EFEITO DA DISLIPIDEMIA SOBRE A CAPACIDADE DE ...Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. RESUMO A dislipidemia é geralmente caracterizada pela presença

Universidade de São Paulo

Faculdade de odontologia de Ribeirão Preto

Priscila Cristina de Paula

EFEITO DA DISLIPIDEMIA SOBRE A CAPACIDADE DE

DEFESA – ESTUDO EXPERIMENTAL

Ribeirão Preto

2013

I n t r o d u ç ã o | 2


EFEITO DA DISLIPIDEMIA SOBRE A CAPACIDADE DE

DEFESA – ESTUDO EXPERIMENTAL

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP, como parte dos requisitos para obtenção do titulo de mestre em Biologia Oral.

Orientadora: Profa. Dra. Marilena Chinali Komesu

Versão Corrigida

Ribeirão Preto

2013


Autorizo a reprodução e divulgação do teor total ou parcial deste trabalho por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada à fonte.

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central do Campus USP - Ribeirão Preto

De Paula, Priscila Cristina

Efeito da dislipidemia sobre a capacidade de defesa– estudo experimental. Ribeirão Preto, 2013.

94 p. : il. ; 30cm

Versão corrigida da Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto/USP. Área de Concentração: Biologia Oral. A versão original se encontra disponível na Biblioteca da Unidade sede do Programa.

Orientadora: Komesu, Marilena Chinali

1. Dislipidemia. 2. Colesterol. 3. Doença periodontal.


FOLHA DE APROVAÇÃO


Efeito da dislipidemia sobre a capacidade de defesa – estudo experimental

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre.

Área de Concentração: Biologia Oral

Aprovado em: ____/____/2013

Banca Examinadora:

1) Prof.(a). Dr.(a).: _________________________________________________________

Instituição: ________________________________________________________________

Julgamento: __________________Assinatura: ___________________________________

2) Prof.(a). Dr.(a).: _________________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________________

Julgamento: __________________Assinatura: ___________________________________

3) Prof.(a). Dr.(a).: _________________________________________________________

Instituição: ________________________________________________________________

Julgamento: _________________Assinatura: _____________________________________


Dedicatória


Dedico a meus pais, Mário e Cidinha que renunciaram muitos

sonhos para possibilitar a mim os caminhos do conhecimento.

A minha irmã Natália, pelo incentivo, paciência, e por seus

ensinamentos. Sua ajuda foi fundamental para realização desse

trabalho.

Ao meu noivo Wesley, por sua compreensão, por suas palavras

que sempre me confortaram nos momentos difíceis.

Vocês são muito importantes para mim, amo vocês!!


Agradecimentos


A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força

interior para superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas

incertas e me suprir em todas as minhas necessidades.

À Profa. Dra. Marilena Chinali Komesu, por me conceder a

oportunidade de realizar este trabalho sob sua orientação, pela

paciência e seus ensinamentos que contribuíram para meu aprendizado.

Ao Programa de Pós-graduação em Reabilitação Oral da

Faculdade de odontologia de Ribeirão Preto, e seus docentes, pela

oportunidade e ensinamentos que contribuíram para minha formação.

Aos técnicos Edna, Gilberto e Kleber, que ao longo desses dois

anos tornaram-se grandes amigos.

À técnica Adriana pela ajuda na realização da parte

experimental.

Ao Prof. Dr. Osvaldo de Freitas por ceder o espaço de seu

laboratório para realização de parte desse trabalho.

Aos amigos e companheiros de laboratório Alan e Cristiano, pelos

ensinamentos e pela ajuda nos experimentos.

A todos os colegas do curso de Pós-Graduação em Reabilitação

Oral, pela amizade e companheirismo.


À CAPES, que contribuiu financeiramente para a realização

desse trabalho.


Epígrafe


Esforça-te, e tem bom ânimo; não temas, nem te espantes, porque o Senhor, teu Deus, é contigo por onde quer que andares.

Josué 1:9


Resumo


De Paula, PC. Efeito da dislipidemia sobre a capacidade de defesa – estudo experimental. Ribeirão Preto, 2013. 94pp. Dissertação (Mestrado pelo Programa: Reabilitação Oral- Área de concentração: Biologia Oral). Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.

RESUMO

A dislipidemia é geralmente caracterizada pela presença de níveis alterados e/ou elevados de colesterol total plasmático, LDL, triglicerídeos e de HDL. Em muitos casos, a dislipidemia está também associada à obesidade, embora o indivíduo possa apresentar alterações de colesterol sem ser obeso. São encontrados na literatura trabalhos clínicos que mostram uma clara relação entre doença periodontal e dislipidemia, sendo essa relação também demonstrada em outras situações de inflamação e infecção. No entanto, embora existam sugestões de que a relação inversa também possa ser verdade, algumas limitações observadas nos estudos não nos permitem assegurar que a doença sistêmica (dislipidemia) poderia estar alterando a resposta inflamatória (doença periodontal). Sendo assim o objetivo do presente trabalho foi avaliar o comportamento do epitélio gengival e a resposta inflamatória em ratos wistar, em condição de dislipidemia experimental. A dislipidemia foi induzida pela adição de colesterol à ração dos animais, e a inflamação local induzida por aplicação de LPS (lipopolissacarídeo bacteriano- E. coli). Foram avaliados fatores locais (infiltrado inflamatório na região gengival) e aspectos sistêmicos (níveis séricos de mediadores da resposta inflamatória IL-6, IL-1β e TNF-α, e proteínas envolvidas na regulação da resposta inflamatória: SLPI e leptina). Nos animais com dislipidemia os resultados da análise histológica mostraram um aumento dos parâmetros inflamatórios (edema, infiltrado inflamatório, pavimentação leucocitária e hiperemia), principalmente na 4°semana de aplicação do LPS. As citocinas analisadas e a leptina, moléculas pró-inflamatórias, estavam mais elevadas nos animais com dislipidemia, já o SLPI, envolvido na redução do dano causado pela inflamação, estava reduzida nesses animais em relação aos animais sem dislipidemia que também receberam aplicações de LPS. Diante de nossos resultados, concluímos que a dislipidemia pode alterar a resposta inflamatória à infecção. Palavra Chave: dislipidemia, doença periodontal, colesterol.


Abstract


De Paula, PC. Effect of dyslipidemia on defense capability- experimental study. Ribeirão Preto, 2013. 94pp. Dissertação (Mestrado pelo Programa: Reabilitação Oral- Área de concentração: Biologia Oral). Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.

ABSTRACT

Dyslipidemia is characterized by elevated or altered levels of plasma total cholesterol, LDL, HDL and triglycerides. In many cases, dyslipidemia is associated with obesity, although individuals may present altered levels of cholesterol without being obese. Studies have shown an interrelationship between periodontal disease and dyslipidemia. There are, in the literature studies showing a clear relationship between periodontal disease and dyslipidemia, which is also demonstrated in other situations of inflammation and infection. However, although there are suggestions that the inverse relationship can also be true, some limitations observed in the studies did not allow us to ensure that systemic alteration (dyslipidemia) could be influencing the inflammatory response (periodontal disease). Therefore, the objective of this study was to evaluate the behavior of the gingival epithelium and inflammatory response in wistar rats under conditions of experimental dyslipidemia. Dyslipidemia was induced by increasing the amount of cholesterol in the diet of animals, and local inflammation was induced by the application of LPS (E-coli lipopolissacarídeo). We assessed local factors (inflammatory infiltrate in the gingival area), and systemic aspects (inflammatory mediators levels as IL-6, IL-1β and TNF-α) and the plasma levels of proteins involved in the regulation of inflammatory response (SLPI and leptin). In animals with dyslipidemia histopathological analysis showed an increased level of inflammatory parameters (edema, inflammatory infiltrate, leukocyte margination and hyperemia), particularly in the 4th week after LPS application. Cytokines and leptin presented higher plasma levels in animals with dyslipidemia, but SLPI, considered a molecule involved in tissue protection, mostly in situations of inflammation or infection, was reduced in these animals compared to their controls. Our results allow us to conclude that dyslipidemia may alter the inflammatory response to infection. Keywords: dyslipidemia, periodontal disease, cholesterol


Sumário


Sumário

1.1 Introdução .................................................................................................. 22

1.2 Doença Periodontal ....................................................................................... 25

1.3 Doença Periodontal e Dislipidemia ............................................................... 28

2. Proposição ....................................................................................................... 35

2.1 Objetivos Gerais ............................................................................................. 35

2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 35

3. Material e Método .......................................................................................... 37

3.1 Animais .......................................................................................................... 37

3.2 Preparação da ração com acréscimo de colesterol ........................................ 37

3.3 Indução da Inflamação Gengival ................................................................... 38

3.4 Protocolos Experimentais .............................................................................. 38

3.5 Coleta de amostras ......................................................................................... 39

3.6 Quantificação de lipídios e lipoproteínas ....................................................... 40

3.7 Técnica Histológica ........................................................................................ 41

3.8 Análises laboratoriais .................................................................................... 44

3.8.1 Elisa Indireto ................................................................................................. 45

3.8.2 Elisa Sanduíche ......................................................................................... 47

3.9 Análise Estatística ........................................................................................ 49

4. Resultados ....................................................................................................... 51

4.1 Avaliação do peso dos animais ....................................................................... 51

4.2 Avaliação dos lipídios .................................................................................. 52

4.3 Avaliação dos lipídios durante a indução da infecção ................................... 54

4.4 Análise Histopatológica .................................................................................. 58

4.5 Avaliação dos mediadores inflamatórios ....................................................... 60

4.5.1 IL-1β .......................................................................................................... 60


4.5.2 IL-6 ............................................................................................................. 61

4.5.3TNF-α .......................................................................................................... 61

4.5.4 SLPI ............................................................................................................ 62

4.5.5 Leptina ....................................................................................................... 63

5.0 Discussão ...................................................................................................... 66

6.0 Conclusão ....................................................................................................... 76

7.0 Referências Bibliográficas .......................................................................... 78

8.0 Anexo .............................................................................................................. 94


Lista de figuras


Lista de Figuras

Figura 1 - Estrutura da lipoproteína ............................................................................. 24

Figura 2 - Apresentação histopatológica do tecido gengival saudável ........................ 42

Figura 3 - Apresentação histopatológica do tecido gengival com inflamação ............ 43

Figura 4 - Parâmetros inflamatórios ............................................................................ 44

Figura 5 - Controle de Peso ......................................................................................... 51

Figura 6 - Quantificação de LDL e HDL ..................................................................... 52

Figura 7 - Quantificação do colesterol total, triglicérides e VLDL ............................. 53

Figura 8 - Quantificação de HDL durante inflamação ................................................ 54

Figura 9 - Quantificação de LDL durante inflamação ................................................. 55

Figura 10 - Quantificação de Colesterol Total durante inflamação ............................. 56

Figura 11 - Quantificação de VLDL durante a inflamação ......................................... 57

Figura 12 - Quantificação de triglicérides durante inflamação .................................... 57

Figura 13 - Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região posterior .. 58

Figura 14 - Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região anterior .... 59

Figura 15 - Quantificação de IL-1β .............................................................................. 60

Figura 16 - Quantificação de IL-6 ................................................................................ 61

Figura 17 - Quantificação de TNF-α ........................................................................... 62

Figura 18 - Quantificação de SLPI .............................................................................. 63

Figura 19 - Quantificação de Leptina .............................................................................. 64


Introdução


1. Introdução

Desde a década passada o sobrepeso e a obesidade têm crescido a proporções 1

pandêmicas, afetando principalmente os países desenvolvidos (Sowers et al., 2011). Esse 2

fato se mostra associado à diminuição da atividade física somado ao desbalanço alimentar, 3

o que faz com que a prevalência da obesidade esteja tornando-se uma ameaça à saúde 4

pública (Wang e Peng, 2011; de Alcântara et al., 2012) . 5

No Brasil o excesso de peso e a obesidade aumentaram nos últimos seis anos 6

segundo levantamento realizado pelo Ministério da Saúde. De acordo com o estudo, a 7

proporção de pessoas acima do peso no Brasil avançou de 42,7%, em 2006, para 48,5%, 8

em 2011. No mesmo período, o percentual de obesos subiu de 11,4% para 15,8% 9

(Ministério da Saúde, 2012). 10

O acúmulo de tecido adiposo é um fator de risco para muitas doenças crônicas, e 11

está intimamente ligado à síndrome metabólica que é caracterizada por um grupo de 12

alterações, incluindo a resistência à insulina, hipertensão e a dislipidemia, que 13

compreendem os principais fatores de risco para diabetes tipo II, doenças cardiovasculares 14

e cerebrovasculares (Nesbitt et al., 2010; Wang et al., 2011; Gray et al., 2011). 15

A dislipidemia é caracterizada pela presença de níveis elevados ou anormais 16

de lipídios e/ou lipoproteínas no sangue (Scardina et al., 2011; Siasos et al., 2011). 17

Embora ainda não esteja clara a proporção de indivíduos obesos que desenvolva a 18

dislipidemia, essa alteração é considerada a mais importante comparada a outras 19

manifestações presentes na obesidade (Wang e Peng, 2011). 20

Apesar da estreita ligação entre obesidade e dislipidemia, alguns indivíduos 21

obesos não desenvolve essa alteração metabólica (Goossens e Blaak, 2012), e também nem 22

Introdução


todos os indivíduos com dislipidemia são obesos, demonstrando que a associação 1

obesidade e dislipidemia não é obrigatória (De Alcântara Neto et al., 2012). A 2

susceptibilidade ao desenvolvimento da dislipidemia esta relacionada à prática de maus 3

hábitos alimentares (De Alcântara Neto et al., 2012), exceto em indivíduos que sofrem da 4

má absorção do colesterol devido a alterações genéticas - hipercolesterolemia familiar. 5

Hipercolesterolemia Familiar é uma patologia de origem genética, autossômica 6

dominante (forma mais grave). É caracterizada essencialmente, pelo aumento dos níveis 7

plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), devido à deficiência na depuração 8

dessa lipoproteína, por possuir alteração genética nos receptores ou na própria estrutura das 9

apoproteínas que compõem a membrana da LDL (Futema et al., 2012). 10

Embora o colesterol em excesso seja visto como um vilão para a saúde, a presença 11

equilibrada dessa molécula é vital para o organismo, pois constitui a peça fundamental para 12

a produção de vários hormônios, para síntese de sais biliares, vitamina D, além de fazer 13

parte da estrutura da membrana celular (da silva et al., 2007 ). 14

Grande parte do colesterol que o indivíduo necessita é sintetizada pelo próprio 15

organismo, sendo necessário obter apenas uma pequena quantidade pela alimentação 16

(Lupattelli et al., 2012). 17

Por ser uma molécula hidrofóbica, o colesterol é transportado pelo sangue através 18

de lipoproteínas, que são associações de lipídios e proteínas. A lipoproteína possui um 19

núcleo hidrofóbico formado pelo colesterol esterificado e por triacilgliceróis, envolvido 20

por uma monocamada de fosfolipídios (organizados com a parte polar voltada para o meio 21

aquoso e a parte apolar para o interior), de proteínas denominadas apoproteínas, e pelo 22

colesterol livre, que por ser uma molécula anfipática encontra-se entre os fosfolípides da 23

monocamada (Siasos et al., 2011). 24

Introdução


Figura1- Estrutura da lipoproteína. (Imagem extraída do site: http://biocolesterol.blogspot.com.br/2010_11_01_archive.html#).

As lipoproteínas são classificadas de acordo com sua densidade, e são conhecidas pelas 1

siglas em inglês: HDL (High Density Lypoprotein- lipoproteína de alta densidade), LDL (Low 2

Density Lypoprotein- lipoproteína de baixa densidade), IDL (Intermediate Density 3

Lipoprotein- lipoproteína de densidade intermediária), VLDL (Very Low Density Lypoprotein - 4

muito baixa densidade), e os quilomicros (molécula que possui menor densidade, comparada 5

com as demais lipoproteínas) (Gowdy et al., 2012). 6

A dislipidemia é caracterizada por uma alteração da quantidade de lipídios circulantes 7

no sangue, que incluem o aumento de colesterol total, triglicerídeos, LDL e diminuição de 8

HDL (Gowdy et al., 2012). 9

Valores de colesterol total acima de 200 mg/dl têm sido repetidamente correlacionado 10

ao desenvolvimento de doenças vasculares periféricas e coronarianas (Sangwan et al., 2013). E 11

o elevado nível de LDL plasmático pode levar ao desenvolvimento da aterosclerose (Katz et 12

al., 2002). 13

Introdução


Estudos também mostram que o HDL poderia exercer efeitos diversos que vão além 1

do transporte reverso do colesterol, incluindo propriedades anti-inflamatórias, anti-oxidativas e 2

anticoagulante. (Haas e Mooradian, 2011; G et al., 2011 ). 3

Os sinais e sintomas clínicos do aumento de colesterol aparecem geralmente na vida 4

adulta, embora já se saiba que as lipoproteínas podem estar aumentadas no plasma desde a 5

infância ou adolescência. Apesar de subclínico, o aumento de colesterol pode atuar como um 6

fator de risco para processos patológicos, e hoje se aconselha a prevenção dessa alteração em 7

crianças com tendência a obesidade, hipercolesterolemia ou hipertrigliceridemia (Raitakari et 8

al., 2003; Li et al., 2004; Peebles, 2008, Avis et al., 2009; Zappalla e Gidding, 2009). 9

Atualmente, a relação entre os níveis de colesterol e a inflamação tornou-se foco de 10

estudo em vários trabalhos (Feingold et. al., 1992; Sattar et al., 2003; Toms et al., 2010; 11

Sangwan et al., 2013). Pesquisadores observaram que pacientes portadores de doenças 12

inflamatórias, entre elas artrite reumatóide e doença periodontal possuíam elevadas taxas de 13

colesterol e seus derivados (exceto HDL) (Toms et al., 2011; Nisar et al., 2012). 14

1.1. Doença Periodontal

A doença periodontal é uma doença inflamatória crônica, caracterizada por uma 15

resposta de tipo Th1 (Katz et al., 2002), é considerada uma das infecções crônicas mais 16

frequentes em seres humanos, que acomete os tecidos gengivais e a estrutura de suporte dos 17

dentes, podendo levar a perda do elemento dental (Ekuni et al., 2005; Pussinen et. al., 2007; 18

Andriankaja et al., 2010) . Atualmente é classificada levando em consideração medidas 19

clínicas, incluindo a presença e gravidade de bolsas periodontais, perda de inserção clínica, e a 20

extensão da perda óssea alveolar (Kretschmar et al. 2012). 21

Introdução


As principais bactérias associadas com o início da doença periodontal são 1

predominantemente bactérias gram-negativas anaeróbias e espiroquetas, entre elas 2

Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia e 3

Treponema denticola (Kretschmar et al., 2012; Laugisch et al., 2012) . 4

Embora as bactérias orais, toxinas, enzimas e metabolitos sejam os principais fatores 5

causais do início do processo inflamatório, a resposta inflamatória do hospedeiro também é 6

importante, principalmente na progressão da doença (Ozdemir et al., 2012). Apesar de ser uma 7

inflamação do tecido bucal, a doença periodontal pode provocar inúmeras alterações sistêmicas 8

(Iacopino e Cutler, 2000). 9

Tomofuji, et al. (2006) concluíram que a doença periodontal pode causar danos 10

celulares em estruturas distantes como cérebro, coração e rins devido a liberação de espécies 11

oxigênio-reativas levando à peroxidação dos lipídios da membrana celular. 12

Vários mediadores inflamatórios são liberados na doença periodontal, entre eles as 13

citocinas, que são pequenas proteínas solúveis produzidas pelas células. Esses mediadores 14

desempenham um papel importante em numerosas funções biológicas, incluindo a regulação 15

da resposta inflamatória e imunológica (Callard et al.,1999; Mattuella et al., 2012). 16

As citocinas pró-inflamatórias, tais como interleucina 1 beta (IL-1β), interleucina 6 17

(IL-6) e Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) desempenham um papel importante na 18

patogênese da doença periodontal (Monteiro et al., 2009). Essas citocinas possuem papeis que 19

se interligam no processo inflamatório. A IL-1β influencia mais de 90 genes, tais como genes 20

de outras citocinas (TNF-α e IL-6), receptores de citocinas, reagentes de fase aguda, fatores de 21

crescimento, enzimas de remodelação de tecidos, genes que transcrevem componentes da 22

matriz extracelular e moléculas de adesão (Boch et al., 2001; Wei et al., 2004). 23

IL-1β é um dos ativadores celulares mais potentes e multifuncionais. É produzida 24

principalmente por monócitos / macrófagos, células NK (natural killer) e células B, além de 25

outras células, tais como fibroblastos, queratinócitos e células endoteliais, que também podem 26

Introdução


produzir essa citocina após estimulação. A atividade biológica da IL-1β é extremamente 1

diversa, com foco sobre a ativação de proteínas de fase aguda, prostaglandinas, outras 2

citocinas, a indução da síntese de colágeno e colagenase e reabsorção óssea (Mengel et al., 3

2002). 4

TNF-α age no processo de migração de células de defesa, induzindo a expressão de 5

moléculas de adesão e de citocinas, entre elas IL-1β e IL-6, que são citocinas quimiotáticas 6

envolvidas na migração de células para locais de infecção e inflamação, além disso, promove 7

reabsorção de osso alveolar e perda de inserção de tecido conjuntivo na doença periodontal 8

(Kindle et al., 2006; Kim, 2010). 9

A IL-6, um polipeptídio de pequeno tamanho, aproximadamente 26 KDa (Kilodalton), 10

foi originalmente identificado como um fator diferenciador das células B, mas é hoje 11

reconhecido como uma citocina multifuncional que está associada à regulação da resposta 12

imunológica, hematopoiese e resposta inflamatória (Kishimoto, 2010; Mihara et al., 2012; 13

Nibali et al.,2012; Smolen et al., 2012). 14

A IL-6 é produzida por uma variedade de células, tais como monócitos, fibroblastos, 15

osteoblastos, e células vasculares endoteliais, em resposta aos agentes inflamatórios (Souza et 16

al. 2008), sendo por isso um importante marcador inflamatório. Atua tanto na resposta imune 17

inata como na adaptativa, e estimula a síntese de proteínas de fase aguda, como a proteína C-18

reativa (Tonet et al., 2008). 19

A atividade da IL-6 no processo inflamatório é considerada complexa, uma vez que atua 20

como citocina pró-inflamatória (estimulando a produção de proteínas da fase aguda, induzindo 21

a febre e a angiogênese) e também como citocina anti-inflamatória (diminuindo o recrutamento 22

de neutrófilos) (Crosntein, 2007). 23

A IL-6 é considerada uma citocina de transição entre as fases aguda e crônica da 24

inflamação, ou até mesmo uma citocina de transição entre a resposta imunológica inata e 25

adquirida (Xing et al., 1998; Jones, 2005). Altos níveis de IL-6 podem ser observados em 26

Introdução


muitas doenças inflamatórias crônicas e mesmo em doenças auto-imunes (Wong et al., 2006; 1

Rose-John et al., 2006; Mihara et al., 2012). 2

Estudos mostram aumento de IL-6 associado ao desenvolvimento de doença periodontal 3

crônica, perda de ligamento periodontal e do osso alveolar (Nibali et al., 2012). 4

1.2. Doença Periodontal e Dislipidemia

Vários estudos apontam para uma relação positiva entre a doença periodontal e os níveis 5

plasmáticos de colesterol total, LDL e triglicérides. Muitos desses estudos sugerem que a 6

doença periodontal seria um fator de risco para a dislipidemia (Memon et al., 1993; Doxey et 7

al.,1998). 8

A liberação de citocinas no processo inflamatório parece alterar o metabolismo dos 9

lipídios (Feingold et al., 1992; Cutler et al.,1999; Iacopino e Cutler, 2000). Por exemplo, a 10

doença periodontal está associada à níveis elevados de IL-6, TNF-α e IL-1β, essas citocinas 11

atuam sobre a lipoproteína lipase, que é uma enzima responsável pela degradação 12

principalmente de triglicérides e LDL, levando à redução da depuração dessas moléculas, o 13

que justifica a presença de níveis elevados de triglicerídeos e LDL em pacientes com doença 14

periodontal (Feingold et al., 1992; Nurmohamed e Dijkmans, 2009; Bullon et al., 2009; Nisar 15

et al., 2012). 16

Wolfe, et al. (1985) demonstraram que em situação de sepsis ocorre um aumento do 17

VLDL hepático, provavelmente devido ao aumento da síntese de ácidos graxos no fígado, além 18

de um aumento da lipólise no tecido adiposo (Bullon et al., 2009). 19

Segundo Fentoglu, et al.(2008) e Iacopino e Cutler (2000), TNF-α e IL-1β exercem 20

efeitos sobre o metabolismo lipídico pois, essas citocinas estimulam a produção de outras 21

Introdução


citocinas, o que desvia a utilização de aminoácidos envolvidos no metabolismo dos lipídios, 1

resultando no aumento dos lipídios no sangue. 2

Além disso, TNF-α parece induzir o aumento dos níveis de colesterol hepático por 3

aumentar a atividade da enzima HMG-CoA redutase (3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A 4

redutase), a qual participa da síntese de colesterol no fígado (Bullon et al., 2009). 5

Pejcic, et al. (2011) em seu estudo concluíram que o controle da doença periodontal 6

em pacientes portadores de dislipidemia alterou os nos níveis lipídicos, houve uma redução do 7

colesterol total, LDL, triglicérides, e aumento de HDL. 8

São muitos os estudos que relatam a presença de alterações na distribuição de 9

lipoproteínas (redução dos níveis de HDL, e alterações nos níveis de LDL), como 10

consequência de episódios inflamatórios (Cutler et al., 1999; Fentoglu et al., 2009; Fentoglu et 11

al., 2011; Pejcic, 2011). No entanto, alguns pesquisadores levantam a hipótese de que essa 12

relação (dislipidemia e inflamação) também pode ocorrer de forma inversa, ou seja, a 13

dislipidemia instalada deixaria o organismo mais suscetível ao desenvolvimento de infecções 14

(Chu et al., 1999). 15

O delineamento de um estudo para analisar esta relação nem sempre é simples, 16

devido a vários fatores que podem interferir em ambas as situações, como o histórico de 17

desenvolvimento do início das doenças (o que se desenvolveu primeiro: dislipidemia ou 18

inflamação), além do envolvimento de outras comorbidades, (diabetes, doenças 19

cardiovasculares, obesidade, entre outras) que frequentemente acompanham o histórico da 20

dislipidemia (Nurmohamed e Dijkmans, 2009; Fentoglu et al., 2011). 21

Pode-se destacar alguns trabalhos que focam essa relação (dislipidemia causando 22

inflamação), como o trabalho de Van Halm, et al. (2007), que utilizou amostras de doadores de 23

um banco de sangue, os quais posteriormente desenvolveram artrite reumatóide. Foi observado 24

que esses pacientes em comparação com o controle, tinham colesterol total superior em 4%, 25

Introdução


HDL inferior em 9% e níveis 17% maiores de triglicérides. Esses níveis de lipídios foram 1

observados pelo menos dez anos antes do aparecimento de sintomas da artrite reumatóide. 2

Pacientes com artrite reumatóide e níveis elevados de colesterol quando tratados com 3

sinvastatina (medicamento com ação antilipêmica, um inibidor específico da enzima HMG-4

CoA redutase), apresentaram além de uma redução no nível de colesterol, também da atividade 5

da doença inflamatória (artrite reumatóide). No entanto, não está claro se a redução na 6

atividade da doença inflamatória é devido ao efeito antilipêmico ou apenas relacionada ao 7

efeito anti-inflamatório já conhecido da sinvastatina (Van Halm et al., 2007; Dalcico et al., 8

2012). 9

Fentoglu, et al. (2011), em seu estudo clínico, ao comparar pacientes saudáveis com 10

pacientes com dislipidemia, concluiu que a média dos parâmetros periodontais como índice de 11

placa, nível de inserção clínica, profundidade de sondagem e sangramento gengival estavam 12

maiores em pacientes com dislipidemia. 13

Várias explicações vêm sendo levantadas na busca de possíveis respostas. Para alguns 14

autores os pacientes com perfil lipídico deteriorado podem estar mais susceptíveis a doenças 15

inflamatórias, isto é, uma ou mais lipoproteína poderia ter um papel regulatório na inflamação 16

(Van Halm et al., 2007; Fentoglu et al., 2008). 17

Alguns estudos demonstraram que a dislipidemia causa disfunção da parede de 18

pequenos vasos e também no processo inflamatório e imunológico, o que pode levar à 19

produção alterada de resposta a diferentes injúrias (Ishikawa et al.,2004). 20

Scardina, et al. (2011) mostraram alteração da microcirculação no tecido periodontal 21

de humanos com hipercolesterolemia, e Maglakilidze, et al. (2005) mostraram alterações 22

morfológicas e funcionais das células gengivais e na microcirculação em coelhos 23

hipercolesterolêmicos. Outros estudos apontam que danos na função endotelial associados a 24

dislipidemia são produzidos principalmente por alterações nos níveis de LDL (Stokes et al., 25

2002); e a hiperlipidemia provoca alteração da função dos leucócitos (Krause et al., 1992); e 26

Introdução


que essas alterações poderiam acelerar a progressão das doenças periodontais. (Stokes et al., 1

2002; Krause et al., 1992). 2

Além disso, parece que a dislipidemia pode alterar a capacidade de ativação dos 3

linfócitos B e T, e impedir a resposta do hospedeiro contra fungos, bactérias e vírus. A 4

dislipidemia inibe a migração das células dendríticas e provoca uma superestimulação dos 5

macrófagos que leva a uma deficiência da sua atuação como célula apresentadora de antígeno, 6

sendo que esses macrófagos alterados também estariam associados a deficiências de 7

cicatrização e aumento do dano da doença periodontal (Ludewig et al., 2001; Shamshiev et al., 8

2007; Martens et al., 2008). 9

É conhecido que apoproteína A-I (Apo A-I) presente na superfície da HDL pode 10

inibir a resposta inflamatória ao impedir a ligação de células T com macrófagos abolindo 11

posteriormente a liberação de citocinas inflamatórias, além de inibir moléculas de adesão 12

(Hyka et al, 2001; Van Halm et al., 2007; Bullon et al., 2008). Desta forma, a redução dessa 13

lipoproteína poderia deixar o organismo desequilibrado frente às infecções. 14

Animais com deficiência de apoproteína E (Apo E) (consequentemente 15

apresentam aumento de colesterol) têm suprimida a resposta imunológica do tipo Th1, 16

favorecendo a resposta do tipo Th2, assim a resposta mediada por anticorpos ficaria mais 17

eficiente que a defesa celular (Nazzal et al., 2010). 18

Existem evidências de que a hipercolesterolemia, e não apenas a obesidade, estaria 19

associada a um aumento da expressão de moléculas de adesão e geração de espécies oxigênio-20

reativas, e também que monócitos e neutrófilos com hiperativação apresentariam resposta 21

inflamatória exagerada ao LPS- lipopolissacarídeo bacteriano (Craig et al., 1994; VanderPoll 22

et al., 1995; Stokes et al., 2002). 23

Juntamente com a liberação de citocinas pró-inflamatórias no fluido crevicular 24

gengival, as células epiteliais secretam inibidores de proteases para proteger o tecido de danos 25

Introdução


excessivos, entre essas inibidoras destaca-se o SLPI (secretory leukocyte protease inhibitor) 1

(Kretschmar et al., 2012). 2

O SLPI regula a atividade de várias proteases liberadas no sitio da inflamação. A 3

elastase é umas das proteases liberada por neutrófilos, e desempenha um papel importante na 4

destruição do tecido conjuntivo que está associada aos estágios iniciais do processo 5

inflamatório (Uitto et al., 1996; Ujiie et al., 2007). 6

As fases iniciais da doença periodontal são relacionadas com níveis elevados de 7

SLPI na região local, nesse momento o organismo secreta uma grande quantidade desse 8

inibidor na tentativa de impedir a degradação do tecido pelas proteases. Sua presença na região 9

inflamada também está relacionada à sua ação antimicrobiana, anti-inflamatória e de 10

cicatrização. No entanto, nas fases terminais da doença periodontal (destruição avançada, perda 11

da função) o SLPI está reduzido, provavelmente devido à sua degradação pelas proteases 12

catepsina L, cisteínas bacterianas (gingipains) e devido à interação na formação do complexo 13

com elastase (Kantyka et al., 2009; Pateel et al., 2010). 14

Em animais, foi observado que a IL-1β e TNF-α induzem a liberação de leptina 15

(Vanderpoll et al., 1991). A proteína leptina é produzida, predominantemente, pelos 16

adipócitos e posteriormente lançada para a corrente sanguínea. Exerce diferentes respostas no 17

hipotálamo, com o objetivo de balancear a ingestão alimentar e o gasto energético levando a 18

homeostase. Tem sido implicada na regulação de vários mecanismos biológicos, entre os quais 19

a reprodução, a resposta imune e inflamatória, a hematopoiese, a angiogênese e a formação 20

óssea, no entanto seu papel mais relevante, diz respeito a regulação da ingestão alimentar e a 21

homeostasia energética (Karthikeyan e Pradeep, 2007; Farooqui et al., 2012). 22

A leptina atua na regulação do balanço de th1/th2, além de modular a produção de 23

citocinas a partir de monócitos/macrófagos, aumentando a liberação de TNF-α e IL-6 24

(Vanderpoll et al., 1991). Baixo nível desse hormônio é associado com a diminuição do 25

Introdução


número de linfócitos T e supressão da resposta dessa célula quando ativada. Ao mesmo tempo, 1

provoca uma hiper-resposta do sistema monócito / macrófago (Vanderpoll et al., 1991). 2

Alguns autores relatam que os níveis de leptina são aumentados por estímulos 3

inflamatórios, tais como LPS e citocinas (Faggioni et al., 1998; Arnalich et al., 1999; Finck e 4

Johnson, 2000) . No entanto, em humanos esse achado ainda é questionável, pois as 5

conclusões são conflitantes (Vanderpoll et al., 1991; Johnson e Serio, 2001; Karthikeyan e 6

Pradeep, 2007) . 7

Embora ainda não seja possível estabelecer com segurança se as alterações das 8

lipoproteínas são causa ou consequência na sua relação com a doença periodontal, já existem 9

trabalhos que admitem uma “via de mão dupla” para essa relação, ou seja, a doença local 10

(doença gengival) exacerba a doença sistêmica (dislipidemia), e ao mesmo tempo, a doença 11

sistêmica predispõe, ou aumenta o grau de desenvolvimento da doença local (Cutler e 12

Iacopino, 2003; Fentoglu et al., 2011; Scardina et al., 2011). 13

Introdução


Proposição


2. Proposição

2.1. Objetivos Gerais:

• Avaliar a resposta inflamatória na presença de dislipidemia induzida pela dieta.

2.2. Objetivos Específicos:

• induzir dislipidemia nos animais através de uma ração com aumento de colesterol,

• desenvolver inflamação gengival com aplicação de LPS (lipopolissacarídeo bacteriano),

• avaliar a resposta inflamatória

o realizando análise histológica local,

o quantificando mediadores inflamatórios: IL-1 β, IL-6 e TNF-α;

• quantificar a presença plasmática da proteína SLPI (secretory leucocyte protease

inhibitor)

• quantificar os níveis do hormônio leptina durante a inflamação

Proposição


Material e Método


3. Material e Método

3.1. Animais

Para esse estudo foram obtidos no Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto da 1

Universidade de São Paulo, 40 ratos machos (Rattus Norvegicus albino, variedade wistar) com 2

aproximadamente 40 gramas de peso corporal. Os animais foram mantidos no biotério da 3

Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto- USP, em caixas acrílicas coletivas (cinco ratos por 4

caixa), em ambiente com temperatura controlada (24 ºC ± 1 ºC) e ciclo claro-escuro de 12 horas 5

(ciclo claro se iniciando às sete horas da manhã), com água filtrada e comida ad libitum. 6

3.2. Preparo da ração com acréscimo de colesterol

Foi adicionado 1% (em peso) de colesterol em pó (colesterol 95%, SIGMA®) e 20% em 7

peso de óleo de soja (Liza ®) na ração padrão, baseado nos trabalhos de Badimon, et al. (1990) e 8

Fani, et al. (1988) com algumas modificações. A ração padrão foi moída, e a ela foram 9

adicionadas o colesterol, o óleo de soja e água (para facilitar a homogeneização da mistura), a 10

massa formada foi passada em uma máquina para ser comprimida e os pellets formados. A ração 11

foi mantida em estufa a 56°C por dois dias para evaporação do excesso de água. 12

Material e Método


3.3. Indução da Inflamação Gengival

Os animais foram anestesiados com tribomoetanol (2,2,2- tribomoethanol, SIGMA®) 1

administrado via intraperitoneal na dose de 25mg/100g de peso corporal. Depois de anestesiados, 2

os animais receberam 3µl de injeção intra-gengival com solução de LPS (LPS - Escherichia coli 3

- SIGMA® 0111:b4) diluído em PBS (Phosphate buffered saline) 10mg/ml, na região palatina 4

de incisivos (região anterior) e 1° molares superiores direito e esquerdo (região posterior), duas 5

vezes na semana (com intervalo de três dias) de acordo com o protocolo de Aquino, et al.(2009a). 6

A aplicação foi realizada com agulha de calibre 26G½ acoplada a uma seringa plástica descartável 7

de 1ml, e com ajuda de uma espátula para afastar a língua dos animais. 8

3.4. Protocolos Experimentais

Os procedimentos do protocolo experimental foram aprovados pelo comitê de ética para 9

uso de animais em laboratório do Campus de Ribeirão Preto da universidade de São Paulo e estão 10

em conformidade com os princípios universais para o uso de Animais em Pesquisa e no Ensino – 11

Protocolo sob n° 10.1.1484.53.4, aprovado em 02/03/2011 (Anexo A). 12

Os animais foram divididos da seguinte forma: 13

Grupo I – 20 animais, receberam a ração com acréscimo de colesterol 14

Grupo II - 20 animais, receberam a ração padrão 15

Ambos os grupos foram mantidos no biotério tendo livre acesso à respectiva ração por 16

oito semanas. Após esse período, cinco animais de cada grupo (animais controle, sem inflamação) 17

Material e Método


foram submetidos à eutanásia para análise de lipoproteínas, e o restante foi subdividido para 1

receber as aplicações de LPS, da seguinte maneira: 2

1 semana de aplicação: 5 animais de cada grupo ( I e II)

2 semanas de aplicação: 5 animais de cada grupo( I e II)

4 semanas de aplicação: 5 animais de cada grupo( I e II)

3.5. Coleta de Amostras

Ao final do período de cada tratamento os animais foram mantidos em jejum durante 12 3

horas. Após isso, foram pesados para dosagem de anestésico e submetidos à eutanásia com uma 4

sobredose anestésica. No momento da eutanásia removeu-se 10 mililitros de sangue através de 5

punção cardíaca, com agulha 21G1 acoplada a uma seringa plástica descartável de 10ml. O 6

plasma sanguíneo foi obtido por centrifugação do sangue total. Parte do plasma foi utilizado 7

imediatamente após a coleta para avaliação das lipoproteínas, e o restante foi aliquotado em 8

criotubos e estocados à –80°C para posterior análise. A maxila dos animais foi removida, fixada e 9

descalcificada para análise histológica (ver adiante a descrição detalhada). 10

Material e Método


3.6. Quantificação de Lipídios e Lipoproteínas

Do sangue colhido e centrifugado, utilizou-se o soro para avaliação de colesterol total, 1

HDL, LDL, VLDL e triglicérides por meio de Kits (LABTEST DIAGNÓSTICA ®), utilizando 2

um sistema enzimático colorimétrico para reação de ponto final, mensurado pelo 3

espectrofotômetro de absorbância. 4

Avaliação do colesterol total – A colheita de amostras para medição do colesterol total 5

deve ser padronizada, uma vez que podem existir efeitos significativos nos resultados se as 6

amostras são colhidas de forma diferente (posição, garroteamento). Além disso, a variação 7

biológica do colesterol pode decorrer da variação biológica das lipoproteínas transportadoras de 8

colesterol, sendo o LDL a que apresenta maior diversidade de medidas. Os animais tiveram 9

padronização dos procedimentos e métodos para a colheita de sangue, e todos os procedimentos 10

foram realizados de acordo com as especificações do fabricante. Mesmo nessas condições, o 11

fabricante dos kits (LABTEST DIAGNÓSTICA ®), informa que pode ocorrer uma variação 12

intrínseca de até 11,6%. 13

Avaliação do LDL – Os valores para LDL foram calculados baseados na Equação de 14

Friedewald: LDL (mg/dl) = colesterol total – HDL + (triglicérides/5 ou VLDL). 15

Avaliação do HDL - Para essa lipoproteína também foi utilizado o Kit LABTEST 16

DIAGNÓSTICA®. Para o HDL segundo o fabricante, pode ocorrer uma variação biológica 17

normal em torno de 7,5%, uma vez que a concentração dessa lipoproteína de alta densidade 18

também sofre influência de fatores como dieta recente, variações de peso corporal, atividades 19

físicas e outros hormônios. Os efeitos dessa variação podem ser controlados até certo ponto por 20

meio da padronização das condições de preparo e colheita das amostras, o que foi realizado nos 21

experimentos aqui descritos. 22

Material e Método


Avaliação do VLDL – O VLDL foi calculado como 1/5 do valor encontrado para os 1

triglicerídeos. 2

Avaliação dos triglicerídeos – A concentração de triglicérides é influênciada por 3

hábitos dietéticos recentes, variações de peso corporal e exercício físico, então os valores dos 4

triglicérides em um mesmo individuo são bastante variáveis. Embora os animais tenham sido 5

deixados em jejum durante 12 horas antes da coleta do sangue, existe uma considerável variação 6

biológica, podendo existir diferenças de cerca de 21% em medições repetidas num mesmo 7

individuo (segundo orientações do fabricante dos kits). Dessa forma, os valores obtidos para todas 8

as lipoproteínas neste trabalho foram utilizados apenas para uma comparação entre os grupos, e 9

não como avaliação especifica de qualquer dos lipídios séricos. 10

3.7. Técnica Histológica

A peça colhida (maxila) foi imersa em uma solução de formalina 1/10 em água destilada 11

e deixada fixar por 24 horas. Para a descalcificação da peça foi utilizado uma solução de citrato de 12

sódio (a 20% em água destilada) + ácido fórmico (solução a 50% ou ½ em água destilada) 13

segundo protocolo descrito por Behmer, et al. (1975). A cada dois dias foi feita a troca da 14

solução, tendo sido, em média, realizadas 3 trocas (período de aproximadamente uma semana) ou 15

até que a peça apresentasse a necessária descalcificação. Após a descalcificação as peças foram 16

desidratadas por uma série crescente de alcoóis e embebidas em parafina. 17

Dos blocos obtidos foram feitos cortes de 6µm de espessura, sendo selecionado um corte 18

a cada 10, totalizando dois cortes por animal, os quais foram colocados sobre lâmina de vidro e 19

corados com hematoxilina e eosina (H&E) para análise histológica das regiões que receberam a 20

aplicação de LPS (região palatina de incisivos e de 1°molar superior bilateral). 21

Material e Método


O grau de inflamação na área gengival foi caracterizado levando em consideração a 1

presença de células de defesa (neutrófilos e linfócitos), edema, pavimentação leucocitária e 2

hiperemia. O grau de inflamação foi padronizado da seguinte forma: Ø = sem inflamação; + = 3

inflamação leve; e ++ = inflamação severa. A analise histológica foi realizada por dois 4

avaliadores que não sabiam a qual grupo pertencia a amostra analisada. Foram analisados, em 5

cada região, cinco campos, onde cada campo poderia receber no máximo dois sinais positivos 6

(++), sendo que a somatória final de 10 sinais positivos nos cinco campos refletia 100%. 7

A análise histológica foi realizada com microscópio de luz comum (NIKON®). 8

Pode- se observar nas figuras 2 e 3 exemplos de região do epitélio gengival saudável 9

(sem inflamação) e da região que recebeu as aplicações de LPS, respectivamente, onde 10

posteriormente foi realizada a análise histopatológica. 11

Figura 2 – Apresentação histopatológica do tecido gengival saudável. H&E, Aumento 200x. Sulco gengival da região de incisivo superior.

Material e Método


Figura 3 – Apresentação histopatológica do tecido gengival com inflamação. H&E, Aumento 200x. Sulco gengival da região de incisivo superior.

Material e Método


Observe abaixo, exemplos de presença de edema, hiperemia, pavimentação leucocitária e 1

infiltrado celular inflamatório. (Figura 4). 2

Figura 4 – Parâmetros inflamatórios. Presença de edema (áreas claras), células características de inflamação aguda (polimorfonucleares). Observe também vasos com característica de pavimentação vascular leucocitária e vasos hiperêmicos. Hematoxilina e Eosina, aumento 400X.

3.8. Análises Laboratoriais

As dosagens foram realizadas pelo teste de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent 3

Assay). Sendo que as citocinas, IL-6, IL-1β e TNF-α foram avaliadas através do ELISA tipo 4

sanduíche, e o SLPI e a Leptina foram dosadas através de ELISA indireto. 5

Células de defesa →

Edema →

↑Pavimentação

leucocitária

← Hiperemia

Material e Método


3.8.1. ELISA INDIRETO

SLPI

Para a dosagem de SLPI foi utilizado o anticorpo primário rabbit polyclonal antibody 1

anti-SLPI of mouse origin (Santa Cruz®), e como anticorpo secundário foi utilizado goat anti-2

rabbit igG-HRP (SC-2004- Santa Cruz®). 3

Não foi utilizada proteína recombinante para curva padrão (os resultados foram obtidos 4

pela comparação entre as densidades ópticas das amostras). 5

As amostras do soro puro dos animais foram depositadas 100µl/poço em duplicata e 6

incubadas overnight à temperatura de 4°C. 7

Realizou-se a lavagem da placa com 200µl/poço com PBS. O bloqueio da placa foi 8

realizado, utilizando-se como tampão de bloqueio ovalbumina a 10% (SIGMA®-albumin from 9

chicken egg whites) em PBS, 200µl/poço, durante duas horas à 37°C. Após o bloqueio realizou-se 10

uma lavagem com PBS (200µl/poço) e foi adicionado anticorpo primário diluído 200 vezes, em 11

tampão de bloqueio, 100µl/poço, incubando-se duas horas em temperatura ambiente. Após 12

incubação, foram feitas duas lavagens com PBS, e adicionou-se anticorpo secundário goat anti-13

rabbit igG-HRP (SC-2004- Santa Cruz®), diluído 1000 vezes em ovalbumina a 10% e depositado 14

100µl por poço, incubando-se 60 minutos à temperatura ambiente. Após esse processo, quatro 15

lavagens foram realizadas, e adicionou-se substrato 2,2’-azino-Bis 3-Ethylbenzthiazoline-6-16

sulfonic Acid (ABTS - SIGMA®) e ABTS enhancer diluído 11X em ABTS liquid substrate 17

(SIGMA®), 100µl/poço, incubou-se por aproximadamente 30 minutos. Como stop solution foi 18

utilizado SDS (dodecil sulfato de sódio) a 1% (100µl/poço). Após o bloqueio da reação, a placa 19

foi lida em leitora de microplaca (thermoplate-TP-Reader®) à 405nm. 20

Material e Método


LEPTINA

Para a dosagem de Leptina foi usado com padrão a recombinant Rat Leptin 1

(peprotech®), e como anticorpo de detecção biotinylated goat anti-rat leptin [1,0µg/ml] 2

(peprotech®). 3

O padrão e as amostras do soro dos animais (diluídas ½ em PBS) foram depositados 4

100µl/poço em duplicata e incubados overnight à temperatura ambiente. 5

O bloqueio da placa foi realizado utilizando-se como tampão de bloqueio PBS +1% BSA 6

(bovine serum albumin - SIGMA®), 300µl/poço, durante duas horas em temperatura ambiente. 7

Após o bloqueio foi realizada uma lavagem (PBS+ 0,05% de tween-20), 300µl/poço. Foi 8

adicionado o anticorpo de detecção diluído (0,1% de BSA+ 0,05% tween-20 em PBS), 9

100µl/poço, incubando-se por duas horas em temperatura ambiente. Após incubação, foram 10

realizadas quatro lavagens. Foi adicionado 100µl/poço de avidina-HRP (peprotech®) diluída 1/ 11

2000, mantido por 30 minutos em temperatura ambiente. Após esse processo quatro lavagens 12

foram realizadas, e adicionou-se substrato ABTS (SIGMA®) e ABTS enhancer diluído 11X em 13

ABTS liquid substrate (SIGMA®), 100µl/poço, incubou-se por aproximadamente 40 minutos. 14

Como stop solution foi utilizado SDS a 1%(100µl/poço). Após o bloqueio da reação, a placa foi 15

lida em leitora de microplaca (thermoplate-TP-Reader®) à 405nm. 16

Material e Método


3.8.2. ELISA SANDUÍCHE

Para a dosagem das citocinas IL-6 e IL-1β foram utilizados kits da Peprotech®, e para 1

dosagem de TNF-α o kit da Abnova® seguindo as orientações dos fabricantes, descritas abaixo. 2

Foi utilizado como padrão de IL-1β: recombinant rat IL-1β+2.2mg BSA+11.0mg D-3

mannitol (Peprotech®) [3 ng/ml]; como anticorpo de captura: antigen-affinity purified rabbit 4

anti-rat IL-1β (Peprotech®) [2µg/ml]; e anticorpo de detecção : biotinylated antigen-affinity 5

purified rabbit anti-rat IL-1β (Peprotech®)[0,5µg/ml]. 6

Para detecção da IL-6 utilizou-se como padrão: recombinant Rat IL-6 + 2.2mg BSA + 7

11.0mg D-mannitol ( Peprotech®) [5ng/ml]; o anticorpo de captura: antigen-affinity purified goat 8

anti-Rat IL-6 + 0.5mg D-mannitol (Peprotech®) [1,0µg/ml]; e para o anticorpo detecção foi 9

utilizado biotinylated antigen-affinity purified goat anti-Rat Il-6 + 0.5mg D-mannitol 10

(Peprotech®) [0,25µg/ml]. 11

O padrão utilizado para detecção de TNF-α: rat TNF-α standard lyphilized 5000 pg/ml 12

(Abnova®); o anticorpo de captura polyclonal antibody to rat TNF-α (Abnova®) já presente na 13

placa; e como anticorpo de detecção: biotin-conjugated anti-rat TNF-α polyclonal antibody 14

(Abnova®). 15

Para detecção de IL-1β e IL-6 a placa de ELISA foi sensibilizada com anticorpo de 16

captura (2µg/ml) diluído em PBS e adicionou-se 100µl/poço. A placa foi incubada overnight em 17

temperatura ambiente. Após isso os poços foram lavados quatro vezes com tampão de lavagem 18

(0.05% tween-20 SIGMA®, em PBS) 300µl/poço. A placa foi incubada em temperatura ambiente 19

por uma hora com 300µl/poço de tampão de bloqueio (1% de BSA em PBS). Em seguida, quatro 20

lavagens. Após este tratamento a placa recebeu as amostras puras em duplicata (soro dos animais) 21

e o padrão foi diluído (0,05% de tween 20 em 0.1% de BSA em PBS) de 3ng/ml a 0 ng/ml. A 22

placa foi incubada por duas horas em temperatura ambiente. Após a incubação, repetiram-se as 23

Material e Método


lavagens (quatro vezes). A placa em seguida recebeu o anticorpo de detecção (0,25µg/ml), 1

100µl/poço. Após incubação por mais duas horas os poços foram lavados (quatro vezes) e 2

receberam 100µL de avidina-HRP diluída 2000 vezes (0,05% de tween 20 em 0.1% de BSA em 3

PBS). A placa foi mantida em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, a placa foi 4

lavada para receber o substrato ABTS (SIGMA®) e incubou-se por aproximadamente 30 minutos. 5

Para bloqueio da reação foi usado como stop solution SDS (dodecil sulfato de sódio) a 1% 6

(100µl/poço). Após o bloqueio da reação, a placa foi lida em leitora de microplaca (thermoplate-7

TP- Reader®) à 405nm. 8

A placa para detecção de TNF-α foi fornecida no kit, sensibilizada com anticorpo 9

primário polyclonal antibody to rat TNF-α. Os poços foram lavados duas vezes com 400 µl/poço 10

de tampão de lavagem (1% de tween 20 em PBS disponibilizado pelo kit abnova ®), em seguida 11

foi adicionado em duplicata o padrão rat TNF-α (diluída 1:2 em diluente fornecido pelo kit 12

abnova®) de 2,5ng/ml a 0,0ng/ml. As amostras foram diluídas também em diluente 1:2 e 13

adicionadas em duplicata 100µl/poço. Foi adicionado 50µl/poço de Biotin -Conjugate diluída 14

1:100 em tampão de ensaio (1% de tween 20 em PBS) e a placa foi então incubada por duas horas 15

em temperatura ambiente. Após a incubação foram realizadas quatro lavagens. Adicionou-se 16

streptavidin-HRP (diluída 1:100 em tampão de ensaio) 100µl/poço incubados por uma hora em 17

temperatura ambiente. Após a incubação foram repetidas as lavagens (quatro vezes) e adicionado 18

100µl/poço de TMB substrate Solution (Tetramethyl-benzidine presente no kit Abnova®) 19

incubados por aproximadamente 10 minutos e com stop solution (1M Acido Fosfórico) 20

100µl/poço, foi realizado o bloqueio da reação. A placa foi lida em leitor de microplaca 21

(thermoplate-TP- Reader®) à 620nm conforme orientações do fabricante. 22

Material e Método


3.9. Análise Estatística

Para a análise estatística utilizou-se o software GraphPad InStat 5.00 para Windows 1

(1992-2007 GraphPad Software, Inc, San Diego, USA). 2

Após realização de teste de normalidade, concluiu-se que os resultados eram compostos 3

de dados não paramétricos e, portanto, utilizou-se a comparação de duas médias utilizando o teste 4

de Mann-Withney. Consideraram-se para as análises, intervalos de confiança de 95% e valores de 5

p significantes quando iguais ou inferiores a 0,05. 6

Material e Método


Resultados


4. Resultados

4.1. Avaliação do peso dos animais

A pesagem dos animais foi realizada a cada duas semanas durante oito semanas iniciais 1

(antes da aplicação de LPS). Os animais que receberam ração especial (com aumento de 2

colesterol) não apresentaram aumento de peso significante em relação aos animais que receberam 3

ração padrão. 4

Figura 5- Controle de Peso. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). A pesagem dos animais foi realizada a cada duas semanas durante oitos semanas (antes da aplicação de LPS). Teste Mann Whitney.

0

100

200

300

400

500

2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas

Gra

ma

s

Controle de Peso

ração padrão

ração especial

Resultados

4.2. Avaliação dos Lipídio

Os animais que receberam a ração com acréscimo de colesterol, após oito semanas, 1

apresentaram alteração significativa nos níveis das lipoproteínas LDL e HDL comparada com o 2

grupo de animais que receberam 3

A ração com acréscimo de colesterol ca4

como obsevado na figura 6. 5

Figura 6- Quantificação de LDL e HDL. especial (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). Quantificação realizada após oito semanas de tratamento com as respectivas dietas, antes da aplicação de LPS. Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa*p<0.05; **p<0.01.

0

10

20

30

40

50

60

ração padrão

mg

/dl

tempos experimentais

LDL

Lipídio s

Os animais que receberam a ração com acréscimo de colesterol, após oito semanas,

apresentaram alteração significativa nos níveis das lipoproteínas LDL e HDL comparada com o

de animais que receberam ração padrão.

A ração com acréscimo de colesterol causou um aumento de LDL e diminuição do HDL,

Quantificação de LDL e HDL. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). Quantificação realizada após oito semanas de

tratamento com as respectivas dietas, antes da aplicação de LPS. Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa

ração padrão ração especial


LDL

0

10

20

30

40

50

60

ração padrão

mg

/dl

tempos experimentos

HDL


Os animais que receberam a ração com acréscimo de colesterol, após oito semanas,

apresentaram alteração significativa nos níveis das lipoproteínas LDL e HDL comparada com o

usou um aumento de LDL e diminuição do HDL,

(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). Quantificação realizada após oito semanas de

tratamento com as respectivas dietas, antes da aplicação de LPS. Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa

ração especial

tempos experimentos

Resultados


Os valores de colesterol total, triglicérides e VLDL não apresentaram diferença 1

estatística entre os grupos (figura 7). 2

0

20

40

60

80

100


mg

/dl

grupos experimentais

Colesterol total

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


mg

/dL


Triglicérides

Resultados


Figura 7- Quantificação do colesterol total, triglicérides e VLDL. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol). Quantificação realizada após oito semanas de tratamento com as respectivas dietas, antes da aplicação de LPS. Teste Mann Whitney.

0

5

10

15

20


mg

/dl


VLDL

Resultados

4.3. Avaliação dos Lipídio

HDL

Os resultados mostram que existe diminuição significativa de HDL em animais que 1

receberam a ração com acréscimo de colesterol, em situação de infecção quando comparados aos 2

animais que receberam ração padrão3

Figura 8. Quantificação de HDL durante a inflamaçãocolesterol), ração especial (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterolalimentaram de ração com acréscimoalimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de HDL foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª*p<0.05; **p<0.01.

0

10

20

30

40

50

60

70

1°semana

mg

/dl

Lipídio s durante a indução de infecção

Os resultados mostram que existe diminuição significativa de HDL em animais que

receberam a ração com acréscimo de colesterol, em situação de infecção quando comparados aos

que receberam ração padrão.

durante a inflamação. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de (animais que se alimentaram de ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS

alimentaram de ração com acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPSacréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de HDL foi realizada em três

períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa

2°semana 4°semana ração padrão ração especial


HDL


Os resultados mostram que existe diminuição significativa de HDL em animais que

receberam a ração com acréscimo de colesterol, em situação de infecção quando comparados aos

(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de

), ração especial+LPS (animais que se ração padrão+LPS (animais que se

acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de HDL foi realizada em três semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa

ração padrão+LPS

ração especial+LPS

ração padrão

ração especial

Resultados

0

10

20

30

40

50

1°semana

mg

/dl

LDL

Em situação de infecção é possível observar aumento significativo do LDL em animais 1

com dislipidemia principalmente na 1° e 4°semana da aplicação de LPS quando comparado com 2

animais que receberam ração padrão e LPS. 3

Figura 9. Quantificação de LDL durante a inflamação.colesterol), ração especial (animais que se alimentaram com ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais qalimentaram com ração com acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de LDL foi realizada em trêperíodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa *p<0.05; **p<0.01.

Colesterol total, triglicérides e VLDL

Não foi observada relação direta entre as medidas de colesterol total4

e a situação de dislipidemia (aumento do LDL e diminuição do HDL) ou mesmo provocada pela 5

infecção induzida. 6

Da mesma forma, triglicérides e VLDL7

ração padrão quando comparados àqueles que receberam a alimentação8



LDL

Em situação de infecção é possível observar aumento significativo do LDL em animais

com dislipidemia principalmente na 1° e 4°semana da aplicação de LPS quando comparado com

animais que receberam ração padrão e LPS.

durante a inflamação. Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que se alimentaram com ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais q

m ração com acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de LDL foi realizada em trê

(após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa

Colesterol total, triglicérides e VLDL

relação direta entre as medidas de colesterol total

a situação de dislipidemia (aumento do LDL e diminuição do HDL) ou mesmo provocada pela

Da mesma forma, triglicérides e VLDL foram observados aumentados em animais com

ração padrão quando comparados àqueles que receberam a alimentação


ração padrão+LPS


ração padrão

ração especial

Em situação de infecção é possível observar aumento significativo do LDL em animais

com dislipidemia principalmente na 1° e 4°semana da aplicação de LPS quando comparado com

Ração padrão (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que se alimentaram com ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se

m ração com acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de LDL foi realizada em três

(após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente significativa

relação direta entre as medidas de colesterol total, VLDL, triglicérides

a situação de dislipidemia (aumento do LDL e diminuição do HDL) ou mesmo provocada pela

observados aumentados em animais com

ração padrão quando comparados àqueles que receberam a alimentação com aumento de

Resultados

0

20

40

60

80

100

120

1°semana

mg

/dl

colesterol. Esses resultados mostram a necessidade de maiores estudos na produção e distribuição 1

desses lipídios e lipoproteínas.2

Figura 10- Quantificação de colesterol totalcolesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), raçãoalimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi reaem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitneysignificativa *p<0.05.



Colesterol total

colesterol. Esses resultados mostram a necessidade de maiores estudos na produção e distribuição

s e lipoproteínas.

Quantificação de colesterol total durante a inflamação. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi reaem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney


ração padrão+LPS


ração padrão

ração especial

colesterol. Esses resultados mostram a necessidade de maiores estudos na produção e distribuição

(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se

padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente

Resultados

0

5

10

15

20

1°semana

mg

/dl

0

20

40

60

80

100

1°semana

mg

/dl

Figura 11. Quantificação de VLDLcolesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), raçãoalimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de VLDL foi realizada em trperíodos de aplicação de LPS (após uma semana, duas semanas e quatro semanas). Teste Mann Whitney, dsignificativa *p<0.05; **p<0.0 .

Figura 12. Quantificação de triglicéridescolesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), raçãoalimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi reaem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitneysignificativa *p<0.05; **p<0.01.



VLDL



Triglicérides

. Quantificação de VLDL durante a inflamação. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de VLDL foi realizada em trperíodos de aplicação de LPS (após uma semana, duas semanas e quatro semanas). Teste Mann Whitney, d

Quantificação de triglicérides durante a inflamação. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial (animais que receberam ração com acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi reaem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney


ração padrão+LPS


ração padrão

ração especial

ração padrão+LPS


ração padrão

ração especial


padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de VLDL foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após uma semana, duas semanas e quatro semanas). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente


padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de colesterol total foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whitney, diferença estatisticamente

Resultados

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1°semana

% d

e in

fla

ma

ção

4.4. Análise Histopatológica

Os resultados mostram que apenas após quatro semanas de aplicação de LPS foi possível 1

observar diferença estatística entre as áreas analisadas 2

padrão+LPS 66% ± 8.94, grupo ração especial+LPS 78% ± 8.36; região de dentes posteriores: 3

grupo ração padrão+LPS 56% ± 5.47, grupo ração especial+LPS 66% ± 5,42), sendo que, nos 4

animais tratados com dieta hipercole5

análise dos parâmetros (hiperemia, pavimentação leucocitária, edema e células de defesa) para 6

avaliação do processo inflamatório. A inflamação7

dados podem ser obsevados nos gráficos 8

Figura 13- Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região posterior. acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colestede LPS). A aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05.

semana 2°semana 4°semana ração padrão


Região Posterior

4.4. Análise Histopatológica

s resultados mostram que apenas após quatro semanas de aplicação de LPS foi possível

observar diferença estatística entre as áreas analisadas (região de dentes anteriores: grupo ração

padrão+LPS 66% ± 8.94, grupo ração especial+LPS 78% ± 8.36; região de dentes posteriores:

grupo ração padrão+LPS 56% ± 5.47, grupo ração especial+LPS 66% ± 5,42), sendo que, nos

animais tratados com dieta hipercolesterolêmica, houve um aumento dos valores obtidos na

análise dos parâmetros (hiperemia, pavimentação leucocitária, edema e células de defesa) para

avaliação do processo inflamatório. A inflamação foi então, considerada de maior intensidade.

ser obsevados nos gráficos 13 e 14.

Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região posterior. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colestede LPS). A aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05.


ração especial +LPS

ração padrão+LPS

ração padrão

s resultados mostram que apenas após quatro semanas de aplicação de LPS foi possível

(região de dentes anteriores: grupo ração

padrão+LPS 66% ± 8.94, grupo ração especial+LPS 78% ± 8.36; região de dentes posteriores:

grupo ração padrão+LPS 56% ± 5.47, grupo ração especial+LPS 66% ± 5,42), sendo que, nos

sterolêmica, houve um aumento dos valores obtidos na

análise dos parâmetros (hiperemia, pavimentação leucocitária, edema e células de defesa) para

considerada de maior intensidade. Os

(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey,

Resultados

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1°semana

% d

e in

fla

ma

ção

Figura 14 - Avaliação histopatológica do processo acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). Aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05

semana 2°semana 4°semana ração padrão


Região Anterior

Avaliação histopatológica do processo inflamatório na região anterior. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam

LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). Aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey,

mente significativa *p<0.05.



ração padrão+LPS

ração padrão

(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam

LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). Aplicação de LPS foi realizada por três períodos: uma semana, duas semanas e quatro semanas. Teste Mann Whithey,

Resultados


0

200

400

600

800

1000

1ª semana 2ª semana 4ª semana ração padrão

pg

/ml


IL-1 β

ração padrão+LPS


ração padrão

4.5. Avaliação dos mediadores inflamatórios

4.5.1. IL-1 ββββ

Nos períodos de aplicação de LPS (1, 2 e 4 semanas), não houve diferença estatística dos 1

níveis de IL-1β entre o grupo de animais que recebeu a ração rica em colesterol e o grupo que 2

recebeu a ração padrão. A quantidade de IL-1β nas amostras de plasma dos animais que 3

receberam apenas ração padrão não foi detectada pelo teste ELISA, como obsevado na figura 15. 4

Figura 15- Quantificação de IL-1β. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de IL-1β foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey.

Resultados

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

1ª semana

pg

/ml

4.5.2. IL-6

Após os períodos de aplicação de LPS (1, 2 e 4 1

diferença estatística entre os grupos em todos os períodos. O grupo que recebeu ração com 2

colesterol apresentou níveis maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como 3

obsevado na figura 16. 4

Figura 16- Quantificação de IL-6. Ração padrão(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesteem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa **p<0.01.

4.5.3. TNF-αααα

O resultado obtido para avaliação do TNF5

densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos 6

períodos 1 e 2 semanas de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol 7



IL-6

Após os períodos de aplicação de LPS (1, 2 e 4 semanas) os níveis de IL

diferença estatística entre os grupos em todos os períodos. O grupo que recebeu ração com

colesterol apresentou níveis maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como

Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de ILem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente

obtido para avaliação do TNF-α está representado pela leitura dada em

densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos

períodos 1 e 2 semanas de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol


ração padrão+LPS


ração padrão

semanas) os níveis de IL-6 apresentaram

diferença estatística entre os grupos em todos os períodos. O grupo que recebeu ração com

colesterol apresentou níveis maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como

(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais

rol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de IL-6 foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente

está representado pela leitura dada em

densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos

períodos 1 e 2 semanas de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol

Resultados

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

1ª semana

DO

(d

en

sid

ad

e ó

pti

ca)

apresentou leituras maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na 1

figura 17. 2

Figura 17- Quantificação de TNF-α. Ração padrão(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesteem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05; **p<0.01.

4.5.4. SLPI

Os resultados obtidos na avaliação do SLPI estão representados pela leitura em 3

densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas na 1° e 2° 4

semana de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol apres5

menores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 6



TNF- αααα

apresentou leituras maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na

Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de TNFem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente

Os resultados obtidos na avaliação do SLPI estão representados pela leitura em

densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas na 1° e 2°

semana de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol apres

menores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura


ração padrão+LPS


ração padrão

apresentou leituras maiores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na

(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais

rol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de TNF-α foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente

Os resultados obtidos na avaliação do SLPI estão representados pela leitura em

densidade óptica. As leituras apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas na 1° e 2°

semana de aplicação de LPS. O grupo que recebeu ração rica em colesterol apresentou leituras

menores, comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 18.

Resultados

Figura 18- Quantificação de SLPI. Ração padrão(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesteem três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05; **p<0.01.

4.5.5. Leptina

Após os períodos de aplicação de LPS (uma, duas e quatro semanas) os níveis de leptina 1

apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos períodos 2° e 4° semana. O grupo 2

que recebeu ração com colesterol apresentou 3

comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 14

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

1ª semana

DO

(d

en

sid

ad

e ó

pti

ca)

**

Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de SLPI foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente

Após os períodos de aplicação de LPS (uma, duas e quatro semanas) os níveis de leptina

apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos períodos 2° e 4° semana. O grupo

que recebeu ração com colesterol apresentou níveis maiores (nos períodos

comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 1



SLPI

ração padrão+LPS


ração padrão


(animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS

(animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais rol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de SLPI foi realizada

em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente

Após os períodos de aplicação de LPS (uma, duas e quatro semanas) os níveis de leptina

apresentaram diferença estatística entre os grupos apenas nos períodos 2° e 4° semana. O grupo

níveis maiores (nos períodos 2° e 4° semana),

comparado ao grupo que recebeu a ração padrão, como obsevado na figura 19.

ração padrão+LPS


ração padrão

Resultados


Figura 19- Quantificação de Leptina. Ração padrão (animais que receberam ração sem acréscimo de colesterol), ração especial+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS), ração padrão+LPS (animais que se alimentaram com ração sem acréscimo de colesterol e receberam aplicações de LPS). A quantificação de leptina foi realizada em três períodos de aplicação de LPS (após 1ª semana, 2ª semana e 4ª semana). Teste Mann Whithey, diferença estatisticamente significativa *p<0.05.

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60


µg

/ml


Leptina

ração padrão+LPS


ração padrão

*

*

Resultados


Discussão


5.0. Discussão

A literatura mostra que pacientes portadores de doenças inflamatórias como, por 1

exemplo, a doença periodontal, apresentam elevadas taxas de colesterol (Miyazawa et al., 2012; 2

O’Rourke et al., 2012 ), e existem indícios de que a liberação de citocinas no processo 3

inflamatório pode alterar o metabolismo dos lipídios (McNeely et al., 1995; Homma et al., 2004; 4

Genco et al., 2005). Existem também alguns trabalhos mostrando que níveis elevados de 5

colesterol no organismo podem predispor o desenvolvimento de alterações inflamatórias (Van 6

Halm et al., 2007; Fentoglu et al., 2009). 7

Sabe-se que a dislipidemia pode ser desenvolvida pela dieta inadequada (principalmente 8

quando associada ao sedentarismo), ou por predisposição genética (Fentoglu et al., 2009). 9

Uma alimentação inadequada, como a alta ingestão de gorduras animais, pode acarretar 10

um acúmulo de colesterol no organismo. Em nosso estudo a dislipidemia foi induzida nos animais 11

pelo fornecimento de uma ração com aumento de colesterol. 12

Os animais que tiveram livre acesso à ração com acréscimo de colesterol tiveram 13

aumento de LDL (36,24 mg/dl) e redução de HDL (35,90 mg/dl) quando comparados com os 14

animais do grupo que recebeu ração padrão (LDL -18,48mg/dl, e HDL - 42,87mg/dl). 15

Quanto aos demais lipídios (colesterol total, triglicérides e VLDL) não houve diferença 16

estatística entre o grupo que recebeu a ração com colesterol e o grupo ração padrão. Segundo 17

Tomofuji, et al. (2006), o período de 8 semanas de ingestão rica em colesterol é um período muito 18

curto para elevar triglicérides séricos nos animais. Além disso, existem vários trabalhos que 19

apontam que os ratos wistar são resistentes ao aumento de colesterol pela dieta (Rudling e 20

Angelin, 1993; Ness e Gertz, 2004; Lindsey et al., 2011). 21

Discussão


Os resultados mostram que a ração provocou dislipidemia, já que essa alteração pode 1

ser caracterizada por aumento do colesterol LDL e redução de colesterol HDL (Arquivos 2

Brasileiros de Cardiologia, 2007; Hersberger et al., 2011). 3

A obesidade, que tem como um dos parâmetros indicativos o excesso de peso, está 4

associada a um estado de inflamação crônica sistêmica, que promove hiperatividade do sistema 5

imunológico e libera mediadores inflamatórios no organismo (Genco et al., 2005; O’Rourke et 6

al., 2012). Os animais, tratados com a ração com aumento de colesterol não apresentaram 7

aumento significativo de peso em relação aos alimentados com ração padrão. Yamamoto, et al. 8

(2010), em seu estudo também não observou aumento de peso significativo no grupo de 9

animais com ingestão de ração com colesterol pelo período de 8 semanas. Essa observação 10

afasta a hipótese de que os animais estavam obesos e ser essa a causa dos níveis alterados de 11

citocinas inflamatórias. 12

A doença periodontal é uma doença infecciosa causada principalmente por bactérias 13

gram-negativas, que provoca um aumento local e sistêmico de mediadores pró-inflamatórios 14

(Page et al., 1991; Nakajima et al., 2010). 15

Embora os microorganismos sejam considerados agentes etiológicos da doença 16

periodontal, as proteínas mediadoras da inflamação parecem ser as principais responsáveis pela 17

destruição dos tecidos periodontais. Estudos mostram que, pacientes com doença periodontal 18

apresentam níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias no soro e no tecido, tais como IL-1β, 19

IL-6 e TNF-α (Gorska et al., 2003; Pradeep et al., 2009). 20

Várias evidências sugerem que o TNF-α tem um potencial para induzir a degradação 21

do tecido conjuntivo e reabsorção óssea alveolar, além de regular a liberação de IL-1β, que 22

desempenha um papel no inicio e progressão da inflamação (Wei et al., 2004; Kindle et al., 23

2006; Garlet et al., 2010). 24

Vários métodos têm sido usados para induzir a doença periodontal em ratos de forma 25

a avaliar a patogênese da doença e seus possíveis tratamentos, no entanto, não há um modelo 26

Discussão


único que reflita todas as características da doença periodontal humana (Klausen, 1991; 1

Guerkan et al., 2009). 2

A doença periodontal pode ser induzida pela manipulação dietética (dieta a base de 3

fibras que pode traumatizar o epitélio devido a mecânica da mastigação e facilitar a penetração 4

de bactérias) (Robinson et al., 1991), introdução de microorganismos patogênicos (Jordan et 5

al., 1972, Fiehn et al., 1992), colocação de uma ligadura, que funciona como um sítio de 6

colonização bacteriana (Klausen, 1991), ou por injeção de toxinas bacterianas como o LPS 7

(lipopolissacarídeo) (Klausen, 1991, Llavaneras et al., 1999, Yamamoto et al., 2010). 8

O LPS (lipopolissacarídeo) é um constituinte da parede celular de praticamente todos 9

os microrganismos subgengivais Gram-negativos (Garrison e Nichols, 1989; Ramamurthy, 10

2002). Estas moléculas provocam permeabilidade vascular, infiltração de leucócitos 11

polimorfonucleares, causando edema (Page, 1991) e liberação de mediadores inflamatórios 12

como as IL-1, IL-6, IL-8, fator de necrose tumoral (Lindemann et al., 1988, Agarwal et al., 13

1995) e prostaglandinas (Garrison et al., 1988, Garrison e Nichols, 1989 ), como subsequente 14

ativação dos osteoclastos (Jiang et al., 2002). 15

Embora a bactéria E. coli não seja uma bactéria periodontopatogênica o efeito 16

inflamatório que ela acarreta no tecido gengival é semelhante ao desenvolvido por bactérias 17

presentes na placa subgengival (Miyauchi et al., 2001; Ramamurthy, 2002; Ekuni et al., 2003). 18

Esse modelo de indução de doença periodontal permite que inflamação permaneça por um 19

período mais extenso quando comparada, por exemplo com o método de ligadura (de Aquino 20

et al., 2009b). 21

A região inflamada é caracterizada por infiltrado de células de defesa, edema, 22

pavimentação leucocitária e hiperemia. Na análise histológica confirmou-se que esses 23

parâmetros estavam presentes nos animais que receberam as aplicações de LPS, demonstrando 24

o quadro de inflamação instalado. 25

Discussão


Durante a 1ª e 2ª semana os animais com dislipidemia apresentaram grau de 1

inflamação semelhante ao dos animais saudáveis. Porém, quando os mesmos parâmetros foram 2

observados em um tempo maior de exposição ao agente patogênico (na 4°semana de aplicação 3

do LPS) notou-se um aumento do grau de inflamação nos animais com dislipidemia, sugerindo 4

que a dieta com alto teor de colesterol tem maior efeito na cronicidade do processo 5

inflamatório da gengiva. Estes achados estão de acordo com o trabalho de Tomofuji, et al. 6

(2005, 2006), no qual observaram que ratos com inflamação gengival induzida por aplicação 7

tópica de agentes inflamatórios por 4 semanas (LPS de E. coli e proteases extraída de 8

Streptomyces griseus) e alimentados por oito semanas com uma dieta rica em colesterol, 9

apresentaram uma resposta inflamatória maior comparado ao grupo ração padrão+LPS. 10

A ingestão de uma dieta rica em colesterol pode aumentar a formação de espécies 11

reativas de oxigênio (ROS), que aumenta a peroxidação lipídica causando danos teciduais 12

(Wilson et al., 1999; Balkan et al., 2002; Homma et al., 2004; Sudhahar et al., 2006; Afonso 13

et al., 2013). O estresse oxidativo está envolvido na patogênese de muitas doenças, entre elas a 14

doença periodontal (Wei et al., 2004). O organismo libera espécies reativas de oxigênio como 15

forma de defesa contra os patógenos, e o desequilíbrio entre essas moléculas e as 16

antioxidativas pode levar a uma maior destruição tecidual (Wei et al., 2004). 17

Sendo assim, é provável que o estresse oxidativo produzido pela dieta rica em 18

colesterol somado àquele causado pela presença de bactérias periodontopatogênicas, tenha um 19

efeito importante na progressão da doença periodontal, potencializando a liberação de 20

mediadores inflamatórios no tecido periodontal, causando maior inflamação tecidual 21

(Tomofuji et al., 2006). 22

Os resultados do presente estudo estão de acordo com esses dados, mostrando que a 23

dieta com aumento de colesterol agravou o quadro inflamatório nos animais, principalmente 24

quando o período de exposição é maior. 25

Discussão


Numerosos estudos (Henninger et al., 1997; Kimura et al., 1997; Stokes et al., 2002) 1

têm demonstrado que a hipercolesterolemia provoca alteração na microvasculatura, refletida na 2

ativação de células endoteliais, recrutamento de leucócitos, rolamento e aderência, e também a 3

ativação do fator de agregação plaquetária (PAF). 4

Segundo Kim et al. 1991, uma dieta com acréscimo de colesterol aumenta a 5

deposição de lipídios em vários órgãos, o que resulta em um aumento nos níveis de moléculas 6

inflamatórias sistêmicas circulatórias, tais como proteína C-Reativa (Warnberg et al., 2004). 7

Dessa forma, uma dieta rica em colesterol pode, de forma indireta, aumentar a circulação de 8

moléculas inflamatórias, e aumentar a inflamação induzida por agentes patogênicos 9

bacterianos (Tomofuji et al., 2005). 10

O aumento de células inflamatórias no periodonto em resposta ao LPS bacteriano 11

libera mediadores químicos como as citocinas IL-1β, TNF-α e IL-6 (Ramamurthy, 2002), que 12

podem regular positivamente as metaloproteínases (MMPs), e a síntese de proteinases por 13

macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos (Birkedalhansen et al., 1993) levando a 14

destruição tecidual e óssea no foco da inflamação. 15

As citocinas, que são pequenas proteínas solúveis, e transmitem informações de uma 16

célula para outra (Callard et al., 1999), são potentes estimuladoras da expressão da molécula de 17

adesão celular em células endoteliais, e também são importantes para a etapa de migração das 18

células imunes recrutadas para o foco da inflamação (Sattar et al., 2003; Kindle et al., 2006; 19

Garlet et al., 2010). 20

Em estudos avaliando o nível de IL1-β e TNF-α em animais tratados com uma dieta 21

hiperlipidêmica durante oito semanas e aplicações de LPS por quatro semanas foi observada 22

um aumento dessas citocinas comparada ao grupo ração padrão+LPS (controle) (Tomofuji et 23

al., 2006; Yamamoto et al., 2010). No presente estudo os resultados foram semelhantes, o 24

nível de TNF-α encontrado nos animais com o quadro de inflamação foi maior naqueles que 25

apresentavam dislipidemia (1° e 2° semana). O nível de IL-1β também foi maior em alguns 26

Discussão


períodos, apesar de não ser estatisticamente significativo quando comparado ao grupo ração 1

padrão+LPS. 2

Uma das explicações de como a dislipidemia, induzida nos animais, poderia estar 3

predispondo a um grau maior de inflamação seria a hipótese mostrada por Hyka et al., (2001), 4

que demonstraram a capacidade de apolipoproteína AI (apo AI), presente na lipoproteína 5

HDL, em inibir a resposta inflamatória. A apo AI impede a ligação entre monócitos e linfócitos 6

T, impedindo ativação do linfócito, e a liberação de TNF-α e IL1-β. Além disso, o colesterol 7

HDL inibe a expressão de VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) e a ICAM-1 8

(intercellular adhesion molecule) (Ashby et al., 1998) que são moléculas com um importante 9

papel na migração de células inflamatórias da corrente sanguínea até o foco da inflamação. 10

Dessa forma, parece que o HDL apresenta ação anti-inflamatória, e sua redução no organismo 11

reflete de forma negativa na contenção da resposta inflamatória. 12

No presente estudo, entre os animais com inflamação induzida, aqueles que 13

apresentavam perfil dislipidêmico foram os que apresentavam maiores níveis de IL-1β e TNF-14

α, sendo que o nível de HDL estava diminuído em todos os períodos de tratamento (1°semana: 15

27,69 mg/dl; 2°semana: 37,63mg/dl, 4°semana: 32,94mg/dl) em comparação aos animais do 16

grupo ração padrão+LPS (1°semana: 43,64mg/dl; 2°semana: 52,36mg/dl, 4°semana: 17

42,29mg/dl). Assim estes dados corroboram com a ideia de que o nível de HDL reduzido pode 18

contribuir na elevação do nível de citocinas pro- inflamatórias como IL1-β e TNF-α (Hyka et 19

al., 2001; Franco et al., 2011). 20

A IL-6 é uma citocina pró-inflamatória importante envolvida na regulação da resposta 21

do hospedeiro à infecção e lesão no tecido (Marchetti et al., 2012), além de ser uma citocina 22

fundamental para a regulação do metabolismo ósseo, pois está envolvida no processo de 23

reabsorção óssea, e inibição da formação de osso (Moreira et al.,2007). O nível de expressão 24

de IL-6 tem sido associado com a gravidade da doença periodontal (Moreira et al., 2007). 25

Estudos mostram que a expressão prolongada de IL-6 leva a apoptose de neutrófilos e suprime 26

Discussão


a infiltração dessas células na área da inflamação, além disso, leva a retenção e ativação de 1

células mononucleares de defesa na área da inflamação, contribuindo para a cronicidade do 2

processo inflamatório (Hurst et al., 2001; Kaplanski et al. 2003; Gabay, 2006, Rose- John et 3

al.,2006; Fonseca et al.,2009). 4

É possível notar que durante todo o período de tratamento com o agente inflamatório 5

o nível de IL-6 estava aumentado nos animais com dislipidemia quando comparado com 6

animais que consumiram ração padrão. 7

A combinação da dieta com alto teor de colesterol e agentes patogênicos bacterianos 8

elevaram TNF- α e IL-6 sistêmico de forma mais expressiva do que em animais com dieta 9

normal, desta forma, esta liberação aumentada, pode exacerbar a destruição do periodonto na 10

doença periodontal. 11

O SLPI é expresso por células epiteliais e tem a função de impedir danos excessivos 12

ao tecido, causados pelas enzimas proteolíticas durante a inflamação. Estudos realizados com 13

camundongos deficientes de SLPI mostraram outras funções dessa proteína, como por 14

exemplo, antagonizar toxinas bacterianas como LPS, suprimir a produção de metaloproteinases 15

e induzir a síntese de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 (McNeely et al., 1995). 16

No presente estudo, nos animais que consumiram a ração padrão, foi observado que 17

durante os estágios iniciais da inflamação os níveis de SLPI apresentaram-se elevados, e que 18

durante os estágios seguintes do experimento houve uma redução dessa molécula. Nakamura, 19

et al. 2003 e Pateel, et al. 2010, também observaram que nos estágios iniciais do doença 20

periodontal, o SLPI está aumentada, e é encontrada em nível reduzido ao longo do processo 21

inflamatório nos estágios em que há um agravamento da doença. 22

Em nosso estudo os animais com dislipidemia, diante da inflamação provocada pelo 23

LPS, tiveram níveis de SLPI reduzidos em todos os períodos experimentais, sugerindo que 24

nesses animais existe um comprometimento na liberação do SLPI. 25

Discussão


A dislipidemia parece reduzir os níveis de SLPI, contribuindo para que o organismo 1

esteja mais susceptível à maior agressividade da infecção (Yin et al., 2010), o que corrobora 2

com nossos resultados, pois em animais com dislipidemia, onde o nível de SLPI é reduzido, o 3

grau de inflamação (refletido pelo nível de citocinas e análise histopatológica) é maior do que 4

nos animais saudáveis. 5

A leptina é uma proteína não glicosilada de 16 kDa, codificada pelo gene ob. É 6

sintetizado principalmente por adipócitos e desempenha um papel importante na controle do 7

peso corporal por regular a ingestão de alimentos e liberação de energia, devido a suas ações 8

sobre o hipotálamo (Zhang et al., 1994). 9

Vários estudos sugerem que a proteína leptina pode estar envolvida na regulação da 10

resposta imune em roedores e humanos (Farooqi et al., 2002; De Rosa et al., 2006; Lago et al., 11

2008). Durante episódios inflamatórios foi observado que a leptina atua na defesa do 12

hospedeiro, pois sua ausência contribui substancialmente para a mortalidade e enfraquece a 13

resposta imune local e sistêmica (Tschoep et al., 2010). 14

A leptina contribui para a liberação de citocinas pró-inflamatórias e a fagocitose por 15

macrófagos (Ahima e Flier, 2000; Karthikeyan e Pradeep, 2007). A presença da leptina e de 16

seu receptor OB-R na mucosa oral e nas glândulas salivares sugere que essa proteína é também 17

de grande importância para as doenças que afetam a cavidade oral (Kim et al.,2010). 18

Em nosso estudo, durante os períodos de aplicações do LPS o nível de leptina de 19

ambos os grupos, estavam elevados comparado ao nível basal, o que sugere que o processo 20

inflamatório elevou o nível de leptina no soro. A detecção da leptina foi progressivamente 21

aumentada de forma proporcional ao tempo de exposição ao agente inflamatório, semelhante 22

ao trabalho de Karthikeyan e Pradeep, (2007), onde eles observaram que o nível de leptina no 23

soro de pacientes, aumentou à medida que a doença periodontal progrediu. Estudos sugerem 24

que a leptina em um nível equilibrado participa da defesa do organismo (Karthikeyan e 25

Pradeep, 2007; Farooqui et al., 2012). Foi observado em nosso estudo que, em animais com 26

Discussão


dislipidemia esse hormônio juntamente com mediadores inflamatórios é expresso em um nível 1

elevado quando comparado ao nível basal. Essa observação, assim como a avaliação dos 2

receptores da leptina merecem mais estudos. 3

Discussão


Conclusão


6.0. Conclusão

De acordo com os resultados, foi possível concluir que: 1

1. é possível induzir dislipidemia em ratos wistar utilizando-se ração com acréscimo de 2

colesterol; 3

2. a indução da inflamação foi realizada na gengiva dos animais, e mostrou importantes 4

diferenças entre os grupos observados; 5

3. tanto a análise histológica local quanto a avaliação dos mediadores inflamatórios 6

séricos mostraram que principalmente a inflamação crônica está com intensidade 7

aumentada em animais com dislipidemia. 8

4. o SLPI, importante protetor celular e tecidual está com presença diminuída em 9

animais com dislipidemia; 10

5. existe um aumento da detecção de leptina em animais com dislipidemia, no entanto, 11

esse resultado preliminar merece maiores estudos com relação ao: 12

a) efeito de uma quantidade aumentada dessa proteína livre na corrente 13

sanguínea e, 14

b) avaliação da condição dos seus receptores nos tecidos bucais e das 15

consequências dessas situações. 16

Conclusão


Referências Bibliográficas


7.0 Referências Bibliográficas

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IV Diretriz Brasileira Sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose Departamento de Aterosclerose da Sociedade Brasileira de Cardiologia. Arq Bras Cardiol . - Volume 88, Suplemento I, Abril 2007.



Anexo


8.0. Anexo

Anexo A – Ofício do comitê de ética no uso de animais

Anexo

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EFEITO DA DISLIPIDEMIA SOBRE A CAPACIDADE DE ...Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. RESUMO A dislipidemia é geralmente caracterizada pela presença