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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA
NÚCLEO DE BIOLOGIA
EFEITOS DA PINEALECTOMIA SOBRE O TIMO DE RATOS
Aluna: Maria Daniele da Silva Campos Orientadora: Profa. Dra. Katharine Raquel Pereira dos Santos
VITÓRIA DE SANTO ANTÃO/2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO ACADÊMICO DE VITÓRIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
EFEITOS DA PINEALECTOMIA SOBRE O TIMO DE
RATOS
Trabalho apresentado ao Curso de
Graduação em Ciências Biológicas do
Centro Acadêmico de Vitória (CAV/UFPE)
como requisito para aprovação da Disciplina
Eletiva Trabalho de Conclusão de Curso
Autora: Maria Daniele da Silva Campos
Orientadora: Profª. Dra. Katharine Raquel Pereira dos Santos
VITÓRIA DE SANTO ANTÃO/ 2011
EFEITOS DA PINEALECTOMIA SOBRE O TIMO DE RATOS
Maria Daniele da Silva Campos
ORIENTADOR:
_____________________________________
Profª. Dra. Katharine Raquel Pereira dos Santos
(Núcleo de Biologia – CAV/UFPE)
EXAMINADORES:
_____________________________________
Prof. Dr. Francisco Carlos Amanajás de Aguiar Júnior
(Núcleo de Biologia – CAV/UFPE)
_____________________________________
Prof. Dra. Glaucia Maria Lopes Reis
(Núcleo de Nutrição - CAV/UFPE)
_____________________________________
Prof. Dra. Cristina de Oliveira Silva
(Núcleo de Nutrição – CAV/UFPE)
Vitória de Santo Antão,______ de ________________ de 2011.
Dedico este trabalho a Deus,
familiares e Professores, por todo
amor e carinho que foi concedido, ao
longo desta trajetória de conquista e
oportunidades vivenciadas.
AGRADECIMENTOS
A Deus por todas as coisas maravilhosas que me foram concedidas ao
longo desta trajetória que passei e das conquistas que obtive.
A minha mãe Josefa Maria da Silva, que em todos os momentos esteve
presente ao meu lado com muito zelo e carinho.
A minha orientadora Katharine Raquel pela atenção, paciência e horas
de dedicação.
A todos os professores por transmitir seus conhecimentos, suas
experiências, e apoiar-nos em nossas dificuldades.
Aos meus amigos pelo companheirismo que tivemos as dificuldades que
superamos e pelas conquistas que teremos.
Ao técnico André Pukey por sua ajuda e apoio dedicado em momentos
de dificuldades.
A todos que contribuíram de forma direta e indiretamente, e estiveram ao
meu lado em todos momentos.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fotomicrografia do lobo (L) do timo de rata pinealectomizada com 45 dias. Zonas medular e cortical não diferenciadas. Coloração
H.E. 100x.
17
Figura 2: Fotomicrografia de timo de ratas pinealectomizada com 45
dias. Evidenciando vasos sanguíneos (V), Coloração H.E. ± 400x.
17
Figura 3: Fotomicrografia de timo de rata sham-pinealectomizada com
45 dias. Em cada lobo (L) as zonas: cortical (C) e medular (M)
diferenciadas. Coloração H.E. 100x.
18
Figura 4: Fotomicrografia de timo de ratas sham-pinealectomizada 45 dias. Evidenciando vasos sanguíneos (setas) e regiões cortical(C) e medular (M) diferenciadas. Coloração H.E. ± 400x.
18
Figura 5: Fotomicrografia de timo de ratas pinealectomizada com 45
dias. Mostrando atividade dos macrófagos contendo ferritina (Setas)
na região cortical do lóbulo tímico. Coloração Pearls ± 100x
19
Figura 6: Fotomicrografia do timo de ratas sham-pinealectomizada
com 45 dias. Mostrando atividade dos macrófagos contendo ferritina
entre as regiões cortical (C) e medular (M). Coloração Pearls ± 100x.
19
Figura 7: Fotomicrografia da região interlobular do timode rato
pinealectomizado com 45 dias. Observar grande quantidade de tecido
adiposo (TA) na região interlobula. Coloração H.E. ± 100x.
20
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Médias dos pesos do timo por grupo analisado. Média,
Desvio padrão (DP) e número de casos válidos (N) com os níveis de significância do teste t para os pesos.
16
TABELA 2: Comparação das características microanatômicas entre os
grupos analisados. GI e GIII (Grupoo pinealectomizados); GII e GIV (Grupos Sham-pinealectomizados).
20
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA
iv
AGRADECIMENTOS v LISTA DE FIGURAS
vi
LISTA DE TABELAS
vii
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
6
MANUSCRITO
Resumo
12
Abstract
12
Introdução
13
Metodologia
14
Resultados
16
Discussão
21
Conclusões
22
Agradecimentos
22
Referências
23
ANEXO
Normas para submissão de trabalhos na revista Ciência Animal
Brasileira
27
1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A glândula pineal está localizada na extremidade posterior do terceiro
ventrículo, no teto do diencéfalo, com o qual está conectada por um curto
pedúnculo (Reiter, 1989; Latarjet, 2005). Esta glândula secreta principalmente a
melatonina, um hormônio não esteróide (indolamina) que dentre outras
funções, está relacionado na regulação do sistema neuroendócrino (Aires,
1999; Dangelo, 2007; Ferreira, 2010).
A síntese de melatonina (N-acetil-5-Metoxitriptamina) é realizada
principalmente na pineal e está sob controle do núcleo supraquiasmático e o
qual tem sua atividade rítmica endógena controlada pela luz ambiental. A sua
síntese se inicia com a captação do aminoácido triptofano, mecanismo que não
está totalmente elucidado (Suden, 1989 ; Moore, 2008), podendo ser de forma
ativa sob controle adrenérgico (Alonso-Solis, 1992). Nos pinealócitos, o
triptofano é transformado em 5-Hidroxitriptofano que por sua vez é convertido
por uma descarboxilase em 5-Hidroxtriptamina (serotonina). A norepinefrina
interage com os receptores a e ß-adrenérgicos, induzindo a conversão de ATP
em cAMP que causa ativação de N-Acetiltransferase (NAT), enzima esta que
atua na serotonina transformando-a em N-Acetilserotonina, e finalmente esta é
convertida em melatonina por ação da hidroxi-indol-O-metil transferase
(HIOMT) (Öcal-Irez et al., 1989; Reiter, 1991; Neto & Scaldaferri, 2005;
Ximenes, 2008).
A melatonina desempenha vários efeitos endócrinos no organismo,
como a atividade antitumoral, possui importante ação antigonadotrófica, visto
que inibe a produção de hormônio liberador das gonadotrofinas (GnRH), que é
essencial para o desenvolvimento das gônadas na fase da puberdade.
Antioxidante podendo reduzir a quantidade de radicais livres no organismo e
antidepressiva. Atua ainda como fator de indução do sono, alteração da
atividade elétrica na epilepsia, no metabolismo de carboidratos, no controle do
fenômeno de jet lag, no humor, no desempenho e como modulador de
respostas inflamatórias e imunológicas (Csaba et al.,1966; Rudeen et al., 1980;
Bartsch & Bartsch, 1981; Reiter, 1989; Wilkinson, 1991; Vanecek, 1998 ; Cos &
2
Sánchez-Barceló, 2000 ; Seraphim et al., 2000 ; Lima et al., 2001 ; Adrián et al.,
2002 ; Markus et al., 2003 ; Neto & Scaldaferri, 2005 ; Gracía-Santos et al.,
2006 ; Konturek et al., 2007 ; Otálora et al., 2007 ; Martín-Renedo et al., 2008 ;
Pizarro et al., 2008 ; Tam et al., 2008 ; Wu et al., 2008).
Há múltiplos mecanismos de ação possíveis da melatonina, uma vez
que os sítios de ligação para este hormônio estão presentes em diversas
regiões do sistema nervoso central, em artérias cerebrais, em diversos tecidos
periféricos, nas adrenais, em órgãos linfóides primários e secundários, no
coração, nas glândulas mamárias, entre outros. Existem dois tipos de
receptores de membrana bem conhecidos: o ML1 com alta afinidade para
melatonina e o ML2 com baixa afinidade para este hormônio, entretanto, possui
alta afinidade com a serotonina (Dubocovich, 1999).
A glândula pineal tem conexões anatômicas e funcionais especialmente
com o sistema imunológico e, portanto, é hoje reconhecida como um
importante órgão imunoneuroendócrino no homem e nos animais. Uma série
de estudos experimentais tem relatado a melatonina influencia as funções
imunológicas devido a sua capacidade anfipática, pois pode atravessar a
membrana celular e ligar-se diretamente aos receptores ligados a órgãos
linfóides primários e secundários. Há relatos que este hormônio também tem
uma relação estimulante nos linfócitos T e macrófagos, e a sua ausência causa
atrofia no timo e no baço. Sendo observado ainda que a falta de melatonina no
organismo causa uma diminuição na produção de interleucina-2 e na atividade
das células natural killer (Oner, 2004; Gustavs, 2001; Ferreira, 2010).
Segundo Beskonakli (2001) existe uma relação entre o sistema
imunológico e o sistema nervoso central (SNC) particularmente, entre a
glândula pineal e o hipotálamo, os quais liberam neurotransmissores que
participam da modulação dos processos imunes com envolvimento do zinco, e
que a pinealectomia diminui os níveis plasmáticos de zinco. É conhecido ainda
que o principal alvo da melatonina é o timo, uma vez que, tanto a glândula
pineal como o timo são inervados pelo gânglio cervical superior. A deficiência
de zinco está associada à atrofia tímica, reduzindo a resposta imune a
antígenos T-dependente o que altera a imunidade celular, consequentemente,
3
compromete a modulação das respostas imunológicas.
Há relatos contraditórios da pinealectomia em relação ao timo, visto que
de acordo com Vollrath (1981) o referido órgão, responde à pinealectomia com
aumento do peso e diminuição do número de mastócitos, enquanto Öner et al.
(2004) observou o inverso.
O timo situa-se imediatamente atrás da extremidade superior do
esterno, próximo do coração e de grandes vasos. Possui dois lobos envolvidos
por uma cápsula delgada composta por tecido conjuntivo denso não modelado,
a qual penetra no órgão através de septos de tecido conjuntivo trabecular,
dividindo o órgão em lóbulos. O estroma de cada lóbulo tímico é formado por
uma rede de células epiteliais com grande atividade mitóticas para renovação
dos tecidos, por macrófagos, células dendríticas, e pelos timócitos. Os
macrófagos são células pertencentes ao sistema mononuclear fagocitário e são
subdivididos em dois grupos de células, fagócitos e células apresentadoras de
antígeno. As células dendríticas apresentam como sua principal função
capturar e transportar os antígenos. Os timócitos são uma designação geral
das células em diferentes estágios de diferenciação que vão dar origem aos
linfócitos T maduros. (Lima, 2001; Lima, 2007; Junqueira & Carneiro 2004 ;
Gartner & Hiatt, 2007).
A porção periférica de cada lóbulo é denominada de córtex e está
constituída por tecido linfóide denso contendo a maioria dos timócitos
relativamente imaturos em proliferação, enquanto a porção central ou medular
é formada por tecido linfóide frouxo e contém as células T maduras. A
maturação dos timócitos avança simultaneamente com a migração destas
células do córtex para a medula tímica (Junqueira & Carneiro 2004; Ross,
2008).
Este órgão se forma a partir de células epiteliais derivadas do
endoderma do terceiro par de bolsas faríngeas e do mesênquima embrionário.
O seu primórdio é circundado por uma camada fina de mesênquima, este
tecido deriva de células da crista neural juntamente com as células epiteliais do
timo, este tecido mesênquimal é essencial para o seu desenvolvimento.
4
(Moore, 2000; Aires, 1999).
Durante a ontogenia ocorrem modificações seqüenciais intensas das
moléculas expressas na superfície dos timócitos. Estas alterações fenotípicas
caracterizam os diferentes estágios de diferenciação da célula e permite o
estudo do desenvolvimento de linfócitos T. As células T são responsáveis pelo
reconhecimento imune-específico dos patógenos e pelo desencadeamento das
respostas imunes adaptativas. Estas células são derivadas de células-tronco da
medula óssea, entretanto, os linfócitos T sofrem um processo de maturação no
timo. A maturação e a diferenciação das células-troncos em células T
imunocompetentes denomina-se instrução das células tímicas, esse processo
se caracteriza pela expressão e deleção de antígenos de superfície CD
específicos. Em seguida as células T passam por estágios de seleção positiva
no córtex e se sobreviverem passam pelo outro estágio de seleção negativa na
medula. (Junqueira & Carneiro, 2004; Almeida, 2006; Sanches, 2006; Lima,
2007 ; Gartner & Hiatt, 2007).
Quando chegam ao timo, determinados linfócitos já estão
comprometidos com a diferenciação para linhagem T, posto que expressam,
nesse estágio, o antígeno CD7 na membrana e o antígeno CD3 no citoplasma.
Essas células progenitoras no timo, podem transformar-se em células
dendríticas intratímicas, assim como em timócitos. As interações com o
estroma tímico levam à expressão dos marcadores específicos da linhagem T.
Esses linfócitos T maduros serão transformados na grande maioria em células
auxiliadoras de memória, que ao deixarem o timo, entram na circulação e
migram para os órgãos linfóides periféricos. (Junqueira & Carneiro, 2004;
Almeida, 2006; Sanches, 2006; Lima, 2007; Gartner & Hiatt, 2007).
Ao nascimento, o timo pesa poucas gramas, na adolescência é bem
desenvolvido, mas no adulto é reduzido a uma massa fibro-adiposa, de tecido
conjuntivo amplamente infiltrado por tecido adiposo (Dangelo, 2007). Apesar de
no adulto ele diminuir, ainda continua sendo funcional e importante para
manutenção da saúde, além de secretar hormônios tímicos, como
timopoeintina e a timosina, que regulam a maturação dos linfócitos T (Guyton,
2002 ; Dangelo 2007; Moore, 2008 ).
5
Foram realizados vários estudos com a pinealectomia e seus efeitos no
organismo. Um desses efeitos foi à influência da ausência da melatonina no
sistema imunológico, como exemplo o timo que é um dos órgãos central imune
celular (Beskonakli, 2001; Öner et al., 2004)
A pinealectomia elimina níveis detectáveis de melatonina, quebrando
seu ritmo diário de secreção, afetando consequentemente o sistema
imunológico, uma vez causa uma involução do timo, perda de elementos
linfóides do córtex tímico, e ocorre uma não diferenciação no limite córtico-
medular. (Öner, 2004 ; Naranjo, 2007). Naranjo (2007) demonstrou que a
pinealectomia traz como consequência um aumento no número de macrófagos,
e a presença da melatonina traz um aumento relativo no peso do timo e da
atividade mitótica dos linfócitos e células epiteliais.
Em estudos realizados por Rai (2003) com esquilos adultos do sexo
masculino, foi constatado que nos animais pinealectomizados, houve uma
diminuição significativa na quantidade de células timocíticas do timo. Já para o
grupo tratado com melatonina exógena, foi obtido resposta inversa com o
aumento de células tímicas, assim como, nos níveis de linfócitos da circulação
do sangue periférico e na medula óssea, melhorando assim o estado
imunológico.
Diante do exposto acima, o referido estudo tem por objetivo descrever os
efeitos da pinealectomia sobre o timo de ratos adultos, visando fornecer
subsídios para entender a relação entre a melatonina e o sistema imunológico.
6
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11
MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À REVISTA CIÊNCIA ANIMAL
BRASILEIRA
12
EFEITOS DA PINEALECTOMIA SOBRE O TIMO DE RATOS
Maria Daniele da Silva Campos¹; Katharine Raquel Pereira dos Santos²
¹Graduandas do Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas – CAV/ Vitória de Santo Antão – UFPE;
[email protected],;² Docente do Núcleo de Ciências Biológicas – CAV/ Vitória de Santo Antão –
UFPE; E-mail: [email protected]
Resumo: A glândula pineal esta localizada no teto do diencéfalo, e participa do sistema
neuroendócrino, sintetizando um hormônio dependente de fotoperíodo chamado
melatonina, este hormônio desempenha vários efeitos endócrinos no organismo,
funcionando como modulador de respostas imunológicas. Estudos relatam que a
pinealectomia causa fortes alterações morfofisiológicas e histológicas do timo. Desta
forma, o presente estudo busca uma descrição histológica do timo em ratos machos e
fêmeas pinealectomizados, visando fornecer subsídios para entender a relação entre a
melatonina e o sistema imunológico. Portanto, foram utilizadas ratos machos e fêmeas
com 45 dias de idade. Os animais foram divididos em quatro grupos: machos e fêmeas
pinealectomizados e sham-pinealectomizados. Ao final do período de sete meses, os
animais foram anestesiados, eutanasiados e necropciados para remoção do timo. Os
timos coletados, pesados, fixados em NBF a 10% e processados seguindo a técnica
histológica de rotina. Os cortes obtidos foram corados por H.E. e analisados em
microscopia de luz. Os resultados revelaram que o timo das ratas pinelactomizadas,
apresentaram-se com uma desorganização estrutural não ocorrendo uma distinção
macroscópica das zonas, teve um aumento do número e tamanho de vasos sanguíneos, e
aumento no número de macrófagos.
Palavras – chave: Pineal; sistema imune; morfologia.
Abstrac: The pineal gland is located on the roof of the diencephalon, and participates in
the neuroendocrine system, synthesizing a hormone called melatonin photoperiod-
dependent, this hormone plays several endocrine effects in the body, functioning as a
modulator of immune responses. Studies have reported that pinealectomy causes severe
morpho-physiological and histological changes of the thymus. Thus, this study seeks a
histological description of the thymus in pinealectomized male and female rats, to
provide data to understand the relationship between melatonin and
imunológico.Portanto system, we used male and female rats 45 days old. The animals
were divided into four groups: male and female sham-pinealectomized and
pinealectomized. At the end of the period of seven months, the animals were
anesthetized and euthanized necropciados for removal of the thymus. The loans
collected, weighed, fixed in 10% NBF and processed following the routine histological
technique. The sections obtained were stained with hematoxylin and eosin and
examined under light microscopy. The results revealed that the thymus of rats
pinelactomizadas, presented with a structural disorganization occurring not distinguish
macroscopic areas, had an increase in the number and size of blood vessels and
increased numbers of macrophages.
Keywords: Pineal; immune system; morphology.
13
INTRODUÇÃO
A glândula pineal participa do sistema neuroendócrino, secretando a melatonina,
hormônio que dentre outras funções, está relacionado com a regulação de um biorritmo
(Bartsch, 1981; Dubocovich , 1999; Adrián, 2002; Maksimovich, 2002; Gayton, 2002;
Markus, 2003; Junqueira & Carneiro, 2004).
A síntese de melatonina é dependente do fotoperíodo, e presumivelmente é mais
alta à noite do que durante o dia. Em todos os vertebrados, e possivelmente em muitos
invertebrados um rítmo circadiano de produção de melatonina em níveis mais altos é
sempre associado com a noite. Ocorrem múltiplos mecanismos de ação possível da
melatonina, pois tem receptores específicos como ML1 e ML2 espalhado pelo sistema
nervoso central, órgãos linfóides primários e secundários, entre outros órgãos(
Dubocovich , 1999 ; Öner, 2004 ).
Atualmente, sabe-se que a glândula pineal tem conexões funcionais com o
sistema imunológico principalmente com o timo uma vez que ambos são inervados pelo
gânglio cervical superior. E que a melatonina funciona como um modulador do sistema
imune, portanto, a pineal é hoje reconhecida como um importante órgão
imunoneuroendócrino no homem e nos animais. Sabe-se que a pinealectomia, elimina
níveis detectáveis de melatonina, quebrando seu ritmo diário de secreção, afetando
consequentemente o sistema imunológico, diminuindo a resposta primária de produção
de anticorpos e aumentando a resposta secundária causando também alterações na
histologia e morfologia do timo (Csaba et al., 1966; Vollrath, 1981; Beskonakli, 2001;
Öner et al., 2004; Ferreira, 2010).
Muitos estudos realizados comprovam que a melatonina está diretamente
relacionada com o timo. Estudos realizados por Rai (2003) e Öner et al. (2004),
observaram que a pinealectomia causa a desorganização na estrutura do timo, não sendo
diferenciadas as regiões cortical e medular. Öner et al. (2004) demonstrou ainda que a
pinealectomia acelera o processo de involução do timo.
Há ainda relatos de que a pinealectomia diminui significantemente o número de
elementos linfóides do timo, aumento no número de macrófagos fagocitários, dilatação
dos vasos sanguíneos, acúmulo de colóide nos lóbulos do timo e diminuição
significativa da quantidade de timócitos no órgão. Enquanto a administração de
melatonina em condições normais aumenta o peso relativo do timo de ratos e das
glândulas supra-renais. O peso relativo do baço também tendeu a aumentar após o
14
tratamento com melatonina (Öner, 2004; Pertsov, 2006; Naranjo, 2007). Para o timo, os
estudos são contraditórios, visto que Vollrath (1981) encontrou resultados contrários.
Diante do exposto, o referido estudo tem por objetivo descrever os efeitos da
pinealectomia sobre o timo de ratos adultos, visando fornecer subsídios para entender a
relação entre a melatonina e o sistema imunológico.
MATERIAIS E MÉTODOS
1. MATERIAIS
Para o estudo foram utilizados 20 animais (Rattus norvegicus albinus), sendo 10
machos e 10 fêmeas. Os animais foram mantidos em gaiolas com alimentação e água
ad. libitum, à temperatura 22 ºC e ciclo claro/escuro 12/12h, sendo divididos em quatro
grupos com 5 animais cada:
Grupo I: ratas pinealectomizados com 45 dias de idade;
Grupo II: ratas sham-pinealectomizados com 45 dias de idade;
Grupo III: ratos pinealectomizados com 45 dias de idade;
Grupo IV: ratos sham-pinealectomizados com 45 dias de idade;
2. MÉTODOS
2.1. PINEALECTOMIA
Para realização do procedimento cirúrgico foi inicialmente administrada
medicação antibiótica (Ampicilina sódica) 20mg/kg por via intraperitoneal 10 minutos
antes da cirurgia. A pinealectomia seguiu a técnica descrita por (Kuszak e Rodin, 1977)
e adaptada por Santos et al., (2003), e foi realizada com os animais pertencentes ao
grupo I previamente anestesiados, utilizando inicialmente 0,1 ml de xilazina (20mg/ml)
e quetamina (50 mg/ml) por 100 gramas de peso, por via intraperitoneal. Após
tricotomia e assepsia da área dorsal da cabeça, foi realizada abertura da pele e do tecido
subcutâneo até a exposição da calota craniana, onde o periósteo foi afastado com o
auxílio do bisturi. Com um micromotor de baixa rotação e uma broca de dentista no 05,
foi retirado um fragmento circular da calota de aproximadamente 4 mm de diâmetro,
tendo como ponto central de referência o lambda, e colocado em solução fisiológica a
15
0,9%. Em seguida, foi feita a ligadura do seio venoso e com o auxílio de pinças
adequadas, a glândula pineal foi removida sob microscópio estereoscópico.
Posteriormente, o encéfalo foi recoberto com o fragmento ósseo e suturados os planos
cirúrgicos. No período pós-operatório os animais foram colocados em gaiolas isoladas
para a recuperação anestésica e admistrado ácido acetil salicílico (AAS) 120 mg/Kg por
via oral a cada 4 horas por um período de 24 horas.
Após o período pós-operatório, os animais foram acomodados em gaiolas e
separados nas condições fotoperiódicas acima estabelecidas, onde permaneceram por
um período de 7 (sete) meses.
2.2. SHAM-PINEALECTOMIA
Os animais sham-pinealectomizados passaram pelos mesmos procedimentos
cirúrgicos descritos acima, porém os mesmos não sofreram a remoção da glândula
pineal.
2.3. EXAME MACROSCÓPICO
Ao final do período de sete meses, os animais foram anestesiados, em seguida
eutanasiados com Pentobarbital sódico (30mg/ml) na dosagem 50mg/Kg intraperitonial
e então necropsiadas. Para tanto, foi realizada uma toracotomia simples mediana por
incisão vertical para a coleta do timo, o qual foi pesado e evidenciado se havia variações
na coloração e tamanho entre os grupos analisados.
2.4. EXAME MICROSCÓPICO
Após análise anatômica, o material coletado foi clivado e fixado em NBF
(formalina a 10% neutra tamponada) e conservado no álcool a 70% e glicerinado a 5%.
Posteriormente foi processado no Laboratório de Biotecnologia e Fármacos –
CAV/UFPE, seguindo a técnica histológica de rotina descrita por (Behmer et al.,1976 ;
Rieder & Schmidt, 1987), sendo desidratados em soluções crescentes de álcool etílico
(70%, 80%, 90% e dois banhos a 100%), diafanizados em dois banhos de xilol,
impregnados e incluídos em parafina. Os blocos obtidos foram cortados com 5 µm de
espessura e em seguida corados por hematoxilina e eosina para caracterização geral da
microanatomia do timo. Foram realizada ainda a coloração de Perls para visualizar a
atividade no metabolismo do ferro celular pelos macrófagos. As lâminas obtidas foram
analisadas através da microscopia de luz.
16
2.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os pesos dos timos foram analisados estatisticamente através do software biostat
5.0. As médias foram comparadas entre os diversos grupos através do teste t de student.
A diferença entre os dados foram consideradas significativas quando p < 0,05.
RESUTADOS
A análise macroscópica revelou que o timo apresentava coloração mais
acentuarda nos grupos sham-pinealectomizados. Visualmente, não foram evidenciadas
diferenças no tamanho dos timos dos animais entre os grupos considerados. No entanto,
os resultados mostraram que os grupos pinealectomizados apresentaram uma menor
média dos pesos do timo quando comparado com os grupos sham-pinealectomizados
(Tabela 1), sendo estas variações estatisticamente significantivas, quando realizado teste
t comparando os grupos machos e fêmeas juntos com p < 0,02 .
Tabela 1: Médias dos pesos do timo por grupo analisado. Média, Desvio
padrão (DP) e número de casos válidos (N).
GRUPOS MÉDIA DOS PESOS + DP N
GI 0,16538 + 0,0438613 5
GII 0,18566 + 0,015276 5
GIII 0,17182 + 0,014264 5
GIV 0,20842 + 0,0306963 5
Os resultados obtidos com a análise histológica revelaram que o timo dos grupos
considerados apresentou-se revestido por uma cápsula de tecido conjuntivo, o qual
envia septos que dividem o órgão em lóbulos. No entanto, a organização lobular e a
quantidade do infiltrado de tecido adiposo interlobular diferiram entre os grupos (Tabela
2). Os grupos I e III não exibiram diferenciação entre as zonas cortical e medular (Fig.
1), entretanto, foi evidenciada uma maior densidade e dilatação dos vasos sanguíneos
lobulares (Fig. 2) quando comparado com os grupos II e IV (Figs. 3 e 4).
17
Figura 1: Fotomicrografia do lobo (L) do timo de rata
pinealectomizada com 45 dias. Zonas medular e cortical não
diferenciadas. Coloração H.E. 100x
Figura 2: Fotomicrografia de timo de ratas pinealectomizada com 45
dias. Evidenciando vasos sanguíneos (V), Coloração H.E. ± 400x.
18
Figura 3: Fotomicrografia de timo de rata sham-pinealectomizada
com 45 dias. Em cada lobo (L) as zonas: cortical (C) e medular (M)
diferenciadas. Coloração H.E. 100x.
Figura 4: Fotomicrografia de timo de ratas sham-pinealectomizada 45
dias. Evidenciando vasos sanguíneos (setas) e regiões cortical(C) e
medular (M) diferenciadas. Coloração H.E. ± 400x.
19
Foi observado ainda um maior número de macrófagos contendo ferro celular
concentrados na região cortical do timo dos grupos I e III (Fig. 5), enquanto nos grupos
II e IV, estas células ocuparam principalmente a região cortico/medular (Fig. 6)
Figura 5: Fotomicrografia de timo de ratas pinealectomizada com 45
dias. Mostrando atividade dos macrófagos contendo ferritina (Setas)
na região cortical do lóbulo tímico. Coloração Pearls ± 100x.
Figura 6: Fotomicrografia do timo de ratas sham-pinealectomizada
com 45 dias. Mostrando atividade dos macrófagos contendo ferritina
entre as regiões cortical (C) e medular (M). Coloração Pearls ± 100x.
20
O tecido adiposo interlobular foi mais abundante nos animais pinealectomizados
(Fig. 7).
Figura 7: Fotomicrografia da região interlobular do timode rato
pinealectomizado com 45 dias. Observar grande quantidade de tecido
adiposo (TA) na região interlobula. Coloração H.E. ± 100x.
Não foram observadas variações microanatômicas entre machos e fêmeas do
mesmo grupo. A tabela 2 mostra um resumo das diferenças microanatômicas observadas
entre os grupos pinealectomizados e sham-pinealectomizados.
TABELA 2: Comparação das características microanatômicas entre os grupos analisados. GI e GIII
(Grupos pinealectomizados); GII e GIV (Grupos Sham-pinealectomizados).
CARACTERÍSTICAS GI e GII GII e GIV
Região córtico/medular Não diferenciada Diferenciada
Densidade de vasos
sanguíneos
Maior Menor
Diâmetro dos vasos
sanguíneo
Maior Menor
Corpúsculo de Hassal Pouco Pouco
Macrófagos Região cortical Região cortiço/medular
21
DISCUSSÃO
Os estudos recentes indicam que a melatonina desempenha vários efeitos no
organismo e que a pinealectomia elimina quase que totalmente os níveis circulantes
deste hormônio, acarretando alterações importantes no sistema imunológico. Visto que o
mesmo age nos receptores de membrana e que seus sítios de ligação são encontrados em
órgãos linfóides primários e secundários, assim, possuindo um papel importante na
regulação da função imunitária (Dubocovich et al., 1999; Beskonakli, 2001; Öner,
2004).
Alguns anos após a puberdade, o timo começa a involuir e torna-se infiltrado por
células adiposas, sendo este um processo fisiológico normal da glândula. Estas
alterações afetam diretamente a produção de células T e, conseqüentemente, a
capacidade de desenvolvimento de uma resposta imune eficiente (Lima, 2007).
As alterações observadas no timo dos animais pinealectomizados como a
diminuição do peso e o aumento do infiltrado de tecido adiposo interlobular,
corroboram os estudos realizados por Csaba (1966), Öner (2004) e Naranjo (2007), os
quais demonstraram que a pinealectomia acelera o processo de atrofia tímica, reduzindo
consequentemente o peso do mesmo, enquanto o tratamento com melatonina estimula a
sua hiperplasia. Do ponto de vista funcional, este hormônio tem um papel importante na
regulação da função imunitária, visto que o timo atrofiado diminuirá o processo de
formação e maturação das células.
Os linfócitos T são responsáveis pelo reconhecimento imune-específico dos
patógenos e pelo desencadeamento das respostas imunes adaptativas (Lima, 2007). A
organização estrutural do lóbulo tímico é importante no processo de maturação dos
linfócitos, uma vez que os linfócitos passam por uma seleção positiva no córtex em que
se reconhecem as moléculas do MHC da própria pessoa, além de antígenos próprios
como estranhos. Posteriormente a esta etapa, os linfócitos sobreviventes que passaram
pelo teste de seleção positiva saem do córtex e seguem em direção a medula, no qual
passam por outro processo de seleção em que se reconhecem outros antígenos próprios,
consistindo na seleção negativa (Ross, 2008). Desta forma a desestruturação básica do
lóbulo tímico observada nos grupos pinealectomizados, pode comprometer o processo
de instrução dos linfócitos T.
Observou nesse estudo que ocorreu um aumento no número de macrófagos
fagocitando o ferro nas regiões cortical dos grupos pinealectomizados em relação ao
22
grupo controle que apresentou macrófagos fagocitando o ferro em menor quantidade,
principalmente na região cortico/medular. Estes resultados ainda devem ser melhor
investigados para interpretações mais concretas.
A gliproteína (VEGF) consiste no fator de crescimento endotelial, sendo um
potente e seletivo fator mitogênico para o endotélio. De acordo com Fuchs (2010) a
pinealectomia eleva os níveis de VEGF e consequentemente, aumenta a atividade celular
do endotélio, além de promover a dilatação dos mesmos. No presente estudo foi
observado uma maior vascularização dos lóbulos tímicos dos grupos pinealectomizados.
Resultados semelhantes já foram observados uma variedade tecidos e órgãos de animais
pinealectomizados, no entanto, no timo este fato ainda não tinha sido relatado.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos através deste estudo confirmam que a diminuição dos
níveis de melatonina, através da pinealectomia provoca alterações na estrutura
histológica do timo, acelera o processo de involução, causa desestruturação das camadas
cortical e medular do órgão, diminuição nos níveis de linfócitos, aumento no número de
células fagocitárias e dilatação dos vasos sanguíneos e estas modificações influenciará
na fisiologia do timo consiste em um dos órgãos centrais do sistema imune.
AGRADECIMENTOS
Dedico este trabalho:
A professora orientadora Katharine Raquel Pereira dos Santos, por todo apoio,
dedicação e paciência prestada.
Ao professor colaborador Francisco Amanajás, por toda ajuda dedicada.
Ao técnico André Pukei pela colaboração durante o processo.
A Universidade Federal de Pernambuco- CAV pela oportunidade do desenvolvimento
do trabalho.
23
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VOLLRATH L. Handbuch der mikroskopischen anatomie des menschen. New York:
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26
ANEXO
27
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e Abstract (em inglês), com um máximo de 200 palavras); 5- Palavras-chave (máximo
de cinco, apresentadas na língua do texto e em inglês - Keywords); 6-Introdução; 7-
Material e Métodos; 8- Resultados e Discussão (separados se necessário);9-
Conclusões; 10- Agradecimentos (se necessário) e 11- Referências, em ordem
alfabética pelo sobrenome do primeiro autor, seguindo a NBR 6023, da ABNT.
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