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Profesor Patrocinante Dr. Felipe Barros O. Centro de Estudios Científicos Profesor Co-Patrocinante Dr. Alejandro Reyes Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias
EFECTO MODULADOR DEL LACTATO EXTRACELULAR SOBRE LA GLICÓLISIS DE ASTROCITOS EN REPOSO Y
ESTIMULADOS POR POTASIO
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
TAMARA FABIOLA SOTELO HITSCHFELD
VALDIVIA – CHILE 2009
Dedicado a mis queridos papás Cristián y Fabiola
y mis opapas Albino y Edigna
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Página
1. RESUMEN 1
1.1 SUMMARY 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.1. Producción de lactato a partir de una molécula de glucosa 4
2.2. El transporte de lactato en células cerebrales 6
2.3. El lactato en el intersticio cerebral 7
2.4. Efectos de potasio sobre el metabolismo astrocítico 8
3. MATERIALES Y MÉTODOS 11
3.1. Materiales 11
3.1.1. Animales 11
3.1.2. Reactivos 11
3.2. Métodos 11
3.2.1. Cultivo mixto primario de corteza de ratón 11
3.2.2. Microscopia de epifluorescencia 12
3.2.3. Nanosensor FLII12Pglu600µΔ6 13
3.2.3.1. Infección viral del nanosensor FLII12Pglu600µΔ6 en astrocitos 18
3.2.3.2. Calibración del nanosensor FLII12Pglu600µΔ6 en astrocitos 18
3.2.4. Sonda fluorescente BCECF 20
ii
3.2.5. Condiciones experimentales 20
3.2.6. Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) 21
3.2.7. Análisis estadístico 23
4. RESULTADOS 24
4.1. Caracterización del transportador de monocarboxilato 1 24
4.2. Efectos agudos del lactato sobre el metabolismo basal de glucosa 27
4.2.1. Efectos del lactato sobre la concentración basal de glucosa en el
estado estacionario
27
4.2.2. Efectos del lactato sobre la tasa glicolítica basal 29
4.3. Efectos del lactato sobre el metabolismo de glucosa activado por un
aumento del potasio extracelular
31
4.3.1. Modulación por lactato del efecto del potasio sobre el nivel de la
glucosa en el estado estacionario
31
4.3.2. Efecto agudo del lactato sobre la tasa glicolítica estimulada por
potasio
33
4.4. Mecanismos de la modulación glicolítica por lactato 39
4.4.1. Mecanismo 1: acidificación 39
Mecanismos 2 y 3: deprivación de NAD+ y acumulación de piruvato 4.4.2. 41
44
5. DISCUSIÓN
5.1. Transporte de lactato en astrocitos 44
iii
5.2. Modulación de la glicólisis por lactato en astrocitos en reposo y 46
activados por potasio
6.3. Mecanismos implicados en la modulación de la glucosa por lactato
extracelular
49
6. BIBLIOGRAFIA 52
7. ANEXO 65
7.1. Calibración del sensor de hexosas por trans-aceleración 65
7. 2. Efecto del lactato y el piruvato en el sensor de hexosas
FLII12Pglu600µΔ6
67
7.3. Medición de lactato liberado desde astrocitos 67
7.3.1. Sensibilidad del HPLC por lactato 71
iv
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Regulación de la glicólisis por las enzimas glicolíticas y razón
NAD+/NADH.
5
Figura 2. Esquema microscopio de epifluorescencia. 14
Figura 3. Esquema del nanosensor de hexosas FLII12Pglu600µΔ6. 16
Figura 4. Efecto del pH y presencia de azúcar en las señales de CFP, citrine
FRET y citrine directa.
17
Figura 5. Calibración del sensor de hexosas FLII12Pglu600µΔ6 en
astrocitos.
19
Figura 6. Esquema HPLC HitaCHI LaChrom Elite. 22
Figura 7. Evaluación del transporte de lactato en astrocitos. 26
Figura 8. Impacto del lactato extracelular sobre la concentración de glucosa
intracelular en astrocitos.
28
Figura 9. La tasa glicolítica es sensible al lactato extracelular. 30
Figura 10. Efecto de lactato sobre la activación glicolítica mediada por
potasio en estado estacionario.
32
Figura 11. Efecto de lactato sobre la sensibilidad glicolítica ejercida por
potasio 6 mM.
34
Figura 12. Sensibilización glicolítica tardía en astrocitos expuestos potasio 6
mM en ausencia de lactato.
36
Figura 13. Efecto de lactato sobre el metabolismo de la glucosa activada por 37
v
potasio 15 mM.
Figura 14. Sensibilización glicolítica tardía en astrocitos expuestos potasio 15
mM y lactato 5 mM.
38
Figura 15. Efecto del lactato sobre el pH intracelular en distintas condiciones
tampones.
40
Figura 16. Durante activación por potasio el pH intracelular no es afectado
por lactato extracelular.
42
Figura 17. El piruvato imita el efecto inhibitorio del lactato. 43
Figura 18. Modelo del efecto de lactato sobre la glicólisis de astrocitos en
reposo y estimulados por potasio.
45
Figura 19. Efecto de lactato sobre la inhibición glicolítica de astrocitos en
reposo y estimulados por potasio.
47
Figura A1. Modelo de trans-aceleración de GLUT1. 66
Figura A2. Efecto lactato y piruvato en el sensor de hexosas
FLII12Pglu600µΔ6.
68
Figura A3. Sensibilidad del método HPLC por el lactato 72
Figura A4. Activación glicolítica por potasio 15 mM en astrocitos cultivados
sobre superficies de plástico.
73
vi
INDICE DE TABLA S
Página
Tabla 1.
Concentraciones de lactato teórico presente en el sobrenadante a 3
y 15 mM potasio.
70
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
AM : acetoximetil-éster
BCECF : 2’,7’-bis(carboxietil)-5(6)-carboxyfuoresceína
CFP : proteína fluorescente cian
DAD : arreglo de diodos
DIA : depolarización inducida por alcalinización
FRET : transferencia de energía de resonancia
Gal : galactosa
GGBP : proteína unión a glucosa, galactosa
Glc : glucosa
HEPES : [N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-ácido etansulfónico)]
HPLC : cromatografía líquida de alta eficacia
IAA : ácido yodo acético
KRH : tampón Krebs-Ringer Hepes
LDH : lactato deshidrogenasa
MEM : minimum essentials medium eagle
NAD+ : dinucleótido de nicotinamida y adenina
NADH : dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido
ROIs : región de interés
SFB : suero fetal bovino
Tris : tris-(hidroximetil)-amino-metano
U.A. : unidades arbitrarias
1
1. RESUMEN
La actividad sináptica produce un aumento de origen desconocido en la
concentración de lactato intersticial. Se ha propuesto que parte de este lactato es
liberado por astrocitos en respuesta a señales neuronales y que el lactato serviría de
sustrato energético preferencial para las neuronas. Además, se ha demostrado que el
lactato actúa como vasodilatador cerebral, favoreciendo la llegada de nutrientes a las
zonas activadas. Estudios recientes en nuestro laboratorio han mostrado que los
astrocitos son capaces de aumentar en segundos su tasa glicolítica en respuesta a
potasio, catión liberado desde neuronas durante la actividad sináptica excitatoria, lo que
presumiblemente causaría una liberación aguda de lactato hacia el medio extracelular.
En este trabajo se investigó el posible papel modulador del lactato extracelular
sobre la tasa de la glicólisis astrocitaria en condiciones de reposo y durante activación
por potasio extracelular. Con el objetivo de evaluar esta posibilidad se midió el efecto
del lactato sobre la glicólisis astrocitaria en tiempo real, mediante un nanosensor de
glucosa basado en FRET. El lactato inhibió de manera sustancial a la glicólisis de
células en reposo, pero en menor grado a la glicólisis activada por un aumento del
potasio extracelular. Determinamos que la inhibición de la glicólisis por el lactato no se
debe a un efecto sobre el pH o el tono redox intracelular, sino más bien, sugerimos que
se debe al aumento del piruvato intracelular con la consiguiente inhibición por producto
de la piruvato quinasa. En resumen, proponemos que el lactato actúa como una señal
de retroalimentación negativa para la glicólisis astrocitaria. La mayor sensibilidad de los
astrocitos en reposo sugiere además un posible mecanismo de desvío de la glucosa
desde zonas en reposo hacia zonas activadas.
2
1.1. SUMMARY
Synaptic activity produces an increase in interstitial lactate concentration whose
origin is unknown. It has been suggested that this lactate is partly released by astrocytes
in response to neuronal signals and that lactate may serve as preferential fuel for
neurons. Furthermore, it has been shown that lactate is a vasodilator in brain tissue,
favoring the delivery of nutrients to active zones. Recent studies in our laboratory have
shown that astrocytes are able to increase their rate of glycolysis within seconds in
response to potassium, cation that is released by neurons in response to excitatory
synaptic activity, which presumably would lead to an acute release of lactate towards the
extracellular milieu.
This thesis investigated the possible modulatory role of lactate on astrocytic
glycolysis at rest and during activation by extracellular potassium. Aiming to asses this
possibility, the effect of lactate on astrocytic glycolysis was measured in real time with a
FRET glucose nanosensor. Lactate strongly inhibited glycolysis in resting cells and to a
lesser degree, inhibited glycolysis in potassium-activated cells. It was possible to show
that the effect of lactate on glycolysis was not mediated by intracellular pH changes nor
by changes in redox potential. Rather, we suggest that the inhibition is due to increased
intracellular pyruvate concentration, with subsequent product inhibition of pyruvate
kinase. In summary, we propose that lactate behaves as a negative feedback signal for
astrocytic glycolysis. The higher sensitivity of resting astrocytes suggests that lactate
may serve a signal to deviate glucose from resting zones towards activated zones.
3
2. INTRODUCCIÓN
La actividad sináptica produce importantes flujos iónicos. La activación de los
receptores ionotrópicos de glutamato causa entrada de sodio y calcio al terminal post-
sináptico, y al mismo tiempo la salida de potasio el cual actúa como contraión. Estos
movimientos iónicos son seguidos por cambios en el metabolismo energético local. En
los primeros segundos de activación aumenta el gasto de ATP por las bombas de
cationes neuronales que regeneran los gradientes iónicos.
El principal sustrato energético en el cerebro del mamífero adulto es la glucosa y
mediciones de microdiálisis y micro-electrodos muestran que la actividad sináptica lleva
a una disminución rápida de la concentración intersticial de glucosa (Fillenz, 2005; Hu y
Wilson, 1997a) indicando un aumento de su consumo. Se ha observado también que la
actividad sináptica lleva a cambios agudos de la concentración intersticial de lactato, lo
que sugiere cambios en la relación entre su producción y consumo local (Hu y Wilson,
1997b). Existe evidencia creciente de que los astrocitos, el tipo celular más abundante
en el cerebro de primates, están involucrados en los eventos metabólicos
desencadenados por activación neuronal.
Este trabajo describe una investigación de los eventos metabólicos agudos
generados en astrocitos en respuesta a señales neuronales. En particular se estudió el
efecto de variaciones en la concentración de lactato extracelular sobre la velocidad de
la glicólisis de astrocitos en cultivo primario bajo distintos niveles de activación por
potasio extracelular.
4
2.1. Producción de lactato a partir de una molécula de glucosa
La glucosa es el principal sustrato energético del cerebro en mamíferos
(Magistretti, et al, 1999), si bien este órgano representa sólo un 2% del peso corporal,
el 20% de la ingesta total de glucosa y oxígeno son consumidos por él. Para que este
azúcar sea utilizado por las células cerebrales, astrocitos y neuronas, debe atravesar
las células endoteliales que constituyen la barrera hematoencefálica. La difusión de la
glucosa se ve facilitada por los transportadores facilitativos de glucosa, GLUTs (Joost y
Thorens, 2001), donde es la isoforma GLUT1 la que se encuentra presente en células
endoteliales y astrocitos, mientras que en neuronas está presente la isoforma GLUT3
(Leino, et al, 1997; Duelli y Kuschinsky, 2001).
Los astrocitos juegan un rol crítico en la regulación metabólica de la glucosa en
el cerebro (Pellerin, et al, 2007). En el astrocito, el metabolismo de la glucosa puede ser
modulada por tres enzimas claves de la vía glicolítica: 1) hexoquinasa; enzima
autoregulatoria cuya función es fosforilar la glucosa en el carbono 6, 2)
fosfofructoquinasa, regulada por el pH intracelular y la razón AMP/ATP proveniente de
la bomba Na+/K+ ATPasa, y 3) piruvato quinasa, enzima regulada por el ATP que influye
en el destino de su producto, el piruvato. Este según las condiciones energéticas puede
converger hacia la producción de lactato o en una segunda instancia hacia el ciclo de
los ácidos tricarboxílicos (Rolleston y Newsholme, 1967). Cuando la glicólisis anaerobia
lleva curso dentro de una célula, la manera de sustentar el flujo glicolítico hacia la
producción de lactato, es mediante el ciclo NAD+/NADH. En la figura 1 se presenta un
esquema representativo de la regulación glicolítica por sus enzimas, la producción de
lactato y la mantención del ciclo NAD+/NADH en el astrocito por las enzimas
5
Figura 1. Regulación de la glicólisis por las enzimas glicolíticas y razón
NAD+/NADH. La reacción catalizada por la enzima Gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa utiliza el cofactor NAD+ para reducirlo a NADH, el cual es sustrato para
lactato deshidrogenasa quien lo lleva a su forma oxidada nuevamente. Las flechas
grandes indican las etapas irreversibles de la glicólisis gobernadas por las enzimas
hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa.
6
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y lactato deshidrogenasa.
La enzima lactato deshidrogenasa (LDH) participa en la producción de lactato,
en la reacción, piruvato + NAD+ lactato + NADH + H+ que puede ocurrir
reversiblemente (Petrat, et al, 2005). Esta enzima es un tetrámero formado por los
polipéptidos A y B, característica que permite generar 5 isoformas para la enzima
(Markert y Appella, 1961), y cuyas propiedades catalíticas difieren debido a la
combinación de estas subunidades (B4 o LDH1, B3A o LDH2, B2A2 o LDH3, BA3 o
LDH4, y A4 o LDH5) (Bittar, et al, 1996; O`Brien, et al, 2007). En el cerebro se expresan
todas las isoformas de LDH, pero en distintas proporciones dependiendo del tipo celular
(O`Brien, et al, 2007). LDH1 se encuentra expresado en neuronas, mientras que LDH-4
y 5 lo está en astrocitos (Bittar, et al, 1996; Laughton, et al, 2000; Pellerin y Magistretti,
2003). LDH1 se encuentra presente en tejidos aerobios, mientras que LDH5 se expresa
en tejidos productores de lactato (Cahn, et al, 1962; Markert, et al, 1975), por esta razón
se ha inferido que los astrocitos convierten el piruvato a lactato, mientras que las
neuronas son capaces de oxidar el lactato a piruvato para su consumo durante
actividad sináptica. No se han observado diferencias en la expresión de las isoformas
de LDH a distintas concentraciones de glucosa (O`Brien, et al, 2007).
2.2. El transporte de lactato en células cerebrales
El transporte de lactato es mediado por los co-transportadores de
monocarboxilatos; MCTs (Dringen, et al, 1993; Tsacopoulos y Magistretti, 1996), cuyo
movimiento simporte de una molécula de lactato y un protón puede ocurrir
reversiblemente (Poole y Halestrap, 1993; Bergersen, et al, 2002). Los MCTs poseen 12
7
dominios trans-membrana y sus extremos amino y carboxilo terminal se encuentran
hacia el espacio intracelular (Poole, et al, 1996) y cuya estructura es homóloga a los
transportadores facilitativos de glucosa (GLUTs) (Joost y Thorens, 2001). Existen 14
isoformas de los MCTs de los cuales sólo 1, 2 y 4 han sido identificados en cerebro
(Halestrap y Price, 1999; Pellerin, et al, 2005). Los astrocitos de corteza expresan
MCT1 y MCT4, mientras que en las neuronas lo es MCT2 (Bröer, et al, 1999; Pellerin, et
al, 2005). Cada una de estas isoformas presentan distintas afinidades por lactato. En
astrocitos, se ha reportado que la Km del MCT1 fluctúa entre 4-8 mM (Schneider, et al,
1993; Bröer, et al, 1997; Carpenter y Halestrap, 1994; Jackson y Halestrap, 1996),
mientras que el MCT4 tiene una Km de 35 mM (Dimmer, et al, 2000). En neuronas, la
isoforma MCT2 tiene una Km de 0,7 mM (Bröer, et al, 1999).
2.3. El lactato en el intersticio cerebral
La concentración de lactato en el intersticio cerebral ha sido medida con
sistemas de microdiálisis, tanto en ratas y humanos conscientes, donde se determinó
que la concentración extracelular fue de 2,7 y 1,38 mM, respectivamente (Abi-Saab, et
al, 2002). Se ha propuesto que el lactato puede ser acumulado en el espacio
extracelular y en el medio intracelular de astrocitos, el que sería una fuente importante
de reserva metabólica para cuando las neuronas incrementen sus demandas
energéticas (Pellerin, et al, 2007). En ganglios simpáticos, se ha reportado que el
lactato es capaz de modular el metabolismo de la glucosa, prefiriendo el consumo de
lactato por sobre el de la glucosa (Larrabee, 1995; 1996). El lactato también puede
participar en la modulación de la dilatación de vasos sanguíneos (Gordon, et al, 2008).
8
Cuando hay un aumento de calcio astrocitario, las prostaglandinas son sintetizadas y
liberadas por difusión simple (Chan, et al, 1998, 2002). Su re-captación se lleva a cabo
a través de los transportadores de prostaglandinas, PGTs, los que intercambian una
molécula de lactato citosólica por una prostaglandina PGE2 presente en el extracelular
(Kanai, et al, 1995). Cuando el metabolismo anaerobio está activo, los niveles de
lactato elevados no permiten que PGE2 sea recapturado, generando la dilatación de los
vasos sanguíneos y con ello el aumento de oxígeno y glucosa en el intersticio cerebral.
2.4. Efectos de potasio sobre el metabolismo astrocítico
La actividad sináptica causa un aumento rápido de la concentración intersticial de
potasio, el cual llegaría a 12-15 mM en condiciones de activación aferente máxima
(Kofuji y Newman, 2004). En condiciones patológicas como isquemia-reperfusión y
spreading depression el potasio intersticial puede llegar hasta 60 mM (Somjen, 2001,
2002). Estudios de captación de isótopos en cultivos primarios puros de astrocitos por
períodos prolongados (20 min a 4 hrs), mostraron que niveles fisiológicos y patológicos
de potasio extracelular producen efectos pequeños o indetectables (0-40% de aumento)
en el metabolismo de glucosa (Cummins, et al, 1979; Peng, et al, 1994, 1996; Huang, et
al, 1994; Takahashi, et al, 1995; Hajek, et al, 1996; Abe, et al, 2006). Un estudio de la
producción de lactato mostró un aumento más sustancial (100%) en respuesta a 60 mM
potasio (Walz y Mukerji, 1988), lo que posiblemente fue influido por la degradación
acelerada de glicógeno en respuesta a potasio (Hof, et al, 1988). Más recientemente,
gracias al uso de nanosensores de glucosa FRET, fue posible en nuestro grupo evaluar
el efecto del potasio sobre el metabolismo de glucosa en astrocitos en cultivo mixto con
9
neuronas y con una resolución temporal de segundos (Bittner, 2009). Los resultados de
este estudio indicaron que concentraciones fisiológicas de potasio (4-15 mM) producen
una activación robusta y reversible de la tasa glicolítica astrocitaria (300-600%). La
magnitud y curso temporal de esta respuesta es compatible con el aumento de la
concentración de lactato intersticial observado en respuesta a activación sináptica, lo
que sugiere que una fracción importante del aumento de lactato durante la activación
neuronal es de origen astrocítico.
En vista del posible papel de los astrocitos en la producción de lactato durante la
actividad sináptica nos propusimos investigar la posibilidad de que el lactato sirviese
como señal de retroalimentación para su propia producción en astrocitos, por lo que se
planteó la siguiente hipótesis de trabajo:
“El lactato extracelular modula agudamente la glicólisis en astrocitos en
reposo y estimulados con concentraciones fisiológicas de potasio”.
Para evaluar esta hipótesis, se planteó como objetivo general:
Determinar la modulación de la glicólisis astrocitaria por efecto de lactato
extracelular en condiciones de reposo y activación por potasio.
10
Objetivos Específicos
1. Determinar la constante de afinidad del MCT presente en astrocitos.
2. Medir el efecto del lactato extracelular sobre la concentración de glucosa
intracelular y su tasa glicolítica en condiciones basales.
3. Medir el efecto del lactato extracelular sobre la concentración de glucosa
intracelular y su tasa glicolítica en condiciones de alto potasio.
4. Estudiar los mecanismos celulares involucrados en la modulación de la glicólisis
en astrocitos de cultivo.
11
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1. Animales
En este estudio se utilizaron cortezas de cerebro de neonatos de ratón cepa
B6CBA. Los animales fueron proporcionados por el bioterio del Centro de Estudios
Científicos, los cuales fueron mantenidos a una temperatura ambiente de (20 ± 2) ºC y
un ciclo de día/noche de 12 horas.
3.1.2. Reactivos
Sigma Chemical Co.: HEPES, sulfato de magnesio, bicarbonato de sodio, D-glucosa,
D- galactosa, L-lactato, MEM, lactato de sódio.
Merck & Co., Inc.: Cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, ácido
clorhídrico, etanol.
Gibco: Neurobasal, suplemento B27, tripsina, penicilina-estreptomicina.
HyClone: SFB.
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Cultivo mixto primario de corteza de ratón
Para llevar a cabo el cultivo primario, neonatos de 1 a 3 días fueron sacrificados
por decapitación. Las cabezas fueron recolectadas y mantenidas en medio HANK’s
12
(100 µM HEPES Ácido, 1,36 µM NaCl, 74 µM KCl, 50 µM Glucosa, 44 µM KH2PO4, rojo
fenol, pH 7,4) con 102UI - 102 µg/mL penicilina- estreptomicina y 2,5 µg/mL Fungizona a
4ºC. Estas condiciones fueron utilizadas hasta la obtención de la corteza cerebral libre
de meninges e hipocampo. Para la obtención de las células gliales y neuronas se digirió
el tejido con tripsina 5X durante 5 minutos. La reacción se detuvo con la adición de
medio MEM 9 mM glucosa, suplementado con 10% SFB, 1 mM piruvato, 2mM
glutamina, 2,5 µg/mL fungizona, 102UI - 102 µg/mL penicilina-estreptomicina. A
continuación, se realizó disgregación mecánica del tejido, obteniéndose células
cerebrales en suspensión, las cuales fueron plaqueadas sobre cubreobjetos de 25 mm
previamente tratadas con poli-L-lisina (1 g/L) en medio de cultivo MEM 10% SFB y se
incubó por 90 minutos en una atmósfera húmeda artificial con 5% CO2 - 95% aire a
37ºC. Posteriormente el medio fue reemplazado por neurobasal suplementado con
2mM glutamina, 2% B27, 2,5 µg/mL fungizona, 102UI - 102 µg/mL penicilina-
estreptomicina. Las células fueron utilizadas entre los días 8 y 13 de realizado el
cultivo, con un 60 - 80% de confluencia por placa. El medio neurobasal fue
reemplazado cada 4 días. Todos los procedimientos fueron aprobados previamente por
el comité de bioética del Centro de Estudios Científicos.
3.2.2. Microscopía de epifluorescencia
Para visualizar astrocitos cargados con BCECF o astrocitos que expresan el
sensor de hexosas, se utilizó un microscopio de epifluorescencia Olimpus IX70
acoplado con una lámpara ARC Cairn, equipado con un monocromador Cairn
Optoscan, donde la emisión de la sonda o proteína fluorescente fueron capturadas por
13
una cámara ORCA-ER Hamamatsu, bajo el control del Software AQM Advance 6. La
fluorescencia fue medida en regiones de interés (Regions of Interest; ROIs) ubicadas
sobre las células y un background (ruido de fondo). Todas las mediciones fueron
realizadas con el objetivo 40X con una apertura numérica de 1,3. En la figura 2 se
presenta un esquema del microscopio de epifluorescencia, donde astrocitos que
expresan el sensor de hexosas son excitados a 430 nm. La emisión de la lámpara de
xenón pasa a través de un monocromador que selecciona la luz escogida, la que
luego de viajar por una fibra óptica llega hasta el microscopio. Un espejo dicroico
refleja la luz hacia la muestra, permitiendo excitar la proteína sensible a 430 nm, y la
correspondiente transferencia de energía a la proteína aceptora. Finalmente, la
emisión de ambas pasa por el microscopio hasta el optosplit, donde las señales son
separadas por otros espejos dicroicos y detectadas por la cámara ORCA y
transformadas digitalmente en el software AQM Advance 6.
3.2.3. Nanosensor FLII12Pglu600µΔ6
El nanosensor FLII12Pglu600µΔ6 es miembro de la familia de nanosensores de
glucosa (Deuschle et al., 2005; Fehr, et al., 2003; Takanaga et al., 2008), compuesta
por 3 proteínas, una parte central GGBP (Glucose, Galactose binding protein) capaz
de unir glucosa y galactosa, una proteína fluorescente citrine en su extremo carboxilo
y otra proteína fluorescente CFP en su amino terminal. El funcionamiento de la
proteína se basa en el principio FRET, donde la unión de hexosas (glucosa o
galactosa) inducen un cambio conformacional, permitiendo que citrine y CFP se
acerquen, favoreciendo la trasferencia de energía desde el donador (CFP) al aceptor
14
F.
E. B.
D.
A. C.
G.
H.
Figura 2. Esquema microscopio de epifluorescencia. Se utilizó un set up FRET para
realizar los registros de glucosa y pH. En la representación el sensor FRET de hexosas
es excitado a 430 nm. La luz proveniente de una lámpara de Xenón (A), es difractada y
seleccionada en un monocromador (B), luego la luz de 430 nm (-) viaja desde la fibra
óptica (C) hasta el microscopio. Una vez que llega al cubo FRET (D) ésta es reflejada
pasando por el filtro de excitación y el objetivo (E) hasta la muestra (F). Luego, la
emisión de fluorescencia de CFP (-) y citrine FRET (-) viajan hasta el optosplit (G)
donde son separadas. Finalmente, las señales emisión son captadas digitalmente (H).
Filtros (BP) y espejos, plano (1), cóncavo (2), grilla de difracción (3) y dicroico, D (4).
15
(citrine). Como se observa en la figura 3 la eficiencia de citrine depende de la distancia
intermolecular de las moléculas donador/aceptor, donde la transferencia de energía se
verá aumentada si GGBP está unida a una hexosa y por el contrario, se verá
disminuida si la concentración intracelular de glucosa o galactosa disminuye.
Para medir el azúcar intracelular se excitó CFP a una longitud de onda de 430
nm, la emisión fue colectada a 485 ± 20 nm y 535 ± 15 nm. Desde las imágenes
superpuestas de las emisiones se obtuvieron las señales crudas de CFP (430→485) y
citrine FRET (430→535) y a las señales normalizadas se les calculó la razón. Ensayos
controles muestran que la emisión de citrine es sensible a pH, por lo que se realizaron
correcciones directamente a 512 nm con un octavo del tiempo de la excitación de 430
nm y colectándose la señal a 535 ± 15 nm. Desde las señales de citrine FRET se
dividieron los valores por el 35% de la desviación de la emisión de citrine directa
(512→535) a partir del 1. Si bien citrine directa es sensible a los protones, esta proteína
presenta una modificación que la hace más insensible a pH en el rango fisiólogico,
permitiendo disminuir artefactos en las mediciones. En la figura 4 A se muestran las
propiedades de las señales de CFP, citrine FRET y citrine directa. CFP es sensible a la
presencia de azúcar, y no a variaciones de pH, mientras que citrine directa representa
todo lo contrario. En la figura 4 B se muestran las imágenes de astrocitos expresando el
senso, el cual muestra las señales de emisión por separado (CFP, citrine directa y la
razón citrine FRET/citrine directa). También se destaca la distribución citosólica y
exclusión nuclear, características de la familia de estos nanosensores proteicos (Bittner,
2009; Fehr, et al, 2003). Las señales de fluorescencia de CFP, citrine FRET y citrine
directa son sensibles a cambios de foco, cambios de volumen y movimiento, pero
16
GGBP A. B.
CFP Citrine
Figura 3. Esquema del nanosensor de hexosas FLII12Pglu600µΔ6. Proteína de
fusión compuesta por un par de proteínas fluorescentes citrine y CFP que se
encuentran acopladas a GGBP (Glucose, galactose binding protein). En el esquema se
muestra el principio de FRET aplicado para este nanosensor. A. En un medio libre de
hexosas las proteínas citrine y CFP se encuentran alejadas, lo que implica que la
emisión de fluorescencia de citrine es menor a la emitida por CFP; esto se traduce en
una disminución de la eficiencia FRET. B. La presencia de hexosas permite el
acercamiento de las proteínas fluorescentes, donde la emisión de CFP disminuye dada
la tranferencia de energía a citrine, proteína cuya fluorescencia se ve aumentada; todo
esto se observa como un aumento de la eficiencia FRET.
17
(Flu
ores
cenc
ia -
Rui
do d
e fo
ndo)
nor
mal
izad
o
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
A. a. B. b. GalactosaMonensina
c. d.
10 minutos
Figura 4. Efecto del pH y presencia de azúcar en las señales de CFP, citrine
FRET y citrine directa. A. Registro temporal de las señales de fluorescencia
normalizadas para CFP (-), citrine FRET (-) y citrine directa (-). Durante la exposición
de galactosa, se observa como CFP disminuye su emisión de fluorescencia producto
de la mayor transferencia de energía a citrine. La señal de citrine directa es insensible
a este fenómeno, sin embargo, cuando se agrega 10 µM monensina (agente
alcalinizante), se observa un aumento de la señal en citrine directa y citrine FRET, que
daría cuenta de una alcalinización intracelular. Durante este fenómeno, CFP es
insensible a la variación del pH intracelular. B. Expresión del sensor en astrocitos
corticales durante el tratamiento de A, detectándose la fluorescencia de emisión de
CFP (a), citrine FRET (b), citrine directa (c) y razón citrine FRET/citrine directa (d), por
microscopia de epifluorescencia.
18
no así la razón de fluorescencia. La técnica FRET utilizada nos permite determinar los
fenómenos intracelulares de metabolismo, transporte y captación de hexosas.
3.2.3.1. Infección viral del nanosensor FLII12Pglu600µΔ6 en astrocitos
Los cultivos mixtos primarios fueron infectados con un vector adenoviral que
muestra una gran selectividad por astrocitos por sobre las neuronas. Se incubaron las
células por 12 horas overnight y luego fueron lavadas con medio. Para permitir la
expresión adecuada del sensor los cultivos fueron utilizados 24 - 72 horas post-
infección viral.
3.2.3.2. Calibración del nanosensor FLII12Pglu600µΔ6 en astrocitos
Para determinar las concentraciones de glucosa y galactosa intracelular, se
realizó la calibración del nanosensor. Las células debieron ser permeabilizadas por 30
minutos con un clamp de calibración (500 μM IAA, 100 µM nigericina, 10 μM
monensina, 20 µg/mL gramicidina) el que permitió inhibir la glicólisis y equilibrar iones
como calcio, protones y sodio, en un buffer intracelular (Ver en condiciones
experimentales). Posteriormente, los astrocitos fueron expuestos a concentraciones
crecientes de glucosa o galactosa mediante trans-aceleración (Figura 5 A) (Anexo 5.1).
Para expresar los datos de fluorescencia en concentración de glucosa o
galactosa intracelular se trazó una hipérbola rectangular, de la cual se obtuvieron el
máximo de fluorescencia (Δmax) y la afinidad del sensor para cada azúcar (KD). En la
figura 5 B el valor de ΔRmax determinado para el sensor fue de un 27%, mientras que
las constantes de disociación del sensor (KD) por glucosa y galactosa fueron de 0,43 y
19
5%
5 minutos
Gal (mM)
0,9
0,6 0,3
2
0,3 0,6
1,5
1,5
0,9
2
Glc (mM) 0
0
[Galactosa]i (mM)0 1
A.
20
10
20
30
40
[Glucosa]i (mM) 0 1 2
% Δ
R
0
10
20
30
40
% Δ
R
B.
Figura 5. Calibración del sensor de hexosas FLII12Pglu600µΔ6 en astrocitos. La
calibración del sensor fue realizado en astrocitos permeabilizados, cuya glicólisis se
encontró inhibida. A. Registro representativo de un astrocito expuesto a glucosa y
luego a galactosa mediante trans-aceleración. Este procedimiento se realizó hasta una
concentración final de 2 mM para ambos azúcares. B. El panel derecho se muestra la
afinidad del sensor para glucosa (KD 0,43) en 5 células y galactosa (KD 0,87) en 7
células, donde el Δmax fue de un 27%. El ● corresponde a la concentración de glucosa
de astrocitos permeabilizados.
20
0,87 mM, respectivamente.
3.2.4. Sonda fluorescente BCECF
La molécula BCECF es una sonda fluorescente racionométrica sensible a
protones, tiene una pKa de 7,0, cuya característica permite trabajar en rangos
fisiológicos de pH. Se utiliza su forma acetoximetil-ester (BCECF/AM), una molécula
lipofílica que entra fácilmente a la célula; una vez dentro los grupos AM son hidrolizados
por esterasas presentes en citoplasma lo que genera una molécula BCECF
fluorescente hidrofílica que es incapaz de atravesar la membrana lípidica. La sonda
BCECF fue excitada a 495 y 440 nm, longitudes de onda que permiten medir la
variación de protones y cambios de volumen, respectivamente. El volumen debe ser
evaluado, debido a variaciones de tamaño que puedan producirse en la célula, cuya
consecuencia pueden ser la dilución ó concentración de la sonda. Luego de la
excitación a 495 y 440 las emisiones fueron colectadas a 560 y 510 nm,
respectivamente. La sonda fue cargada por 3-4 minutos a una concentración de 0,1µM.
La señal de BCECF fue calibrada en los cultivos por exposiciones a soluciones
con distintos pH, luego de permeabilizar las células con 10 μg/ml nigericina y 20 μg/ml
gramicidina en un buffer intracelular. La sonda fue calibrada en tampón HEPES y
solución bicarbonato a distintos pH (Bittner, 2009).
3.2.5. Condiciones experimentales
Los experimentos de fluorescencia en tiempo real se llevaron a cabo a
temperatura ambiente (22-25ºC), donde los cultivos primarios fueron expuestos a
21
distintas soluciones salinas.
KRH/HEPES (mM): 136 NaCl, 3 KCl, 1,25 CaCl2, 1,25 MgSO4, 1-2 glucosa, 2 lactato de
sodio, 10 HEPES, pH 7,4
KRH/Bicarbonato (mM): 112 NaCl, 3 KCl, 1,25 CaCl2, 1,25 MgCl2, 1-5 glucosa, 10
HEPES, 24 NaHCO3, pH 7,2. Solución gaseada con 95% O2/5% CO2.
Cuando se usaron concentraciones más altas de potasio, el NaCl fue ajustado para
mantener la isotonisidad.
KRH/Bicarbonato intracelular (mM): 10 NaCl, 106 KCl, 10 HEPES, 1,25 MgSO4, 24
KHCO3, pH 7,0. Solución gaseada con 95% O2/5% CO2.
Para preparar las soluciones, se utilizó una pesa analítica SCALTEC, un agitador
magnético VELP® Scientifica y Cimare y un pHmetro EXTCH instruments.
3.2.6. Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)
Se hizo uso de un sistema HPLC HitaCHI LaChrom Elite® para determinar la
sensibilidad al lactato. En la figura 6 se muestran los compartimientos acoplados en
este equipo: A. la bomba L-2100 SMASH, B. el autosampler L-2200, C. un horno de
columnas L2300 y en D. un detector DAD. Para detectar el lactato, se utilizó en una
columna apolar C18 a una temperatura de 40 ºC, y con una fase móvil de 10 mM ácido
sulfúrico (H2SO4) se mantuvo flujo constante de 1 mL/min. El equipo utilizado estuvo
provisto de un detector de arreglo de diodos (DAD) y la detección final del lactato se
midió a 210 nm, se observó un pico de elución a los 2,05 minutos. El HPLC estuvo
conectado además a una computadora para la adquisición de datos. Para la evaluación
22
A)
B)
C)
D)
E)
Figura 6. Esquema HPLC HitaCHI LaChrom Elite. Se muestra una representación del
equipo HPLC durante la detección del lactato. A. La bomba establece el flujo del
sistema (1 mL/seg) con el solvente H2SO4. B. La muestra de lactato, almacenada en el
autosampler, es inyectada al flujo del sistema. C. La columna C18 que se encuentra en
el horno de columnas, concentra y separa el lactato de los otros componentes de la
muestra. D. La detección se determinó a 210 nm con el sistema DAD (arreglo de diodo)
y la evaluación de los datos se realizó con el software EZChrom Elite, versión 3.2.1. E.
Los desechos de la cromatografía fueron almacenados en un colector. Las flechas
negras representan la dirección del ensayo.
23
de los datos obtenidos, se utilizó el programa EZChrom Elite, versión 3.2.1. Se midieron
concentraciones de 80; 3,2; 0,128 y 0,00512 mM lactato de sodio diluídos en la misma
fase móvil.
3.2.7. Análisis estadístico
Los datos son presentados como promedio ± error estándar (número de células,
número de experimentos). Para los análisis estadísticos, de regresión lineal,
histogramas de distribución e hipérbolas rectangulares se utilizó el programa Sigma Plot
11.0.
Para comparar dos muestras se evaluó la significancia estadística con la prueba
t-student pareada, mientras que para grupos múltiples se utilizó ANOVA, seguido de
test Tuckey. En los análisis estadísticos, se consideró diferencia significativa p < 0,05.
24
4. RESULTADOS
Este trabajo tuvo como objetivo explorar un posible papel regulador del lactato
sobre la glicólisis en astrocitos. Dada la reciente disponibilidad de herramientas para la
medición de la tasa glicolítica en células individuales y con alta resolución temporal, se
pudo llevar a cabo una evaluación de los efectos agudos del lactato sobre la glicólisis
astrocitica en cultivos mixtos. Considerando recientes hallazgos en nuestro laboratorio
que indican que la glicólisis es modulada por potasio en el orden de segundos, también
se exploró el efecto de lactato en condiciones de activación por potasio.
A la fecha no se han descrito receptores de lactato en la superficie celular, lo que
hace de los transportadores de lactato, los principales candidatos para la detección del
lactato extracelular. El lactato es transportado desde y hacia el citosol junto a un protón
por los co-transportadores de monocarboxilatos de la familia MCT. En astrocitos se han
descrito dos isoformas, MCT1 y MCT4, que difieren en cuanto a su afinidad por lactato.
MCT1 tiene una constante de afinidad del orden de 4-8 mM y MCT4, una constante de
afinidad > 20 mM. Por otra parte, las neuronas expresan MCT2, que posee una
constante de afinidad < 1 mM (Juel y Halestrap, 1999). Como primer objetivo se
planteó la caracterización del transportador de lactato en nuestras condiciones de
cultivo.
4.1. Caracterización del transportador de monocarboxilato 1
Dado que el lactato es cotransportado con un protón, es posible evaluar la
entrada de lactato midiendo la acidificación intracelular causada por la entrada del
25
protón, lo que fue llevado a cabo usando la sonda fluorescente sensible a protones
BCECF. Estos experimentos fueron efectuados en ausencia del tampón fisiológico
bicarbonato, reemplazado por HEPES, pues como se discute más adelante (sección
4.4.1) la presencia de bicarbonato atenúa fuertemente el impacto del transporte de
protones sobre el pH intracelular. Como se ve en la figura 7 A, la exposición a lactato
llevó a una acidificación aguda del citoplasma astrocitario llegándose rápidamente a un
nuevo estado estacionario. La capacidad tampón y los mecanismos de extrusión de
protones hacen que la tasa de acidificación observada sea una fracción pequeña y
desconocida de la tasa real de entrada de protones. Sin embargo, bajo el supuesto de
linealidad en el comportamiento de estos mecanismos, es posible usar tanto la tasa
inicial de acidificación como la diferencia en la concentración de protones antes y
durante la exposición a lactato como parámetros de la velocidad de transporte hacia el
interior de la célula. Dado lo rápido de la acidicación inducida por lactato que
caracteriza a los astrocitos, en este trabajo se optó por usar la diferencia y no la tasa
inicial. En 74 astrocitos en 5 experimentos, la (Km) promedio fue de 5,4 ± 0,6 mM y la
variación máxima de la concentración de protones fue de 12,8 ± 0,7 nM (Figuras 7 B-
C). Esta última es un parámetro de la velocidad máxima de transporte (Vmax).
Estos resultados sugieren fuertemente que en nuestras condiciones de cultivo, la
isoforma astrocítica predominante es el MCT1. La figura 7 D se muestra además que
hubo una correlación positiva entre la Km y el grado de acidicación máximo, fenómeno
que no parece haber sido descrito con anterioridad.
26
pH in
trac
elul
ar
10 mM lactato
Concentración de lactato (mM)
0 2 4 6 8 10
Con
cent
raci
ón d
e pr
oton
es (n
M)
0
2
4
6
8
10
Vmax (nM)0 5 10 15 20 25
Km
(mM
)
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Km (mM)
0 5 10 15 20 25 30
Frec
uenc
ia (n
úmer
o de
ast
roci
tos)
0
10
20
Con
cent
raci
ón d
e pr
oton
es
40
60
80
0,14
18,82
MCT1MCT2 MCT4
2 minutos
7,4
7,3
7,2
7,1
A. B.
C. D.
Figura 7. Evaluación del transporte de lactato en astrocitos. A. Variación del pH
(arriba) y de los protones (abajo) en una célula que fue expuesta a lactato 10 mM. B.
Curva dosis respuesta de lactato en función de la variación de la concentración de
protones intracelulares. C. Rangos de Km reportadas para las isoformas MCT1, MCT2 y
MCT4, junto a la distribución poblacional obtenida en este estudio. D. Relación Km y
Vmax para cada astrocito estudiado (74 células, n= 5). Los ● y ● corresponden al pH y
concentración de protones intracelular, respectivamente
27
4.2. Efectos agudos del lactato sobre el metabolismo basal de glucosa
La activación neuronal causa cambios agudos en la concentración cerebral de
lactato. Mediante micro-electrodos sensibles a lactato implantados en el hipocampo, se
ha podido observar que la estimulación aferente provoca una caída aguda de la
concentración intersticial de lactato lo que segundos después es seguido por una
segunda fase en la cual el lactato supera su nivel basal (Hu y Wilson, 1997b).
Aprovechando la resolución temporal de la medición de glucosa mediante FRET, se
investigó el posible efecto de cambios agudos en la concentración de lactato sobre el
metabolismo astrocítico de glucosa. Primeramente se midió el impacto de las
variaciones de lactato sobre la concentración de glucosa en el estado estacionario.
4.2.1. Efectos del lactato sobre la concentración basal de glucosa en el estado
estacionario
El efecto de lactato extracelular sobre la concentración de glucosa en estado
estacionario se registró a concentraciones de 0, 2 y 5 mM lactato extracelular en célula
única durante todo un experimento. Los valores de lactato fueron escogidos basados en
la literatura, 2 mM es la concentración fisiológica presente en el cerebro (Abi-Saab, et
al, 2002) y 5 mM corresponde al valor aproximado de la Km observada para el MCT1
presente en astrocitos, mientras que la ausencia de lactato fue utilizado como control.
En la figura 8 A se muestra un registro de la glucosa intracelular en el tiempo en un
astrocito, donde se observa que el retiro o exposición de lactato generó una
disminución o un aumento significativo de la concentración de glucosa,
respectivamente. En la figura 8 B se muestra el comportamiento de 31 células
28
Concentración de lactato (mM)
Con
cent
raci
ón d
e gl
ucos
a (m
M)
2 5 0
**
0
Lactato (mM) 5
0,1
mM
Glc
5 minutos
1,5
1,0
0,5
0,0
A. B.
Figura 8. Impacto del lactato extracelular sobre la concentración de glucosa
intracelular en astrocitos. A. Registro de la concentración de glucosa de una célula
que fue expuesta a lactato 5 mM. B. Concentraciones de glucosa intracelular en el
estado estacionario de 31 astrocitos en 5 experimentos, en presencia (2 y 5 mM) y
ausencia de lactato extracelular. Las barras horizontales representan el promedio de los
datos. (* p< 0,05 ANOVA). El ● corresponde a la concentración de glucosa intracelular.
29
analizadas (n= 5). Las líneas negras representan los promedios de las concentraciones
de glucosa en lactato 2, 5 y 0 mM, cuyos valores son (mM): 0,53 ± 0,04, 0,66 ± 0,05 y
0,37 ± 0,03, respectivamente. Estos datos muestran que el metabolismo de la glucosa
es sensible al lactato extracelular, pero no permiten asegurar a qué nivel se produce la
modulación, pues la concentración de glucosa en el estado estacionario depende tanto
de su utilización por la hexoquinasa como de su transporte por el transportador de
glucosa GLUT1.
4.2.2. Efectos del lactato sobre la tasa glicolítica basal
La tasa glicolítica puede ser medida en tiempo real mediante la interrupción del
estado estacionario con un inhibidor del transportador de glucosa (Bittner, 2009). Para
determinar el metabolismo de la glucosa, los astrocitos fueron expuestos a 20 µM
citocalasina B, un inhibidor reversible de los transportadores de glucosa. En la figura
9 A se observa que el inhibidor produce una disminución en la concentración de
glucosa cuya pendiente representa la tasa de la hexoquinasa. En la figura 9 B se
muestra que la tasa glicolítica basal (en ausencia de lactato) fue de 1,4 ± 0,2 µM/seg,
la que fue inhibida en un 78,5% por lactato 5 mM (0,31 ± 0,2 µM/seg) (31 células, n= 4).
La inhibición de la tasa glicolítica por lactato se desarrolló en el rango de segundos.
Con estos resultados se puede afirmar que el lactato inhibe agudamente el consumo
basal de glucosa por astrocitos.
30
Concentración de lactato (mM)
Tasa
glic
olíti
ca (µ
M/s
eg)
0
1
2
3
4
5 0
*Lactato (mM) 5
A. B.
CitoB0
2 minutos
0,1
mM
Glc
Figura 9. La tasa glicolítica es sensible al lactato extracelular. Para medir el
metabolismo de glucosa se utilizó 20 µM citocalasina B, un inhibidor del transporte de
glucosa. A. Se midió el consumo de glucosa en un astrocito en presencia y ausencia de
lactato 5 mM. B. Tasas glicolíticas de 31 astrocitos en 4 experimentos, las barras
horizontales representan el promedio de los datos. (*p< 0,05 t-student pareado). El ●
corresponde a la concentración de glucosa intracelular y las tasas glicolíticas (lactato en
mM): ● 5 y ○ 0.
31
4.3. Efectos del lactato sobre el metabolismo de glucosa activado por un
aumento del potasio extracelular
La activación de los receptores glutamatérgicos ionotrópicos durante la actividad
sináptica excitatoria causa la liberación de potasio, el cual desde sus niveles
intersticiales de reposo (2,5 - 3 mM) puede llegar en segundos hasta 12-15 mM (Aitken
y Somjen, 1986; Connors, et al., 1982; Kofuji y Newman, 2004). Resultados recientes
de nuestro laboratorio mostraron que el potasio es capaz de ejercer una activación
aguda de la glicólisis en astrocitos, sin afectar el transporte de glucosa. El efecto de
potasio fue evidente a 6 mM, con una activación de aproximadamente 200%,
llegándose a un 300-400% a 15 mM potasio (Bittner, 2009). A continuación se
describen experimentos diseñados para investigar un posible efecto modulatorio del
lactato sobre el metabolismo de glucosa en condiciones de activación por potasio.
4.3.1. Modulación por lactato del efecto del potasio sobre el nivel de la glucosa en
el estado estacionario
Dados los antecedentes presentados, nos propusimos evaluar si el lactato
extracelular era capaz de modular el efecto del potasio sobre la concentración de
glucosa en el estado estacionario. Las células se incubaron en presencia y ausencia de
lactato y tras alcanzar un nuevo estado estacionario, la glicólisis fue activada con 6 mM
o 15 mM potasio. Como se puede apreciar en la figura 10 A, la presencia de lactato
determinó una clara inhibición del efecto del potasio. La tasa de disminución de la
concentración de glucosa inducida por potasio entrega un parámetro semicuantitativo
de la activación de la glicólisis. En la figura 10 B, se muestra que la presencia de lactato
32
25
0Lactato (mM)
K+
15 minutos
0,5
mM
Glc Ta
sa d
e di
smin
ució
n de
glu
cosa
(µM
/seg
)
0
5
10
15
25
30
Tasa
de
dism
inuc
ión
de g
luco
sa(µ
M/s
eg)
0
2
4
10
12
52
0
**
*
6 mM
15 mM
Concentración de lactato (mM)
A. B.
Figura 10. Efecto de lactato sobre la activación glicolítica mediada por potasio en
estado estacionario. A. se muestran 2 registros de astrocitos que incubados en
presencia y ausencia de lactato son expuestos a potasio 6 mM (arriba) y 15 mM (abajo).
B. Resumen de las tasas de disminución de glucosa durante la presencia de potasio 6
(arriba) y 15 mM (abajo), en 21 y 18 células, respectivamente. (n=3 para cada set). Las
barras horizontales representan los promedios para cada uno de los tratamientos. (*p<
0,05 ANOVA). El ● corresponde a la concentración de glucosa intracelular y la
disminución de glucosa en potasio 6 o 15 mM (lactato en mM): ▪ 2; ▪ 5; ▫ 0.
33
fue capaz de ejercer un papel modulador tanto a un nivel moderado de activación (6
mM potasio), como a un nivel máximo de activación (15 mM). Las tasas de disminución
de la concentración de glucosa gatilladas por 6 mM potasio a 2, 5 y 0 mM lactato fueron
(µM/seg): 1,2 ± 0,3; 0,9 ± 0,2; 2,3 ± 0,5, respectivamente (21 células, n= 3). Para 15 mM
potasio, las tasas de disminución de glucosa fueron (µM/seg): 3,6 ±0,7; 3,8 ± 0,4; 6,7 ±
1,5 para 2, 5 y 0 mM lactato, respectivamente (18 células, n= 3). Aunque estos
resultados sugieren que el lactato es capaz de modular la glicólisis en condiciones de
activación metabólica, no permiten cuantificar el grado de modulación, ni permiten
establecer cuán rápido es el efecto modulador.
4.3.2. Efecto agudo del lactato sobre la tasa glicolítica estimulada por potasio
Para cuantificar el efecto de lactato sobre la tasa glicolítica estimulada por
potasio, se diseñaron experimentos en presencia de citocalasina B. Confirmando lo
observado en estado estacionario, la figura 11 muestra que el lactato ejerce un papel
modulatorio significativo sobre la glicólisis activada por 6 mM potasio, con tasas de 1,1
± 0,2 y 1,7 ± 0,2 µM/seg en presencia y ausencia de lactato 5 mM lactato,
respectivamente (28 células analizadas, n=5), implicando un 32% de inhibición en
presencia de lactato y cuya modulación es sustancialmente menor que la observada en
condiciones basales (Fig. 9). Ahora, si observamos en detalle la figura 11 B, la
distribución de los datos sugiere que existen dos poblaciones celulares distintas, las
que se muestran separadas en la figura 11 C. Una población fue activada fuertemente
por potasio, pero resultó relativamente insensible al lactato, mientras otra población fue
insensible al potasio pero fue fuertemente modulada por lactato. Estos dos
34
Tasa
glic
olíti
ca(µ
M/s
eg)
0
1
2
3
0,1
mM
Glc
2 minutos
Lactato (mM)
0
5
6 mM K+CitoB
5 5 03 66
Lactato (mM)K+ (mM)
5 5 03 66
**
*
K+ (mM)Lactato (mM)
6 63055
Tasa
glic
olíti
ca (µ
M/s
eg)
0
1
2
3
4
5 *A. B.
C.
Figura 11. Efecto de lactato sobre la sensibilidad glicolítica ejercida por potasio 6
mM. A. Registro de una célula a la que se midió el metabolismo con 20 µM citocalasina
B primero en reposo (3 mM K+) y luego en potasio 6 mM en presencia y ausencia de
lactato 5 mM. B. Tasas metabólicas de astrocitos en presencia de lactato y potasio, las
barras horizontales representan el promedio de 28 células en 5 experimentos. C. Tasas
glicolítica promedio de astrocitos sensibles (izquierda) e insensibles (derecha) a potasio
6 mM (* p< 0,05 ANOVA). El ● corresponde a la concentración de glucosa intracelular y
las tasas glicolíticas (potasio, lactato en mM): ● 3, 5; ▪ 6, 5; ▫ 6, 0.
35
comportamientos celulares se presentaron en un mismo campo y en distintos
experimentos. El grupo sensible a potasio tuvo una tasa glicolítica (µM/seg) promedio
de 0,4 ± 0,1, que aumentó a 2,1 ± 0,3 ante 6 mM potasio y a 2,6 ± 0,2 al retirar el
lactato (12 células, n=3). El grupo insensible a potasio mostró una tasa glicólitica
(µM/seg) promedio de 0,4 ± 0,1 que se mantuvo en 0,4 ± 0,1 en presencia de potasio 6
mM, aumentando a 0,9 ± 0,2 al retirar el lactato (16 células, n=3). No se observó una
relación entre estos comportamientos y los días en cultivo de las células estudiadas. Del
grupo de 16 astrocitos insensibles a potasio 6 mM, dos comportamientos pudieron ser
discriminados (Figura 12). Doce células reaccionaron inmediatamente al retiro del
lactato y 4 células presentaron un retardo entre el retiro del lactato y el aumento de la
tasa glicolítica. El promedio del retraso observado fue de 1,46 minutos, con un rango de
1 a 2,5 minutos.
La glicólisis activada máximamente por 15 mM potasio fue también sensible al
lactato extracelular (Figura 13 A). El promedio de la tasa metabólica con lactato 5 mM
fue de 1,2 ± 0,7 µM/seg, mientras que en ausencia de lactato fue de 2,0 ± 0,8 µM/seg
(24 células, n=3), es decir, el lactato inhibió la glicólisis en un 41%, cifra similar al 32%
observado bajo estimulación moderada y sustancialmente menor al 78,5% observado
en condiciones basales. En una fracción menor de las células se observó un retardo en
la respuesta a 15 mM potasio. En la figura 14 A se muestran los datos de dos células
contiguas, una de las cuales respondió instantáneamente al potasio mientras la otra
mostró un retraso de 1,5 min. De 24 células, 5 presentaron un retardo (Figura 13 B)
con un tiempo promedio de 1,08 minutos, con un rango entre 48 segundos y 1,48
minutos. Este fenómeno no ha sido observado en numerosos experimentos
36
5 minutos
0,2
mM
Glc
CitoB6 mM K+
5
0
actato (mM)LA. B.
0
20
40
60
80
100
% c
élul
as a
ctiv
adas
por
lact
ato
sin retraso con retraso
antes después
Tasa
glic
olíti
ca (µ
M/s
eg)
*2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
C.
1 minuto
Figura 12. Sensibilización glicolítica tardía en astrocitos expuestos potasio 6 mM
en ausencia de lactato. A. Registros de 2 células que se les midió el metabolismo de
glucosa con 20 µM citocalasina B en potasio 6 mM en presencia y ausencia de lactato 5
mM. Arriba se muestra un astrocito que se activó inmediatamente tras la retirada de
lactato y abajo otra célula que se activó tardíamente. B. Porcentajes de astrocitos
activados en estas condiciones. C. Tasas glicolíticas en ausencia de lactato antes y
después del retraso (4 células, n=3). Las barras horizontales representan el promedio
de los datos. (* p< 0,05 t-student pareado). El ● corresponde a la concentración de
glucosa intracelular y las tasas glicolíticas (potasio, lactato en mM): ● 3, 5; ▪ 6, 5; ▫ 6, 0.
37
0,1
mM
Glc
2 minutos
Tasa
glic
olíti
ca (µ
M/s
eg)
-1
0
1
2
3
4
Lactato (mM)
0
5
15 mMK+
A. B.
*
CitoB
5 0Concentración de lactato (mM)
Figura 13. Efecto de lactato sobre el metabolismo de la glucosa activada por
potasio 15 mM. A. Registro temporal de la concentración de glucosa en un astrocito al
que se midió el metabolismo con 20 µM citocalasina B en potasio 15 mM en presencia y
ausencia de lactato 5 mM. B. Tasas metabólicas activadas por potasio 15 mM en
presencia y ausencia de lactato. Las barras horizontales representan el promedio de 24
células en 3 experimentos en cada tratamiento (* p< 0,05 t-student pareado). El ●
corresponde a la concentración de glucosa intracelular y las tasas glicolíticas en 15 mM
potasio (lactato en mM): ▪ 5; ▫ 0.
38
A. Lactato (mM)
0
5
15 mM K+
B.
0
20
40
60
80
100
CitoB0,
2 m
M G
lc
5 minutos
Tasa
glic
olíti
ca (µ
M/s
eg)
-1
0
1
2
3
% c
élul
as a
ctiv
adas
por
pot
asio
Con retrasoSin retraso
Des
C.
1.5 minutos
Antes pués
Figura 14. Sensibilización glicolítica tardía en astrocitos expuestos potasio 15 mM
y lactato 5 mM. A. Registros de 2 astrocitos que se les midió el metabolismo de
glucosa con 20 µM citocalasina B con potasio 15 mM en presencia y ausencia de
lactato 5 mM. Arriba se muestra un astrocito que se activó inmediatamente tras la
exposición de potasio 15 mM y abajo otro que se activó tardíamente. B. Porcentajes de
astrocitos activados glicolíticamente en estas condiciones. C. Tasas glicolíticas de
astrocitos que respondieron tardíamente al potasio 15 mM (5 células, n=1). Las barras
horizontales representan el promedio de los datos. El ● corresponde a la concentración
de glucosa intracelular y las tasas glicoliticas en 15 mM potasio (lactato en mM): ▪ 5; ▫ 0.
39
llevados a cabo en el laboratorio en presencia de 2 mM lactato. Parece posible
entonces que la mayor concentración de lactato inhiba al mecanismo de activación
desencadenado por potasio.
4.4. Mecanismos de la modulación glicolítica por lactato
Habiéndose detectado un efecto modulador del lactato sobre la glicólisis astrocitica
en condiciones de reposo y activación, se procedió a investigar los mecanismos
involucrados en esta modulación. En principio, nos planteamos tres posibles
mecanismos de inhibición glicolítica por lactato: efecto de la acidicación sobre la
fosfofructoquinasa, inhibición de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH) por deprivación de NAD+ mediada por la lactato deshidrogenasa e inhibición
por producto de la piruvato quinasa. Las siguientes secciones presentan experimentos
diseñados a distinguir entre estos posibles mecanismos.
4.4.1. Mecanismo 1: acidificación
La acidificación intracelular inhibe a la glicólisis a nivel de la fosfofructoquinasa
(Erecińska, et al, 1995; Trivedi y Danforth, 1966). Por otro lado, el transporte de lactato
hacia y desde el citosol conlleva el movimiento de un protón, el cual pudiera cambiar el
pH intracelular y de ese modo afectar la glicólisis. Como se mostró en la figura 7, el
flujo de lactato a través del transportador astrocítico causó cambios significativos en el
pH intracelular, los cuales también pueden observarse en uno de los experimentos de la
figura 15 A. Estos ensayos fueron efectuados en presencia de tampón HEPES, el cual
no penetra al espacio intracelular. Sin embargo, en presencia de bicarbonato, el cual
otorga una mayor capacidad tampón y permite el papel regulatorio del co-
40
MonensinaLactato (mM)
A.
5 minutos
0,1
u.a.
pH
0
25
*
52
0
7,40
7,35
7,25
7,20
7,15
7,30
7,35
7,30
7,25
7,20
7,15
**
*
B.
pHpH
Concentración de lactato (mM)
HEPES
Bicarbonato
Figura 15. Efecto del lactato sobre el pH intracelular en distintas condiciones
tampones. A. Registros representativos del efecto de lactato extracelular sobre el pH
intracelular en tampón HEPES (arriba) y tampón bicarbonato (abajo). Se utilizó 10 µM
monensina como control de alcalinización. B. Variación del pH intracelular en respuesta
a lactato en buffer HEPES (izquierda) (45 células, n= 3) y bicarbonato (derecha) (45
células, n= 3). Las barras representan promedio de las células analizadas. * p< 0,05
ANOVA (HEPES) y t-student pareado (bicarbonato). El ● corresponde al pH intracelular.
41
transportador sodio/bicarbonato NBC, los cambios de pH inducidos por lactato fueron
prácticamente indetectables (Fig. 15 A-B). En la figura 16 se muestra la fuerte
alcalinización intracelular causada por aumentos de potasio extracelular, fenómeno
debido a la activación del NBC (Deitmer y Szchtowsky; 1990; Pappas y Ransom, 1994).
En presencia de potasio, el lactato tampoco produjo efectos sustanciales sobre el pH
intracelular. En conclusión, el movimiento de protones a través del MCT no conlleva
cambios importantes en el pH intracelular en astrocitos bajo condición basal o
estimulada, lo que hace improbable su participación en la inhibición de la glicólisis.
4.4.2. Mecanismos 2 y 3: deprivación de NAD+ y acumulación de piruvato
En la figura 17 A se muestra como la exposición a piruvato produjo un aumento
agudo e importante de la concentración de glucosa, consistente con una disminución
aguda de la tasa glicolítica. Mediciones paralelas de pH intracelular mostraron que el
piruvato causa una disminución pequeña del pH intracelular, la que no sería suficiente
para explicar el dramático efecto sobre el metabolismo de la glucosa. El hecho de que
tanto el lactato como el piruvato inhiban la glicólisis no es compatible con un papel
modulatorio importante para el tono redox intracelular, pues mientras el lactato favorece
la disminución del NAD+, el piruvato favorece su aumento.
En conjunto, estos resultados indican que el efecto inhibitorio del lactato sobre la
glicólisis astrocítica es debido a un aumento de la concentración citosólica de piruvato,
el que de acuerdo a datos previos modularía alostéricamente a la piruvato quinasa
(Ainsworth y MacFarlane,1973), con la acumulación rio-arriba de intermediarios
glicolíticos y la consecuente inhibición por sustrato de la hexoquinasa.
42
0,
1 u.
a. p
H
10 minutos
Lactato (mM) 0
25
K+
52
0
7,7
7,6
7,4
7,5
7,2
7,6
7,3
7,4
7,5
7,7
*
pHpH
Concentración de lactato (mM)
6 mM
15 mM
A. B.
Figura 16. Durante activación por potasio el pH intracelular no es afectado por
lactato extracelular. A. Registros representativos del efecto de lactato extracelular
sobre el pH intracelular en presencia de potasio 6 mM (arriba) y 15 mM (abajo). B.
Variación del pH intracelular en respuesta a lactato de 45 células (n= 3). Las barras
horizontales representan el promedio de cada tratamiento. * p< 0,05 ANOVA (HEPES) y
t-student pareado (bicarbonato). El ● corresponde al pH intracelular.
43
A.
2
Piruvato (mM) 0
0
2
Lactato (mM)0.
2 m
M G
lc
10 minutos
Con
cent
raci
ón d
e G
luco
sa (m
M)
Lactato Piruvato
0,1
u.a
pH
5 minutos
2
0
0
2
B. *
NH4+
Piruvato (mM)
Lactato (mM)
pH
Lactato Piruvato
*
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
7,40
7,35
7,30
7,25
7,20
7,15
7,10
C. D.
Figura 17. El piruvato imita el efecto inhibitorio del lactato. A. Efecto de lactato y
piruvato en célula única sobre la concentración de glucosa en estado estacionario. B.
Concentraciones de glucosa intracelulares de 32 células (n= 3) en presencia de lactato
o piruvato 2 mM, C. Efecto de piruvato sobre el pH intracelular de un astrocito. Se usó
2,5 mM NH4Cl como control de acidificación. D. Efecto del pH intracelular por lactato y
piruvato en 43 células (n= 3). * p< 0,05 t-student pareado. Las barras representan el
promedio de los datos. Los ● y ● corresponden a la concentración de glucosa y pH
intracelular, respectivamente.
44
5. DISCUSIÓN
El principal hallazgo de esta tesis es la modulación aguda de la glicólisis
astrocitaria por lactato extracelular, fenómeno que hace del lactato una posible señal de
retroalimentación fisiológica. También se observó que el efecto modulatorio del lactato
depende del grado de activación de la glicólisis, con una mayor potencia en células en
reposo comparado con células activadas. Dado que el lactato es capaz de difundir lejos
de las zonas activas (Dienel y Cruz, 2008), esta última observación sugiere que el
lactato podría servir como señal para disminuir el metabolismo de zonas adyacentes y
de esa manera desviar glucosa hacia las zonas activas (Fig. 18).
5.1. Transporte de lactato en astrocitos
La constante de afinidad de la captación de lactato por astrocitos en nuestras
condiciones de cultivo fue de 5,4 mM, valor consistente con la presencia de la isoforma
MCT1 del transportador de monocarboxilato. Las constantes cinéticas de los
transportadores de monocarboxilato han sido medidas mediante técnicas directas (flujo
de lactato) e indirectas (flujo de protones). Con lactato radioactivo, los astrocitos de rata
en cultivo primario mostraron una Km de captación de 7,7 mM, mientras la misma
isoforma expresada en oocitos de Xenopus laevis mostró una Km de 5,6 mM (Bröer, et
al, 1997). El flujo de protones ha sido estimado con micro-electrodos de pH y con
sondas fluorescentes, lo que se hace normalmente en ausencia de bicarbonato para
reducir la capacidad de tamponamiento intracelular (Schneider, et al, 1993; Bröer, et al,
1997; Carpenter y Hapestrap, 1994; Jackson y Halestrap, 1996). En oocitos de
45
Figura 18. Modelo del efecto de lactato sobre la glicólisis de astrocitos en reposo
y estimulados por potasio. La liberación de lactato desde astrocitos activados por
potasio difunde por el instertisio cerebral, pudiendo alcanzar a astrocitos en reposo. La
presencia de lactato extracelular, permite modular la glicólisis de ambos tipos célulares,
inhibiendo sustancialmente la de aquellos en reposo más que la de astrocitos que lo
producen. Adicionalmente, el aumento de lactato provocaría la dilatación de los vasos
sanguíneos, permitiento que la glucosa fluya hasta astrocitos glicolíticamente activados,
mientras que el lactato liberado sería utilizado como sustrato energético local de las
neuronas en actividad.
46
Xenopus laevis, transfectados con cDNA del MCT1 (Bröer, et al, 1997) se midió la
variación del pH con micro-electrodos, donde se obtuvo una Km de 3,5 mM. Dado su
tamaño reducido, las mediciones en células de mamífero se efectúan normalmente con
sondas fluorescentes como el BCECF. De esta manera, la Km del MCT1 de hepatocitos
y células tumorales Ehrlich-Lettre fue estimada en 4,7 y 4,5 mM, respectivamente. En
este trabajo, La constante de afinidad de la captación de lactato por astrocitos, medida
indirectamente a través de cambios en el pH intracelular, fue de 5,4 mM, cuyo valor se
asemeja a la Km observada en la literatura para el MCT1 (4 – 8 mM) y no para el MCT4
(35 mM) ni para el MCT2 (0,7 mM).
5.2. Modulación de la glicólisis por lactato en astrocitos en reposo y activados por
potasio
Las mediciones en el estado estacionario mostraron que la exposición a lactato
extracelular aumentó la concentración de glucosa en forma dosis dependiente. Este
efecto fue más pronunciado en condiciones de reposo que bajo estimulación glicolítica.
En principio un aumento de la concentración de glucosa pudiera haberse debido a un
incremento en la capacidad de transporte, por ejemplo por una activación del
transportador de glucosa GLUT1, o a una disminución de la tasa glicolítica. Para
distinguir entre estas posibilidades, la tasa glicolítica fue determinada directamente
mediante el bloqueo del transporte de glucosa con el inhibidor citocolasina B. La tasa
glicolítica medida en presencia de 5 mM lactato fue un 79% menor que la tasa glicolítica
medida en ausencia de lactato (Figura 8 y Figura 19). Importantemente, este efecto
47
% d
e in
hibi
ción
glic
olíti
ca
0
20
40
60
80
100
3 6 15
Basal Estimulado
Concentración de potasio (mM)
**
Figura 19. Efecto de lactato sobre la inhibición glicolítica de astrocitos en reposo
y estimulados por potasio. Se muestra el porcentaje de inhibición de la glicólisis por
presencia de lactato 5 mM en astrocitos bajo condiciones de reposo (3 mM potasio) o
estimulados por potasio (6 y 15 mM). (* p<0,05 ANOVA)
48
ocurrió en el orden de segundos, lo que hace del lactato un posible modulador agudo
de la glicólisis astrocitaria.
No fue posible encontrar trabajos previos en la literatura donde se hubiese
explorado el efecto de lactato sobre la glicólisis astrocitaria. Estudios de producción de
CO2 a partir de lactato radioactivo en ganglios simpáticos aislados (Larrabee, 1995,
1996) y estudios in-vivo en humanos usando fluoro-desoxi-glucosa (Kemppainen,
2005), mostraron que el lactato inhibe el consumo de glucosa en el tejido nervioso.
Nuestros resultados sugieren que al menos parte de esa inhibición ocurriría a nivel de
los astrocitos.
En astrocitos cuya glicólisis se encontraba estimulada por potasio, el lactato
también ejerció un papel inhibitorio. Sin embargo la potencia del efecto fue menor a la
observada en células en reposo (Fig. 23). Tanto durante activación moderada y
estimulación máxima, el lactato inhibió la glicólisis solamente entre 30-40%, es decir
aproximadamente la mitad del grado de inhibición observado en células en reposo. Una
posible explicación de este resultado es que durante la estimulación glicolítica, los
astrocitos aumenten su concentración intracelular de lactato, lo que los haría menos
sensibles a variaciones del lactato extracelular. El análisis más detallado de los datos
reveló que existían dos poblaciones astrocitarias, una de las cuales era sensible a
potasio y no a lactato, mientras la otra tuvo un comportamiento opuesto. Este resultado
sugiere que existen al menos dos tipos metabólicos en los astrocitos en cultivos y
pudiera tener relación con la descripción previa de dos fenotipos astrocitarios (Lalo, et
al, 2006). La observación de una tardanza significativa en la respuesta a la retirada del
lactato observada en algunas células activadas por potasio (Fig. 12) no tiene una
49
explicación obvia. Una posibilidad es que luego de varios minutos de exposición a
potasio, que es un fuerte activador de la degradación de glicógeno en astrocitos (Hof, et
al, 1988), se acaben las reservas de glicógeno, llevando a una disminución de la
concentración de glucosa 6-fosfato con la consiguiente desinhibición de la hexoquinasa
y aumento del consumo de glucosa. Los depósitos de glicógeno son dependientes del
grado de diferenciación (Brunet et al, 2009), lo que pudiese variar entre célula y célula.
Otra posibilidad es que hubiese una modulación aguda del transportador de lactato,
como la descrita recientemente para MCT2 en neuronas expuestas a
neurotransmisores (Pierre, et al, 2009).
5.3. Mecanismos implicados en la modulación de la glucosa por lactato
extracelular
El pH es un importante modulador de la glicólisis en astrocitos (Swanson y
Benington, 1996; Bittner, 2009). La actividad de la enzima glicolítica fosfofructoquinasa
depende de la concentración de protones intracelulares, activándose a pH alcalino e
inhibiéndose a pH ácido (Erecińska, et al, 1995; Trivedi y Danforth, 1966). En el pasado
se había propuesto que los MCT podría contribuir a la acidosis intersticial (Nedergaard y
Goldman, 1993), dado el flujo de lactato desde las células gliales al extracelular llevaría
consigo el movimiento de un protón. Años más tarde, se reportó que este hecho no
implicaría un efecto neto en el pH intersticial (Chesler, 2003). Los resultados de este
trabajo, muestran que los tratamientos con lactato 2 y 5 mM afectan en el pH
astrocitario cuando se utiliza buffer HEPES en la solución, no así con el tampón
bicarbonato. Del primero se observa una acidificación durante la entrada de lactato y
50
una alcalinización en la salida, ambos con cifras significativas. En el tampón
bicarbonato no se observó una variación de pH importante. El grupo de Schneider y
colaboradores midiendo la variación de protones con un micro-electrodo de pH, donde,
al igual que en este trabajo, observaron el efecto de HEPES y bicarbonato debido a la
presencia o ausencia del lactato extracelular (Schneider, et al, 1993). En conjunto,
estos resultados indicarían que la entrada o salida de lactato a los astrocitos no tiene
implicancias en el pH intracelular en condiciones fisiológicas. Ello pudiera ser explicado
parcialmente por la presencia de un metabolón, el cual estaría compuesto por el
cotransportador sodio-bicarbonato electrogénico (NBCe1), la anhidrasa carbónica
intracelular y el transportador de monocarboxilato 1, los cuales participarían,
directamente en la regulación del pH astrocitario (Becker, et al, 2005; Becker y Deitmer,
2007).
El efecto del pH intracelular por variaciones de lactato tampoco se vio afectado
en presencia de potasio 6 y 15 mM. A pesar que el pH extracelular no pudo ser medido,
se ha reportado que el aumento de potasio genera una acidificación aguda que puede
ser reversible cuando potasio vuelve a concentraciones basales o cuando se utiliza un
inhibidor de la glicólisis (Krag, et al, 1983). Estos hechos en conjunto sugerirían que la
acidificación podría deberse al aumento de lactato en el extracelular, sin embargo, el
uso de inhibidores de la bomba Na+/K+ ATPasa, mediador importante de la activación
glicolítica por potasio alto, no podría cesar la acidificación (Grichtchenko y Chesler,
1994; Krag, et al, 1983). Uso de inhibidores de la anhidrasa carbónica, podrían revertir
la acidificación en el extracelular debido a potasio alto (Krag, et al, 1983) dada su
importante participación en la regulación del pH extracelular (Chesler, 2003).
51
Para identificar el mecanismo de acción del lactato sobre la glicólisis astrocitaria,
se investigó la posible participación del ciclo del NAD+/NADH. Para dilucidar esto, se
utilizó la molécula piruvato dado que puede entrar a la célula por el MCT y no requiere
usar NAD+ para participar en la glicólisis. Si piruvato no cambiaba la concentración de
glucosa entonces el efecto de inhibición por el ciclo NAD+/NADH estaría descartado.
Fascinantemente, piruvato pudo aumentar la glucosa astrocitaria, hecho que implicaba
el aumento de intermediarios de la glicólisis. Se concluye que el lactato afectaría la
glicólisis no por un efecto sobre el pH ni el tono redox, sino probablemente por un
aumento del piruvato intracelular con la consiguiente inhibición por producto de la
piruvato quinasa.
52
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65
7. ANEXO
7.1. Calibración del sensor de hexosas por trans-aceleración
La trans-aceleración es el aumento de la tasa de transporte de un sustrato
debido a la presencia de otro (Barros, et al, 2007). En la figura A1 A el sitio activo del
transportador se puede encontrar dispuesto hacia el espacio extracelular (Te) o hacia al
intracelular (Ti). Por ejemplo, el transporte de glucosa sucede en 4 etapas y
dependiendo de la energía de activación de GLUT1 por la presencia o ausencia del
sustrato podremos encontrar los estados conformacionales de la proteína en Te o Ti. La
unión de glucosa a GLUT1 en la superficie externa tiene una alta energía de activación,
generando una inmediata disposición de la proteína hacia la superficie intracelular, este
efecto lleva consigo la disminución de la energía por afinidad al azúcar y su respectiva
liberación. Cuando el transportador no tiene unido la glucosa la energía de activación es
muy baja, por lo que la reversibilidad de GLUT1 a la superficie extracelular es muy
lenta.
Se sabe que GLUT1 presenta una mayor afinidad por glucosa que por galactosa.
En la figura A1 B se muestra que luego de la liberación de glucosa, el transportador
puede unir la galactosa presente en el citoplasma celular. Este fenómeno permite una
rápida y eficiente reversibilidad del transportador a la superficie extracelular. La trans-
aceleración que se presenta aquí, fue la estrategia que se utilizó, para que durante la
calibración del sensor el transporte de glucosa o galactosa no sea una limitante al
momento de determinar los parámetros cinéticos del sensor.
66
A.
B.
IntracelularExtracelular Extracelular Intracelular
Figura A1. Modelo de trans-aceleración de GLUT1. A. La glucosa (●) es
transportada rápidamente por GLUT1, sin embargo, la reversibilidad del transportador
desde la superficie intracelular a la extracelular posee una energía de activación muy
baja B. Luego de transportar la glucosa al citoplasma celular, la reversibilidad del
transportador puede ser muy eficiente si un azúcar de menor afinidad que glucosa (●)
se une al sitio activo. La trans-aceleración fue la estrategia experimental usada en este
trabajo para realizar la calibración del sensor de hexosas FLII12Pglu600µΔ6 en
astrocitos de cultivo.
67
7.2. Efecto del lactato y el piruvato en el sensor de hexosas FLII12Pglu600µΔ6
En este trabajo, se utiliza un sensor de hexosas FRET que permite medir
variaciones de la glucosa intracelular dada por cambios en el metabolismo o transporte
de la glucosa. Este nanosensor, puede interactúar con diversas moléculas
intracelulares, tales como azúcares o iones intracelulares (protones y calcio). Con estos
antecedentes, se investigó si el lactato y el piruvato generan artefactos en la señal de
fluorescencia del sensor, utilizando para ello la ausencia o presencia de galactosa, un
azúcar no metabolizable en astrocitos (Wiesinger, et al, 1997). En la figura A2, se
muestra que la presencia de lactato y piruvato pueden aumentar la concentración de
glucosa en estado estacionario, mientras que en presencia y ausencia de galactosa, no
se observa ninguna variación de la señal de fluorescencia del sensor.
7.3. Medición de lactato liberado desde astrocitos
Durante actividad sináptica, el potasio es liberado desde el terminal post-
sináptico neuronal (Holthoff y Witte, 2000). Estudios en nuestro laboratorio demuestran
que el aumento de potasio en el espacio extracelular promueve una activación aguda
de la glicólisis en astrocitos (Bittner, 2009). Nosotros proponemos que dicha activación
del metabolismo de la glucosa es capaz de generar un aumento agudo en la producción
de lactato. Para validar esta hipótesis, nos propusimos medir el lactato liberado desde
los astrocitos con una técnica de alta sensibilidad.
Se planteó realizar el experimento en cultivos primarios de astrocitos confluentes
cultivados sobre una superficie de plástico. Experimentalmente, dichos astrocitos serían
expuestos a dos tipos de soluciones de 3 y 15 mM potasio. El experimento ideal,
68
43
0/51
2 no
rmal
izad
o
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
30 minutos
2
Piruvato (mM)0
0
2
Lactato (mM)Galactosa
Glucosa
Figura A2. Efecto lactato y piruvato en el sensor de hexosas FLII12Pglu600µΔ6.
Para verificar si lactato o piruvato ejercen un artefacto sobre la señal de fluorescencia,
se realizaron controles en presencia y ausencia de glucosa y galactosa. La - representa
la razón normalizada entre la fluorescencia de la señal citrine FRET y de la citrine
directa (430/512).
69
consiste en exponer las células durante 30 segundos a cada una de estas condiciones,
para luego colectar y filtrar el sobrenandante, el cual sería utilizado para medir el lactato
liberado mediante la técnica de HPLC.
El primer ejercicio fue estimar las concentraciones de lactato teorico esperado de
astrocitos expuestos a condiciones de reposo (3 mM potasio), donde se realizó el
siguiente supuesto matemático.
1.- Si la tasa glicolítica astrocitaria a 22ºC es de 1 µM/seg, entonces en 1 Litro tenemos
1 µmol/seg
2.- Si en un pocillo de 35 mm hay 106 células, y cada una tiene un volumen de 1 pL, por
lo tanto, tenemos que en un posillo hay 1 µL de células.
3.- Si en 1 Litro tenemos 1 µmol/seg, entonces en un posillo tenemos 1 pmol/seg de
consumo de glucosa, y por lo tanto tenemos una producción de 2 pmol/seg de lactato.
4.- Si en un litro hay 2 pM de lactato entonces, ¿Cuál es la mejor condición para
obtener una concentración más alta de lactato? En la tabla 1 se muestran las
concentraciones esperadas de lactato en el sobrenadante a volúmenes y tiempos de
exposición.
Finalmente, nos propusimos hacer una aproximación del lactato liberado durante
exposición de potasio 15 mM, donde la tasa de consumo de glucosa en estas
condiciones es de 3,7 µM/seg. En la tabla 1 se muestra un resumen de las condiciones
con potasio 15 mM a estudiar.
70
Tabla 1. Concentraciones de lactato teórico presente en el sobrenadante a 3 y 15
mM potasio. Se muestran los datos calculados de las concentraciones de lactato a
distintos tiempos de estimulación y distintos volúmenes de sobrenadante. Para la tasa
glicolítica en 3 mM potasio, 1 µM/seg y para 15 mM potasio, 3,7 µM/seg. Ambos
experimentos a una temperatura ambiente de 22ºC.
Lactato esperado (nM)
Potasio extracelular (mM)
Tiempo de exposición (seg)
1 mL
0,5 mL
0,1 mL
3 mM
1
30
100
300
2
60
200
600
4
240
800
2.400
20
600
2.000
6.000
15 mM
1
30
100
300
7.4
222
740
2.220
14.8
888
2.738
8.880
74
2.220
7.400
22.200
71
7.3.1. Sensibilidad del HPLC por lactato
La técnica de cromatografía líquida de alta eficacia, es ampliamente utilizada en
diversas áreas de ámbito clínico, forense, industrial e investigación, ya que permite
detectar bajas concentraciones de analito en muestras biológicas. Dada la sensibilidad
de esta estrategia, nos propusimos evaluar la sensibilidad de la técnica por lactato,
mediante una curva de calibración. Para esta determinación se utilizó una columna C18
apolar y una fase móvil polar H2SO4, en condiciones isocráticas. En la figura A3 se
muestra la curva de calibración obtenida para lactato de sodio bajo estas condiciones.
Posteriormente, se midieron sustancias como glucosa y tampón HEPES, que
debian estar presentes en las muestras problema. Sorpresivamente, el buffer HEPES
fue detectado en el mismo tiempo de elución del lactato, razón por la que se elimino de
la solución KRH. En la figura A4 se muestra el retiro del tampón no afecta a la
activación glicolítica de astrocitos cultivados sobre una superficie de plástico.
En el pasado, el lactato ha sido detectado enzimáticamente en ensayos con
potasio 60 mM (Walz y Mukerji, 1988), estimulo que probablemente se deba a la
activación de la vía glucogenolítica por exposición a potasio durante 1 hora. En este
trabajo se propuso diseñar un método sensible a lactato, con el fin de medir su
concentración durante estímulos en el rango de segundos por potasio 15 mM. Si bien la
técnica de HPLC es ampliamente utilizada en la industria, resulta no ser lo
suficientemente sensible para la medir el lactato teórico esperado de astrocitos en
reposo y activados por potasio. La concentración 5,12 µM lactato fue el valor mínimo
detectado por esta técnica y si bien el valor esperado en la exposición máxima por
potasio fue de 22 µM, esta condición se aleja del objetivo de este planteamiento.
72
Concentración de Lactato (mM)0 20 40 60 80
Áre
a (e
+7)
Concentración de Lactato (mM)0 1 2 3
Área
(e+6
)
5
4
3
2
1
1.2
2.4
3.6
A. B.
Figura A3. Sensibilidad del método HPLC por el lactato. A. Se muestran los valores
de área bajo la curva del pico de elución, donde se utilizaron concentraciones de lactato
80, 3,2; 0,128 y 0,00512 mM. B. La figura pequeña muestra una ampliación de zona de
mayor sensibilidad en A. En A y B la flecha negra muestra la concentración de lactato
0,128 mM.
73
0.1
mM
5 minutos
15 mM K+1mM Glucosa
Figura A4. Activación glicolítica por potasio 15 mM en astrocitos cultivados sobre
superficies de plástico. Registro de una célula expuesta a potasio 15 mM (▫). El
buffer KRH bicarbonato no contiene tampón HEPES y el experimento se realizó en
ausencia de lactato. El ● corresponde a la concentración de glucosa intracelular
74
A pesar de ésto, las condiciones utilizadas aquí podrían ser mejoradas, ya que
las variables tales como: el tiempo de retención, temperatura, pH, hidrofobicidad del
compuesto, características la fase estacionaria y fase móvil, son factores posibles de
modificar para mejorar la sensibilidad de detección.
• Para permitir una fuerte interacción del lactato con la silica, el pH de la fase
móvil debiera ser igual al pKa del lactato, ya que una molécula apolar tiene más
oportunidades de interaccionar con la fase estacionaria. Adicionalmente, se
utilizaría un tampón de fosfato de sodio (50 mM) ya que se sabe, que las
moléculas de fosfato pueden actúar como contranión neutralizando cualquier
carga expuesta de la silica o del lactato.
• Debido a que la superficie de interacción silica-lactato es reducida, proponemos
utilizar una molécula que permita aumentar la entropía de esta interacción. La
molécula a usar sería el tetrabutil de amonio (5mM) y se encontraría presente en
la fase móvil de este ensayo.
Si aún estas condiciones no fueran suficientes paramejorar la detección del
lactato, entonces deberíamos utilizar otros métodos de alta resolución temporal.
Parpura V. y colaboradores han desarrollado una forma de medir el glutamato liberado
desde las neuronas, donde la metodología enzimática a utilizar podía ser monitoreado
ópticamente (Hua, et al, 2004; Malarkey, et al, 2008). Ahora, basándonos en nuestro
objetivo, la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) quien convierte el lactato liberado
desde los astrocitos a piruvato, utiliza β nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) para
75
reducir a NADH, un producto fluorescente que se posible de ser excitado con luz UV.
Se espera que el aumento de potasio en el extracelular, aumente los niveles de lactato
extracelular por un aumento proporcional del NADH, que sería detectado ópticamente.
