéficos no desenvolvimento de culturas florestais e
agrícolas. Em função da variação da composição do lodo de esgoto, é
recomendável uma análise física e química do material antes de sua aplicação
e um monitoramento regular dos níveis de metais em produtos agrícolas para
evitar seu acúmulo na cadeia alimentar e atender às legislações vigentes nos
diversos países.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
56
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CAPÍTULO 8
PIGMENTOS FOLIARES
Mara Lúcia Cruz De Souza1, Anny Mery Marcon Ruiz2, Fernando
Broetto3, Luz Maria Ruiz Machuca4, Enrique Alonso Zuñiga4, Tamiris
Cristina Oliveira de Andrade1
1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem e Energia na Agricultura) – Faculdade
de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,
CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil, e-mail: [email protected]. 2Engenheira
Florestal, Mestranda em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade
Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 3Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual
Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dra. Irina Delanova
Gemtchujnicov, s/n0, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. 4
Doutor em Agronomia
(Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.
Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
Os pigmentos foliares podem ser empregados como sinalizadores de
estresse em plantas. Plantas submetidas a estresse bióticos e abióticos
apresentam decréscimo na assimilação de nutrientes que compõem a molécula
de clorofila, prejudicando o aparelho fotossintético (CODOGNOTTO et al.,
2002). Cavalcante et al. (2009), infere que plantas cultivadas em solos salinos
sofrem degradação da clorofila devido ao acréscimo da atividade da enzima
clorofilase reduzindo a concentração de clorofila nas folhas.
2. Clorofilas
A clorofila é o pigmento mais abundante nas plantas e ocorrem nos
cloroplastos das folhas e em outros tecidos vegetais. É objeto fundamental
para a fotossíntese, absorvendo luz solar e convertendo em energia química,
processo primordial para as plantas. A fotossíntese abrange duas fases: fase
fotoquímica e fase bioquímica, na fase fotoquímica ocorrem as reações
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
60
luminosas, essas reações acontecem quando as plantas estão iluminadas. Na
fase bioquímica ocorrem as reações de fixação de carbono que não dependem
de energia luminosa.
A presença e a concentração de pigmentos fotossintéticos nas plantas
são dependentes da espécie. Os seres vivos que realizam fotossíntese que
produz oxigênio (oxigênica) apresentam a clorofila a. Alguns seres vivos são
destituídos da clorofila a, apresentando como pigmento fotossintético a
bacterioclorofila, é o caso das bactérias fotossintetizantes. A primeira fase do
processo da fotossíntese (fase clara) utiliza como pigmento a clorofila a. Já os
demais pigmentos, conhecidos como acessórios que integram diferentes tipos
de clorofilas (Clorofilas b, Clorofilas c, Clorofilas d e carotenoides) são
utilizados auxiliando na assimilação de luz e na movimentação da energia
radiante para os núcleos de reação (TAIZ & ZIEGER, 2004).
A máxima capacidade fotossintética das plantas é determinada pelos
teores de pigmentos (clorofilas e carotenoides) nos tecidos foliares, pois
possuem uma relação com a assimilação e movimentação de energia luminosa
e ao desenvolvimento e adaptação a vários ambientes (REGO e POSSAMAI,
2006).
Para extração de clorofilas deve-se ter cuidado, pois as ligações entre as
moléculas de clorofilas são bem delicadas (não covalentes), podendo se
romper facilmente ao macerar os tecidos em solventes orgânicos. O melhor
solvente a ser utilizado na extração de uma substância sofre influência direta
do caráter hidrofílico/hidrofóbico da substância, segundo Mussi (2003).
Para uma eficiente extração dos pigmentos foliares, utilizam-se solventes
polares (o acetato de etila, a acetona, o etanol, o metanol, dimetilformamida e a
piridina). O éter de petróleo e o hexano são solventes apolares pouco eficientes
na extração de pigmentos.
As plantas verdes possuem principalmente clorofila a que correspondem
a 75% dos pigmentos verdes totais, sendo que as clorofilas a e b são
encontradas nos organismos em uma proporção de 3:1. A proporção varia com
as condições de crescimento e fatores ambientais, assim plantas que crescem
na sombra apresentam uma quantidade elevada de clorofila b, o que pode
estar relacionado com suas propriedades de absorção da luz. A clorofila b é
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
61
capaz de absorver fortemente entre 450 e 480 nm, enquanto a clorofila a
absorve entre 400 e 450 nm (SILVA et al., 2013).
Entretanto, as moléculas de clorofila podem sofrer degradação por se
tratar de moléculas instáveis. Variações no meio como alterações no pH,
estresse térmico ou excesso de luz são fatores que causam degradações nas
clorofilas, dando origem a produtos denominados feopigmentos. A feofitina,
originada da degradação da clorofila, causa várias alterações nas medidas
deste pigmento, por absorver luz na mesma região do espectro que a clorofila
(CETESB, 2014).
3. Antocianinas
A palavra antocianina tem origem grega (anthos, uma flor, e kyanos, azul
escuro). As antocianinas são o segundo mais importante grupo de pigmentos
de origem vegetal são encontradas em maior quantidade nas angiospermas
(LOPES et al., 2007).
As antocianinas têm como principais funções em flores e frutos vários
mecanismos reprodutores das plantas, tais como dispersão de sementes e a
polinização, atuam também protegendo vários tecidos das plantas de
processos oxidativos, agindo como filtro das ações da luz (MALACRIDA e
MOTA, 2006). Costa et al. (2015) informa que em algumas espécies vegetais,
as antocianinas estão relacionadas à resistência de patógenos e agem
aprimorando e controlando a fotossíntese.
4. Extração e análise dos teores de pigmentos
4.1 Preparo da amostra
Coletar folhas frescas em campo e armazenar em recipiente com isolação
térmica, no intuito de manter a umidade das folhas. Em laboratório deve-se
retirar amostras circulares com o auxílio de um “cortador com diâmetro pré-
definido” os quais posteriormente devem ser alocados em tubos de ensaio.
Deve-se utilizar folhas sadias e evitar a realização do corte sobre nervuras, e
áreas com possíveis danos.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
62
4.2 Ensaio
a. Para análise das antocianinas “A”: adicione 1 mL de solução de
Dimetilformamida ácido em cada tubo.
b. Preparo da solução de Dimetilformamida ácido (0.1 N HCL com DMF):
Para um volume total de 500 mL, misturar 1,53 mL de HCL concentrado (puro)
com 498.5 mL de dimetilformamida.
c. Para análise de clorofilas “C” e outros pigmentos: adicione 1 mL de solução
de Dimetilformamida puro em cada tubo.
Tampe os tubos com papel alumínio e mantenha no escuro por 24 horas
ou mais. Ao final da incubação, os discos devem ter aparência incolor. A
solução “A” deve ter uma coloração vermelha e a solução “C” deve apresentar
coloração verde (Figura 1).
Figura 1. Detalhe da extração de clorofilas em folhas de eucalipto.
Ao final da incubação as leituras devem ser realizadas nos comprimentos
de onda λ. a 525, 654 e 666 nm para antocianinas “A” e para clorofilas “C”, leia
a D.O a 480, 646,8 e 663,8 nm, conforme Lee et al. (1987). Utilize
Dimetilformamida, como branco do espectrofotômetro.
A determinação das antocianinas, clorofilas e outros pigmentos serão
calculadas pelas equações estabelecidas por Porra et al. (1989), expressas em
µg mL-¹.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
63
Antocianinas
𝐴𝑛𝑡𝑜𝑐𝑖𝑎𝑛𝑖𝑛𝑎 =𝐴525 − (0,14053 × 𝐴654 + 0,01746)
38
Onde:
A525 = leitura da amostra a 525 nm;
A654= leitura da amostra a 654nm.
Clorofila a
𝐶𝑙𝑜𝐴 = (12 × 𝐴663,8) − (3,11 × 𝐴646,8)
Onde:
CloA – Clorofila a;
A663,8 – Leitura da amostra a 663,8nm;
A646,8 - Leitura da amostra a 646,8nm.
Clorofila b
𝐶𝑙𝑜𝐵 = (20,78 × 𝐴663,8) − (4,88 × 𝐴646,8)
Onde:
CloB - Clorofila b;
A663,8 – Leitura da amostra a 663,8nm;
A646,8 - Leitura da amostra a 646,8nm.
Carotenoides
𝐶𝑎𝑟𝑇 = ((1000 × 𝐴480) − (1,12 × 𝑐𝑙𝑜𝐴) − (34,07 × 𝐶𝑙𝑜𝐵)
245)
Onde:
CarT – carotenoides totais;
A - Leitura da amostra a 480nm;
CloA – Clorofila a;
CloB - Clorofila b.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
64
Referências
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em pinhão-manso (Jatropha curcas L.) sob estresse salino. In: JORNADA DE
ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 9. 2009, Pernambuco. Resumos...
Pernambuco, out. 2009.
CETESB. Análise de Clorofila a como Ferramenta no Monitoramento da
qualidade das Águas. Cadernos da Gestão do Conhecimento. São Paulo,
2014. 83p.
CODOGNOTTO, L. M.; LEITE, I.C.; SANTOS, D. M. M.; MADALENO, L.L.;
KOBORI, N.N.; MARIN, A.; MADALENO, L. L.; KOBORI, N. N.; BANZATTO,
D.A. Efeito do alumínio nos teores de clorofilas de plântulas de feijão-mungo e
labe-labe. Revista Ecossistema, v.27, n.12, p. 27-30, 2002.
COSTA, V. C.; GRAMACHO, R. S.; SANTOS, A. S.; AMORIM, F. A. C.
Aplicação do Extrato De Amêndoa de Cacau (Theobroma Cacao. L) como um
Novo Indicador em Titulações Ácido-Base. Revista Virtual Química, v.7, n. 4,
p. 1496-1507. 2015.
LEE, D.W., BREMMEIER, S., SMITH, A.P. The selective advantage of anthocyanins in developing leaves of mango and cacao. Biotropica, v. 19, p. 40-49, 1987. LOPES, T. J., XAVIER, M. F., QUADRI, M. G. N., QUADRI, M. B. Antocianinas: uma breve revisão das características estruturais e da estabilidade. Revista Brasileira Agrociência, Pelotas, v.13, n.3, p. 291-297, 2007. MALACRIDA, C.R.; MOTA, S. Antocianinas em suco de uva: composição e estabilidade. Boletim do CEPPA, v. 24, p. 59-82, 2006. MUSSI, L. Eficiência fotodinâmica das protoporfirinas IX de magnésio e
zinco. 73p. Dissertação (Mestrado em Química) - Curso de Pós-graduação em
Química, Instituto de Química, Unicamp. 2003.
REGO, Gizelda Maia; POSSAMAI, Edilberto. Efeito do sombreamento sobre o
teor de clorofila e crescimento inicial do Jequitibá-rosa. Boletim de Pesquisa
Florestal, Embrapa Florestas, n. 53, p. 179-194, 2006.
SILVA, A. R. et al. Extração de pigmentos fotossintéticos em folhas das
espécies de café (coffea arábica), acálifa (acalypha hispida) e urucum
(bixa orellana) por meio de cromatografia em papel. VIII Simpósio de
Pesquisa dos Cafés do Brasil 25 a 28 de novembro de 2013, Salvador - BA.
TAIZ, L.; ZIEGER, E. Fisiologia vegetal. 3.ed. Porto Alegre: Artmed, 2004.
p.693.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
65
CAPÍTULO 9
PROTEÍNAS SOLÚVEIS TOTAIS
Fernando Broetto1, Luz Maria Ruiz Machuca2, Enrique Alonso
Zuñiga2, Mara Lúcia Cruz De Souza3, Anny Mery Marcon Ruiz4,
Alessandro Reinaldo Zabotto3, Cristiane de Pieri5
1Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual
Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dra. Irina Delanova
Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil, e-mail:
Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de
Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,
CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 3Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem
e Energia na Agricultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual
Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
4Engenheira Florestal, Mestranda em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas,
Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu
– SP, Brasil. 5Doutora em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas,
Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu
– SP, Brasil.
1. Introdução
A análise de proteínas solúveis totais pode ser feita de forma bastante
simples através de métodos espectrofotométricos. O protocolo mais difundido
é o Bradford, o qual utiliza Coomassie Brilliant Blue G-250. Este composto
carregado negativamente liga-se a cargas positivas da cadeia polipeptídica. O
corante apresenta em dois picos de absorção: vermelho (Amax. = 465nm) e azul
(Amax. = 595 nm). Apesar da predominância da forma vermelha de absorção, a
mesma converte-se para a forma azul, quando o corante reage com a proteína.
A reação é altamente reproduzível e rápida, completando-se em cerca de dois
minutos com estabilidade de cor por até uma hora. No entanto, as leituras
devem ser efetuadas após 15 minutos de incubação. O segundo método,
pouco conhecido, mas muito preciso é uma modificação da técnica do biureto
com algumas vantagens relativas a maior precisão (5 a 10 vezes), curva de
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
66
calibração linear e mantem a qualidade da detecção de proteínas sem
influência em relação a presença de muitos compostos.
2. Material e reagentes
2.1 Determinação de Proteína solúvel total pelo método Bradford
(Bradford, 1976)
2.1.1 Ensaio
Para obtenção do extrato, moer 500 mg de tecido vegetal em 2 mL de
tampão fosfato 0, 1 M, pH 6.7 e centrifugar por 10 min a 5000 x g e separar o
sobrenadante (extrato bruto); Pipetar três alíquotas de 100 µL (triplicata) de
extrato e acrescentar 5 mL do reativo de Bradford (agitar); Ler a absorbância
em 595 nm após 15 minutos. Comparar a leitura obtida em espectrofotômetro
com a curva padrão, através da equação da reta. Para melhorar a precisão,
determinar poucas amostras de cada vez para que as leituras não demorem,
considerando-se que a linearidade do método começa a alterar após 15
minutos de reação. Utilizar preferencialmente cubetas de vidro ou plástico
(metacrilato) e não de quartzo para evitar a adesão do complexo corante-
proteína nas mesmas.
2.1.2 Preparo das soluções
Comassie Brilliant Blue G-250
Dissolver 100 mg do corante em 50 mL de etanol 95% e adicionar 100 mL de
ácido fosfórico 85% e misturar bem em Becker; Diluir até 1 L em balão volumétrico e
filtrar 2 vezes em papel de filtro e armazenar em frasco escuro em geladeira.
Albumina de soro bovino - BSA (1 mg mL-1)
Dissolver 0,88 g de NaCl (PM = 58,45) em 100 mL de H2O para obter
solução salina 0,15 M; Dissolver 100 mg de proteína (BSA, albumina de soro
bovino) em 100 mL de solução salina 0,15 M, e armazenar em freezer.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
67
2.1.3 Curva padrão
Organize um esquema de análise como o quadro abaixo em triplicata e
proceda a reação e leitura da D.O a 595 nm. A regressão linear dos valores
médios obtidos será utilizada como referência para análises de proteína solúvel
em tecido vegetal.
Quadro. Reação e leitura da D.O a 595 nm para análises de proteína solúvel
em tecido vegetal
Identificação Componentes do ensaio
Tubo # Concentração
(µg) BSA (µL)
H2O
(µL)
Coomassie
brilliant Blue
(mL)
1 0 0 100 5.0
2 10 10 90 5.0
3 20 20 80 5.0
4 30 30 70 5.0
5 40 40 60 5.0
6 50 50 50 5.0
7 60 60 40 5.0
8 70 70 30 5.0
9 80 80 20 5.0
10 90 90 10 5.0
11 100 100 0 5.0
2.2 Determinação de Proteína pelo método do amido negro (Popov, 1975)
Para o ensaio, serão preparadas soluções padronizadas de proteína
(BSA) em concentração final de 0.1 mg BSA mL-1 em água bidestilada
(armazenar em freezer a -22°C). A solução corante será formulada inicialmente
com o preparo de uma solução estoque com 0.13 g amidonegro10B dissolvido
em 1 mL de ácido acético 100%, p.A. e 9 mL de etanol. Esta mistura deverá
permanecer em agitação por uma noite e mantida a 4°C. Para o teste, mistura-
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
68
se 0.5 mL da solução estoque com 24.5 mL de Ácido (10 mL de ácido acético
com 90 mL de etanol). A solução de trabalho deverá ser preparada apenas
antes do uso e filtrada. Ainda para o teste, será necessário o preparo de uma
solução 1N de NaOH (dissolver 2 g NaOH em água bidestilada, completando-
se o volume para 50 mL.
2.3 Protocolo
A curva padrão deverá ser preparada em triplicata, em tubos Eppendorf:
BSA, em µg µL padrão
0 0
2 20
4 40
6 60
8 80
As amostras de extrato vegetal serão analisadas em triplicata (tubos
Eppendorf) sendo que padrões e amostras são tratados paralelamente.
Alíquotas de 100 µL de amostra serão misturadas a 0.6 mL da solução
corante e incubadas por 5 min a temperatura ambiente. Os tubos serão então
centrifugados por 5 min a 12,000 x g (centrífuga para Eppendorf), descartando-
se o sobrenadante. Adicionar 1.0 mL do Ácido e agitar em vortex, seguindo-se
de centrifugação por 5 min a 12,000 x g. Esta etapa será repetida mais uma
vez, descartando-se o sobrenadante completamente. O pellet resultande será
dissolvido em 300 µL de NaOH 1N por agitação em vortex. Ao final, determinar
a a absorção em 624 nm (branco, utilizar padrão sem BSA).
Alternativamente, a D.O. poderá ser obtida a partir da leitura em Elisa-
reader (filtro: 620 nm), conforme modelo abaixo.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
69
Quadro. Modelo D.O. para leitura em Elisa-reader (filtro: 620 nm).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0µg
BSA
0µg
BSA
2µg
BSA
2µg
BSA
4µg
BSA
4µg
BSA
6µg
BSA
6µg
BSA
8µg
BSA
8µg
BSA empty empty
B sample
1a
sample
1b
sample
1c
sample
2a
sample
2b
sample
2c
sample
3a
sample
3b
sample
3c
sample
4a
sample
4b
sample
4c
C sample
5a
sample
5b
sample
5c
sample
6a
sample
6b
sample
6c
sample
7a
sample
7b
sample
7c
sample
8a
sample
8b
sample
8c
D sample
9a
sample
9b
sample
9c
sample
10a
sample
10b
sample
10c
sample
11a
sample
11b
sample
11c
sample
12a
sample
12b
sample
12c
E sample
13a
sample
13b
sample
13c
sample
14a
sample
14b
sample
14c
sample
15a
sample
15b
sample
15c
sample
16a
sample
16b
sample
16c
F sample
17a
sample
17b
sample
17c
sample
18a
sample
18b
sample
18c
sample
19a
sample
19b
sample
19c
sample
20a
sample
20b
sample
20c
G sample
21a
sample
21b
sample
21c
sample
22a
sample
22b
sample
22c
sample
23a
sample
23b
sample
23c
sample
24a
sample
24b
sample
24c
H sample
25a
sample
25b
sample
25c
sample
26a
sample
26b
sample
26c
sample
27a
sample
27b
sample
27c
sample
28a
sample
28b
sample
28c
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
70
Referências
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Analytical Biochemistry,
72:248-254, 1976.
POPOV, N.; SCHIMITT, M. SCHULZEL, S.; MATTHIES, H. Einei störungsfreie
Mikromethode zur Bestimmung des Proteingehaltes in Gewebehomogenaten.
Acta Biologica Medica Germanica. 34, 1975, 1441-1446.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
71
CAPÍTULO 10
RAZÃO ISOTÓPICA DE 13
C/12
C E 15
N/14
N
Fernando Broetto1, Luz Maria Ruiz Machuca2, Enrique Alonso
Zuñiga2, Mara Lúcia Cruz De Souza3, Irineu Eduardo Kühn3,
Cristiane de Pieri4
1Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual
Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dra. Irina Delanova
Gemtchujnicov, s/n0, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. e-mail:
[email protected]; 2Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de
Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,
CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil,. 3Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem)
– Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de
Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 4
Doutora em Ciência Florestal -
Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de
Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.
1. Introdução
Medidas de discriminação isotópica são técnicas de grande utilidade para
compreensão das relações entre as plantas e o meio ambiente onde se
desenvolvem. Os isótopos são átomos de um mesmo elemento que diferem
unicamente no número de nêutrons e, portanto, na sua massa atômica,
mantendo-se idênticas as suas propriedades químicas (MATEO et al., 2004).
No caso do nitrogênio, o 15N é o isótopo estável de maior interesse nos
estudos de ecofisiologia (MARTÍNEZ-ALCÁNTARA, 2010). Sua descoberta
data de 1929, sendo que sua aplicação aumentou fundamentalmente nas três
últimas décadas graças à implantação de metodologias que utilizam a
espectrometria de massas de fluxo de isótopos (MIDDELBOE e JOHANSEN,
1990). Da mesma forma, o carbono é um isótopo de interesse em plantas. A
atmosfera contem CO2 cujas formas ocorrem como isótopos 12C, 13C, e 14C nas
proporções de 98.9%, 1.1%, e 10-10 %, respectivamente. As propriedades
químicas do 13CO2 são idênticas aquelas do 12CO2, porém devido à pequena
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
72
diferença na massa (2.3%), as plantas tendem a fixar menos o 13CO2 que o
12CO2. Plantas C3 (δ13C–28‰) discriminam mais 13CO2 que as plantas C4
(δ13C–14 ‰). A maior discriminação de carbono ocorre durante a reação de
carboxilação catalizada pela RUBISCO, a enzima primária de fixação de CO2
em plantas C3, apresentando uma discriminação intrínseca (δ 13C) de –30 ‰.
Por outro lado, a PEP carboxilase, a enzima primária de fixação em plantas C4,
apresenta um efeito de discriminação isotópica muito menor, sendo δ 13C = –2
a 5.7 ‰ (CONDON et al., 2002).
2. Aplicação dos isótopos δ 13C e δ 15N em plantas sob estresse
Os isótopos δ13C e δ 15N são utilizados na ecofisiologia para avaliar as
respostas das plantas a mudanças climáticas, sendo que ambos são sensíveis
às restrições ambientais (PEUKE et al., 2006)
As análises isotópicas do carbono medem a relação de 13C/12C das
amostras e os resultados são expressos em termos de diferença de 13C em
relação ao padrão.
Em plantas, a maioria dos trabalhos com isótopo δ13C é realizado em
nível foliar, sabendo-se que nesse órgão vegetativo ocorre o maior
fracionamento da fotossíntese. No entanto, o carbono nas plantas pode ter
variações genotípicas e ambientais diferentes, dependendo do órgão
vegetativo. (MATEO et al., 2004). A discriminação do isótopo δ13C pelas folhas
de plantas C3 está relacionada com as trocas gasosas da fotossíntese,
podendo estar controlada pela razão da concentração do CO2 nos espaços
intercelulares das folhas e da atmosfera Farquhar et al. (1982).
As plantas sob condições de boa disponibilidade de água no solo,
aproveitam a maior disponibilidade de CO2 para aumentar sua eficiência
hídrica. Embora haja redução da condutância estomática nessas condições
não há limitação da fotossíntese, tornando-se os valores do isótopo δ13C mais
negativos (maior discriminação do δ13C) à medida que a concentração de CO2
aumenta (BEERLING; WOODWARD 1995).
A composição isotópica natural do 15N/14N (δ15N) poderia ser usado como
marcador do metabolismo do N em plantas sob diferentes condições. No
entanto, sabe-se que o metabolismo no N primário é complexo e as perdas ou
ganhos diferem com o tempo (ARIZ et al., 2015). O fracionamento do isótopo
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
73
de nitrogênio na planta ocorre como resultado da assimilação do NO-3 ou NH+4
na translocação para as folhas e o metabolismo no nitrogênio no citoplasma.
Diversos estudos observaram que o δ15N diminui com a idade da planta e
intensidade de luz, no entanto, aumenta com maiores concentrações de NO-3
(WADA; HATTORI, 1978; KOHL; SHEARER, 1980).
2.1 Coleta e processamento do material vegetal
Recomenda-se coletar folhas totalmente expandidas do terço médio da
planta e depositá-las dentro de sacolas de papel devidamente identificadas, em
seguida as amostras deverão ser levadas cuidadosamente para o laboratório.
As amostras vegetais (folhas) deverão ser secas em estufa de ventilação
forçada (Figura 1), a temperatura de 50° C por um período de 48 h.
Figura 1. Estufa com circulação forçada de ar para secagem de tecidos vegetais.
Após secagem, as amostras deverão transferir-se para potes plásticos
especiais (que suportem condições de baixas temperaturas) e moídas
individualmente em moinho criogênico (2010 GENO/GRINDER – Spex
SamplePrep, USA) durante três minutos após resfriamento a -196 °C. O material
obtido deverá apresentar características homogêneas e de granulometria menor
que 60 µm (DUCATTI et al., 1982).
Fonte: Autores do capitulo (2018)
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
74
Figura 2. Transferência das amostras para tubos plásticos (A), resfriamento em
nitrogênio líquido (B) e moagem em moinho criogênico (C).
As amostras moídas devem ser transferidas para tubos Eppendorf e
posteriormente pesadas em cápsulas de estanho (Figura 3) com
aproximadamente 60 µg e 600 µg para análise da razão isotópica 13C/12C e
15N/14N respectivamente.
Figura 3. Potes plásticos com amostras (A) e pesagem em capsulas de
estanho (B).
As capsulas deverão ser introduzidas por meio de amostrador automático
no EA onde, em presença de oxigênio (O2) sofrerão a combustão e
redução para a obtenção de CO2 ou N2 dependendo da análise. Os gases
formados serão direcionados para o IRMS utilizando He como gás de arreste.
A B C
A
Fonte: Autores do capitulo (2018)
B
Fonte: Autores do capitulo (2018) Fonte: Autores do capitulo (2018)
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
75
2.2 Análises da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N
As amostras deverão ser analisadas por espectrometria de massa de
razão isotópica de fluxo contínuo CF-IRMS “continuous-flow isotope ratio mass
spectrometry” utilizando um IRMS (Delta V Advantage Isotope Ratio MS –
Thermo Scientific, Germany) acoplado a um analisador elementar – EA
“elemental analyzer” (Flash 2000 Organic Elemental Analyzer – Thermo
Scientific, Germany) por meio da interface (ConFlo IV Universal Interface –
Thermo Scientific, Germany).
2.3 Determinação da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N
Os valores das razões isotópicas são expressos em valor de delta per mil
(δ‰) relativos aos padrões internacionais PeeDee Belemnite (PDB) para o 13C
e, nitrogênio do ar atmosférico para 15N, de acordo com a seguinte equação
geral:
δ‰ (amostra, padrão) = [(Ramostra – Rpadrão) / Rpadrão] x 1000 (15)
Em que R representa a razão entre o isótopo menos abundante e o mais
abundante, em particular 13C/12C e 15N/14N. Recomenda-se que cada amostra
seja analisada duas vezes para a obtenção dos valores médios; as medidas
serão repetidas exclusivamente quando o desvio padrão for superior que 0,2‰
para δ13C e 0,4‰ para δ15N.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
76
Referências
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O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
77
CAPÍTULO 11
FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a: ASPECTOS
GERAIS E PROTOCOLO DE MEDIDA PARA LI-6400/LI-
6400XT
Diogo Capelin1, Gabriel Silva Daneluzzi1, Ricardo Ferraz de
Oliveira1, Fábia Barbosa da Silva1, Aécio Mendes da Silva1,
Francynês da Conceição Oliveira Macedo1, Aldeir Ronaldo Silva1,
Marina Viana Queiroz1, Fernando Broetto2
1Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"/ Universidade de São Paulo, Piracicaba – SP,
Brasil, e-mail: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected],[email protected], [email protected],
[email protected]. 2Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica,
Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua
Profa. Dra. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil.
1. Introdução
O desenvolvimento de uma sólida compreensão das relações entre os
parâmetros de fluorescência e o transporte de elétrons fotossintéticos in vivo
aliado a disponibilidade comercial de uma variedade de fluorômetros portáteis e
de fácil operação (BAKER, 2008), tem levado a difusão da técnica de medida
de fluorescência da clorofila in vivo em estudos de ecofisiologia de plantas
(HALNET, 2018).
Os métodos de medida da fluorescência da clorofila baseiam-se no
pressuposto de que a energia luminosa absorvida pelas moléculas de clorofila
pode ser dissipada por três diferentes, competitivas e interligadas vias:
dissipação fotoquímica (fotossíntese); dissipação não fotoquímica (emissão de
calor); ou reemissão em um comprimento de onda maior que o absorvido pelas
clorofilas a fluorescência. Desta forma, a mudança em uma das vias resultará
em alterações nas demais (HALNET, 2018).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
78
Além de ser uma medida não invasiva, a fluorescência da clorofila pode
ser uma ferramenta muito poderosa para o estudo do desempenho
fotossintético das plantas (MURCHIE; LAWSON, 2013). Fornece ainda,
informações sobre a quantidade da energia que está disponível para a
dissipação fotoquímica, especialmente quando combinada com outras medidas
não invasivas, como análise de trocas gasosas e termometria infravermelha
(BAKER, 2008).
Para fins de medida é importante conhecer os parâmetros que são
considerados pelos métodos mais difundidos. A partir dos anos 80, a
introdução da técnica de fluorescência por pulso de amplitude modulada (PAM)
abriu novas oportunidades para o estudo detalhado das formas de dissipação
nos fotossistemas (RUBAN, 2016). Nesta técnica, plantas adaptadas ao escuro
são submetidas a uma baixa intensidade de luz, suficiente para induzir a
emissão de fluorescência, porém insuficiente para arrancar elétrons do centro
de reação do fotossistema II (PSII).
Assim é obtida a fluorescência mínima ou inicial da clorofila “a” no estado
adaptado ao escuro (Fo) (figura 1) que representa a emissão de luz pela
molécula de clorofila “a” quando esta encontra-se em estado de excitação
anterior à dissipação da energia para os centros de reação do PSII, em uma
condição em que todos os aceptores primários de elétrons, quinona A
(QA), estejam em estado oxidado (KRAUSE e WEIS, 1991). Esta forma de
dissipação de energia ocorre independentemente dos eventos fotoquímicos
(CONROY, 1986).
A fluorescência máxima no estado adaptado ao escuro (Fm) (Figura 1) é
obtida quando todos os aceptores primários de elétrons do PSII tenham sido
“fechados” (QA totalmente reduzida) em resposta a um pulso de alta
intensidade (aproximadamente 9000 µmols m2 s-1) e curta duração (de 0,5 a
1,0 segundo) (CONROY, 1986). Nesta condição, a energia é completamente
dissipada através da fluorescência da clorofila, uma vez que, durante um curto
espaço de tempo, as QA’ s encontram-se completamente reduzidas, impedidas,
portanto, de receber novos elétrons oriundos dos centros de reação dos PSII
(MAXWELL; JOHNSON, 2000).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
79
Figura 1. Medidas básicas de fluorescência da clorofila. Em folhas adaptadas
ao escuro, são medidos os valores de fluorescência mínima da folha adaptada
ao escuro Fo, e Fluorescência máxima da folha adaptada ao escuro Fm. Em
folhas iluminadas, são medidos Fluorescência no estado estável Fs ou F,
Fluorescência máxima da folha adaptada ao claro Fm’, e Fluorescência mínima
da folha adaptada ao claro Fo’. Fv: fluorescência variável adaptada ao escuro;
Fv’: fluorescência variável adaptada ao claro; ΔF ou Fq; Fluorescência que é
dissipada a partir do nível máximo Fm’ até F’ pela fotoquímica do PSII.
A partir desse simples procedimento, obtém-se a fluorescência inicial da
clorofila a (Fo) e a fluorescência máxima (Fm) que reflete a máxima capacidade
energética das clorofilas.
A partir desses parâmetros pode-se calcular a eficiência quântica
potencial de PSII (Fm-Fo) / Fm também conhecido como Fv/Fm (CONROY, 1986;
GENTY et al., 1992; MURCHIE; LAWSON, 2013). Fv/Fm possui grande
relevância pois reflete o máximo (ou potencial) rendimento quântico do PSII e é
uma boa medida de sua integridade. Valores ótimos de Fv/Fm medidos em
várias espécies de plantas encontraram-se próximos de 0,83 (BJORKMAN;
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
80
DEMMIG, 1987). Essa variável tem sido amplamente utilizada como referência
para detectar perturbações induzidas por estresse no aparato fotossintético
(BAKER; ROSENQVIST, 2004; SILVA et al., 2014).
Conforme descrito acima, Fv/Fm é obtida em plantas adaptadas ao escuro.
Quando as plantas são submetidas a luminosidade, ou seja, são adaptadas à
luz, a dissipação da energia captada pelas clorofilas ocorre através das vias
fotoquímica, calor (dissipação não fotoquímica) e fluorescência.
Quando as plantas são expostas a luz, a máxima fluorescência observada
em Fm é reduzida pelas demais formas de dissipação atingindo um estado
estável conhecido como Fs. Nessa condição, a aplicação de um pulso de
radiação saturante elevará a fluorescência ao nível máximo no estado
adaptado a luz (Fm’) e o valor obtido é menor que Fm, uma vez que, em
condições de adaptação à luz, a fotoquímica e o calor são formas de
dissipação atuantes e reduzem a energia dissipada através da fluorescência.
Um pulso de escuro, que pode ser associado a utilização de luz no
comprimento do vermelho-distante, reduz a fluorescência ao seu nível mínimo,
obtido em plantas previamente adaptadas a luz (Fo’) (HALNET, 2018) (figura 1).
A Tabela 1 apresenta as principais variáveis obtidas através das medidas
de fluorescência da clorofila a. É importante salientar que a literatura utiliza
nomenclatura variável para cada parâmetro, sendo necessária atenção para a
forma de cálculo de cada um, a fim de evitar que uma informação seja tomada
por outra.
Embora a medida da fluorescência da clorofila seja uma técnica
poderosa, ela também é limitada. Mesmo com fácil manuseio, a teoria
subjacente, o processo por trás das medições e o ajuste do instrumento
precisam ser entendidos, caso contrário, os dados produzidos causarão
interpretações enganosas, uma vez que, uma grande quantidade de dados é
produzida e sua interpretação permanece bastante complexa. Além disso, a
análise da fluorescência não é suficiente para explicar o que acontece na
fotossíntese ou para calcular, por exemplo, a produção de biomassa (HALNET,
2018).
Tabela 1. Variáveis relacionadas à medida de fluorescência da clorofila com base no
manual do LI-6400 /LI-6400XT (LI-COR Biosciences, 2012).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
81
Variável Equação Descrição
Medida
Escuro Fo --
Fluorescência mínima da folha adaptada ao
escuro
Fm --
Fluorescência máxima da folha adaptada
ao escuro
Claro
FS -- Fluorescência no estado estável
Fm' --
Fluorescência máxima da folha adaptada
ao claro
Fo' --
Fluorescência mínima da folha adaptada ao
claro
Calculada
Escuro Fv Fm-Fo Fluorescência variável adaptada ao escuro
Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm Eficiência quântica potencial do PSII
Claro
qP (Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’) Dissipação fotoquímica
qN
(Fm – Fm')/(Fm –
Fo') Dissipação não fotoquímica
NPQ (Fm- Fm’)/Fm’ Dissipação não fotoquímica alternativa
ETR
ΦPSII*PPFD*
αleaf*f Taxa efetiva de transporte de elétrons
ΦCO2
(A –
Adark)/Iαleaf
Rendimento quântico associado a
assimilação de CO2
ΦPSII (Fm’ - Fs)/Fm’ Eficiência quântica efetiva do PSII
Onde PPFD é densidade de fluxo de fótons incidentes, αleaf é a absorbância
fracionária de luz pela folha (o LI-6400 usa o valor de αleaf de 0,84 – LI-COR
Biosciences, 2012; Baker, 2008) e f é a fração de quanta absorvida que é usada
pelo PSII, sendo tipicamente assumida como 0,5 para plantas C3 e 0,4 para
algumas plantas C4 como o milho (LI-COR Biosciences 2012).
Diversos processos podem utilizar o poder redutor e energia (NADPH e
ATP) gerados pelo fluxo de elétrons na cadeia transportadora do cloroplasto,
como a fotorrespiração e ciclo do nitrogênio, além de sua utilização para a
fixação de carbono (TAIZ; ZAIGER, 2013). Além disso, a própria dissipação
não fotoquímica através do ciclo das xantofilas requer NADPH na conversão de
zeaxantina para violaxantina (JAHNS; LATOWSKI; STRZALKA, 2009).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
82
A dissipação da energia das clorofilas via formação de espécies reativas
de oxigênio constitui uma válvula de segurança para a liberação do excesso de
energia. A produção de 1O2 nos centros de reação ocorre quando os aceptores
de elétrons do PSII (pool de plastoquinona) estão em um estado altamente
reduzido, geralmente em condições de alta luminosidade ou seca
(CZARNOCKA; KARPINSKI, 2018). Isoladamente a análise de fluorescência da
clorofila é incapaz de quantificar a energia dissipada por estes processos.
Uma aplicação mais eficaz da fluorescência é combina-la com outras
técnicas, em particular, medições de troca gasosas, para obter uma imagem
completa da resposta das plantas ao seu ambiente (HALNET, 2018).
Para mais informações sobre a fluorescência da clorofila consulte Maxwell
e Johnson (2000), Baker e Rosenqvist (2004), Baker (2008), Murchie e Lawson
(2013) e Ruban (2016).
Neste capítulo propomos um protocolo para auxiliar a execução de boas
medidas de fluorescência da clorofila, em especial para os usuários do LI-6400
acoplado a câmara de fluorescência.
2. Testes básicos de funcionamento da câmara de fluorescência da folha
(LCF)
A câmara de fluorescência da folha (6400-40 Leaf Chamber Fluorometer -
LCF) é composta por três tipos de LEDs diferentes quanto ao comprimento de
onda que produzem: 3 LEDs azuis (comprimento de onda de aproximadamente
470 nm), 1 LED vermelho distante (comprimento de onda de aproximadamente
740 nm) e o restante dos LEDs são vermelhos (comprimento de onda de
aproximadamente 640 nm). A LCF possui, além das fontes de luz, um detector
de fluorescência e outro detector de luz actínica (figura 2). Na parte inferior da
câmara da folha está localizado um termopar responsável pela medida de
temperatura da folha.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
83
Figura 2. Conjunto de LEDs e detectores para a medida de fluorescência da
clorofila. Vista superior interna da câmara de fluorescência da folha. A- LEDs
azuis, M- luz de medida, FR- LED de comprimento de onda na faixa do
vermelho distante; os demais LEDs emitem luz no comprimento de onda do
vermelho. Adaptado de LI-COR Bioscience, 2012.
Para a realização de boas medidas de fluorescência da clorofila todos os
componentes da LCF precisam estar devidamente calibrados. Com o intuito de
assegurar ao usuário o bom funcionamento dos componentes da LCF alguns
testes básicos são sugeridos abaixo.
Com o equipamento ligado, entre no menu “HOME MENU” na tela
principal do equipamento. Vá em “Diagnostics & Tests” clique em enter, desça
até a linha “LCF Control Panel...” (figura 3) e siga os passos descritos a seguir.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
84
Figura 3. Imagem ilustrativa do “LCF Control Panel” - menu utilizado para
diagnósticos e testes da câmara da fluorescência da folha (LCF).
1. LCF ON/OFF:
Alterne o LCF entre ON e OFF clicando nas setas para baixo e para cima
localizadas nas laterais do painel do LI-6400. Quando em OFF, o cooler da
câmara deve parar. Quando em ON, o cooler deve ligar.
2. Mod ON/OFF:
Com LCF: ON, Mod: ON, e Meas: 3.0, o LED verde de status MSR deve
estar ligado; este LED localiza-se no cabo de conexão entre o console e a
sensor head na extremidade ligada ao console. Agora olhe para os dois
LEDs vermelhos na LCF enquanto você alterna a função Mod entre ON e
OFF. Os dois LEDs devem ficar mais brilhantes quando Mod é OFF, e com
menos brilho quando Mod é ON. O LED verde de status MSR permanecerá
aceso.
3. Configurações de frequência - Freq:
Com Mod ON, percorra as definições frequência (0,25 - 1,0 - 10 - 20 KHz).
Você deverá ver o brilho nos dois LEDs mudar. Quanto maior a freqüência
mais brilhante deverão ser os LEDs.
4. Zere o sinal de fluorescência:
Mude a função Mod para ON e defina o valor 0 para Meas. O sinal ("Final
F") deve ir a zero (+/- 4). Pressione Z para zera-lo caso este valor não seja
atingido.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
85
5. Verifique a resposta da fluorescência: Com Meas em 3, Mod ON, Filter em
0,5, e Gain em 10, prenda o cartão rosa fluorescente (que vem com o
equipamento) na câmara de fluorescência. As leituras devem ser cerca de
300 ou 400. O ruído ou variação do sinal deve ser de cerca de 2 ou 3. A
ausência de resposta ao cartão, ou a qualquer folha clipada na câmara,
indica que o fluorômetro não está funcionando.
Obs: Cada equipamento LI-6400 possui um cartão rosa fluorescente
particular, não utilize cartões de outros equipamentos.
6. Verifique filtro digital - Filter: Alterar para 200 Hz (pressione a seta para
baixo para saltar de 0,5 para 200). O pico de ruído vai aumentar em um
fator de 10. Defina o filtro de volta para 0,5 Hz.
7. Verificação do funcionamento dos LEDs azuis: Altere Blue de 0 para 2.
Verifique se todos os três LEDs azuis actínicos na LCF estão ligados. Agora
aumente-os até 10. O valor de parIn_μm deverá ser cerca de 150 ou 200.
Volte o valor de Blue para 0.
8. Verificação do funcionamento dos LEDs vermelhos: Altere Red para 1 e
veja se eles ligam. Eles deverão estar todos ligados em 1 e todos
desligados em 0. Desligue-os.
Atenção: não há impedimentos para elevar o brilho dos LEDs vermelhos até
seu valor máximo 10, entretanto, em valores próximos ao máximo eles se
tornarão muito brilhantes, sendo que sua observação direta é perigosa,
além disso, a manutenção de valores altos por mais que alguns segundos
encurtará a vida uútil dos LEDs.
9. Verificação do funcionamento do LED vermelho-distante (Far red): Mude o
valor de Far para 10. Veja se ele está iluminado. Posteriormente desligue-o.
2.1 Calibração do flash retangular
Essa é uma rotina importante e inerente ao método MPF (Multiphase
Flash Protocol). Para obter flashes retangulares bons é necessário fazer a
calibração. Para isso, você pode usar a câmara fechada sem a folha, aberta,
ou com folha.
Na tela inicial, vá em Calib Menu, LCF Source e escolha Square Flash
Calibration. Pressione Y. O procedimento levará alguns minutos. A rotina de
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
86
calibração do flash retangular roda a LCF por uma variedade de flashes de
duração e intensidade variáveis e determina algumas relações empíricas que o
sistema usa posteriormente para fornecer flashes razoavelmente retangulares
e as fases 1 e 3 do multifásico também retangulares.
Quando perguntado Keep?, pressione Y.
A razão para que a calibração seja feita é que a eficiência dos LEDs cai
com o calor por ele próprio gerado. Quando os LEDs são acionados muito
intensamente para um flash, seu output começa a cair quase imediatamente ao
atingir o brilho desejado. Isso é compensado tentando aumentar a corrente
elétrica para os LEDs apenas o suficiente para equilibrar isso.
Portanto essa rotina deve ser feita no começo do dia e periodicamente ao
longo do dia se a temperatura mudar muito.
2.2 Definição da intensidade ótima da luz de medidas (Meas)
Este programa oferece um protocolo para a determinação da melhor
intensidade de luz de medida (Meas) para a determinação da fluorescência
inicial Fo. Para a determinação deste parâmetro é necessário o fornecimento de
uma intensidade luminosa tão grande quanto possível para induzir a
fluorescência sem induzir a fotossíntese, ou seja, é necessária uma intensidade
luminosa máxima capaz de produzir fluorescência da clorofila, porém
imediatamente inferior ao necessário para produzir o deslocamento de elétrons
dos centros de reação dos fotossistemas.
Com uma folha adaptada a condição de escuro clipada na câmara de
medidas vá para o menu de calibração “Calib menu” e em “LCF source”
selecione “Optimum Meas Intensity”. Forneça uma série de intensidades que
serão aplicadas pela Meas. Pressione enter. Insira o tempo que o feixe de
medição ficará ligado em cada intensidade. Pressione enter. Defina o tempo de
recuperação entre cada intensidade quando o feixe de medidas permanecerá
desligado (Figura 4). Pressione enter. Na dúvida, deixe os valores padrão.
Aparecerá a seguinte pergunta: Store results at end? Pressione Y caso você
deseje. Se não, pressione N. Ao final, aparecerá Plot results? Pressione Y para
ver o gráfico.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
87
Figura 4. Menu para a determinação de “Optimum Meas Intensity”.
Durante o "tempo em cada intensidade", o programa coletará os dados de
fluorescência F e, em seguida, determinará a taxa de variação de F (por
minuto) (dF/dt) marcado como slope. Ao final, será gerado um gráfico destes
valores de slope em função da intensidade de medida. Intensidades de Meas
mais altas que o ideal resultam em um aumento de slope, o que indica o início
da dissipação fotoquímica, tornando o valor obtido para Fo incorreto. Por este
motivo toma-se como ideal a maior intensidade de Meas que resulta na menor
variação de slope (Figura 5).
Figura 5. Gráfico apresentado como resultado do teste para definição da
intensidade ótima de Meas. Adaptado de LI-COR Biosciences, 2012.
2.3 Definição da intensidade do flash de saturação
Este programa oferece um protocolo para a determinação da melhor
intensidade do flash de saturação utilizado para a determinação de Fm e Fm’.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
88
Com uma folha adaptada a condição de luz clipada na câmara de
medidas vá até o menu de calibração “Calib menu”, “LCF source” e selecione
“Optimum Flash Intensity”. Forneça uma série de intensidades para o flash,
bem como, o tempo de recuperação entre cada flash (figura 6). Pressione enter
para aparecer essas opções à medida que você as vai escolhendo. Responda
Y para sim ou N para não quando aparecer as perguntas Store each flash?,
Store results at end? Pressione enter para começar.
Figura 6. Menu para a determinação de “Optimum Flash Intensity”.
Ao final será apresentado um gráfico de Fmax plotado contra a intensidade
do flash. A menor intensidade do flash que produz o maior valor de
fluorescência é considerada ideal (figura 7). Se esta condição for obtida na
intensidade mais alta (10), é possível que mesmo a maior intensidade do flash
seja incapaz de promover a máxima fluorescência. Neste caso é recomendável
a utilização do protocolo “MultiPhase Flash”, capaz de calcular a máxima
fluorescência da clorofila.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
89
Figura 7. Gráfico apresentado como resultado do teste para definição de
“Optimum Flash Intensity’. Adaptado de LI-COR Biosciences, 2012.
2.4 Protocolo para flash multifásico (MultiPhase Flash)
A medida da fluorescência máxima de folhas adaptadas a luz (Fm’) é
necessária para o cálculo da eficiência quântica efetiva de PSII (PSII) e da
taxa de transporte de elétrons (ETR). Com relação a Fm', ele geralmente é
medido com um único flash de saturação para reduzir o aceptor de elétrons
primário do PSII (QA). Em muitas condições, especialmente em plantas de
campo adaptadas de alta luminosidade, a redução completa do pool de QA é
dificultada e muitas vezes o protocolo padrão que utiliza um flash retangular
não é capaz de alcançar esta condição, nestes casos é sugerida a utilização do
flash de saturação com formato multifásico (Figura 8).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
90
Figura 8. Esquema ilustrativo dos diferentes formatos de flash de saturação.
Esquerda: flash retangular; Direita: Flash multifásico. Adaptado de LI-COR
Biosciences, 2012.
O flash multifásico é composto por três fases com diferentes intensidades
luminosas (Q). A fase 1 utiliza alta intensidade, por aproximadamente 250 ms
para reduzir o pool de QA-PQ; A fase 2 é uma rampa de queda de Q que dura
cerca de 500 ms; Na fase 3 a Q do flash retorna ao valor inicial a fim de
garantir que a dissipação não-fotoquímica não foi ativada pelo flash. Com os
valores de Fm’ obtidos na fase 2 é gerada uma regressão, que, quando
extrapolada, intercepta o eixo y em um gráfico de fluorescência vs. 1E4/Q
(figura 9). Neste gráfico o ponto do intercepto do eixo y é tido como um valor de
Fm’ obtido com uma Q que tende ao infinito.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
91
Figura 9. Regressão dos valores de Fm' obtidos na fase 2 do flash multifásico,
plotados vs. 1E4/Q e extrapolados para estimar a fluorescência máxima na
intensidade do flash que tende ao infinito. Adaptado de LI-COR Biosciences,
2012.
O adequado ajuste da regressão é atestado por um valor elevado de r2
que pode ser obtido adequando os tempos de duração, intensidade de cada
fase do flash e especialmente adequando a porcentagem de queda da rampa.
A configuração do flash multifásico pode ser feita na linha 8, f2 “Flr
Editor”; em flash selecione o “type” alterando-o para “Multiphase”, defina a
porcentagem da rampa bem como a duração de cada fase. Uma boa
porcentagem de queda da rampa situa-se entre 15% e 40%.
Para visualizar o flash obtido, na linha 0 aperte f5 “View Fsh/Drk”. Na tela
serão exibidos os detalhes do flash. Aperte f1 “View Graph”. Na tela “Flr Event
Viewer” aperte F para “latest Flash” D “latest Dark Pulse” e P para “Previously
stored file”. Para visualizar a regressão obtida na linha 0 aperte f5 “View
Fsh/Drk” na tela que exibe os detalhes do flash. Aperte f3.
2.5 Medida da fluorescência da clorofila
As medidas de fluorescência da clorofila a iniciam-se com a folha
adaptada ao escuro. Esta adaptação é feita pela manutenção das folhas em
ausência de luminosidade e pode ser obtida diretamente com a folha clipada a
LCF, ou com a utilização de clips de papel apropriados que acompanham o
equipamento (9964-091 dark adapting clip kit).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
92
Nesta fase registramos os parâmetros Fo (Fluorescência com todos os
aceptores do fotossistema II (PS II) “abertos”; QA’s totalmente oxidadas). Para
esta medida os dois LEDs representando a Meas (Figura 1) estarão ligados.
Com a folha ainda adaptada ao escuro será obtida a fluorescência
máxima da clorofila (Fm) através da aplicação de um flash de saturação, de
modo que todos os aceptores do PS II tenham sido “fechados” (QA’s totalmente
reduzidas).
Entre no menu “New Msmnts”, na linha 8 aperte f4 para selecionar “Msr
Adjust”, neste menu será inserida a intensidade de “Meas” definida no
protocolo “Optimum Meas Intensity” descrito acima. Os LEDs responsáveis
pela “Meas” são modulados (ligam e desligam) muito rapidamente e é permitido
ao usuário escolher a frequência de modulação (0,25, 1, 10 ou 20 kHz). Esta
luz vermelha modulada é referida como “a luz de medida”. Em frequências
elevadas a quantidade de radiação fornecida aumenta e pode levar ao início da
dissipação fotoquímica da energia, o que acarretaria em medidas errôneas de
Fo, desta forma é recomendado que para a determinação deste parâmetro seja
utilizada a frequência de 0,25 KHz de “Meas”.
Para as definições do flash de saturação e determinação de Fm ainda na
linha 8 aperte f2 para acessar “Flr Editor”. Será exibido como padrão o flash do
tipo retangular, você poderá altera-lo para Multiphase-flash caso necessário.
Defina a intensidade de acordo com o obtido no protocolo “Optimum Flash
Intensity”. A frequência dos LEDs para o flash de saturação deve ser mantida
em 20 kHz.
Abra um arquivo para salvar suas leituras: na linha 1 aperte f1 “Open
LogFile”. Na linha 9 você observará “meas is on”; “actinic is off”; e “far red is
off”. Nas medidas com adaptação ao escuro necessariamente “actinic” deverá
estar “off” para que nenhuma radiação em excesso seja fornecida a folha, isso
habilitará os comandos para as leituras de Fo e Fm, presentes na linha 0. Na
linha 0 aperte f3 “Do Fo Fm” para registrar Fo e aplicar o flash para
determinação de Fm, ou registre um por vez apertando f1 “Do Fo” e f2 “Do Fm”,
nunca na ordem inversa.
Inicie a adaptação da folha a condição luminosa. Na linha 8 aperte f3,
“Define Actinic”, selecione PAR, em “Target” entre com o valor de radiação
(PAR) previamente definido em uma curva de luz, (ver próximo capítulo) aperte
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
93
f5 “Keep”. Repare que na linha 9 aparecerá “Actinic is ON” na posição f4. Isso
ligará os LEDs azuis e vermelhos no interior da LCF e habilitará os comandos
para leituras com a folha adaptada a luz presentes na linha 0.
OBS: para as leituras dos parâmetros de fluorescência da clorofila com a
folha adaptada à luz, o IRGA deve estar devidamente ajustado para a
realização de medidas de trocas gasosas, uma vez que, uma boa medida
destes parâmetros necessita que a dissipação fotoquímica esteja estável. Faça
a checagem do equipamento conforme o fabricante (LI-COR Bioscience, 2012)
e como detalhado em Capelin et al. (2017) (Check-list de preparação).
Quando os parâmetros de trocas gasosas estiverem estáveis aperte f4
“Do Fs Fm’ Fo’” na linha 0. Observe que os parâmetros relacionados a folha
adaptada à luz são seguidos por um (’). Para a determinação de Fo’ é utilizado
um período de escuro e um período no qual o LED no comprimento de onda do
vermelho-distante (far red) se acende. Ele é responsável por estimular a
drenagem dos elétrons na cadeia transportadora, promovendo a re-oxidação
de todas as QA’s, gerando um novo valor mínimo de fluorescência, desta vez
em folhas adaptadas a luz.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
94
Referências
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BAKER, N. R.; ROSENQVIST, E. Applications of chlorophyll fluorescence can improve crop production strategies: an examination of future possibilities. Journal of Experimental Botany, v. 55, n. 403, p. 1607–1621, 2004.
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CAPELIN, D.; DANELUZZI, G.S.; OLIVEIRA, R.F.; BRESSAN, D.F.; CORRÊA, C.V.; JOCA, T.A.C.; ALVES, M.S.; BROETTO, F. Utilização do IRGA - Analisador de gases por infravermelho para avaliação de trocas gasosas em plantas: Check list de preparação. In: BROETTO, F.; GOMES, E.R.; JOCA, T.A.C. (Orgs.) O Estresse das Plantas - Teoria e Prática. São Paulo: Cultura Acadêmica, 2017. cap. 13, p.187-194.
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O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
96
CAPÍTULO 12
CURVA FOTOSSINTÉTICA DE RESPOSTA À LUZ
(CURVA A-Q): CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS E PASSO
A PASSO PARA EXECUÇÃO
Gabriel Silva Daneluzzi1, Diogo Capelin1, Ricardo Ferraz de
Oliveira1, Fábia Barbosa da Silva1, Aécio Mendes da Silva1,
Francynês da Conceição Oliveira Macedo1, Aldeir Ronaldo Silva1,
Marina Viana Queiroz1, Fernando Broetto2
1Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"/ Universidade de São Paulo, Piracicaba – SP,
Brasil, e-mail: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected],[email protected], [email protected],
[email protected]. 2Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica,
Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua
Profa. Dra. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil.
1. Introdução
As medidas de trocas gasosas usando analisadores de gases por
infravermelho é uma técnica bastante difundida e de fácil uso para
determinação de parâmetros importantes para o entendimento da fisiologia de
uma planta. Entre eles, taxa e eficiência fotossintéticas e componentes
fisiológicos e bioquímicos que são limitantes ao processo. Além disso, o uso de
fluorômetros ampliou a capacidade de avalição da fotossíntese (LONG;
BERNACCHI, 2003).
Duas abordagens podem ser utilizadas: medidas pontuais e as curvas de
resposta. Nessa última, medidas são feitas variando a concentração de um
substrato da fotossíntese (CO2) ou da fonte energética (luz). A curva
fotossintética de resposta à luz (A-Q) descreve a assimilação líquida de CO2
(A, µmol CO2 m-2 s-1) por uma folha como uma função de alterações na
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
97
intensidade luminosa (Q, µmol fótons m-2 s-1), ou seja, a densidade de fluxo de
fótons fotossintéticos (DFFF).
Muitos modelos matemáticos têm sido usados para descrever curvas A-Q
e os parâmetros calculados a partir delas são usados para descrever a
capacidade fotossintética, eficiência etc. Lobo et al. (2013) apresenta os
modelos matemáticos mais comuns para ajuste de curva A-Q utilizando a
função Solver do Microsoft Excel. O trabalho é acompanhado de planilhas do
Excel que permitem escolher a curva A-Q mais ajustada, selecionando-a pelo
menor valor da soma dos quadrados dos erros, que é uma medida estatística
da discrepância entre os dados e um modelo de estimativa.
A curva A-Q pode fornecer parâmetros como taxa de respiração no
escuro, ponto de compensação de luz (valor de luz no qual o CO2 assimilado
pela fotossíntese está em equilíbrio com o CO2 produzido pela respiração na
luz e fotorrespiração), eficiência quântica (obtida pela inclinação inicial da
curva) e taxa fotossintética máxima (Amax) (LI-COR Biosciences, 2012; LOBO et
al., 2013).
Em alguns casos, depois de atingir o valor Amax, um subsequente
decréscimo de A com aumento de intensidade luminosa, referido como
fotoinibição, pode ser observado (Ye, 2007).
Segundo Lobo et al. (2013), não há um modelo matemático definitivo para
descrever a curva A-Q que possa ser empregado em todas as situações.
Vários pesquisadores têm desenvolvidos esses modelos e ano após anos eles
são aprimorados. Por isso, nunca deixe de consultar a literatura.
Este capítulo traz orientações para a execução da curva fotossintética de
resposta à luz no IRGA LI-6400XT (LI-COR Biosciences, Lincoln, EUA)
seguindo instruções do fabricante (LI-COR Biosciences, 2012).
2. Considerações operacionais
2.1 Curva rápida
Esse método se aproveita do fato que o aparato fotossintético responde
quase imediatamente a luz, especialmente decréscimos de luz, assim a curva
se desenvolve de maneira rápida, como o nome sugere.
Comece com a folha equilibrada a alta intensidade luminosa, ou seja,
aguarde até que a abertura estomática e a assimilação estejam estáveis.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
98
Diminua a luz gastando um ou dois minutos em cada ponto, decrescendo 200
µmol m-2 s-1 ou menos. Ao fazer isso, você vai perceber que os estômatos não
tiveram tempo de se ajustar e tendem a estarem mais abertos nos valores de
baixa luminosidade do que normalmente estariam. Isso se manifesta como um
Ci (fração molar do CO2 intercelular) que aumenta progressivamente ao longo
da medição. Isso não é errado, porém os valores de condutância estomática
não são reequilibrados em cada novo ponto da curva, ou seja, tome cuidado
com seu uso.
2.2 Curva lenta
Nessa abordagem, os estômatos tem tempo para se equilibrarem em
cada nível de luz. Você pode usar o Ci como indicador de equilíbrio estomático
para fazer o registro de cada ponto, na medida em que o Ci ficará
razoavelmente constante ao longo da curva, desde que você espere (algo que
pode levar de 15 a 20 minutos em cada nível luminoso – por isso a curva é
lenta).
Dessa maneira você pode começar com alta intensidade luminosa e ir
decrescendo, ou com a luz desligada, em seguida, ligando-a, e aumentando o
seu nível gradativamente.
2.3 Luz
A melhor fonte de luz para realizar essa curva é a 6400-02B (vermelha +
azul) ou a 6400-40 LCF (fluorômetro, que também possui LEDs vermelhos e
azuis). A fonte 6400-02 contém somente LEDs vermelhos, o que causa
fechamento estomático além do normal à medida que a luz diminui, ou retarda
a abertura estomática à medida que a luz aumenta. Para mais detalhes sobre a
influência da luz azul na abertura estomática veja a revisão de Zeiger (1983).
2.4 CO2
Mantenha a concentração de CO2 na câmara constante. Use o mixer
controlando Sample CO2. Do contrário, os efeitos do dióxido de carbono na
fotossíntese serão confundidos com os efeitos da luz.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
99
2.5 Temperatura
Mantenha constante a temperatura da folha. Isso pode ser feito
indiretamente controlando a temperatura do bloco. Pela nossa experiência, o
controle da temperatura do bloco mantém a temperatura da folha relativamente
constante. É mais difícil de obter estabilidade controlando a temperatura da
folha diretamente.
2.6 Umidade
Isso pode ser feito com o próprio LI-6400. Opere o controle do fluxo pela
fração molar de água. Se a curva vai da luz para o escuro, as taxas de
condutância estomática e transpiração vão cair, então deixe uma margem para
o fluxo cair também. Se for do escuro para a luz as taxas aumentarão e o fluxo
também aumentará (ocorrerá de modo automático pelo controle do
equipamento).
Caso você disponha de um LI-610 Portable Dew Point Generator (gerador
de ponto de orvalho) ou outro equipamento que forneça ar com umidade
controlada, você pode utilizá-lo na entrada de ar do LI-6400.
Faça a checagem do equipamento conforme o fabricante (LI-COR
Biosciences, 2012) e como detalhado em Capelin et al. (2017) (Check-list de
preparação). Dê atenção especial a vazamentos.
Você pode fazer a curva manualmente, alterando os valores de luz e
registrando cada ponto quando as leituras estiverem estáveis. Antes de iniciar
a curva manual ou automática, espere a folha atingir um estado estável:
fotossíntese e condutância estomática sem tendência de aumento ou
diminuição e coeficiente de variação das medidas (TotalCV) de valor baixo.
Isso assegura que os estômatos estejam abertos e que enzimas e envolvidas
na fixação de CO2 estejam completamente ativas (JOHNSON; MURCHIE,
2011).
2.7 Passo a passo da curva de luz rápida automática (Autoprogram)
Controle o valor de CO2, luz, fluxo de ar, umidade e temperatura. Ajuste a
razão estomática e a área foliar. Faça o Match dos IRGAs.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
100
Abra um arquivo (Open LogFile) e dê um nome a ele. Vá na linha 5,
AUTO PROG. Escolha a opção Light Curve2. Aparecerá a seguinte
mensagem: Append to the current log file? Pressione Y. Se preferir, você pode
ir direto em AUTO PROG, Light Curve2 e nomear o arquivo. A partir daí você
estará no menu de configuração da curva.
Em Summary, em Lamp control, selecione PAR. Em SetPts, escolhas os
valores de intensidade luminosa total e a intensidade de luz azul (em % ou
µmol). Use 0 para quantidade em µmol ou 1 para porcentagem. Entre com os
valores como o exemplo: 2000, 10, 1. Isso significa que esse ponto será de
2000 µmol m-2 s-1 de luz total, com 10% de luz azul, sendo o restante vermelha
(caso você esteja usando as fontes de luz 6400-02B ou 6400-40 LCF). Nas
linhas de baixo coloque os próximos valores. O mais comum é trabalhar com
10% de azul (padrão do equipamento). Mas isso não impede de você ajustar os
valores conforme o objetivo de sua pesquisa.
Em Stability wait, escolha os valores mínimo e máximo. Para o valor
mínimo, 120 segundos é geralmente adequado. Este é o tempo que o sistema
irá aguardar em cada ponto para checar a estabilidade antes de registrar as
medidas. Para o tempo máximo, 200 segundos é adequado. Este é o máximo
que o sistema aguardará pela estabilidade antes do registro. Escolha a ação do
Log e os critérios de estabilidade.
Em Log Opts, escolha entre Beep on ou off, para ouvir, ou não, um som
quando for registrada uma medida. Em Match, as opções são Never, Always ou
“If one of…”. Never significa nunca fazer o Match, Always, sempre fazê-lo. Na
terceira opção, você pode escolher que o Match seja feito em algumas
situações, são elas: Elapsed time (tempo decorrido), CO2 change (mudança de
CO2) e CO2 (variação de CO2 entre amostra e referência). Na dúvida, escolha
essa opção e deixe os padrões do equipamento. Match sempre não é
obrigatório, porém não escolha a opção Never.
Depois de se certificar que esteja tudo certo, pressione START (f5) e o
equipamento fará automaticamente a curva de resposta à luz.
Se você desejar ver o gráfico da curva sendo feito, selecione na linha 1 a
opção VIEW FILE (f2), Import GrafDef (f1), Light curve. Pressione SELECT. É
necessário sair do gráfico (escape) para que a curva siga adiante. A cada novo
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
101
ponto registrado, vá em VIEW FILE (f2) e pressione REPLOT GRAPH (f2) para
vê-lo novamente. Retorne ao menu de medidas.
Na linha k é possível acompanhar nas opções Program e ProgPrgs a
contagem de tempo para cada etapa e o progresso da curva com o os pontos
já feitos, respectivamente. Após o término da curva, feche o arquivo: Linha 1,
Close File (f3).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
102
Referências
CAPELIN, D.; DANELUZZI, G.S.; OLIVEIRA, R.F.; BRESSAN, D.F.; CORRÊA, C.V.; JOCA, T.A.C.; ALVES, M.S.; BROETTO, F. Utilização do IRGA - Analisador de gases por infravermelho para avaliação de trocas gasosas em plantas: Check list de preparação. In: BROETTO, F.; GOMES, E.R.; JOCA, T.A.C. (Orgs.) O Estresse das Plantas - Teoria e Prática. São Paulo: Cultura Acadêmica, 2017. cap. 13, p.187-194.
JOHNSON, G.; MURCHIE, E. Gas Exchange Measurements for the Determination of Photosynthetic Efficiency in Arabidopsis Leaves. In. Jarvis, R.P. (Ed.) Chloroplast Research in Arabidopsis: Methods and Protocols, Volume II. New York: Springer, 2011. Cap. 17. p. 311- 326.
LI-COR Biosciences. Using the LI-6400/6400XT: Portable Photosynthesis System. Version 6, 2012.
LOBO, F.A.; BARROS, M.P.; DALMAGRO, H.J.; DALMOLIN, A.C.; PEREIRA, W.E.; Souza, E.C.; VOURLITIS, G.L.; RODRÍGUEZ-ORTÍZ, C.E. Fitting net photosynthetic light-response curves with Microsoft Excel – a critical look at the models. Photosynthetica, v. 51, n. 3, p. 445–456, 2013.
LONG, S.P.; BERNACCHI, C.J. Gas exchange measurements, what can they tell us about the underlying limitations to photosynthesis? Procedures and sources of error. Journal of Experimental Botany, v. 54, n. 392, p. 2393-2401, 2003.
YE, Z.-P. A new model for relationship between irradiance and the rate of photosynthesis in Oryza sativa. Photosynthetica, v. 45, n. 4, p. 637-640, 2007.
ZEIGER, E. The biology of stomatal guard cells, Annual Review of Plant Physiology, v. 34, p. 441-75, 1983.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
103
CAPÍTULO 13
CURVA FOTOSSINTÉTICA DE RESPOSTA AO CO2
(CURVA A-CI): CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS E PASSO
A PASSO PARA EXECUÇÃO
Gabriel Silva Daneluzzi1, Diogo Capelin1, Ricardo Ferraz de
Oliveira1, Fábia Barbosa da Silva1, Aécio Mendes da Silva1,
Francynês da Conceição Oliveira Macedo1, Aldeir Ronaldo Silva1,
Marina Viana Queiroz1, Fernando Broetto2
1Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"/ Universidade de São Paulo, Piracicaba – SP,
Brasil, e-mail: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected],[email protected], [email protected],
[email protected]. 2Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica,
Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua
Profa. Dra. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil.
1. Introdução
A fotossíntese é um processo que pode ser rotineiramente avaliado em
tempo real em plantas intactas pelas técnicas de trocas gasosas e
fluorescência da clorofila, que fornecem informações detalhadas de suas
diversas etapas. Isso é feito por meio de analisadores de gases por
infravermelho (infrared gas analyzer - IRGA) acoplados, muitas vezes, a
fluorômetros.
Os equipamentos disponíveis no mercado são sistemas abertos,
portáteis, de fácil uso e permitem um alto grau de controle do ambiente foliar,
incluindo concentração de CO2, luz, umidade e temperatura. Entre eles
podemos citar: LI-6400XT e LI-6800 (LI-COR, Lincoln, EUA), GFS-3000
(WALZ, Effeltrich, Alemanha), LCpro-SD e LCi-SD (ADC Bioscientific,
Hoddesdon, Inglaterra) e CIRAS-3 (PP Systems, Amesbury, EUA) (LONG;
BERNACCHI, 2003).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
104
O princípio básico de funcionamento é o mesmo, independentemente do
sistema. Uma folha intacta aderida à planta é colocada em uma câmara
hermética e ar com concentrações conhecidas de CO2 e H2O é passado
através dessa câmara com uma vazão constante. A quantidade de CO2 e H2O
produzidos ou consumidos na câmara é medida como diferenças na
absorbância nos analisadores por infravermelho (JOHNSON; MURCHIE,
2011).
Dessa maneira o equipamento fornece medidas em tempo real de
assimilação de carbono (A, µmol m-2 s-1), condutância estomática (gs, mol m-2 s-
1), transpiração (E, mmol m-2 s-1), fração molar do CO2 intercelular (Ci µmol
mol-1) entre outras (LONG; BERNACCHI, 2003).
O método mais frequentemente utilizado para entender como a
fotossíntese de plantas C3 responde a variações ambientais é o modelo de
Farquhar, von Caemmerer e Berry (FARQUHAR et al., 1980). Ele descreve a
fotossíntese como sendo limitada pela rubisco ou pela regeneração de RUBP
(ribulose 1,5-bisfosfato). Uma terceira limitação, uso de triose-fosfato, foi
adicionada por Sharkey (1985).
Curvas fotossintéticas de resposta ao CO2, mais conhecidas como curvas
A-Ci, são adequadas para avaliar esses três mecanismos e fornece uma série
de informações sobre a fisiologia e bioquímica de uma planta (SHARKEY,
2016). Teoricamente, cinco parâmetros podem ser estimados a partir dessas
curvas em plantas C3: taxa máxima de carboxilação da rubisco (Vcmax), taxa
máxima de transporte de elétrons para uma dada intensidade luminosa (J),
taxa máxima de uso de triose-fosfato (TPU), respiração diurna (Rd) e
condutância mesofílica (gm) (SHARKEY, 2016).
Para mais detalhes consulte o trabalho de Sharkey et al. (2007), que
fornece uma explicação detalhada de como modelar a curva A-Ci e estimar os
parâmetros acima citados, além de Sharkey (2016), que fornece uma planilha
em Excel com os cálculos para curva de CO2, além de curva de luz.
Uma abordagem mais detalhada está disponível no material suplementar
em Bellasio et al. (2016b), que fornece uma série de planilhas que permitem a
estimativa de muito mais parâmetros. Bellasio et al. (2016a) fornece planilhas
para cálculos relacionados a curva A-Ci e de luz para plantas C4.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
105
O presente capítulo traz orientações para a execução da curva A-Ci no
IRGA LI-6400XT (Open versão 6.3.4) seguindo instruções do fabricante (LI-
COR Biosciences, 2012). Considerações a serem feitas quando for realizar
uma curva de resposta ao CO2.
2. IRGA LI-6400XT
2.1 Luz
Mantenha a luz constante durante a curva. Como o comportamento
estomático não é tão importante nesse caso, desde que os estômatos estejam
razoavelmente abertos, a câmara 6400-02 LED, que contém apenas luz
vermelha, funcionará igualmente bem a que contém luzes azuis e vermelhas
6400-02B LED.
2.2 CO2
Use o mixer no modo de controle do CO2 na referência (CO2R). Defina a
ordem que a curva vai ser realizada. Algumas considerações devem ser feitas.
Altas concentrações de CO2 podem induzir fechamento estomático, portanto
elas devem ficar no final da curva. Ademais, se muito tempo é gasto perto do
ponto de compensação de CO2, pode haver desativação enzimática. Um
esquema de medida sugerido é: começar com CO2 em concentração ambiente,
reduzir sua concentração ao ponto de compensação de CO2, retornar a
concentração ambiente e então aumentar até o limite superior.
2.3 Temperatura
Esta curva deve ser realizada sob temperatura constante. Você pode
escolher entre controlar a temperatura do bloco ou da folha. Geralmente, o
controle da temperatura do bloco mantém a temperatura da folha relativamente
constante. Controlando a temperatura da folha, as medidas demoram mais a
estabilizar, uma vez que esse controle é feito de forma indireta, onde o
equipamento altera a temperatura do bloco até que a temperatura da folha
atinja a temperatura alvo.
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
106
2.4 Controle da umidade
Isso pode ser feito com o próprio LI-6400. No ajuste do fluxo de ar,
selecione o controle da fração molar de água e escolha o valor desejado. É
provável que haja maiores taxas de condutância estomática e transpiração em
valores baixos de CO2, então escolha um valor de fração molar que forneça
uma taxa de fluxo que possa ser aumentada (automaticamente pelo
equipamento).
Caso você disponha de um gerador de ponto de orvalho, por exemplo, LI-
610 Portable Dew Point Generator, ou outro equipamento que forneça ar com
umidade controlada, você pode utilizá-lo na entrada de ar do LI-6400.
2.5 Match
Faça antes de cada medida já que a concentração de CO2 estará
mudando bastante. Faça a checagem do equipamento conforme o fabricante
(LI-COR Biosciences, 2012) e como detalhado em Capelin et al. (2017) (Check-
list de preparação). Dê atenção especial a vazamentos.
Você pode fazer a curva manualmente, alterando os valores de CO2 na
referência e registrando cada ponto quando as leituras estiverem estáveis.
Antes de iniciar a curva manual ou automática, espere a folha atingir um estado
estável: fotossíntese e condutância estomática sem tendência de aumento ou
diminuição e coeficiente de variação das medidas (TotalCV) de valor baixo
(<5%). Lembre-se, quanto maior a diferença entre o ambiente em que a planta
está e as condições ambientais da câmara, mais tempo será necessário para
as medidas ficarem estáveis.
2.6 Passo a passo da curva automática (Autoprogram)
Escolha o valor de luz, que deve ser saturante (usualmente maior que
1500 μmol m-2 s-1 para plantas C3). Se você fez curvas de luz em suas plantas
(ver capítulo anterior), o valor saturante é aquele que resultou na máxima
assimilação de carbono.
Escolha o valor de fluxo desejado (μmol s-1), ou controle pela fração molar
de água (mmol mol-1).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
107
Defina a temperatura levando em conta as considerações feitas acima.
Ajuste a razão estomática e área foliar. Faça o Match dos IRGAs.
Abra um arquivo (Open LogFile) e dê um nome a ele. Vá na linha 5,
AUTO PROG. Escolha a opção A-Ci Curve2. Aparecerá a seguinte mensagem:
Append to the current log file? Pressione Y.
Ao invés disso, você pode ir direto em AUTO PROG, A-Ci Curve2 e
nomear o arquivo. A partir daí você estará no menu de configuração da curva.
Em Summary, em CO2 control, escolha Reference CO2. Em seguida,
escolha os pontos de CO2. Seguindo o que foi dito acima, você pode usar os
seguintes valores: 400 300 200 100 50 400 400 600 800 1000 1200. Se você
estiver trabalhando com uma planta C4, use 0 ao invés de 50. Note que há dois
pontos de 400 em sequência após o valor mais baixo. Isso deve ser feito para
que a folha tenha tempo de se recuperar após o valor de CO2 baixo.
Posteriormente, esse primeiro valor pode ser descartado. Os valores de
assimilação de carbono nesses pontos de 400 devem ser similares àquele
primeiro valor de 400, onde a planta estava no estado estável.
A literatura traz exemplos diversos de valores de CO2 utilizados em
curvas A-Ci (veja ZENG et al., 2010, MOUALEU-NGANGUE et al., 2017,
GŁOWACKA et al., 2018). Quanto mais pontos na curva, melhores serão as
estimativas nos modelos matemáticos para os cálculos dos parâmetros
derivados da curva A-Ci. Use valores adequados às suas condições.
Depois ajuste o tempo de espera para estabilidade (Stability wait). Para o
tempo mínimo, 60 segundos é geralmente adequado. Este é o tempo que o
sistema irá aguardar em cada ponto para checar a estabilidade antes de
registrar as medidas. Para o tempo máximo, 120 segundos é adequado. Este é
o máximo que o sistema aguardará pela estabilidade antes do registro.
Em Log, deixe selecionado Log. Em Stability definition, escolha os
critérios de estabilidade. Em Log Opts, escolha entre Beep on ou off, para
ouvir, ou não, um som quando for registrada uma medida.
Em Match, escolha entre Never, Always ou “If one of…”. Never significa
nunca fazer o Match, Always, sempre fazê-lo. Na terceira opção, você pode
escolher que o Match seja feito em algumas situações, são elas: Elapsed time
(tempo decorrido), CO2 change (mudança de CO2) e CO2 (variação de CO2
entre amostra e referência). Na dúvida, deixe os padrões do equipamento. É
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
108
recomendado fazer o Match sempre ou atendendo algumas daquelas
condições.
Após os ajustes feitos, pressione START e o equipamento fará
automaticamente a curva de resposta ao CO2. Se você desejar ver o gráfico da
curva sendo feito, selecione na linha 1 a opção VIEW FILE (f2), Import GrafDef
(f1), A Ci Curve. Pressione SELECT. É necessário sair do gráfico (escape) para
que a curva siga adiante. A cada novo ponto registrado, vá em VIEW FILE (f2)
e pressione REPLOT GRAPH (f2) para vê-lo novamente. Retorne ao menu de
medidas.
Na linha k é possível acompanhar nas opções Program e ProgPrgs a
contagem de tempo para cada etapa e o progresso da curva com o os pontos
já feitos, respectivamente. Após o término da curva, feche o arquivo: linha 1,
Close File (f3).
O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise
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